專利名稱：軟骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防與組織變化相關(guān)的疾病的方法，例如，一種關(guān)節(jié)炎癥疾病，諸如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病的關(guān)節(jié)炎、幼年慢性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、傳染性關(guān)節(jié)炎和幼年自發(fā)性關(guān)節(jié)炎，其它涉及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的疾病，諸如，骨關(guān)節(jié)炎、半月板的損傷、痛風(fēng)，影響肌骨骼系統(tǒng)結(jié)構(gòu)元素的疾病，諸如，肌腱損傷、韌帶損傷，以及骨疾病諸如骨質(zhì)疏松癥，影響主動脈的疾病包括動脈粥樣硬化、脈管炎和外傷導(dǎo)致的損傷，肺病包括哮喘和慢性梗阻性肺病(COPD)。本發(fā)明還涉及用于這樣的方法和組合物中新的化合物，而優(yōu)選的本發(fā)明涉及具有核心多肽序列WLEAK(SEQ ID No1)的新的多肽化合物。
在目前的內(nèi)容中組織變化的類型主要涉及炎癥介導(dǎo)的軟骨損傷。
另一方面，本發(fā)明涉及與一種受體，例如一種整合素受體和/或一種聚陰離子的結(jié)構(gòu)，例如肝素/類肝素硫酸鹽，相互作用的化合物。
背景技術(shù)：
組織的損傷是影響很多器官類型的疾病的一個特征并且表現(xiàn)了人口日益增多的特別帶有老年化的問題。許多這樣的疾病帶有一種慢性炎癥的元素。這樣的疾病諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、全身性動脈粥樣硬化、慢性肺病、腱炎、帶有輕微疼痛和腰椎間盤突出的脊柱問題。到目前為止，這些疾病包括了社會上花費最大、個人痛苦的主要疾病種類。
關(guān)節(jié)炎是幾種關(guān)節(jié)炎癥疾病的通用名稱。關(guān)節(jié)疾病在人群中極為普遍。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者約為1％，而骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率更為普遍，至少為10％。兩種疾病本質(zhì)的主要特征是漸進性的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷以及炎癥引起的疼痛殘疾。
目前，一些患者風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀可以通過藥物治療減輕，例如抗-炎癥劑包括皮質(zhì)激素，物理療法或外科手術(shù)。更近采用細胞因子抑制劑，特別是TNF-α能夠改善2/3患有嚴重風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的情況。
然而，很多患者對于上述治療并沒有產(chǎn)生有效應(yīng)答或者治療導(dǎo)致很多副作用(參見，例如Smolen & Steiner，Nature Reviews，Vol.2，(2003)，473-488)。本領(lǐng)域已知的是軟骨粘合素(CHAD)與另外的化合物結(jié)合可以對組織變化起作用(WO0137861)并且還顯示膠原蛋白II與軟骨粘合素(WO03049669)結(jié)合能夠用于治療腰椎間盤突出。令人驚奇的是本發(fā)明的軟骨粘合素及其片段作為純合化合物在去除和/或抑制組織損傷相關(guān)參數(shù)具有預(yù)期效果。
需要新的方法治療與組織變化相關(guān)的疾病，特別是在治療效果和減小副作用方面。
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防與組織變化相關(guān)的疾病的方法，例如，一種關(guān)節(jié)炎癥疾病，諸如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病的關(guān)節(jié)炎、幼年慢性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、傳染性關(guān)節(jié)炎和幼年自發(fā)性關(guān)節(jié)炎，涉及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的其它疾病，諸如，骨關(guān)節(jié)炎、半月板的損傷、痛風(fēng)，涉及脊柱椎間盤的疾病，諸如，后背疼，影響肌骨骼系統(tǒng)元件結(jié)構(gòu)的疾病，諸如，肌腱損傷、韌帶損傷，以及骨疾病，諸如，骨質(zhì)疏松癥，影響主動脈的疾病包括動脈粥樣硬化、脈管炎和外傷導(dǎo)致的損傷，肺病包括哮喘和COPD。該方法包括給主體施加其需要的治療和/或預(yù)放劑量的化合物，該化合物至少為以下之一a)調(diào)節(jié)涉及一種與組織變化相關(guān)疾病的細胞表型的變化，b)調(diào)節(jié)涉及一種與組織變化相關(guān)疾病的細胞中細胞外的基質(zhì)分子的產(chǎn)量，c)抑制分解因子的正常產(chǎn)量和活性，例如，NO，細胞因子和/或涉及一種與組織變化相關(guān)疾病的細胞中的蛋白酶，d)調(diào)節(jié)涉及一種與組織變化相關(guān)疾病的細胞的分裂，e)調(diào)節(jié)涉及一種與組織變化相關(guān)疾病的細胞的遷移，f)調(diào)節(jié)生長因子的產(chǎn)量和/或g)調(diào)節(jié)涉及一種與組織變化相關(guān)疾病的細胞的對外界刺激的應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明的方法的通常目的是介導(dǎo)細胞實現(xiàn)特異的功能，其全部對與組織變化相關(guān)的疾病具有正面效果。
目前，主要研究的組織變化的主要類型炎癥是涉及介導(dǎo)軟骨損傷的變化。涉及與組織變化相關(guān)疾病的細胞類型取決于待研究的疾病和受影響的組織。涉及如上所述疾病的細胞的例子是軟骨細胞、成骨細胞、骨細胞、成纖維細胞、腱細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞和前-炎癥細胞例如滑液成纖維細胞和樹枝狀細胞。
在一個具體實施例中，涉及疾病的細胞是軟骨細胞。上述方法的下列描述一般用于涉及與組織變化相關(guān)疾病的所有細胞類型，但是參考具體細胞，例如，軟骨細胞和平滑肌細胞以及如何調(diào)節(jié)這些細胞的行為，從而治療或預(yù)防與軟骨細胞相關(guān)的組織變化。
在一個具體的方面，根據(jù)本發(fā)明的方法包括給主體施加其需要的治療和/或預(yù)防劑量的化合物，該化合物能夠調(diào)節(jié)涉及與組織變化相關(guān)疾病的細胞表型變化。在本發(fā)明的內(nèi)容中術(shù)語“表型”的特定含義不是簡單的而本領(lǐng)域人員將理解該術(shù)語涉及細胞的特征并且可以在很多水平上限定。最簡單和傳統(tǒng)所用參數(shù)是細胞形狀。鑒別表型的其它方法是通過例如分子的細胞產(chǎn)量，例如不同模式基質(zhì)蛋白質(zhì)、蛋白酶和生長因子的產(chǎn)量，細胞固定、遷移、分解和/或合成代謝狀態(tài)的鑒別，以及鑒別細胞是分裂還是不分裂。因此，用于本發(fā)明的化合物僅僅影響細胞的表型。然而，在本發(fā)明的一個具體實施例中，通過使用根據(jù)本發(fā)明的一種化合物至少有一個其它的因子被影響而沒有——作為主要作用——影響細胞的表型。一個例子包括例如通過調(diào)節(jié)生長因子的產(chǎn)量。
沒有結(jié)合任何特異的原理，發(fā)明人在一個實驗中發(fā)現(xiàn)特別是圓形的軟骨細胞與細胞行為相關(guān)。
至于在根椐本發(fā)明的方法中的術(shù)語b，導(dǎo)致組織變化的方法之一，例如組織損傷，是修復(fù)組織損傷失敗。雖然組織經(jīng)常通過某些基質(zhì)成分增加的產(chǎn)量而作出應(yīng)答，但是越來越清楚的是需要用于組織結(jié)構(gòu)適當組裝的所有成分的產(chǎn)量缺乏協(xié)調(diào)。該缺點似乎是一種被抑制的組裝，其比活性不充分的修復(fù)過程更糟糕。因此，通過調(diào)節(jié)細胞外的基質(zhì)成分的產(chǎn)量，可以獲得組織結(jié)構(gòu)的適當組裝。
根據(jù)本發(fā)明的方法中的術(shù)語c導(dǎo)致組織變化的另一方法是組織結(jié)構(gòu)分子提高的損壞導(dǎo)致組織失敗和損傷。這可以通過組織細胞本身產(chǎn)生的蛋白酶而實現(xiàn)。在所有帶有組織損傷成分的組織中，蛋白酶產(chǎn)量提高。通過刺激細胞降低蛋白酶的產(chǎn)量，可以防止組織結(jié)構(gòu)分子的損壞。如以下將被更詳細說明，一種受體，例如，一種整合素受體，與特異配體的結(jié)合，在軟骨細胞上將導(dǎo)致蛋白酶產(chǎn)量降低。
根據(jù)本發(fā)明的方法中的術(shù)語d當細胞增殖時，細胞基質(zhì)成分的產(chǎn)量最小，即細胞無法為組織修復(fù)做出貢獻。因此，通過防止細胞分裂，所作用的細胞可以轉(zhuǎn)而產(chǎn)生基質(zhì)成分而組織修復(fù)。細胞分裂被認為取決于整合素受體的活性，即通過加入或者刺激或者抑制受體的配體來調(diào)節(jié)整合素受體的活性，細胞分裂可以被調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的方法中的術(shù)語e治療與組織變化相關(guān)的疾病的一種方法是抑制在這樣的疾病中所涉及的細胞的遷移。在例如全身性動脈粥樣硬化中，可能有平滑肌細胞遷移到動脈內(nèi)膜。這些細胞將堆積而且它們中的很多將分裂。同時，脂肪在這些細胞內(nèi)積聚并包圍它們而且它們還形成連接組織。因此，由于這些積聚的細胞和包圍的材料使得動脈最內(nèi)層顯著變厚。如果壁足夠厚，動脈內(nèi)腔將會減小而血流會降低，這樣就降低了氧氣的供應(yīng)。細胞遷移被認為取決于整合素受體的活性，即通過加入與受體相互作用的配體調(diào)節(jié)整合素受體的活性，可以抑制細胞遷移。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在特定情況下抑制軟骨細胞的細胞遷移有利于減輕與組織變化相關(guān)的疾病。
根據(jù)本發(fā)明的方法中的術(shù)語f用于治療與組織變化相關(guān)的疾病的另一切入點是調(diào)節(jié)生長因子的產(chǎn)量。生長因子是基因產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)例如細胞分裂、組織增殖和基質(zhì)成分的產(chǎn)量中起到重要作用。每個生長因子具有特異的細胞表面受體并且結(jié)合一種生長因子至它的受體上可以起始，或在某些情況下，封閉細胞分裂。一種具體的生長因子，TGF-beta，水平過高被發(fā)現(xiàn)會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎中可見的變化，而且TGF-beta的水平在肺纖維化中也較高導(dǎo)致產(chǎn)生過量的膠原蛋白。
更具體地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法的化合物，通過與細胞表面上的結(jié)構(gòu)相互作用而在與上述提及的疾病相關(guān)的細胞上發(fā)揮它們的作用。這樣結(jié)構(gòu)的例子是受體和/或聚陰離子的結(jié)構(gòu)，特別是類肝素包括肝素和類肝素硫酸鹽。因此，本發(fā)明涉及一種方法，其中一種或多種化合物能夠a)與涉及組織變化相關(guān)疾病的細胞表面所表達的受體相互作用，b)與聚陰離子的結(jié)構(gòu)相互作用，例如，但不限于涉及組織變化相關(guān)疾病的細胞表面所表達或存在的類肝素硫酸鹽，和/或c)與一種或多種受體和/或一種或多種聚陰離子的結(jié)構(gòu)聯(lián)合相互作用。
在該方法中，一種化合物既能與一種受體也能與一種聚陰離子的結(jié)構(gòu)相互作用，或者與兩種或更多受體和/或兩種或更多聚陰離子的結(jié)構(gòu)相互作用。受體通常需要聚合以達到最佳活性，即通過提供一種能夠交聯(lián)兩種或更多受體或聚陰離子的結(jié)構(gòu)的化合物，確保二聚或多聚，導(dǎo)致最佳活性。而且一種化合物結(jié)合至一種受體和/或聚陰離子的結(jié)構(gòu)將被提高，因為當兩種或更多結(jié)合位點被涉及時結(jié)合更加緊密。例如，軟骨粘合素被認為具有兩個特異的結(jié)合區(qū)域，一個用于整合素受體而另一個用于類肝素結(jié)合。因此這樣物質(zhì)具有多種功能性。
軟骨細胞，作為軟骨中唯一的細胞類型，在軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用。軟骨細胞的角色包括基質(zhì)分子的正常翻轉(zhuǎn)和分子沉積進入功能基質(zhì)中。
本發(fā)明人的研究顯示軟骨細胞表達幾種與細胞調(diào)節(jié)相關(guān)的細胞表面結(jié)構(gòu)。
相關(guān)的細胞表面結(jié)構(gòu)包括整合素受體。整合素受體是一條alpha和一條beta鏈的復(fù)合物，其可以選自18條不同的alpha鏈和8條不同的beta鏈。各種整合素受體可以具有不同的配體并引發(fā)不同的應(yīng)答。
軟骨細胞上細胞表面結(jié)構(gòu)的另一個例子，與細胞的調(diào)節(jié)相關(guān)的，是聚陰離子的結(jié)構(gòu)，例如，類肝素，諸如肝素/類肝素硫酸鹽、軟骨素/皮膚素硫酸鹽鏈、硫酸鹽化神經(jīng)節(jié)苷脂或磷脂的群。
類肝素硫酸鹽在細胞表面是到處存在的，其占優(yōu)勢地被發(fā)現(xiàn)于橫跨膜粘結(jié)蛋白聚糖家族或糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的蛋白多糖上。
在本說明書中，術(shù)語類肝素還包括類肝素類似物。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)軟骨粘合素抑制細胞結(jié)合至軟骨細胞上的整合素α2β1受體，強烈指示軟骨粘合素結(jié)合至軟骨細胞是通過整合素α2β1受體。軟骨粘合素是一種富含亮氨酸的，軟骨基質(zhì)蛋白質(zhì)。軟骨粘合素的結(jié)合包括細胞以維持圓形并且停留在合成代謝模式，出現(xiàn)刺激細胞產(chǎn)生ECM-分子，并且防止細胞擴散和/或遷移以及細胞分裂。研究還顯示大部分其它天然的整合素配體，例如，膠原蛋白II在細胞上具有差不多相反的作用。
如這里所示，人軟骨細胞與天然的和未折疊的軟骨粘合素粘著情況相等顯示一種線性多肽序列節(jié)導(dǎo)該粘著。對軟骨粘合素的消化也顯示軟骨粘合素的較小片段能介導(dǎo)上述作用。
因此，在本發(fā)明的一個具體實施例中受體a)是一種整合素受體并且一種或多種化合物是多肽，其包括一種或多種軟骨粘合素片段或其類似物。
本發(fā)明人已經(jīng)鑒別出一種特異的軟骨粘合素片段(CQLRGLRRWLEAK-SEQ ID NO3)，其通過一種整合素受體，例如整合素α2β1受體，而結(jié)合至軟骨細胞，在軟骨細胞上具有上述作用，即防止細胞的擴散和遷移并且同時細胞傾向于保持圓形表型。進一步的研究顯示一個與CQLRGLRRWLEAK相似的亞片段LRRWLEAK(SEQ ID NO2)防止細胞的擴散和遷移并且同時細胞傾向于保持圓形表型。整合素結(jié)合活性位于C-末端殘留的序列，涉及WLEAK序列(SEQ ID NO1)。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)如果賴氨酸被帶有側(cè)鏈的另一氨基酸，即精氨酸取代的話，序列的整合素結(jié)合特性會喪失，即賴氨酸在WLEAK(SEQ ID No1)序列中對于活性是必需的。
然而，不能排除賴氨酸被另外的氨基酸替換的序列可能維持其活性。
發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，將色氨酸用另一帶有芳香基側(cè)鏈的另一氨基酸，即酪氨酸替換，以及將谷氨酸用另一帶有側(cè)鏈的氨基酸，即天冬氨酸替換，不影響序列的整合素結(jié)合活性。
因此，本發(fā)明涉及一種方法，其中至少一個軟骨粘合素片段具有與SEQ ID No1(WLEAK)的氨基酸序列至少大約60％，例如至少大約70％，至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性。
與SEQ ID No1的序列具有至少60％同源性的例子是以下序列Xaa-L-Yaa-A-K，其中Xaa可以選自色氨酸和蘇氨酸，而Yaa可以選自谷氨酸和天冬氨酸。
本發(fā)明還涉及一種方法，其中至少一種軟骨粘合素片段具有與SEQ ID No2(LRRWLEAK)的氨基酸序列至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性。
而且，本發(fā)明還涉及一種方法，其中至少一種軟骨粘合素片段具有與SEQ ID No3(QLRGLRRWLEAK)的氨基酸序列至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性。
發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)軟骨粘合素結(jié)合至細胞表面上的粘結(jié)蛋白聚糖可防止細胞分裂，并導(dǎo)致提高了的粘著。
粘結(jié)蛋白聚糖是一個4個橫跨膜類肝素硫酸鹽蛋白多糖的家族，其被認為是細胞表面重要的粘附協(xié)同-受體，其活性參與粘著和信號通路。
軟骨粘合素通過肝素/類肝素硫酸鹽鏈結(jié)合至粘結(jié)蛋白聚糖。本發(fā)明人已經(jīng)鑒別出一個特異的軟骨粘合素片段，其與肝素/類肝素硫酸鹽相互作用。
因此，本發(fā)明涉及一種方法，其中至少一種軟骨粘合素片段具有與SEQ ID No4(KRSKK)的氨基酸序列至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性。
本發(fā)明還涉及一種方法，其中至少一種軟骨粘合素片段具有與SEQ ID No5(KKAGRH)的氨基酸序列至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性。
而且，本發(fā)明還涉及一種方法，其中至少一種軟骨粘合素片段具有與SEQ ID No6(KFPTKRSKKAGRH)的氨基酸序列至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性。
進而，本發(fā)明涉及一種方法，其中至少一種軟骨粘合素片段具有與SEQ ID No7(CKFPTKRSKKAGRH)的氨基酸序列至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性。
在另一實施例中，根據(jù)本發(fā)明的多肽包括至少一個能結(jié)合整合素受體的軟骨粘合素，至少一個能結(jié)合肝素/類肝素硫酸鹽從而調(diào)節(jié)信號的軟骨粘合素，其中肝素/類肝素硫酸鹽可以被發(fā)現(xiàn)于粘結(jié)蛋白聚糖和磷脂酰肌醇蛋白聚糖的細胞外區(qū)域上。
在一個具體的實施例中，多肽包含一種氨基酸序列其具有與如下的氨基酸序列至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％或至少大約95％的同源性i)一個SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的氨基酸序列，和ii)一個SEQ ID NO4，SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的氨基酸序列。
關(guān)于氨基酸序列，“序列同源性”指的是序列在采用例如采用SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫利用FASTA pep-cmp用一個可變的pam因子，并且將gap產(chǎn)生罰函數(shù)設(shè)定為12.0而將gap延伸罰函數(shù)設(shè)定為4.0，視窗為兩個氨基酸，進行評估時具有固定的值。序列同源性在特定的殘基指的是包括同源的殘基，其已經(jīng)被簡單的衍生化。
如上所述，研究表明軟骨粘合素的線性片段與它們的細胞表面結(jié)構(gòu)強烈相互作用。而對于其它的多肽和細胞表面結(jié)構(gòu)，如果多肽是非-線性的可能更好。
為了制備更加穩(wěn)定的多肽，多肽可以被設(shè)計成環(huán)狀，因為環(huán)狀多肽更能抵抗外肽酶。此外，保護基團例如乙?；?、酰胺基或甲基，作為本領(lǐng)域已知的工具，可作為合成修飾，其進一步幫助穩(wěn)定多肽低抗分解和代謝降解。
本發(fā)明特別提供了一種新的具有通式(I)線性或環(huán)狀多肽和它們的應(yīng)用所述通式I為P1-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-xa-xb-xc-xd-K-y1-y2-y3-y4-y5-y6-y7-y8-P2其中xa選自W、K或Y其中xb選自L或R其中xc選自E或S其中xd選自A、K、D或E其中x1選自C或缺少其中x2選自Q或缺少其中x3選自L或缺少其中x4選自R、C或缺少其中x5選自G、K或缺少其中x6選自L、F或缺少其中x7選自R、P或缺少其中x8選自R、C、T或缺少其中y1選自A、C或缺少其中y2選自S、G或缺少其中y3選自R或缺少其中y4選自P、H或缺少其中y5選自D或缺少其中y6選自A或缺少其中y7選自T或缺少其中y8選自C或缺少其中P1和P2為缺少或一個保護基團或一個其藥物活性的鹽，在制造用于治療和/或診斷疾病的藥劑中，組織紊亂變化與炎癥介導(dǎo)的軟骨損傷相關(guān)。
在另一實施例中，本發(fā)明涉及新的多肽，在附加的權(quán)利要求中給出了進一步的示例，可供參考。以上給出的類似討論也與這些多肽相關(guān)。
藥物組合物本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包括一種化合物能夠a)調(diào)節(jié)涉及與組織變化相關(guān)疾病的細胞的表型變化，b)調(diào)節(jié)涉及與組織變化相關(guān)疾病的細胞中細胞外的基質(zhì)分子的產(chǎn)量，c)抑制分解因子的正常產(chǎn)量和活性，例如，NO、細胞因子和/或與組織變化相關(guān)疾病的細胞中的蛋白酶，d)調(diào)節(jié)與組織變化相關(guān)疾病的細胞的分裂，e)調(diào)節(jié)與組織變化相關(guān)疾病的細胞的遷移，f)調(diào)節(jié)生長因子的產(chǎn)量，和/或g)調(diào)節(jié)與組織變化相關(guān)疾病的細胞對帶有一種或更多藥物賦形劑的外界刺激的應(yīng)答。
而且，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括一種化合物能夠a)與在組織變化相關(guān)疾病的細胞表面表達的受體相互作用，b)與在組織變化相關(guān)疾病的細胞表面上的聚陰離子結(jié)構(gòu)相互作用，和/或c)與一種或更多受體和/或一種或更多聚陰離子的結(jié)構(gòu)聯(lián)合相互作用。以及帶有一種或更多藥物賦形劑。
在一個實施例中受體是一種整合素受體。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物通常包括特定的化合物加上一種或更多藥物可接受的賦形劑，即藥物惰性基質(zhì)或載體。
載體可以是各種形式，其取決于預(yù)定的藥劑形式和給藥途徑。
藥物可接受的賦形劑可以是，例如，填充劑、粘合劑、分解劑、稀釋劑、潤滑劑、溶劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、增強劑、調(diào)味劑、著色劑、pH調(diào)節(jié)劑、延緩劑、吸濕劑、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑等。詳細介紹可見于藥物手冊，例如，Remington’s藥物科學(xué)或藥物賦形劑手冊。在那些情況下，藥物組合物被設(shè)計用于控制釋放，其還可以包括釋放控制試劑，例如，常規(guī)用于形成基質(zhì)片劑的材料(例如纖維素衍生物，例如羥丙基甲基纖維素及其類似物)。可替換的，組合物可以被一種控制釋放的包衣，例如一種腸包衣或一種膜包衣來包被。一種合適的包衣可以是一種基本上不可溶于水但是可滲透水的包衣。
化合物可以通過合適的方式給藥，例如，口服、含服、鼻滴、眼滴、肺部給藥、局部給藥、經(jīng)皮膚給藥、陰道給藥、直腸給藥、眼部給藥、腸外注射(包括如inter alia皮下、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)以及靜脈內(nèi))，給藥路線對于個體目的有效。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇合適的給藥路線。
藥物組合物包括一種根據(jù)本發(fā)明的化合物，其可以是固體、半固體或流體組合物。
固體組合物可以是片劑的形式，例如，常規(guī)片劑、泡騰片劑、包衣片劑、溶化片劑或舌下片、藥丸、粉末、微粒、顆粒狀、粒狀材料、固體分散物或固體溶液。
半固體形式的組合物可以是糊劑、霜劑、膏劑、凝膠或水凝膠。
流體形式的組合物可以是一種溶液、一種乳劑包括納米乳劑、一種懸浮液、一種分散液、一種微脂粒狀組合物、一種噴霧、一種混合物、一種糖漿或一種精華液。
其它根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的合適藥劑形式為陰道藥劑、栓劑，膏劑、膏藥、片劑、膠囊、香粉、藥片、裝置等。
藥物組合物可以通過本領(lǐng)域人員已知的在藥物形成中的任何方法來制備。
本發(fā)明還涉及利用一種化合物，其能夠a)調(diào)節(jié)涉及與組織變化相關(guān)疾病的細胞的表型變化，b)調(diào)節(jié)涉及與組織變化相關(guān)疾病的細胞中細胞外的基質(zhì)分子的產(chǎn)量，c)抑制分解因子的正常產(chǎn)量和活性，例如，NO，細胞因子和/或與組織變化相關(guān)疾病的細胞中的蛋白酶，d)調(diào)節(jié)與組織變化相關(guān)疾病的細胞的分裂，e)調(diào)節(jié)與組織變化相關(guān)疾病的細胞的遷移，f)調(diào)節(jié)生長因子的產(chǎn)量，和/或g)調(diào)節(jié)與組織變化相關(guān)疾病的細胞對帶有一種或更多藥物賦形劑的外界刺激的應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及利用化合物，其能夠a)與在與組織變化相關(guān)疾病的細胞表面表達的受體相互作用，b)與在與組織變化相關(guān)疾病的細胞表面上的聚陰離子結(jié)構(gòu)相互作用，和/或c)與一種或更多受體和/或一種或更多聚陰離子的結(jié)構(gòu)聯(lián)合相互作用。
該受體是一種整合素受體。
化合物和整合素受體之間的相互作用可以通過任何合適的方法檢測。合適方法的一個例子是細胞的顯微分析從而確定細胞形狀的變化。另一種檢測方法涉及檢測細胞行為的變化。
檢測一種化合物和一種整合素受體之間結(jié)合的另一方法包括將待測化合物施加至一個實驗中，該實驗包括表達整合素受體的細胞和一種固定化的整合素受體天然配體，以及評價是否化合物抑制細胞與天然配體的結(jié)合。
結(jié)合也可以通過標記的多肽的FACS分析來檢測，以及等離子共振(Biacore)。
化合物和聚陰離子的結(jié)構(gòu)之間的相互作用可以通過任何合適的方法檢測。合適方法的一個例子是是細胞的顯微分析從而確定細胞形狀的變化。另一種檢測方法涉及檢測細胞行為的變化，例如細胞遷移。
另一種檢測化合物和聚陰離子的細胞表面結(jié)構(gòu)之間結(jié)合的方法包括將待測化合物施加至一個實驗中，該實驗包括表達聚陰離子的結(jié)構(gòu)的細胞和一種固定化的聚陰離子結(jié)構(gòu)的天然配體，以及評價是否化合物抑制細胞與天然配體的結(jié)合。
結(jié)合也可以通過標記的多肽的FACS分析來檢測，以及等溫滴定法(ITC)。
本發(fā)明涉及一種在生物體外檢測一種化合物活性或兩種或更多化合物的組合作用于細胞外的基質(zhì)成分生產(chǎn)的方法，該方法包括a)在一種或更多待測化合物存在下培養(yǎng)細胞，b)監(jiān)測從培養(yǎng)的組織外植體中基質(zhì)成分的釋放，c)監(jiān)測用代謝試劑，例如IL-1和纖連蛋白片段刺激后從培養(yǎng)的組織外植體中基質(zhì)成分的改性釋放，d)在生長因子存在下監(jiān)測從培養(yǎng)的組織外植體中基質(zhì)成分的改性釋放，e)監(jiān)測在動物中模型疾病進程的調(diào)節(jié)，例如膠原蛋白關(guān)節(jié)炎，博萊霉素肺纖維化和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。
實施例引入以下的例子來說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。
為了證明軟骨粘合素-衍生多肽調(diào)節(jié)涉及與組織變化相關(guān)疾病的細胞的表型變化，我們采用這樣的細胞(軟骨細胞、滑膜細胞)，在軟骨外植體和一種關(guān)節(jié)炎動物模型中進行了實驗。
材料和方法重組蛋白質(zhì)的表達和純化人軟骨粘合素cDNA被連接入pQE8載體(QIAGEN Inc.Valencia，CA)并且在M15E-coli中表達。穩(wěn)定態(tài)細菌的過夜培養(yǎng)物(8ml)被用于接種400ml LB-培養(yǎng)基(Luria-Bertani)而細胞在37℃生長2.5小時(OD600of 0.7-0.9)。通過加入2mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)，(Sigma Chemicais CO.，St Louis，MO)而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達，并且培養(yǎng)物又生長4.5小時。細菌隨后通過離心收集，冷凍并再懸浮于細胞溶解緩沖液中(6M GuHCl，0.1M NaH2PO4和0.5M NaCl，pH 8.0)，其包含5mM NEM(Sigma)。懸浮液用21號標準針頭(21G，0.8x50)抽吸10次以溶解細胞。不可溶的碎片通過離心去除。組氨酸標記的重組蛋白質(zhì)采用一個Hi-Trap Ni-螯合柱(Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)基本上按照制造商的說明書進行純化。溶胞產(chǎn)物被添加至Ni2+-交換柱，用10倍體積的細胞溶解緩沖液清洗而結(jié)合蛋白質(zhì)用8M尿素，0.1M NaH2PO4和0.5M NaCl pH 6.3洗脫。片段通過加入1M Tris pH9.0而立即被中和。通過SDS-PAGE和Western印記(western blotting)被測定(數(shù)據(jù)未示出)的包含預(yù)期蛋白質(zhì)的片段被收集，用水滲析并凍干。EBNA-細胞表達的軟骨粘合素如(8)處表述的而生產(chǎn)。
軟骨粘合素多肽的產(chǎn)生完整的重組蛋白質(zhì)(1mg，EBNA-細胞表達(8))采用Lys-C(RocheMolecular Biochemicals)根據(jù)制造商的說明書以1∶50的酶與基質(zhì)比例被蛋白酶解消化。產(chǎn)生的多肽通過逆相色譜在帶有0-70％的乙腈，0.1％TFA(0.1ml/min.超過50min.)梯度的一臺Sephasil C8柱(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)上采用一個SMART-系統(tǒng)(Pharmacia LKB Biotechnology)被分離。流出液在280nm檢測。收集片段，凍干并且再懸浮于PBS中，隨后被用于細胞粘附實驗以封閉完整的軟骨粘合素的粘著。
質(zhì)譜法質(zhì)譜法采用一臺Bruker Scout 384 Reflex III基質(zhì)-捕獲激光解析/電離時間飛行(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀完成。該儀器在正離子模式中采用，延遲抽取，加速電壓為26kV。多肽樣本主要通過反射探測儀進行分析并且50-150單束光譜被積聚以提高信噪比。用于鑒別所獲得多肽質(zhì)量的是ProFound。
多肽的合成這里所述的多肽可以通過任何常規(guī)合成方式進行制備，包括化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)?；瘜W(xué)合成可以通過本領(lǐng)域已知的方法，涉及一個末端氨基酸功能基團選擇性去保護和在完全去保護所有功能基團之后偶聯(lián)選擇性保護氨基酸的環(huán)狀設(shè)備。合成可以在溶液中或固相支持物上利用本領(lǐng)域已知的合適固相來實現(xiàn)。優(yōu)選地，多肽基本上被純化，例如，無熱源質(zhì)的，例如，多于70％，特別優(yōu)選多于90％純化(用于例子的評估，在多肽的情況下，通過合適的技術(shù)例如多肽圖譜，測序或色譜法)。純化可以通過例如色譜法實現(xiàn)(例如HPLC、尺寸排阻、離子交換、親和、疏水相互作用、逆相)或毛細電泳。
肝素結(jié)合稀釋于PBS中的完整的重組蛋白質(zhì)(100 el 10μg，EBNA-細胞表達的)通過肝素-瓊脂糖(Amersham Pharmacia)(1ml)，用20體積的PBS清洗并且用2M NaCl(6xlml)洗脫。洗脫的材料用乙醇沉淀，通過SDS-PAGE(10％)分離并通過Western印記(western blot)顯像(CHAD abα-80，Larsson等)。多肽CKFPTKRSKKAGRH(SEQ ID No7)稀釋在PBS中并通過肝素-瓊脂糖(100μl)，用20體積的PBS清洗并且用結(jié)合材料采用0.5、1、和2M NaCl(每個3倍柱體積)洗脫。
細胞和細胞培養(yǎng)起源于人軟骨肉瘤的人細胞(K9)受Drs.Sven Inerot和AndersLindahl，The Salgrenska University Hospital Gothenburg，Sweden惠贈。K9細胞培養(yǎng)在Dulbeccos Modified Eagle培養(yǎng)基中營養(yǎng)混合物F12(DMEM/F12 1∶1)帶有GLUTAMAX I，補充了10％胎牛血清，25μg/ml維生素C酸，50IU青霉素和50μg/ml鏈霉素(LifeTechnologies，Inc.)。一種起源于人軟骨肉瘤的不同的人細胞系(K105)受dr.Sven Inerot，The Salgrenska University Hospital，Gothenburg，Sweden惠贈。K105細胞培養(yǎng)在混合的40％DulbeccosModified Eagle培養(yǎng)基中，其包40％Minimum Essential Media(MEM)alpha培養(yǎng)基，10％營養(yǎng)混合物F1，補充了100nM氫化可的松，100ng/ml胰島素，10％胎牛血清，25μg/ml維生素C酸，50IU青霉素和50μg/ml鏈霉素(Life Technologies，Inc.)。為了收獲細胞，培養(yǎng)盤采用Ca2+/Mg2+-free PBS沖洗3次并且細胞采用0.5％胰蛋白酶和1mM EDTA孵育5min。分離的懸浮于包含1mg/ml胰蛋白酶抑制劑(Sigma)的PBS中并隨后在PBS中清洗。為了去除膜結(jié)合膠原蛋白，細胞采用膠原蛋白酶100U/ml(CLSPA；WorthingtonBiochemicai Corp.，Lancewood，NJ)在PBS，37℃中處理30min并隨后在PBS中清洗。
牛軟骨細胞通過膠原蛋白酶(CLS1；Worthington BiochemicalCorp.，Lacewood，NJ)分解如(10)所述的4-6月大的牛犢的關(guān)節(jié)軟骨而被分離出來。簡言之，軟骨片用膠原蛋白酶在EBSS(Earle’s平衡鹽溶液，GIBCO BRL Gaitersburg，MD)中分解16小時。細胞通過100μm的尼龍過濾器過濾，在含有0.2％BSA(SERVA)的PBS種洗3次。
細胞粘附48-孔組織培養(yǎng)盤(Nunclon，Nunc，Denmark)采用5μg/ml軟骨粘合素在4M鹽酸胍，50mM醋酸鈉，pH 5.8中包被過夜，或?qū)τ谔烊坏鞍踪|(zhì)在PBS中?？商鎿Q的包被是在PBS中5μg/ml膠原蛋白類型II隨后用在PBS中0.5％BSA包被3小時。膠原蛋白類型II從牛鼻軟骨通過胃蛋白酶消化(11)而分離。細菌表達的軟骨粘合素也如上所述分離。在EBNA細胞中表達的重組軟骨粘合素被克隆并且如(8)所述被純化。
為了檢測細胞結(jié)合，軟骨肉瘤細胞或牛軟骨細胞懸浮于包含0.1％BSA，25U/ml膠原蛋白酶的PBS中并被加入孔中(50,000/well)，在缺乏或存在各種多肽庫或合成的多肽(200、100、50、25、12.5μg/ml)的情況下。非粘連細胞在1小時之后被去除而粘附通過檢測溶酶體的N-乙酰葡糖胺糖苷酶(12)而被測定。粘附和擴散通過光學(xué)顯微鏡顯像。在研究時，k105細胞被允許粘著30分鐘，未結(jié)合的細胞被去除而不含有血清，帶有或不帶有多肽(250μg/ml)，β1整合素抗體(clone P4C10，Gibco BRL)，EDTA(5mM)的培養(yǎng)基被加入。細胞形態(tài)在1、3和20小時之后通過光學(xué)顯微鏡顯像。
將軟骨粘合素偶聯(lián)至瓊脂糖重組軟骨粘合素(在每毫升瓊脂糖中有EBNA-細胞中表達的2.5mg重組軟骨粘合素)根據(jù)制造商的說明書被偶聯(lián)至Mini-Leak瓊脂糖(Kem En Tec，A/S，Denmark)。對照瓊脂糖采用相同方式處理而不加入蛋白質(zhì)。
表面標記和膜的制備懸浮于PBS中的人軟骨肉瘤細胞(k105)采用EZ-鏈硫化NHS-LC生物素(Pierce Chemical Co)在終濃度1mg/ml室溫孵育1小時。細胞在含0.1M甘氨酸的PBS中孵育10分鐘以封閉自由生物素，在PBS中洗3次隨后再懸浮并均質(zhì)化于10mM KCl，20mM Tris/HCl，pH7.4，lmM EDTA(1ml/106細胞)中。在1,500g離心5分鐘以去除核，在懸浮液中加入0.15M NaCl并且在50,000g離心30分鐘收集膜片段。沉淀物懸浮于2ml含油8M UREA，2％Triton-X-1000的TBSpH7.4中，補充COMPLET蛋白酶抑制劑(Roche)。溶胞產(chǎn)物在14,000g離心20分鐘而被澄清。
軟骨粘合素結(jié)合蛋白質(zhì)的親和純化軟骨粘合素-和對照瓊脂糖(1ml)被壓入微型柱(Bio-Rad，Hercules，CA)中并采用20體積流動緩沖液(含有6M UREA，1％Triton-X-100的TBS，pH 7.4，補充了COMPLET蛋白酶抑制劑(Roche))平衡。生物素標記了的細胞的溶胞產(chǎn)物兩次通過控制柱，與軟骨粘合素-瓊脂糖孵育過夜采用連續(xù)的末端至末端在4℃混合。軟骨粘合素-的和對照瓊脂糖采用20體積的流動緩沖液清洗并用含0.5M NaCl，6M UREA補充了COMPLET(1ml片段)的TBS pH 7.4洗脫。洗脫的蛋白質(zhì)用乙醇沉淀，再懸浮并且部分材料在37℃下用肝素酶和軟骨素酶ABC消化過夜。未消化和已消化的材料通過SDS-PAGE 4-12％分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF-膜(蓋)，并用在10mM Tris/HCl、pH 7.4、0.15M NaCl和2％Tween(封閉緩沖液)中的2％BSA封閉。生物素-標記的蛋白質(zhì)顯像在與鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1∶5000在封閉緩沖液中)孵育之后通過化學(xué)發(fā)光檢測利用ECL系統(tǒng)(Amersham)顯像。
免疫沉淀生物素-標記的細胞表面材料在固定了的軟骨粘合素上親和純化，用0.5M NaCl洗脫并通過一個脫鹽柱(PD-10，Pharmacia)，用含0.1％triton X-100，補充了COMPLET蛋白酶抑制劑的TBS平衡和洗脫。稀釋的材料與一種粘結(jié)蛋白聚糖-全-抗體(5μg/ml，Rapraeger)孵育過夜并且免疫復(fù)合物采用prot-A-瓊脂糖收集。瓊脂糖采用肝素酶緩沖液(50mM Hepes，50mM NaOAc，150mM NaCl，pH6.5)清洗3次，再懸浮于同樣的緩沖液中并采用肝素酶在37℃消化。免疫沉淀的蛋白質(zhì)和細胞溶胞產(chǎn)物通過SDS-PAGE 10％分離并且電轉(zhuǎn)移至PVDF-膜(蓋)。膜采用在10mM Tris/HCl、pH 7.4、0.15MNaCl和2％Tween中的2％BSA(封閉緩沖液)封閉。免疫沉淀的蛋白質(zhì)在與鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1∶5000在封閉緩沖液中)孵育之后通過化學(xué)發(fā)光檢測利用ECL系統(tǒng)(Amersham)顯像。k105細胞表達的粘結(jié)蛋白聚糖的檢測采用粘結(jié)蛋白聚糖-全-抗體(1μg/ml，Rapraeger)，抗兔HRP(DAKO)抗體和利用ECL系統(tǒng)(Amersham)的化學(xué)發(fā)光檢測。
細胞粘附，實施例II進行下列實驗是為了測定抑制細胞粘附的能力。
研究設(shè)計組織培養(yǎng)盤(48-孔)采用5microg/ml表達在E.Coli中的軟骨粘合素包被并且用BSA封閉非特異性的結(jié)合。K 105細胞懸浮于包含0.1％BSA，25U/ml膠原蛋白酶的PBS中并且在要檢測的合成多肽的存在下加入孔(50,000/孔)中并允許在37℃中粘著1小時。非粘著細胞通過清洗去除，而粘附作用通過分析溶酶體的己糖胺酶而測定。
軟骨外植體下列實驗檢測在IL-1刺激的軟骨中釋放的NO上多肽的作用。
研究設(shè)計一個去皮的牛鼻子(來自18-24月大的牛)在Horby屠宰場(Team Ugglarp，Sweden)收集。鼻內(nèi)的中隔被切除而粘膜和軟骨膜在軟骨被放置在含有PEST(100IU青霉素，100μg/ml鏈霉素)和2.5μg/ml兩性霉素B(所有來自Invitrogen，Sweden)的PBS中室溫2小時之前被去除。
2mm的小片從軟骨取出。每片放置在一個24-孔細胞培養(yǎng)板(Falcon，Sweden)中，板中包含1ml細胞培養(yǎng)基，HAMs F12(Invitrogen，Sweden)補充了10μg/ml BSA、25mg/ml抗壞血酸(兩者都來自Sigma，Sweden)、PEST(100IU青霉素，100mg/ml鏈霉素)以及2.5μg/ml兩性霉素B。24小時之后，更換培養(yǎng)基而軟骨片用人重組IL-1a，10ng/ml(Roche，Sweden)刺激。多肽在20和400μM三個一組進行檢測。軟骨組織被孵育又一個6天，培養(yǎng)基每3天一換。每次都收集培養(yǎng)基檢測NO(Griess反應(yīng))。
滑液成纖維細胞以下實驗檢測在IL-1刺激的滑膜細胞釋放的IL-6。
研究設(shè)計來自抗原引發(fā)的關(guān)節(jié)炎的鼠，過度增殖的滑膜，血管翳，在疾病開始之后4天從發(fā)炎的膝蓋中取出。血管翳組織在37℃，5％CO2中孵育在膠原蛋白酶(400U/ml，Worthington，USA)中3小時之前，在帶有PEST(100IU青霉素，100μg/ml鏈霉素)和兩性霉素B(2.5μg/ml)(都來自InVitrogen，Sweden)的PBS中被切成小片。細胞被離心(8min.，rt，1100rpm.)并懸浮于RPMI 1640中，其補充了10％FCS(InVitrogen，Sweden)，PEST和兩性霉素B并且將細胞接種在一個25cm2長頸瓶在37℃，5％CO2中。隨后的一天，細胞用培養(yǎng)基洗一次并且繼續(xù)孵育。在融合時，細胞用胰蛋白酶處理1分鐘(0.25％胰蛋白酶加上EDTA，InVitrogen，Sweden)，計數(shù)并接種于96孔板，10000細胞/孔/200μl。
24小時之后，更換培養(yǎng)基并且細胞用人重組IL-la，50ng/ml(Roche，Sweden)刺激。待研究的多肽以濃度間隔50-400μM三個一組進行檢測。在37℃，5％CO2中孵育72小時之后，收集培養(yǎng)基檢測NO(Griess反應(yīng))而IL-6通過ELISA按照制造商的說明書(BDBiosciences，USA)進行分析。
在體內(nèi)抗原引發(fā)的關(guān)炎以下模型實驗利用抗原引發(fā)的關(guān)節(jié)炎檢測待研究的化合物對膝關(guān)節(jié)腫脹的作用。
評估了局部給藥待測化合物，400mM每天兩次，對鼠中m-BSA抗原引發(fā)的單純關(guān)節(jié)炎發(fā)展進程中的作用。
采用鹽或氨甲喋呤處理的動物(在臨床意義上的劑量)被用作對照。
研究設(shè)計采用重量為大約150g(B&K breeding center，Denmark)的雌性Dark Agouti鼠。動物在尾巴根部皮內(nèi)注入溶解在50mg鹽水并乳化于50ml Freund’s完全佐劑中的(Sigma F 5881)1mgmBSA(Sigma A-1009)。10天以后鼠被剃毛(左膝蓋)并在關(guān)節(jié)內(nèi)進行免疫實驗(i.a)，注射溶解于50ml鹽水中的50mg mBSA。待測化合物在進行免疫實驗之前4小時在50ml鹽水中而被施加至關(guān)節(jié)內(nèi)(左膝)并且之后一天兩次。關(guān)節(jié)炎(膝蓋直徑)的發(fā)展通過一臺odimeter/測徑器記錄。上述過程通過在安氟烷麻醉下進行。動物在免疫實驗/第一次治療之后4天被處死。
結(jié)果合成多肽侯選多肽被合成并采用Schafer-N，Denmark的逆相色譜進行純化。最優(yōu)選的多肽序列位于表1中，其中環(huán)化用方括弧[]表示，H-代表N-末端，而-OH代表C-末端，即未保護的氨基酸末端。
表1、優(yōu)選多肽序列的列表
圖1、K9細胞粘附至選擇的基質(zhì)成分。
48-孔組織培養(yǎng)盤采用5μg/ml膠原蛋白類型II，組織提取的牛軟骨粘合素，表達在EBNA細胞中的人軟骨粘合素和表達在E-coli中的人軟骨粘合素包被并且用BSA封閉非特異性結(jié)合。細胞在37℃允許粘附1小時。未粘附的細胞通過清洗去除而粘附通過分析溶酶體的N-乙酰葡糖胺糖苷酶而測定。粘附在大多數(shù)細胞中表達，50,000細胞/孔被接種。
如圖1所示，細胞粘附在各種基質(zhì)上都同樣好。明顯地，EBNA細胞表達的天然軟骨粘合素顯示的粘附特性實際上與細菌表達的大多數(shù)可能未折疊的蛋白質(zhì)相同，因為包被是在4M鹽酸胍變性的條件下進行的并且由于半胱氨酸殘基被N-乙基馬來酰亞胺封閉而沒有二硫鍵。因此結(jié)合最可能是由線性序列來節(jié)導(dǎo)。
圖2、軟骨粘合素片段的分離和通過多肽庫抑制細胞結(jié)合。
表達在EBNA-細胞中的重組軟骨粘合素(1mg)采用內(nèi)蛋白酶Lys-C分解并且在一臺Sephasil C8柱上采用SMARTTM系統(tǒng)(Pharmacia)片段化。流出液在280nm進行檢測并且片段如圖2A(P1-P11)所示被收集成庫。多肽庫被凍干并且溶解于PBS中并用于抑制實驗。48-孔組織培養(yǎng)盤采用5μg/ml E-coli中表達的軟骨粘合素包被并且用BSA封閉非特異性結(jié)合。細胞(50,000細胞/孔)在多肽庫P1-P11(見圖2B)的存在下被允許在37℃下粘附1小時。未粘附的細胞通過清洗去除，而粘附通過分析溶酶體的N-乙酰葡糖胺糖苷酶而檢測。粘附至膠原蛋白類型II作為陽性對照而粘附至BSA包被的孔作為陰性對照。多肽庫的抑制作用被測定并且發(fā)現(xiàn)P7在抑制細胞粘附至軟骨粘合素中效果最強烈。
在P7中鑒別蛋白片段MALDI-TOF MS被用于鑒別和測定P7中軟骨粘合素片段的分子質(zhì)量。被鑒別的多肽列于表I中。
表I、來自P7的軟骨粘合素片段
通過比較存在于Glu-C消化的重組軟骨粘合素(數(shù)據(jù)未視出)的片段中的多肽，多肽1947.01被選作細胞結(jié)合的最佳侯選者。
圖3、K105細胞對軟骨粘合素的粘附，用多肽CQLRGLRRWLEAK抑制。
一個12-mer多肽(1947.01)加上一個N-末端半胱氨酸(CQLRGLRRWLEAK)代表通過質(zhì)譜法鑒別序列的侯選者，其被合成并且測定其抑制細胞粘附的能力。組織培養(yǎng)盤采用5μg/ml表達在E.coli中的軟骨粘合素包被并且用BSA封閉非特異性結(jié)合。細胞懸浮于包含0.1％BSA，25U/ml膠原蛋白酶的PBS中并在合成多肽(200、100、50、25、12.5μg/ml)存在下加入孔(50,000/孔)中并在37℃下被允許粘附1小時。未粘附的細胞通過清洗去除，粘附通過分析溶酶體的己糖胺酶而測定。
粘附在大多數(shù)細胞表達，數(shù)據(jù)代表兩個孔的平均。獨立實驗具有相似的結(jié)果。圖3表明k105細胞與軟骨粘合素的粘附以一種劑量依賴的方式降低在12-mer多肽數(shù)量上升的情況下。該多肽因而包含一種細胞結(jié)合序列。
圖4、軟骨粘合素肝素-結(jié)合和肝素-結(jié)合多肽的鑒別。
表達于EBNA-細胞中的重組軟骨粘合素(10 or 100μg)通過肝素-瓊脂糖-柱(Pharmacia)。清洗柱并用PBS中的2M NaCl洗脫。洗脫的材料在SDS-PAGE(10％)上分離并采用一種軟骨粘合素抗體通過Wstern印記(western blot)檢測(見圖4)。在36kDa的帶代表軟骨粘合素在72kDa的帶代表軟骨粘合素的二聚體。發(fā)現(xiàn)軟骨粘合素確實與肝素-瓊脂糖結(jié)合。
侯選多肽CKFPTKRSKKAGRH(SEQ ID No7)被合成。多肽結(jié)合肝素的能力在肝素-瓊脂糖上確定，其中用0.5、1和2M NaCl洗脫的材料通過MALDI-TOF MS鑒別(數(shù)據(jù)未示出)。
圖5、加入或未加入兩種與不同表面結(jié)構(gòu)相互作用的細胞結(jié)合多肽的情況下K105細胞與人軟骨粘合素的粘附。
組織培養(yǎng)盤用5μg/ml在E.Coli中表達的軟骨粘合素或膠原蛋白類型II包被并用BSA封閉非特異性結(jié)合。細胞(50,000/孔)懸浮于包含0.1％BSA，25U/ml膠原蛋白酶的PBS中并在存在或缺乏合成多肽(250μg/ml)的情況下加入孔中，在37℃被允許粘附1小時。未粘附的細胞通過清洗去除。擴散通過光學(xué)顯微鏡顯像，而粘附通過分析溶酶體的己糖胺酶測定。粘附在大多數(shù)細胞表達，數(shù)據(jù)代表兩個孔的平均。獨立實驗具有相似的結(jié)果。如圖5所示，細胞(k105)粘附至軟骨粘合素在250μg/ml的12-mer多肽(CQLRGLRRWLEAK)存在下降低而粘附和擴散在250μg/ml的13-mer肝素結(jié)合多肽(CKFPTKRSKKAGRH，SEQ ID No7)存在下提高。與膠原蛋白類型II的粘附?jīng)]有被任何這兩種多肽明顯影響。數(shù)據(jù)清楚的表明在軟骨粘合素中有兩個特異的細胞結(jié)合區(qū)域。一個由肝素結(jié)合多肽代表而一個由表面的整合素結(jié)合多肽代表。
圖6、在加入或不加入細胞結(jié)合多肽的情況下牛軟骨細胞與人軟骨粘合素的粘附。
組織培養(yǎng)盤用5μg/ml在E.Coli中表達的軟骨粘合素或膠原蛋白類型II包被并用BSA封閉非特異性結(jié)合。牛軟骨細胞(100,000/孔)懸浮于包含0.1％BSA，25U/ml膠原蛋白酶的PBS中并在存在或缺乏合成多肽(250μg/ml)的情況下加入孔中，在37℃被允許粘附1小時。未粘附的細胞通過清洗去除。擴散通過光學(xué)顯微鏡顯像，而粘附通過分析溶酶體的己糖胺酶測定。粘附在大多數(shù)細胞表達，100,000細胞/孔被接種。如圖6所示，牛軟骨細胞與軟骨粘合素的粘附在12-mer多肽(CQLRGLRRWLEAK)的存在下降低而在13-mer肝素結(jié)合多肽(CKFPTKRSKKAGRH，SEQ ID No7)的存在下提高。該多肽與它的細胞表面分子的結(jié)合包括提高細胞表面受體活性的信號。
圖7、K105細胞與軟骨粘合素的粘附，細胞結(jié)合多肽在粘著細胞上的作用。
組織培養(yǎng)盤用5μg/ml在E.Coli中表達的軟骨粘合素包被并用BSA封閉非特異性結(jié)合。K105細胞懸浮于包含0.1％BSA的PBS中并加入孔中(50,000/孔)。未粘附的細胞在30分鐘后通過清洗去除，不帶有血清的培養(yǎng)基加上或不加上多肽(250μg/ml)而被加入并且結(jié)合細胞在1、3和20小時之后通過光學(xué)顯微鏡顯像。圖7顯示，12-mer多肽(CQLRGLRRWLEAK)刺激細胞集合而擴散和遷移在13-mer肝素結(jié)合多肽(CKFPTKRSKKAGRH，SEQ ID No7)的存在下提高。
圖8、K105細胞與細胞結(jié)合多肽的粘附。
組織培養(yǎng)盤用33μg/ml(20μM)多肽溶液包被。細胞(50,000/孔)懸浮于包含0.1％BSA，25U/ml膠原蛋白酶的PBS中并在存在或缺乏合成多肽(250μg/ml)的情況下加入孔中，在37℃被允許粘附1小時。未粘附的細胞通過清洗去除。擴散通過光學(xué)顯微鏡顯像。
圖8顯示平鋪在多肽CQLRGLRRWLEAK上的細胞粘著并且保持圓形而粘附作用在溶液中同樣多肽的存在下被抑制。平鋪在多肽CKFPTKRSKKAGRH，SEQ ID No7上的細胞，粘著并擴散但是該多肽在待測濃度時并不能抑制粘附作用。因而表現(xiàn)出與類肝素硫酸鹽結(jié)合多肽的結(jié)合被認為更加緊密或者與該多肽的結(jié)合改變細胞行為。
圖9、K105細胞與軟骨粘合素的粘附，確定在抑制多肽中更短的關(guān)鍵氨基酸序列。
組織培養(yǎng)盤用5μg/ml在E.Coli中表達的軟骨粘合素包被并用BSA封閉非特異性結(jié)合。細胞懸浮于包含0.1％BSA的PBS中并加入孔中(50,000/孔)。未粘附的細胞在30分鐘后通過清洗去除，不帶有血清的培養(yǎng)基加上或不加上多肽(250μg/ml)而被加入并且結(jié)合細胞在1、3和20小時之后通過光學(xué)顯微鏡顯像。如圖9所示，多肽QLRGLRRWLEAK(SEQ ID No3)和LRRWLEAK(SEQ ID No2)同樣防止擴散并誘導(dǎo)細胞形成集合而多肽QLRGLRRW對細胞的擴散和遷移沒有作用。整合素結(jié)合活性位于涉及WLEAK(SEQ ID No1)序列的C-末端8個殘基。
圖10、K105細胞與軟骨粘合素的粘附，β1整合素抗體和EDTA在粘著細胞上的作用。
組織培養(yǎng)盤用5μg/ml在E.Coli中表達的軟骨粘合素包被并用BSA封閉非特異性結(jié)合。K105細胞懸浮于包含0.1％BSA的PBS中并加入孔中(50,000/孔)。未粘附的細胞在30分鐘后通過清洗去除，多肽，抗β1抗體，5mM EDTA或不含血清的空白培養(yǎng)基被加入并且結(jié)合的細胞在1和3小時之后通過光學(xué)顯微鏡顯像。圖10顯示，多肽CQLRGLRRWLEAK和抗β1抗體防止擴散和細胞形成集合而加入導(dǎo)致細胞分開。
圖11、在k105細胞上軟骨粘合素結(jié)合膜蛋白多糖。
在人軟骨肉瘤細胞(K105)上的細胞表面蛋白質(zhì)被生物素表記并且在尿素中在軟骨粘合素-瓊脂糖上親和純化。結(jié)合的材料用0.5MNaCl洗脫，在SDS-PAGE(4-12％)上分離并在肝素酶和軟骨素酶ABC治療之前和之后用Western blot檢測。在獨立的實驗中，通過僅僅用肝素酶分解而獲得了相似的結(jié)果(見圖11)。在酶分解之后正向遷移對應(yīng)于50-60kDa左右的成分對應(yīng)于沒有采用酶處理的250kDa標記以上發(fā)現(xiàn)的類肝素硫酸鹽蛋白多糖。
圖12、軟骨粘合素結(jié)合蛋白質(zhì)與全-粘結(jié)蛋白聚糖抗體的免疫沉淀。
人軟骨肉瘤細胞(K105)用生物素進行表面標記并且膜被提取采用固定化的軟骨粘合素清洗和親和純化。結(jié)合的材料用0.5M NaCl洗脫并用一種粘結(jié)蛋白聚糖-全-抗體免疫沉淀，通過SDS-PAGE(10％)分離并且鏈霉抗生物素蛋白HRP和ECL系統(tǒng)通過Western blot檢測。如圖12A所示，來自軟骨粘合素-柱洗脫的材料中大約50kDa(肝素酶之后)抗體免疫沉淀的蛋白質(zhì)帶在對照柱中沒有明顯的帶被檢測到(見圖12B)。
K105細胞表達的粘結(jié)蛋白聚糖用粘結(jié)蛋白聚糖-全-抗體進行檢測(肝素酶之后)(見圖12B)。膜蛋白質(zhì)用SDS-PAGE(10％)分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用全-抗體孵育并采用抗兔HRP抗體和ECL系統(tǒng)檢測。K105細胞顯示出表達粘結(jié)蛋白聚糖1、2、3和4。結(jié)合至軟骨粘合素的成分代表粘結(jié)蛋白聚糖3。
圖13、檢測抑制細胞粘附，實施例II。
該圖顯示環(huán)狀多肽，H-[CQLRGLRRWLEAKASRPDATC]-OH ID No9)，和相應(yīng)的保護多肽Ac-[CQLRGLRRWLEAKASRPDATC]-NH2(SEQ ID No12)，
對細胞的粘附顯示出抑制作用。
圖14、軟骨外植體檢測。
濃度400μM的SEQ ID 9能夠降低從IL-1刺激的軟骨外植體的NO-釋放。
圖15、滑液成纖維細胞和IL-6的釋放。
SEQ ID 9能以一種劑量依賴的方式降低IL-6從IL-1刺激的滑膜細胞的釋放。
圖16、體內(nèi)抗原引發(fā)的關(guān)節(jié)炎。
局部給藥多肽SEQ ID 9與鹽水處理的動物相比降低了膝關(guān)節(jié)的腫脹。疾病-減輕的效果與用氨甲喋呤治療的效果相同。
討論來自軟骨粘合素的整合素-結(jié)合片段鑒別了一種以劑量依賴的方式抑制細胞粘附至完整蛋白質(zhì)的軟骨粘合素多肽(CQLRGLRRWLEAK)。細胞粘附至軟骨粘合素是通過整合素α2β1的介導(dǎo)，其中粘附表現(xiàn)出是通過它的I-區(qū)域(9)介導(dǎo)。
在目的是為了鑒別結(jié)合是否是通過線性序列介導(dǎo)的實驗中，顯示人軟骨肉瘤細胞(K9)對天然或未折疊的軟骨粘合素的結(jié)合是一樣的。這為線性多肽序列介導(dǎo)結(jié)合提供了有力證據(jù)，促進了結(jié)構(gòu)的研究。利用由細菌表達的缺乏取代基的軟骨粘合素進一步支持結(jié)合是通過不涉及轉(zhuǎn)錄后修飾的多肽介導(dǎo)的理論。知道了一個線性多肽序列涉及結(jié)合，設(shè)計了一個策略，基于蛋白水解酶對EBNA細胞表達的蛋白質(zhì)的裂解采用兩種不同的蛋白酶至少在一種情況下維持活性結(jié)構(gòu)。所產(chǎn)生的多肽被片段化并用于抑制細胞與完整的蛋白質(zhì)的結(jié)合?；钚远嚯牟捎肕ALDITOF質(zhì)譜法鑒別。
采用該原則，顯示出以一種劑量依賴的方式抑制細胞(k105)結(jié)合的多肽CQLRGLRRWLEAK被鑒別。粘附至多肽CQLRGLRRWLEAK的細胞在粘附在完整的蛋白質(zhì)上被觀察時保持圓形。該13殘基長多肽應(yīng)該保留有一個更短的氨基酸鏈直至能結(jié)合受體。為了驗證該問題兩個重疊的多肽，CQLRGLRR和LRRWLEAK(SEQ ID No2)被合成。在平鋪于固定化的軟骨粘合素上的細胞加入多肽并發(fā)現(xiàn)LRRWLEAK(SEQID No2)類似于CQLRGLRRWLEAK可防止擴散和誘導(dǎo)細胞形成集合。這些結(jié)果表明細胞結(jié)合的活性是位于涉及WLEAK(SEQ ID No1)序列的序列之中C-末端的8個殘基。
幾個報道描述了具有能阻斷一種基質(zhì)蛋白質(zhì)和一種特異的整合素之間粘附作用的短多肽的發(fā)現(xiàn)。許多多肽被發(fā)現(xiàn)處于雙整合素的環(huán)結(jié)構(gòu)中，例如MLD(EC3B和EC6A)、VGD(EC3A)(13)和RGD(在幾個雙整合素中)、純化自毒蛇E.Carinatus的毒液中。α9和α4亞基結(jié)構(gòu)相似并且都識別VCAM-1作為配體。一種MLDG的結(jié)構(gòu)域單元被發(fā)現(xiàn)于雙整合素EC3和EC6中，抑制α9β1和α4β1粘附至VCAM-1然而破壞α9轉(zhuǎn)染的細胞粘附至VCAM-1的濃度顯示對其他α9β1配體，骨橋蛋白和固生蛋白-C(13)具有很小的作用或沒有作用。多肽SSVYGLR和AEIDGIEL之前顯示出能抑制與骨橋蛋白和固生蛋白-C的結(jié)合(14)而另一方面對α9β1粘附至VCAM-1沒有作用。另一多肽RRETAWA直接競爭α5β1與RGD-包含纖連蛋白片段的結(jié)合(15)。CPCFLLGCC-多肽抑制β2粘附至ICAM-1以及von Willebrand因子(16)。當固定在塑料支持物上時β2整合素與白細胞粘附但不是β1或β3整合素-介導(dǎo)的細胞粘附。在血管損傷位點暴露在ICAM-1和yon Willebrand因子上的LLG序列被認為在結(jié)合白細胞中起到作用并有可能被用于針對炎癥反應(yīng)的藥物中。
CHAD與細胞的α2β1相互作用通過調(diào)節(jié)基質(zhì)蛋白質(zhì)的合成而對細胞的表型具有更特異的作用(數(shù)據(jù)未示出)并且明顯阻斷細胞分裂和遷移。這種表型不同于由膠原蛋白II結(jié)合誘導(dǎo)的表型對于在成人軟骨中維持軟骨的作用是關(guān)鍵的。這將首先涉及修復(fù)和T細胞外的基質(zhì)的改裝，其連續(xù)暴露以負擔有效處理的需要。還有可能α2β1整合素的活性在防止細胞死亡中起作用，如通過研究T-淋巴細胞所指示的(Gendron，S.，Couture，J.，Aoudjit，F(xiàn).；整合素α2β1通過蛋白質(zhì)磷酸酶2A-依賴的MAPK/ERK通路活性抑制Fas-介導(dǎo)的T-淋巴細胞凋亡，J.Biol.Chem 2003，Sept 17)。
軟骨粘合素的肝素結(jié)合片段序列分析鑒別的軟骨粘合素C-末端部分中的基本氨基酸簇顯示出肝素-結(jié)合特性。這導(dǎo)致調(diào)查是否軟骨粘合素能結(jié)合肝素。重組軟骨粘合素被發(fā)現(xiàn)結(jié)合肝素而侯選多肽(aa346)CKFPTKRSKKAGRH(aa359)，SEQ ID No7，被合成并顯示結(jié)合肝素。起作用的受體被鑒別為粘結(jié)蛋白聚糖3。
整合素是被最特征化的粘附受體家族但是粘結(jié)蛋白聚糖目前被認識到是重要的細胞表面粘附共-受體，其能活躍的參與粘附和信號(1、2)。多肽(aa346)CKFPTKRSKKAGRH(aa359)，SEQ ID No7，已發(fā)現(xiàn)在體外對于細胞粘附，擴散和遷移具有刺激作用。在細胞粘附上的相似效果已在(PMA)治療之后顯示(3、9、4、5)。PMA已知能激活蛋白激酶C信號并且因此在涉及粘結(jié)蛋白聚糖4和整合素s的進程中刺激粘附和擴散(3)。
間充質(zhì)細胞利用粘結(jié)蛋白聚糖而粘附至ADAM 12和β1整合素以誘導(dǎo)擴散(6)。
軟骨粘合素在組織中存在兩種形式，其中一種形式缺少9個最后氨基酸，功能差異未知(Neame PJ，Sommarin Y，Boynton RE，Heinegard D.，J Biol Chem.1994 Aug 26；269(34)21547-54.)。肝素結(jié)合多肽CKFPTKRSKKAGRH，SEQ ID No7，其相應(yīng)于這部分軟骨粘合素被合成。
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序列表SEQUENCE LISTING<110>AnaMar Medical AB(安娜瑪醫(yī)藥有限公司)<120>Modulation of cartilage homeostasis by active domains of cell binding extracellular matrixmolecules(軟骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié))<130>P10799<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Trp Leu Glu Ala Lys1 5<210>2<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Leu Arg Arg Trp Leu Glu Ala Lys1 5<210>3<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens
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Ash Arg Leu Asn Gln Leu Pro Ser Asn Phe Pro Phe Asp Ser Leu Glu260 265 270Thr Leu Ala Leu Thr Asn ASh Pro Trp Lys Cys Thr Cys Gln Leu Arg275 280 285Gly Leu Arg Arg Trp Leu Glu Ala Lys Ala Ser Arg Pro Asp Ala Thr290 295 300Cys Ala Ser Pro Ala Lys Phe Lys Gly Gln His Ile Arg Asp Thr Asp305 310 315 320Ala Phe Arg Ser Cys Lys Phe Pro Thr Lys Arg Ser Lys Lys Ala Gly325 330 335Arg His<210>9<211>21<212>PRT<213>homo sapiens<400>9Cys Gln Leu Arg Gly Leu Arg Arg Trp Leu Glu Ala Lys Ala Ser Arg1 5 10 15Pro Asp Ala Thr Cys20<210>10<211>52<212>PRT<213>homo sapiens<400>10Ser Leu Glu Thr Leu Ala Leu Thr Ash Ash Pro Trp Lys Cys Thr Cys1 5 10 15Gln Leu Arg Gly Leu Arg Arg Trp Leu Glu Ala Lys Ala Ser Arg Pro20 25 30Asp Ala Thr Cys Ala Ser Pro Ala Lys Phe Lys Gly Gln His Ile Arg35 40 45Asp Thr Asp Ala50
<210>11<211>14<212>PRT<213>homo sapiens<400>11Gln Leu Arg Gly Leu Arg Arg Trp Leu Glu Ala Lys Ala Ser1 5 10<210>12<211>21<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
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<221>MOD_RES<222>(21)..(21)<223>AMIDATION<400>12Cys Gln Leu Arg Gly Leu Arg Arg Trp Leu Glu Ala Lys Ala Ser Arg1 5 10 15Pro Asp Ala Thr Cys20<210>13<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Cys Trp Leu Glu Ala Lys Cys1 5
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<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>ACETYLATION<220>
<221>MOD_RES<222>(14)..(14)<223>AMIDATION<400>15Cys Lys Phe Pro Thr Lys Arg Ser Lys Lys Ala Gly Arg His1 5 10<210>16<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>16Cys Lys Arg Ser Lys Lys Cys1 權(quán)利要求
1.一種具有下列通式(I)的線性或環(huán)狀多肽的用途，所述通式(I)為P1-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-xa-xb-xc-xd-K-y1-y2-y3-y4-y5-y6-y7-y8-P2其中xa選自W、K或Y，xb選自L或R，xc選自E或S，xd選自A、K、D或E，x1選自C或缺少，x2選自Q或缺少，x3選自L或缺少，x4選自R、C或缺少，x5選自G、K或缺少，x6選自L、F或缺少，x7選自R、P或缺少，x8選自R、C、T或缺少，y1選自A、C或缺少，y2選自S、G或缺少，y3選自R或缺少，y4選自P、H或缺少，y5選自D或缺少，y6選自A或缺少，y7選自T或缺少，y8選自C或缺少，以及其中P1和P2為缺少或一個保護基團，在制造用于治療和/或診斷與炎癥介導(dǎo)的軟骨損傷相關(guān)的疾病的藥劑中的用途，例如一種關(guān)節(jié)炎癥疾病，諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病的關(guān)節(jié)炎、幼年慢性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、傳染性關(guān)節(jié)炎和幼年自發(fā)性關(guān)節(jié)炎，其它涉及關(guān)節(jié)機構(gòu)的疾病例如骨關(guān)節(jié)炎、半月板的損傷、痛風(fēng)，影響肌骨骼系統(tǒng)的疾病例如肌腱損傷、韌帶損傷，和骨疾病例如骨質(zhì)疏松癥，影響主動脈的疾病包括動脈粥樣硬化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中P1為乙?；蛉鄙?，而P2為一種氨基或缺少。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中x2-x3選自Q-L或缺少，而y5-y6-y7是D-A-T或缺少。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中x4-x5-x6-x7選自R-G-L-R，C-K-F-P或缺少，而y2-y3-y4選自S-R-P、G-R-H或缺少。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是KRSKK(SEQ ID No.4)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是CKRSKKC(SEQ ID No.16)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是KFPTKRSKKAGRH(SEQ ID No.6)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是CKFPTKRSKKAGRH(SEQ ID No.7)或其保護形式(SEQ IDNo.15)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中xa選自W或T并且xb是L，xc是E并且xd選自A或E。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中xa是W并且xb是L，xc是E并且xd是A。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是WLEAK(SEQ ID No.1)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是LRRWLEAK(SEQ ID No.2)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是QLRGLRRWLEAK(SEQ ID.No.3)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是QLRGLRRWLEAKAS(SEQ ID.No.11)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是CWLEAKC(SEQ ID.No.13)。
16.根據(jù)權(quán)利要求10的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是CQLRGLRRWLEAKASRPDATC(SEQ ID No.9)或其保護形式(SEQ IDNo.12)。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中通式I是CQLRGLRRWLEAKC(SEQ ID No.14)。
18.根據(jù)權(quán)利要求3～17任一的一種線性或環(huán)狀多肽的用途，其中所述多肽為環(huán)狀。
19.一種具有通式(I)的線性或環(huán)狀多肽，所述通式(I)為P1-x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-xa-xb-xc-xd-K-y1-y2-y3-y4-y5-y6-y7-y8-P2，其中xa選自W、K或Y，xb選自L或R，xc選自E或S，xd選自A、K、D或E，x1選自C或缺少，x2選自Q或缺少，x3選自L或缺少，x4選自R、C或缺少，x5選自G、K或缺少，x6選自L、F或缺少，x7選自R、P或缺少，x8選自R、C、T或缺少，y1選自A、C或缺少，y2選自S、G或缺少，y3選自R或缺少，y4選自P、H或缺少，y5選自D或缺少，y6選自A或缺少，y7選自T或缺少，y8選自C或缺少，以及其中P1和P2為缺少或一個保護基團。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求19的一種線性或環(huán)狀多肽，其中P1為乙酰基或缺少，而P2為一種氨基或缺少。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的一種線性或環(huán)狀多肽，其中x2-x3選自Q-L或缺少，而y5-y6-y7是D-A-T或缺少。
22.根據(jù)權(quán)利要求19～21任一的一種線性或環(huán)狀多肽，其中x4-x5-x6-x7選自R-G-L-R、C-K-F-P或缺少，而y2-y3-y4選自S-R-P、G-R-H或缺少。
23.根據(jù)權(quán)利要求19～21任一的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是KRSKK(SEQ ID No.4)。
24.根據(jù)權(quán)利要求19～21任一的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是CKRSKKC(SEQ ID No.16)。
25.根據(jù)權(quán)利要求19～21任一的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是KFPTKRSKKAGRH(SEQ ID No.6)。
26.根據(jù)權(quán)利要求19～21任一的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是CKFPTKRSKKAGRH(SEQ ID No.7)或其保護形式(SEQ IDNo.15)。
27.根據(jù)權(quán)利要求19～21任一的一種線性或環(huán)狀多肽，其中xa選自W或T并且xb是L，xc是E并且xd選自A或E。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的一種線性或環(huán)狀多肽，其中xa是W并且xb是L，xc是E并且xd是A。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是WLEAK(SEQ ID No.1)。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是LRRWLEAK(SEQ ID No.2)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是QLRGLRRWLEAK(SEQ ID No.3)。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是QLRGLRRWLEAKAS(SEQ ID No.11)。
33.根據(jù)權(quán)利要求28的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是CWLEAKC(SEQ ID No.13)。
34.根據(jù)權(quán)利要求28的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是CQLRGLRRWLEAKASRPDATC(SEQ ID No.9)或其保護形式(SEQ IDNo.12)。
35.根據(jù)權(quán)利要求28的一種線性或環(huán)狀多肽，其中通式(I)是CQLRGLRRWLEAKC(SEQ ID No.14)。
36.根據(jù)權(quán)利要求21～35任一的一種線性或環(huán)狀多肽，其中所述多肽為環(huán)狀。
37.一種如權(quán)利要求19～36任一所限定的線性或環(huán)狀多肽在醫(yī)藥中的用途。
38.一種藥物組合物，其包括如權(quán)利要求19～36任一所限定的線性或環(huán)狀多肽并加上一種或更多添加劑、載體或賦形劑。
39.一種在體內(nèi)治療和/或預(yù)防炎癥介導(dǎo)的軟骨損傷的方法，例如，一種關(guān)節(jié)炎癥疾病，諸如患者的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病的關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎，該方法包括為患者施加一種其需要的有效劑量的、如權(quán)利要求19-36任一所限定的化合物或如權(quán)利要求38所限定的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種線性或環(huán)狀多肽以及所述多肽在醫(yī)藥中的用途，并且尤其是制造用于治療和/或預(yù)防與炎癥介導(dǎo)的軟骨損傷相關(guān)的疾病的藥劑，例如，一種關(guān)節(jié)炎癥疾病，諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病的關(guān)節(jié)炎、幼年慢性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、傳染性關(guān)節(jié)炎和幼年自發(fā)性關(guān)節(jié)炎，其它涉及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的疾病，諸如骨關(guān)節(jié)炎、半月板的損傷、痛風(fēng)，影響肌骨骼系統(tǒng)結(jié)構(gòu)元素的疾病，諸如肌腱損傷，韌帶損傷，以及骨骼疾病諸如骨質(zhì)疏松癥，影響主動脈的疾病包括動脈粥樣硬化。根據(jù)本發(fā)明的線性或環(huán)狀多肽的最小核心序列是[WKY]－[LR]－[ES]－[AKDE]－K，包括多肽，例如，WLEAK、LRRWLEAK、QLRGLRRWLEAK、QLRGLRRWLEAKAS、CQLRGLRRWLEAKASRPDATC、CQLRGLRRWLEAKC、CWLEAKC、KRSKK、CKRSKKC、KFPTKRSKKAGRH和CKFPTKRSKKAGRH。
文檔編號A61P19/02GK1950102SQ200580013901
公開日2007年4月18日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者迪克·海涅高, 利斯貝特·阿涅塔·坎珀 申請人:安娜瑪醫(yī)藥有限公司