專利名稱：在20位與整聯(lián)蛋白拮抗劑綴合的7－叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有細(xì)胞毒活性的由含有RGD序列的環(huán)肽類與喜樹堿衍生物組成的化合物，其制備方法，其作為藥物的應(yīng)用和含有它們的組合物。
特別地，本發(fā)明中所述的化合物被賦予了對整聯(lián)蛋白αvβ3和αvβ5的高親和性以及以微摩爾濃度對人細(xì)胞系的選擇性細(xì)胞毒活性。
背景技術(shù)：
化療抗癌藥為治療窗最受限的藥物。實(shí)際上，由于其細(xì)胞毒活性為非選擇性的，所以它們可以無差別地?fù)p害它們所接觸的機(jī)體的所有細(xì)胞。
目前存在使細(xì)胞毒性劑選擇性定向針對腫瘤細(xì)胞的問題，以使活性劑在不損害健康周圍組織細(xì)胞的情況下發(fā)揮其活性，或至少盡可能地限制所述的損害。
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，通過使用選擇性環(huán)肽類，其參考化合物被認(rèn)為是環(huán)五肽c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(JACS 1997，119，1328-35；國際專利申請WO 97/06791)，或通過使用單克隆抗體(Cell，1994，79，1157-64)，封阻整聯(lián)蛋白αvβ3和αvβ5，導(dǎo)致血管發(fā)生阻滯并且使腫瘤生長減少。此外，還觀察到了抗轉(zhuǎn)移作用(J.Clin.Invest.，1995，96，1815)。Brooks等(Science，1994，264，569-71)報(bào)導(dǎo)了與正常組織休眠細(xì)胞相比腫瘤脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞自身優(yōu)先表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ3。在處于晚期臨床研發(fā)階段的化合物中，我們可以提及c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-MeVal)或EMD121974或西侖吉肽。
Ruoslati和合作者(Current Opinion in Oncology，1998，10，560-5)顯示結(jié)合腫瘤內(nèi)皮的RGD類似物一旦與細(xì)胞毒性劑多柔比星綴合就形成比單獨(dú)多柔比星更有效和毒性更低的化合物。這些作者還證實(shí)，無容置疑，這種作用可歸因于與RGD綴合，因?yàn)榻Y(jié)合被游離肽本身拮抗(Arap，Pasqualini和Ruoslati，Science，1998，279，377-380)。后來，相同的作者還進(jìn)行了使促編程性細(xì)胞死亡肽序列與RGD類似物化學(xué)結(jié)合的其它實(shí)驗(yàn)，證實(shí)新化合物對血管發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞具有選擇性毒性并且在小鼠中具有抗癌活性(Ruoslati，NatureMedicine，1999，5，1032-8)。
Marcus等在國際專利申請WO 01/17563中描述了通過由一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的間隔基與整聯(lián)蛋白αvβ3和αvβ5的非肽抑制劑拮抗劑綴合的細(xì)胞毒性劑諸如喜樹堿的特異性抗癌活性。
Aoki等在Cancer Gene Therapy，2001，8，783-787中描述了與RGD序列綴合的組氨?；奄嚢彼岬奶禺愋钥拱┗钚裕沂玖嗽谛∈笾袑δ[瘤的尋靶作用。
對基因轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)提出了由整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的在細(xì)胞表面上結(jié)合的構(gòu)思(Hart等，J.Biol.Chem.，1994，269，12468-12474)。
7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿(或CPT184或ST1481或Gimatecan)是一種口服有活性的喜樹堿衍生物，并描述于歐洲專利EP1044977中。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿在20位與含有RGD序列的環(huán)肽衍生物綴合(可能通過適當(dāng)?shù)拈g隔基)產(chǎn)生被賦予了高的選擇性的抗癌活性的化合物，其可以有利地用于制備治療腫瘤的藥物。
本發(fā)明的化合物因其對腫瘤細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒活性而產(chǎn)生了具有較少和嚴(yán)重程度較低的副作用的藥物。
本發(fā)明的描述本發(fā)明的目的在于與含有RGD序列的環(huán)肽衍生物綴合的7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿衍生物。所得分子具有未改變的原始喜樹堿的細(xì)胞毒性能，和親和性與對非輟合的環(huán)肽類所觀察到的相當(dāng)?shù)恼?lián)蛋白結(jié)合特性。這種組合的結(jié)果有利于細(xì)胞毒性劑濃集在那些最多表達(dá)αvβ3和αvβ5型整聯(lián)蛋白的細(xì)胞中(尋靶)。細(xì)胞毒性劑以綴合形式和/或通過酶或水解作用形成的游離形式發(fā)揮其胞內(nèi)活性。
本發(fā)明的主要目的由此在于通式(I)的化合物 其N1-氧化物、外消旋混合物、其單一對映體、其單一非對映異構(gòu)體、其E和Z型、其混合物、其藥物上可接受的鹽；其中R1為U-X-Y基團(tuán)，其中U不存在或?yàn)橄铝谢鶊F(tuán)-COCHR10NH-或CON[(CH2)n2NHR7]-CH2-之一，其中R10為H或選自下列基團(tuán)組成的組可選地被C6-C14芳基或氨基-烷基C1-C4取代的直鏈或支鏈C1-C4烷基；R7為H或直鏈或支鏈C1-C4烷基；n2為2-6的整數(shù)；X不存在或?yàn)镠或?yàn)檫x自下列中的基團(tuán)-COCHR3NH-、-COCHR6(CH2)n3R4-、-R4-CH2(OCH2CH2)n4OCH2R4-、-R4(Q)R4-、-R5[Arg-NH(CH2)n5CO]n6R5-、-R5-[N-胍基丙基-Gly]n6R5-，其中n3為0-5的整數(shù)，n4為0-50的整數(shù)，n5為2-6的整數(shù)，n6為2-7的整數(shù)；R3為H或可選地被-COOH、-CONH2、-NH2或-OH取代的直鏈或支鏈C1-C4烷基；R4選自-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-組成的組；R5不存在或?yàn)榛鶊F(tuán)-R4(Q)R4-；R6為H或-NH2；Q選自下列基團(tuán)組成的組直鏈或支鏈C1-C6亞烷基；直鏈或支鏈C3-C10亞環(huán)烷基；直鏈或支鏈C2-C6亞烯基；直鏈或支鏈C3-C10亞環(huán)烯基；C6-C14亞芳基；亞芳基(C6-C14)-亞烷基(C1-C6)；亞烷基(C1-C6)-亞芳基(C6-C14)；含有至少一個(gè)選自O(shè)、N、S組成的組的雜原子的芳族或非芳族雜環(huán)基(C3-C14)；Y不存在或?yàn)镠或如下基團(tuán)c(Arg-Gly-Asp-AA1-AA2)，其中c指的是環(huán)；AA1選自下列基團(tuán)組成的組(D)-Phe、(D)-Trp、(D)-Tyr、(D)-2-萘基Ala、(D)-4-叔丁基-Phe、(D)-4，4′-聯(lián)苯基-Ala，(D)-4-CF3-Phe、(D)-4-乙酰基胺-Phe；AA2選自下列基團(tuán)組成的組NW-CH[(CH2)n7-CO]CO、NW-CH[(CH2)n7-NH]-CO、NW-[4-(CH2)n7-CO]-Phe、NW-[4-(CH2)n7-NH]-Phe、[NW]-Gly、NW-Val，其中W選自H；直鏈或支鏈C1-C6烷基；-(CH2)n7-COOH，其中n7為0-5的整數(shù)；4-羧芐基、4-氨甲基芐基；條件是X和Y不能同時(shí)不存在。
本發(fā)明包括具有上述通式(I)的化合物作為用作拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的藥物的活性成分的應(yīng)用。在源于拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制的治療應(yīng)用中，我們提及了寄生蟲或病毒感染。
鑒于其特定的藥理特征，所以通式(I)的化合物還用于制備治療腫瘤及其轉(zhuǎn)移形式的藥物。
本發(fā)明還包括含有作為活性成分的通式(I)的化合物與至少一種藥物上可接受的載體和/或賦形劑的混合物的藥物組合物。
本發(fā)明的化合物為在20位官能化的7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿與含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的環(huán)肽縮合的結(jié)果。該結(jié)構(gòu)組合具有有利于細(xì)胞毒性劑(喜樹堿)濃集在最多表達(dá)αvβ3和αvβ5型整聯(lián)蛋白的細(xì)胞中的優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞毒性劑以綴合形式和/或通過酶或水解作用以游離形式發(fā)揮其活性。
在上述通式(I)中出現(xiàn)的各種官能團(tuán)和殘基的定義以及藥物上可接受的鹽的定義為任何化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識并且不必做特別的定義。不過，對這類基團(tuán)的參照引用可以在技術(shù)和專利文獻(xiàn)中找到，例如在國際專利申請WO 00/53607、WO 03/101995和WO 03/101996中。
一組最初的優(yōu)選化合物由通式(I)的化合物組成，其中U和/或X不為不存在。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物如下 可以使用本文下述和對本發(fā)明優(yōu)選化合物例示的方法制備通式(I)的化合物。該方法構(gòu)成了本發(fā)明的另一個(gè)目的。
基本上，作為本發(fā)明目的的通式(I)的化合物通過可能經(jīng)由合適的橋(表示為″U1-X1″)官能化的7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿(表示為″7-t-but-CP″)與環(huán)肽衍生物(表示為″Y1″)縮合來制備。
可以按照下列反應(yīng)方案之一進(jìn)行縮合反應(yīng)7-t-but-CP+U1-X1-Y1或7-t-but-CP-U1+X1-Y1或7-t-but-CP-U1-X1+Y1或7-t-but-CP+U1+X1+Y1或7-t-but-CP-U1+X1+Y1；其中7-t-but-CP表示7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿，U1、X1和Y1分別表示如通式I中所定義的基團(tuán)U、X和Y，可選地被適當(dāng)官能化和/或被保護(hù)，以便獲得通式I的綴合的化合物。
使用常規(guī)方法進(jìn)行這些反應(yīng)，例如S.S.Dharap等在Journal ofControlled Release 2003，91，61-73、R.Bhatt在Journal ofMedicinal Chem.2003，46，190-3中所述的那些方法。
如實(shí)施例1-6中所述，可以按照常規(guī)肽合成技術(shù)制備環(huán)肽類Y1?？梢栽诠滔嗷蛟谌芤褐羞M(jìn)行肽合成。
一旦獲得了所需的環(huán)肽，就將其以被保護(hù)形式用于縮合反應(yīng)，并且僅在獲得最終化合物后除去保護(hù)基。使用公知方法例如通過使用純?nèi)宜岬乃嵝詶l件或在有氯化有機(jī)溶劑存在下進(jìn)行脫保護(hù)。
本發(fā)明中所述的化合物為拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑且由此可用作藥物，特別是用于治療得益于抑制所述的拓?fù)洚悩?gòu)酶的疾病。特別地，本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出抗增殖活性且由此用于其治療特性，并且具有使其適合于藥物組合物配制的理化特性。
藥物組合物含有至少一種通式(I)的化合物作為活性成分，其用量以便產(chǎn)生顯著的治療作用。本發(fā)明涵蓋的組合物是完全常規(guī)的并且使用制藥工業(yè)中通常實(shí)施的方法獲得。按照選擇的給藥途徑，組合物為固體或液體形式并適合于口服、非腸道或靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明的組合物含有至少一種藥物上可接受的載體或賦形劑連同活性成分。特別可以使用制劑輔劑，例如增溶劑、分散劑、懸浮劑或乳化劑。
通式(I)的化合物還可以與其它活性成分聯(lián)用，例如抗癌藥或具有抗寄生蟲或抗病毒活性的其它藥物，既可以為單獨(dú)分開的劑型，也可以在單一劑型中。
本發(fā)明的化合物可用作具有抗癌活性的藥物，例如在非小細(xì)胞(non-microcytoma)和小細(xì)胞肺癌或結(jié)腸直腸癌或前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、胃腸癌、肝癌、卡波西肉瘤、腎癌、肉瘤和骨肉瘤、睪丸癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、膀胱癌和頭頸癌中具有抗癌活性的藥物。本發(fā)明化合物提供的優(yōu)點(diǎn)之一在于該分子的喜樹堿部分固有的抗拓?fù)洚悩?gòu)酶活性與該分子的環(huán)肽部分提供的整聯(lián)蛋白抑制活性的組合。結(jié)果為本發(fā)明化合物將在腫瘤學(xué)領(lǐng)域中被從事該領(lǐng)域的技術(shù)人員有利接受的可能的聯(lián)合作用。實(shí)際上，含有Arg-Gly-Asp序列的環(huán)肽部分不僅使所述分子定向針對表達(dá)整聯(lián)蛋白的腫瘤，而且一旦達(dá)到靶物就能夠發(fā)揮從該分子的細(xì)胞毒性部分的內(nèi)化到整聯(lián)蛋白抑制活性的多種功能，從而產(chǎn)生優(yōu)點(diǎn)，特別是在抑制腫瘤血管發(fā)生方面。環(huán)肽部分一旦從喜樹堿部分分離，還能夠在距腫瘤部位一段距離處發(fā)揮其作用，且由此本發(fā)明的化合物還可用于預(yù)防或治療轉(zhuǎn)移形式。
作為本發(fā)明目的的藥物還可以用于治療寄生蟲疾病。
下列實(shí)施例進(jìn)一步解釋了本發(fā)明。
使用縮寫如下Aad(氨基己二酸)；Amb(氨甲基芐基)；Amp(氨甲基苯丙氨酸)；Boc(叔丁氧羰基)；CSA(樟腦磺酸)；CTH(催化轉(zhuǎn)移氫化)；DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)；DCM(二氯甲烷)；DIEA(二異丙基乙胺)；DMF(二甲基甲酰胺)；Dy(Otf3)三氟甲磺酸鏑；Fmoc(9-芴甲氧羰基)；HOBT(羥基苯并三唑)；NMP(N-甲基-吡咯烷酮)；Pht(鄰苯二甲?；?；Pmc(五甲基色滿-6-磺?；?；ST1481(7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿，也稱作gimatecan)；TBTU(四氟硼酸-O-苯并三唑-1-基-四甲基脲鎓)；TFA(三氟乙酸)。
實(shí)施例實(shí)施例1c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)
(被保護(hù)的ST2581)的合成將1.587mmol Fmoc-Gly-Res(Res＝Sasrin Resin，Bachem)在攪拌下懸浮于75ml DMF中30分鐘，此后加入18ml哌啶，再繼續(xù)攪拌30分鐘。將過濾并且用DMF洗滌的樹脂懸浮于50ml NMP(N-甲基-吡咯烷酮)中15分鐘，此后加入Fmoc-Arg(Pmc)-OH、HOBT、TBTU和DIEA(各3.174mmol)；攪拌2小時(shí)后，過濾該混懸液并且用DMF洗滌。在使用哌啶脫保護(hù)后，依次使用其它氨基酸重復(fù)偶聯(lián)，每次如上所述進(jìn)行操作，即Fmoc-Amp(Cbz)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH。在Fmoc-N-末端最終脫保護(hù)后，使用45ml 1％在DCM中的TFA使線性五肽從樹脂上釋放。將其溶于約1l的CH3CN，并且加入4.761mmol HOBT和TBTU和10ml DIEA；將該溶液保持?jǐn)嚢?0分鐘，蒸發(fā)溶劑至小體積并且使用水完成產(chǎn)物沉淀。將過濾的粗產(chǎn)物溶于27ml MeOH和DMF 1∶1的混合物；加入5mmol甲酸銨(ammonium formiate)和0.55g 10％ Pd/C并且在室溫下攪拌30分鐘。用C鹽過濾該混懸液并且使其干燥。通過制備型RP-HPLC純化殘余物(柱AlltimaC-18，Alltech；流動(dòng)相50％CH3CN在水+0.1％TFA中；保留時(shí)間(Rt)＝9.13分鐘)。得到483mg白色粉末。
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.3，8.07，8.04，7.90，7.80，7.33，7.15，7.07，4.62，4.50，4.35，4.12，4.01，3.15，3.03，2.96-2.65，2.58，2.48，2.32，2.02，1.75，1.50，1.35，1.23。
分子量(Maldi-Tof)973實(shí)施例2c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Aad)(被保護(hù)的ST2650)的合成正如實(shí)施例1中所述處理0.69mmol Fmoc-Gly-Res，差別在于在此情況中以二肽Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH形式加入第三和第四個(gè)氨基酸。在通過CTH脫保護(hù)并且使用制備型RP-HPLC(流動(dòng)相66％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝17.29分鐘)純化粗產(chǎn)物后得到187mg純肽。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.23，4.58，4.20-3.90，3.28，3.05，2.99，2.85，2.74-2.35，2.15，2.05，1.85-1.25。
分子量(Maldi-Tof)940實(shí)施例3c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Me-Amp)(被保護(hù)的ST2700)的合成向達(dá)到回流的Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH2)-COOH在無水甲苯中的混懸液中加入2eq CSA和20eq低聚甲醛，分成4部分間隔15分鐘加入。將該混合物冷卻，使用120ml甲苯稀釋并且用5％NaHCO3和水洗滌。在蒸發(fā)溶劑后，將殘余物溶于15ml CHCl3+15ml TFA+700μlEt3SiH；將該混合物置于暗處攪拌42小時(shí)。在蒸發(fā)溶劑后，通過硅膠過濾純化殘余物。總產(chǎn)率90％。
如實(shí)施例1中所述在固相中合成線性肽，插入如上所述制備的作為第三個(gè)氨基酸的Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH2)-COOH。在這種情況中，使用30％在DMF中的二異丙胺(300eq)溶液進(jìn)行樹脂上N-Fmoc-末端的脫保護(hù)(因?yàn)榇嬖卩彵蕉柞啺?。環(huán)化后，將500mg肽趁熱溶于10ml無水EtOH，向其中加入0.9ml NH2-NH2·H2O在乙醇中的1M溶液。在回流狀態(tài)下加熱2小時(shí)后，蒸發(fā)溶劑并且在劇烈振搖下將殘余物吸收于10ml DCM+10ml Na2CO3溶液。在蒸發(fā)后從有機(jī)相中回收粗的終產(chǎn)物并且通過制備型RP-HPLC純化(流動(dòng)相52％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝10分鐘)。
1H-NMR(CDCl3)δ8.29-7.66，7.38-7.07，4.95-4.77，4.09，3.41，3.05-2.81，2.51，2.05，1.74，1.40，1.26。
分子量(Maldi-Tof)987實(shí)施例4c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp(CO-(CH2)2-COOH)](被保護(hù)的ST2649)的合成將120mg環(huán)肽c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]·TFA(如實(shí)施例1中所述制備)與化學(xué)計(jì)算量的TEA和琥珀酸酐一起溶于3.6mlDCM-DMF 2∶1的混合物。1小時(shí)后，用30ml DCM稀釋該反應(yīng)混合物并且用水洗滌。干燥和濃縮有機(jī)相得到殘余物，為100mg純產(chǎn)物。分析型RP-HPLC柱Purosphere STAR，Merck；流動(dòng)相45％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝13.17分鐘。
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.20-7.75，7.19-7.02，4.58，4.45，4.36，4.30，4.20，4.05，3.00，2.97-2.57，1.83，1.62，1.32。
分子量(Maldi-Tof)1073實(shí)施例5c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Amb-Gly)(被保護(hù)的ST2701)的合成向1.22mmol的Boc-一保護(hù)的對-苯二甲胺在6ml THF中的溶液中加入1.83mmol TEA并且滴加1.22mmol溴乙酸芐酯在2ml THF中的溶液。將該混合物在攪拌下保持過夜，此后蒸發(fā)溶劑并且在快速柱上純化殘余物(CHCl3-EtOAc，9∶1)。得到0.69mmol N-(4-Boc-NH-CH2-芐基)-甘氨酸芐酯。
將250mg Fmoc-D-Phe-OH溶于27ml DCM并且加入40μl雙光氣和230μl均-可力??；15分鐘后，加入190mg先前制備的酯(溶于3ml DCM)。3小時(shí)后，將80μl N-Me-哌嗪加入到該反應(yīng)混合物中并且攪拌10分鐘，此后用10ml DCM稀釋該混合物并且用水、0.5NHCl、水、5％NaHCO3和水進(jìn)行萃取。在蒸發(fā)溶劑后，通過硅膠快速色譜法純化殘余物(DCM-EtOAc，9∶1)。產(chǎn)率80％。
向溶于6ml MeOH中的100mg由此獲得的產(chǎn)物中加入76μl AcOH和42mg HCOONH4并且將該混合物冷卻至0℃，且加入50mg 10％Pd/C。30分鐘后，用C鹽過濾該反應(yīng)混合物。使濾液干燥并且在快速柱上純化(CHCl3-MeOH 9∶1)。產(chǎn)率90％。
將190mg由此獲得的產(chǎn)物溶于1.2ml TFA并且使其干燥(Boc脫保護(hù))；將殘余物重新溶于9ml 10％Na2CO3+6ml二烷，冷卻至0℃并且滴加120μl芐氧羰基氯用3ml二烷稀釋的溶液。在室溫下攪拌1小時(shí)后，在真空中進(jìn)行蒸發(fā)至小體積，此后用水稀釋該混合物，用HCl使pH降至1并且使用EtOAc進(jìn)行萃取。在蒸發(fā)溶劑后，通過硅膠過濾純化殘余物，使用CHCl3-MeOH(8∶2)洗滌。純二肽產(chǎn)率82％。
如實(shí)施例1中所述處理0.69mmol Fmoc-Gly-Res。在Arg后，順次加入先前制備的二肽Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH2-芐基)-G1。在通過CTH使Cbz脫保護(hù)后，通過制備型RP-HPLC純化粗產(chǎn)物c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Amp-Gly)(流動(dòng)相50％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝10.5分鐘)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.29-7.66，7.44-6.90，5.15，4.72-4.18，4.20，4.05-3.32，3.15，3.06，2.70，2.51，2.49，2.01，1.80-1.35，1.49，1.35，1.23。
分子量(Maldi-Tof)973實(shí)施例6c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2CH2)n-O-CH2-COOH))的合成向200mg c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)·TFA(如實(shí)施例1中所述獲得)在4ml 3∶1 DCM-DMF混合物中的溶液中加入大大過量的乙二醇二酸。向同一溶液中加入DIEA(3eq)和DCC(2eq)。將該混合物攪拌過夜，此后用DCM稀釋并且用水洗滌。
通過蒸發(fā)有機(jī)相回收粗產(chǎn)物并且通過快速色譜法純化(流動(dòng)相CHCl3-MeOH 7∶3+1％AcOH)；收集合并含有產(chǎn)物的級分，用水洗滌，脫水并且使其變干，且得到殘余物，為157mg純產(chǎn)物。
分析型RP-HPLC(柱Purosphere STAR，Merck；流動(dòng)相50％在水中的CH3CN 50％+0.1％TFA；Rt＝10.96)1H-NMR(DMSO-d6)δ8.35-7.92，7.20-7.00，4.65，4.50，3.94，3.60-3.45，3.00-2.60，2.55，2.45，2.30，2.00，1.70，1.50，1.30，1.20。分子量(Maldi-Tof)相應(yīng)于使用的不同分子量的乙二醇。
gimatecan衍生物的合成實(shí)施例720-O-Val-gimatecan-ST2678的合成將1mmol如專利EP 1 044 977實(shí)施例2中所述制備的ST1481、0.6mmol Dy(OTf)3、3mmol二甲氨基吡啶和3mmol Boc-Val-OH懸浮于15ml無水CH2Cl2中并且使其達(dá)到-10℃；30分鐘后，加入3.1mmolDCC并且在-10℃下再經(jīng)過30分鐘后，將該反應(yīng)混合物加熱至室溫。2小時(shí)后，再用20ml CH2Cl2稀釋該反應(yīng)體系，用1N HCl、NaHCO3洗滌并且用Na2SO4干燥。通過使用CH2Cl2/MeOH 97∶3的SiO2色譜法純化粗產(chǎn)物而得到為黃色固體的產(chǎn)物，產(chǎn)率為92％。在CH2Cl2/MeOH 96∶4中的Rf＝0.72。
分析型RP-HPLC(柱Luna C18，Phenomenex；流動(dòng)相45％在水中的CH3CN；Rt＝23.0)1H-NMR(CDCl3)δ9.05，8.3-8.2，7.9-7.7，7.3，5.8-5.7，5.5-5.4，5.05-4.95，4.4-4.3，2.4-2.2，1.6-1.4，1.1-0.9。
分子量(ESI)646在0℃下將中間體產(chǎn)物ST2678[N-Boc]在DCM/TFA(75/25)中脫保護(hù)，具有定量產(chǎn)率?？梢詫⒂纱双@得的ST 2678用于直接結(jié)合RGD衍生物或作為可用于結(jié)合第二殘基的進(jìn)一步的中間體(參見實(shí)施例8-9)。
實(shí)施例820-O-Val-Asp-gimatecan-ST2676[N-Boc]的合成
在0℃下將1mmol ST2678和3.7mmol DIPEA以該順序加入到1.2mmol合適保護(hù)的天冬氨酸、1.8mmol HOBt和1.4mmol EDC在DMF中的溶液中。將該反應(yīng)混合物在室溫下保持過夜，此后使其分配在水與二氯甲烷之間，并且通過使用CH2Cl2/MeOH 96∶4的SiO2色譜法純化由此獲得的粗產(chǎn)物而得到為黃色固體的產(chǎn)物，產(chǎn)率為66％。在CH2Cl2/MeOH 96∶4中的Rf＝0.5分析型RP-HPLC(柱Luna C18，Phenomenex；流動(dòng)相45％在水中的CH3CN；Rt＝23.3)。
1H-NMR(CDCl3)δ9.05，8.3-8.2，7.9-7.7，7.4-7.2，6.0-5.9，5.7-5.6，5.5-5.4，5.1，4.8-4.7，4.6-4.5，3.3-3.1，3.0-2.8，2.4-2.2，1.6-1.4，1.-0.9。
分子量(ESI)851羧基的脫保護(hù)在20psi下用H2/10％Pd-C氫解芐酯，在使用CH2Cl2/MeOH 94∶6純化后得到產(chǎn)率70％。在CH2Cl2/MeOH 92∶8中的Rf＝0.52。
分析型RP-HPLC(柱Luna C18，Phenomenex；流動(dòng)相45％在水中的CH3CN；Rt＝22.9)1H-NMR(CDCl3)δ9.05，8.3-8.2，7.9-7.7，7.5，6.0-5.9，5.7-5.6，5.5-5.4，4.8-4.7，4.5-4.4，3.3-3.1，2.9-2.8，2.4-2.2，1.6-1.4，1.1-0.9。
分子量(ESI)761
實(shí)施例9化合物[ST2677]的合成 將1mmol脫保護(hù)的ST2678-[N-Boc]溶于10ml無水吡啶并且在使該溶液達(dá)到0℃后，加入2.5mmol琥珀酸酐；使該混合物恢復(fù)到室溫1小時(shí)。除去溶劑，將殘余物吸收于CH2Cl2并且用0.5N HCl洗滌有機(jī)相。通過使用CH2Cl2/MeOH 95∶5的SiO2色譜法純化粗產(chǎn)物而得到為黃色固體的預(yù)期產(chǎn)物，產(chǎn)率為90％。在CH2Cl2/MeOH 92∶8中的Rf＝0.41。
分析型RP-HPLC(柱；Luna C18，Phenomenex；流動(dòng)相45％在水中的CH3CN；Rt＝17.0)1H-NMR(CDCl3)δ9.05，8.4-8.2，7.9-7.7，7.5，6.4-6.3，5.7-5.6，5.5-5.4，4.6-4.5，3.7，3.0-2.1，1.5，1.1-0.9。
分子量(ESI)646綴合衍生物的合成實(shí)施例10化合物ST2670(或ST2671)的合成
對兩者使用相同的合成方法。
向冷卻至0℃的1.2mmol ST2676[N-Boc](或ST2677)在無水DMF中的溶液中加入2.1mmol HOBt和1.4mmol EDC并且將所得混合物攪拌30分鐘，此后順次加入1mmol ST2581和DIPEA。在保持過夜后，使該混合物分配在水與二氯甲烷之間且然后用Na2SO4干燥有機(jī)相并且通過使用CH2Cl2/MeOH 92∶8的SiO2色譜法純化粗產(chǎn)物而得到預(yù)期產(chǎn)物-被保護(hù)的ST2670(或被保護(hù)的ST2671)，產(chǎn)率在55％-65％范圍。
分析型RP-HPLC(柱Luna C18，Phenomenex；流動(dòng)相45％在水中的CH3CN；對被保護(hù)的ST2670 Rt＝20.1且對被保護(hù)的ST2671 Rt＝23.2)分子量(ESI)對被保護(hù)的ST2671為1718分子量(ESI)對被保護(hù)的ST2670為1601綴合產(chǎn)物的脫保護(hù)對兩種化合物進(jìn)行最終的脫保護(hù)以得到兩種化合物ST2670和ST2671，使用CH2Cl2/TFA 1∶1進(jìn)行2小時(shí)，使該混合物從0℃達(dá)到室溫；在該操作步驟后進(jìn)行使用離子交換樹脂的步驟，得到為鹽酸鹽的產(chǎn)物。
分析型RP-HPLC(柱Luna C18，Phenomenex；流動(dòng)相35％在水中的CH3CN；對ST2670 Rt＝14.5且對ST2671 Rt＝14.3)分子量(ESI)對ST2671為1294
分子量(ESI)對ST2670為1279生物學(xué)結(jié)果與整聯(lián)蛋白αvβ3受體的結(jié)合在緩沖液(20mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2，1mMMgCl2，1mM MnCl2)中將純化的αvβ3受體(Chemicon，cat.CC1020)稀釋至濃度為0.5μg/ml。將100μl等分部分加入到96-孔平板中并且在+4℃下保溫過夜。用緩沖液(50mM Tris，pH 7，4，100mM NaCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，1mM MnCl2，1％牛血清白蛋白)將平板洗滌一次且然后再在室溫下保溫2小時(shí)。用相同緩沖液將平板洗滌兩次并且在室溫下在有競爭配體存在下與放射性配體[125I]鋸鱗血抑肽(echistatin)(Amersham Pharmacia Biotech)0.05nM一起保溫3小時(shí)。在保溫結(jié)束時(shí)，洗滌各孔并且使用γ計(jì)數(shù)器(Packard)測定放射性。在有過量冷鋸鱗血抑肽(1μM)存在下測定配體的非特異性結(jié)合。
與整聯(lián)蛋白αvβ5受體的結(jié)合在緩沖液(20mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2，1mMMgCl2，1mM MnCl2)中將純化的αvβ5受體(Chemicon，cat.CC1020)稀釋至濃度為1μg/ml。將100μl等分部分加入到96-孔平板中并且在+4℃下保溫過夜。用緩沖液(50mM Tris，pH 7，4，100mM NaCl，2mMCaCl2，1mM MgCl2，1mM MnCl2，1％牛血清白蛋白)將平板洗滌一次且然后再在室溫下保溫2小時(shí)。用相同緩沖液將平板洗滌兩次并且在室溫下在有競爭配體存在下與放射性配體[125I]鋸鱗血抑肽(AmershamPharmacia Biotech)0.15nM一起保溫3小時(shí)。在保溫結(jié)束時(shí)，洗滌各孔并且使用γ計(jì)數(shù)器(Packard)測定放射性。在有過量冷鋸鱗血抑肽(1μM)存在下測定非特異性配體結(jié)合。
IC50參數(shù)的評價(jià)將產(chǎn)物對玻連蛋白受體的親和性表示為IC50值±SD，即表示為能夠抑制50％特異性放射性配體-受體結(jié)合的濃度。使用″ALLFIT″軟件研究IC50參數(shù)。
結(jié)果下表給出了喜樹堿-RGD綴合物與RGD肽類對玻連蛋白αvβ3和αvβ5受體的親和性結(jié)果。這些綴合物對兩種整聯(lián)蛋白受體均表現(xiàn)出與對RGD肽類觀察到的相當(dāng)?shù)挠行вH和性。
表1喜樹堿-RGD綴合物對玻連蛋白αvβ3和αvβ5受體的親和性化合物 αvβ3αvβ5IC50±SD(nM)ST2670 47.7±0.974±0.8ST2671 22.8±1.254.2±0.5表2RGD肽類對玻連蛋白αvβ3和αvβ5受體的親和性化合物 αvβ3αvβ5IC50±SD(nM)ST2581 1.7±0.1 3.4±0.1ST2650 28.6±0.70.17±0.01ST2700 7.2±0.070.9±0.005
ST264937.6±0.95.1±0.07ST270136.7±0.72.9±0.1綴合物對不同腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性為了評價(jià)化合物對細(xì)胞存活的作用，使用sulphorodamine B試驗(yàn)。為了測試化合物對細(xì)胞生長的作用，使用PC3人前列腺癌、A498人腎癌、A2780人卵巢癌細(xì)胞和NCI-H460非小細(xì)胞肺癌。使A2780、NCI-H460和PC3腫瘤細(xì)胞生長在含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI 1640中，而使A498腫瘤細(xì)胞生長在含有10％胎牛血清(GIBCO)的EMEM中。
以約10％的融合率將腫瘤細(xì)胞接種在96-孔組織培養(yǎng)平板(Corning)中并且使其貼壁并恢復(fù)至少24小時(shí)。然后向每個(gè)孔中加入不同濃度的藥物以便計(jì)算其IC50值(抑制50％細(xì)胞存活的濃度)。將平板在37℃下保溫72小時(shí)或者2小時(shí)隨后恢復(fù)72小時(shí)。在處理結(jié)束時(shí)，通過除去上清液并且添加PBS而洗滌平板3次。加入200μl PBS和50μl冷80％TCA。將平板在冰上保溫至少1小時(shí)。除去TCA，將平板浸入蒸餾水洗滌3次并且在紙上和40℃下干燥5分鐘。
然后加入200μl 0.4％在1％乙酸中的sulphorodamine B。將平板在室溫下再保溫30分鐘。除去Sulphorodamine B，將平板浸入1％乙酸洗滌3次，然后將它們在紙上和40℃下干燥5分鐘。
然后加入200μl Tris 10mM，將平板在攪拌下保持20分鐘。在540nm下用Multiskan熒光分光光度計(jì)以光密度測定存活細(xì)胞。將殺死細(xì)胞的量計(jì)算為與對照培養(yǎng)物相比sulphorodamine B結(jié)合的降低百分比。
使用″ALLFIT″程序計(jì)算IC50值。
綴合物ST2670表現(xiàn)出對A2780卵巢腫瘤細(xì)胞最有效的細(xì)胞毒活性，IC50值為0.4μM。此外，綴合物ST2670表現(xiàn)出與對ST2677(游離喜樹堿)觀察到的相當(dāng)?shù)膶δ[瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(表3)。綴合物ST2671對PC3腫瘤細(xì)胞也表現(xiàn)出與對游離喜樹堿ST2676發(fā)現(xiàn)的相當(dāng)?shù)挠行Ъ?xì)胞毒性。
表3綴合物ST2670和ST2671以及游離喜樹堿(ST2676和ST2677)對PC3、A498和A2780腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(72小時(shí)處理)化合物PC3 A498 A2780IC50±SD，μMST26709.6±0.6 1.6±0.3 0.4±0.05ST26710.35±0.08 n.d. n.d.
ST26760.038±0.004 0.047±0.005 ＜0.00097ST26775.42±0.55 1.37±0.30.079±0.003n.d.＝未測定表4游離喜樹堿20-O衍生物(ST2676、ST2677、ST2678)對H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性(2小時(shí)處理)化合物NCI-H460IC50±SD，μMST26760.17±0.02ST2677＞1ST26780.025±0.00權(quán)利要求
1.通式(I)的化合物 其N1-氧化物、外消旋混合物、其單一對映體、其單一非對映異構(gòu)體、其E和Z型、其混合物、其藥物上可接受的鹽；其中R1為U-X-Y基團(tuán)，其中U不存在或?yàn)橄铝谢鶊F(tuán)-COCHR10NH-或CON[(CH2)n2NHR7]-CH2-之一，其中R10為H或選自下列基團(tuán)組成的組可選地被C6-C14芳基取代的直鏈或支鏈C1-C4烷基或氨基-烷基C1-C4；R7為H或直鏈或支鏈C1-C4烷基；n2為2-6的整數(shù)；X不存在或?yàn)镠或?yàn)檫x自下列中的基團(tuán)-COCHR3NH-、-COCHR6(CH2)n3R4-、-R4-CH2(OCH2CH2)n4OCH2R4-、-R4(Q)R4-、-R5[Arg-NH(CH2)n5CO]n6R5-、-R5-[N-胍基丙基-Gly]n6R5-，其中n3為0-5的整數(shù)，n4為0-50的整數(shù)，n5為2-6的整數(shù)，n6為2-7的整數(shù)；R3為H或可選地被-COOH、-CONH2、-NH2或-OH取代的直鏈或支鏈C1-C4烷基；R4選自-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-組成的組；R5不存在或?yàn)榛鶊F(tuán)-R4(Q)R4-；R6為H或NH2；Q選自下列基團(tuán)組成的組直鏈或支鏈C1-C6亞烷基；直鏈或支鏈C3-C10亞環(huán)烷基；直鏈或支鏈C2-C6亞烯基；直鏈或支鏈C3-C10亞環(huán)烯基；C6-C14亞芳基；亞芳基(C6-C14)-亞烷基(C1-C6)；亞烷基(C1-C6)-亞芳基(C6-C14)；含有至少一個(gè)選自O(shè)、N、S組成的組的雜原子的芳族或非芳族雜環(huán)基(C3-C14)；Y不存在或?yàn)镠或如下基團(tuán)c(Arg-Gly-Asp-AA1-AA2)，其中c指的是環(huán)；AA1選自下列基團(tuán)組成的組(D)-Phe、(D)-Trp、(D)-Tyr、(D)-2-萘基Ala、(D)-4-叔丁基-Phe、(D)-4，4′-聯(lián)苯基-Ala，(D)-4-CF3-Phe、(D)-4-乙?；?Phe；AA2選自下列基團(tuán)組成的組NW-CH[(CH2)n7-CO]-CO、NW-CH[(CH2)n7-NH]-CO、NW-[4-(CH2)n7-CO]-Phe、NW-[4-(CH2)n7-NH]-Phe、[NW]-Gly、NW-Val，其中W選自H；直鏈或支鏈C1-C6烷基；-(CH2)n7-COOH，其中n7為0-5的整數(shù)；4-羧芐基、4-氨甲基芐基；條件是X和Y不能同時(shí)不存在。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中U和X不為不存在。
3.權(quán)利要求1的化合物，具有如下通式 其N1-氧化物、外消旋混合物、其單一對映體、其單一非對映異構(gòu)體、其E和Z型、其混合物、其藥物上可接受的鹽。
4.權(quán)利要求1的化合物，具有如下通式 其N1-氧化物、外消旋混合物、其單一對映體、其單一非對映異構(gòu)體、其E和Z型、其混合物、其藥物上可接受的鹽。
5.制備權(quán)利要求1-4的化合物的方法，按照如下反應(yīng)方案之一進(jìn)行7-t-but-CP+U1-X1-Y1或7-t-but-CP-U1+X1-Y1或7-t-but-CP-U1-X1+Y1或7-t-but-CP+U1+X1+Y1或7-t-but-CP-U1+X1+Y1；其中7-t-but-CP表示7-叔丁氧基亞氨基甲基喜樹堿，U1、X1和Y1分別表示如通式I中所定義的基團(tuán)U、X和Y，所述基團(tuán)可選地被適當(dāng)官能化和/或被保護(hù)。
6.藥物組合物，含有作為活性成分的至少一種權(quán)利要求1-4的化合物與至少一種藥物上可接受的賦形劑和/或載體的混合物。
7.權(quán)利要求1-4的化合物在制備藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-4的化合物在制備被賦予拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制活性的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，用于制備具有抗癌活性的藥物。
10.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所述的藥物用于治療非小細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸腫瘤、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、胃腸癌、肝癌、卡波西肉瘤、腎癌、肉瘤和骨肉瘤、睪丸癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、膀胱癌和頭頸癌。
11.權(quán)利要求1-4的化合物在制備用于預(yù)防或治療轉(zhuǎn)移形式的藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求8的應(yīng)用，用于制備具有抗寄生蟲活性的藥物。
13.權(quán)利要求8的應(yīng)用，用于制備具有抗病毒活性的藥物。
全文摘要
本發(fā)明描述了通式(I)的化合物，其中R
文檔編號A61P31/00GK101065150SQ200580015213
公開日2007年10月31日 申請日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月13日
發(fā)明者A·達(dá)爾波佐, S·潘克, L·莫里尼, G·加尼尼, M·O·廷蒂, C·皮薩諾, F·祖尼諾, D·阿洛阿蒂, L·維西, S·德拉瓦勒, 倪明紅 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司, 研究和治療腫瘤國家研究所