專利名稱：核酸微球體，其制備和遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及核酸微球體的制備及其遞送，特別是為了誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的耐受性以處理醫(yī)學(xué)問題。更特別的，本發(fā)明涉及借助于采用含水條件制備的微球體的藥物遞送技術(shù)。所述微球體可摻入干擾RNA，質(zhì)粒DNA、反義(AS)寡核苷酸或其它核酸。這些微球體用于在體內(nèi)和原位改變細(xì)胞功能。
背景技術(shù)：
微粒體、微球體和微膠囊是具有小于一毫米，更優(yōu)選小于100微米直徑的固體或半固體顆粒，其可由各種材料，包括合成聚合物、蛋白質(zhì)和多糖形成。微球體已經(jīng)被用于很多不同的應(yīng)用中，主要是分離、診斷和藥物遞送。
從合成聚合物、天然聚合物、蛋白質(zhì)和多糖制備這些微球體可應(yīng)用很多不同的技術(shù)，包括相分離、溶劑蒸發(fā)、乳化和噴霧干燥。通常，這些聚合物形成這些微球體的支持結(jié)構(gòu)，并且目的藥物被摻入到該聚合物結(jié)構(gòu)中。用于形成微球體的示例的聚合物包括描述于Ruiz的美國(guó)專利5,213,812，Reid等人的美國(guó)專利5,417,986，Tice等人的美國(guó)專利4,530,840，Tice等人的美國(guó)專利4,897,268，Tice等人的美國(guó)專利5,075,109，Singh等人的美國(guó)專利5,102,872，Boyes等人的美國(guó)專利5,384,133，Tice等人的美國(guó)專利5,360,610和Southern Research Institute的歐洲專利申請(qǐng)公開248,531中的乳酸和乙醇酸的均聚物和共聚物(PLGA)；描述于Illum的美國(guó)專利4,904,479中的嵌段共聚物，例如特窗908(tetronic 908)和普羅沙姆407(poloxamer 407)；以及描述于Cohen等人的美國(guó)專利5,149,543中的聚偶磷氮(polyphosphazenes)。采用例如這些聚合物制備的微球體表現(xiàn)差的裝載率并經(jīng)常只能夠?qū)⑿“俜致实哪康乃幬飺饺氲剿鼍酆衔锝Y(jié)構(gòu)中。因此，經(jīng)常必須用相當(dāng)大量的微球體給藥以獲得治療效果。
球狀小珠或顆粒作為生物化學(xué)家的工具已經(jīng)商業(yè)化很多年了。例如，結(jié)合于小珠的抗體形成特異于特定配體的相對(duì)大的顆粒。該被抗體包被的大顆粒通常被用于交聯(lián)在細(xì)胞表面上的受體以活化細(xì)胞，被結(jié)合于固相用于免疫親和純化，并可用于遞送隨時(shí)間緩慢釋放的治療劑，利用結(jié)合于所述顆粒的組織或腫瘤特異性抗體以使所述治療劑靶向于所需的位點(diǎn)。
將抗體共價(jià)結(jié)合到固相基質(zhì)上的常用方法是用化學(xué)結(jié)合試劑衍生小珠，然后將所述抗體結(jié)合到該活化的珠上。應(yīng)用合成聚合物小珠優(yōu)于應(yīng)用蛋白質(zhì)分子，其允許采用比許多蛋白質(zhì)可以耐受的更苛刻的衍生條件，且相對(duì)成本不高，并經(jīng)常形成穩(wěn)定于廣泛的變性條件的連接。很多衍生化的珠是商業(yè)化了的，它們都具有各種不同的組分和大小。由合成聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯或乳膠形成的小珠可購(gòu)自許多來(lái)源，例如Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(Richmond，Calif.)和LKB Produkter(Stockholm，Sweden)。由天然高分子和顆粒，例如瓊脂糖、交聯(lián)的瓊脂糖、球蛋白、脫氧核糖核酸和脂質(zhì)體形成的小珠可購(gòu)自如下來(lái)源例如Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Pharmacia(Piscataway，N.J.)和IBF(France)。由聚丙烯酰胺和瓊脂糖的共聚物形成的小珠可購(gòu)自如下來(lái)源例如IBF和Pharmacia。有磁性的小珠可購(gòu)自如下來(lái)源例如Dynal Inc.(Great Neck，N.Y.)。
目前可獲得的微粒體或小珠的一個(gè)缺點(diǎn)是它們都難于制造和成本高。由這些已知方法制備的微粒體具有寬的粒度分布，經(jīng)常缺少均勻性，并且當(dāng)活性組分的濃度高時(shí)不表現(xiàn)出長(zhǎng)期釋放動(dòng)力學(xué)。另外，用于這些已知方法的聚合物需要溶解在有機(jī)溶劑中以形成微粒體。因此它們必須在被設(shè)計(jì)成可處理有機(jī)溶劑的特殊設(shè)備中制備。這些有機(jī)溶劑可使包含于微粒體中的蛋白質(zhì)或肽變性。殘留的有機(jī)溶劑當(dāng)對(duì)人和動(dòng)物用藥時(shí)可能有毒。
另外，可獲得的微粒體幾乎沒有足夠小到適合穿過針頭的大小，所述的針頭通常用于給藥治療劑或用于通過吸入給藥。例如，采用聚乳酸乙醇酸(PLGA)制備的微球體是大的并有聚集的傾向。粒度選擇的步驟會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品損失，但對(duì)于除去對(duì)于注射而言過大的顆粒是必須的。用于注射的合適大小的PLGA顆粒，必須通過適應(yīng)大粒度的大規(guī)格針頭給藥，這經(jīng)常導(dǎo)致患者的不適。
通常，許多目前可獲得的微粒體被活化以在水相介質(zhì)中釋放它們的內(nèi)含物，因此它們必須被凍干以防止過早的釋放。另外，采用PLGA體系制備的這樣的顆粒表現(xiàn)出基于侵蝕和擴(kuò)散兩者的釋放動(dòng)力學(xué)。在這種類型的體系中，觀察到藥物的初始突釋或快速釋放。這種突釋效應(yīng)可在將所述顆粒給藥的病人中導(dǎo)致不希望的副作用。
用脂質(zhì)封裝目標(biāo)藥物而制備的微粒體是已知的。例如，在Sinil Kim的美國(guó)專利5,422,120中所述的那樣，環(huán)繞著多種水相隔室的雙層膜中排列以形成顆粒的脂質(zhì)，可以被用來(lái)封裝水溶性藥物用于隨后的遞送。這些粒度通常大于10微米并被設(shè)計(jì)用于關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和硬膜外給藥。另外，脂質(zhì)體已經(jīng)被用于小分子的靜脈遞送。脂質(zhì)體是由單獨(dú)或多個(gè)磷脂和膽固醇的雙層組成的球狀顆粒。脂質(zhì)體的大小為30微米或更大并且可以裝載多種水溶性或脂溶性藥物。脂質(zhì)體技術(shù)已經(jīng)被如下問題所阻礙，包括脂質(zhì)組分的純度、可能的毒性、囊泡異質(zhì)性和穩(wěn)定性、過度吸收和生產(chǎn)或保質(zhì)期困難。
醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)的目標(biāo)是將核酸遞送到到對(duì)象，包括但不限于動(dòng)物或哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞內(nèi)用于治療。例如，可將核酸相對(duì)有效地遞送到在培養(yǎng)物中(體外)的細(xì)胞內(nèi)，但當(dāng)將核酸遞送到動(dòng)物中時(shí)(體內(nèi))，核酸酶導(dǎo)致核酸快速降解。
除了保護(hù)核酸使其免于核酸酶消化，核酸遞送媒介物還必須顯示低毒性，必須有效地被細(xì)胞吸收并具有明確的、易于生產(chǎn)的配方。如在臨床試驗(yàn)中所示，用于遞送的病毒載體可能導(dǎo)致嚴(yán)重負(fù)面的、甚至致命的體內(nèi)免疫應(yīng)答。另外，這種方法具有在體內(nèi)致突變作用的可能性。通過將核酸封入不同配方的脂質(zhì)復(fù)合物(例如脂質(zhì)體或陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物)中而遞送，通常在體內(nèi)是無(wú)效的并可能有毒性作用。核酸與各種不同的聚合物或與肽組成的復(fù)合物已經(jīng)顯示出不一致的結(jié)果并且這些配方的毒性尚被解決。核酸已經(jīng)被封裝入聚合物基質(zhì)中用于遞送，但在這些情況下，這些顆粒具有寬的大小范圍并且用于治療性應(yīng)用的效果尚未被證明。
因此，對(duì)解決核酸的遞送問題和提供有效的核酸配方有需要。同樣，持續(xù)需求開發(fā)微球體和制備微球體的新方法。微球體及其制備已經(jīng)描述于Scott等人的美國(guó)專利6,458,387，Woiszwillo等人的美國(guó)專利6,268,053、6,090,925、5,981,719和5,599,719，和Woiszwillo的美國(guó)專利5,578,709中。這里明確指出的上述參考文獻(xiàn)和所有其它的參考文獻(xiàn)通過引用并入本發(fā)明中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是微球體及其制備方法和應(yīng)用，所述微球體包含生物活性劑，例如DNA、siRNA(沉默RNA，也公知為雙鏈RNA)、mRNA、tRNA，和所有其它核酸，包括但不限于寡核苷酸。據(jù)信本發(fā)明的微球體遞送方法防止了或阻止了所遞送的核酸與細(xì)胞核酸酶接觸，因此防止了治療用核酸的過早降解。
包含核酸的微球體可用于治療各種不同疾病，包括但不限于自身免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化、1型糖尿病、銀屑病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、Berger氏病(IgA腎病)、慢性疲勞綜合癥、Crohn氏病、皮肌炎、纖維肌痛、Grave氏病、橋本氏甲狀腺炎、扁平苔癬、重癥肌無(wú)力、odopathic血小板減少性紫癜、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、Sjogren綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎和白癲風(fēng)。另外，所述微球體可用于治療其它樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞相關(guān)的疾病或其它的基于吞噬細(xì)胞的疾病或癥狀，包含可以通過反義寡核苷酸或siRNA方法而治療、調(diào)?；驕p輕的那些疾病，等等。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，向?qū)ο筮M(jìn)行AS寡核苷酸的微球體遞送，以誘導(dǎo)與發(fā)作于個(gè)體中的與解決1型糖尿病相關(guān)的樹突細(xì)胞耐受性。包含AS寡核苷酸的微球體用水相條件制備。這些微球體在對(duì)象中被用于抑制基因表達(dá)并用于防止自身免疫性糖尿病類型病癥。本發(fā)明的微球體可被用于治療正在發(fā)作的疾病或用作預(yù)防性治療。
本發(fā)明的微球體還可包含多種生物活性試劑，包括寡核苷酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，合成了靶向于CD40，CD80和CD86初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的三種AS-寡核苷酸，并且制備了寡核苷酸混合物的水溶液并將其與聚合物溶液組合。處理完成后，就得到了包含所述寡核苷酸的微球體。
本發(fā)明微球體的制備可以通過使用或不使用交聯(lián)試劑、聚陽(yáng)離子、聚陰離子和/或能源，例如熱而進(jìn)行。
本發(fā)明的微球體尤其很好地適合于體內(nèi)并且以原位方法給藥，例如直接皮下遞送。在這方面的一個(gè)應(yīng)用是用于治療皮下腫瘤在和治療病毒感染。所述微球體可通過各種不同的其它給藥途徑而遞送，包括但不限于，口、肺部、鼻腔、靜脈、肌內(nèi)、皮下、局部、眼部、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和栓劑給藥，及其組合。
本發(fā)明的微球體還可用于診斷目的，包括但不限于基因診斷。
本發(fā)明的這些和其它的方面、目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，包括各種不同的組合，通過考慮如下詳細(xì)的說(shuō)明而可變得明顯和清楚地理解。


在這一部分說(shuō)明中，將參考所附附圖，其中圖1為示意圖，說(shuō)明了在1型糖尿病中胰腺的胰島素生成β細(xì)胞的自身免疫破壞中的樹突細(xì)胞的作用；圖2為包含β-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒DNA載體的圖；圖3顯示光學(xué)顯微照片，其提供了用包含β-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒DNA(pDNA)微球體轉(zhuǎn)染NIH 3T3纖維原細(xì)胞的證據(jù)；圖4為無(wú)保護(hù)的pDNA和本發(fā)明的兩種pDNA微球體制劑的瓊脂糖電泳凝膠的光學(xué)顯微照片，分別都是暴露于DNA酶后；圖5為在四種不同質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染應(yīng)用中，β-半乳糖苷酶活性的直方圖；圖6至圖9為AS-寡核苷酸和聚L-賴氨酸聚陽(yáng)離子的微球體的掃描電子顯微圖；圖10至圖13為包含AS-寡核苷酸和聚L-鳥氨酸聚陽(yáng)離子的微球體的掃描電子顯微圖；圖14和圖15為無(wú)聚陽(yáng)離子組分而形成的AS-寡核苷酸的微球體的掃描電子顯微圖；圖16的圖概括了用本發(fā)明的微球體和根據(jù)其它用于遞送靶向于三種初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的AS-寡核苷酸的方法治療的三組NOD小鼠中糖尿病的發(fā)病率；和圖17為本發(fā)明SiRNA微球體的掃描電子顯微圖(SEM)。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述所需的本發(fā)明詳述的實(shí)施方案在本文中公開；然而，應(yīng)當(dāng)明白，所公開的實(shí)施方案僅僅是本發(fā)明的示例，其可以以各種不同的形式實(shí)施。因此，本文中所公開的特定的細(xì)節(jié)不應(yīng)被認(rèn)為是限制性的，它僅僅是權(quán)利要求的基礎(chǔ)和教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員以實(shí)際上任何適合的方式變化性應(yīng)用本發(fā)明的基礎(chǔ)。
通常本發(fā)明的微球體包含一種或多種活性劑，這些微球體優(yōu)選基本上是球狀，并具有適合于細(xì)胞吸收的基本上窄的大小分布。所述微球體可通過包括非腸道遞送的可選擇的給藥方法、通過口服途徑、通過肺部途徑、通過眼部途徑、通過使用貯庫(kù)體系和其它給藥途徑而遞送。
所述微球體包含核酸活性劑，例如DNA、RNA、siRNA、mRNA、tRNA和其它類型的核酸，包括但不限于RNA或DNA寡核苷酸，及其組合。本發(fā)明優(yōu)選的微球體包含一種或多種寡核苷酸。所述微球體用作治療劑用于治療各種疾病和/或用作診斷工作的工具，包括但不限于功能基因組的。例如，反義寡核苷酸微球體通過阻止mRNA接觸核糖體而干擾蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程的翻譯階段。將所述反義微球體遞送到患病的細(xì)胞、病毒或細(xì)菌中，在那里它們特異性結(jié)合(雜交)于其靶mRNA。結(jié)果，所述mRNA被分解并因此不能由核糖體轉(zhuǎn)錄為功能蛋白質(zhì)。因此反義微球體是一種有效的工具，其抵抗與身體中蛋白質(zhì)過度表達(dá)和/或不足表達(dá)有關(guān)的疾病，例如在自身免疫性疾病中發(fā)生的那樣。
反義寡核苷酸的重要優(yōu)點(diǎn)是它們是高度特異的，因?yàn)樗鼈円种埔环N基因的表達(dá)。同樣，反義寡核苷酸也是通用的，因?yàn)槔碚撋峡梢蚤_發(fā)出抵抗任何基因及其mRNA的AS寡核苷酸；DNA序列是對(duì)于AS核苷的設(shè)計(jì)唯一需要的信息。AS寡核苷酸對(duì)動(dòng)物或人的培養(yǎng)細(xì)胞也是有效的。本發(fā)明的反義寡核苷酸微球體也是“可檢驗(yàn)的”，因?yàn)樗鼈冇捎诰哂蟹浅Ｌ禺愋缘奈恢貌⒛苡脽晒鈽?biāo)記物標(biāo)記而是診斷有用的。
已知寡核苷酸易于被熱、搖晃和其它機(jī)械和化學(xué)處理所破壞，所以它們不能長(zhǎng)久附著于靶核酸并阻斷它們的作用。同樣已知蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸等在體內(nèi)具有非常短的壽命(幾分鐘到幾小時(shí))，因此需要有效地遞送到細(xì)胞，并且在一些情況下，直接向細(xì)胞核遞送以避免酶降解。因此，一般來(lái)說(shuō)這些試劑不能成功地“無(wú)保護(hù)”地遞送，而是需要被保護(hù)或配成制劑以允許它們?cè)隗w內(nèi)遞送。
本發(fā)明的寡核苷酸通過摻入微球體中而保持了它們的生物活性。另外，所述微球體還提供高的裝載能力。換句話說(shuō)，較大劑量的治療用核酸可以通過劑量給藥基于所述微球的總重的高濃度(例如30-100重量％的核酸)的微球而向?qū)ο蠼o藥。本文中除非另外明確說(shuō)明，百分比是基于組合物的總重的重量百分比。所述微球體提供用于反義寡核苷酸和其它類型核酸分子的非病毒遞送工具。
所述微球包含基本上是球狀形式的生物活性化合物。典型地，該微球體據(jù)有基本上窄的粒度分布，其平均粒度為不大于50微米。典型地，所述粒度將小于10微米，更典型地小于5微米。優(yōu)選它們具有窄的大小分布，其中平均粒度約為0.04至約8微米，或者為約0.1至約約4微米，或者約0.2至約4微米，或者約0.4至約4微米，和為了需要約1微米的微球體的應(yīng)用，優(yōu)選約1至約3微米。平均粒度可以為例如約2微米，并且所述粒度范圍可以調(diào)整以適合于所需的應(yīng)用。
所述微球體優(yōu)選包含基本上是無(wú)定形的或非結(jié)晶的核酸，即它們是無(wú)定形狀態(tài)或半結(jié)晶形式。如本文中所用的，“無(wú)定形”指核酸的通常無(wú)規(guī)的固態(tài)形式，其中在微球體中不存在一種或多種核酸的晶格，而“半結(jié)晶”指核酸的通常無(wú)規(guī)的固態(tài)形式，其中微球體的核酸內(nèi)含物包含小于50％晶格形式的一種或多種核酸。
以具有所需大小的微球體形式遞送生物活性化合物可增強(qiáng)藥物的功效并減少浪費(fèi)。這還可以減少由高劑量活性劑導(dǎo)致的反作用。所述微球體的大小可確定它靶向于什么器官。另外，控制用于體內(nèi)生物試劑遞送的微球的優(yōu)化的粒度是重要的，因?yàn)橹挥刑囟ù笮〉奈⑶蚩梢员话屑?xì)胞吸收。比本文中所描述的更大的微球體可能引發(fā)巨噬細(xì)胞和其它免疫機(jī)制降解所述生物顆粒，而更小的微球體可能溶解過快。
在制造微球體過程中，將所需的生物試劑，典型的為寡核苷酸或其它核酸化合物，溶解于水溶液中。將其與水溶性的一種或多種聚合物相結(jié)合，所述聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG)及其組合。所述水溶性聚合物不形成所述微球體的基本部分，就算形成，也只是幫助制備微球體。所述核酸可構(gòu)成微球體組合物的最多至100重量％。典型的，它們將構(gòu)成至少20重量％，典型地至少約30重量％，優(yōu)選至少約50重量％，更優(yōu)選至少70重量％，和最優(yōu)選至少約90重量％。所述核酸可構(gòu)成微球體的至少約95重量％。通常優(yōu)選在含水/水溶性的一種或多種聚合物混合物中，在中等酸度pH下形成微球體。例如經(jīng)常將一種或多種聚合物溶解于緩沖溶液中，例如pH為約5.3的乙酸鈉。通過這種常規(guī)技術(shù)，微球體還可用其它聚合物制備，例如多糖，包括帶正電荷的和帶負(fù)電荷的多糖和其它生物相容性高分子。組分加入的順序可以變化以形成具有不同化學(xué)和物理性質(zhì)，例如大小、形態(tài)和/或表面電荷的微球體。
在一些微球體的制備中，優(yōu)選在形成所述微球體前，將核酸與聚陽(yáng)離子結(jié)合。然而避免使用聚陽(yáng)離子在一些例子中可能是有利的，因?yàn)橐恍╆?yáng)離子能與毒性問題關(guān)聯(lián)。使用聚陰離子，聚陰離子交聯(lián)劑，或其它交聯(lián)試劑也可以用于制備這些微球體。優(yōu)選的聚陰離子的例子是聚賴氨酸和聚鳥氨酸。其它的包含聚乙烯亞胺(PEI)、醇溶蛋白、精蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚精氨酸、乙烯胺，及其組合。
當(dāng)微球體的制備中和在微球體中包含聚陽(yáng)離子組分時(shí)，它可以以形成微球體的總組合物的約0至約80重量％的水平存在。用聚陽(yáng)離子制成的微球體可包含至少約2重量％，或者可包含至少約5重量％、或可包含至少約10重量％、或可包含至少約20重量％、或可包含至少約30重量％的聚陽(yáng)離子，其它的部分，通常包含核酸。
在一些微球體生產(chǎn)的應(yīng)用中，向所述組合物提供能量(例如以熱或其它能源的形式)以利于制備微球體制劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能量的加入可用于制備本發(fā)明的一些類型的微球體。
所述微球體組合物可包含多種生物活性化合物。因此，所述的微球體，無(wú)論單獨(dú)的或聚集成組微球體，可包含多于一種的核酸，例如，一種或多種寡核苷酸。另外，在核酸微球體形成后可向核酸微球的表面加入其它的分子，包括但不限于抗體、受體配體或化學(xué)吸引劑。
盡管很多技術(shù)可用于制備本發(fā)明微球體(參見通過引用并入本發(fā)明的參考文獻(xiàn))，但下文已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特別用于制備本發(fā)明微球體的方法。
通過包含聚陽(yáng)離子∶核酸的體積比為約0.5∶1至約4∶1的聚陽(yáng)離子而制備核酸混合物的水溶液。制備聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇的聚合物溶液并與包含核酸的溶液結(jié)合。通過加熱或冷卻或二者組合而改變組合溶液的溫度，并且多次離心和洗滌提供水相濃縮懸浮液，通常將其冷凍和凍干以形成包含一種或多種核酸和聚陽(yáng)離子的微球體的干燥粉末。在形成微球體之前，混合物的溫度可以從室溫以約0.1至約400℃/分鐘的速度被降低和升高。對(duì)于冷卻應(yīng)用，一般將所述混合物從約35℃冷卻到約-196℃。并且對(duì)于加熱應(yīng)用，將所述混合物從約4℃加熱到約100℃。
可將其它的賦形劑加入到最終的組合物中或形成預(yù)微球體的混合物中，例如多糖、帶正電或負(fù)電荷的多糖和其它優(yōu)選為生物相容性的聚合物。加入的順序可以改變，其可導(dǎo)致形成具有不同化學(xué)和/或物理性質(zhì)的微球體。其它部分可加到表面上作為，例如，化學(xué)吸引劑或受體配體。
本發(fā)明的微球體是用于質(zhì)粒DNA、反義寡核苷酸和其它核酸分子的非病毒遞送媒介物。
本發(fā)明的微球體組合物可以為液體懸浮體的形式(優(yōu)選為水相的)，干燥粉末形式，在有機(jī)溶劑中的懸浮體或以固體形式微封裝入其它聚合物中。
如上所述，本發(fā)明的微球體的可通過各種不同的給藥途徑而劑量給藥?；钚运幬锏膶?shí)際給藥劑量、要被劑量給藥的制劑的濃度和制劑的體積將由有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生決定并通常依賴于許多因素，包括但不限于，要被治療的對(duì)象的要被治療的疾病或癥狀、年齡、性別和體重，用于治療特定靶的核酸的效力，在劑量制劑中核酸的濃度等等。本文中所用的，“有效的量”指本發(fā)明微球體防止、治療或改善在對(duì)象中的疾病或癥狀的量。
本發(fā)明微球體具有特殊保護(hù)的特征。用β-半乳糖苷酶微球體的體外研究表明該微球體形式保護(hù)了所述DNA免受核酸酶破壞?？紤]到減緩降解，DNA和寡核苷酸經(jīng)常被硫醇化。例如一般AS-寡核苷酸為硫醇化的形式。因?yàn)槲⑶蝮w的保護(hù)特征，對(duì)于這種硫醇化形式的需要可以減弱或根本不需要。
本發(fā)明優(yōu)選的方法的目的是將本文中所述的靶向于CD40、CD80和CD86的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的反義(AS)-寡核苷酸微球體通過配成制劑和注射而防護(hù)或改進(jìn)自身免疫性胰島素依賴糖尿病。這些寡核苷酸已經(jīng)被設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)免疫耐受性以防止在NOD小鼠模型中的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞的破壞。導(dǎo)致這些β細(xì)胞破壞的的事件圖解于圖1中。其說(shuō)明了1型糖尿病如何通過在NOD小鼠中以及人中的胰腺的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞的自身免疫破壞而顯現(xiàn)出來(lái)。在糖尿病臨床發(fā)作期，人保持10-20％他們剩余的β細(xì)胞量。這些殘余量的剩余能力可導(dǎo)致足夠保持調(diào)整葡萄糖水平的胰島素水平。優(yōu)選的本發(fā)明的微球體被提供以干擾這些β細(xì)胞的自身免疫性破壞，這圖解于圖1中。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，樹突細(xì)胞(DC)可被激活為有效的抗原提呈細(xì)胞，這種細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于所有組織中并在皮膚下高度富集。這些抗原提呈樹突細(xì)胞的功能是通過激活特別是在淋巴結(jié)中的T細(xì)胞而作為免疫應(yīng)答的引發(fā)劑。
圖2描繪了包含β-半乳糖苷酶基因質(zhì)粒載體，其用于轉(zhuǎn)染NIH 3T3纖維原細(xì)胞。用質(zhì)粒DNA微球體轉(zhuǎn)染NIH 3T3纖維原細(xì)胞的體外證據(jù)示于圖3中，其為響應(yīng)于加入β-半乳糖苷酶X-gal基質(zhì)細(xì)胞的外觀被染成藍(lán)色。
圖4圖解了體外微球體保護(hù)溶液中DNA的能力。該圖描繪的瓊脂糖電泳凝膠顯示通過通常如本發(fā)明中指明的那樣制備的質(zhì)粒DNA微球體給予了對(duì)核酸酶的保護(hù)。在質(zhì)粒樣品1、2和3中，無(wú)保護(hù)的質(zhì)粒DNA暴露于DNA酶，用拖尾表示三個(gè)水平的的DNA酶暴露中每個(gè)水平下質(zhì)粒DNA的降解。在顆粒1和顆粒2樣品中，將質(zhì)粒DNA微球體制劑暴露于DNA酶。缺少拖尾表明該微球體制劑表現(xiàn)出其防護(hù)了質(zhì)粒DNA使其免于降解。
圖5在四種不同的質(zhì)粒DNA應(yīng)用中定量轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶活性的表達(dá)水平。無(wú)保護(hù)的質(zhì)粒DNA應(yīng)用顯示非常低的水平。對(duì)于用脂質(zhì)體(lipofectamine)，市售的陽(yáng)離子脂質(zhì)作為遞送媒介物的質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物的轉(zhuǎn)染，其顯示出一定程度上較大的水平。對(duì)于兩種質(zhì)粒DNA微球體制劑，其顯示出基本較大的活性，其中微球體1相應(yīng)于圖4的顆粒1，和微球體2相應(yīng)于圖4的顆粒2。
為了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，下文中的實(shí)施例列舉了本發(fā)明的一些特征和優(yōu)點(diǎn)。這些實(shí)施例不應(yīng)認(rèn)為是限制性的或另外限定了本發(fā)明。
實(shí)施例1靶向于CD40、CD80和CD86初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的三種AS-寡核苷酸通過Pittsburgh(Pittsburgh，Pa.)大學(xué)的DNA合成儀器合成。該AS寡核苷酸序列如下，星號(hào)表明硫醇化，
Seq ID 1CD 40-AS5’C*AC*AG*C C*GA*GG*C*AA*AGA*C*AC*C A*T*G C*AG*GG*C*A-3’Seq ID 2CD80-AS5’-G*GG*AA*A G*CC*AG*G A*AT*CT*AG*AG*CC*A A*TG G*A-3’Seq ID 3CD86-AS5’-T*GG*GT*G C*TT*CC*G T*AA*GT*T C*TG*GA*A C*AC*G*T*C-3’所述寡核苷酸混合物的水溶液通過組合等分的每份都包含一種類型寡核苷酸的三份寡核苷酸溶液制備寡核苷酸混合物的水溶液，以形成10mg/ml的三種類型寡核苷酸溶液。制備四批寡核苷酸混合物水溶液。制備10mg/ml的去離子水中的聚L-賴氨酸·HBr(聚L-賴氨酸·HBr最高至50,000，得自Bachem，King of Prussia，PA)。如表1所述，將聚L-賴氨酸·HBr以體積比為1∶1、2∶1、3∶1和4∶1的比例加入到寡核苷酸溶液中。批次標(biāo)記為1、2、3和4。將該混合物小心地渦旋振蕩。制備25％的聚合物溶液，其包含在pH為5.5的1M乙酸鈉(光譜純，Gardena，CA)中的12.5％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，40,000道爾頓，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(聚乙二醇，3,350道爾頓，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)。將該聚合物溶液以如表1所述的2∶1的體積比加入到批次1-4中，表1表示在批次1-4中的AS寡核苷酸、聚L-賴氨酸·HBr和PEG/PVP的體積表1

將所述批次在70℃下溫育30分鐘，然后冷卻到23℃。當(dāng)冷卻時(shí)，該溶液變混濁并出現(xiàn)沉淀。然后將該懸浮液離心，除去過量的PEG/PVP。形成的沉淀通過將沉淀再次懸浮于去離子水中，離心和除去上層清液而洗滌。洗滌過程重復(fù)三次。將該水相的濃縮懸浮體冷凍并凍干以形成包含寡核苷酸和聚L-賴氨酸的微球體的干燥粉末。
圖6表示批次1(聚L-賴氨酸∶寡核苷酸比例為1∶1)的掃描電子顯微照片(SEM)。制成的微球體大小為0.5-4μm，平均粒度為大約2.5μm。還觀察到未知物質(zhì)的沉淀。通過HPLC進(jìn)行的進(jìn)一步的研究表明該沉淀包括殘留的PEG/PVP，主要是PVP。
圖7表示批次2(聚L-賴氨酸∶寡核苷酸比例為2∶1)的SEM。制成的微球體大小為0.2-4μm，平均粒度為大約1μm。
圖8表示批次3(聚L-賴氨酸∶寡核苷酸比例為3∶1)的SEM。制成的微球體大小為0.2-4μm，平均粒度為約1μm。還觀察到未知物質(zhì)的沉淀。通過HPLC進(jìn)行的進(jìn)一步的研究確定該沉淀包括殘留的PEG/PVP，主要是PVP。
圖9表示批次4(聚L-賴氨酸∶寡核苷酸比例為4∶1)的SEM。制成的微球體大小為0.2-6μm。粒度具有多分散性，其中大約一半的顆粒具有1μm的平均粒度，和一半的顆粒具有5μm的平均粒度。
實(shí)施例2靶向于CD40、CD80和CD86初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的AS寡核苷酸為實(shí)施例1的AS寡核苷酸序列。通過組合等分的每份溶液包含一種類型的寡核苷酸的三份寡核苷酸溶液制備寡核苷酸混合物的水溶液，以形成10mg/ml的三種類型寡核苷酸的溶液。制備四批該寡核苷酸混合物的溶液。制備5mg/ml的聚L-鳥氨酸·HBr的(得自Sigma的聚L-鳥氨酸·HBr11,900(vis))去離子水溶液。
將聚L-鳥氨酸·HBr以如表2所述不同的體積比加到寡核苷酸溶液中。批次標(biāo)記為1、2、3和4。將該混合物溫和地渦旋振蕩。制備25％的聚合物溶液，其包含在pH為5.5的0.1M乙酸鈉(SpectrumChemicals，Gardena，CA)中的12.5％PVP(40,000道爾頓，SpectrumChemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(3,350道爾頓，SpectrumChemicals，Gardena，CA)。將該聚合物溶液以如表2所述的不同體積比加入到批次1-4中。如實(shí)施例1所述的那樣進(jìn)行溫育和沖洗。表2提供了AS寡核苷酸、聚L-鳥氨酸-HBr和PEG/PVP在批次1-4中的體積表2

圖10表示批次1(聚L-鳥氨酸∶寡核苷酸比例為1∶1)的SEM。制成的微球體大小為0.2-8μm，平均粒度為約2μm。還觀察到未知物質(zhì)的沉淀。另外的HPLC研究證明該沉淀包括殘留的PEG/PVP，主要是PVP。
圖11表示批次2(聚L-鳥氨酸∶寡核苷酸比例為2∶1)的SEM。制成的微球體大小為0.2-8μm，平均粒度為約2μm。許多微球體聚集在一起。還觀察到未知物質(zhì)的沉淀。另外的HPLC研究證明該沉淀包括殘留的PEG/PVP，主要是PVP。
圖12表示批次3(聚L-鳥氨酸∶寡核苷酸比例為1∶1，只有PEG)的SEM。形成無(wú)定形的沉淀。這說(shuō)明在配方中存在的PVP對(duì)微球體形成具有重要的作用。
圖13表示批次4(聚L-鳥氨酸∶寡核苷酸比例為1∶3，只有PEG)的SEM。形成大小為10-50μm的多孔微球體，碎裂的微球體和2-10μm的系列的聚集的微球體。沒有看到單個(gè)的微球體。這批表明在配方中存在的PVP對(duì)微球體形成具有重要的作用。
實(shí)施例3靶向于CD40、CD80和CD86初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的AS寡核苷酸用具有實(shí)施例1的寡核苷酸序列合成。通過組合等分的每份溶液包含一種類型的寡核苷酸的三份寡核苷酸溶液制備寡核苷酸混合物的水溶液，以形成10mg/ml的三種類型寡核苷酸的溶液。制備兩批寡核苷酸混合物的溶液。
制備25％的聚合物溶液，其包含在pH為5.5的0.1M乙酸鈉(光譜純化學(xué)品，Gardena，CA)中的12.5％PVP(40,000道爾頓，SpectrumChemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(3,350道爾頓，SpectrumChemicals，Gardena，CA)。同樣制備25％PEG的0.1M乙酸鈉，pH為5.5的溶液。將這些聚合物溶液以如表3所述的不同體積比加入到批次1-2中。如實(shí)施例1所述的那樣進(jìn)行溫育和沖洗。表3提供了在批次1-2中AS寡核苷酸、PEG/PVP和PEG的體積表3

圖14表示批次1(PEG∶寡核苷酸2∶1)的SEM。形成無(wú)定形的沉淀。這批再次說(shuō)明存在PVP對(duì)微球體形成具有重要的作用。
圖15表示批次2(PEG/PVP∶寡核苷酸2∶1)的SEM。形成具有粒度分布為0.2-6μm的微球體，也觀察到未確定來(lái)源的長(zhǎng)鏈。這批表明沒有聚陽(yáng)離子微球體也能形成。
實(shí)施例4用具有1型糖尿病的NOD小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)研究。如圖1所述，1型糖尿病通過胰腺的產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞的的自身免疫破壞而顯現(xiàn)。AS寡核苷酸在三種應(yīng)用中嘗試被用于干擾β-細(xì)胞的自身免疫破壞。目的是通過靶向于CD40、CD80和CD86的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本而干擾樹突細(xì)胞功能，所述轉(zhuǎn)錄本編碼對(duì)于激活T細(xì)胞所需的樹突細(xì)胞表面蛋白。具有低水平CD40、CD80和CD86的樹突細(xì)胞已知用于在體內(nèi)促進(jìn)抑制性免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)可導(dǎo)致T細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)β-細(xì)胞反應(yīng)低下。
在第一組測(cè)試動(dòng)物中，從NOD小鼠的骨髓祖細(xì)胞離體增殖樹突細(xì)胞。將三種靶向于CD40、CD80和CD86初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的AS寡核苷酸組合加入到組織培養(yǎng)的細(xì)胞中。溫育后，將AS寡核苷酸轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞注射到5-8周(尚未有糖尿病)齡的有血緣關(guān)系的(syngenetic)受體中。這就是離體遞送方式。
平行的，將AS寡核苷酸微球體直接注射到其它同樣年齡的NOD小鼠中。在每個(gè)如此處理的小鼠上進(jìn)行單針注射。另一組這些NOD小鼠不被處理并用作對(duì)照。
圖16顯示對(duì)照的，未處理的NOD小鼠在23周齡時(shí)都出現(xiàn)糖尿病。用離體AS寡核苷酸轉(zhuǎn)染和重新注入樹突細(xì)胞(AS-ODN DC)而處理的組顯示出其延遲了糖尿病發(fā)作，其中20％“未發(fā)作糖尿病”，這說(shuō)明葡萄糖水平被保持在非糖尿病范圍。直接用微球體在體內(nèi)注射的NOD小鼠，71％在43周時(shí)“未發(fā)作糖尿病”。
實(shí)施例5用熒光Cy3標(biāo)記短鏈干擾RNA雙鏈，siGLO環(huán)孢素A受體BsiRNA(小鼠)，得自Dharmacon(Lafayette，CO)。所述雙鏈RNA序列示如Seq ID 4和它的互補(bǔ)序列Seq ID 5所示Seq ID 4環(huán)孢素A受體B siRNA 5’-GGAAAGACUGUUCCAAAAAUU-3’Seq ID 5互補(bǔ)序列5’-UUUUUGGAACAGUCUUUCCUU-3’SiRNA的水溶液被制成為15mg/mL的溶液。同樣，制備15mg/mL的聚L-賴氨酸·HBr的去離子水(聚L-賴氨酸30,000-70,00MW，Sigma)。將聚L-賴氨酸以體積比為1∶1加入到siRNA中，如表1所述。將該混合物溫和地渦旋振蕩。制備25％的聚合物溶液，其包含在pH為5.5的1M乙酸鈉(Spectrum Chemicals，Gardena，CA)中的12.5％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，40,000道爾頓，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)和12.5％PEG(聚乙二醇，3,350道爾頓，Spectrum Chemicals，Gardena，CA)，。將該聚合物溶液以如表4所述的2∶1的體積比加入到siRNA/聚L-賴氨酸混合物中，表4顯示siGLO siRNA雙鏈、聚L-賴氨酸·HBr和PEG/PVP的體積。
表4

該批在58℃下溫育30分鐘，然后在冰上冷卻30分鐘。在冷卻中，溶液變混濁并出現(xiàn)沉淀。然后將懸浮液過濾，除去過量的PEG/PVP。形成的沉淀通過將沉淀再次懸浮于去離子水中，離心和除去上層清液而洗滌。洗滌過程重復(fù)三次。將水相的濃縮懸浮液在-80℃下冷凍并凍干以形成包含Cy3標(biāo)記的siGLO環(huán)孢素A受體B siRNA雙鏈和聚L-賴氨酸的微球體干燥粉末。
圖17表示一批微球體(聚L-鳥氨酸∶siRNA雙鏈比例為1∶1)的掃描電子顯微照片(SEM)。因此制成的微球體大小為0.2-1.4μm，平均粒度為約0.48納米。
應(yīng)當(dāng)這樣理解，已描述的本發(fā)明的實(shí)施方案是本發(fā)明原則的應(yīng)用的一些示例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可不背離本發(fā)明的真實(shí)內(nèi)涵和外延而進(jìn)行許多改變。本文中描述的各種特征可以任何組合而應(yīng)用，所述特征不受本文中明確指出的具體的組合的限制。
序列表<110>巴克斯特國(guó)際公司(Baxter International Inc.)巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司(Baxter Healthcare S.A.)<120>核酸微球體，其制備和遞送(Nucleic acid microspheres，Production and Delivery thereof)<130>SCT064892-47<141>2005-05-12<160>5<210>1<211>31<212>DNA<213>Mus musculus<400>1cacagccgag gcaaagacac catgcagggc a 31<210>2<211>29<212>DNA<213>Mus musculus<400>2gggaaagcca ggaatctaga gccaatgga 29<210>3<211>30<212>DNA<213>Mus Musculus<400>3tgggtgcttc cgtaagttct ggaacacgtc 30
<210>4<211>21<212>RNA<213>Mus musculus<400>4ggaaagacug uuccaaaaau u 21<210>5<211>21<212>RNA<213>Mus musculus<400>5uuuuuggaac agucuuuccu u 2權(quán)利要求
1.微球體，其包含約20重量％至100重量％的一種或多種核酸，并且具有不大于約50微米的平均粒度。
2.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的核酸占微球體的約30重量％至約100重量％。
3.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的核酸占微球體的約50重量％至約100重量％。
4.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的核酸占微球體的約70重量％至約100重量％。
5.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的核酸占微球體的約90重量％至約100重量％。
6.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的核酸占微球體的至少約95重量％。
7.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的微球體包含至少兩種不同的核酸。
8.權(quán)利要求1的微球體，其中至少一種所述的核酸為寡核苷酸。
9.權(quán)利要求8的微球體，其中所述的微球體包含至少兩種不同的寡核苷酸。
10.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的微球體具有不大于約2微米的平均粒度和約0.04微米至約8微米的粒度分布。
11.權(quán)利要求7的微球體，其中所述的微球體具有不大于約2微米的平均粒度和約0.04微米至約8微米的粒度分布。
12.權(quán)利要求8的微球體，其中所述的微球體具有不大于約2微米的平均粒度和約0.04微米至約8微米的粒度分布。
13.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的微球體具有不大于約1微米的平均粒度和約0.2微米至約4微米的粒度分布。
14.權(quán)利要求7的微球體，其中所述的微球體具有不大于約1微米的平均粒度和約0.2微米至約4微米的粒度分布。
15.權(quán)利要求8的微球體，其中所述的微球體具有不大于約1微米的平均粒度和約0.2微米至約4微米的粒度分布。
16.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的核酸選自DNA、DNA寡核苷酸、RNA寡聚核糖核苷酸、DNA/RNA雜交寡核苷酸、mRNA、siRNA或tRNA，及其組合。
17.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的微球體在懸浮液中。
18.權(quán)利要求1的微球體，其中所述的微球體在干燥粉末制劑中。
19.治療對(duì)象的方法，其包含將權(quán)利要求1的微球體向?qū)ο蠼o藥。
20.權(quán)利要求15的方法，其中遞送所述微球體的給藥途徑選自靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、局部、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、口腔、肺部、眼部、鼻、頰內(nèi)、陰道、直腸給藥及其組合。
21.防護(hù)個(gè)體免受自身免疫性疾病的方法，其包括皮下注射權(quán)利要求1的微球體。
22.防護(hù)個(gè)體免受自身免疫性疾病的方法，其包括皮下注射權(quán)利要求7的微球體。
23.包含核酸的生物活性微球體的制備方法，其將所述核酸用溶劑溶解以形成組合物并從所述組合物形成微球體，所述的微球體具有不大于約50微米的平均粒度。
24.權(quán)利要求23的方法，其中向所述溶劑中加入至少一種聚陽(yáng)離子。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的聚陽(yáng)離子選自聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺、醇溶蛋白、精蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚精氨酸、乙烯胺及其組合。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述的聚陽(yáng)離子為聚賴氨酸。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述的聚陽(yáng)離子為聚鳥氨酸。
28.權(quán)利要求23的方法，其中向所述溶劑中加入至少一種聚陰離子。
29.權(quán)利要求23的方法，其中向所述溶劑中加入至少一種聚合物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的聚合物選自多糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮及其組合。
31.權(quán)利要求23的方法，其中所述的形成是通過向所述組合物中加入交聯(lián)試劑而進(jìn)行的。
32.權(quán)利要求23的方法，其中所述的形成是通過向所述組合物中加入能量而進(jìn)行的。
33.權(quán)利要求23的方法，其中所述的形成是通過在所述組合物中不含聚陽(yáng)離子組分而進(jìn)行的。
34.權(quán)利要求23的方法，其中所述的形成是通過在所述組合物中不含交聯(lián)組分而進(jìn)行的。
35.權(quán)利要求23的方法，其中所述的形成是通過在所述組合物中不含聚陰離子組分而進(jìn)行的。
36.權(quán)利要求23的方法，其中所述的形成是通過不施用能源就從所述組合物中形成微球體而進(jìn)行的。
全文摘要
通過將包含核酸的化合物溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉軇w系中并從所形成溶液中的形成微球體而制備核酸。將該微球體對(duì)個(gè)體給藥用作對(duì)癥狀的保護(hù)，其中核酸的遞送用于，例如自身免疫性疾病的治療。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1980640SQ200580014988
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月12日
發(fā)明者特倫斯·L·斯克特, 黛博拉·拉弗里尼埃, 韋雷德·比什克－利布, 拉里·R·布朗 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司, 巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司