專利名稱：Regⅲ蛋白的抑制劑作為哮喘的治療劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的一個目的是提供篩選用于治療哮喘的試劑的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供治療哮喘的方法。本發(fā)明的這些和其它目的和優(yōu)點從下文的描述中將會顯而易見。
背景技術：
本發(fā)明一般涉及哮喘的治療。具體地，本發(fā)明涉及篩選用于治療哮喘的試劑的方法和治療哮喘的方法。哮喘是一種以可逆性氣道阻塞和氣道高反應性(AHR)的重復發(fā)作為特征的氣道慢性炎性疾病。其典型的臨床表現(xiàn)包括，呼吸短促、喘鳴、咳嗽和胸部緊迫感，其可以變成威脅生命或致命的疾病。當現(xiàn)在的治療都關注于降低癥狀性支氣管痙攣和肺部炎癥時，人們越來越注意到長期的氣道改變在患哮喘的患者的加速的肺部惡化中發(fā)揮作用。氣道改變涉及很多的病理特征，包括上皮平滑肌和成肌纖維細胞增生和/或組織轉化，上皮下的纖維化和基質沉積。這些過程共同導致在致命性哮喘中氣道高達約300％的肥厚。盡管對于闡述哮喘的病理生理學已經(jīng)有了重大的進步，但在過去的20年間，該疾病的流行、發(fā)病率、和死亡率卻一直在上升。2000年單是在美國，直接由哮喘就導致了近180萬人到急診室就診，465,000人住院治療并有4,487人死亡。每年與哮喘有關的醫(yī)療保健費用估計達140億美元。一般公認，變應性哮喘是由對空氣變應原的不當炎性反應引發(fā)的。哮喘者的肺表現(xiàn)出了淋巴細胞、肥大細胞，尤其是嗜酸性細胞的強烈滲透。大量的證據(jù)表明，該免疫應答是由表達TH2細胞因子分布的CD4+T-細胞驅動的。哮喘的一個鼠類模型包括，使動物對卵白蛋白(OVA)致敏，然后在氣管內(nèi)傳輸OVA激發(fā)。該方法在小鼠肺中產(chǎn)生了TH2免疫應答，并模擬在人哮喘中可見的4種主要的病理生理學應答，包括血清IgE(特應性)向上調(diào)節(jié)，嗜酸性粒細胞增多、粘液過度分泌、和AHR。由嗜堿粒細胞、肥大細胞表達，由T細胞和NK細胞激活的細胞因子IL-l 3在小鼠肺對OVA的免疫應答中發(fā)揮了重要的作用。鼠IL-l 3的直接肺部滴入引發(fā)了全部4種與哮喘相關的病理，相反地，可溶性IL-l 3拮抗劑(sIL-l 3Rα2-Fc)的存在會完全阻斷OVA-激發(fā)誘導的杯狀細胞粘液合成和AHR轉變成乙酰膽堿。Wills-Karp，M.，等人，″Interleukin-13central mediator of allergic asthma，″Science282(5397)(1998)；Grunig，G.，等人，″Requirement for IL-l 3independently of IL-4 in experimental asthma，″Science 282(5397)2261-2263(1998)。因此，IL-l 3介導的信號足以引發(fā)全部4種與哮喘有關的病理生理學表型，這正是小鼠模型中粘液分泌過多和誘導AHR所需要的。生物學激活的IL-l 3特異性地與低親和力結合鏈IL-l 3Rα1和高親和力的多聚體復合物結合，其中所述多聚體復合物包含IL-l3Rα1和IL-4R，IL-4R是IL-4信號復合物的共有組分。Wills-Karp，M.，″IL-12/IL-l 3 axis in allergic asthma，″J Allergy Clin Immunol 107(1)9-18(2001)。IL-l 3途徑級聯(lián)的激活引起轉錄激活因子Stat6補充、磷酸化及最終的核轉位。大量的生理學研究表明，肺的OVA-激發(fā)不會在與Stat6-/-無效等位基因同型結合的小鼠中引起主要的病理學相關表型，包括嗜酸性粒細胞滲透、粘液分泌過多和氣道高反應性。Kuperman，D.，等人，″Signal transducer and activator of transcription factor 6(Stat6)-deficient mice are protected from antigen-induced airwayhyperresponsiveness and mucus production，″J Exp Med 187(6)939-48(1998)。近來的遺傳學研究表明，在IL-l 3的特異性人等位基因和其哮喘和特應性信號組分之間的結合，在人疾病的此種途徑中顯示了關鍵性的作用。Shirakawa等人，″Atopy and asthmagenetic variants ofIL-4 and IL-l 3 signaling，″Immunol.Today 21(2)60-64(2000)。IL-l 3也與其它的受體鏈IL-l 3Rα2結合，后者在人和小鼠中表達，其生物學功能迄今尚未確定。鼠IL-l 3Rα2以相對于IL-l 3Rα1約100倍的更大親和力(Kd為0.5到1.2nM)與IL-l 3結合，其允許構成有效的可溶性IL-l 3拮抗劑sIL-l 3Rα2-Fc。sIL-l 3Rα2-Fc作為拮抗劑已經(jīng)用于多種疾病模型，以在血吸蟲誘導的肝纖維化和肉芽腫形成，腫瘤免疫監(jiān)督、以及OVA-激發(fā)的哮喘模型中證明IL-l 3的作用。Wills-Karp，M.，等人，″Interleukin-13central mediator of allergicasthma，″Science 282(5397)2258-2261(1998)；Grunig，G.，等人，″Requirement for IL-l 3 independently of IL-4 in experimental asthma，″Science 282(5397)2261-2263(1998)。RegIII蛋白是Reg基因家族的一個子類，該基因家族是一個多基因家族，還包括作為β細胞生長因子的RegI和RegII。Okamoto，H.，J.Hepatobiliary Pancreat.Surg.6254-262(1999)。在人中，RegIII家族包括HIP-一種在肝細胞癌、腸、和胰腺、和胰腺炎相關蛋白(PAP)中表達的基因。出處同前。
其他在人中發(fā)現(xiàn)的REG家族基因是RegIα、RegIβ和Reg相關序列。出處同前。小鼠REG基因包括RegI、RegII、RegIIIα、RegIIIβ、RegIIIγ、和RegIIIδ。出處同前。在大鼠、牛和倉鼠中也觀測到了Reg基因。根據(jù)其他Reg家族成員細胞的促有絲分裂活性和家族成員之間的同源性，人們相信，Reg蛋白是生長因子。出處同上。由于RegIII子類成員間序列同源性的程度，本發(fā)明者相信，這些基因和蛋白在生理結構和功能上是相關的。當前治療支氣管痙攣和氣道炎癥的哮喘療法包括，使用支氣管擴張劑、皮質類固醇、和白細胞三烯抑制劑。在使用了一段時間后，很多這樣的治療會包括不希望的副作用并喪失有效性。此外，在治療性介入中使用的僅有有限的藥物可以有效地減少在哮喘中發(fā)生的氣道改變過程。因此，仍然存在增加對哮喘的分子理解，相應地識別出對該復雜疾病的新治療策略的需要。本發(fā)明正是滿足了這種需要。
發(fā)明簡述我們發(fā)現(xiàn)，與對照的非哮喘動物相比，在哮喘的動物模型中RegIII蛋白的信使RNA(mRNA)在統(tǒng)計學上顯著地增加。具體地，我們發(fā)現(xiàn)，通過氣管內(nèi)的卵白蛋白激發(fā)或直接在肺部滴注IL-l 3會使編碼RegIII的mRNA增加，因此發(fā)現(xiàn)其可以作為哮喘治療的靶點。因此，在本發(fā)明的一個方面，提供篩選用于治療哮喘的試劑的方法。同時也提供治療哮喘的方法。在本發(fā)明的一個方面，一種篩選用于治療哮喘的試劑的方法，包括(a)將RegIII蛋白與受試試劑接觸；和(b)確定受試試劑是否抑制RegIII蛋白的活性，其中減除RegIII蛋白活性的受試試劑對治療哮喘是有用的。在一些方面，如果它抑制RegIII蛋白的活性，該方法還包括將該受試試劑歸類為治療哮喘的試劑的步驟。在另一方面，本發(fā)明提供一種篩選用于治療哮喘的試劑的方法，包括(a)將編碼與RegIII蛋白啟動子可操作地連接的報道基因產(chǎn)物的核苷酸序列與受試試劑接觸；和(b)確定該試劑是否抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中抑制報道基因產(chǎn)物產(chǎn)生的受試試劑在治療哮喘中是有用的。在一些方面，如果它抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，本發(fā)明還包括將該受試試劑歸類為治療哮喘的試劑的步驟。在本發(fā)明的另一個方面，提供治療哮喘的方法。在一個實施方案中，該方法包括，給需要治療的哺乳動物施用治療量的降低RegIII蛋白活性的試劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該方法包括，給需要治療的哺乳動物施用治療量的減少RegIII蛋白生成的試劑。
附圖簡述附

圖1是人胰腺炎相關蛋白(PAP)的mRNA序列的代表，其是如Dusetti，N.J.，等人，Genomics19(1)108-114(1994)報道的RegIII家族的一個成員(SEQ ID NO1)。殘基33-557代表編碼序列(Genbank登錄號NP_002571)。附圖2是翻譯的人PAP的氨基酸序列的代表(SEQ ID NO2)，如Dusetti等人，同上所報道(Genbank登錄號NM_002580)。附圖3是鼠(Mus musculus)RegIIIγ蛋白的mRNA序列的代表(SEQ ID NO3)，如Narushima Y.，等人，Gene185(2)159-68(Feb.7，1997)報道，其中，殘基33到557代表編碼序列(Genbank登錄號D63361)。附圖4是翻譯成鼠(Mus musculus)RegIIIγ蛋白(SEQ IDNO4)的氨基酸序列，如Narushima等人同上所報道。附圖5(SEQ ID NO5)是人PAP啟動子的核苷酸序列的代表。附圖6(SEQ ID NO6)是小鼠RegIIIγ蛋白的核苷酸序列的代表。
發(fā)明詳述本文涉及的專利和科學文獻確立了本領域技術人員可用的知識。本文所引用的已公開的美國專利、已批準的申請、已公開的申請(美國和外國)和參考物，包括GenBank數(shù)據(jù)庫序列都以相同程度一并引入作為參考，就像它們每個都是特定地和分別地通過參考引入本文。本發(fā)明是基于下列意想不到的發(fā)現(xiàn)與對照的非哮喘動物相比，在哮喘的動物模型中RegIII蛋白的mRNA在統(tǒng)計學上顯著地增加。具體地，通過氣管內(nèi)的卵白蛋白激發(fā)或直接在肺部滴注IL-l 3會使編碼RegIIIγ的mRNA增加。此外，依次阻斷IL-l 3結合到IL-l 3受體上的能力，抑制了RegIIIγ的表達。在鼠的哮喘模型中，RegIIIγ蛋白的向上調(diào)節(jié)表明，在變應性應答中涉及Reg蛋白，同時，RegIII蛋白是通過IL-l 3途徑調(diào)節(jié)的。Reg蛋白包含一個多基因家族，根據(jù)序列同源性分成3個子類。最具有特征的是RegI，最初鑒定其在胰腺β-細胞再生中作為生長因子，在胰腺再生的創(chuàng)傷愈合和胃粘膜愈合的模型中其表達向上調(diào)節(jié)。在去除胰腺的大鼠中，RegI促進胃上皮細胞的有絲分裂，并誘導胰腺β-細胞的體內(nèi)增殖。RegIII是小鼠染色體6上的Reg多基因絡合物的一部分，其幾乎唯一地在腸和結腸中表達。通過直接滴注或IL-l 3的轉基因肺特異性表達在肺部施用IL-l 3，會發(fā)生氣道上皮細胞肥大。密切相關的Reg蛋白的有絲分裂性質使得RegIII家族候選基因進入在各種動物疾病模型和人哮喘中觀察到的肺上皮肥大中用于進一步研究。本發(fā)明人相信，在例如肺中RegIII蛋白刺激上皮生長和/或肥大。由于上皮細胞生長和/或肥大而在哮喘中觀察到的上皮細胞肥厚是在肺中改變過程的一部分。根據(jù)在上述討論的小鼠變應性哮喘模型中Reg蛋白的促有絲分裂性質和RegIII家族蛋白mRNA的向上調(diào)節(jié)，因此將RegIII蛋白鑒定成在人哮喘中對抗肺上皮肥大和氣道改變過程的靶基因。RegIII家族蛋白包括但不限于，人HIP、人PAP、小鼠RegIIIα、小鼠IIIβ、小鼠IIIγ、小鼠IIIδ、大鼠PAP、大鼠PAPIII、牛PTP和倉鼠島(hamster islet)再生相關蛋白(INGAP)。因此，本發(fā)明人相信，在哮喘的變應性應答中涉及RegIII家族的蛋白質，因此，Reg蛋白的抑制劑在治療哮喘中將是有效的。此處的“哮喘”包括但不限于，特應性哮喘、非特應性哮喘、變應性哮喘、運動誘發(fā)性哮喘、藥物誘發(fā)性哮喘、職業(yè)性哮喘和后期哮喘。如上所述，本發(fā)明提供篩選用于在哺乳動物中治療哮喘的試劑的方法。在一個實施方案中，哺乳動物是人。此處的“試劑”包括但不限于，合成的小分子，化學試劑，核酸例如反義寡核苷酸，RNA，抑制劑例如siRNA，核酶，核酸配體例如適體，肽和蛋白質例如激素、細胞因子、抗體及其片段。在一個方面，該方法包括將RegIII蛋白和受試試劑與蛋白質的底物接觸。在一個方面，受試試劑調(diào)節(jié)(例如，抑制或提高)RegIII蛋白的活性。在另一個方面，受試試劑調(diào)節(jié)(例如，抑制或提高)RegIII蛋白的產(chǎn)生或表達?！笆茉囋噭笔羌俣ǖ摹霸噭保湔{(diào)節(jié)能力還未經(jīng)證實。一旦篩選受試試劑，如果它們表現(xiàn)出調(diào)節(jié)蛋白質活性或產(chǎn)生或表達(例如通過調(diào)節(jié)轉錄或翻譯)，就將其歸類為“試劑”。在一個特殊的實施方案中，該試劑降低或抑制RegIII蛋白的活性。在一些實施方案中，該試劑結合到RegIII蛋白上。在其它實施方案中，該試劑與RegIII蛋白活性或表達的抑制劑或激活劑相互作用(例如通過化學修飾)。通過一個非限制性的例子，該試劑可以結合并抑制RegIII蛋白的激活劑，或者該試劑可以結合并激活RegIII蛋白活性的抑制劑。此外，在另一個非限制性的例子中，該試劑可以例如通過拮抗IL-l 3、IL-l 3受體或IL-4受體，與RegIII蛋白的上游產(chǎn)物相互作用。該方法包括確定該受試試劑是否調(diào)節(jié)(例如，抑制)RegIII蛋白的活性，如果該受試試劑調(diào)節(jié)(例如，抑制)RegIII蛋白的活性或表達，就將其歸類為治療哮喘的試劑。如附圖1和2所分別提供，RegIII蛋白家族的一個成員—人PAP的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所列。如附圖3和4所分別提供，鼠RegIIIγ蛋白的的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所列。抑制RegIII蛋白的活性或表達的示例性試劑包括但不限于，IL-l3的拮抗劑例如sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-Fc，IL-13受體的拮抗劑，IL-4受體的拮抗劑，抗體例如抗-RegIII蛋白抗體(例如，抗-HIP、抗-PAP、抗RegIIIγ)、IL-l 3中和抗體、IL-l 3R抗體，核酸例如siRNA、適體(即核酸配體)、反義寡核苷酸和核酶和小分子化學抑制劑。當是抗體時，該方法包括但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、遺傳工程抗體、雙重特異性抗體、抗體片段(包括但不限于″Fv″、″F(ab′)2″、″F(ab)″和″Dab″)和代表抗體反應部分的單鏈。這樣的抗體包括，屬于任意免疫球蛋白類的抗體，例如IgM、IgG、IgD、IgE、IgA或其子類或混合物。本發(fā)明還包括這些抗體的衍生物，例如當改變涉及其作為藥物制劑使用的一個或多個性質例如血清穩(wěn)定性或產(chǎn)生的效力時，仍保留了它們與RegIII蛋白結合活性的衍生物。在另一個實施方案中，抑制了RegIII蛋白的產(chǎn)生。該方法包括但不限于，確定該受試試劑是否調(diào)節(jié)(例如抑制)RegIII蛋白的表達，如果該受試試劑調(diào)節(jié)(例如抑制)RegIII蛋白的表達，就將其歸類為治療哮喘的試劑。抑制RegIII蛋白表達的示例性試劑包括但不限于，選自可溶性IL-l 3受體(例如IL-l 3Rα1和IL-l 3Rα2的胞外域，其單獨或融合到異源性部分例如Fc上，例如13RαsIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l3Rα2-Fc)；對抗IL-l 3或IL-l 3R的中和抗體或其抗原結合片段；核酶；反義寡核苷酸；RNA抑制劑(例如，siRNA)；激素；細胞因子；和化學試劑(例如小分子)的拮抗劑。參見Wynn等人的美國專利U.S.6,664,227，在此將其整體引入本文作為參考。RegIII蛋白與誘導哮喘的癥狀和/或并發(fā)癥有關的發(fā)現(xiàn)，使得我們提出RegIII蛋白的序列可以用于本發(fā)明的鑒定試劑的方法。這些方法包括，測定可能的試劑抑制RegIII蛋白活性和/或產(chǎn)生或表達的能力。在這些測定中有用的多核苷酸和多肽不僅包括此處所公開的基因或編碼的多肽，也包括與野生型基因和多肽具有基本相同活性的變異體。此處的“變異體”包括，包含一個或多個刪除、插入或取代的多核苷酸或多肽，只要該變異體保留了與野生型多核苷酸或多肽基本相同的活性。至于多肽，所關注的刪除型變異體包括缺少生物活性非必需部分的多肽片段，而所關注的插入型變異體包括融合多肽，其中野生型多肽或其片段融合到另一個多肽上。因此，在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的RegIII蛋白可以由與如SEQ ID NO1(附圖1)或SEQ ID NO3(附圖3)所列的核苷酸序列具有至少約60％，至少約70％，至少約80％或至少約90％同一性的核酸序列編碼。可以通過例如用來自the National Institutes ofHealth的高級BLAST計算機程序，2.0.8版比較序列信息來確定同一性的百分比。另外，在另一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的RegIII蛋白可以由與如SEQ ID NO1(附圖1)或SEQ ID NO3(附圖3)所列的核苷酸序列基本相似的核苷酸序列編碼。此處的“基本相似”是指，核苷酸序列與在適當嚴格條件下雜交的對照核苷酸序列足夠地相似。確定相似性的方法是本發(fā)明所屬領域公知的。嚴格條件的例子如下表1所示高嚴格條件是至少如條件A-F的嚴格條件；嚴格條件是至少如條件G-L的嚴格條件；低嚴格條件是至少如條件M-R的嚴格條件。
表1
1雜交長度是對雜交多核苷酸的雜交區(qū)域的預期。當將多核苷酸雜交到未知序列的靶多核苷酸上時，假設雜交長度是雜交多核苷酸的長度。當雜交已知序列的多核苷酸時，可以通過校準多核苷酸的序列和鑒定最佳序列互補性的一個或多個區(qū)域來確定雜交長度。
2在雜交和洗滌緩沖液中，可以把SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4，和1.25mM EDTA，pH 7.4)替換成SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后，進行15分鐘的洗滌。
TB*-TR*雜交長度預計少于50個堿基對的雜交溫度應當?shù)陀陔s交的熔化溫度(Tm)5-10EC，其中根據(jù)下列等式確定Tm。對于長度小于18個堿基對的雜交，Tm(EC)＝2(A的#+T堿基)+4(G的#+C堿基)。對于長度在18到49個堿基對的雜交，Tm(EC)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是在雜交中堿基的數(shù)目，Na+是在雜交緩沖液(Na+的1X SSC＝0.165M)中鈉離子的濃度。多核苷酸雜交的嚴格條件的其它例子在Sambrook等人，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，Chs.9 & 11，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Ausubel等人編著，Current Protocols in Molecular Biology，§§2.10，6.3-6.4，John Wiley & Sons，Inc.(1995)中提供，在此一并引入作為參考。可以通過技術人員已知的方法來制備RegIII蛋白。例如，可以將編碼RegIII蛋白基因的核苷酸序列引入到需要的宿主細胞中。可以首先將該核苷酸序列插入到適當?shù)闹亟M表達載體中。可以根據(jù)技術人員公知的方法在載體內(nèi)摻入上述的核苷酸序列來構建重組表達載體。在本發(fā)明中有用的種類廣泛的載體都是已知的。適當?shù)妮d體包括質粒載體和病毒載體，后者包括反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和皰疹病毒載體。該載體可以包括在特定宿主細胞內(nèi)核酸有效表達必需或需要的其他已知的遺傳要素，包括調(diào)節(jié)要素。例如，該載體可以包括啟動子和任意必需的增強子序列，該增強子序列與啟動子相協(xié)作完成基因的轉錄。該核苷酸序列可以可操作地連接到所述調(diào)節(jié)成分上。這樣的核苷酸序列涉及的是“遺傳構造”。遺傳構造可以在其自身中或在與一個或多個其他遺傳成分的組合中包含遺傳要素。在一些實施方案中，這些遺傳要素可操作地連接。在一些實施方案中，在遺傳構造中可以不存在有爭論的特定基因(例如hHIP、hPAP、RegIIIγ)，包括但不限于，RegIII蛋白的啟動子與報道基因可操作地結合的情況。在此處，當將核苷酸序列置于與另一核苷酸序列的功能關系中時，該核苷酸序列就是“可操作地連接”到另一核苷酸序列上。例如，如果編碼序列可操作地連接到啟動子序列上，這一般意味著該啟動子可以啟動編碼序列的轉錄?！翱刹僮鞯剡B接”是指被連接的DNA序列典型地是連續(xù)的，以及在必需連接兩個蛋白質編碼區(qū)時是連續(xù)的并在讀碼框中。但是，由于當通過數(shù)千堿基對分離啟動子時增強子可能有作用以及內(nèi)含子序列具有不同的長度，一些核苷酸序列可以可操作地連接，但并不連續(xù)?？梢杂煤芏嗟姆椒▉韺⒕幋aRegIII蛋白的核苷酸序列引入宿主細胞，其中該核苷酸序列可以包括在重組表達載體中。這些方法是本領域已知的，包括機械法、化學法、親脂法和電穿孔。顯微注射和具有例如被引入的DNA的金顆粒底物的基因槍的使用，是一種代表性的、非限制的示例性機械法。磷酸鈣或DEAE-葡聚糖的使用，是一種代表性的、非限制的示例性化學法。示例性的親脂法包括使用脂質體和用于脂類介導的轉染的其他陽離子試劑。這些方法都是本領域公知的。在本發(fā)明中，可以使用種類廣泛的宿主細胞來產(chǎn)生所需的大量RegIII蛋白。這些細胞包括但不限于，真核和原核細胞，包括本領域已知的哺乳動物細胞和細菌細胞?？梢酝ㄟ^技術人員公知的技術來分離和純化RegIII蛋白，這些技術包括但不限于，色譜、電泳和離心技術。這些方法是本領域已知的。典型地，將樣品(例如組織、細胞培養(yǎng)、或一定量的RegIII蛋白)與受試試劑接觸一段時間，以充分抑制蛋白質的活性或產(chǎn)生/表達。該段時間各不相同，取決于受試試劑的性質、具體的RegIII蛋白、所選擇的活性或表達檢測方法和所選擇的樣本組織。技術人員無需過多試驗就可確定該時間。示例性的受試試劑是通過結合或通過例如與RegIII蛋白結合，阻斷其與信號轉導途徑的功能性相互作用的能力來降低蛋白質的活性。類似的測定可以篩選出阻斷RegIII蛋白表達的受試試劑，包括但不限于，例如IL-l 3拮抗劑(例如sIL-l 3Rα2-Fc融合蛋白)或IL-4拮抗劑?？梢杂梅N類廣泛的測定來確定受試試劑是否抑制RegIII蛋白的活性。由于RegIII蛋白具有促有絲分裂活性，這些測定包括但不限于，細胞增殖測定和粘液產(chǎn)生測定。在一個實施方案中，所需的細胞與有效量的RegIII蛋白和受試試劑接觸或培養(yǎng)。該量可以有效地刺激上皮細胞生長和/或肥大，是技術人員可以確定的。然后測定細胞增殖，并與用不含受試試劑的RegIII蛋白處理的對照細胞相比較?？梢杂梅N類廣泛的細胞增殖測定來確定受試試劑是否抑制RegIII蛋白的活性。這些細胞增殖測定是本領域公知的，包括，例如標記的脫氧胸苷吸收測定、5-溴-2′-去氧尿苷吸收測定、溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-聯(lián)苯四鈉測定、三磷酸腺苷產(chǎn)生測定，或它們的一些組合。如本領域所知，標記的脫氧胸苷結合，例如放射性標記的脫氧胸苷結合可以用于監(jiān)測或定量細胞增殖。細胞結合標記的核苷酸，典型地是氚化脫氧胸苷，其進入新合成的DNA中。通過定量結合到DNA中的放射性標記的核苷酸的量來確定細胞增殖的相對量。Cunningham，B.A.，The Scientist，15(13)26(2001)?？梢酝ㄟ^液體閃爍計數(shù)來測定結合到DNA中的放射性標記的核苷酸的量，并作為細胞增殖的量度標準。類似地，可以把其他的核苷酸結合到新合成的DNA中，定量，并作為細胞增殖的相對量度標準。例如可以把5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU)結合到DNA中，并通過在酶免疫分析法，例如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)中使用商供的單克隆抗體對抗BrdU來定量。溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-聯(lián)苯四鈉(MTT)測定包括MTT與稱作甲月替的藍色化合物的細胞還原減少。相對于衰老或死細胞，在增殖活躍的細胞中細胞還原增加。因此通過觀測藍色的強度(例如用分光鏡)定量甲月替為細胞增殖提供了相對的量度標準。Cunningham，B.A.，The Scientist，15(13)26 (2001)；Mosmann，J.Immunol.Methods 6555-63(1983)?？梢允褂闷渌乃倪螓}來代替MTT或除了MTT以外使用其它的四唑鹽，包括WST-1、WST-8、XTT、和MTS?？梢杂冒▉碜訟merican Type Culture Collection(Manassas，VA)的商供的試劑盒來進行這些測定。三磷酸腺苷產(chǎn)生測定是測定在所研究的細胞中存在的ATP的量。典型地，ATP與各種水解ATP的成分反應，導致光的產(chǎn)生。光的強度與細胞中ATP的量是成比例的。在一個測定中，在氧存在下ATP與熒光素酶和熒光素反應。對這些測定的描述在，例如The Scientist，15(13)26(2001)；Mosmann，J.Immunol.Methods 6555-63(1983)和Crouch等人，J.Immunol.Methods 16081-88(1993)中?？梢允褂帽绢I域已知的定量細胞的其他方法，包括使用血細胞計數(shù)器和錐蟲藍染色，例如如Ausubel，等人，編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons所述。在細胞增殖測定中可以使用種類廣泛的細胞。細胞的非限制性例子是哺乳動物細胞，可以對RegIII蛋白的促有絲分裂活性產(chǎn)生應答。這些細胞包括，例如，原發(fā)性上皮細胞或細胞系，例如LIM1863(Whitehead等人Cancer Res.47(10)2683-9(May 15，1987))。這種細胞典型地作為細胞培養(yǎng)物存在。細胞的其他非限制性例子是氣道上皮細胞。細胞培養(yǎng)方法是技術人員已知的，并在例如Ausubel等人，編輯，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；A.J.Shaw，編輯，Epithelial Cell CultureA Practice Approach(PracticalApproach Series)，IRL press，1996；R.I.Freshney和M.G.Freshney，編輯，Culture of Epithelial Cells，第二版，John Wiley & Sons，2002；和C.Wise，編輯，Epithelial Cell Culture Protocols(Methods in MolecularBiology，v.188)，Humana Press，2002中進行了描述?？梢杂糜诖_定受試試劑是否抑制RegIII蛋白活性的其他測定是定量從用H&E染色的細胞中產(chǎn)生的粘液，這是本領域技術人員已知的技術。在一個實施方案中，上皮細胞與有效量的RegIII蛋白和受試試劑接觸或培養(yǎng)。該量可以有效地刺激上皮細胞分化進入杯形細胞中，并可以與用不含受試試劑的RegIII蛋白處理的對照細胞相比較。除了用于粘液產(chǎn)生的H&E染色外，可以用經(jīng)典的逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)測定編碼mRNA表達的粘液的減少，用cDNA或寡核苷酸測定來測定表達的mRNA的球型曲線、或定量粘液中粘多糖的量?？梢杂煤芏喾N的測定來定量粘液，包括用染料給粘膜成分染色，并用比色法定量。在一個實施方案中，可以用高碘酸Schiff技術給粘膜中存在的粘蛋白、糖蛋白或粘多糖染色?；蛘撸梢苑派湫詷擞浾车鞍祝⑼ㄟ^如Svitacheva，N.和Davies，J.R.，″Mucinbiosynthesis and secretion in tracheal epithelial cells in primaryculture，″Biochem.J.35323-32(2001)所述的通過疏水相互作用色譜來分析。可以用本領域已知的標準方法和例如，如Svitacheva，N.和Davies，J.R.(出處同上)所述，來分離粘液。簡言之，收集培養(yǎng)物中的細胞，在透析樣品后通過等容密度梯度離心來分離粘蛋白。來源廣泛的哺乳動物上皮細胞可以在上述包括定量粘蛋白的篩選測定中使用，以及用于上述的細胞增殖測定。上皮細胞的非限制性例子是小氣道上皮細胞或支氣管上皮細胞，其可從Clonetics(www.cambrex.com)獲得。典型地，這些細胞作為細胞培養(yǎng)物存在。細胞培養(yǎng)方法是技術人員已知的，并例如在Ausubel等人，編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；A.J.Shaw，編輯，Epithelial Cell CultureA Practice Approach(Practical ApproachSeries)，IRL press，1996；R.I.Freshney，和M.G.Freshney，編輯，Culture of Epithelial Cells，第二版，John Wiley&Sons，2002；和C.Wise，編輯，Epithelial Cell Culture Protocols(Methods in MolecularBiology，v.188)，Humana Press，2002中進行了描述。此外，上皮細胞系可以用于涉及粘蛋白定量的篩選測定。在本發(fā)明的篩選方法中可以測定種類廣泛的受試試劑。例如，本領域已知的小分子化合物，合成小分子化學試劑，核酸例如反義寡核苷酸，RNA抑制劑例如siRNA、核酶、和適體，肽和蛋白質例如激素、抗體、和其片段，都可以作為受試試劑。在一個非限制性的例子中，通過結晶由酶和已知抑制劑形成的絡合物來確定RegIII蛋白的活性位點的三維結構。然后用推理性藥物設計，通過改變已知抑制劑的結構或設計結合到酶的活性位點的小分子來鑒定新的受試試劑。類似地，技術人員將會理解，推理性藥物設計也可以用于設計IL-l 3R和/或IL-4R的拮抗劑，這兩種拮抗劑也可以用于調(diào)節(jié)RegIII蛋白的產(chǎn)生。如本文的其他地方所討論，受試試劑包括RegIII蛋白活性的抑制劑，以及RegIII蛋白表達或產(chǎn)生的抑制劑。RegIII蛋白活性抑制劑的非限制性例子包括RegIII蛋白的抗體、小分子抑制劑、和蛋白質和肽，例如激素和細胞因子。RegIII產(chǎn)生抑制劑包括但不限于，抑制RegIIImRNA或蛋白產(chǎn)生的受試試劑。這些受試試劑的非限制性例子包括IL-l3的拮抗劑、siRNA、反義核酸、核酶、適體、IL-l 3的中和抗體、IL-l3R和IL-4R。IL-l 3的拮抗劑包括但不限于，阻斷IL-l 3與IL-l 3受體或IL-4受體結合能力的受試試劑。這些拮抗劑包括但不限于IL-l3Rα1-Fc，SIL-l 3Rα2-Fc，和抗IL-l 3、IL-l 3R或IL-4R的中和抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明也提供篩選用于在哺乳動物中治療哮喘的試劑的方法，包括，篩選調(diào)節(jié)(例如，抑制或激活)RegIII蛋白活性或產(chǎn)生或表達的試劑。該方法包括，將編碼報道基因產(chǎn)物的核苷酸序列與被認為可以有效抑制RegIII蛋白產(chǎn)生的受試試劑接觸，其中該核苷酸序列可操作地與編碼RegIII蛋白的哺乳動物基因的啟動子連接，其中所述基因包括但不限于hHIP、hPAP、或RegIIIγ；確定該受試試劑是否抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生；和如果該受試試劑抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，就將其歸類為治療哮喘的試劑。在一個實施方案中，哺乳動物是人。在一個實施方案中，編碼RegIII蛋白的基因的啟動子包括如SEQ ID NO5或SEQID NO6分別所列的核苷酸序列，其中所述基因包括但不限于hHIP、hPAP、或RegIIIγ。與所述序列具有至少約50％，至少約70％，至少約80％，或至少約90％的同一性，并例如作為啟動子具有直接表達如所述的編碼RegIII蛋白的基因的功能的核苷酸序列，也包括在本發(fā)明中?？梢杂帽绢I域公認的方法來確定RegIII蛋白的啟動子的核苷酸序列。所述方法一個非限制性的例子是用SEQID NO1(附圖1)或SEQ ID NO3(附圖3)作為探針篩選基因組文庫(例如，YAC人基因組文庫)中感興趣的啟動子序列。確定適當啟動子序列的方法的另一個非限制性的例子是通過用探針(例如包含SEQID NO1或其一部分)探測電泳分析的人基因組DNA，然后確定該cDNA探針(例如SEQID NO1)在哪里雜交來完成人基因組DNA的索瑟恩DNA印跡法(Southern blot)。一旦確定了探針(例如SEQID NO1)雜交的帶，就分離(例如從凝膠切除)該帶，并用于序列分析。這就允許刪除SEQID NO1的核苷酸104-106(即ATG位點)的核苷酸片段5′。該核苷酸片段的長度為約500到100個單元。如SEQ ID NO3(附圖3)所列的鼠RegIIIγ蛋白的啟動子序列也可以通過這些方法來確定。與所述序列具有至少約70％，至少約80％，或至少約90％的同一性，并例如作為啟動子具有直接表達如所述的編碼RegIII蛋白的基因的功能的核苷酸序列，也包括在本發(fā)明中。種類廣泛的報道基因可以可操作地連接到上述的RegIII蛋白啟動子上。這些基因可以編碼例如熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、β-葡糖苷酸酶、堿性磷酸酶、和綠色熒光蛋白、或其他本領域已知的報道基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個實施方案中，將編碼與RegIII蛋白啟動子可操作地連接的報道基因的核苷酸序列引入宿主細胞中。首先將該核苷酸序列插入到如前所述的適當重組表達載體中。在本發(fā)明這個方面的載體可以包括在具體哺乳動物細胞中足夠表達來自RegIII蛋白啟動子的核苷酸序列所必需或需要的其他已知的遺傳要素，包括調(diào)節(jié)要素。例如，該載體可以包括任意在體內(nèi)與啟動子協(xié)作例如完成報道基因體內(nèi)轉錄所必需的增強子序列。將核苷酸序列引入宿主細胞的方法與前述的制備RegIII蛋白的方法是相同的。在本發(fā)明的篩選方法中可以使用種類廣泛的宿主細胞。示例性的宿主細胞包括，例如中國倉鼠卵巢、大腸桿菌、COS和桿菌?；蛘撸谒龅妮d體中篩選的方法可以使用編碼全部或部分RegIII蛋白的核苷酸序列。在該情況下，如前所述，可以通過技術人員已知的技術分離和純化RegIII蛋白，所述技術包括色譜、電泳和離心技術。此外，可以通過本領域已知的方法定量RegIII蛋白。在將與RegIII蛋白啟動子可操作地連接的編碼報道基因或RegIII蛋白基因的核苷酸序列和被認為可以有效抑制RegIII蛋白產(chǎn)生的受試試劑結合后，確定該受試試劑是否抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^定量報道基因產(chǎn)物的量或活性來確定該端點。定量的方法取決于所使用的報道基因，但也包括取決于所使用的報道基因產(chǎn)物抗體的酶聯(lián)免疫吸附法測定。此外，該測定可以測定化學發(fā)光、熒光或放射性衰變、或本領域已知的其他方法。確定所述報道基因產(chǎn)物的活性或量的測定法是本領域已知的。如果該受試試劑抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，就將其歸類為治療哮喘的試劑。本發(fā)明的篩選方法可以通過體外(例如在基于細胞的測定或在酶活性測定中通過監(jiān)測RegIII蛋白的活性或表達)或體內(nèi)(例如在給哺乳動物施用受試試劑后，通過監(jiān)測組織樣本例如BAL中RegIII蛋白的活性或表達)來完成。示例性的哺乳動物包括但不限于，人、小鼠、大鼠和狗。本發(fā)明也提供治療哮喘的方法。此處的“治療”、“治療的”、“被治療”是指預防、減少或消除哮喘的至少一種癥狀或并發(fā)癥。哮喘示例性的癥狀和/或并發(fā)癥包括但不限于，AHR、粘液產(chǎn)生過度、血清IgE水平升高、氣道嗜酸性粒細胞增多和氣道改變。這些方法包括給需要治療的哺乳動物例如人治療量的降低RegIII蛋白產(chǎn)生或活性的試劑。其他可以用本發(fā)明的試劑治療的哺乳動物的非限制性例子包括小鼠、大鼠和狗?！爸委熈俊贝砟芤种苹蚪档蚏egIII蛋白的活性或產(chǎn)生或表達并導致足夠臨床應答的試劑的量。臨床應答包括所治療病癥的改善或該病癥的預防。當然，根據(jù)本發(fā)明施用的試劑的具體劑量要通過病例周圍的具體環(huán)境，包括所施用的試劑、要治療的具體哮喘及類似的情況來確定。降低RegIII蛋白的活性或產(chǎn)生或表達的試劑包括在上述的篩選測定中發(fā)現(xiàn)的那些試劑。其他的試劑或抑制劑是本領域公知的，包括，例如蛋白質和肽例如激素、細胞因子和抗體或其部分，核苷酸例如反義寡核苷酸、siRNA、核酶、和適體，以及小分子。參見例如Houston，等人，PNAS 99(14)9127-9137(2002)。通過實例，所用的對抗RegIII蛋白的抗體可以是，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、遺傳工程抗體、雙重特異性抗體、抗體片斷(包括但不限于″Fv″、″F(ab′)2″、″F(ab)″和″Dab″)和代表抗體反應部分的單鏈。這樣的抗體包括，屬于任意免疫球蛋白類的抗體，例如IgM、IgG、IgD、IgE、IgA或其子類或混合物。本發(fā)明還包括這些抗體的衍生物，例如當改變涉及其作為藥物制劑使用的一個或多個性質，例如血清穩(wěn)定性或產(chǎn)生的效力時，仍保留了它們FoxM1-結合活性的衍生物?？贵w的非限制性例子包括抗-RegIII蛋白抗體、抗IL-l 3中和抗體、抗IL-l 3R和抗IL-4R抗體。產(chǎn)生上述每一種抗體形式的方法都是本領域公知的。在不同的實施方案中，這樣的抗體結合到RegIII蛋白(例如hHIP、hPAP、RegIIIγ)、IL-l 3、IL13-R、IL-4R、或RegIII信號途徑的其他成分上。在另外的實施方案中，抗體結合到RegIII活性或表達的抑制劑上。產(chǎn)生上述每一種抗體形式的方法都是本領域公知的。可以用于合成抗體的細胞包括轉化后的動物、真菌、細菌細胞或酵母細胞。通過非限制性實例，可以用已知的方法從RegIII蛋白免疫的動物制備雜交瘤細胞，和分離它們的抗體產(chǎn)生的B細胞，選擇這些細胞用于與抗體結合的RegIII或IL-l 3，隨后將這些細胞融合到，例如人或動物的例如小鼠mylenoma細胞、人淋巴樣干細胞或異雜交瘤細胞或通過用適當?shù)牟《靖腥具@些細胞而產(chǎn)生無限增殖化細胞系。通過非限制性實例，可以將人RegIII(例如，HIP、PAP)或IL-l 3單克隆抗體用于檢測RegIII蛋白或治療具有哮喘樣癥狀的患者。術語“單克隆”是指所獲得的抗體的性質，來源于基本上同種群的抗體(即，除了可能在較小量中存在的自然發(fā)生的突變外，包含該種群的抗體個體是相同的)，當需要通過具體方法制備抗體時，其不會被翻譯。因此在樣品中RegIII蛋白的檢測或定量可以通過利用在單克隆抗體和RegIII蛋白或IL-l 3之間的特定結合反應進行免疫測定來完成。各種免疫測定法是本領域公知的，可以使用它們中任何一種。免疫測定法的例子包括使用單克隆抗體和其他的單克隆抗體分別作為初級和次級抗體的夾層法，使用單克隆抗體和多克隆抗體分別作為初級和次級抗體的夾層法，使用膠體金的染色法、凝集法、膠乳法和化學發(fā)光法?？贵w片段也可以用于哮喘治療的RegIII蛋白或IL-l 3檢測。例如，可以通過用酶例如番木瓜蛋白酶或胃蛋白酶清除抗體的Fc部分的酶方法，通過化學氧化或通過抗體基因的基因操作獲得抗體片段。使用基因操作的非截斷型片段也是可能和有利的。這些抗體或其片段可以單獨或作為混合物使用。本領域技術人員可以理解，當通過減少RegIII蛋白的活性或產(chǎn)生或表達來進行治療哮喘的測定時，對抗IL-l 3受體或IL-4受體的抗體也是有用的。本發(fā)明包括治療哮喘的方法，包括施用治療量的IL-l 3拮抗劑，其中所述施用降低了RegIII蛋白的產(chǎn)生。如本文在其他地方所解釋，RegIII蛋白的表達至少部分地通過IL-l 3途徑來調(diào)節(jié)。在一個非限制性的實施方案中，受試試劑是IL-l 3的拮抗劑，其中斷IL-l 3結合到IL-l 3受體上的能力，導致RegIII蛋白的向下調(diào)節(jié)。在一個非限制性的實施方案中，IL-l 3的拮抗劑阻斷IL-l 3結合到IL-l 3受體上的能力。在一個例子中，該拮抗劑與IL-l 3受體競爭性地與IL-l 3結合。在一個例子中，拮抗劑包括但不限于，包含一個或多個IL-l 3受體結合鏈的融合蛋白?？扇苄匀诤系鞍椎姆窍拗菩詫嵗↖L-l 3Rα1-Fc和IL-l 3Rα2-Fc。示例性的受試試劑也包括但不限于化學試劑，包括合成的小分子，核酸例如反義寡核苷酸、siRNA、核酶、和適體，肽和蛋白質例如激素、細胞因子和抗體或其一部分，例如抗IL-l 3中和抗體和抗IL-l 3R和IL-4R抗體。本發(fā)明包括治療哮喘的方法，包括施用核酸。示例性的核酸包括但不限于，脫氧核糖核酸或核糖核酸。在一個實施方案中，核糖核酸具有的核酸序列與如附圖1和3的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所列的用于編碼RegIII蛋白的核苷酸序列的一部分互補。在另一個實施方案中，小的干擾RNAs(即通過RNA干擾的方法)可以作為RegIII蛋白的抑制劑使用。RNA干擾涉及由與沉默基因靶點對應的雙鏈RNA引起的序列特異性、轉錄后基因沉默/使用小的干擾RNAs抑制蛋白質產(chǎn)生的方法是本領域公知的，并在例如PCT國際申請?zhí)朩O01/75164、WO00/63364；WO01/92513；WO00/44895；和WO99/32619中公開。RNA干擾構造或siRNA復式RNA分子可以用于干擾RegIII蛋白或IL-l 3的表達。典型地，RegIII蛋白或IL-l 3的至少19，21，22，或23個核苷酸對于siRNA分子是足夠的。在一個實施方案中，siRNA分子具有2-核苷酸3′懸突。如果在細胞中siRNA從構造中例如從發(fā)夾結構分子或從所需的RegIII或IL-l3序列的反轉重復中表達，那么隨后內(nèi)源性細胞結構將會產(chǎn)生懸突。SiRNA分子也可以通過化學合成、體外轉錄、或核糖核酸酶或dicer的長dsRNA消化作用來合成。Brummelkamp，等人，Science，296550-53(2002)；Elbashir，等人，Nature，411494-98(2001)；Elbashir，等人，Genes Dev，15188-200(2001)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括治療哮喘的方法，包括聯(lián)用一種或多種RegIII蛋白活性或產(chǎn)生或表達的抑制劑和一種或多種IL-l 3的拮抗劑。示例性的RegIII抑制劑包括調(diào)節(jié)(例如，抑制)RegIII蛋白活性的抑制劑例如抗RegIII抗體，以及調(diào)節(jié)(例如，抑制)RegIIImRNA轉錄的抑制劑例如siRNA、核酶、適體、和反義寡核苷酸。示例性的IL-l 3拮抗劑包括阻斷IL-l 3結合到IL-l 3受體上的能力的試劑。這些試劑包括作用于IL-l 3分子上的試劑例如sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l3Rα2-Fc和抗IL-l 3中和抗體，以及作用于IL-l 3受體的試劑例如抗IL-l3R抗體和合成的小分子。IL-l 3的拮抗劑還包括核酶、適體、siRNA、反義寡核苷酸、細胞因子、和激素。此處關注的是涉及抑制RegIII蛋白和拮抗IL-l 3的試劑的聯(lián)合治療。本發(fā)明包括在哺乳動物中降低RegIII蛋白表達的方法。該方法包括施用有效量的IL-l 3的拮抗劑。在一個實施方案中，該拮抗劑阻斷IL-l 3結合到IL-l 3受體上的能力。在另一個實施方案中，該拮抗劑阻斷IL-l 3結合到IL-4受體上的能力。這些拮抗劑包括在上述與治療哮喘有關的方法中所討論的那些。在一些實施方案中，該拮抗劑選自sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-Fc和IL-l 3的中和抗體。在另一個方面，本發(fā)明包括檢測哮喘治療效力的方法。該方法包括施用受試試劑并檢測RegIII蛋白的表達，其中RegIII蛋白表達的減少表明該受試試劑在治療哮喘中是有效的。受試試劑包括在本文的其他地方描述的那些。在一個實施方案中，該方法包括施用IL-l 3的拮抗劑。IL-l 3的拮抗劑包括上述的那些。IL-l 3拮抗劑的非限制性的例子包括sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-Fc和IL-l 3的中和抗體。治療哮喘的方法包括給需要治療的哺乳動物施用IL-l 3拮抗劑，檢測RegIII蛋白的活性或表達或產(chǎn)生水平，并將RegIII蛋白的活性或表達或產(chǎn)生水平與在用IL-l 3拮抗劑治療前的對照水平相比較。RegIII蛋白的活性或表達或產(chǎn)生水平相對于對照水平可以增加或減少。如果受試試劑降低或抑制了RegIII蛋白的活性或表達，就將其歸類為對治療哮喘有效的IL-l 3拮抗劑。抑制RegIII蛋白的活性或表達的示例性的試劑包括但不限于，sIL-l 3Rα1-Fc、sIL-l 3Rα2-c、IL-l 3的中和抗體和抗RegIII抗體?？梢酝ㄟ^各種途徑來施用該試劑。施用的示例性途徑包括口服、胃腸外、經(jīng)皮和肺部施用。例如，該試劑可以鼻內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、葉鞘內(nèi)、或其任意組合地施用。對于肺部施用的噴霧器，可以用吸入器或氣霧分配器遞送適當制劑形式的治療劑(即，與氣霧劑一起)。此外，該試劑可以單獨或與其他試劑或已知藥物組合施用。在組合中，試劑可以同時施用，或者各試劑在不同時間施用。當與一種或幾種已知的哮喘藥物組合時，試劑和藥物可以同時施用或者可以在藥物前或后施用該試劑。在一個實施方案中，該試劑可以在藥學可接受的載體中施用?？梢允褂帽绢I域已知的任何適當?shù)妮d體。在一個實施方案中，載體有效地溶解了該試劑。載體包括但不限于，固體、液體或固體和液體的混合物。載體可以制成膠囊、片劑、丸劑、粉末劑、錠劑、混懸劑、乳劑或糖漿的形式。載體可以包括作為調(diào)味劑、潤滑劑、增溶劑、助懸劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、片劑崩解劑和裝膠囊材料的物質。全身性口服的片劑可以包括如本領域已知的賦形劑例如碳酸鈣、碳酸鈉、糖類(如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇)、纖維素(如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉)、膠(如阿拉伯膠、黃蓍膠)，和崩解劑例如玉米、淀粉或海藻酸，粘合劑例如明膠、膠原或阿拉伯膠和潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。在粉末劑中，該載體是精細分離的固體，其與有效量的精細分離的試劑混合。在溶液、混懸劑或糖漿中，有效量的試劑溶解或懸浮于載體例如無菌水或有機溶劑如含水的丙二醇中。其他組合物的制備，包括將抑制劑分散到淀粉或羧甲基纖維素鈉的水溶液或本領域已知的適當?shù)挠椭小Ｔ撛噭┛梢灾委熈渴┯?。所述量在治療哮喘中是有效的。該量可以不同，取決于所使用試劑的活性、哮喘的性質和患者的健康情況。術語“治療有效量”是指某一劑量的治療可以有效地達到所需的治療結果。此外，技術人員將會理解，通過細調(diào)和/或施用超過一種試劑，或通過施用該試劑和抗哮喘化合物(如，皮質類固醇)可以減少或增加試劑的治療有效量。如下文實施例所示，治療有效量很容易即可確定，例如以經(jīng)驗為主以相對較低量開始，然后逐步增加并同時評價有益效果(即暴露于抗原后哮喘癥狀的減少)。當該試劑與載體組合時，試劑的存在量可以是約1％重量到約99％重量，剩余部分由藥學可接受的載體構成。在一些實施方案中，該試劑的存在量是約25％重量到約75％重量。在一些實施方案中，該試劑的存在量是約30％重量到約60％重量。在一些實施方案中，該試劑的存在量是約40％重量到約50％重量。現(xiàn)在將參照具體的實施例來說明本發(fā)明?？梢岳斫猓峁┑膶嵤├怯脕碚f明本發(fā)明的實施方案，而不是對本發(fā)明的范圍進行限定。
實施例1在小鼠肺中與變應性反應有關的基因表達改變?yōu)殍b定由氣管內(nèi)OVA-激發(fā)誘導的基因表達改變，在0天通過腹膜內(nèi)(i.p)注射10μg的卵白蛋白(OVA)(Sigma，St.Louis，MO)的200μl PBS液使Balb/C小鼠(Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME))免疫。在4和25天，用氯胺酮和甲苯噻嗪(分別為45和8mg/kg)的混合物使小鼠麻醉，用50μl 1.5％的OVA溶液或等體積的PBS在氣管內(nèi)激發(fā)。為鑒定IL-l 3介導的信號轉導對mRNA的濃度依賴性，在變應激發(fā)過程前或過程中，三次腹膜內(nèi)注射可溶性IL-l 3受體融合蛋白sIL-l 3Rα2-Fc來處理兩組OVA-激發(fā)的小鼠。作為受體融合蛋白的Fc-部分的對照，類似地用腹膜內(nèi)施用hIgG來處理兩組OVA-激發(fā)的小鼠。第二組的6只對照小鼠類似地對OVA致敏，但隨后并不激發(fā)，并在同一時程中在腹膜內(nèi)單獨施用PBS緩沖液(n＝2)，或還在腹膜內(nèi)注射hIgG(n＝2)或sIL-l 3Rα2-Fc(n＝2)。第二次肺部抗原激發(fā)(28天)78小時后，收集OVA-激發(fā)和單用緩沖液的對照小鼠的肺組織。用液氮冷凍的研缽和研磅將折斷的冷凍小鼠肺組織粉末化，懸浮在6ml 4M異硫氰酸胍/0.7％2-巰基乙醇(GTC/ME)中，脈沖聲處理2分鐘。用酸性平衡苯酚(Promega Total RNA Kit)將該組織混懸液萃取兩次，并用等量的異丙醇沉淀核酸。將片狀沉淀物再懸浮于0.8mlGTC/ME中，用等量的酸性苯酚再萃取兩次，用氯仿萃取一次。RNA是用乙醇沉淀的，并懸浮于DEPC處理的H20中，用OD280定量。根據(jù)Byme，等人，″Preparation of mRNA for expressionmonitoring，″Current Protocols in Molecular Biology John Wiley andSons，Inc.(New York 2000)所述的變化，用Superscript Kit(BRL)從10μg總RNA合成cDNA。第一標準合成在50℃進行以阻止核糖體核糖核酸的誤寫入，并使用包含聚-T引物(T7T24)的啟動子用于隨后的體外防腐RNA(crank)的擴增和生物素標記。根據(jù)制造商的說明書使用Biome Carboxyterminated beads(Polysciences)來純化cDNA，并在48μl的10mM乙酸鈉pH7.8中洗脫。體外T7聚合酶驅動轉錄反應來合成和生物素標記反義cRNA，進行Qiagen Rneasy自旋柱純化和cRNA的斷裂。根據(jù)制造商的說明書，在200μl的總體積中，GeneChip雜交混合物包含在1XMES緩沖液中的10μg斷裂的cRNA、0.5mg/ml乙?；腂SA，0.1mg/ml青魚精液DNA。在45℃將反應混合物與Affymetrix Mu11KsubA和Mu11KsubB寡核苷酸陣列雜交18小時。除去雜交混合物，洗滌該陣列，并使用GeneChip流控站400用抗生物素蛋白鏈菌素R-藻紅蛋白(分子探針)染色，根據(jù)制造商的說明書用Hewlett Packard基因陣列掃描器掃描。收集熒光數(shù)據(jù)并用MicroArray Suite 4.0軟件轉變成基因特異性差異平均數(shù)。制作十一員標準曲線的方法，包括以濃度范圍為0.5pM到150pM向各個雜交混合物中摻加來自克隆細菌和噬菌體序列的基因片段。這些標準品代表，假定平均轉錄大小為2kb時RNA的頻率為約百萬分之3.3到1000(ppm)。通過T7聚合酶驅動的IVT反應從基于質粒的模版中合成生物素化的標準曲線片段。粗短刺狀的生物素化RNA片段可以做為內(nèi)標物評價薄片敏感度，和作為標準曲線將測定個體基因得到的熒光差異平均數(shù)轉化成ppm形式的RNA頻率?？梢杂冒ɑ蛱禺愋怨押塑账岬恼_匹配和單錯配探針組合之間的平均熒光差異來確定粗短刺狀標準曲線的頻率值。此外，主要根據(jù)部分個體陽性或陰性應答探針對的第二組算法可以用于評價基因產(chǎn)物的絕對存在或缺失。將個體微陣列的敏感度設置為最小濃度的一半，在最小濃度下存在任意2或3個鄰近的標準曲線粗短刺狀的模版。強制標準曲線線性回歸必須通過0，最小的報道基因頻率設置成個體GeneChip的敏感度。測定每個處理或對照試驗情況的多次獨立性復制物，表達數(shù)據(jù)用于常規(guī)統(tǒng)計分析以努力消除假陽性。開始比較在給定試驗設置下從個體測定中確定的頻率值。比較處理和對照動物的平均值以獲得平均倍差(AFC)。使用含原頻率值的不同協(xié)方差或含log-轉換的頻率值的相同協(xié)方差來計算兩尾t-檢驗。用于鑒定變應原-激發(fā)誘導的基因表達的三個處理組的每一個的全部基因表達在mRNA的完整性、要求存在的基因數(shù)目、和通過不同對照和治療曲線(數(shù)據(jù)未列出)計算的總mRNA頻率方面都達到了良好的平衡。通過腹膜內(nèi)聯(lián)用人IgG或sIL-l 3Rα2-Fc并不足以改變測定PBS處理的對照小鼠的基因表達曲線，因此在計算未處理基線表達的平均值時，將6只對照小鼠的頻率值組合作為一個組。類似地，在計算肺變應原激發(fā)mRNA頻率德平均頻率值時，將腹膜內(nèi)聯(lián)用緩沖液或hIgG處理的4只OVA-激發(fā)小鼠組合作為一個組。數(shù)據(jù)如下表2所示。
表2變應原刺激后RegIIIγ mRNA的頻率值 該數(shù)據(jù)表明RegIIIγ蛋白mRNA是由直接在肺部氣管內(nèi)施用IL-l 3或卵白蛋白誘導的變應性激發(fā)所誘導的。此外，這些數(shù)據(jù)顯示，用可溶性受體拮抗劑(sIL-l 3Rα2-Fc)激活的IL-l 3的抑制作用完全抑制了卵白蛋白激發(fā)的RegIIIγ蛋白的表達。先前利用sIL-l 3Rα2-Fc拮抗劑的生理學研究表明，IL-l 3活性對于哮喘病理學包括上皮粘液產(chǎn)生和AHR是重要的。因此，經(jīng)鑒定，RegIIIγ蛋白是卵白蛋白變應性激發(fā)的IL-l 3敏感基因的下游產(chǎn)物，其可以鑒定治療哮喘的治療劑。這些數(shù)據(jù)證明，腹膜內(nèi)施用可溶性IL-l 3拮抗劑能完全抑制OVA變應性肺RegIII蛋白的誘導作用。先前利用sIL-l 3Rα2-Fc拮抗劑的生理學研究表明，IL-l 3活性對于哮喘病理學包括上皮粘液產(chǎn)生和AHR是重要的。Wills-Karp，M，等人，Science 282(5397)2258-61(1998)。因此，這些數(shù)據(jù)表明，導致抑制RegIIIγ蛋白的治療性介入與減少和哮喘有關的癥狀相關。
實施例2mIL-l 3肺滴注誘導的在小鼠肺中的基因表達改變?yōu)殍b定在肺基因表達中IL-l 3介導的改變，用肺滴入多次的5μg劑量(0，24小時和48小時)的重組mIL-l 3處理6只Balb/C系小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。按相同時間表給第二組對照Balb/C系小鼠(n＝4)只滴注緩沖液。此外，同樣地用多次劑量的mIL13(n＝4)或PBS緩沖液(n＝5)肺部滴注來處理Stat6-/-裸鼠，然后在78小時收集所有的肺，用于制作表達曲線。Stat6-/-是另外的對照；它在IL-l 3信號途徑中是關鍵的中間體，對于粘液產(chǎn)生和AHR是關鍵性的；該IL-l 3信號轉導物的缺失將改善哮喘癥狀。用于鑒定變應原-激發(fā)誘導的基因表達的三個處理組的每一個的全部基因表達在mRNA的完整性、要求存在的基因數(shù)目、和通過不同對照和治療曲線計算的總mRNA頻率方面達到了良好的平衡。數(shù)據(jù)如表3所示。
表3 這些數(shù)據(jù)表明，mRNA濃度的增加是由mIL-l 3肺滴入介導的。
實施例5RegIII蛋白活性的抑制劑的篩選測定的預示性實施例將人RegIII蛋白(例如，hHIP、hPAP)克隆到細菌表達載體中，轉化成大腸桿菌或COS細胞，利用標準分子生物學和生物化學方法通過柱色譜法從細菌或哺乳動物培養(yǎng)基中純化。然后用RegIII蛋白處理初級上皮細胞或上皮細胞系。在與蛋白質接觸后，分析細胞或細胞系中上皮細胞或粘蛋白的增加。通過將上皮細包染色或通過顯微鏡觀察分泌粒的增加來確定它們調(diào)節(jié)(例如，抑制)粘液產(chǎn)生和/或上皮細胞增殖的能力，由此篩選受試試劑。
實施例6包括RegIII蛋白啟動子的RegIII蛋白產(chǎn)生的抑制劑的篩選測定的預示性實施例將RegIII蛋白的蛋白啟動子連接到報道基因，例如熒光素酶上。通過用IL-l 3誘導證明報道基因的激活，表明其轉錄特異性。篩選受試試劑來鑒定其中可以阻斷IL-l 3誘導的報道基因活性的那些。
實施例7用RegIII蛋白抑制劑治療哮喘給經(jīng)診斷患有哮喘的患者施用治療有效量的已知RegIII蛋白的蛋白抑制劑。同樣顯示哮喘癥狀的對照組用安慰劑對照物來治療。施用可以是單個治療或在數(shù)天時間里治療。評估患者的和哮喘有關的癥狀，例如AHR和粘液產(chǎn)生。通過與對照組比較與哮喘有關的癥狀的減少來確定治療的有效性。在附圖和上述的描述中已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的解釋和描述，同樣應當認為只是作為解釋，而不是進行適當?shù)南拗?，應當理解，僅對一些實施方案進行了顯示和描述，因此要求保護在本發(fā)明精神內(nèi)的所有改變和變更。此外，本文引用的所有參考文獻對本領域技術人員都達到了指示的水平，因此將它們整體引入作為參考。
權利要求
1.一種篩選用于在哺乳動物中治療哮喘的試劑的方法，包括(a)將RegIII蛋白與受試試劑接觸；和(b)確定受試試劑是否抑制RegIII蛋白的活性，其中減除RegIII蛋白活性的受試試劑在治療哮喘中是有用的。
2.權利要求1的方法，其中哺乳動物是人。
3.權利要求1的方法，其中哮喘選自特應性哮喘、非特應性哮喘、變應性哮喘、運動誘發(fā)性哮喘、藥物誘發(fā)性哮喘、職業(yè)性哮喘和后期哮喘。
4.權利要求1的方法，其中確定受試試劑是否抑制RegIII蛋白的活性包括進行細胞增殖測定。
5.權利要求4的方法，其中細胞增殖測定選自標記的脫氧胸苷吸收測定、5-溴-2′-去氧尿苷吸收測定、溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-聯(lián)苯四鈉測定、三磷酸腺苷產(chǎn)生測定，或它們的組合。
6.權利要求4的方法，其中細胞選自初級上皮細胞或上皮細胞系。
7.權利要求1的方法，其中RegIII蛋白是哺乳動物的RegIII蛋白。
8.權利要求1的方法，其中RegIII蛋白具有選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列。
9.權利要求1的方法，其中RegIII蛋白的氨基酸序列與選自SEQID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列具有至少約70％同一性。
10.一種篩選用于在哺乳動物中治療哮喘的試劑的方法，包括(a)將編碼與哺乳動物RegIII蛋白啟動子可操作地連接的報道基因產(chǎn)物的核苷酸序列與受試試劑接觸；和(b)確定該試劑是否抑制報道基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中減除RegIII蛋白活性的受試試劑在治療哮喘中是有用的。
11.權利要求10的方法，其中哺乳動物是人。
12.權利要求10的方法，其中哮喘選自特應性哮喘、非特應性哮喘、變應性哮喘、運動誘發(fā)性哮喘、藥物誘發(fā)性哮喘、職業(yè)性哮喘和后期哮喘。
13.權利要求10的方法，其中確定受試試劑是否抑制RegIII蛋白的產(chǎn)生包括定量報道基因產(chǎn)物的量或活性。
14.權利要求10的方法，其中RegIII蛋白啟動子具有SEQ ID NO5的核苷酸序列。
15.權利要求10的方法，其中RegIIIγ蛋白啟動子的核苷酸序列與SEQ ID NO5的核苷酸序列具有至少約80％同一性。
16.權利要求10的方法，其中RegIII蛋白啟動子具有SEQ ID NO6的核苷酸序列。
17.權利要求10的方法，其中RegIII蛋白啟動子的核苷酸序列與SEQ ID NO6的核苷酸序列具有至少約80％同一性。
18.權利要求10的方法，其中報道基因產(chǎn)物選自熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、β-葡糖苷酸酶、堿性磷酸酶、和綠色熒光蛋白。
19.一種治療哮喘的方法，包括給需要治療的哺乳動物施用治療量的降低哺乳動物RegIIIγ蛋白活性的試劑。
20.權利要求19的方法，其中哺乳動物是人。
21.權利要求19的方法，其中治療哮喘是通過選自降低AHR、降低粘液產(chǎn)生過多、降低血清IgE水平、和降低氣道嗜酸性粒細胞過多的方法來完成的。
22.權利要求19的方法，其中降低哺乳動物RegIII蛋白活性的試劑是sIL-l 3Ra2-Fc。
23.權利要求19的方法，其中哺乳動物的RegIII蛋白是由選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的核苷酸序列編碼的。
24.權利要求19的方法，其中哺乳動物的RegIII蛋白是由與選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的核苷酸序列具有至少約70％同一性的核苷酸序列編碼的。
25.一種治療哮喘的方法，包括給需要的哺乳動物治療量的減少哺乳動物RegIII蛋白產(chǎn)生的試劑。
26.權利要求25的方法，其中減少RegIII蛋白產(chǎn)生的試劑是核酸。
27.權利要求26的方法，其中核酸是核糖核酸。
28.權利要求27的方法，其中核糖核酸具有的核苷酸序列與SEQID NO或SEQ ID NO3所列的用于編碼RegIII蛋白的核苷酸序列的一部分互補。
29.權利要求27的方法，其中核糖核酸是干擾RNA。
30.權利要求25的方法，其中哺乳動物是人。
31.權利要求25的方法，其中該抑制劑在藥學可接受的載體中施用。
全文摘要
提供篩選用于治療哮喘的試劑的方法。該方法包括篩選降低RegIII蛋白產(chǎn)生或活性的試劑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RegIII蛋白在產(chǎn)生與哮喘有關的癥狀或病理并發(fā)癥中發(fā)揮作用。也提供治療哮喘的方法，以及篩選和用RegIII蛋白的抑制劑治療。
文檔編號A61K39/385GK1964987SQ200580018284
公開日2007年5月16日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權日2004年6月4日
發(fā)明者M·福萊蒂, D·D·唐納森 申請人:惠氏公司