專利名稱：具有抗－整聯(lián)蛋白活性的環(huán)肽衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的目的為用作藥物的化合物、其制備方法、含有它們的藥物組合物及其在制備用于治療因異常血管發(fā)生所致疾病的藥物中的應用。
背景技術：
在腫瘤患者中，化療在許多情況中是用于播散性癌癥的唯一治療選擇。改進抗癌化療功效并且降低其毒性的一種手段在于給予靶向涉及腫瘤血管發(fā)生的受體的藥物。
整聯(lián)蛋白涉及腫瘤血管發(fā)生過程中和轉移過程中細胞彼此之間和細胞與胞外基質之間的粘附。特別地，αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白受體在人腫瘤微血管的內皮細胞和腫瘤細胞自身中強表達。
目前公認腫瘤血管化是用于抗癌療法的富有希望的靶標[H.Jin和J.Varner，Br.J.Cancer，2004，90(3)561-5]。
近年來，許多研究已經證實含有Arg-Gly-Asp序列的環(huán)肽衍生物呈現(xiàn)對整聯(lián)蛋白受體的高親和性。
正在研究使用環(huán)RGD-肽類抑制腫瘤進展和新血管發(fā)生并且有些研究已經顯示出了有希望的結果。
例如，近來在大鼠中化學誘導的結腸癌中證實后期開始使用整聯(lián)蛋白阻斷肽類進行治療使得腫瘤生長得到抑制并且導致腫瘤負荷減少，這看起來至少部分是由對新血管發(fā)生的抑制介導的(Haier J.等，Clin Exp Metastasis.2002；19(8)665-72)。因此，看起來αvβ3-整聯(lián)蛋白-受體抑制是對于癌癥的良好治療策略。
此外，這些環(huán)RGD肽類還因其可透入靶細胞(例如HIV)而可在心血管疾病、骨質疏松癥和利用細胞整聯(lián)蛋白的病毒感染中具有有意義的治療應用。這類化合物可用于使化療藥，特別是抗癌藥定向于表達高水平整聯(lián)蛋白受體的那些細胞。按照這種方式，獲得有效的治療反應，而由化療藥誘發(fā)的副作用減輕。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及被賦予了抗-整聯(lián)蛋白活性的環(huán)肽衍生物，并且特別涉及除含有在本文所述的所有化合物中恒定的三個氨基酸的序列外，還含有其它兩個為天然和非天然氨基酸的殘基的環(huán)肽類，所述的天然和非天然氨基酸可以在氮或在Cα上被為官能團或具有官能團的末端鏈的殘基取代，所述的官能團令人意外地增強其與整聯(lián)蛋白αvβ3和αvβ5的結合。本發(fā)明還涉及制備所述化合物的方法，其作為藥物的應用，特別是作為整聯(lián)蛋白受體抑制劑的應用，所述的藥物具有用于治療疾病的作用，所述的疾病諸如視網膜病、急性腎功能衰竭、骨質疏松癥和轉移；并且本發(fā)明還涉及含有所述化合物的藥物組合物。這些化合物在被適當標記時還用作用于檢測小腫瘤塊和動脈閉塞事件的診斷試劑。
由本發(fā)明的環(huán)肽類傳載的藥物屬于細胞毒性劑類，諸如烷化劑(環(huán)磷酰胺、亞硝基脲)、抗代謝物(甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracyl)、阿糖胞苷)、天然產物(多柔比星和結構類似物、放線菌素D、博來霉素、長春花生物堿、鬼臼毒素和絲裂霉素C)。
有關αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白受體化合物及其應用的現(xiàn)有技術的詳盡描述，讀者可以參見以本申請人名義的WO 2004/011487，其中還結合科學背景技術進行明確參考。
令人意外的是，本發(fā)明的所得分子顯示出對整聯(lián)蛋白的親和性，有時顯著高于對屬于同一類別和在文獻中描述的環(huán)肽觀察到的親和性[H.Kessler等，J.Med.Chem.，1999，42，3033-40]。
因此，本發(fā)明提供了αvβ3和αvβ5類型整聯(lián)蛋白抑制劑，它們遠比已知化合物更為有效。
因此，本發(fā)明的主要目的在于如下的式I化合物c(R1-Arg-Gly-Asp-R2)(式I)其外消旋混合物、其單一對映體、其單一非對映異構體及其藥物上可接受的鹽，其中-c指的是環(huán)；-R1為具有如下通式的氨基酸-NX-CY(Z)-CO-；其中-X選自下列基團組成的組H、直鏈或支鏈C1-C6烷基、C6-C10芳基、芐基、(CH2)n-COR、(CH2)n-NHR′、4-COR-芐基、4-(CH2-NHR′)-芐基；其中n為1-5的整數(shù)；-Y選自下列基團組成的組H、CHmFm′；其中m+m′＝3，其中m和m′為0-3的整數(shù)；-Z選自下列基團組成的組H、直鏈或支鏈C1-C6烷基、C6-C10芳基、(CH2)n1-COR、(CH2)n1-NHR′，4-NHR′-(CH2)n1-芐基、4-COR-芐基，其中n1為0-5的整數(shù)；-R選自下列基團組成的組W、OW、N[CH2-CO-NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW]2、NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW、NW-(CH2-CH2NH)n2-CH2-CH2NHW；其中n2為1-22的整數(shù)；且-W選自下列基團組成的組H、C1-C3烷基；-R′選自下列基團組成的組H、CO-(CH2)n2-COOW、CO-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-NHW、CO-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW；其中n2具有上述含義；且-R2選自下列基團組成的組D-Phe、D-Tyr、D-Trp、D-2-萘基-Ala、D-4-叔丁基-Phe、D-4，4′-聯(lián)苯基-Ala、D-4-CF3-Phe、D-4-乙酰基胺-Phe。
式(I)化合物的優(yōu)選實例為c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp)；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad)；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp)；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH2)2COOH]；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly)；
c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(O-CH2-CH2)2-O-CH2-COOH]；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(OCH2CH2)8-OCH2-COOH]；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(羧基亞戊基)-Val]；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(烯丙氧基羰基亞戊基)-Val]；和c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2-CH2)3OCH3)]。
所謂藥物上可接受的鹽的含義是不會產生毒副作用的任意的鹽。
這類鹽是藥理學家和制藥技術中的專業(yè)技術人員眾所周知的。
可以按照下文所述和對本發(fā)明優(yōu)選化合物舉例說明的方法制備式I的化合物。該方法構成了本發(fā)明的另一個目的。
可以在合成非天然氨基酸殘基后，如實驗部分實施例中所述，按照常規(guī)肽合成技術，制備式I的化合物。可以在固相或溶液中進行肽合成。一旦制備了適當保護的線性肽，將其環(huán)化。
本發(fā)明中所述的化合物為整聯(lián)蛋白抑制劑并且由此用作治療癌癥的藥物，作為診斷性顯像試劑并且作為靶向藥物載體(G.C.Tucker2003 Curr.Opin.Investig.Drugs 4,722-31)，特別用于治療其細胞天然地或以誘導方式(例如，作為放療的結果)過表達整聯(lián)蛋白的腫瘤；用于炎性疾病(例如類風濕性關節(jié)炎)，用于異常血管發(fā)生潛在的疾病，諸如腫瘤、視網膜病、眼病、急性腎功能衰竭、骨質疏松癥和轉移、心血管疾病(中風和心臟損害)；和經皮冠狀動脈腔內血管成形術后再狹窄(J.S.Kerr等，Drug News Perspect 2001，14，143 50)。本文所述的化合物在適當被標記時還用作診斷試劑，尤其是用于檢測小腫瘤塊和動脈閉塞事件。已經用(18)F、(111)In、(99)Tc、(90)Y和許多碘同位素標記了各種拮抗劑，以便監(jiān)測腫瘤誘導的血管發(fā)生，因為整聯(lián)蛋白涉及內皮細胞遷移以形成新血管(R.H.Haubner等，2003Q.J.Nucl.Med.47 189-99)。高親和放射性標記的肽類可以用作αvβ3整聯(lián)蛋白的靶物并且使血管損害區(qū)域顯像，因為αvβ3整聯(lián)蛋白表達在活化的內皮細胞和血管損傷后的血管平滑肌細胞中增加。這種手段克服了磁共振和計算機軸向體層攝影術成像方法的缺陷，諸如缺乏生物相關性配體和用于成像的血液造影劑(F.G.Blankenberg等，2002 Am.J.Cardiov.Drugs 2,357-65)。
藥物組合物含有至少一種式(I)的化合物作為活性組分，其用量以產生顯著的治療作用。本發(fā)明的組合物是完全常規(guī)的并且使用制藥工業(yè)中通常實施的方法獲得。按照選擇的給藥途徑，組合物為適合于口服、非腸道或靜脈內給藥的固體或液體形式。本發(fā)明的組合物含有連同活性成分一起的至少一種藥物上可接受的載體或賦形劑。特別可以使用制劑輔劑，例如增溶劑、分散劑、懸浮劑和乳化劑。
式I的化合物還可以與其它抗癌藥或具有抗寄生蟲或抗病毒活性的其它藥物聯(lián)用，既可以為單獨分開的劑型，也可以在單一劑型中。
屬于本發(fā)明目的的藥物還可以用于治療寄生蟲和腺病毒疾病。病原體進入細胞可以通過直接穿透質膜、網格蛋白介導的胞吞、小窩胞吞、胞飲或大胞飲(macropinocytosis)發(fā)生。大胞飲需要整聯(lián)蛋白的參與(0.Meier等，2003，J.Gene Med.5,451-62)。那么，可以通過抑制整聯(lián)蛋白介導的粘附并且通過趨化因子受體引導的白細胞募集來發(fā)揮抗寄生蟲活性，例如在控制克氏錐蟲誘導的炎癥中。順便說一句，在查加斯病的急性期中，炎癥過程的誘導對控制宿主/寄生蟲平衡的靶組織中的克氏錐蟲是決定性的(J.Lannes-Vieira，2003，Mem.Inst.Oswaldo Cruz，98,299-304)。
下列實施例進一步解釋了本發(fā)明。
使用縮寫如下Aad(氨基己二酸)；Amb(氨甲基芐基)；Amp(氨甲基苯丙氨酸)；Boc(叔丁氧羰基)；CSA(樟腦磺酸)；CTH(催化轉移氫化)；DBU(1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一-7-烯)；DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)；DCM(二氯甲烷)；
DEAD(乙炔二羧酸二乙酯)；DIEA(二異丙基乙胺)；DMF(二甲基甲酰胺)；EMEM(含有Earle’s鹽的Eagle極限必需培養(yǎng)基)；Fm(芴甲基)；Fmoc(9-芴甲氧羰基)；HOBT(羥基苯并三唑)；NMP(N-甲基-吡咯烷酮)；oNBS(2-硝基苯磺酸鹽)；PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)；Pht(鄰苯二甲?；?；Pmc(五甲基色滿-6-磺酰基)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；TBTU(四氟硼酸-0-苯并三唑-1-基-四甲基脲鎓)；TEA(三乙胺)；Teg(三甘醇一甲基醚)；和TFA(三氟乙酸)。
實施例實施例1c(Ars-Gly-Asp-D-Phe-Amp)-ST2581的合成將1.587mmol Fmoc-Gly-Res(Res＝Sasrin Resin_，Bachem)在攪拌下懸浮于75ml DMF中30分鐘，此后加入18ml哌啶，再繼續(xù)攪拌30分鐘。將過濾并且用DMF洗滌的樹脂懸浮于50ml NMP(N-甲基-吡咯烷酮)中15分鐘，此后加入Fmoc-Arg(Pmc)-OH、HOBT、TBTU和DIEA(各3.174mmol)；攪拌2小時后，過濾該混懸液并且用DMF洗滌。在使用哌啶脫保護后，依次使用其它氨基酸重復縮合，每次如上所述進行操作，即Fmoc-Amp(Cbz)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH。在Fmoc-N-末端最終脫保護后，使用45ml 1％在DCM中的TFA使線性五肽從樹脂上釋放。將其溶于約11的CH3CN，并且加入4.761mmol HOBT和TBTU及10ml DIEA；將該溶液在攪拌下保持30分鐘，蒸發(fā)溶劑至小體積并且使用水完成產物沉淀。
將過濾的粗產物溶于苯甲硫醚(50eq)和TFA(270eq)并且在室溫下攪拌過夜。
使該反應混合物變干，將殘余物吸收于最少量的TFA并且使用過量的乙醚重新沉淀。最終通過RP-HPLC純化粗產物[柱Alltima C-18，Alltech；流動相17％CH3CN在水+0.1％TFA中]分析型HPLC柱Purosphere STAR，Merck；流動相15％在水中的CH3CN+0.1％TFA)∶Rt＝12.15分鐘。
分子量＝652實施例2c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad)-ST2650的合成正如實施例1中所述處理0.69mmol Fmoc-Gly-Res，差別在于在此情況下以二肽Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH形式加入第三和第四個氨基酸。在通過CTH對芐酯脫保護并且使用制備型RP-HPLC(流動相55％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝17.29分鐘)純化粗產物后得到187mg純的脫保護的肽。將其溶于TFA并且在室溫下1小時后使該溶液變干。將殘余物重新溶于最少量的TFA并且使用過量乙醚沉淀。重復該操作，直到獲得澄清的終產物。
分析型RP-HPLC(17％在水中的CH3CN+0.1％TFA)∶Rt＝12.52分鐘。
分子量＝619實施例3c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp)-ST2700的合成向達到回流的Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH2)-COOH在無水甲苯中的混懸液中加入2eq CSA和20eq低聚甲醛，分成4部分間隔15分鐘加入。將該混合物冷卻，使用120ml甲苯稀釋并且用5％NaHCO3和水洗滌。在蒸發(fā)溶劑后，將殘余物溶于15ml CHCl3+15ml TFA+700μlEt3SiH；將該混合物置于暗處攪拌42小時。在蒸發(fā)溶劑后，通過硅膠過濾純化殘余物?？偖a率90％。
如實施例1中所述在固相中合成線性肽，插入如上所述制備的作為第三個氨基酸的Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH2)-COOH。在這種情況中，使用在DMF溶液中的30％二異丙胺(300eq)使樹脂上的N-Fmoc-末端脫保護(因為存在鄰苯二甲酰亞胺)。環(huán)化后，將500mg肽加熱溶于10ml無水EtOH，向其中加入0.9ml NH2-NH2·H2O在乙醇中的1M溶液。在回流狀態(tài)下加熱2小時后，蒸發(fā)溶劑并且在劇烈振搖下將殘余物吸收于10ml DCM+10ml Na2CO3溶液。在蒸發(fā)有機相后，通過制備型RP-HPLC純化粗殘余物(流動相17％CH3CN在水+0.1％TFA中)。
分析型RP-HPLC(16％在水中的CH3CN+0.1％TFA)∶Rt＝11.7分鐘。
分子量＝665實施例4c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CH2)2COOH]-ST2649的合成將120mg環(huán)肽c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]·TFA(如實施例1中所述制備)與化學計算量的TEA和琥珀酸酐一起溶于3.6mlDCM-DMF2∶1的混合物中。1小時后，用30ml DCM稀釋該反應混合物并且用水洗滌。干燥和濃縮有機相得到殘余物，為100mg半琥珀酸酯。使用TFA將該產物完全脫保護且然后如上述實施例中所述進行首次純化。然后通過制備型RP-HPLC進一步純化(23％在水中的CH3CN+0.1％TFA)分析型RP-HPLC(20％在水中的CH3CN+0.1％TFA)∶Rt＝14.66分鐘。
分子量＝751實施例5
c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly)-ST2701的合成向1.22mmol Boc-一保護的對-苯二甲胺在6ml THF中的溶液中加入1.83mmol TEA并且滴加1.22mmol溴乙酸芐酯在2ml THF中的溶液。將該混合物在攪拌下保持過夜，此后蒸發(fā)溶劑并且在快速色譜柱上純化殘余物(CHCl3-EtOAc，9∶1)。得到0.69mmol N-(4-Boc-NH-CH2-芐基)-甘氨酸芐酯。
將250mg Fmoc-D-Phe-OH溶于27ml DCM并且加入40μl雙光氣和230μl均-可力?。?5分鐘后，加入190mg先前制備的酯(溶于3ml DCM中)。3小時后，將80μl N-Me-哌嗪加入到該反應混合物中并且攪拌10分鐘，此后用10ml DCM稀釋該混合物并且用水、0.5N HCl、水、5％NaHCO3和水進行萃取。在蒸發(fā)溶劑后，通過硅膠快速色譜法純化殘余物(DCM-EtOAc，9∶1)。產率80％。
向溶于6ml MeOH中的100mg由此獲得的產物中加入76μl AcOH和42mg HCOONH4并且將該混合物冷卻至0℃，且加入50mg 10％Pd/C。30分鐘后，用C鹽過濾該反應混合物。使濾液變干并且在快速色譜柱上純化(CHCl3-MeOH 9∶1)。產率90％。
將190mg由此獲得的產物溶于1.2ml TFA并且使其干燥(Boc脫保護)；將殘余物重新溶于9ml 10％Na2CO3+6ml二_烷，冷卻至0℃并且滴加120μl芐氧羰基氯用3ml二_烷稀釋的溶液。在室溫下攪拌1小時后，在真空中進行蒸發(fā)至小體積，此后用水稀釋該混合物，用HCl使pH降至1并且使用EtOAc進行萃取。在蒸發(fā)溶劑后，通過硅膠過濾純化殘余物，使用CHCl3-MeOH(8∶2)洗滌。純二肽產率82％。
如實施例1中所述處理0.69mmol Fmoc-Gly-Res。在Arg后，順次加入先前制備的二肽Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH2-芐基)-Gly。將粗產物溶于苯甲硫醚和TFA中并且在室溫下攪拌4.5小時。如其它實施例中所述進行第一次純化，而使用制備型HPLC(流動相16％在水中的CH3CN+0.1％TFA)完成最終純化。
分析型RP-HPLC(流動相15％CH3CN在水+0.1％TFA中)；Rt＝7.67分鐘。
分子量＝652實施例6c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(O-CH2-CH2)2-O-CH2-COOH]-ST2661的合成向200mg c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)·TFA(如實施例1中所述獲得)在4ml 3∶1 DCM-DMF混合物中的溶液中加入大大過量的乙二醇二酸。向同一溶液中加入DIEA(3eq)和DCC(2eq)。將該混合物攪拌過夜，此后用DCM稀釋并且用水洗滌。
通過蒸發(fā)有機相回收粗產物并且通過快速色譜法純化(流動相CHCl3-MeOH 7∶3+1％AcOH)；收集合并含有產物的級分，用水洗滌，脫水并且使其干燥，得到殘余物，為157mg純產物。用TFA將其處理1.5小時并且如其它實施例中所述凈化，此后通過制備型HPLC進行最終純化(流動相22％在水中的CH3CN+0.1％TFA)。
分析型RP-HPLC(23％CH3CN在水+0.1％TFA中)；Rt＝10分鐘。
分子量＝855。
實施例7c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(OCH2CH2)8-OCH2-COOH]-ST2874的合成將150mg實施例1中所述的肽和110mg PEG 600-COOFm(1eq)+HOAT(1.5eq)+DIEA(2eq)溶于6ml DCM-DMF(2∶1)混合物中，并且將該溶液冷卻至0℃；加入1.5eq DCC并且將該混合物保持攪拌過夜。在蒸發(fā)溶劑后，在快速色譜柱上純化殘余物(步驟ICHCl3-MeOH，96∶4；步驟IICHCl3-MeOH，90∶10)。為了使芴甲酯脫保護，將36mg該酯溶于1.8ml CHCl3，加入41μl(20eq)哌啶并且在室溫下保持1夜。蒸發(fā)溶劑后，通過制備型HPLC純化粗殘余物(46％CH3CN在水+0.1％TFA中)。將由此獲得的純產物溶于TFA并且在室溫下保持2小時。在減少至小體積后，使用過量的乙醚沉淀完全脫保護的產物。分析型RP-HPLC(26％CH3CN在水+0.1％TFA中)；Rt＝7.89-15.83分鐘。
分子量＝1119。
實施例8c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(羧基亞戊基)-Val)]ST2956[和烯丙基衍生物ST2957]的合成按照上述方法，通過固相合成獲得Arg(Pmc)-Gly序列，同時通過下列方法引入構件oNbs-N[CH2)5-COOAll]Val-OH將構件(3eq)(合成如下述)和1-溴-N，N-2-三甲基-1-丙烯胺(4.5eq)的混合物在惰性氣氛(氬氣)中溶于DCM，在室溫下繼續(xù)攪拌10分鐘。
然后在惰性氣體環(huán)境中將該混合物加入到在含有可力丁(12eq)的DCM中的樹脂中。2小時(Kaiser試驗陰性)后，過濾樹脂并且用大量DCM e DMF充分洗滌，且在減壓條件下干燥。
為了進行2-硝基苯磺?；?oNbs)部分的脫保護，向樹脂中加入在DMF中的2-巰基乙醇(10eq)+DBU(5eq)。30分鐘后，再次加入相同試劑，在2小時后，裂解完全(通過HPLC檢驗)。過濾樹脂并且用DCM和DMF洗滌。
接下來的偶聯(lián)的合成途徑相同，使用N3-D-Phe-Br。通過從相應的氨基酸開始的″重氮轉移″反應[Alper等，Tetrahedron Lett.(1996)37，6029]制備相應的α-疊氮化物酸。使用SnCl4(10eq)+苯硫酚(40eq)和TEA(10eq)在DMF中的溶液還原疊氮化物部分。將這種溶液加入到在DMF中的樹脂中并且保持攪拌1小時。然后用2N NaOH將所得混懸液處理5分鐘，過濾并且用水、DMF、MeOH、DMF e DCM洗滌。
隨后Asp縮合、之后的Fmoc基團脫保護、樹脂裂解和肽環(huán)化的條件為常用于肽化學合成的那些條件。
通過快速色譜法純化粗材料。
首先使用Pd(Ph3P)4且然后使用TFA逐步對獲得的肽進行脫保護。通過使用TFA/乙醚沉淀來純化終產物。
實施例8aoNbs-[N(CH2)5-COOAll]-Val-OH構件合成向羥基酸HO-(CH2)5COOH和無水乙醇的溶液中加入Cs2CO3(1eq)。將該混合物保持攪拌直至鹽完全溶解(約40分鐘)。在真空中蒸發(fā)溶劑并且用苯干燥殘余物，直到得到白色固體結晶。向溶于DMF中的該固體中加入烯丙基溴(11eq)并且在攪拌下保持2小時。再加入烯丙基溴(11eq)并且在室溫下保持攪拌過夜。通過快速色譜法純化粗材料(己烷(exane)/AcOEt，1∶1)。產率70％。
向在10℃下的oNbs-Va1-OtBu在THF中的溶液中加入羥基酯(1.05eq)和三苯膦(1.5eq)。在-20℃下，加入4.08ml DEAD(在甲苯中40％)。在室溫下攪拌48小時后，蒸發(fā)溶劑并且通過RP-HPLC純化粗材料。(CH3CN/H2O/TFA75-25-0.1)。產率70％。
在使用TFA最終使叔丁酯脫保護后，得到所希望的構件。
實施例9c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2CH2)3-OCH3)]-ST2597的合成如實施例1中所述通過固相合成該肽，插入如下制備的Fmoc-Amp(CO-CH2-Teg)-OH作為第三個氨基酸將570mg CH3O(CH2CH2O)3-CH2-COOH、473mg 2，3，4，5-五氟苯酚(Pfp)和207μl吡啶溶于11.4ml DCM。向冷卻至0℃的該溶液中加入637mg DCC并且將該反應混合物在攪拌下保持1.5小時。在過濾并且用水、1N HCl、水、5％NaHCO3和水洗滌濾液后，將該有機溶液干燥，得到984mg粗酯。
向500mg Fmoc-氨甲基苯丙氨酸.TFA鹽在15ml DCM中的混懸液中加入260μl TEA，隨后加入800mg活化的酯并且將該混合物在攪拌下保持3小時。通過快速色譜法純化粗產物，得到純的構件。
如常純化最終的環(huán)肽并且從制備型HPLC中分離(27％CH3CN在水+0.1％TFA中)，Rt＝12.7分鐘。
分子量＝855實施例10生物學結果與整聯(lián)蛋白αvβ3受體結合在緩沖液(20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2，1mMMgCl2，1mM MnCl2)中將純化的αvβ3受體(Chemicon，cat.CC1020)稀釋至濃度為0.5μg/ml。將100μl等分部分加入到96-孔平板中并且在+4℃下保溫過夜。用緩沖液(50mM Tris，pH7,4，100mM NaCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，1mM MnCl2，1％牛血清白蛋白)將平板洗滌一次且然后再在室溫下保溫2小時。用相同緩沖液將平板洗滌兩次并且在室溫下在有競爭配體存在下與放射性配體[125I]鋸鱗血抑肽(echistatin)(Amersham Pharmacia Biotech)0.05nM一起保溫3小時。在保溫結束時，洗滌各孔并且使用γ計數(shù)器(Packard)測定放射性。在有過量冷鋸鱗血抑肽(1μM)存在下測定配體的非特異性結合。
與整聯(lián)蛋白αvβ5受體結合在緩沖液(20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2，1mMMgCl2，1mM MnCl2)中將純化的αvβ5受體(Chemicon，cat.CC1020)稀釋至濃度為1μg/ml。將100μl等分部分加入到96-孔平板中并且在+4℃下保溫過夜。用緩沖液(50mM Tris，pH7,4，100mM NaCl，2mMCaCl2，1mM MgCl2，1mM MnCl2，1％牛血清白蛋白)將平板洗滌一次且然后再在室溫下保溫2小時。用相同緩沖液將平板洗滌兩次并且在室溫下在有競爭配體存在下與放射性配體[125I]鋸鱗血抑肽(AmershamPharmacia Biotech)0.15nM一起保溫3小時。在保溫結束時，洗滌各孔并且使用γ計數(shù)器(Packard)測定放射性。在有過量冷鋸鱗血抑肽(1μM)存在下測定非特異性配體結合。
IC50參數(shù)的評價將產物對玻連蛋白受體的親和性表示為IC50值±SD，即表示為能夠抑制50％特異性放射性配體-受體結合的濃度。使用″ALLFIT″軟件研究IC50參數(shù)。
結果所有檢查的RGD肽類均表現(xiàn)出對αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白受體的顯著親和性，IC50值在納摩爾級。特別地，在抑制鋸鱗血抑肽與αvβ3整聯(lián)蛋白結合中最具有活性的是ST2581(IC50＝1.7nM)，隨后是產物ST2661和ST2700(IC50＝4和7nM)，而對αvβ5整聯(lián)蛋白受體最具有活性的是產物ST2650(IC50＝0.17nM)，隨后是分子ST2661和ST2700(IC50分別為0.35和0.99nM)。
盡管整聯(lián)蛋白的主要功能在于介導細胞與胞間空間和基底膜中的ECM蛋白的粘附，但是它們還轉導促進細胞遷移以及存活的胞內信號。整聯(lián)蛋白不具有內在酶活性，但在其與多價胞外基質(ECM)蛋白結合后，通過與黏著斑復合物中的激酶和銜接蛋白共聚集而活化信號傳導途徑。例如，整聯(lián)蛋白連接通過活化編程性細胞死亡抑制劑并且通過抑制半胱天冬酶活化而抑制編程性細胞死亡。整聯(lián)蛋白還通過活化Rho和Rac GTP酶(鳥苷三磷酸酶)并且通過使肌動蛋白纖絲與膜錨定而刺激細胞遷移。這些黏著蛋白通過刺激細胞周期蛋白的表達促進細胞周期進入。因此，整聯(lián)蛋白連接支持促進細胞增殖、存活和遷移的信號轉導級聯(lián)。相反，抑制細胞整聯(lián)蛋白-配體相互作用可以抑制細胞遷移和增殖并且誘導編程性細胞死亡(Jin H.和Varner J.2004 Br.J.Cancer 90，561-565)。
表1RGD肽類對玻連蛋白αvβ3和αvβ5受體的親和性
腫瘤細胞在玻連蛋白上的粘附試驗使A2780人卵巢癌和PC3前列腺癌細胞生長在含有10％胎牛血清和50μg/ml硫酸慶大霉素的RPMI 1640中。使A498人腎癌生長在含有10％胎牛血清和50μg/ml硫酸慶大霉素的EMEM中。將所有細胞均維持在37℃含有飽和濕度和95％空氣和5％CO2氣氛的保溫箱內。
A2780細胞系表達高水平的αvβ5整聯(lián)蛋白，A498表達高水平的αvβ3整聯(lián)蛋白，且PC3表達低水平的這兩種整聯(lián)蛋白。
為了測試藥物對細胞粘附的作用，將對每種腫瘤細胞系合適的細胞密度(40000-50000個細胞/孔)與不同濃度的化合物在包被了玻連蛋白(5μg/ml)的96-孔組織培養(yǎng)板中保溫并且使其附著3小時。此后，用含有Ca2+e Mg2+的PBS將細胞洗滌一次。在室溫下使用4％低聚甲醛將腫瘤細胞固定10分鐘并且在室溫下使用1％甲苯胺藍染色10分鐘。用雙蒸水洗滌腫瘤細胞，干燥并且使用1％SDS溶解。在微量平板讀出器(Victor2，EG&G Wallac)上以600nm測定粘附細胞數(shù)。
使用″ALLFIT″計算機程序評價作為衡量分子對腫瘤細胞與玻連蛋白粘附的抑制作用的參數(shù)的IC50值。在表2中報導了使用本發(fā)明測試化合物獲得的結果。
表2粘附試驗
權利要求
1.具有如下式I的環(huán)肽類c(R1-Arg-Gly-Asp-R2)(式I)其外消旋混合物、其單一對映體、其單一非對映異構體及其藥物上可接受的鹽，其中-c指的是環(huán)；-R1為具有如下通式的氨基酸-NX-CY(Z)-CO-；其中-X選自下列基團組成的組H、直鏈或支鏈C1-C6烷基、C6-C10芳基、芐基、(CH2)n-COR、(CH2)n-NHR′、4-COR-芐基、4-(CH2-NHR′)-芐基；其中n為1-5的整數(shù)；-Y選自下列基團組成的組H、CHmFm′；其中m+m′＝3，其中m和m′為0-3的整數(shù)；-Z選自下列基團組成的組H、直鏈或支鏈C1-C6烷基、C6-C10芳基、(CH2)n1-COR、(CH2)n1-NHR′，4-NHR′-(CH2)n1-芐基、4-COR-芐基，其中n1為0-5的整數(shù)；-R選自下列基團組成的組W、OW、N[CH2-CO-NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW]2、NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW、NW-(CH2-CH2NH)n2-CH2-CH2NHW；其中n2為1-22的整數(shù)；且-W選自下列基團組成的組H、C1-C3烷基；-R′選自下列基團組成的組H、CO-(CH2)n2-COOW、CO-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-NHW、CO-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW；其中n2具有上述含義；且-R2選自下列基團組成的組D-Phe、D-Tyr、D-Trp、D-2-萘基-Ala、D-4-叔丁基-Phe、D-4，41-聯(lián)苯基-Ala、D-4-CF3-Phe、D-4-乙酰基胺-Phe。
2.權利要求1的化合物，選自下列化合物組成的組c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp)；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad]；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp)；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH2)2COOH]；c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly)；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(O-CH2-CH2)2-O-CH2-COOH]；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(OCH2CH2)8-OCH2-COOH]；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(羧基亞戊基)-Val)]；c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(烯丙氧基羰基亞戊基)-Val]；和c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2-CH2)3OCH3)]。
3.制備權利要求1-2所述的化合物的方法，包括合成線性肽及其隨后環(huán)化。
4.權利要求3的方法，其中在固相或溶液中進行肽的合成。
5.權利要求1-2所述的化合物在制備藥物中的應用。
6.藥物組合物，含有至少一種權利要求1或2的化合物與至少一種藥物上可接受的賦形劑或載體的混合物。
7.權利要求6的組合物，還含有選自抗癌藥、抗寄生蟲藥或抗病毒藥組成的組的藥物，在單獨分開的劑型中或在單一劑型中。
8.權利要求1-2的化合物在制備具有整聯(lián)蛋白受體抑制活性的藥物中的應用。
9.權利要求8的應用，其中所述的藥物用于治療源于異常血管發(fā)生的疾病。
10.權利要求9的應用，其中所述的疾病選自天然和以誘導方式過表達整聯(lián)蛋白的腫瘤、炎癥形式(例如類風濕性關節(jié)炎)、眼病、視網膜病、急性腎功能衰竭、骨質疏松癥和轉移、心血管疾病(中風和心臟損害)組成的組。
11.權利要求1-2的化合物在制備通過整聯(lián)蛋白抑制而具有抗寄生蟲活性的藥物中的應用。
12.含有權利要求1或2化合物的放射性標記的衍生物的組合物。
13.權利要求1或2化合物的放射性標記的衍生物在制備診斷試劑中的應用。
14.權利要求13的應用，其中所述的診斷試劑用于檢測小腫瘤塊或動脈閉塞事件。
全文摘要
本發(fā)明描述了式(I)的化合物c(R
文檔編號A61K38/00GK1953990SQ200580015238
公開日2007年4月25日 申請日期2005年5月4日 優(yōu)先權日2004年5月13日
發(fā)明者A·達爾波佐, S·潘克, G·加尼尼, M·O·廷蒂, C·皮薩諾, L·維西, 倪明紅 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司