專利名稱：：治療胰腺癌的組合物和方法本申請(qǐng)要求了2004年3月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/555,809的權(quán)利，在此并入它的全部?jī)?nèi)容作為參考。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及生物科學(xué)的領(lǐng)域，更具體地是涉及癌癥研究的領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及了組合物，該組合物包含能抑制編碼PCDH1、CDH3或GPR107的基因的表達(dá)的核酸。在一些實(shí)施方案中，該化合物是對(duì)應(yīng)于這些基因的子序列的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。
背景技術(shù)：
：西方國(guó)家中，胰管腺癌(Pancreaticductaladenocarcinoma，PDACa)是癌癥死亡的第五個(gè)主要的原因，在任何惡性程度下都是致死率最高的幾種癌癥之一，5年的存活率僅有4％。在美國(guó)，每年估計(jì)有30700名病人被診斷為胰腺癌，而且近30000名病人死于胰腺癌。絕大部分患者在該疾病的晚期得到診斷，在這個(gè)階段該疾病對(duì)現(xiàn)有的療法都不起反應(yīng)，而病人只能生存幾個(gè)月。只有手術(shù)切除才有可能治愈PDACa，但是只有10-20％的PDACa患者能接受可能根治的切除，而且即使在根治性手術(shù)后，也有80-90％的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)而死于PDACa。在也接受吉西他濱(gemcitabine)和/或放射線化學(xué)治療的患者中，術(shù)后的結(jié)果或生活質(zhì)量出現(xiàn)一些改善，但是這些方法對(duì)患者長(zhǎng)期生存的影響卻極小，因?yàn)镻DACa會(huì)對(duì)任何一種治療方法都有強(qiáng)烈的抗性?；谶@種原因，對(duì)大多數(shù)患者的治療都集中于緩解病情上。因此，當(dāng)前對(duì)于胰腺癌的治療來(lái)說(shuō)十分緊迫的問(wèn)題是建立一種新的PDACa分子治療方法和鑒定出新的PDACa治療性分子靶物。發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明是基于一個(gè)驚人的發(fā)現(xiàn)，即抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)可以有效地抑制多種癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)，包括那些PDACa中涉及的細(xì)胞。本申請(qǐng)中所描述的發(fā)明部分地基于這一發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。在所述方法中，提供了包括將細(xì)胞與包含小干擾RNA(siRNA)的組合物接觸，該siRNA抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)的方法。本發(fā)明也提供了抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。這些方法包括給受試者施用包含小干擾RNA(siRNA)的組合物，其中siRNA可與來(lái)自PCDH1，CDH3或GPR107的序列特異性地雜交。本發(fā)明的另一方面，提供了在生物樣本的細(xì)胞中抑制PCDH1，CDH3或GPR107基因表達(dá)的方法。通過(guò)以足夠抑制PCDH1，CDH3或GPR107基因的表達(dá)的量將雙鏈核糖核酸(RNA)分子導(dǎo)入細(xì)胞，可以抑制所述基因的表達(dá)。另一方面，本發(fā)明涉及例如在所提供的方法中有用的產(chǎn)品，其包括核酸序列，載體以及包含它們的組合物。在所述產(chǎn)品中提供了siRNA分子，所述siRNA分子具有這樣的性質(zhì)當(dāng)它們被導(dǎo)入到表達(dá)PCDH1，CDH3或GPR107基因的細(xì)胞中時(shí)，抑制這些基因的表達(dá)。這樣的分子中包括那些包含了有義和反義鏈的分子，其中所述有義鏈包含與PCDH1，CDH3或GPR107靶序列相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列，而其中所述反義鏈包含與該有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。所述分子的有義鏈和反義鏈互相雜交形成雙鏈分子。本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“生物體”是指任何有生命的、包括至少一個(gè)細(xì)胞的實(shí)體。有生命的生物體可以像例如單真核細(xì)胞那樣簡(jiǎn)單，或者像哺乳動(dòng)物包括人那樣復(fù)雜。本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“生物樣本”是指一個(gè)完整的生物體或生物體的組織、細(xì)胞或組成部分的亞類(subset)(如體液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜索(amnioticcord)血、尿液、陰道液和精液)。此外，“生物樣本”還可指勻漿、裂解產(chǎn)物、提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，其由完整的生物體或其組織、細(xì)胞或組成部分的亞類，或其級(jí)分或部分制備。最后，“生物樣本”指培養(yǎng)基，例如在其中生物體已經(jīng)增殖的營(yíng)養(yǎng)肉湯或凝膠，該培養(yǎng)基中包含細(xì)胞組分，例如蛋白質(zhì)或核酸分子。本發(fā)明重點(diǎn)描述了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。通過(guò)使細(xì)胞同PCDH1，CDH3或GPR107的小干擾RNA(siRNA)的組合物接觸來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。該細(xì)胞進(jìn)一步同轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑相接觸。細(xì)胞以體外、體內(nèi)或離體提供。受試者是哺乳動(dòng)物，如人、非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。所述細(xì)胞是胰管細(xì)胞?；蛘?，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞(即癌細(xì)胞)，如癌細(xì)胞或腺癌細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞是胰管腺癌細(xì)胞。抑制細(xì)胞生長(zhǎng)意味著處理的細(xì)胞與未處理的細(xì)胞相比，增殖的速率較低，或生存力(viability)降低。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的增殖測(cè)定法來(lái)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)“siRNA”是指一種雙鏈的RNA分子，它阻斷目標(biāo)mRNA的翻譯。采用了將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，其中包括DNA為模板由其轉(zhuǎn)錄RNA的技術(shù)。siRNA包含有義的PCDH1，CDH3或GPR107核酸序列、反義的PCDH1，CDH3或GPR107核酸序列、或二者。所述siRNA可能包含兩個(gè)互補(bǔ)的分子，或者可以如此構(gòu)建，以使得單個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)具有來(lái)自目的基因的有義和互補(bǔ)的反義序列，例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在一些實(shí)施方案中，這導(dǎo)致微小RNA(miRNA)的產(chǎn)生。本方法用來(lái)改變例如由于細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞中的基因表達(dá)。在靶細(xì)胞中，siRNA同PCDH1，CDH3或GPR107的轉(zhuǎn)錄本相結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生PCDH1，CDH3或GPR107的減少。該寡核苷酸的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸，并可與天然存在的PCDH1，CDH3或GPR107轉(zhuǎn)錄本一樣長(zhǎng)。優(yōu)選地，該寡核苷酸的長(zhǎng)度為大約19個(gè)到大約25個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地，該寡核苷酸的長(zhǎng)度少于大約75個(gè)，大約50個(gè)，或大約25個(gè)核苷酸。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制PCDH1，CDH3或GPR107表達(dá)的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA寡核苷酸的例子包括分別含有靶序列例如SEQIDNOs22，23或24的核苷酸的寡核苷酸。設(shè)計(jì)具有在靶細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的能力的雙鏈RNA的方法是已知的(參見(jiàn)如美國(guó)專利No.6,506,559，在此并入它的全部?jī)?nèi)容作為參考)。例如，由Ambion網(wǎng)站可得到用于設(shè)計(jì)siRNAs的計(jì)算機(jī)程序(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。該計(jì)算機(jī)程序可從Ambion，Inc.獲得，其根據(jù)下面的步驟來(lái)選擇用于siRNA合成的核苷酸序列。siRNA目標(biāo)位點(diǎn)的選擇1.以轉(zhuǎn)錄本的起始密碼子AUG開(kāi)始，向下游尋找AA二核苷酸序列。記錄每一處AA和其3’端相鄰的19個(gè)核苷酸的出現(xiàn)作為可能的siRNA目標(biāo)位點(diǎn)。Tuschl等人不推薦在5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)和起始密碼子附近區(qū)域(75個(gè)堿基以內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA(TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro.GenesDev13(24)3191-7(1999))，因?yàn)檫@些區(qū)域可能更富含調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將可能的目標(biāo)位點(diǎn)同適當(dāng)?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)(人、小鼠、大鼠等等)進(jìn)行對(duì)比，并排除任何與其他編碼序列具有顯著的同源性的靶序列。推薦使用BLAST，其可以在NCBI服務(wù)器上找到，網(wǎng)址為www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著基因的長(zhǎng)度來(lái)選擇幾個(gè)靶序列來(lái)評(píng)價(jià)。本發(fā)明還包含分離的核酸分子，其包含靶序列的核酸序列，例如SEQIDNOs22，23和24的核苷酸，或者與SEQIDNOs22，23和24的核苷酸的核酸序列互補(bǔ)的核酸分子。本文使用的“分離的核酸”是指脫離它們的原本的環(huán)境(如，若其為天然存在的，則指自然環(huán)境)，并由此合成性地由其自然狀態(tài)改變的核酸。本發(fā)明中，分離的核酸包括DNA、RNA以及它們的衍生物。當(dāng)分離的核酸是RNA或它的衍生物時(shí)，核苷酸序列中的堿基“t”應(yīng)被替換為“u”。本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指核酸分子的核苷酸單位之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對(duì)，而術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”是指兩個(gè)核酸或化合物或相關(guān)的核酸或化合物或者其組合之間的物理或化學(xué)的相互作用。互補(bǔ)核酸序列在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交以形成穩(wěn)定的雙螺旋(duplex)結(jié)構(gòu)，其包含極少的錯(cuò)配或不包含錯(cuò)配。對(duì)本發(fā)明而言，具有5個(gè)或更少的錯(cuò)配的兩個(gè)序列被認(rèn)為是互補(bǔ)的。而且本發(fā)明的分離的核苷酸的有義和反義鏈通過(guò)雜交可以形成雙鏈核苷酸或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的雙螺旋在每10個(gè)配對(duì)中包含不多于1個(gè)錯(cuò)配。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙螺旋的兩條鏈完全互補(bǔ)，這樣的雙螺旋不含有錯(cuò)配。對(duì)于PCDH1，CDH3或GPR107，核酸分子的長(zhǎng)度分別小于3851，3205或6840個(gè)核苷酸。例如，所述核酸分子的長(zhǎng)度小于約500，約200或約75個(gè)核苷酸。本發(fā)明還包括含有一種或多種本文所述的核酸的載體，以及含有該載體的細(xì)胞。本發(fā)明的分離的核酸用于抗PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA，或者編碼該siRNA的DNA。當(dāng)所述核酸用于siRNA或者編碼siRNA的DNA時(shí)，有義鏈優(yōu)選長(zhǎng)于約19個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)于21個(gè)核苷酸。本發(fā)明部分地基于下面的發(fā)現(xiàn)在胰管腺癌(PDACa)中，同非癌性胰組織相比，編碼PCDH1，CDH3或GPR107的基因過(guò)量表達(dá)。PCDH1，CDH3或GPR107的cDNA長(zhǎng)度為3851，3205或6840個(gè)核苷酸。PCDH1，CDH3或GPR107的核酸序列和多肽序列分別顯示在SEQIDNO1和2，3和4或5和6。這些序列數(shù)據(jù)也可通過(guò)下面的登錄號(hào)得到。PCDH1(CFUPC)L11370，NM_002587CDH3X63629，NM_001793GPR107NM_032925，NM_020960，(KIAA1624R39794)AB046844包含SEQIDNOs22，23和24的siRNAs的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致PDACa細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制。PCDH1(CFUPC)屬于原鈣黏著蛋白家族(protocadherinfamily)，其是鈣依賴的細(xì)胞-細(xì)胞粘附的分子的鈣黏著蛋白超家族(cadherinsuperfamily)中最大的亞族。許多原鈣黏著蛋在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，它們可能在神經(jīng)回路發(fā)生和突觸傳遞調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用(SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，ObataS，DavidsonM，StJohnT，TaketaniS，SuzukiS.Protocadherinsalargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem.EMBOJ.，122249-56，1993.FrankM，andKemlerR.Protocadherins.CurrOpinCellBiol.，14557-62，2002)。但是，PCDH1在胰腺癌細(xì)胞中十分豐富，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中卻不豐富(圖3A)，它的功能還不清楚。CDH3也是鈣黏著蛋白家族中一個(gè)典型成員(ShimoyamaY，YoshidaT，TeradaM，ShimosatoY，AbeO，HirohashiS.MolecularcloningofahumanCa2+-dependentcell-celladhesionmoleculehomologoustomouseplacentalcadherinitslowexpressioninhumanplacentaltissues.JCellBiol.，1091787-94.1989)，它們通過(guò)其保守的胞內(nèi)域與聯(lián)蛋白(catenins)和細(xì)胞骨架(cytoskeletons)連接，介導(dǎo)控制細(xì)胞極性、分化、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ChristoforiG.Changingneighbors，changingbehaviorcelladhesionmolecules-mediatedsignalingduringtumorprogression.EMBOJ.，22，2318-2323，2003)。但是，與E-鈣黏著蛋白或N-鈣黏著蛋白不同，CDH3的功能還不清楚。在乳腺和卵巢中觀察到了它的表達(dá)，在乳腺癌和前列腺癌中報(bào)道了表達(dá)的喪失(loss)，盡管乳腺癌中的P-鈣黏著蛋白的表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)((PeraltaSolerA，KnudsenKA，SalazarH，HanAC，KeshgegianAA.P-cadherinexpressioninbreastcarcinomaindicatespoorsurvival.Cancer，861263-1272.1999)。GPR107(KIAA1624)是有七次跨膜結(jié)構(gòu)(seventransmembrane)的G蛋白偶聯(lián)受體(Gprotein-coupledreceptors，GPCR)的一種。當(dāng)前有很大一部分處方藥靶向一個(gè)或多個(gè)GPCR，而對(duì)于大部分主要的治療區(qū)域，在某種程度上通過(guò)幾種以GPCR為基礎(chǔ)的藥物起作用。很明顯，就藥物發(fā)現(xiàn)的潛力而言，GPCRs的排位是最高的。如Northern印跡分析(圖3C)所示，GPR107在正常的心臟、胎盤(pán)、骨骼肌、前列腺、睪丸、卵巢和脊髓中無(wú)限制地表達(dá)。但是，GPR107在重要的生命器官中豐度較低，這說(shuō)明靶向這些分子可望在人體內(nèi)產(chǎn)生較低的毒性。抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法本發(fā)明涉及通過(guò)抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，即癌細(xì)胞生長(zhǎng)。PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)，例如，通過(guò)特異性地靶向PCDH1，CDH3或GPR107基因的小干擾RNA(siRNA)而被抑制。PCDH1，CDH3或GPR107靶物包括，例如，SEQIDNOs22，23和24的核苷酸。在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已顯示雙鏈RNA(dsRNA)對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮很強(qiáng)的特異的沉默作用，這被稱為RNA干擾(RNAi)(SharpPA.RNAianddouble-strandRNA.GenesDev.1999Jan15；13(2)139-41.)。dsRNA被含有RNaseIII基序的酶加工成20-23個(gè)核苷酸的dsRNA，稱為小干擾RNA(siRNA)。所述siRNA與多組分核酸酶復(fù)合物一起特異地靶向互補(bǔ)的mRNA(HammondSM，BernsteinE，BeachD，HannonGJ.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells.Nature.2000Mar16；404(6775)293-6；HannonGJ.RNAinterference.Nature.2002Jul11；418(6894)244-51.)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由20或21-merdsRNA構(gòu)成的、具有19個(gè)互補(bǔ)的核苷酸和3’末端非互補(bǔ)的胸腺嘧啶或尿嘧啶二聚體的siRNA，已顯示具有基因特異性的knock-down作用而不導(dǎo)致基因表達(dá)的全局性變化(ElbashirSM，HarborthJ，LendeckelW，YalcinA，WeberK，TuschlT.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001May24；411(6836)494-8.)。另外，含有核內(nèi)小RNA(smallnuclearRNA，snRNA)U6或聚合酶IIIH1-RNA啟動(dòng)子的質(zhì)粒有效地產(chǎn)生這種募集第III類RNA聚合酶III的短RNA，從而能夠組成性地抑制其目標(biāo)mRNA(MiyagishiM，TairaK.U6promoter-drivensiRNAswithfoururidine3′overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatBiotechnol.2002May；20(5)497-500.；BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.ASystemforStableExpressionofShortInterferingRNAsinMammalianCellsScience.296(5567)550-553，April19，2002.)。通過(guò)將細(xì)胞與含有PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的組合物接觸來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步將該細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑接觸。合適的轉(zhuǎn)染試劑是本領(lǐng)域已知的。抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)意味著同沒(méi)有暴露于所述組合物的細(xì)胞相比，細(xì)胞以更低的速率增殖或具有降低的生存力。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，如MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)來(lái)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。所述PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA定向于PCDH1，CDH3或GPR107基因序列的單一靶物?；蛘?，所述siRNA定向于PCDH1，CDH3或GPR107基因序列的多個(gè)靶物。例如，所述組合物含有定向于PCDH1，CDH3或GPR107的2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，或5個(gè)或者更多靶序列的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA。PCDH1，CDH3或GPR107靶序列是指與PCDH1，CDH3或GPR107基因的一部分相同的核苷酸序列。靶序列可包括人PCDH1，CDH3或GPR107基因的5’端非翻譯(UT)區(qū)、開(kāi)放閱讀框(ORF)或者3’端非翻譯區(qū)。或者，所述siRNA是同PCDH1，CDH3或GPR107基因表達(dá)的上游或下游調(diào)節(jié)序列(modulator)互補(bǔ)的核酸序列。上游和下游調(diào)節(jié)序列的例子包括同PCDH1，CDH3或GPR107基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子、同PCDH1，CDH3或GPR107多肽相互作用的激酶或磷酸酶、PCDH1，CDH3或GPR107啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子。同目標(biāo)mRNA雜交的PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA減少或抑制由PCDH1，CDH3或GPR107基因編碼的PCDH1，CDH3或GPR107多肽產(chǎn)物的產(chǎn)生，這是通過(guò)與正常的單鏈mRNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，從而干擾翻譯，并由此干擾所述蛋白的表達(dá)。所以本發(fā)明的siRNA分子可定義為它們?cè)趪?yán)格的條件下，同來(lái)自PCDH1，CDH3或GPR107基因的mRNA或cDNA特異性雜交的能力。對(duì)本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)“雜交”或“特異性雜交”用于指在“嚴(yán)格的雜交條件”下，兩種核酸分子雜交的能力。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格的雜交條件”是指在此條件下，通常是在核酸的復(fù)雜混合物中，核酸分子與其靶序列雜交，而與其它序列不發(fā)生可檢測(cè)的雜交。嚴(yán)格的條件是序列依賴性的，而且在不同的環(huán)境下是不同的。序列越長(zhǎng)，特異性雜交的溫度越高。詳細(xì)的關(guān)于核酸雜交的指導(dǎo)見(jiàn)于Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)。一般而言，在特定的離子強(qiáng)度和pH值條件下，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列的熔點(diǎn)(Tm)低大約5-10℃。所述Tm是指(在特定離子強(qiáng)度、pH值和核酸濃度下)大約50％的與靶物互補(bǔ)的探針同靶序列在平衡狀態(tài)雜交的溫度(由于靶序列過(guò)量存在，在Tm下，平衡時(shí)50％的探針被占據(jù))。嚴(yán)格的條件也可以通過(guò)添加去穩(wěn)定試劑如甲酰胺達(dá)到。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)至少為背景的2倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。下面可為示例性的嚴(yán)格雜交條件50％的甲酰胺，5xSSC和1％SDS，孵育溫度為42℃；或者5x的SSC和1％SDS，孵育溫度為65℃，在0.2x的SSC和0.1％SDS在50℃洗滌。本發(fā)明的siRNA的長(zhǎng)度小于約500個(gè)，約200個(gè)、約100個(gè)、約50個(gè)，或約25個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，該siRNA長(zhǎng)度為約19個(gè)到約25個(gè)核苷酸。示例性的用于生產(chǎn)PCDH1，CDH3或GPR107siRNA的核酸序列分別包含SEQIDNos22，23或24的核苷酸序列作為靶序列。此外，為了增強(qiáng)siRNA的抑制活性，可在靶序列的反義鏈的3’末端添加核苷酸“U”。待添加的“U”的數(shù)目最少為約2個(gè)，一般情況是約2個(gè)到約10個(gè)，優(yōu)選約2個(gè)到約5個(gè)。添加的“U”在該siRNA的反義鏈的3’末端形成單鏈。細(xì)胞是任何表達(dá)或過(guò)表達(dá)PCDH1，CDH3或GPR107的細(xì)胞。該細(xì)胞是上皮細(xì)胞如胰管細(xì)胞?；蛘?，該細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如如癌、腺癌、母細(xì)胞瘤、白血病、骨髓瘤或者肉瘤。所述細(xì)胞是胰管腺癌細(xì)胞。PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA以能同mRNA轉(zhuǎn)錄本相結(jié)合的形式直接導(dǎo)入細(xì)胞?；蛘?，編碼PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的DNA在載體中。載體通過(guò)例如下面的方式來(lái)產(chǎn)生將PCDH1，CDH3或GPR107靶序列克隆到表達(dá)載體中，其可操作地連接于調(diào)控序列，所述調(diào)控序列以使得兩條鏈都(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄)表達(dá)的方式位于該P(yáng)CDH1，CDH3或GPR107序列的側(cè)翼，(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.)。由第一個(gè)啟動(dòng)子(如克隆的DNA的3’啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄與PCDH1，CDH3或GPR107mRNA反義的RNA分子，另外由第二個(gè)啟動(dòng)子(如克隆的DNA的5’啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)錄出PCDH1，CDH3或GPR107mRNA的有義鏈的RNA分子。有義和反義鏈在體內(nèi)雜交以產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體用于使PCDH1，CDH3或GPR107基因沉默。或者，用兩種構(gòu)建體來(lái)產(chǎn)生siRNA構(gòu)建體的有義和反義鏈?？寺〉腜CDH1，CDH3或GPR107也可編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體，其中單個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)具有來(lái)自靶基因的有義序列和互補(bǔ)的反義序列。由任意的核苷酸序列組成的環(huán)序列可以位于有義和反義序列之間以形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明也提供了具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’的siRNA，其中[A]是與同來(lái)自PCDH1，CDH3或GPR107的mRNA或cDNA特異性雜交的序列相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，[A]是與選自SEQIDNos22，23和24的核苷酸的序列相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸序列，且[A’]是由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序列。[A]區(qū)同序列[A’]雜交，然后形成由[B]區(qū)組成的環(huán)。環(huán)序列的長(zhǎng)度優(yōu)選可為約3個(gè)到約23個(gè)核苷酸。例如，環(huán)序列可選自下列序列(http//www.ambion.com/techlib/tb/tb506.html)。此外，由23個(gè)核苷酸組成的環(huán)序列也提供具活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，andStevenson，M.(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature418435-438)。CCC，CCACC或者CCACACCJacque，J.M.，Triques，K.，andStevenson，M(2002)ModulationofHIV-1replicationbyRNAinterference.Nature，Vol.418435-438。UUCGLee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G.，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，andRossi，J.(2002)ExpressionofsmallinterferingRNAstargetedagainstHIV-1revtranscriptsinhumancells.NatureBiotechnology20500-505.Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，andTocchini-Valentini，G.P.(2003)Exonucleolyticdegradationofdouble-strandedRNAbyanactivityinXenopuslaevisgerminalvesicles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4)1639-1644。UUCAAGAGADykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，andSharp，P.A.(2002)KillingthemessengerShortRNAsthatsilencegeneexpression.NatureReviewsMolecularCellBiology4457-467。例如，本發(fā)明優(yōu)選的帶有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNAs如下所示。在下列的結(jié)構(gòu)中，所述環(huán)序列可選自CCC，UUCG，CCACC，CCACACC和UUCAAGAGA。優(yōu)選的環(huán)序列是UUCAAGAGA(DNA序列為ttcaagaga(SEQIDNO35))。GACAUCAAUGACAACACAC-[B]-GUGUGUUGUCAUUGAUGUC(SEQIDNO22的靶序列)GGAGACAGGCUGGUUGUUG-[B]-CAACAACCAGCCUGUCUCC(SEQIDNO23的靶序列)GUGGCUCUACCAGCUCCUG-[B]-CAGGAGCUGGUAGAGCCAC(SEQIDNO24的靶序列)PCDH1，CDH3或GPR107序列側(cè)翼的調(diào)控序列是相同的或者是不同的，使得它們的表達(dá)可以被獨(dú)立地調(diào)節(jié)，或者以時(shí)間的或空間的方式調(diào)節(jié)。通過(guò)將PCDH1，CDH3或GPR107基因模板克隆到載體中，可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出siRNAs，其中所述表達(dá)載體包括，例如，來(lái)自于核內(nèi)小RNA(snRNA)U6或者人H1RNA啟動(dòng)子的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單位。為了將載體引入到細(xì)胞中，可使用轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑(transfectionenhancingagent)。將FuGENE(RocheDiagnostices)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)，和Nucleofector(WakopureChemical)用作轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法，在體外檢測(cè)PCDH1，CDH3或GPR107mRNA中多個(gè)部分的寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷酸在腫瘤細(xì)胞(如使用胰腺細(xì)胞系，例如胰管腺癌(PDACa)細(xì)胞系)中減少PCDH1，CDH3或GPR107的能力。利用PCDH1，CDH3或GPR107的特異性抗體或其它檢測(cè)策略測(cè)定，與沒(méi)有候選siRNA組合物存在下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，與候選siRNA組合物接觸的細(xì)胞中PCDH1，CDH3或GPR107基因產(chǎn)物減少。然后，檢測(cè)在體外的基于細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞的分析中使PCDH1，CDH3或GPR107的產(chǎn)生減少的序列對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。在小鼠或大鼠體內(nèi)檢測(cè)在體外基于細(xì)胞分析中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的序列，以確證在具有惡性新生物的動(dòng)物中PCDH1，CDH3或GPR107產(chǎn)生的減少及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的降低。治療惡性腫瘤的方法患有以過(guò)表達(dá)PCDH1，CDH3或GPR107為特征的腫瘤的患者通過(guò)施用PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA來(lái)治療。在患有或具有發(fā)生例如胰管腺瘤(PDACa)的危險(xiǎn)的患者中，siRNA療法被用來(lái)抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)鑒定這些患者的具體腫瘤類型。胰管腺瘤(PDACa)例如通過(guò)CT，MRI，ERCP，MRCP，計(jì)算機(jī)X線斷層攝影術(shù)(computertomography)或超聲波來(lái)診斷。如果治療在受試者中產(chǎn)生臨床有益效果，例如PCDH1、CDH3或GPR107的表達(dá)減少，或腫瘤的大小、患病率(prevalence)或轉(zhuǎn)移可能性的降低等等，則該治療是有效的。當(dāng)預(yù)防性應(yīng)用治療時(shí)，“有效”是指治療阻礙或防止腫瘤的形成，或者防止或緩解腫瘤的臨床癥狀的癥狀。有效性是結(jié)合任何用于診斷或治療特定的腫瘤種類的已知方法來(lái)確定的。siRNA治療是通過(guò)以編碼本發(fā)明的siRNA的標(biāo)準(zhǔn)載體和/或基因遞送系統(tǒng)，例如通過(guò)遞送合成的siRNA分子對(duì)患者施用siRNA來(lái)進(jìn)行的。通常，合成的siRNA分子被化學(xué)穩(wěn)定化，以防止體內(nèi)核酸酶降解。制備化學(xué)穩(wěn)定化的RNA分子的方法在本領(lǐng)域是已知的。通常，這樣的分子包含修飾的骨架(backbones)和核苷酸以防止核糖核酸酶的作用。其它的修飾也是可能的，如膽固醇結(jié)合的siRNA已顯示了改善的藥學(xué)性質(zhì)(Songetal.NatureMed.9347-351(2003))。合適的基因遞送系統(tǒng)可包括脂質(zhì)體，受體介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)(receptormediateddeliverysystems)，或病毒載體例如皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等等。治療的核酸組合物被配制到可藥用的載體中。治療的組合物也可以包括如上所述的基因遞送系統(tǒng)?？伤幱玫妮d體是適合施用于動(dòng)物的生物相容性賦形劑(vehicle)，例如生理鹽水。化合物的治療有效量是能產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上預(yù)期效果的量，所述醫(yī)學(xué)上預(yù)期效果例如在受治療的動(dòng)物中減少PCDH1，CDH3或GPR107的產(chǎn)生，減少細(xì)胞生長(zhǎng)如增殖，或者減少腫瘤生長(zhǎng)。胃腸外施用，如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)和腹膜內(nèi)遞送途徑，可以用來(lái)遞送PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA組合物，對(duì)于胰腺癌的治療，腹腔動(dòng)脈、脾動(dòng)脈或肝總動(dòng)脈直接注入都是有用的。任一患者的劑量取決于許多因素，包括患者身材的大小(size)、身體的表面積、年齡、所施用的具體核酸、性別、施用的時(shí)間和途徑、一般健康狀況和同時(shí)施用的其它藥物。靜脈內(nèi)施用的核酸的劑量為大約106至1022個(gè)拷貝的所述核酸分子。以標(biāo)準(zhǔn)方法施用多核苷酸，如通過(guò)注射到如肌肉或皮膚組織的間質(zhì)間隙(interstitialspace)中、導(dǎo)入到循環(huán)系統(tǒng)中或體腔中，或者通過(guò)吸入或吹入。多核苷酸也與可藥用的液體載體，例如水性或部分水性的液體載體一起通過(guò)注射或其他途徑遞送給動(dòng)物。多核苷酸同脂質(zhì)體(如陽(yáng)離子或陰離子脂質(zhì)體)相結(jié)合。多聚核酸中包括靶細(xì)胞表達(dá)所需要的遺傳信息，如啟動(dòng)子。除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有同本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員的所通常理解的相同的意義。雖然與本文所描述的方法和材料類似或等價(jià)的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試，但是合適的方法和材料如下所述。這里所提到的出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它的參考文獻(xiàn)全部以其全文并入本文作為參考。在矛盾的情況下，以包括定義的本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)例僅僅是說(shuō)明性的，而不是限制性的。附圖簡(jiǎn)述圖1描述了通過(guò)RT-PCR顯示在PDACa細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)PCDH1(A)和CDH3(B)的確認(rèn)結(jié)果的照片。來(lái)自同一個(gè)體的顯微切割的正常胰管上皮細(xì)胞(正常)和生命器官(肺、心臟、肝、腎和骨髓)的樣品，通過(guò)半定量RT-PCR進(jìn)行對(duì)比。圖2描述了顯示PDACa組織中免疫組織化學(xué)結(jié)果的照片。在胰管腺癌細(xì)胞中觀察到CDH3蛋白過(guò)量表達(dá)，但是正常的胰管中卻沒(méi)有。圖3描述了每個(gè)胰腺癌靶基因在正常成年組織中的表達(dá)譜的Northern印跡分析的照片。(A)PCDH1，(B)CDH3和(C)GPR107。圖4描述了顯示用siRNAknockdownPDACa細(xì)胞PK-45P中內(nèi)源PCDH1的效果的照片。圖4(A)顯示RT-PCR的結(jié)果。該結(jié)果證實(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體410si而不是通過(guò)EGFPsi，確認(rèn)了PCH1mRNA的knockdown作用。410si被特異性地設(shè)計(jì)為用于PCDH1mRNA序列，而EGFP用于EGFPmRNA的序列。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲RNA進(jìn)行分析。用ACTB將輸入的cDNA進(jìn)行歸一化。圖4(B)是顯示集落形成試驗(yàn)的結(jié)果的照片。其顯示用410si轉(zhuǎn)染載體一周后集落的數(shù)目急劇減少，其中410si已通過(guò)RT-PCR證明有效地knockdownPCDH1。圖4(C)是顯示MTT測(cè)定結(jié)果的條形圖。它也顯示了用410si轉(zhuǎn)染的而不是通過(guò)EGFPsi的生長(zhǎng)細(xì)胞的數(shù)目急劇減少。圖5描述了顯示用siRNAknockdownPDACa細(xì)胞KLM-1中內(nèi)源CDH3的效果的照片。圖5(A)顯示RT-PCR的結(jié)果。其通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體si24而不是通過(guò)EGFPsi轉(zhuǎn)染證實(shí)了CDH3mRNA的knockdown作用。si24被特異性地設(shè)計(jì)為用于CDH3mRNA序列，而EGFPsi則用于EGFPmRNA序列。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲RNA進(jìn)行分析。用ACTB將輸入的cDNA進(jìn)行歸一化。圖5(B)是顯示集落形成試驗(yàn)的結(jié)果的照片。其顯示用si24轉(zhuǎn)染一周后細(xì)胞中集落的數(shù)目明顯減少，所述si42載體已通過(guò)RT-PCR證明有效地knockdownCDH3。圖5(C)是顯示MTT測(cè)定結(jié)果的條形圖。它也顯示用si24轉(zhuǎn)染的而不是通過(guò)EGFPsi的生長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)的急劇減少。圖6描述了用siRNAknockdownPDACa細(xì)胞KLM-1中內(nèi)源GPR-107的效果的照片。圖6(A)顯示RT-PCR的結(jié)果。該結(jié)果通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體1003si而不是通過(guò)EGFPsi，證實(shí)了GPR-107mRNA的knockdown作用。1003si特異性地設(shè)計(jì)為用于GPR-107mRNA序列，而EGFPsi則用于EGFPmRNA序列。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲RNA進(jìn)行分析。用ACTB將輸入的cDNA進(jìn)行歸一化。圖6(B)是顯示集落形成試驗(yàn)的結(jié)果的照片。其顯示用1003si轉(zhuǎn)染一周后細(xì)胞中集落的數(shù)目減少，所述1003si已通過(guò)RT-PCR證明有效地knockdownGPR-107。圖6(C)是顯示MTT測(cè)定結(jié)果的條形圖。它也顯示用1003si轉(zhuǎn)染的而不通過(guò)EGFPsi的生長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)減少。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中做進(jìn)一步的描述，其并沒(méi)有限制如權(quán)利要求中所述的本發(fā)明的范圍。[實(shí)施例1]通用方法細(xì)胞系和組織樣品人胰腺細(xì)胞系PK45P，KLM1和MIA-PaCa2(ATCC編號(hào)CRL-1420)得自日本東北大學(xué)發(fā)育、衰老和癌癥研究所生物醫(yī)學(xué)研究細(xì)胞資源中心(CellResourceCenterforBiomedicalResearch，InstituteofDevelopment，AgingandCancer，TohokuUniversity)。所有的細(xì)胞都是公眾可獲得的。利用cDNA微陣列分離PDACa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的基因cDNA微陣列玻片的制作方法已經(jīng)有描述(OnoK，TanakaT，TsunodaT，KitaharaO，KiharaC，OkamotoA，OchiaiK，TakagiT，andNakamuraY.CancerRes.，605007-5011，2000)。對(duì)每個(gè)表達(dá)譜分析，都制備雙份的包含大約23040個(gè)DNA點(diǎn)的cDNA微陣列片，以減少實(shí)驗(yàn)波動(dòng)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，從18個(gè)胰腺癌組織顯微切割的PDACa細(xì)胞和正常胰管上皮中純化出總RNA。進(jìn)行基于T7的RNA擴(kuò)增，以獲得足夠用于微陣列實(shí)驗(yàn)的RNA。通過(guò)分別使用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(AmershamBiosciences)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，對(duì)來(lái)自PDACa細(xì)胞和正常胰管上皮的擴(kuò)增RNA的等分試樣進(jìn)行標(biāo)記。雜交、洗滌和檢測(cè)如前面描述進(jìn)行(OnoK，TanakaT，TsunodaT，KitaharaO，KiharaC，OkamotoA，OchiaiK，TakagiT，andNakamuraY.CancerRes.，605007-5011，2000)。接著，在上調(diào)的基因中，關(guān)注PCDH1，CDH3和GPR107這三個(gè)基因，因?yàn)樗鼈冊(cè)诔^(guò)50％的已知癌癥中的表達(dá)率超過(guò)5.0，而根據(jù)我們以前對(duì)29種正常人組織中基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，它們?cè)谡５闹饕鞴僦械谋磉_(dá)水平相對(duì)比較低(Saito-HisaminatoA，KatagiriT，KakiuchiS，NakamuraT，TsunodaT，NakamuraY.Genome-wideprofilingofgeneexpressionin29normalhumantissueswithacDNAmicroarray.DNARes.，935-45，2002)。PCDH1和CDH3的半定量RT-PCR將來(lái)自顯微切割的PDACa細(xì)胞和正常胰管上皮細(xì)胞的RNA通過(guò)基于T7的體外轉(zhuǎn)錄(EpicentreTechnologies)經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增，并合成為單鏈cDNA。制備每個(gè)單鏈cDNA的合適的稀釋物用于隨后的PCR擴(kuò)增，其通過(guò)監(jiān)控β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)作為定量對(duì)照。本發(fā)明人采用的引物序列為對(duì)于PCDH1為5’-AGAAGGAGACCAAGGACCTGTAT-3’(SEQ.ID.NO.7)和5’-AGAACTTTATTGTCAGGGTCAAGG-3’(SEQ.ID.NO.8)對(duì)于CDH3為5’-CTGAAGGCGGCTAACACAGAC-3’(SEQ.ID.NO.9)和5’-TACACGATTGTCCTCACCCTTC-3’(SEQ.ID.NO.10)對(duì)于ACTB為5’-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ.ID.NO.11)和5’-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ.ID.NO.12)所有的反應(yīng)包括在GeneAmpPCR系統(tǒng)9700(PEAppliedBiosystems)上在94℃起始變性2分鐘；然后進(jìn)行21個(gè)(對(duì)ACTB)或28-32個(gè)(對(duì)PCDH1和CDH3)94℃30秒，58℃30秒，和72℃1分鐘的循環(huán)。免疫組織化學(xué)將經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋的PDACa切片，用小鼠抗-CDH3單克隆抗體(BDTransductionLaboratories)進(jìn)行免疫染色用于CDH3表達(dá)。將脫掉石蠟的組織切片置于pH6.0的10mM檸檬酸鹽緩沖液中，并在高壓滅菌器中加熱至108℃15分鐘用于抗原挽救(antigenretrieval)。將切片分別用稀釋度為1∶10或1∶100的CDH3的第一抗體在濕度箱中在室溫下溫育一小時(shí)，并用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡聚糖聚合物然后用二氨基聯(lián)苯胺(DAKOEnvisionPlusSystem；DAKOCorporation，Carpinteria，CA)來(lái)顯色。最后用蘇木精對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染。對(duì)于陰性對(duì)照的樣品，省略了第一抗體。Northern印跡分析將人的多組織Northern印跡(Clontech)與[α-32P]dCTP標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，所述PCR產(chǎn)物是通過(guò)上面描述的引物擴(kuò)增的。按照供應(yīng)商推薦的方法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和洗滌。印跡在-80℃下用增感屏放射自顯影5天。psiU6BX質(zhì)粒的構(gòu)建將編碼siRNA的DNA序列插入如下面的質(zhì)粒序列(SEQIDNo26)中(-)表示的核苷酸485-490的缺口中。據(jù)報(bào)道snRNAU6基因由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶III產(chǎn)生在3’末端具有尿苷的短轉(zhuǎn)錄本。使用人胎盤(pán)DNA作為模板，及引物組5’-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3’(SEQIDNo27)和5’-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’(SEQIDNo28)，通過(guò)PCR擴(kuò)增包含啟動(dòng)子區(qū)的snRNAU6基因的基因組片段。純化該產(chǎn)物并使用TA克隆試劑盒按照供應(yīng)商(Invitrogen)的規(guī)程克隆到pCR質(zhì)粒載體中。將含有snRNAU6基因的BamHI和XhoI片段純化并克隆到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的核苷酸1257-56片段，該片段是用引物組5’-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQIDNo29)和5’-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQIDNo30)通過(guò)PCR擴(kuò)增的。將連接的DNA用作PCR的模板，其引物為5’-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3’(SEQIDNo31)和5’-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’(SEQIDNo32)。將該產(chǎn)物用HindIII消化，其隨后自連接以產(chǎn)生psiU6BX載體質(zhì)粒。作為對(duì)照，通過(guò)將雙鏈寡核苷酸5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo33)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNo34)克隆到載體psiU6BX中的BbsI位點(diǎn)而制備psiU6BX-EGFP。表達(dá)siRNA的構(gòu)建體siRNA的核苷酸序列是使用可從Ambion網(wǎng)站(http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)得到的siRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行設(shè)計(jì)的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用于siRNA合成的核苷酸序列使用下面的規(guī)程來(lái)選擇。siRNA目標(biāo)位點(diǎn)的選擇1.從每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本的起始密碼子AUG開(kāi)始，向下游搜索AA二核苷酸序列。將每一處AA和3’端相鄰的19個(gè)核苷酸的出現(xiàn)記錄為可能的siRNA目標(biāo)位點(diǎn)。Tuschl等不推薦在5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)和起始密碼子附近區(qū)域(75個(gè)堿基以內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)檫@些區(qū)域可能更富含調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物會(huì)干擾siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將可能的目標(biāo)位點(diǎn)同適當(dāng)?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)(人類、小鼠、大鼠等等)進(jìn)行對(duì)比，以淘汰掉與其他編碼序列具有顯著的同源性的靶序列。3.選擇合格的靶序列用于合成。沿著基因的長(zhǎng)度選擇幾個(gè)靶序列用于評(píng)價(jià)。下面顯示用于基因PCDH1，CDH3或GPR107的siRNA的寡核苷酸。每個(gè)寡核苷酸是靶序列的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列的組合。發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列和靶序列分別顯示在SEQIDNO19到SEQIDNO21和SEQIDNO22到SEQIDNO24(從每一個(gè)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)序列中去除了核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn))。用于PCDH1的siRNA表達(dá)載體的插入序列410si5’-CACCGACATCAATGACAACACACTTCAAGAGAGTGTGTTGTCATTGATGTC-3’(SEQIDNO13)和5’-AAAAGACATCAATGACAACACACTCTCTTGAAGTGTGTTGTCATTGATGTC-3’(SEQIDNO14)用于CDH3的siRNA表達(dá)載體的插入序列si245’-CACCGGAGACAGGCTGGTTGTTGTTCAAGAGACAACAACCAGCCTGTCTCC-3’(SEQIDNO15)和5’-AAAAGGAGACAGGCTGGTTGTTGTCTCTTGAACAACAACCAGCCTGTCTCC-3’(SEQIDNO16)用于GPR107的siRNA表達(dá)載體的插入序列1003si5’-CACCGTGGCTCTACCAGCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGCTGGTAGAGCCAC-3’(SEQIDNO17)和5’-AAAAGTGGCTCTACCAGCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGCTGGTAGAGCCAC-3’(SEQIDNO18)作為對(duì)照的siRNA表達(dá)載體的插入序列EGFPsi(對(duì)照)5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO33)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQIDNO34)每個(gè)序列的序列號(hào)(SEQIDNO)在表1中列出集落形成/MTT測(cè)定將PK45P，KLM1和MIA-PaCa2之中的人PDACa細(xì)胞系鋪到直徑10-cm的盤(pán)中(5X105個(gè)細(xì)胞/盤(pán))，并根據(jù)制造商的說(shuō)明使用Lipofectamine2000(Invitrogen)或FuGENE6(Roche)以包含EGFP靶序列(EGFP)的psiU6BX和包含靶序列的psiU6BX進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)500mg/ml的遺傳霉素(Geneticin)篩選細(xì)胞一周。最初的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收獲，并通過(guò)RT-PCR分析以證實(shí)對(duì)于PCDH1，CDH3和GPR107的knockdown。RT-PCR的引物與上面的相同。這些細(xì)胞也可用吉姆薩液(Giemsasolution)染色并進(jìn)行MTT分析，從而分別評(píng)價(jià)集落的形成和細(xì)胞數(shù)。[實(shí)施例2]用siRNA方法減少基因PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)和癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制在先前的研究中，通過(guò)結(jié)合激光顯微切割和點(diǎn)樣了27000個(gè)基因的全基因組cDNA微陣列，建立了PDACa精確的表達(dá)譜。本發(fā)明者通過(guò)與正常的胰管上皮(其被認(rèn)為是PDACa的來(lái)源)的表達(dá)譜比較，在PDACa細(xì)胞中鑒定了超過(guò)200個(gè)基因作為上調(diào)的基因(NakamuraT，F(xiàn)urukawaY，NakagawaH，TsunodaT，OhigashiH，MurataK，IshikawaO，Ohgaki，KashimuraN，MiyamotoM，HiranoS，KondoS，KatohH，NakamuraY，andKatagiriT.Genome-widecDNAmicroarrayanalysisofgene-expressionprofilesinpancreaticcancersusingpopulationsoftumorcellsandnormalductalepitheliumcellsselectedforpuritybylasermicrodissection.Oncogene，2004Feb9，正式印刷前的電子發(fā)布稿(Epub))。根據(jù)這些PDACa細(xì)胞的表達(dá)譜，本發(fā)明人選擇了三個(gè)過(guò)量表達(dá)的基因，使用來(lái)自顯微切割的PDACa細(xì)胞的cDNA通過(guò)RT-PCR(圖1A，B)或通過(guò)免疫組織化學(xué)(圖2)，確證了PCDH1和CDH3在PDACa中的過(guò)量表達(dá)。(1)PCDH1(原鈣黏著蛋白，Protocadherin1)(Genbank登錄號(hào)NM_002587；SEQIDNo.1，2)為了研究PCDH1對(duì)PDACa細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的影響，本發(fā)明人通過(guò)基于哺乳動(dòng)物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)特異性地knockdownPCDH1在PDACa細(xì)胞系中的內(nèi)源表達(dá)。如Northern印跡分析(圖3A)所示，PCDH1在正常的心臟、胎盤(pán)和前列腺中不受限制地表達(dá)。它在主要的生命器官中豐度不高，這說(shuō)明靶向這些分子將預(yù)期在人體內(nèi)產(chǎn)生較低的毒性。轉(zhuǎn)染產(chǎn)生siRNA的載體很清楚地導(dǎo)致一種設(shè)計(jì)用于PCDH1的siRNA，410si的內(nèi)源性表達(dá)的減少(圖4A)。該siRNA對(duì)于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成測(cè)定(圖4B)和MTT測(cè)定(圖4C)中導(dǎo)致了急劇的生長(zhǎng)抑制。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地暗示PCDH1在PDACa細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)與癌細(xì)胞生存力相關(guān)。PCDH1和其它原鈣黏著蛋白被支持在細(xì)胞表面上通過(guò)它們的鈣黏著蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)生嗜同種受體相互作用(homophilicinteraction)，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架構(gòu)象、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)或細(xì)胞生長(zhǎng)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(SanoK，TaniharaH，HeimarkRL，ObataS，DavidsonM，StJohnT，TaketaniS，SuzukiS.Protocadherinsalargefamilyofcadherin-relatedmoleculesincentralnervoussystem.EMBOJ.，122249-56，1993，F(xiàn)rankM，andKemlerR.Protocadherins.CurrOpinCellBiol.，14557-62，2002.)。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，PCDH1可能通過(guò)其在細(xì)胞-細(xì)胞粘附中的嗜同種受體相互作用調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的正信號(hào)。(2)CDH3(P-鈣黏著蛋白，P-cadherin)(Genbank登錄號(hào)NM001793；SEQIDNo.3，4)本發(fā)明人通過(guò)RT-PCR(圖1B)和免疫組織化學(xué)(圖2)確證CDH3在PDACa細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)。并根據(jù)微陣列數(shù)據(jù)和RT-PCR(圖1B)，在我們的PDACa表達(dá)譜中超過(guò)200個(gè)上調(diào)的基因中CDH3過(guò)量表達(dá)是最顯著的譜之一。如Northern印跡分析(圖3B)所示CDH3在正常的胸腺、前列腺、卵巢和氣管中不受限制地表達(dá)。它在主要生命器官中豐度不高，這說(shuō)明靶向這些分子將預(yù)期在人體內(nèi)產(chǎn)生較低的毒性。為了探討CDH3對(duì)PDACa細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的影響，本發(fā)明人通過(guò)基于哺乳動(dòng)物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)特異性地knockdownCDH3在PDACa細(xì)胞系中的內(nèi)源表達(dá)。轉(zhuǎn)染產(chǎn)生siRNA的載體清楚地導(dǎo)致一種設(shè)計(jì)用于CDH3的siRNA，si24的內(nèi)源性表達(dá)(圖5A)。該siRNA對(duì)于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成測(cè)定(圖5B)和MTT測(cè)定(圖5C)中導(dǎo)致了急劇的生長(zhǎng)抑制。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地暗示了CDH3在PDACa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)與癌細(xì)胞生存力以及細(xì)胞間相互作用相關(guān)，而且這個(gè)分子可涉及來(lái)自細(xì)胞間相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PDACa有極強(qiáng)的侵略性，而且CDH3在PDACa細(xì)胞中的高表達(dá)也可與它們的侵略性和轉(zhuǎn)移潛力有關(guān)。(3)GPR107(G蛋白偶聯(lián)受體107)(Genbank登錄號(hào)AB046844；SEQIDNo.5，6)本發(fā)明人確定此孤兒(orphan)GPCR作為胰腺癌的靶物，但其功能和配體未知。如Northern印跡分析(圖3C)所示，GPR107在正常的心臟、胎盤(pán)、骨骼肌、睪丸、卵巢和脊髓中不受限制地表達(dá)。為了研究GPR107對(duì)于PDACa細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的影響，本發(fā)明人通過(guò)siRNA特異性地knockdown其GPR107在PDACa細(xì)胞系中的內(nèi)源表達(dá)。轉(zhuǎn)染產(chǎn)生siRNA的載體清楚地導(dǎo)致一種設(shè)計(jì)用于GPR107的siRNA，1003si的內(nèi)源性表達(dá)的減少(圖6A)。該siRNA對(duì)于PCDH1mRNA的knockdown作用在集落形成測(cè)定(圖6B)和MTT測(cè)定(圖6C)中導(dǎo)致了急劇的生長(zhǎng)抑制。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地暗示了GPR107在PDACa細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)與癌細(xì)胞生存力相關(guān)?？傊?，本發(fā)明人鑒定了三種在PDACa細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的膜型分子，而且這三個(gè)分子都可能與癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)，這說(shuō)明這些膜型分子是治療致死性的胰腺癌的理想的分子靶物。工業(yè)適用性本發(fā)明人已顯示了特異性靶向PCDH1，CDH3或GPR107基因的小干擾RNA(siRNA)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，這種新的siRNA是用于開(kāi)發(fā)抗癌藥物的有用的靶物。例如，阻礙PCDH1，CDH3或GPR107表達(dá)或者防止它們活性的試劑可以用作抗癌劑，特別是用于治療胰腺癌，例如胰管腺癌(PDACa)的抗癌劑。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變動(dòng)和修改。序列表<110>腫瘤療法科學(xué)股份有限公司(OncotherapyScience，Inc.)<120>治療胰腺癌的組合物和方法<130>ONC-A0406P<150>US60/555,809<151>2004-03-24<160>35<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3851<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(118)..(3300)<223><400>1cgcaaagccgccgggctgctgcgcccagagccagccggagccggagccggagcccgaact60gcagctccagccccagccgtgcggagccgcagcccaggccggggccggcggcggctc117atggacagcggggcgggcggccggcgctgcccggaggcggccctcctg165MetAspSerGlyAlaGlyGlyArgArgCysProGluAlaAlaLeuLeu151015attctggggcctcccaggatggagcacctgaggcacagcccaggccct213IlcLeuGlyProProArgMetGluHisLeuArgHisSerProGlyPro202530ggggggcaacggctactgctgccctccatgctgctagcactgctgctc261GlyGlyGlnArgLeuLeuLeuProSerMetLeuLeuAlaLeuLeuLeu354045ctgctggctccatccccaggccacgccactcgggtagtgtacaaggtg309LeuLeuAlaProSerProGlyHisAlaThrArgValValTyrLysVal505560ccggaggaacagccacccaacaccctcattgggagcctcgcagccgac357ProGluGluGlnProProAsnThrLeuIleGlySerLeuAlaAlaAsp65707580tatggttttccagatgtggggcacctgtacaagctagaggtgggtgcc405TyrGlyPheProAspValGlyHisLeuTyrLysLeuGluValGlyAla859095ccgtaccttcgcgtggatggcaagacaggtgacattttcaccaccgag453ProTyrLeuArgValAspGlyLysThrGlyAspIlePheThrThrGlu100105110acctccatcgaccgtgaggggctccgtgaatgccagaaccagctccct501ThrSerIleAspArgGluGlyLeuArgGluCysGlnAsnGlnLeuPro115120125ggtgatccctgcatcctggagtttgaggtatctatcacagacctcgtg549GlyAspProCysIleLeuGluPheGluValSerIleThrAspLeuVal130135140cagaatggcagcccccggctgctagagggccagatagaagtacaagac597GlnAsnGlySerProArgLeuLeuGluGlyGlnIleGluValGlnAsp145150155160atcaatgacaacacacccaacttcgcctcaccagtcatcactctggcc645IleAsnAspAsnThrProAsnPheAlaSerProValIleThrLeuAla165170175atccctgagaacaccaacatcggctcactcttccccatcccgctggct693IleProGluAsnThrAsnIleGlySerLeuPheProIleProLeuAla180185190tcagaccgtgatgctggtcccaacggtgtggcatcctatgagctgcag741SerAspArgAspAlaGlyProAsnGlyValAlaSerTyrGluLeuGln195200205gctgggcctgaggcccaggagctatttgggctgcaggtggcagaggac789AlaGlyProGluAlaGlnGluLeuPheGlyLeuGlnValAlaGluAsp210215220caggaggagaagcaaccacagctcattgtgatgggcaacctggaccgt837GlnGluGluLysGlnProGlnLeuIleValMetGlyAsnLeuAspArg225230235240gagcgctgggactcctatgacctcaccatcaaggtgcaggatggcggc885GluArgTrpAspSerTyrAspLeuThrIleLysValGlnAspGlyGly245250255agccccccacgcgccagcagtgccctgctgcgtgtcaccgtgcttgac933SerProProArgAlaSerSerAlaLeuLeuArgValThrValLeuAsp260265270accaatgacaacgcccccaagtttgagcggccctcctatgaggccgaa981ThrAsnAspAsnAlaProLysPheGluArgProSerTyrGluA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gaccaccaagc1980gaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatga2040tctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcg2100catgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcat2160ggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccg2220ctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggc2280tgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttcta2340tcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcg2400acgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggc2460ttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctg2520gagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaat2580agcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtcc2640aaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcg2700taatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaac2760atacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcaca2820ttaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcat2880taatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcc2940tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactca3000aaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagca3060aaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccatagg3120ctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccg3180acaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt3240ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctt3300tctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggc3360tgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtctt3420gagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggatt3480agcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggc3540tacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaa3600agagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtttttttgtttgc3660aagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacg3720gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatca3780aaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagt3840atatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctca3900gcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacg3960atacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctca4020ccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggt4080cctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagt4140agttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtca4200cgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttaca4260tgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcaga4320agtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttact4380gtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctga4440gaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcg4500ccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactc4560tcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactga4620tcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaat4680gccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttccttttt4740caatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgt4800atttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgac4860gtc4863<210>27<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>27ggggatcagcgtttgagtaa20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>28taggccccacctccttctat20<210>29<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>29tgcggatccagagcagattgtactgagagt30<210>30<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>30ctctatctcgagtgaggcggaaagaacca29<210>31<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>31tttaagcttgaagactatttttacatcaggttgtttttct40<210>32<211>37<212>DNA<213>人工的<220><223>人工合成的引物序列<400>32tttaagcttgaagacacggtgtttcgtcctttccaca37<210>33<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成序列<400>33caccgaagcagcacgacttcttcttcaagagagaagaagtcgtgctgcttc51<210>34<211>51<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成序列<400>34aaaagaagcagcacgacttcttctctcttgaagaagaagtcgtgctgcttc51<210>35<211>9<212>DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成間隔區(qū)序列<400>35ttcaagaga9權(quán)利要求1.在受試者中治療或預(yù)防胰腺癌的方法，包括對(duì)所述受試者施用組合物，該組合物包含抑制PCDH1，CDH3或GPR107表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述siRNA包括有義核酸序列和反義核酸序列，其特異地同來(lái)自PCDH1，CDH3或GPR107的序列雜交。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述胰腺癌是胰管腺癌(PDACa)。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述siRNA包含與選自SEQIDNOs22，23和24的序列相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列作為靶序列。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是與選自SEQIDNOs22，23和24的核苷酸的序列相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸環(huán)序列，[A’]是由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序列。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包括轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。7.雙鏈分子，包括有義鏈和反義鏈，其中所述有義鏈包含與選自SEQIDNOs22，23和24的靶序列相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列，且其中所述反義鏈包含與所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈與所述反義鏈相互雜交以形成所述雙鏈分子，且其中所述雙鏈分子當(dāng)被導(dǎo)入表達(dá)PCDH1，CDH3或GPR107基因的細(xì)胞時(shí)，抑制所述基因的表達(dá)。8.權(quán)利要求7的雙鏈分子，其中所述靶序列包含來(lái)自選自SEQIDNos1，3和5的核苷酸序列的至少約10個(gè)毗連的核苷酸。9.權(quán)利要求8的雙鏈分子，其中所述靶序列包含來(lái)自選自SEQIDNos1，3和5的核苷酸序列的約19個(gè)到約25個(gè)毗連的核苷酸。10.權(quán)利要求9的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是單個(gè)核糖核苷酸轉(zhuǎn)錄本，其包括通過(guò)單鏈核糖核苷酸序列連接的所述有義鏈和反義鏈。11.權(quán)利要求8的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長(zhǎng)度小于約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸。12.權(quán)利要求11的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長(zhǎng)度小于約75個(gè)核苷酸的寡核苷酸。13.權(quán)利要求12的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長(zhǎng)度小于約50個(gè)核苷酸的寡核苷酸。14.權(quán)利要求13的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是長(zhǎng)度小于約25個(gè)核苷酸的寡核苷酸。15.權(quán)利要求14的雙鏈多核苷酸，其中所述雙鏈分子是長(zhǎng)度為約19到約25個(gè)核苷酸的寡核苷酸。16.編碼權(quán)利要求8的雙鏈分子的載體。17.權(quán)利要求16的載體，其中所述載體編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本，且包含所述有義鏈和反義鏈。18.權(quán)利要求17的載體，其中所述轉(zhuǎn)錄本還包含連接所述有義鏈和反義鏈的單鏈核糖核苷酸序列。19.載體，其包含多核苷酸，該多核苷酸包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合，其中所述有義鏈核酸包含SEQIDNOs22，23和24的核苷酸序列，而所述反義鏈核酸由與該有義鏈互補(bǔ)的序列組成。20.權(quán)利要求19的載體，其中所述多核苷酸有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是SEQIDNOs22，23和24的核苷酸序列，[B]是由3-23個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列，[A’]是同[A]互補(bǔ)的核苷酸序列。21.用于治療或預(yù)防胰腺癌的藥物組合物，包括作為活性成分的藥學(xué)有效量的小干擾RNA(siRNA)和可藥用的載體，其中siRNA抑制PCDH1，CDH3或GPR107的表達(dá)。22.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所述siRNA包含選自SEQIDNOs22，23和24的核苷酸序列作為靶序列。23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述siRNA有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是同SEQIDNOs22，23和24的核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的核糖核苷酸序列，[B]是由3-23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸序列，[A’]是同[A]互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明重點(diǎn)描述了通過(guò)將細(xì)胞與抑制PCDH1，CDH3或GPR107表達(dá)的siRNA的組合物接觸來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還包括治療癌癥的方法。本發(fā)明還重點(diǎn)描述了在所提供的方法中有用的產(chǎn)品，其包括核酸序列，載體和包含它們的組合物。本發(fā)明還提供抑制腫瘤細(xì)胞，例如胰腺癌細(xì)胞，尤其是胰管腺癌(PDACa)的方法。文檔編號(hào)A61K31/7088GK1977044SQ20058001667公開(kāi)日2007年6月6日申請(qǐng)日期2005年3月18日優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日發(fā)明者中村佑輔,中川英刀申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司