專利名稱：醫(yī)用全氟化合物乳劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物物理學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及用于治療血液喪失、缺氧和缺血病癥的藥物，以及用于改善血液氧運輸和保存分離的灌流器官和組織的藥物。
縮寫、參考符號、單位和術(shù)語列表表面活性劑表面活性物質(zhì)P-268、F-268 Proxanol 268、Pluronic 268PFD 全氟萘烷PFMHP 全氟甲基環(huán)己基哌啶PFOB 全氟辛基溴Fl代表全氟三丙胺及其副產(chǎn)物順式和反式異構(gòu)體全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的混合物的有機(jī)液體。
PFCs 氟碳化合物PFTBA 全氟三丁胺PFTPA(PAF-3) 全氟三丙胺大豆-P大豆磷脂卵-P 卵磷脂n 波長指數(shù)Cv氟碳化合物在乳劑中的體積含量(ml/dl)a 平均粒徑λ波長Ip反應(yīng)原性指數(shù)成功開發(fā)含有氟碳化合物乳劑的灌流介質(zhì)的關(guān)鍵主要取決于所選擇的PFC以及基于這些PFC的乳劑的理化性質(zhì)和制備方法。
醫(yī)用PFC代表不同類的氟碳化合物。它們在外觀上為無色無味的澄清液體，密度很高，約為水的兩倍。異常強(qiáng)的C-F鍵(485.6KJ/mol)使這些化合物的分子間力非常弱。弱的分子間力表現(xiàn)在它們?nèi)芙鈿怏w包括血液氣體的異常強(qiáng)的能力。
PFC的強(qiáng)的C-F鍵使得其具有化學(xué)惰性的特征。它們難溶于水，不能形成在生物體中代謝的基礎(chǔ)。PFC的化學(xué)惰性不能等于其生物學(xué)惰性。靜脈內(nèi)注射PFC基乳劑后，這些乳劑保留在器官和組織中，其停留時間取決于PFC的性質(zhì)和乳劑的劑量。
對不同類的全氟化合物的生物學(xué)性質(zhì)的研究表明其消除速率取決于一系列相關(guān)的理化參數(shù)，即取決于結(jié)構(gòu)和分子量、沸點、蒸氣壓和在己烷中的臨界溶解溫度(T臨界)。T臨界是待測化合物與己烷相等體積混合的溫度。T臨界被認(rèn)為是PFC在脂質(zhì)中相對溶解度的值，該值表征通過膜的速率。T臨界越低，化合物越容易溶于脂質(zhì)，從生物體中消除的速度越快。表1中列出了作為醫(yī)學(xué)應(yīng)用的PFC選擇標(biāo)準(zhǔn)的理化參數(shù)。
表1不同化合物[1]在己烷中的臨界溶解溫度(T臨界)、蒸氣壓(P)和分解半衰期(t1/2)的值
從上述數(shù)據(jù)中可見T臨界與t1/2之間存在強(qiáng)相關(guān)性。對蒸氣壓未觀察到這種相關(guān)性。在很大程度上T臨界與分子量是相互關(guān)聯(lián)的。PFC的最適分子量在460至520之間?？傮w而言，為醫(yī)用PFC所提供的所有選擇標(biāo)準(zhǔn)彼此間并不矛盾，而具有定量特征。目前，致力于開發(fā)和研究全氟碳乳劑的研究者正將注意力放在相對有限數(shù)目的化合物上。表2和表3中列出了最常見的PFC化合物的結(jié)構(gòu)式以及主要的理化性質(zhì)。
表2最常用和最具希望的PFV的結(jié)構(gòu)式
當(dāng)研究不同PFC的主要生物學(xué)性質(zhì)時，制定了一條重要的要求即不存在無法鑒別的混合物。當(dāng)靜脈內(nèi)注射時性質(zhì)未知的混合物可能歪曲基本物質(zhì)的真實行為特征(器官中的貯留時間、毒性、對生物體不同系統(tǒng)的影響)。
表3構(gòu)成醫(yī)用制劑基礎(chǔ)的PFC的理化性質(zhì)
注PFD/PFTPA是Fluosol-DA制劑的基礎(chǔ)；PFD/PFMHP是Perftoran制劑的基礎(chǔ)；PFOB/PFDB是Oxygent制劑的基礎(chǔ)。
PFC液體是各種水溶性生物活性物質(zhì)的不良溶劑?；谶@一原因，PFC作為氧運輸介質(zhì)應(yīng)用時被分散至含水乳劑溶液中直至得到微細(xì)分布的乳劑。
PFC交換氣體的能力由乳劑中總氧含量確定。氧濃度遵循Henry定律，與氧壓成正比。在PFC中氣體的物理溶解度的原則也適用于全氟碳乳劑。溶于乳劑中的氧量取決于氟碳相，而不取決于粒徑，即溶解在氟碳乳劑中的氧量與由每相中氣體量值的和(水相中的氧量加上PFC中的氧量)計算的值相近。在PFC和血漿的混合物中惰性氣體的含量也遵循每相中氣體量相加性定律。因此，乳劑中每種氣體的含量可以根據(jù)基于氣體分壓和部分PFC/H2O體積比的溶解度的物理定律計算。這意味著全氟碳乳劑中的氧含量越高，則它的分壓或它的張力(pO2)越高，氟碳相的比例越高。
當(dāng)注射入體內(nèi)時，每種制劑的具體的(功能性)作用由該制劑的相容性決定，相容性由LD50值以及不存在副作用決定，副作用看起來主要為反應(yīng)原性。PFC乳劑的LD50值的大小主要取決于粒徑。平均粒徑不應(yīng)該超過0.2μm。大粒徑(平均粒徑在0.4μm以上)的比例增加3％-10％時，所述乳劑的LD50值降低兩倍。當(dāng)研制基于靜脈內(nèi)注射用全氟碳乳劑的藥物劑型時，研究全氟碳乳劑可能的反應(yīng)原性是必須解決的最困難的問題。當(dāng)使用反應(yīng)原性制劑時，可能在人中產(chǎn)生過敏反應(yīng)，其表現(xiàn)形式有多種，從皮膚的輕微發(fā)紅至導(dǎo)致呼吸和心臟停搏的過敏性反應(yīng)。
大多數(shù)研究者認(rèn)為最大部分的反應(yīng)原性取決于用于分散乳劑的氟碳基礎(chǔ)(basis)以及在顆粒周圍形成(表面)吸收層的乳化劑的性質(zhì)。認(rèn)為第一代乳劑的反應(yīng)原性是由氧乙烯和聚氧丙烯的非離子嵌段聚合物Pluronic F68(F-68)引起，用天然磷脂代替它們完全解決反應(yīng)原性問題。這種觀點不完全正確，因為盡管脂肪乳劑通過天然磷脂而穩(wěn)定，但還是具有反應(yīng)原性。全氟碳乳劑的反應(yīng)原性不能通過簡單地使用磷脂作為乳化劑和穩(wěn)定劑而消除。實際上，已發(fā)現(xiàn)PFC乳劑的反應(yīng)原性還是首要受乳化的顆粒的表面性質(zhì)影響，即受穩(wěn)定顆粒的乳化劑層的狀態(tài)的影響。除了化學(xué)結(jié)構(gòu)之外，表面活性分子的性質(zhì)以及決定如下的主要參數(shù)也起部分作用分散系統(tǒng)和可能的次級反應(yīng)的穩(wěn)定性、表面活性劑與乳劑顆粒的油核的結(jié)合強(qiáng)度、分子在表面的位置、其堆積密度、相對于血流中存在的蛋白質(zhì)和其它生物活性分子的吸收性質(zhì)的存在以及最后乳劑的粒徑。最后一個參數(shù)應(yīng)該特別提及。只使用聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段共聚物Proxanol 268穩(wěn)定的制劑Perftoran中的乳劑平均粒徑的降低導(dǎo)致次級反應(yīng)的迅速下降，Proxanol 268是與F-68最接近的原型。由此可清楚看出，在乳劑的開發(fā)、制劑和制備方法中，表面現(xiàn)象(兩種異質(zhì)系統(tǒng)——乳劑和血液或血漿的相互作用)在靜脈內(nèi)注射乳劑的行為中起關(guān)鍵的作用。因此油核的成分以及與油核共同起作用的表面活性劑都應(yīng)該通過實驗進(jìn)行選擇，并且所使用的技術(shù)的可行性也應(yīng)該進(jìn)行測試。
開發(fā)本發(fā)明的醫(yī)用全氟碳乳劑及其制備方法時，通過動物模型的方法對每種制劑和每種技術(shù)元件進(jìn)行生物學(xué)作用的研究。已知兔子在注射全氟碳乳劑時的反應(yīng)原性反應(yīng)表現(xiàn)為外周血中嗜中性白細(xì)胞急速下降。評價全氟碳乳劑的可能反應(yīng)原性時在測試中使用反應(yīng)原性指數(shù)Ip，其根據(jù)公式Ip＝Ck/Cv計算，其中Ck和Cv表示相對于對照組和測試組的起始水平的中性粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。若5分鐘和20分鐘后Ip小于3，則反應(yīng)原性的概率是最低的[3]。
已知不同的制備全氟碳乳劑的方法。包括全氟碳乳劑在內(nèi)的并且其中全氟碳基礎(chǔ)是油相的水包油型乳劑的制備需要耗費高能量。油相的粉碎通過超聲方法或機(jī)械方法實施。
在超聲的作用下，通過強(qiáng)烈的局部壓力變化產(chǎn)生的摩擦力實現(xiàn)分散，局部壓力的劇烈變化由兩個原因?qū)е?。第一，在波傳遞的液體中局部壓力和張力的改變。第二，空穴的形成，即由溶于水中的氣體填滿的腔的形成和塌陷。制備亞微乳劑所必需的超聲能量和力都很大，以致除了分散外，還導(dǎo)致C-F鍵的斷裂。結(jié)果在乳劑水相中出現(xiàn)高毒性濃度的F-離子，約為3-5mmol。含有如此高濃度F-的乳劑不能用作血液替代物或保存灌流器官。必需通過離子交換樹脂去除過量的F-離子。經(jīng)超聲分散的乳劑的第二個缺點是分散范圍過大，平均粒徑為0.1μm，但有大的部分顆粒的粒徑可能在0.4μm以上或在0.01μm以下。
通過振搖或劇烈攪拌的機(jī)械分散法得到僅粗糙分散的粒徑在1毫米以上的乳劑，其對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言是不可接受的。為制備微細(xì)分布的乳劑，在高壓(擠出)下將分散相通過微細(xì)孔壓入分散介質(zhì)中，其結(jié)果使液體噴射破裂成為微滴。通過壓力梯度和液壓摩擦力進(jìn)行分散。乳劑通常在高壓均化器中制備。在表面活性物質(zhì)或乳化劑的輔助下使得到的乳劑穩(wěn)定化。對于這些物質(zhì)的穩(wěn)定化作用有兩種原因解釋一是通過降低兩相之間過剩的表面能量或通過降低表面張力，二是通過形成結(jié)構(gòu)上的機(jī)械屏障(吸附層)，其保證顆粒的穩(wěn)定性并防止顆粒互相接觸或粘附或附聚。
在許多表面活性劑中，只有一些滿足制備靜脈內(nèi)注射制劑應(yīng)用的要求(表4)。
表4用于制備全氟碳乳劑的常規(guī)表面活性物質(zhì)
目前，主要有兩種乳化劑用于制備全氟碳乳劑，即Proxanol-268(Pluronic F-68)和天然磷脂(卵磷脂和大豆磷脂等)。
Proxanol的結(jié)構(gòu)與水溶性表面活性劑具有的極性頭(親水部分)和非極性尾(疏水部分)的特征性分子性質(zhì)不相應(yīng)。在Proxanol中，親水性分子特征由兩個聚氧乙烯鏈決定，氫鍵是與水分子形成的。聚氧丙烯中的甲基是其分子具有親脂性的必要前提。F-68和P-268中聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段的比例大致相同，平均為80∶20。這些乳化劑的穩(wěn)定作用主要通過表面活性分子在氟碳顆粒周圍形成的保護(hù)膜的立體效應(yīng)實現(xiàn)。除了結(jié)合于吸收層中的表面活性劑以外，表面活性劑分子中的最大部分在水相中形成各種膠束結(jié)構(gòu)，其中也包括不含氟碳化合物的膠束。在吸收層中的表面活性劑分子與水相的膠束中的表面活性劑分子之間存在動態(tài)平衡，該平衡一方面是吸收層穩(wěn)定所需要的，另一方面在長期儲存中擾亂吸收層中表面活性劑分子的堆積密度。
磷脂是來源于天然的化合物的混合物，其一般結(jié)構(gòu)見表4所示。盡管磷脂被PFD和PFTPA部分溶解在磷脂酰膽堿顆粒雙層中，但是就不同的氟碳化合物而言，磷脂是水溶性的，同時也是親脂性差的活性物質(zhì)。磷脂與氟碳化合物在水相中的聯(lián)合具有雙重特性。在磷脂的片層結(jié)構(gòu)中可能包含氟碳化合物，并(或)可能形成與顆粒表面不可逆地相連的單層磷脂。在含有氟碳化合物和磷脂的乳劑中可能存在非同質(zhì)顆粒，即被含有磷脂和不含磷脂的保護(hù)層覆蓋的顆粒。這種非同質(zhì)性可以歸因于制備的特性和/或磷脂相對于氟碳相過量。
對于微細(xì)分布的乳劑，關(guān)于細(xì)度下降(顆粒粗糙化)的決定性機(jī)制在于通過氟碳化合物分子從分散介質(zhì)中擴(kuò)散而使分散相從小顆粒到較大顆粒的等溫或分子物質(zhì)蒸餾。這一過程被稱為乳劑的“Ostwald熟化”或“濃縮”。這一過程的驅(qū)動力是與較大顆粒相比，小顆粒上面的飽和蒸氣壓力的增加。在這種情況下，氟碳化合物在水介質(zhì)中的溶解度水平也是一個重要的參數(shù)。防止再凝聚對于獲得全氟碳乳劑的抗聚集狀態(tài)，即獲得顆粒的細(xì)度和單個性具有至關(guān)重要的作用。失去穩(wěn)定性，即分子擴(kuò)散和較不顯著的絮凝和凝集的主要路線是其中氟碳相體積低于20％的相對較稀的乳劑和其中氟碳相體積為50％的較濃乳劑的特征。
全氟碳乳劑的穩(wěn)定化路線是已知的。膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定化的基本原理是防止它們分解的機(jī)制。向基于PFC/磷脂的乳劑中加入糖和帶有負(fù)電荷的共乳化劑(磷脂的次要組分)通過改變表面活性劑分子在吸收層中的空間相互作用和通過增加顆粒間的靜電排斥力而防止顆粒的絮凝。
通過向具有較高沸點的氟碳化合物基礎(chǔ)中加入第二種水溶性較差的組分(另一種氟碳化合物)來降低全氟碳乳劑中由分子擴(kuò)散而引起的主要分解過程，并使這一過程減慢。
在開發(fā)Fluosol-DA、Perftoran和Oxygent制劑中都使用了這一穩(wěn)定化原理。下表5中給出了所述制劑的組分和理化性質(zhì)的匯編數(shù)據(jù)。
表5收集的關(guān)于Fluosol-DA(日本)、Perftoran(俄羅斯)和Oxygent(美國)/2/制劑的組分?jǐn)?shù)據(jù)
在前兩種制劑中，將氟碳化合物全氟三丙胺和全氟甲基環(huán)己烷哌啶作為具有較高沸點和較低水溶性的補(bǔ)充劑加入具有最高油相比例的全氟萘烷中。含有磷脂補(bǔ)充劑(Fluosol-DA)的水溶性Pluronic F-68或其原型Proxanol-268(Perftoran)被用作乳化劑。根據(jù)它們的理化性質(zhì)它們差異很小。它們屬于第一代制劑，其一般缺點是由于穩(wěn)定性不足，它們必須冷凍儲存。將具有較高沸點和較低水溶性的全氟癸基溴加入Oxygent(全氟辛基溴)的氟碳基礎(chǔ)中。Oxygent屬于第二代制劑，其優(yōu)點是在非冷凍狀態(tài)下儲存。此外，作為該制劑氟碳基礎(chǔ)的全氟辛基溴以與全氟萘烷基本相同的速率(相當(dāng)于t1/2為～4和7天)從生物體中迅速清除。
Oxygent是組成上有點不同的灌流介質(zhì)中的一個商品名。
該乳化劑不僅有助于H2O/PFC系統(tǒng)中細(xì)度所要求的相界面的表面張力的降低。乳化劑性質(zhì)的改變可影響分子擴(kuò)散的速率。認(rèn)為分子中含有氟疏水性部分和非氟親水性部分的氟化表面活性劑是將來有希望的表面活性劑。最近法國化學(xué)家在用于氟碳化合物的氟化表面活性劑的合成中取得較大成功[4]。合成的氟化表面活性劑的一般結(jié)構(gòu)是全氟鏈和極性頭的組合。烴鏈被用作這些元件的結(jié)合連接。極性頭選白天然物質(zhì)或其衍生物。含有醇或糖衍生物作為極性頭的氟化表面活性劑與Pluronic F-68具有協(xié)同作用。磷脂、糖磷酸酯或磷脂酰膽堿在氟化表面活性劑中用作極性頭增加含有天然磷脂作為乳化劑的氟碳乳劑的穩(wěn)定性。一類新的混合氟化表面活性劑被建議用于穩(wěn)定化[4]。這一類氟化表面活性劑分子是兩個線性成分即烴成分和全氟成分的嵌段。這些化合物的通式如下CnF2n+1CmH2m+1或CnF2n+1CH＝CHCmH2m+1本發(fā)明的發(fā)明人將這些分子命名為“銷釘(dowel)”，其字面意義為“彈簧”或“連接元件”。
有種觀點認(rèn)為含有一般線性RH-RF結(jié)構(gòu)的氟化表面活性劑分子具有加強(qiáng)元件的作用，其烴基末端進(jìn)入覆蓋全氟碳顆粒的脂質(zhì)膜中，而其另一氟末端則進(jìn)入油相，即RH-RF分子改善了表面活性劑表面層的粘附性質(zhì)。
目前，全氟萘烷和全氟辛基溴是最被接受的用于制備生物醫(yī)用乳劑的化合物，其原因是它們與其它氟碳化合物相比能夠從生物體中迅速清除。
已知其中描述了血液替代劑組分的專利[5，6]，其中氟碳基礎(chǔ)是不同比例的兩種氟碳化合物(全氟萘烷/全氟甲基環(huán)己基哌啶或全氟萘烷/全氟三丁胺或全氟辛基溴/全氟甲基環(huán)己基哌啶)、三種氟碳化合物(全氟辛基溴/全氟萘烷/全氟甲基環(huán)己基哌啶或全氟辛基溴/全氟萘烷/全氟三丁胺)或甚至四種氟碳化合物(全氟辛基溴/全氟萘烷/全氟甲基環(huán)己基哌啶/全氟三丁胺)的混合物。通過水溶性乳化劑Proxanol P-268將這些混合物分散。使用這一乳化劑并不能使所述混合物在正溫度下儲存。此外，這些乳化劑凍融后在+4℃下的儲存期有限(至多一個月)。這是它們的主要缺點。
含有氟化表面活性劑的乳劑受專利保護(hù)。含有氟化表面活性劑的微乳劑[7]目前還沒有作為灌流介質(zhì)的實際應(yīng)用，主要是因為它們在體內(nèi)不夠穩(wěn)定。已知另一個通過混合的氟化表面活性劑制備的全氟碳乳劑組合物，在該分子中所述表面活性劑含有親氟部分和親脂部分[8]。這些乳劑實際上在正溫度下只能在3個月之內(nèi)保持其平均粒徑。
已知一個其中用10％liposyn脂肪乳劑作為脂質(zhì)源制備乳劑的專利[9]。有三組氟碳化合物作為氟碳基礎(chǔ)受專利保護(hù)。第一組是全氟環(huán)烷或全氟烷基環(huán)烷(其中包括全氟萘烷、全氟甲基萘烷、全氟全氫化菲等)。第二組包括全氟烷基飽和的雜環(huán)化合物。第三組包括全氟叔胺，包括全氟三丁胺、全氟三丙胺等。全氟辛基溴屬于可應(yīng)用的氟碳化合物。但是還不可能在10％liposyn的輔助下制備穩(wěn)定的全氟萘烷乳劑。它的最長儲存期為25天。
在另一份專利[10]中使用卵磷脂制備乳劑。氟碳相的比例在10-50體積％的較大范圍內(nèi)變動，而磷脂的比例為0.5-7重量％。作為油相，僅從來自這一大類化合物的PFC中選出一種用于該專利中，所述PFC即為具有1-24個氟原子的全氟氫化菲組，全氟萘烷、全氟辛基溴、全氟甲基金剛烷和全氟全氫化菲。
上述兩篇專利主要集中在通過使用所制備的氟碳乳劑用以保存不同器官和系統(tǒng)的方法上。在生理測試的開始階段，將乳劑與晶體溶液和/或膠體滲透壓活性物質(zhì)(白蛋白、羥乙基淀粉)等混合。所述乳劑實際上屬于第二代乳劑，但是它具有很大的缺點。在兩份專利中，并未給出對乳劑穩(wěn)定性的檢查結(jié)果，即在長期儲存(1個月)時粒徑保持情況的結(jié)果。剛提及的這兩篇專利[9，10]本文認(rèn)為是原型。
與本發(fā)明的乳劑最為接近的原型是下面提及的乳劑[11]。這一乳劑被認(rèn)為是原型，屬于第二代乳劑，含有迅速清除的量為40-50體積％的氟碳化合物和量為5-10體積％的高沸點全氟補(bǔ)充劑。使用全氟萘烷或全氟辛基溴(主要組分)作為迅速清除的氟碳化合物，并使用全氟甲基環(huán)己基哌啶作為補(bǔ)充劑。乳化劑是卵磷脂或大豆磷脂。
全氟環(huán)己基哌啶使乳劑穩(wěn)定化，降低主要組分(全氟萘烷或全氟辛基溴)的分子擴(kuò)散率(再凝聚)，并用于制備不同組分的乳劑，即Perftoran。從專利[11]中已知的乳劑的主要缺點是粒徑相對較大，平均在0.2μm以上。
本發(fā)明的目的是增加乳劑的穩(wěn)定性，改善乳劑質(zhì)量，即獲得與生物介質(zhì)(血液、血漿和血清)的生物相容性，儲存期在非冷凍狀態(tài)下至少為6-12個月。
本發(fā)明的醫(yī)用乳劑含有迅速清除的全氟萘烷或全氟辛基溴，還含有全氟補(bǔ)充劑和磷脂。該乳劑的特征在于使用全氟萘烷和全氟辛基溴混合的組合物作為迅速清除的組分，在于全氟補(bǔ)充劑是全氟叔胺混合物，并在于磷脂作為在水鹽介質(zhì)中的分散體使用。
該乳劑的特征還在于氟碳化合物的總濃度為2-40體積％。
該乳劑的特征還在于所述組合物含有比例為10∶1至1∶10的迅速清除的全氟萘烷和全氟辛基溴，在于全氟補(bǔ)充劑占氟碳化合物總含量的1-50％，并含有全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體，還含有另外的全氟-N-甲基環(huán)己基哌啶及其副產(chǎn)物。
該乳劑的特征還在于，它含有在水鹽介質(zhì)中的卵磷脂和大豆磷脂或這些脂質(zhì)的混合物的分散體，其濃度為0.2-5重量％。
該乳劑的特征還在于，水鹽介質(zhì)中的磷脂分散體含有占磷脂總含量1-15％的輔劑。植物油被用作輔劑，實際上有效比例的大豆、葵花子或蓖麻油或這些油的混合物以兩倍或三倍混合物的形式使用。
該乳劑的特征還在于，所述水鹽介質(zhì)含有氯化物和磷酸鹽的鈉鹽和鉀鹽，以及于注射水中的單糖甘露糖醇，水鹽介質(zhì)中的組分濃度具有100-350 mosmol/l的滲透壓。
該乳劑的特征還在于，其平均粒徑不超過0.2μm，粒徑范圍為0.06-0.2μm。
通過均化法制備本發(fā)明乳劑的方法的特征在于該方法包括多個步驟，其包括在水鹽介質(zhì)中分散磷脂，在該磷脂分散體中均化，將制備的乳劑加熱滅菌，以及之后在+4℃下以非冷凍狀態(tài)儲存至少6個月。
本發(fā)明的制備方法的特征還在于磷脂在水鹽介質(zhì)中的分散通過均化法在至少100atm的高壓下進(jìn)行，之后還進(jìn)行滅菌。
本發(fā)明的制備方法的特征還在于磷脂分散體中的氟碳化合物在300-650atm壓力下均化。
本發(fā)明的制備方法的特征還在于磷脂分散體和乳劑在100℃的溫度下滅菌。
如上所述，本發(fā)明的目的是增加乳劑的穩(wěn)定性，改善乳劑質(zhì)量，即獲得與生物介質(zhì)(血液、血漿和血清)的生物相容性，儲存期在非冷凍狀態(tài)下為6-12個月。術(shù)語生物相容性包括不同的變量，對于乳劑而言應(yīng)將其精確化。在上述專利[8-11]中，對于生物相容性的理解是所選擇的PFC的相對高的清除速率，保存該乳劑灌流的組織和器官的能力和對動物相對低毒(至少為流通血量的兩倍體積)，這些觀點彼此之間并不互相排斥，但沒有反映第一個步驟，即這些顆粒在血流中與血漿和血液的共同作用。本發(fā)明中，生物相容性從本發(fā)明的乳劑與生物介質(zhì)(血液、血漿或血清)之間共同作用(反應(yīng))的顯著性水平開始。該共同作用的結(jié)果不僅可以在體內(nèi)進(jìn)行評價，也可以在體外通過在儲存期間和乳劑滲透入血流期間一系列模擬吸收層破壞的因素對乳劑穩(wěn)定性水平的影響來進(jìn)行評價。
乳劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性通常以粒徑為特征，實際上平均粒徑不應(yīng)該超過0.2-0.3μm。該方法對于用于靜脈內(nèi)注射的生物醫(yī)學(xué)分散制劑而言是不夠的。這基于氟碳顆粒在滲透進(jìn)入血流期間，作為外源物質(zhì)與血漿中的蛋白和其它化合物分子以及與血細(xì)胞共同作用這一事實。該共同作用的一般特征取決于顆粒表面性質(zhì)。乳劑的功能性活性(氣體運輸功能)基本上取決于乳化顆粒的表面與血液和血漿之間的相容性，因為例如在外源體表面上補(bǔ)體系統(tǒng)激活以后，引發(fā)反應(yīng)級聯(lián)，這一反應(yīng)級聯(lián)由血管痙攣引起并干擾局部血流。還應(yīng)該注意體外乳劑的穩(wěn)定性受顆粒周圍的表面活性劑的吸收層性質(zhì)(強(qiáng)度、表面形態(tài)學(xué)等)影響很大。在以上所述的意義上，乳劑的穩(wěn)定性問題只能通過通常的顆粒研究化學(xué)膠體方法解決，而不評價結(jié)構(gòu)特性。能夠提供關(guān)于粒徑及顆粒結(jié)構(gòu)整體性的信息的簡單方法和手段的發(fā)展非常有限。因此術(shù)語結(jié)構(gòu)本身應(yīng)該就乳劑而言更精確。
乳劑體外和體內(nèi)穩(wěn)定性研究的進(jìn)展與術(shù)語結(jié)構(gòu)的廣義化和延伸有關(guān)，也取決于結(jié)構(gòu)研究方法的發(fā)展。術(shù)語制劑的或物質(zhì)的穩(wěn)定性由該物質(zhì)的性質(zhì)或不同制劑的穩(wěn)定性決定。決定乳劑性質(zhì)的參數(shù)不足以表征乳劑穩(wěn)定性。在這一方面的測試中，考慮到乳劑結(jié)構(gòu)特征的關(guān)于乳劑穩(wěn)定性的觀點得到擴(kuò)展。
碳乳劑的穩(wěn)定性通常在儲存期間乳劑的粒徑發(fā)生變化后進(jìn)行評價。這種純的化學(xué)膠體方法是不夠的。對于代表制劑基礎(chǔ)并用于靜脈內(nèi)注射的乳劑而言，乳劑穩(wěn)定性的信息不僅對于體外測試具有重要意義，而且對于乳劑流經(jīng)血流時的穩(wěn)定性的預(yù)測也提供了可能性。如果關(guān)于乳劑結(jié)構(gòu)的信息非常清楚，則也可以獲得這種信息。乳劑顆粒具有雙層球體形狀，中間有PFC(顆粒核)，表面有乳化劑層(殼)[12]。乳化劑的殼厚度不厚，為顆粒直徑的5-10％。乳劑在血流中的行為(與血漿蛋白和血細(xì)胞的共同作用、清除速率等)以及長期儲存的穩(wěn)定性大部分取決于顆粒周圍表面活性物質(zhì)的強(qiáng)度和狀態(tài)?；谶@一原因，必需同時獲取在這些作用或其它作用的情況下，關(guān)于待測介質(zhì)中粒徑和結(jié)構(gòu)變化的信息。
對于作為灌流媒介基礎(chǔ)的乳劑中結(jié)構(gòu)變化的理論描述和分析應(yīng)該強(qiáng)調(diào)以下觀點[13]1)乳劑的“總體結(jié)構(gòu)”以及它們的變化的特征是平均粒徑和粒徑分布。
2)“微結(jié)構(gòu)”的特征是殼中的乳化劑狀態(tài)以及乳化劑與PFC之間共同作用的程度、表面活性劑分子的相互位置、它們的排列、堆積密度、氧化程度和結(jié)構(gòu)分子的相狀態(tài)。
迄今為止，所有的研究者都局限在對于“一般結(jié)構(gòu)”的分析上，而這一點是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因為乳劑穩(wěn)定性、生物相容性，特別是顆粒表面性質(zhì)和顆粒吸收能力都是由微結(jié)構(gòu)決定。
將本發(fā)明的乳劑與原型進(jìn)行比較，首先研究在制備的乳劑的不同的儲存時間內(nèi)表征一般結(jié)構(gòu)變化的參數(shù)。
第二，在可以評價乳劑微結(jié)構(gòu)狀態(tài)的條件下，模擬破壞性因素對乳劑的作用。采取用水稀釋形式的稱為“應(yīng)激作用”的方法，與未經(jīng)處理的乳劑做比較，研究參數(shù)的具體變化。用水稀釋乳劑將擾亂分散介質(zhì)中的表面活性劑吸收層(殼)與表面活性劑分子之間的固有平衡?；谶@一原因，它對于維持亞穩(wěn)定系統(tǒng)(氟碳乳劑)的穩(wěn)定性或其分解有特別的預(yù)測意義。
此外，研究在與作為系統(tǒng)模型的血清的接觸過程中乳劑微結(jié)構(gòu)和相容性(研究體外測試中乳劑的生物相容性)。兩種異質(zhì)分散系血清和氟碳乳劑的共同作用的特征是在滲透入血流過程中表面顆粒性質(zhì)的變化和乳劑在儲存中微結(jié)構(gòu)的變化。在12個月的相同時間段內(nèi)，研究一般結(jié)構(gòu)和微結(jié)構(gòu)的變化。
為檢測上述狀態(tài)參數(shù)在儲存期間的變化，需要在測量期間不向待測系統(tǒng)中引入其它干擾因素的方法。因此，選擇、測試并建立了光學(xué)測試方法。
為評價一般結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的發(fā)明人選擇比濁法或濁度光譜法[14]。該方法還用于評價離心和分級分離后乳劑中的粒徑分布情況。通過間接方法評價由氟碳化合物周圍吸收層中的表面活性劑分子之間的相互作用的變化引起的乳劑微結(jié)構(gòu)的變化或顆粒表面性質(zhì)的變化，以找到待測乳劑與血清的相互作用因子(Kτ)，與乳劑與常規(guī)生理鹽溶液的相互作用因子相比相對濁度Kτ＝τ1/τ2，τ1和τ2是指血清/乳劑和血清/常規(guī)生理鹽溶液混合物的濁度，混合物中組分的比例進(jìn)行相應(yīng)的變化[15]。此外，將τ值的計算值和實驗值進(jìn)行比較以證實乳化顆粒性質(zhì)的一致性τ計算＝∑Ni·τi(∑Ni＝1)，τi和Ni是指清除部分的濁度或比例，τ實驗是同一乳劑樣品在分級分離之前的濁度。
I.以下是本發(fā)明乳劑的具體組成。
組成1該乳劑含有40體積％的含有比例為1∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及為氟碳化合物總含量50％的為全氟三丙胺及其副產(chǎn)物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體的混合物的全氟補(bǔ)充劑，用5％磷脂分散體穩(wěn)定在乳化狀態(tài)，該磷脂分散體含有卵磷脂，蓖麻油作為輔劑，其濃度為該卵磷脂總含量的15％，分散于具有以下組分的水鹽介質(zhì)中2mmol(115mg/l)氯化鈉、2mmol一取代磷酸二氫鉀(310mg無水鹽/l)、7.5mmol二取代磷酸二氫鈉(460mg無水鹽/l)、318mmol甘露糖醇(58g甘露糖醇/l)，在注射用水中。滲透壓為310mosmol/l。乳劑顆粒的平均直徑為0.195μm。
組成2根據(jù)組成1的乳劑，其特征在于它含有20體積％的含有比例為10∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及為氟碳化合物總含量25％的量的為全氟三丙胺與其副產(chǎn)物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體的混合物和另外的全氟-N-甲基環(huán)己基哌啶的混合物的補(bǔ)充劑，用25％磷脂分散體穩(wěn)定在乳化狀態(tài)，該磷脂分散體含有大豆磷脂，大豆油作為輔劑，其量為卵磷脂總含量的10％，分散于具有以下組分的水鹽介質(zhì)中2mmol一取代磷酸二氫鈉(276mg無水鹽/l)、7.5mmol二取代磷酸二氫鈉(460 mg無水鹽/l)、278mmol甘露糖醇(50g甘露糖醇/l)，在注射用水中。滲透壓為270mosmol/l。乳劑顆粒的平均直徑為0.1μm。
組成3根據(jù)組成1的乳劑，其特征在于它含有15體積％的含有比例為1∶10的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及為氟碳化合物總含量5％的量的為全氟三丙胺與其副產(chǎn)物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體和另外的全氟-N-甲基環(huán)己基哌啶的混合物的補(bǔ)充劑，用2％磷脂分散體穩(wěn)定在乳化狀態(tài)，該磷脂分散體含有大豆磷脂和卵磷脂，葵花子油作為輔劑，其濃度為磷脂總含量的5％，分散于具有以下組分的水鹽介質(zhì)中1mmol一取代磷酸二氫鈉(138mg無水鹽/l)、3.7mmol二取代磷酸二氫鈉(230mg無水鹽/l)、100mmol甘露糖醇(18g甘露糖醇/l)，在注射用水中。滲透壓為105mosmol/l。乳劑顆粒的平均直徑為0.08μm。
組成4
根據(jù)組成1的乳劑，其特征在于它含有10體積％的含有比例為2∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及為氟碳化合物總含量0.2％的量的為全氟三丙胺與其副產(chǎn)物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體和另外的全氟-N-甲基環(huán)己基哌啶的混合物的補(bǔ)充劑，用2％磷脂分散體穩(wěn)定在乳化狀態(tài)，該磷脂分散體含有卵磷脂，葵花子油和大豆油作為輔劑，其量為卵磷脂總含量的2％，分散于具有以下組分的水鹽介質(zhì)中1mmol一取代磷酸二氫鈉(138mg無水鹽/l)、3.7mmol二取代磷酸二氫鈉(230mg無水鹽/l)、90mmol甘露糖醇(13g甘露糖醇/l)，在注射用水中。滲透壓為100mosmol/l。乳劑顆粒的平均直徑為0.07μm。
組成5根據(jù)組成1的乳劑，其特征在于它含有2體積％的含有比例為1∶2全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及為氟碳化合物總含量10％的量的為全氟三丙胺與其副產(chǎn)物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體和另外的全氟-N-甲基環(huán)己基哌啶的混合物的補(bǔ)充劑，用0.2％磷脂分散體穩(wěn)定在乳化狀態(tài)，該磷脂分散體含有大豆磷脂，大豆油和蓖麻油作為輔劑，其量為大豆磷脂總含量的5％，分散于具有以下組分的水鹽介質(zhì)中2mmol氯化鈉(115mg無水鹽/l)、2mmol一取代磷酸二氫鈉(276mg無水鹽/l)、7.5mmol二取代磷酸二氫鈉(460mg無水鹽/l)、318mmol甘露糖醇(58g甘露糖醇/l)，在注射用水中。滲透壓為350mosmol/l。乳劑顆粒的平均直徑為0.06μm。
組成6根據(jù)組成1的乳劑，其特征在于它含有10體積％的含有比例為4∶1的全氟萘烷和全氟辛基溴的氟碳相(Cv)以及為氟碳化合物總含量4％的量的為全氟三丙胺與其副產(chǎn)物全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體的混合物的補(bǔ)充劑，用2％磷脂分散體穩(wěn)定在乳化狀態(tài)，該磷脂分散體含有大豆磷脂，葵花子油和蓖麻油作為輔劑，其濃度為磷脂總含量的4％，分散于具有以下組分的水鹽介質(zhì)中2mmol一取代磷酸二氫鈉(276mg無水鹽/l)、7.5mmol二取代磷酸二氫鈉(460mg無水鹽/l)、200mmol甘露糖醇(36g甘露糖醇/l)，在注射用水中。滲透壓為225mosmol/l。乳劑顆粒的平均直徑為0.09μm。
在下表6中，根據(jù)組成1-6列出本發(fā)明乳劑的組成。
表6氟碳乳劑的組成1-6
II本發(fā)明的乳劑組合物的制備方法的具體實施方案和所述乳劑的理化性質(zhì)。
實施例1無菌條件下制備乳劑1.1為制備，用10體積％的PFC和1％磷脂分散體制備11乳液。
1.2第一步分散體的制備向無菌圓底燒瓶中加入100ml10％卵磷脂的乙醇溶液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸餾乙醇。加入1g蓖麻油(輔劑濃度為卵磷脂含量的10％)和900ml水鹽溶液。
1.3使用無熱原的水制備水鹽溶液。將含有一取代磷酸二氫鈉、二取代磷酸二氫鈉和甘露糖醇晶體的粉末在干燥箱中在110℃下干燥2小時。此后，在無菌條件下的層流裝置中，將0.138g無水一取代磷酸二氫鈉、0.523g無水二取代磷酸二氫鈉和50.0g甘露糖醇溶于11無熱原的水中。將所得的水鹽溶液濾過從Millipor公司獲得的孔徑為0.4μm的無菌濾器。
1.4在燒瓶中將植物油和水鹽溶液的混合物機(jī)械攪拌至獲得乳黃色勻質(zhì)懸浮液。將所得的磷脂懸浮液加入高壓均化器的無菌容器中。
1.5提前將均化器用過熱水蒸氣和500ml乙醇滅菌，并用500ml無熱原的熱水洗滌。
1.6在100atm壓力下，將磷脂懸浮液通過均化器處理4次直至獲得半透明的勻質(zhì)液體。將所得分散體潷出至玻璃容器中。用無菌惰性氣體(氮氣、氬氣或氮氣和二氧化碳的混合物)將玻璃容器處理2-4分鐘。
1.7用膠皮密封物將玻璃容器密封，蓋上鋁帽。此后，將容器在100℃下滅菌1小時。將容器儲存于室溫下直至下一制備步驟。
1.8下步中處理PFC。將72ml PFD與8ml PFOB混合。將20ml全氟三丙胺加入80ml該組合物中。將所獲得的含有PFD和PFOB的組合物和氟碳補(bǔ)充劑與等體積的醫(yī)用乙醇混合。用分液漏斗將較重的全氟碳相從乙醇中分離出來。將分離的混合物與三倍體積的無熱原的水混合，振搖，并在分液漏斗中分離(氟碳比重差不多超過水比重兩倍)。
1.9此后制備乳劑。將900ml磷脂分散體和100ml處理過的氟碳混合物(含有PFD/PFOB＝9/1+PFTPA-20％的組合物)加入均化器中。將內(nèi)容物在500atm下機(jī)械攪拌使之分散，整個體積流經(jīng)該器8次，直至獲得半透明、帶有乳白色的淡黃色液體即亞微乳劑。將乳劑潷出至每個為100ml的玻璃容器中。用膠皮密封物將玻璃容器密封，蓋上鋁帽。
1.10將容器中的乳劑在100℃加熱滅菌1小時，然后冷卻并在4℃儲存一年。
所得乳劑具有以下組成氟碳相(Cv)10體積％，PFD與PFOB比例9/1，PFTPA在氟碳混合物中的相對含量為20％，卵磷脂濃度為1重量％，蓖麻油濃度為0.1重量％(懸浮液中作為輔劑的蓖麻油的相對含量為卵磷脂總含量的10％。批號1。
用BПЖ-2型粘度計測量該批的粘度，為0.953cP(厘泊)。與含有相同氟碳相含量的Perftoran相比，粘度為2.5cP(厘泊).
實施例2乳劑如實施例1所述相同的組成制備。選擇1∶1的大豆油和蓖麻油混合物作為輔劑。乳劑具有以下組成Cv10體積％，PFD/PFOB 9∶1，PFTPA相對含量20％，卵磷脂濃度1重量％，相對輔劑含量(大豆油/蓖麻油1∶1)為10％。批號2。
實施例3乳劑如實施例1所述相同的組成制備，不過體積為800ml，氟碳含量為20體積％。將200ml 10％大豆磷脂的乙醇溶液加入圓底燒瓶中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸餾乙醇。加入3g輔劑(大豆油和蓖麻油的1∶2混合物，輔劑濃度為卵磷脂的15％)。水鹽溶液含有0.276g無水一取代磷酸二氫鈉、1.046g無水二取代磷酸二氫鈉和10.0g甘露糖醇。將11水鹽溶液加入含有輔劑的燒瓶中，在均化器中振搖分散，如實施例1所述潷出至玻璃容器中并滅菌。制備氟碳相，將40ml PFOB加入160ml PFD中。從這一量中，取出160ml與40ml PFTPA混合。清潔后，將所得的200ml全氟碳混合物逐滴加入含有800ml大豆磷脂分散體的均化器中。將所得乳劑潷出并滅菌。
該乳劑具有以下組成Cv＝20體積％，PFD與PFOB比例8∶2，PFTPA相對含量20％，大豆磷脂濃度2重量％，相對輔劑含量(大豆油/蓖麻油1∶2)為15％。批號3。
實施例4乳劑的制備如實施例1所述，只是PFD與PFOB的比例為8∶2。將30ml PFMHP加入170ml該組合物中，振搖混合，按常規(guī)方法清潔，并逐滴加入均化器中，該均化器中含有800ml含大豆磷脂的分散體(如實施例3中所述獲得)和相同輔劑量為大豆磷脂含量的15％的比例為1∶2的大豆油和蓖麻油。將乳劑在400atm壓力下分散。
乳劑具有以下組成Cv＝20體積％，PFD/PFOB比例8∶2，PFMP的相對含量15％，大豆磷脂濃度2重量％，輔劑相對含量(大豆油/蓖麻油1∶2)為1 5％。批號4。
實施例5乳劑制備方法如實施例1所述，只是加入不同量的卵磷脂。將50ml卵磷脂加入圓底燒瓶中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸餾乙醇。加入0.6g葵花子油和0.5g常規(guī)鹽溶液，振搖混合，在150atm下均化。將25mlPFD和25ml PFOB混合制備PFD/PFOB的5∶5混合物。將49.5ml混合物與0.5ml PFTPA混合。加入50ml混合物，清潔后，向均化器中加入0.95l卵磷脂懸浮液。預(yù)懸浮液的均化在350atm壓力下進(jìn)行。根據(jù)所述規(guī)則，將微細(xì)分布的乳劑潷出并滅菌。
該乳劑具有以下組成Cv＝5體積％，PFD/PFOB比例5∶5，PFTPA相對含量1％，卵磷脂濃度0.5重量％，輔劑相對含量葵花子油12％。批號5。
實施例6將50ml 10％大豆磷脂的乙醇溶液加入圓底燒瓶中。根據(jù)上述方法蒸餾乙醇。加入0.6g大豆油和950ml鹽溶液。混合后，在180atm下在均化器中制備分散體。滅菌后，用分散體制備乳劑。將25ml PFD和25ml PFOB混合制備PFD和PFOB的組合物(比例為5∶5)。將0.5mlPFMHP加入49.5ml該混合物中。用50ml乙醇清潔后，將混合物在含有950ml大豆磷脂的均化器中處理。如上所述，均化分兩個階段進(jìn)行，第一階段在200atm壓力下，第二階段在500atm壓力下。
該乳劑具有以下組成Cv＝5體積％，PFD/PFOB比例5∶5，PFMHP相對含量1％，大豆磷脂濃度0.5重量％，輔劑相對含量(大豆油)為12％。批號6。
實施例7制備大豆磷脂濃度為0.2重量％的懸浮液。此外，向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加入20ml大豆磷脂的乙醇溶液。蒸餾乙醇。向其中加入大豆油和葵花子油比例為1∶1的混合物作為輔劑。如實施例6所述加入980ml常規(guī)鹽溶液進(jìn)行分散并滅菌。
將4ml PFD和16ml PFOB(比例為2∶8)混合制備PFD/PFOB的組合物。將1ml PFMHP加入19ml該混合物中。將20ml所得的這三種組分的混合物與980ml懸浮液均化。均化如以上實施例所述進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行滅菌和潷出。
所獲得的乳劑具有以下組成Cv＝2體積％，PFD/PFOB比例2∶8，PFMHP相對含量5％，大豆磷脂濃度0.2重量％，相對輔劑含量(大豆油/葵花子油1∶1)1％。批號7。
實施例8為制備乳劑，用40重量％的卵磷脂懸浮液制備濃度為5重量％。另外將500ml卵磷脂的乙醇溶液加入燒瓶中。蒸餾乙醇。向其中加入2.5g蓖麻油作為輔劑和600ml常規(guī)鹽溶液?；旌虾螅?00atm壓力下在均化器中進(jìn)行分散直至獲得勻質(zhì)黃白色介質(zhì)。如上所述進(jìn)行滅菌。
將4ml PFD和360ml PFOB(比例為1∶9)混合制備混合物。將40ml PFMHP加入360ml該混合物中。將獲得的400ml這三種組分的混合物與600ml卵磷脂懸浮液分兩個階段均化，第一個階段在250atm壓力下，第二個階段在600atm壓力下。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法潷出并滅菌。
該乳劑具有以下組成Cv＝40體積％，PFD/PFOB比例1∶9，PFMHP相對含量10％，卵磷脂濃度5重量％，相對輔劑含量(蓖麻油)5％。批號8。
實施例9
將40ml PFD和360 PFOB混合制備氟碳相。將40ml PFMHP和40ml有機(jī)液體的混合物80ml加入320ml該混合物中。該乳化劑懸浮液含有4.2重量％卵磷脂、4.2重量％大豆磷脂和4.2g含有比例為9∶1蓖麻油和葵花子油的輔劑，即輔劑量為該卵磷脂總含量的5％。
為制備乳劑，將600ml懸浮液與400ml三種組分的混合物加入均化器中。如以上實施例中所述進(jìn)行均化、潷出和滅菌。
該乳劑具有以下組成Cv＝40體積％，PFD/PFOB比例為1∶9，PFMHP和有機(jī)液體相對含量20％，磷脂濃度(卵磷脂和大豆磷脂1∶1)5重量％，相對輔劑含量(蓖麻油和葵花子油9∶1)0.25％。批號9。
表7獲得的各批乳劑的組成(實施例1-9)
所有批次的組分均列于表7中。
表8中給出了原樣(native)(未稀釋)乳劑和水稀釋乳劑儲存不同時間平均粒徑的研究結(jié)果。
表8實施例1、3、4、5、8和9的原樣碳氟乳劑和水稀釋氟碳乳劑的波長指數(shù)和平均粒徑
根據(jù)最小二乘法計算n值。確定n時的平均方差為0.01-0.03。因此確定n的誤差＝0.3-1％。參數(shù)n是濁度光譜方法中的特征性函數(shù)，由至少3-5點計算。對于微細(xì)分布的乳劑，n明確地與平均粒徑有關(guān)[14]。
根據(jù)獲得的結(jié)果，平均參數(shù)n和a在儲存12個月的情況下幾乎沒有改變。水稀釋作為應(yīng)激作用對粒徑的影響很小。觀察到含有大豆磷脂的乳劑在9-12月的晚期內(nèi)a值有輕微的升高。所有批次的含有磷脂分散體的氟碳乳劑在儲存達(dá)一年波長指數(shù)的變化范圍在3.4和2.7之間。這與平均粒徑從0.11至0.15-0.195μm的增大相對應(yīng)。
為研究粒徑分布，使用對待測介質(zhì)進(jìn)行分級分離的方法。在溫和條件(1500rpm)下將乳劑離心，并(精確地)分離為3部分樣品體積的上面部分20％、中間部分60％和下面部分20％(

圖1)。從圖1中可以看出，作為原型的碳乳劑除了具有粒徑不同的三個部分以外，由于吸收層與油相間弱的結(jié)合以及在吸收層中沒有結(jié)合的表面活性劑還有含有游離磷脂的較輕部分。測量每個部分的a值和n值。本發(fā)明的組合物分級分離乳劑儲存1-12個月的所述參數(shù)見表9。上面部分和中間部分在儲存期間n值和a值沒有變化。下面部分隨儲存時間增長粒徑有輕微的增大。這導(dǎo)致粒徑分布寬度的擴(kuò)伸。從而最大分布寬度為0.06-0.19μm。
所得結(jié)果表明原樣乳劑和水稀釋乳劑(應(yīng)激作用)的平均粒徑在12個月內(nèi)有輕微的增加，但保持在低于0.20μm的可接受的限度。
表9來自實施例1、3、4、5、8、9的乳劑儲存12個月中表征粒徑分布寬度的參數(shù)n和a(離心后的上、中、下＝部分)
發(fā)現(xiàn)觀察到的粒徑分布寬度增加是在具有相對大的顆粒的乳劑中。在儲存12個月后乳劑分級分離中，下面部分的粒徑從0.12增至0.198μm?？偟膩碚f，這一結(jié)果與Ostwald分解機(jī)理(或分子蒸餾)一致。這種相對較大的顆粒的比例很低(～10％)，并沒有破壞平均粒徑的增加。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，在乳劑的分級分離中僅觀察到均勻顆粒沉降，結(jié)果證明即使在儲存一年以后還是沒有游離磷脂。因此乳劑中的顆粒分布保持著單分子物質(zhì)(monomodal)。所得結(jié)果表明所得乳劑在1-12個月的儲存期內(nèi)保持了一般結(jié)構(gòu)。
顆粒與血清的相互作用指數(shù)Kτ見表10，所述血清中通過以1∶1的比例加入5％白蛋白溶液進(jìn)行改良。
氟碳乳劑與血清的相互作用指數(shù)表征乳劑的微結(jié)構(gòu)，表明含有卵磷脂的氟碳乳劑儲存12個月該指數(shù)有一個輕微的變化范圍(血清-乳劑比例1∶0.05和1∶0.1)。當(dāng)比例增加至1∶0.10時，Kτ和Kτ/2的變化范圍也變寬。含有大豆磷脂的氟碳乳劑，Kτ只在儲存達(dá)6個月內(nèi)保持較小的變化范圍。如上所述，觀察到的變化很可能是由于在乳劑的不同儲存時間內(nèi)很難在測試系列中使血清混合物標(biāo)準(zhǔn)化。同時，每批血清和乳劑間的相互作用的變化范圍維持在特定較窄的限度內(nèi)說明在長期儲存期間(6-9個月)，顆粒表面性質(zhì)的變化很小。乳劑中不含磷脂時在儲存的末期Kτ發(fā)生突然的改變可能是由于顆粒與血清中的大分子之間產(chǎn)生了額外的相互作用。為檢驗這一假設(shè)，分別計算了濁度τ的實驗值和計算值，濁度τ是評價氟碳乳劑的結(jié)構(gòu)總體性的另外的獨立參數(shù)(表11)[13]。
表10在+4℃溫度下不同儲存時間乳劑與血清的相互作用指數(shù)
從物理的角度而言，τ是指不存在共同作用和多種分散體的情況下，只含有一些顆粒的分散系統(tǒng)中光線輸出降低量的總和。未稀釋乳劑與水稀釋乳劑的τ的計算值和實驗值的一致證明顆粒與血清大分子之間的相互作用即使在+4℃下儲存9-12月后也幾乎未發(fā)生改變。因此Kτ的突然變化可能與全氟碳/磷脂的另外超分子結(jié)構(gòu)在水分散體中出現(xiàn)有關(guān)，氟碳與磷脂的比例與在乳劑中相同。
表11不同儲存時間的乳劑的濁度實驗值和計算值
在討論本發(fā)明的氟碳化合物的組成和制備方法的優(yōu)點之前，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)乳劑在血流中流動時實現(xiàn)氣體運輸功能的主要條件是維持顆粒的微粒性質(zhì)，且不產(chǎn)生反應(yīng)原性。從膠體化學(xué)和生物物理的角度，乳劑進(jìn)入血流中可以視為一種應(yīng)激作用，其可能導(dǎo)致分散體性質(zhì)的變化。這一作用可能產(chǎn)生以下現(xiàn)象，即乳劑的稀釋和分散體中有機(jī)乳化劑濃度的降低(快速期)。這一過程結(jié)果導(dǎo)致表面活性劑與顆粒表面分子結(jié)合的減弱(緩慢期)。表面活性劑與氟碳化合物之間結(jié)合的這一減弱在顆粒與血漿大分子之間的接觸和相互作用的影響下被進(jìn)一步削弱。這導(dǎo)致吸收層組分或顆粒破壞現(xiàn)象的改變。以上描述的過程發(fā)生的順序是很簡化的代表。
在這一方面的測試中，用水稀釋乳劑模擬第一階段，即乳劑的稀釋和顆粒周圍游離乳化劑濃度的降低。對于所獲得乳劑與血漿的相互作用的實驗?zāi)M第二階段，即血漿大分子接觸對于顆粒表面性質(zhì)的影響。已發(fā)現(xiàn)即使在儲存一年之后，乳劑顆粒仍保持著它們的微結(jié)構(gòu)，用水稀釋沒有影響粒徑，結(jié)果證實了表面活性劑吸收層與顆粒核全氟碳化合物之間的強(qiáng)力結(jié)合。乳劑顆粒與血清的相互作用指數(shù)(在測量誤差的限度內(nèi))也沒有發(fā)生改變，維持了顆粒的表面性質(zhì)。τ的計算值(分級分離之后)與實驗值(分級分離之前)一致證明了儲存一年后顆粒保持其性質(zhì)(顆粒結(jié)構(gòu))以及乳劑中不含游離磷脂。
所采用的方法顯著增加了預(yù)測乳劑進(jìn)入血流后穩(wěn)定性的準(zhǔn)確性。對于具有相同組成的幾批乳劑的穩(wěn)定性和反應(yīng)原性指數(shù)(Ip)的平行研究結(jié)果證明了上述內(nèi)容。指數(shù)Ip根據(jù)方法[3]確定。
實施例10制備具有實施例2所述組成的四批相同乳劑氟碳基礎(chǔ)9±1體積％，PFD與PFOB比例9∶1，有機(jī)液體補(bǔ)充劑20％，卵磷脂1重量％，輔劑(蓖麻油和大豆油1∶1)，為卵磷脂濃度的8％。
在下表12中列出了不同儲存時間的這些批乳劑的n和a值。
表12具有相同組成PFD/PFOB/Fl/卵-p的乳劑不同儲存時間的波長指數(shù)n和平均粒徑
表13通過將具有相同組成PFD/PFOB/Fl/卵磷脂的乳劑離心進(jìn)行分級分離中，表征粒徑分布寬度的波長指數(shù)n和平均粒徑a
根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，在所有情況下原樣乳劑和水稀釋乳劑的平均粒徑在6個月的儲存期內(nèi)保持不變，都在0.06-0.17μm的范圍內(nèi)。具有所示組成的原樣乳劑和水稀釋乳劑的粒徑分布寬度在所述的研究期間內(nèi)幾乎完全沒有變化(表13)。所獲得的乳劑與改良血清之間的相互作用指數(shù)Kτ的相對測量誤差(±10％)在較窄的限度內(nèi)變化(見下表14)。
表14具有相同組成PFD/PFOB/Fl/卵磷脂的乳劑與白蛋白改良血清(80％)之間的相互作用指數(shù)Kτ
表15具有相同組成PFD/PFOB/Fl/卵磷脂的乳劑的反應(yīng)原性指數(shù)(測試中使用卵磷脂分散體)
所得結(jié)果證明本發(fā)明的乳劑和制備方法能夠得到高質(zhì)量的乳劑微結(jié)構(gòu)，在非冷凍狀態(tài)下儲存以及隨后的體外應(yīng)激作用(水稀釋、與富集白蛋白的血清相互作用)都沒有破壞其微結(jié)構(gòu)。相同乳劑模式的反應(yīng)原性測試的結(jié)果完全證實了模擬測試的結(jié)果。研究中任何一點反應(yīng)原性都沒有超過臨界值3(見表15)。
實施例11具有5體積％低氟碳含量的乳劑的結(jié)構(gòu)的完整性和對乳劑反應(yīng)原性的研究該乳劑具有以下組成PFD/PFOB 1∶1，PFMHP 1％，大豆磷脂0.5％，大豆油為輔劑12％，粒徑分布寬度0.03-0.12μm，起始反應(yīng)原性1.61。研究了四批相同的原樣乳劑和水稀釋乳劑的平均粒徑變化(見表16)以及儲存6個月后的反應(yīng)原性(見表17)。從所示數(shù)據(jù)可以看出，所使用的制劑中粒徑的增大和本發(fā)明的制備方法確保了獲得較低的反應(yīng)原性。
表16具有相同組成PFD/PFOB/Fl/大豆磷脂的原樣乳劑和水稀釋乳劑的波長指數(shù)n和平均粒徑a
表17低氟碳含量的乳劑在非冷凍狀態(tài)儲存6個月后的反應(yīng)原性Ip
實施例12乳劑在18個月內(nèi)的長期儲存，其含有10體積％的氟碳化合物，PFD/PFOB比例8∶2，有機(jī)液體20％，卵磷脂2％，蓖麻油作為輔劑10％。不同儲存時間和水稀釋劑的平均粒徑的研究結(jié)果見表18。乳劑與富集達(dá)到50％白蛋白的血清之間的相互作用情況見表19。
表18原樣和水稀釋乳劑PFD/PFOB/Fl/卵磷脂以非冷凍狀態(tài)在不同儲存時間的波長指數(shù)n和平均粒徑a
表19不同儲存時間的乳劑PFD/PFOB/Fl/卵磷脂與白蛋白改良血清(50％)之間的相互作用Kτ
從以上數(shù)據(jù)可以看出，所得得乳劑保持著可測量的理化性質(zhì)。結(jié)果乳劑儲存18個月后反應(yīng)原性為1.5。
實施例13將原型Oxygent AF 0104(生產(chǎn)商Alliance Therapeutic，USA)與根據(jù)本發(fā)明方法制備的乳劑就質(zhì)量方面進(jìn)行比較。該比較以水稀釋的波長指數(shù)和平均粒徑的變化的函數(shù)來進(jìn)行。
在待比較的具有不同絕對氟碳含量的乳劑中，保持氟碳化合物與磷脂的比例相同。所述乳劑的制備方法不同。結(jié)果乳劑PFOB-2(根據(jù)本發(fā)明方法制備)在離心后不含有游離磷脂相(見圖16)，Oxygent和原型PFO-1在吸收層中含有未結(jié)合的游離磷脂，其在離心時很容易漂浮(見圖1A)?；谶@一原因，用水稀釋Oxygent時，該乳劑的粒徑降至0.35-0.15，磷脂聚集，并且乳劑顆粒發(fā)生分解。
在原型乳劑(PFOB-1)中，很清楚沒有這些粗糙的聚集物。但是它們的存在除了影響離心結(jié)果之外，還使根據(jù)原樣乳劑和稀釋乳劑的相加規(guī)則確定的計算和實驗濁度參數(shù)之間有較大差異。對于根據(jù)本發(fā)明方法制備的乳劑，觀察到的實驗和計算濁度值幾乎完全一致(見表21)。應(yīng)該注意，從物理的角度而言，待測的參數(shù)是指不存在共同作用和多種散射物的情況下，單個顆粒光線能量降低量的總和。Oxygent和原型的實驗和計算濁度值不一致證明其不符合相加規(guī)則，即在上述分散系統(tǒng)中顆粒與光通量之間發(fā)生了另外的相互作用。這種相互作用可以在Oxygent和原型的水稀釋中清楚地檢測到，結(jié)果沒有實現(xiàn)顆粒類型的均一性，而是除氟碳乳劑之外，產(chǎn)生不同的磷脂膠束結(jié)構(gòu)。對于乳劑PFOB-2和PFD/PFOB(批號5-03)，顆粒與光通量之間的相互作用即使在非冷凍狀態(tài)下儲存1個月之后仍符合相加規(guī)則。

圖1制備方法使得氟碳乳劑分離為不同部分A根據(jù)原型(乳劑含有游離磷脂)，B根據(jù)本發(fā)明的方法(乳劑僅含有不同粒徑的顆粒)。1、2、3是指上面、中間和下面部分。1a是指上面部分中的游離磷脂。
表20不同氟碳乳劑的組成，未稀釋乳劑和水稀釋乳劑(1∶1)的波長指數(shù)n和平均粒徑a
表21根據(jù)相加規(guī)則實驗和計算濁度值之間的一致
因此所述實施例表明了根據(jù)本發(fā)明的乳劑的所述組成以及所述制備方法和與本發(fā)明最接近的原型和乳劑相比的完整的一系列優(yōu)點。因為以下的協(xié)同作用這是可能的。
1.選擇PFD和PFOB作為主要組分是因為根據(jù)它們的生物學(xué)性質(zhì)和理化性質(zhì)證明這些全氟碳化合物是生物學(xué)可接受的，并已證明它們從生物體中快速清除，即從沉積氟碳顆粒的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞中快速清除。
2.以有效的比例共同使用PFD和PFOB得到混合油相，其性質(zhì)從中心向外周逐漸改變。這使得在蒸氣壓相當(dāng)較低的成分(見表1)中使用親脂性差和沒有親脂性的叔胺成為可能，并因此降低親脂性分子PFD和PFOB向水相中擴(kuò)散。這降低了乳劑分解主要機(jī)制Ostwald熟化的速率，并增加氟碳乳劑中所選成分的穩(wěn)定性。
3.將PFOB引入乳劑成分中增強(qiáng)了它們具有相同氟碳含量時的氧吸收能力，有助于增加另外的x射線對比性質(zhì)。
4.PFOB/PFD和叔胺混合物由于顆粒周圍表面活性劑吸收層的更強(qiáng)結(jié)合而有助于降低最終形式的粘度，結(jié)果使在乳劑的水相中排除游離膠束形式的磷脂成為可能。
5.使用除磷脂以外的理化性質(zhì)不同的油促進(jìn)以較少量的磷脂在顆粒周圍形成更緊密的膜樣吸收層，并防止不含氟碳化合物的膠束結(jié)構(gòu)的形成。
6.所使用的水鹽介質(zhì)的性質(zhì)保證顆粒表面帶有負(fù)電荷，結(jié)果防止顆粒在儲存和運輸期間聚結(jié)。
7.除了保證制備高標(biāo)準(zhǔn)(calibrated)乳劑(粒徑分布窄)的加工技術(shù)方法之外，上述方法還減少分子蒸餾，并提高乳劑穩(wěn)定性。
8.沒有顆粒聚集物和膠束形式磷脂保證了乳劑的吸收性質(zhì)和乳劑激活血流中補(bǔ)體的性質(zhì)，結(jié)果產(chǎn)生低反應(yīng)原性，增加了根據(jù)本發(fā)明組分的乳劑的生物相容性。
III以下說明本發(fā)明的乳劑的生物醫(yī)學(xué)用途測試。
測試1對于該乳劑作為大量血液替代物的用途，用體重為250-300g(n＝20)的健康Wistar大鼠對根據(jù)實施例1(第二部分)的方法制備的氟碳乳劑進(jìn)行容積替代，大鼠用戊巴比妥鈉麻醉。測定大量血液替代后的存活能力，并在等同失血后獲得肝線粒體(見方法[16])。為保證大量血液替代后的膠體滲透壓，在灌流之前將乳劑與20％人白蛋白以1部分白蛋白比6部分乳劑的比例混合，使白蛋白終濃度為3.5％(相對于乳劑中含有10體積％的氟碳化合物這一事實)。在血液替代期間，大鼠在透明的Plexiglas罩中呼吸氧氣富集率達(dá)到FiO2＝0.5的空氣。罩蓋住動物頭，動物仰臥固定。從靜脈竇(右側(cè)前庭)取3.5ml血液，將3.5ml乳劑注射至靜脈竇中。10分鐘后，取出3.5ml血液，并注入等量乳劑。重復(fù)這一步驟直至取出的血量平均至少是動物體重的3.5％；例如，對于體重250g，取出的血量和注入的乳劑量分別是8.8ml。在血液替代之前和之后，測定外周血液中的血紅蛋白、動脈血和靜脈血中的氧分壓和pH值。在這一測試系列中，血液替代后的血紅蛋白濃度平均降低1.9。在對照組(n＝20)中，注射0.15mol氯化鈉和3.5％白蛋白溶液代替乳劑。用核磁共振光譜測定外周血液中氟碳含量。血液替代后，將動物置于氧氣富集率達(dá)到FiO2＝0.5的小室中。
在測試組中(進(jìn)行血液替代)，所有的動物都存活下來，血紅蛋白、紅細(xì)胞和白細(xì)胞在5天之內(nèi)恢復(fù)至正常值。在對照組中，3只動物死亡。5天后，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉處死所有動物，從肝臟中分離線粒體。在恒溫密閉的操作小室中以偏振測定方法記錄肝線粒體在27℃下的呼吸。發(fā)現(xiàn)活性狀態(tài)(有ATP合成)的呼吸速率和由3-羥基丁酸對NAD依賴性底物的氧化而產(chǎn)生的ATP合成平均降低了1.5，琥珀酸的氧化激活了20％。這些數(shù)據(jù)證明存在嚴(yán)重的缺血性損傷。在血液替代5天后分離的肝線粒體中，觀察到呼吸速率和ATP合成都平均激活25％，結(jié)果在回憶中存在嚴(yán)重缺氧狀態(tài)。
測試2所有處理均如前述實施例中所述進(jìn)行，只是使用20％的氟碳乳劑。血紅蛋白含量與起始值相比降低了三倍，平均65-70體積％的血液被替代。對于體重為250g，取出的血液體積和注入的血液替代劑的體積分別為12.25ml。在測試組中，所有的動物都存活下來，對照組中有5只動物死亡。
測試3所有處理均如前述實施例1中所述進(jìn)行。但是血液替代后6小時、1天和3天后將每組中5只動物處死。分離肝線粒體，記錄磷酸化呼吸。在對照組中，觀察到對呼吸速率和NAD依賴性底物氧化磷酸化和琥珀酸氧化磷酸化的迅速抑制，抑制水平平均在50％以上，這表明線粒體嚴(yán)重缺血性損傷。在測試組中，血液替代后6小時觀察到磷酸化呼吸被激活40％，這一激活保持1天，血液替代后第三天最高為25％。這些變化是被保存的、缺氧而不是缺血的肝線粒體的特征。
測試4本測試涉及失血性休克后保存狗的腎臟。通過向兩腎都切除的動物中移植腎以后進(jìn)行腎復(fù)蘇(試驗在得到衛(wèi)生部倫理委員會的特殊許可之后進(jìn)行)，以及通過在血液替代后1小時評價腎中的腺嘌呤核苷酸含量和乳酸和丙酮酸含量而確定腎的保存。測試在10只狗中進(jìn)行，每組5只。
測試步驟在插管麻醉控制呼吸的情況下，從體重為20kg的狗股動脈中取出400ml血液，結(jié)果血壓迅速降低(達(dá)到50-60mmQS)，發(fā)生心臟雙重收縮，血漿中乳酸濃度升高達(dá)到20mmol。取出血液1小時后，向測試組的動物提供體積超出失血量15體積％的血液替代劑，即根據(jù)實施例1的含有達(dá)到3.5％白蛋白補(bǔ)充劑的10％碳乳劑(如實施例14中所述)，向?qū)φ战M的動物提供血漿擴(kuò)張劑polyglucine。再過1小時，將動物處死，切除腎臟。將一個用于移植，另一個用于檢測腎組織的能量交換。
在對照組中，ATP與ADP的比例降低了三倍，能荷([ATP]+1/2[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])降至0.45。在測試組(用氟碳乳劑替代血液)中，ATP與ADP的比例降低了至多兩倍，能荷降低至0.65-0.70。腎組織中乳酸與丙酮酸的比例在對照組中升高至25-30，在測試組中至多升高至6。
在所有情況下，在具有用氟碳化合物處理的那些狗的移植腎臟的接受動物中，在移植物的內(nèi)含物進(jìn)入血流之后立即觀察到排尿。在對照組中，5只動物中有2只發(fā)生再灌注損傷并有快速的組織水腫和完全的血流停止(腎病)。對照組中有3只動物移植腎中血流重建。僅在幾個小時后觀察到排尿。
這些數(shù)據(jù)表明用本發(fā)明的氟碳乳劑在狗中治療失血性休克確保了對器官更好的保護(hù)，使之免于發(fā)生缺血和后續(xù)的再灌注損傷。
測試5該測試涉及根據(jù)實施例制備的氟碳乳劑用于保存灌流的兔心臟的用途。使用前(1-2小時)，將400ml氟碳乳劑與200mlKrebs-Henseleit等滲溶液以2∶1比例混合。將80ml20％血清白蛋白溶液加入600ml該混合物中。用于對比測試的對照組合物含有600ml鹽溶液以及7.2g甘露糖醇和80ml 20％白蛋白溶液作為補(bǔ)充劑。將這些組合物用作保存兔心臟的灌流介質(zhì)。在37℃下進(jìn)行循環(huán)方式的Langendorff灌流。記錄維持心臟收縮的頻率和幅度的時間。對照組和測試組分別使用8只心臟。在使用基于氟碳化合物的灌流液體中，將離體兔心臟的收縮能力至少保持了6-8小時。但是用對照組合物灌流中，卻觀察到心臟收縮頻率和幅度的大幅下降直至心臟停搏。
總之，應(yīng)提及本發(fā)明的乳劑和與本發(fā)明最接近的原型和乳劑相比，其優(yōu)點如下。
本發(fā)明的氟碳乳劑制劑和制備方法確保得到微細(xì)分布、規(guī)定粒徑范圍在0.06至0.195μm之間的高標(biāo)準(zhǔn)乳劑，其含有2-40體積％的氟碳化合物，并用于生物學(xué)可接受的水鹽溶液中的磷脂分散體進(jìn)行穩(wěn)定化。已證明以非冷凍狀態(tài)儲存18個月所述氟碳乳劑仍具有高的細(xì)度和微結(jié)構(gòu)，使獲得高度的生物相容性成為可能，其表現(xiàn)為低的反應(yīng)原性。所研制的乳劑可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)目的，即用于大量失血的替代物，用于治療失血性休克，用于預(yù)防缺血性再灌注損傷，用于制備移植器官和用于灌流保存離體器官。所研制的乳劑具有非常顯著的氧運輸和流變學(xué)性質(zhì)，確保預(yù)防和消除氧依賴性線粒體功能的缺血損傷，以及支持組織在血液替代和治療失血性休克中的有氧能量交換。
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權(quán)利要求
1.醫(yī)用氟碳乳劑，其包含迅速清除的氟碳化合物如全氟萘烷或全氟辛基溴，以及氟碳補(bǔ)充劑和磷脂，其特征在于全氟萘烷和全氟辛基溴的組合物作為迅速清除的組分，其中所述氟碳補(bǔ)充劑代表全氟叔胺混合物，而所述磷脂作為在水鹽介質(zhì)中的分散體使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于其含有2-40體積％的氟碳化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于所述迅速清除的氟碳化合物的組合物含有比例為10∶1至1∶10的全氟萘烷和全氟辛基溴。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于所述氟碳補(bǔ)充劑占所述迅速清除的氟碳化合物的組合物總含量的1-50％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于所述全氟叔胺混合物含有全氟三丙胺與其副產(chǎn)物即全氟-1-丙基-3，4-二甲基吡咯烷酮和全氟-1-丙基-4-甲基哌啶的順式和反式異構(gòu)體的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和5的乳劑，其特征在于所述全氟叔胺混合物還含有全氟-N-甲基環(huán)己基哌啶及其副產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于其含有濃度為0.2-5重量％的在水鹽介質(zhì)中的磷脂分散體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于所述在水鹽介質(zhì)中的磷脂分散體含有卵磷脂或大豆磷脂或這些脂質(zhì)的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于所述在水鹽介質(zhì)中的磷脂分散體含有輔劑植物油，其量為所述磷脂總含量的1-15％。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的乳劑，其特征在于大豆油作為輔劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的乳劑，其特征在于葵花子油作為輔劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的乳劑，其特征在于蓖麻油作為輔劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的乳劑，其特征在于以有效比例的所述油的混合物以兩倍或三倍混合物的形式作為輔劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于所述水鹽介質(zhì)的組合物含有氯化物和磷酸鹽的鈉鹽和鉀鹽，并還含有在注射用水中的單糖甘露糖醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的乳劑，其特征在于所述在水鹽介質(zhì)中的組分的濃度具有100-350mosmol/l的滲透壓。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15之任一項的乳劑，其特征在于平均粒徑不超過0.2μm，并在0.06-0.2μm的范圍內(nèi)。
17.制備氟碳乳劑的方法，其包括在高壓下均化，其特征在于經(jīng)多步驟進(jìn)行，所述多步驟即制備在水鹽介質(zhì)中的磷酯分散體的第一步，將氟碳化合物在磷脂分散體中均化的第二步，將制備的乳劑加熱滅菌的第三步，以及之后在+4℃下以非冷凍狀態(tài)儲存至少6個月的第四步。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于所述在水鹽介質(zhì)中的磷脂分散體通過在至少100atm的高壓下均化，隨后加熱滅菌來制備。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于將所述磷脂分散體中的氟碳化合物在300-650atm壓力下均化。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于將所述磷脂分散體在100℃下滅菌。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于將所述氟碳乳劑在100℃下滅菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，特別是用于治療血液喪失、缺氧和缺血病癥，用于改善血液氧運輸，以及用于保存離體灌流器官和組織的藥物。本發(fā)明的全氟有機(jī)化合物的醫(yī)用乳劑包含迅速清除的全氟有機(jī)化合物如全氟萘烷或全氟辛基溴、全氟叔胺混合物形式的全氟有機(jī)補(bǔ)充劑和水鹽分散體形式的磷脂。所述全氟萘烷和全氟辛基溴以10∶1至1∶10的比例包含在迅速清除的全氟有機(jī)化合物組分中。全氟叔胺混合物是全氟三丙胺與其副產(chǎn)物全氟－1－丙基－3，4－二甲基吡咯烷酮和全氟－1－丙基－4－甲基哌啶順式和反式異構(gòu)體的混合物的形式。本發(fā)明的制備乳劑的方法在于制備磷脂的水鹽分散體，在高壓下將其中的全氟有機(jī)化合物均化以及將最終乳劑加熱滅菌。本發(fā)明的乳劑在+4℃下以其非冷凍狀態(tài)的儲存期等于至少6個月，此期間保持了所述乳劑與生物介質(zhì)(血液、血漿或血清)之間的生物相容性。
文檔編號A61P7/00GK101014326SQ200580013930
公開日2007年8月8日 申請日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者伊琳娜·尼古拉伊夫娜·庫茲涅佐娃, 葉夫根尼·伊利?！っ芬练蛩够?申請人:葉夫根尼·帕夫洛維奇·格爾馬諾夫, 伊琳娜·尼古拉伊夫娜·庫茲涅佐娃, 葉夫根尼·伊利希·梅伊夫斯基