專利名稱：包含高分子量peg－樣化合物的治療輸送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及給哺乳動物例如人輸送或施用治療化合物和組合物的材料和方法。
背景醫(yī)療保健不可否認地是現(xiàn)代社會和個體的根本關(guān)注問題之一，大量金錢和努力被用于確保持續(xù)發(fā)展。結(jié)果已經(jīng)穩(wěn)定地發(fā)展，發(fā)達國家引導(dǎo)著提供日益增多種類的治療化合物的潮流，以治療永遠增加數(shù)量的被視作一種生命形式或另一種(包括人類)的痛苦的疾病、障礙和狀況。但是，隨著我們對健康的理解的增加，保健職業(yè)已經(jīng)逐漸意識到由需要保健的生命形式強加的限制。例如，哺乳動物具有內(nèi)部器官系統(tǒng)、器官和組織，各自具有特征大小、位置和組構(gòu)。該復(fù)雜的內(nèi)部解剖學(xué)會限制向需要的細胞輸送有效量的活性治療劑的能力。對健康細胞的毒害作用和經(jīng)濟學(xué)典型地會排除全身輸送大量的治療劑。結(jié)果，已經(jīng)付出了大量的努力，來開發(fā)輸送治療劑的靶向方案?，F(xiàn)在，這些方案已經(jīng)產(chǎn)生了多功能的、成本經(jīng)濟的治療化合物的靶向作用。另外，靶向藥物輸送的許多方案不能克服這樣的藥物為達到它們在待治療的生物體積內(nèi)的靶位所必須進行的內(nèi)部行程產(chǎn)生的危害。即使當(dāng)適當(dāng)?shù)匕邢驎r，不穩(wěn)定的藥物也會在血流、胃腸道、淋巴系統(tǒng)和身體的細胞外間隙中喪失效力。
對于許多治療劑，尤其是基于蛋白的治療劑，基本形式的保護是提供保護，通過輸送更穩(wěn)定的在體內(nèi)激活的前藥化合物，或通過穩(wěn)定含有治療劑的溶液的pH。前藥方法需要昂貴的且不可預(yù)知的研究，以在個案的基礎(chǔ)上鑒別候選化合物。穩(wěn)定實際的治療劑，例如通過pH穩(wěn)定化，已經(jīng)導(dǎo)致了許多種類緩沖系統(tǒng)的開發(fā)，多種這樣的緩沖劑能與治療的生物的體內(nèi)環(huán)境相容。通過包含穩(wěn)定化合物，例如牛血清白蛋白、酪蛋白等，也能促進穩(wěn)定化。但是，這些方法需要開發(fā)能與給定的治療劑相容且有效的緩沖劑，而穩(wěn)定劑的加入會增加成本，并需要探索以確保穩(wěn)定劑不會妨礙希望的治療活性或具有其它毒害后果(例如，免疫原性)。
另一種類型的穩(wěn)定劑被共價地結(jié)合到治療劑例如蛋白治療劑上。例如，已經(jīng)報道，通過將聚乙二醇分子(例如，1-20kD，典型地3-5kD)共價結(jié)合到蛋白上而使蛋白PEG化，會提高這些治療劑的穩(wěn)定性。Cantin等，Am.J.27659-665(2002)；Specialty ChemicalsMagazine，news article ID 7430(March 25，2004)；Goldenberg，P & T 27(12)619-621(2002)。但是，這些改進需要技巧，會增加治療劑的成本，并需要小心的測試，以確保能保持有意義的治療活性，而不導(dǎo)入有害的體內(nèi)繼發(fā)效應(yīng)。穩(wěn)定化合物例如PEG(3-5kD，例如，GoLytely)也已經(jīng)用在含有治療劑的溶液中。還已經(jīng)將GoLytely(3,340kD)本身用作例如緩瀉藥。低分子量PEG(例如，3-12kD)的加入，并不總能達到醫(yī)學(xué)界尋求的結(jié)果。因而，LMW PEG向含有治療劑的溶液中的添加，包含著附加的成本，必須進行測試，以確保其功效和無毒性，并缺少確信可將其應(yīng)用擴展至新治療劑所需的多能性。
關(guān)于高分子量PEG組合物(例如，20kD)，Hauet等，Kidney Int.62(2)654-667(2002)已經(jīng)報道了含有20kD PEG的溶液在移植前保藏供體腎的應(yīng)用，產(chǎn)生報道的局部缺血/再灌注損傷的減少。但是，未在體內(nèi)施用20kD PEG的溶液。還已經(jīng)將HMW PEG共價地結(jié)合到若干生物相容的化合物中的任一種上，以合成用于形成可生物降解的納米球的雙嵌段聚合物。Gref等，Science 2631600-1603(1994)。預(yù)期納米球會用于體內(nèi)用途，但是這樣的納米球僅僅含有共價結(jié)合到生物相容的化合物上的HMW PEG，所述生物相容的化合物是確保該球可生物降解所必需的。納米球，與其它潛在的體內(nèi)分子載體(例如，脂質(zhì)體，粘性塑料，多糖水凝膠)一樣，典型地通過將治療劑隔離在載體內(nèi)部，稍微從被治療的生物的體內(nèi)環(huán)境移出，為治療劑提供穩(wěn)定性和保護的措施。但是，基于載體的穩(wěn)定治療劑的方法包含相當(dāng)大的開發(fā)成本，這必須獲得回報，以及在制備和輸送含有治療劑的載體時可觀的支出?；谳d體的方法還會犧牲治療劑本身的任何靶向功能，尚未解決這些技術(shù)的靶向組織。而且，載體的使用，會增加載體處理的附加問題，其必須設(shè)計成可被清除或降解，但是必須直到已經(jīng)輸送了治療劑負荷才發(fā)生。因而，本領(lǐng)域仍然存在對輸送治療劑的多功能方法的需要，其能保留功效，或穩(wěn)定甚至不穩(wěn)定的藥物，允許這樣的化合物在喪失它們的治療價值之前達到它們的預(yù)期作用部位。
在大多數(shù)(如果不是全部)情況下，輸送活性治療劑的目的在于治療、改善或預(yù)防生物中的機能障礙(例如，疾病、障礙或狀況)。癌癥、細胞變性疾病(例如，阿爾茨海默氏病)，和細菌性膿毒病是這些類型的機能障礙中的代表，其可以(且經(jīng)常)上升到重大健康關(guān)注問題的水平。不希望受理論的約束，在機能障礙之前的時間穩(wěn)定細胞的直接環(huán)境，可能在延遲、改善或預(yù)防這樣的疾病、障礙或狀況的產(chǎn)生方面具有積極的治療作用。因而，除了本領(lǐng)域前述的對輸送活性治療劑的多功能系統(tǒng)的需要外，本領(lǐng)域仍然需要能穩(wěn)定處于機能障礙危險中的細胞的體內(nèi)環(huán)境的組合物、方法和系統(tǒng)。
微生物-介導(dǎo)的上皮障礙或異常狀況，呈現(xiàn)出對人類和動物的健康的顯著威脅，造成全世界醫(yī)療保健系統(tǒng)的負擔(dān)。這樣的障礙的一個實例，腸-衍生的膿毒病，是生物(例如人患者)中死亡率的主要原因，所述生物患有多種疾病、障礙或痛苦中的任一種，例如燒傷，新生兒小腸結(jié)腸炎，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，炎性腸病，和移植后的器官排斥。長期以來將腸道病原體庫公認為細菌-介導(dǎo)的膿毒病的潛在致死病灶，例如在病危的住院患者中。微生物病原體例如假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌)擾亂腸上皮屏障的調(diào)節(jié)功能的能力，可能是能造成腸-衍生的膿毒病的條件致病微生物中的限定特征。在許多這樣的感染中，已經(jīng)將銅綠假單胞菌鑒別為成因病原體。重要的是，已經(jīng)證實腸道是條件致病菌例如銅綠假單胞菌定殖的主要部位。
預(yù)防或治療微生物-介導(dǎo)的上皮障礙例如腸-衍生的膿毒病的常規(guī)治療方法已經(jīng)遇到不完全的成功?；诳股氐姆椒ㄒ螂y以以不會影響剩余的腸道菌群的方式使抗生素特別針對腸病原體而受到削弱。另外，許多腸病原體，如銅綠假單胞菌所示例的，經(jīng)常變得對抗生素攻擊耐受，導(dǎo)致昂貴的、進行的和不完全成功的預(yù)防或治療方法。免疫治療方法也存在問題，特別是，許多腸病原體例如銅綠假單胞菌是免疫逃避的，導(dǎo)致這樣的方法效力極低。
預(yù)防或治療障礙例如腸-衍生的膿毒病的另一種方法是腸道清洗。在過去的幾年中，已經(jīng)嘗試了使用聚乙二醇(PEG)溶液的腸道清洗，有些無對照的報道表明，PEG可能在許多臨床的和實驗的環(huán)境下，表現(xiàn)出治療腸-衍生的膿毒病的一定前途。這些溶液中的PEG具有3,500道爾頓的平均分子量，且溶液是市場上可得到的(例如，Golytely)。尚不清楚這些相對較低分子量(LMW)的PEG溶液提供治療或預(yù)防腸-衍生的膿毒病的治療益處的機理。典型地，這些溶液用于洗滌或沖洗罹患腸-衍生的膿毒病或處于其發(fā)生危險中的生物的腸道。作為向腸道施用這些LMW PEG溶液的結(jié)果，根據(jù)濃縮方法和使用的化合物的分子量，經(jīng)處理的腸中的菌群組成發(fā)生可變的變化。例如，具有超過約20％的PEG濃度的溶液，可以產(chǎn)生殺死微生物的作用，導(dǎo)致逆境宿主腸道中潛在保護性微生物的消除。并且，低分子量PEG的溶液，會喪失它們的減弱某些生物的毒力能力的功效，盡管保留這些生物。因此，本領(lǐng)域需要一種溶液，它能抑制微生物的毒力表達(微生物的有害性質(zhì))，而不殺死該微生物或附近的微生物，從而提供保存腸道微生物群的天然生態(tài)系統(tǒng)的益處。例如，天然菌群組成的保存，會提供與否則會在腸內(nèi)定殖的條件致病菌的競爭。
伴隨著菌群組成的變化，生物的生理學(xué)也變化。通過測定任意數(shù)目的特征酶活性，例如乳酸脫氫酶水平，可以監(jiān)測這些生理學(xué)變化。結(jié)果，對腸的LMW PEG處理，會在經(jīng)處理的生物中產(chǎn)生生理學(xué)的顯著變化，對經(jīng)處理的生物的健康和康樂具有不可預(yù)知的、且因而潛在有害的長期后果。而且，這樣的處理會在病危的生物例如住院的人類患者中引起大量腸排泄形式的體力要求高的反應(yīng)。
因而，本領(lǐng)域仍然還需要提供一種組合物，其能有效地預(yù)防或治療微生物-介導(dǎo)的上皮障礙(例如，腸-衍生的膿毒病)和/或與這樣的障礙有關(guān)的癥狀，以及通過顯著改變經(jīng)治療的生物的生理學(xué)，實現(xiàn)這樣的益處而不產(chǎn)生其它并發(fā)癥的可能性的方法。
發(fā)明概述通過提供高分子量(HMW)聚乙二醇-樣組合物，其能提供輸送活性治療劑的穩(wěn)定環(huán)境，或者它自身能提供針對特征在于處于發(fā)生微生物-介導(dǎo)的障礙的危險中的上皮表面的異常狀況的有效保護，本發(fā)明滿足了至少一個上述的本領(lǐng)域的需要。適用于在HMW PEG-樣化合物中穩(wěn)定輸送的示例性的治療劑包括蛋白和肽治療劑以及小分子治療劑。HMWPEG-樣化合物為其提供治療益處的示例性的異常狀況包括腸-衍生的膿毒病，與腸內(nèi)菌群有關(guān)的其它腸障礙/疾病，其歸因于腸病原體，包括但不限于銅綠假單胞菌，和哺乳動物例如人類的上皮細胞的多種疾病、障礙和狀況。示例性的HMW PEG-樣化合物是HMW PEG。HMW PEG能抑制或阻止銅綠假單胞菌等病原體接觸腸上皮表面。另外，高分子量PEG會抑制對多種信號(可能涉及數(shù)量(quorum)-感知信號傳遞網(wǎng)絡(luò))作出響應(yīng)的這些病原體(例如，銅綠假單胞菌)中的毒力表達。HMWPEG-樣化合物(例如，HMW PEG)限制腸病原體和腸上皮之間的感染界面的能力，會提供預(yù)防或治療腸-衍生的膿毒病的替代方法，例如在分解代謝應(yīng)激后。重要的是，使用HMW PEG-樣化合物的治療，是節(jié)省成本的，且能相對簡單地在人患者以及多種其它生物例如農(nóng)業(yè)上重要的家畜(例如，牛，豬，綿羊，山羊，馬，雞，火雞，鴨，鵝，等)、寵物和動物園動物上進行。
本發(fā)明的一個方面提供了一種產(chǎn)品，其包含標(biāo)簽包裝材料和有效量的包含在包裝材料中的高分子量聚乙二醇-樣(HMW PEG-樣)化合物，其中所述包裝材料包含標(biāo)簽或包裝說明書，它指示HMW PEG-樣化合物可以用于治療、改善或預(yù)防特征在于異常的上皮細胞的狀況，例如發(fā)炎的上皮或包含屏障機能障礙的上皮。HMW PEG-樣化合物可以是多種高分子量化合物中的任一種，例如陽離子型聚合物，聚鏈烷、聚烯烴或聚烷撐二醇(例如，HMW聚丙二醇，HMW聚乙二醇(HMW PEG)，或其混合物)，HMW PEG的衍生物，例如HMW聚甲氧基PEG，HMW單甲氧基PEG，HMW聚丙二醇，或其混合物。另外，HMW PEG-樣化合物可以是任一種前述的化合物，其還包含至少一個共價結(jié)合的官能團，例如直鏈C1-C10烷氧基(例如，甲氧基)，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基，或其混合物。所述產(chǎn)品的化合物還可以包含接頭例如直鏈C1-C10烷基，有支鏈的C1-C10烷基，芳基(例如，苯基)，或其混合物。產(chǎn)品也可以包含在溶液中的HMW PEG-樣化合物，例如水溶液，其中HMW PEG-樣化合物以至少5％(w/v)、或10％至20％(w/v)的濃度存在。根據(jù)本發(fā)明的HMW PEG-樣化合物的平均分子量大于12,000道爾頓，或是至少15,000道爾頓，或大于15,000道爾頓且小于20,000道爾頓。
根據(jù)權(quán)利要求1的本發(fā)明的產(chǎn)品的標(biāo)簽包裝材料，其中所述標(biāo)簽提供了施用化合物來治療、改善或預(yù)防特征在于異常的上皮細胞的狀況例如上皮炎癥或上皮屏障機能障礙的說明。更具體地，本發(fā)明包含這樣的狀況腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合。另外，該狀況可以是免疫障礙例如白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙，和其混合或組合。用于治療、改善或預(yù)防炎性腸病的產(chǎn)品，可以用于治療、改善或預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎，克羅恩病和其混合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了如上所述的產(chǎn)品，其還包含治療有效量的治療劑。更具體地，本發(fā)明包括任意的可以用于治療、改善或預(yù)防上皮細胞的疾病、障礙或狀況的治療劑，這樣的治療劑包括但不限于，益生微生物制劑，源自至少一種益生微生物的組合物，鎮(zhèn)痛化合物，抗炎化合物，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑，抗生素，抗癌劑，抗?jié)儎?，生長因子，細胞因子，蛋白激素，三葉蛋白和其混合。示例性的治療劑包括5-氨基水楊酸，包含5-氨基水楊酸部分的化合物，皮質(zhì)類甾醇，甲氨蝶呤，6-巰基嘌呤，環(huán)孢菌素，萬古霉素，甲硝唑，頭孢菌素，紫杉烷，包含紫杉烷部分的化合物，喜樹堿，包含喜樹堿部分的化合物，5-氟尿嘧啶，包含5-氟尿嘧啶部分的化合物，抗雄激素化合物，抗雌激素化合物，表皮生長因子，腸三葉因子，胰島素，生長抑素，干擾素和其混合。在有些實施方案中，治療劑是益生乳酸菌，例如，乳桿菌GG(LGG)，唾液鏈球菌嗜熱亞種，干酪乳桿菌，植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌，德氏乳桿菌保加利亞亞種，長雙歧桿菌，嬰兒雙岐桿菌，或短雙歧桿菌，和其混合或組合(例如，VSL#3)，或源自任一種這樣的細菌的化合物或組合物。
本發(fā)明的另一個方面涉及給需要的對象的上皮施用治療組合物的方法，包括施用包含HMW PEG-樣化合物和有效量的治療劑的組合物。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品，適用于該方法的治療劑包括但不限于，益生微生物制劑，源自至少一種益生微生物的組合物，鎮(zhèn)痛化合物，抗炎化合物，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑，抗生素，抗癌劑，抗?jié)儎?，生長因子，細胞因子，蛋白激素，三葉蛋白和其混合。示例性的治療劑包括5-氨基水楊酸，包含5-氨基水楊酸部分的化合物，皮質(zhì)類甾醇，甲氨蝶呤，6-巰基嘌呤，環(huán)孢菌素，萬古霉素，甲硝唑，頭孢菌素，紫杉烷，包含紫杉烷部分的化合物，喜樹堿，包含喜樹堿部分的化合物，5-氟尿嘧啶，包含5-氟尿嘧啶部分的化合物，抗雄激素化合物，抗雌激素化合物，表皮生長因子，腸三葉因子，胰島素，生長抑素，干擾素和其混合。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，HMW PEG-樣化合物是HMW PEG(例如，HWM PEG 15-20kD)?？梢韵蚱涫┯弥委焺┑纳掀ぐǖ幌抻?，腸粘膜，肺粘膜，鼻粘膜，尿道粘膜，食道粘膜，口腔粘膜和皮膚。在有些實施方案中，向其施用治療劑的對象是哺乳動物，例如人。本發(fā)明的該方面包含本領(lǐng)域已知的任何施用方法，包括經(jīng)口施用，直腸施用，腸道清洗，局部施用，靜脈內(nèi)注射，腹膜內(nèi)注射，尿道內(nèi)施用，陰道施用，套管插入術(shù)和輔助的或無輔助的呼吸。在本發(fā)明的該方面的多種實施方案中，治療劑是蛋白性的化合物。該方法也可以包括施用有效量的PA-I凝集素/粘附素，例如，銅綠假單胞菌PA-I凝集素/粘附素；對于包括施用蛋白性的治療劑的方法，特別地預(yù)期PA-I凝集素/粘附素的施用。
本發(fā)明的另一個方面涉及治療對象中微生物-介導(dǎo)的上皮狀況的方法，其包括給需要的對象施用有效量的HMW PEG-樣化合物，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMW PEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。HMW PEG-樣化合物可以在包含至少10％且小于20％HMW PEG-樣化合物(w/v)的水溶液中。對象可以是哺乳動物，例如人。上皮可以是腸粘膜，肺粘膜，鼻粘膜，尿道粘膜，陰道粘膜，食道粘膜，口腔粘膜或皮膚。在實施本發(fā)明的該方面時，可以通過本領(lǐng)域已知的任何途徑，包括經(jīng)口施用，直腸施用，陰道施用，向腸施用，局部施用，靜脈內(nèi)注射，腹腔內(nèi)注射，套管插入術(shù)和輔助的或無輔助的呼吸，施用HMW PEG-樣化合物。適于通過本發(fā)明的該方面治療的狀況包括但不限于，腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合。在一個有關(guān)的方面，本發(fā)明包括向需要的對象施用有效量的HMW PEG-樣化合物的方法，以治療這樣的狀況如白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙，和其混合或組合。在本發(fā)明的這兩個方面，HMWPEG-樣化合物可以是HMW PEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的官能團例如直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。無論是否由微生物誘發(fā)，適于治療的狀況包括腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合或組合。特別地包括對例如下述狀況的治療白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙和其混合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了改善任一種上述狀況的癥狀的方法，包括給需要的對象施用有效量的HMW PEG-樣化合物，其中所述HMWPEG-樣化合物是HMW PEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。
本發(fā)明的另一個方面涉及預(yù)防狀況的方法，包括給需要的對象施用有效量的HMW PEG-樣化合物，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMWPEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。本發(fā)明包括預(yù)防例如下述狀況的方法腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合或組合。
本發(fā)明的另一個方面涉及如上所述的HMW PEG-樣化合物在制備用于治療諸如下述狀況的藥物中的應(yīng)用炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合或組合。特別地包括用于制備治療與下述疾病有關(guān)的狀況的藥物的化合物免疫障礙，例如白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙和其混合或組合。
本發(fā)明的另一個方面提供了減小具有異常狀況、包括疾病狀況的動物的死亡可能性的方法，所述狀況包括處于發(fā)生選自下述的微生物-介導(dǎo)的障礙的危險中的上皮表面腸-衍生的膿毒病，燒傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，炎性腸病，腸病，移植排斥，囊炎，和pig belly，該方法包括給需要的動物施用有效劑量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。合適的動物包括但不限于，狗，貓，綿羊，山羊，牛，豬和人。在前述的方法中，PEG優(yōu)選地具有至少15,000道爾頓的平均分子量，優(yōu)選5,000至20,000道爾頓，或15,000至20,000道爾頓。還優(yōu)選地，PEG具有6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000和25,000道爾頓的平均分子量。而且，PEG可以在包含5-20％PEG、優(yōu)選10-20％PEG(例如，10％PEG)的水溶液中。在該方法的一個實施方案中，所述狀況與腸中存在銅綠假單胞菌生物有關(guān)，且這樣的銅綠假單胞菌的細胞膜完整性無可檢測到的改變。在該方法的另一個實施方案中，銅綠假單胞菌的生長模式無可檢測到的改變。
本發(fā)明的另一個方面是抑制腸-衍生的膿毒病的方法，包括使哺乳動物上皮例如腸接觸聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的平均分子量。在該方法的一個實施方案中，哺乳動物的腸接觸PEG至少30分鐘。
本發(fā)明的其它方面包括抑制上皮病原體(例如，腸病原體)中的PA-I凝集素/粘附素表達的方法，包括給有此需要的動物施用有效劑量的聚乙二醇；抑制上皮-誘導(dǎo)的(例如，腸上皮-誘導(dǎo)的)PA-I凝集素/粘附素的激活的方法，包括給有此需要的動物施用有效劑量的聚乙二醇；抑制C4-HSL-誘導(dǎo)的上皮病原體(例如，腸病原體)的形態(tài)學(xué)變化的方法，包括給有此需要的動物施用有效劑量的聚乙二醇；減少上皮病原體(例如，腸病原體)中的毒力表達的方法，包括給有此需要的動物施用有效劑量的聚乙二醇；減少或預(yù)防上皮表面與微生物毒力因子相互作用的方法，包括給有此需要的動物施用有效劑量的聚乙二醇；通過預(yù)防致病性的數(shù)量-感知激活的形成，改善上皮(例如，腸)發(fā)病的方法，包括給有此需要的動物施用有效劑量的聚乙二醇；和抑制脊椎動物上皮(例如，腸上皮)和細菌例如假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌)之間的相互作用的方法，包括使上皮接觸聚乙二醇。在本發(fā)明的所有這些方面，PEG具有至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的平均分子量。
本發(fā)明的另一個方面是抑制銅綠假單胞菌-誘導(dǎo)的哺乳動物上皮層(例如腸上皮層)的跨上皮電阻的減小的方法，包括使(腸)上皮層接觸聚乙二醇，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的平均分子量。優(yōu)選地，PEG具有15,000至20,000道爾頓的平均分子量。在一個優(yōu)選的實施方案中，微生物(例如，銅綠假單胞菌)的膜的完整性無可檢測到的改變。
本發(fā)明的另一個方面是抑制細菌細胞向哺乳動物上皮(例如哺乳動物的腸)的粘附的方法，包括使腸接觸聚乙二醇，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的平均分子量。同樣對于該方法，PEG優(yōu)選地具有15,000至20,000道爾頓的平均分子量。PEG可以在包含5-20％PEG、優(yōu)選5-10％PEG的水溶液中。預(yù)期適于通過該方法抑制粘附的示例性的細菌細胞是假單胞菌，例如銅綠假單胞菌。
本發(fā)明的另一個方面是減少細菌細胞中PA-I凝集素/粘附素的表達的方法，包括使細菌細胞接觸聚乙二醇，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓、優(yōu)選15,000道爾頓的平均分子量，且優(yōu)選地為15,000至20,000道爾頓。另外，PEG可以在包含5-20％PEG、優(yōu)選5-10％PEG的水溶液中。
在另一個方面，本發(fā)明提供了減小動物死亡的可能性的方法，所述動物表現(xiàn)出微生物-介導(dǎo)的選自下述的上皮障礙腸-衍生的膿毒病，燒傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，炎性腸病，腸病(例如，在危重病中)，移植排斥，囊炎和pig belly，包括施用有效量的化合物(例如，PEG)，其能粘附到選自哺乳動物腸上皮細胞和腸細菌細胞的細胞上，其中所述化合物以地形學(xué)上不勻稱的方式粘附到細胞上，從而抑制哺乳動物腸上皮細胞和細菌細胞的相互作用。優(yōu)選的化合物是表面活性劑。在該方法的一個實施方案中，化合物是PEG，優(yōu)選地具有至少15,000道爾頓的平均分子量。在該方法的另一個實施方案中，通過原子力顯微鏡測定抑制。在該方法的另一個實施方案中，細菌細胞是腸病原體，它的生長特征沒有可檢測的變化。在一個有關(guān)的方面，該方法還包括將有效量的葡聚糖導(dǎo)入動物腸內(nèi)，和/或?qū)⒂行Я康腖-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，一種或多種低聚果糖，N-乙酰基-D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖和半乳糖，乳果糖和本領(lǐng)域已知的平衡緩沖劑和穩(wěn)定劑，導(dǎo)入動物腸內(nèi)。當(dāng)一起作為單一組合物施用時，該多組分單溶液給藥將處理和準(zhǔn)備預(yù)期破壞腸道菌群和腸屏障功能的腸道，例如發(fā)生在嚴(yán)重的分解代謝-、手術(shù)-和外傷-型應(yīng)激后。
本發(fā)明的另一個方面是改善與源自上皮的異常狀況或其特征性的任何疾病或狀況(例如腸-衍生的膿毒病)有關(guān)的癥狀的方法，包括給腸施用聚乙二醇，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的平均分子量，優(yōu)選地為15,000至20,000道爾頓。PEG可以在包含5-20％PEG、優(yōu)選5-10％PEG的水溶液中。本發(fā)明包括改善與本文公開的任何疾病或狀況有關(guān)的癥狀。
本發(fā)明的另一個方面是預(yù)防動物喪失泌乳能力的方法，所述動物表現(xiàn)出處于發(fā)生微生物-介導(dǎo)的影響乳汁輸出的障礙危險中的乳腺上皮表面形式的異常狀況，包括給乳腺的上皮表面施用(例如，局部地)有效劑量的至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的聚乙二醇。示例性的動物包括哺乳動物，例如綿羊，山羊，母牛，豬，馬和人。在一個有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了治療動物喪失泌乳能力的方法，所述動物的特征在于微生物-介導(dǎo)的影響乳汁輸出的乳腺上皮表面的障礙，包括給乳腺施用(例如，局部地)有效劑量的至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的聚乙二醇。在另一個有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了預(yù)防哺育年齡的動物發(fā)生微生物-介導(dǎo)的上皮障礙的方法，包括給動物施用有效劑量的至少5,000道爾頓、優(yōu)選至少15,000道爾頓的聚乙二醇。合適的動物包括哺乳動物，例如人，家畜，家養(yǎng)的寵物，和動物園動物。在一個實施方案中，將PEG與本領(lǐng)域已知的任意嬰兒配方相混合。
本發(fā)明的一個有關(guān)的方面是包含嬰兒配方和聚乙二醇(PEG)的組合物，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。同樣，可以使用本領(lǐng)域已知的任意的嬰兒配方，包括基于哺乳動物奶(例如牛奶、羊奶等)的配方，以及基于豆?jié){的配方。配方還可以富含任意的維生素和/或元素，包括強化鐵。PEG優(yōu)選地具有至少15,000道爾頓的平均分子量，優(yōu)選地在嬰兒或幼兒配方的重配或水合后，以5-20％的范圍存在。本發(fā)明還提供了給動物(優(yōu)選地為哺育年齡)提供營養(yǎng)的方法，包括給動物施用有效劑量的包含嬰兒配方和PEG的組合物。
本發(fā)明的另一個方面是藥物組合物，其包含平均分子量為至少5,000道爾頓、優(yōu)選15,000道爾頓的聚乙二醇，和合適的佐劑，載體或稀釋劑。在一個有關(guān)的方面，組合物還包含選自下述的化合物葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，一種或多種低聚果糖，N-乙?；?D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖和半乳糖，乳果糖和本領(lǐng)域已知的平衡緩沖劑和穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的另一個方面是用于治療性治療或預(yù)防特征在于處于發(fā)生微生物-介導(dǎo)的障礙(例如腸-衍生的膿毒病)危險中的上皮表面的異常狀況的試劑盒，其包含上述的藥物組合物之一和描述該組合物在治療性治療或預(yù)防該異常狀況中的應(yīng)用的說明書。適于包含在試劑盒中的說明書描述了任一種本文公開的治療或預(yù)防方法。
本發(fā)明的其它方面涉及預(yù)防特征在于處于微生物-介導(dǎo)的障礙(包括疾病)危險中的上皮表面的異常狀況的方法。例如，本發(fā)明包括預(yù)防疾病或異常狀況的方法，包括給動物施用包含有效劑量的聚乙二醇(PEG)的組合物，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。本發(fā)明的預(yù)防方法適用的合適的疾病或異常狀況選自游泳耳病，急性中耳炎，慢性中耳炎，呼吸器相關(guān)性肺炎，腸-衍生的膿毒病，壞死性小腸結(jié)腸炎，抗生素-誘導(dǎo)的腹瀉，假膜性結(jié)腸炎，炎性腸病，易激性腸病，中性粒細胞減少性小腸結(jié)腸炎，胰腺炎，慢性疲乏綜合征，生態(tài)失調(diào)綜合征，鏡下結(jié)腸炎，慢性泌尿道感染，性傳播疾病，和感染。適合作為這樣的預(yù)防方法的對象的動物選自狗，貓，綿羊，山羊，牛，豬，雞，馬和人。PEG優(yōu)選地具有至少15,000道爾頓的平均分子量；還優(yōu)選地是具有15,000至20,000道爾頓的平均分子量的PEG。而且，PEG可以在包含10-20％PEG、優(yōu)選10％PEG的水溶液中。施用的組合物還可以包含選自下述的介質(zhì)液體溶液，局部的凝膠，和適用于噴霧的溶液。另外，組合物還可以包含選自下述的化合物葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，低聚果糖，N-乙?；?D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。在一個實施方案中，組合物包含PEG，葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，低聚果糖，N-乙?；?D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。
本發(fā)明的另一個方面是預(yù)防皮膚感染的方法，包括給動物應(yīng)用包含有效量的聚乙二醇(PEG)的組合物的步驟，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。組合物還可以包含選自下述的介質(zhì)軟膏劑，乳霜劑，凝膠和洗劑。本發(fā)明預(yù)期，造成感染的因子選自炭疽芽孢桿菌，天花病毒，腸致病性大腸桿菌(EPEC)，腸出血性大腸桿菌(EHEC)，腸聚集性大腸桿菌(EAEC)，艱難梭菌，輪狀病毒，銅綠假單胞菌，粘質(zhì)沙雷菌，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytocia)，陰溝腸桿菌，白色念珠菌和Candida globrata。
本發(fā)明的另一個方面是預(yù)防呼吸道感染的方法，包括給動物施用有效量的聚乙二醇(PEG)的步驟，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。本發(fā)明的預(yù)防方法適用的呼吸道感染可能起因于通過本領(lǐng)域已知的任何途徑與感染因子的接觸，包括與呼吸器有關(guān)的肺炎(例如，呼吸器相關(guān)性肺炎)，空氣傳播的感染因子，在霧狀液體中(例如通過噴嚏)分散的感染因子等。在有些實施方案中，該方法能預(yù)防選自炭疽芽孢桿菌和天花病毒的因子造成的呼吸道感染。
本發(fā)明的另一個方面是為預(yù)防慢性泌尿道感染而沖洗泌尿道的至少一部分的方法，包括給尿道輸送有效量的包含PEG的組合物的步驟，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。在一個實施方案中，將組合物施用給至少包括膀胱的泌尿道的一部分。
本發(fā)明的另一個方面是預(yù)防性傳播疾病的方法，包括向避孕套應(yīng)用聚乙二醇(PEG)的步驟，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。本發(fā)明的一個有關(guān)的方面是包含至少部分PEG涂層的避孕套，所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。另一個有關(guān)的方面是試劑盒，其包含避孕套和具有至少5,000道爾頓的平均分子量的聚乙二醇(PEG)。
本發(fā)明也包括預(yù)防消化道障礙的方法，包括給有此需要的動物施用有效劑量的包含聚乙二醇(PEG)的組合物，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量。本發(fā)明的預(yù)防方法適用的示例性的消化道障礙可以選自新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，抗生素-誘導(dǎo)的腹瀉，假膜性結(jié)腸炎，炎性腸病，易激性腸病，中性粒細胞減少性小腸結(jié)腸炎，胰腺炎，生態(tài)失調(diào)綜合征和鏡下結(jié)腸炎。
本發(fā)明的另一個方面是監(jiān)測向有此需要的動物施用聚乙二醇(PEG)的方法，包括給有此需要的動物施用有效量的包含標(biāo)記的PEG的組合物，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量，并檢測標(biāo)記的PEG，標(biāo)記的PEG(例如，結(jié)合有微生物)的數(shù)量和/或位置由此提供用于評價施用功效的信息。在監(jiān)測方法的一個實施方案中，標(biāo)記是熒光團(例如，熒光素，羅丹明，Cy3，Cy5)。在該方法的另一個實施方案中，對標(biāo)記的PEG的檢測包含內(nèi)窺鏡檢查。監(jiān)測方法也包括，在糞便樣品中檢測標(biāo)記的PEG(即標(biāo)記的PEG結(jié)合有來源于糞便樣品的組分，例如微生物)。另外，監(jiān)測方法還可以包括施用對微生物特異性的第二標(biāo)記，并檢測第二標(biāo)記。如在此上下文中使用的“特異性”意味著，該標(biāo)記可檢測地與至少一個微生物有關(guān)。
本發(fā)明的另一個方面是監(jiān)測向有此需要的動物施用聚乙二醇(PEG)的方法，包括從接受聚乙二醇的動物得到樣品，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量，使樣品接觸上皮細胞，并測量樣品中的微生物向上皮細胞的粘附，PEG的數(shù)量和/或位置由此提供用于評價施用功效的信息。通過顯微鏡檢查，可以完成測量。
根據(jù)本發(fā)明的另一種監(jiān)測方法是，監(jiān)測向有此需要的動物施用聚乙二醇(PEG)的方法，包括從接受聚乙二醇的動物得到樣品，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量，使上皮細胞層接觸樣品，并測量上皮層的跨-上皮電阻，跨-上皮電阻相對于對照值降低的減少，指示著有效的施用。對照值可以是內(nèi)部的(即在PEG施用前測量TEER)或外部的(即可靠地用于對比的在其它研究中形成的值)。
本發(fā)明的另一種監(jiān)測方法是監(jiān)測向有此需要的動物施用聚乙二醇(PEG)的方法，包括從接受聚乙二醇的動物得到樣品，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量，從該樣品分離微生物，并測量微生物細胞表面的疏水性，樣品中的任何微生物的疏水性由此提供用于評價施用功效的信息。如在此上下文中使用的“分離”指與樣品中的其它組分(例如，固體物質(zhì))分離，足以允許疏水性測量，如本領(lǐng)域會理解的。
本發(fā)明的一個有關(guān)的方面是監(jiān)測聚乙二醇的施用的試劑盒，其包含標(biāo)記的PEG和描述標(biāo)記的PEG在監(jiān)測其施用中的應(yīng)用的方案說明書。合適的方案說明書包括本文公開的或本領(lǐng)域已知的與PEG的施用、輸送或應(yīng)用有關(guān)的任意的方法。在本發(fā)明的該方面的有些實施方案中，試劑盒還包含游離標(biāo)記。
本發(fā)明的另一種監(jiān)測方法是監(jiān)測向有此需要的動物施用聚乙二醇(PEG)的方法，包括從接受聚乙二醇的動物得到樣品，其中所述PEG具有至少5,000道爾頓的平均分子量，和檢測樣品中的PA-I凝集素/粘附素活性，PA-I凝集素/粘附素活性由此提供用于評價施用功效的信息。在該方法的一個實施方案中，通過結(jié)合PA-I凝集素/粘附素結(jié)合配偶體，例如凝集素/粘附素能特異性地結(jié)合的任意已知形式的特異性的抗-PA-1凝集素/粘附素抗體或碳水化合物，檢測PA-I凝集素/粘附素。本發(fā)明的一個有關(guān)的方面是用于監(jiān)測聚乙二醇(PEG)的施用的試劑盒，其包含PA-I凝集素/粘附素結(jié)合配偶體和描述結(jié)合配偶體在檢測樣品中的PA-I凝集素/粘附素中的應(yīng)用的方案說明書。合適的方案說明書包括本文公開的或本領(lǐng)域已知的與PEG的使用有關(guān)的任意的方法。
參考下面的詳細描述，包括附圖和實施例，可以更好地理解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。
附圖簡述

圖1提供了進行假剖腹術(shù)或30％手術(shù)肝切除、然后將銅綠假單胞菌PA27853直接注射進盲腸的小鼠在48小時時的死亡率。小鼠接受30％不流血的左葉肝切除，隨后立即直接盲腸注射1×107cfu/mlPA27853。每組含有7只小鼠。對照小鼠接受假剖腹術(shù)，然后將等量的PA27853注射進盲腸。對于PEG組的小鼠，在盲腸注射前，將1×107cfu/ml PA27853懸浮在PEG 3.35(LMW PEG 3,350)或PEG 15-20(HMWPEG 15,000至20,000道爾頓)中。PEG 15-20的劑量效應(yīng)曲線見小圖b。a.通過Fisher Exact檢驗，確定了PEG 15-20的統(tǒng)計學(xué)上顯著的保護作用(P＜0.001)。b.測得PEG 15-20的最小保護濃度為5％(P＜0.05)。c.在30％手術(shù)肝切除和直接盲腸注射1×107cfu/mlPA27853后24小時，盲腸內(nèi)容物(糞便)、洗過的盲腸粘膜、肝和血液的定量細菌培養(yǎng)。單向ANOVA證實了肝切除后小鼠盲腸內(nèi)容物、粘膜、肝和血液中細菌計數(shù)的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001)。對于PEG3350，觀察到肝和血液細菌計數(shù)的顯著減少(P＜0.05)，而PEG 15-20完全阻止了PA27853向小鼠的肝和血液播散。
圖2顯示了PEG 15-20對PA27853-誘導(dǎo)的上皮屏障機能障礙的保護作用，如通過跨上皮電阻(TEER)所評估的。a.數(shù)據(jù)代表著在頂端暴露于1×107cfu/ml PA278538小時過程中觀察到的一式三份培養(yǎng)物(n＝7)的TEER自基線％最大下降的平均值±SEM。在暴露于PA27853的Caco-2細胞中，證實了TEER的統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低(單向ANOVA(P＜0.001))。對于PEG 15-20，證實了對PA27853誘導(dǎo)的TEER下降的統(tǒng)計學(xué)上顯著的保護作用(P＜0.001)。b.在有PEG 3.35存在且頂端暴露于PA27853的情況下，Caco-2細胞的圖像。共培養(yǎng)4小時后拍攝的圖像，證實了具有漂浮在細胞支架以上30-40微米的細胞的單層完整性的喪失，展示了PA27853向細胞膜的粘附。c.在有PEG 15-20存在下4小時后頂端暴露于PA27853的Caco-2細胞，在任何檢查的平面中沒有表現(xiàn)出漂浮細胞的跡象。
圖3例示了PEG對PA27853中的PA-I表達的抑制作用。a.蛋白印跡分析。PA27853向1mM數(shù)量-感知信號傳遞分子C4-HSL的暴露，導(dǎo)致了PA-I蛋白表達的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001單向ANOVA)，該PA-I蛋白表達在有10％PEG 3.35存在下受到部分抑制，且受到10％PEG 15-20更大得多的抑制。a′.PEG 15-20對C4-HSL-誘導(dǎo)的PA-I表達的最小抑制濃度是5％(P＜0.01)。b.在有和沒有PEG的情況下暴露于C4-HSL的各細菌細胞的電子顯微鏡檢查法證實，C4-HSL造成銅綠假單胞菌的形狀和菌毛表達的形態(tài)學(xué)變化。在有PEG 15-20的情況下，完全消除了C4-HSL-誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)作用，但是PEG 3.35不能。在暴露于PEG 15-20的PA27853周圍，可以看到暈圈-型效應(yīng)。c.RNA印跡雜交。PA27853向0.1mM C4-HSL的暴露，導(dǎo)致PA-I mRNA表達的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001單向ANOVA)，該表達受到10％PEG15-20的極大抑制。d.在有PEG 15-20存在下，通過暴露于Caco-2細胞4小時誘導(dǎo)的PA-I mRNA的增加受到抑制，但是PEG 3.35不能(P＜0.001單向ANOVA)。
圖4顯示了PEG溶液對PA27853的細菌膜完整性和生長模式的作用。a.通過由SYTO 9和碘化丙啶組成的染色方法，評價了2種PEG溶液對細菌膜完整性的作用。兩種PEG溶液對細菌膜滲透性都沒有任何作用。b.與不含PEG的TSB培養(yǎng)基(對照)相比，兩種PEG溶液中的PA27853生長模式表現(xiàn)相同。
圖5顯示了暴露于PEG的Caco-2細胞和細菌細胞的原子力顯微鏡(AFM)圖像。a-c.在只有培養(yǎng)基(a)、含有PEG 3.35的培養(yǎng)基(b)和含有PEG 15-20的培養(yǎng)基(c)存在下，Caco-2細胞的AFM圖像。觀察到PEG 3.35在Caco-2細胞上形成光滑的覆蓋物(b)，而PEG 15-20形成地形學(xué)上更限定的覆蓋物(c)。d-f.PEG 3.35和PEG 15-20中的PA27853的AFM圖像。PEG 3.35在各細菌細胞周圍形成光滑的外膜(e)，而PEG 15-20不但緊抱著各細胞(f)，而且增加聚合物/細菌直徑(g，h)，從而使各細菌彼此遠離。
圖6顯示了PEG溶液對PA27853的分散/成團模式的作用。以63X物鏡放大率，使用具有DIC和GFP熒光濾光鏡的Axiovert100 TV熒光倒置顯微鏡，直接觀察dTC3培養(yǎng)皿中的細菌細胞的分散模式。用Bioptechs恒溫溫度控制系統(tǒng)，調(diào)節(jié)溫度。鎢絲燈(100V)用于DIC和GFP激發(fā)。使用GFP濾光鏡，使用來自Intelligent ImagingInnovations的3D成像軟件(Slldebook)，對Z平面中的細菌細胞分散模式成像。在DIC圖像(6a1)和Z平面重建(6a2)上，觀察到?jīng)]有Caco-2細胞的培養(yǎng)基中的均勻分散的浮游銅綠假單胞菌細胞。在有Caco-2細胞存在下，細菌細胞形成團塊外觀(6b1)，并發(fā)現(xiàn)其粘附到Caco-2細胞上(6b2)。10％PEG 3350減少細菌的運動性，并誘導(dǎo)粘附到孔底部(6c2)的蘑菇狀細菌小菌落(6c1)的立即形成。在有Caco-2細胞存在下，細菌小菌落是在上皮細胞平面以上8微米的量級(6d1，2)。10％PEG 15-20極大地減少銅綠假單胞菌細胞的運動性。然而，對于在含有PEG 15-20的培養(yǎng)基中溫育的前0.5-1小時，細菌細胞形成蜘蛛狀的小菌落，其接近孔的底部(6e1，2)。在幾小時內(nèi)，蜘蛛腿狀的小菌落占據(jù)培養(yǎng)基的整個空間/體積(未顯示)。在有Caco-2細胞存在下，銅綠假單胞菌細胞喪失蜘蛛樣結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)其升高到上皮平面以上(30-40微米)(6f1，2)。
圖7顯示了用益生治療劑(LGG)處理腸上皮細胞的作用，所述治療劑在包含HMW PEG-樣化合物(即HMW PEG 15-20kD)的溶液或缺少該HMW PEG-樣化合物的溶液中。對年輕的成年小鼠結(jié)腸(YAMC)細胞進行多種處理(見下面的凝膠泳道標(biāo)示)，然后收獲，并通過蛋白印跡分析，評價熱休克蛋白表達。泳道1-未處理的細胞(陰性對照)；泳道2-只有高分子量PEG，加入了600ul；泳道3-只有乳桿菌GG(LGG)條件培養(yǎng)基，加入了600ul；泳道4-先給細胞添加600ul PEG，再在2小時后加入600ul LGG；泳道5-先加入LGG，再在2小時后加入PEG(與泳道4中相同的體積)；泳道6-加入300ul LGG和600ul PEG的混合物；泳道7-1∶1比例的混合物(600ul LGG和600ul PEG)；泳道8-900ul LGG和600ul PEG的混合物；泳道9-600ul LGG和300ulPEG的混合物；泳道10-600ul LGG和900ul PEG的混合物；和泳道11-遭受熱應(yīng)激的細胞(HS＝熱休克，陽性對照)。進行蛋白印跡，以評價上面列出的各種處理對誘導(dǎo)型熱休克蛋白hsp72(上圖)和hsp25(中圖)的誘導(dǎo)。Hsc73(下圖)用作上樣對照，以確保在所有的泳道中上樣等量的蛋白。
圖8顯示了用益生治療劑(VSL#3)處理腸上皮細胞的作用，所述治療劑在包含HMW PEG-樣化合物(即HMW PEG 15-20kD)的溶液或缺少該HMW PEG-樣化合物的溶液中。對年輕的成年小鼠結(jié)腸(YAMC)細胞再次進行如下所列的多種處理，然后在16小時后收獲，并通過蛋白印跡分析，評價熱休克蛋白表達。泳道1-VSL#3條件培養(yǎng)基批次A，將600ul加給細胞，并放置16小時；泳道2-VSL#3條件培養(yǎng)基批次A，將1200ul加給細胞，并放置16小時；泳道3-VSL#3培養(yǎng)基批次A，將600ul與600ul PEG相混合，加給細胞16小時；泳道4-VSL#3A/PEG混合物，放置10分鐘，然后去除(更換培養(yǎng)基)；泳道5-VSL#3條件培養(yǎng)基批次B，將600ul加給細胞，并放置16小時；泳道6-VSL#3條件培養(yǎng)基批次B，將1200ul加給細胞，并放置16小時；泳道7-VSL#3培養(yǎng)基批次B，將600ul與600ul PEG相混合，加給細胞16小時；泳道8-VSL#3 B/PEG混合物，放置10分鐘，然后去除(更換培養(yǎng)基)；泳道9-VSL#3條件培養(yǎng)基批次H，將600ul加給細胞，并放置16小時；泳道10-VSL#3條件培養(yǎng)基批次H，將1200ul加給細胞，并放置16小時；泳道11-VSL#3培養(yǎng)基批次H，將600ul與600ulPEG相混合，加給細胞16小時；泳道12-VSL#3 H/PEG混合物，放置10分鐘，然后去除(更換培養(yǎng)基)；泳道13-未處理的細胞(陰性對照)；和泳道14-遭受熱應(yīng)激的細胞(HS＝熱休克，陽性對照)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了產(chǎn)品、方法和系統(tǒng)，其集中地代表著簡單且經(jīng)濟的實現(xiàn)穩(wěn)定化的和有活性的治療劑的輸送的途徑，以及提供了對多種上皮障礙(例如，微生物-介導(dǎo)的上皮障礙)的治療和/或預(yù)防，所述上皮障礙即影響許多哺乳動物(包括人)的異常狀況和疾病。通過給需要的動物施用高分子量極性聚合物例如HMW聚乙二醇-樣化合物，例如，HMW PEG-樣化合物例如HMW PEG，所述動物包括處于危險中的那些，可以用最小的成本和最少的執(zhí)業(yè)培訓(xùn)，治療眾多威脅健康或生命的異常狀況中的任一種，即上皮障礙和疾病，包括腸-衍生的膿毒病。典型地作為溶液施用的HMW PEG-樣化合物的體積，取決于要輸送的治療劑和治療劑的目標(biāo)靶位，例如，如果治療劑在整個或部分腸道中是有活性的，則需要足以有效地用溶液包被腸道或其相關(guān)部分的HMW PEG-樣溶液。如果治療劑在例如腸中具有遠離輸送點的作用位點，且簡單地旨在由其攝入，則HMW PEG-樣溶液僅僅需要預(yù)防治療劑在腸腔中的稀釋，如本領(lǐng)域會理解的。不希望受理論的約束，本發(fā)明提供的益處與下述原則相一致，即通過建立有助于這樣的微生物存活的環(huán)境，可以成功地預(yù)防、改善或治療微生物-介導(dǎo)的上皮障礙。建立在本說明書中使用的術(shù)語的下述含義，并通過考慮共有的2004年2月6日提交的臨時美國專利申請?zhí)?0/542,725；2004年4月20日提交的名稱為“Cytoprotective and Anti-Inflammatory Factors Derived FromProbiotic And Commensal Flora Microorganisms”、發(fā)明人為EugeneChang和Elaine Petrof的臨時美國專利申請?zhí)朹_________(代理人卷號27373/40027)；和2004年4月20日提交的名稱為“CytoprotectiveFactors Derived From Probiotic And Commensal FloraMicroorganisms”、發(fā)明人為Eugene Chang和Elaine Petrof的臨時美國專利申請?zhí)朹__________(代理人卷號27373/40049)，有助于理解下面對本發(fā)明的更詳細描述，這三件申請中的每一篇都在本文整體引作參考。
將″異常狀況″廣義地定義為包括哺乳動物疾病，哺乳動物障礙和哺乳動物健康的任何異常的狀態(tài)，其特征在于處于發(fā)生微生物-介導(dǎo)的障礙的危險中的上皮表面。特征在于處于發(fā)生微生物-介導(dǎo)的障礙危險中的上皮表面的異常狀況包括其中上皮表面已經(jīng)發(fā)生微生物-介導(dǎo)的障礙的狀況。示例性的狀況包括需要醫(yī)學(xué)干預(yù)或由醫(yī)學(xué)干預(yù)引起的人疾病和人障礙，例如燒傷，新生兒小腸結(jié)腸炎，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，炎性腸病，腸病(例如，危重病中的)和移植(例如，器官)排斥。
″燒傷″指由組織暴露于熱引起的哺乳動物組織損傷，所述熱例如開放的火焰、蒸汽、熱流體和熱表面的形式。
″化學(xué)接觸″損傷指與化學(xué)試劑直接接觸造成的損傷，且可以包含化學(xué)灼傷或其它損傷。
″嚴(yán)重的″嗜中性粒細胞減少癥被賦予循環(huán)嗜中性粒細胞數(shù)目顯著減少的其普通且慣用的含義。
″移植排斥″指被認為與宿主生物對移植物(例如，器官)的最終排斥有關(guān)的該移植物的任何發(fā)展。
″施用″被賦予通過本領(lǐng)域公認的任何合適的方式輸送的其普通且慣用的含義。示例性的施用形式包括經(jīng)口輸送，肛門輸送，直接穿刺或注射，包括靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、皮下的和其它形式的注射，局部應(yīng)用，和噴霧劑(例如，噴霧)，凝膠或流體應(yīng)用于眼、耳、鼻、嘴、肛門或尿道口，和套管插入術(shù)。
″有效劑量″是能為接受該劑量的生物提供有益效果的物質(zhì)量，且可以取決于下述因素而變化施用該劑量的目的，接受該劑量的生物的大小和狀況，和本領(lǐng)域公認的與有效劑量的確定有關(guān)的其它變量。確定有效劑量的過程包括屬于本領(lǐng)域知識范圍內(nèi)的常規(guī)優(yōu)化程序。
″動物″被賦予非植物、非原生生物的其常規(guī)含義。優(yōu)選的動物是哺乳動物，例如人。
在本說明書的上下文中，“需要”是能從給特征在于該狀態(tài)的生物施用有效劑量獲益的生物、器官、組織或細胞狀態(tài)。例如，處于發(fā)生腸-衍生的膿毒病的危險中或表現(xiàn)出其癥狀的人，是需要有效劑量的根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品(例如藥物組合物)的生物。
″平均分子量″被賦予組合物組分(例如，分子)的分子量的算術(shù)平均值的其普通且慣用的含義，不管確定該平均值的準(zhǔn)確度如何。例如，具有3.5千道爾頓的平均分子量的聚乙二醇或PEG，可以含有不同分子量的PEG分子，條件是在一定的準(zhǔn)確度水平下測得這些分子量的算術(shù)平均值是3.5千道爾頓，所述準(zhǔn)確度水平可以反映算術(shù)平均值的估計值，如本領(lǐng)域所理解的。類似地，PEG 15-20指其分子量會產(chǎn)生15至20千道爾頓的算術(shù)平均值的PEG，該算術(shù)平均值受上述條件的限制。這些PEG分子包括，但不限于，簡單的PEG聚合物。例如，任選地利用接頭分子例如苯酚，可以將多個相對較小的PEG分子(例如，7,000至10,000道爾頓)連接成具有更高平均分子量(例如，15,000至20,000道爾頓)的單個分子。
“細胞膜完整性”指作為活細胞的功能組分的細胞膜的功能上顯著的修飾的相對缺乏，如本領(lǐng)域會理解的。
″可檢測地改變″被賦予使用適于情形的檢測手段可察覺的變化的其普通且慣用的含義，如本領(lǐng)域會理解的。
″生長模式″統(tǒng)指在本領(lǐng)域被視作能表征細胞生長的細胞或細胞組(例如，一群細胞)的那些性質(zhì)的值，例如細胞增殖或倍增時間，新生細胞群的地形學(xué)外觀，和本領(lǐng)域認為有助于理解細胞或細胞群的生長模式的其它變量。
″抑制″具有抑制、減少或阻止的其普通且慣用的含義。例如，抑制形態(tài)學(xué)變化指使形態(tài)學(xué)變化更困難或完全阻止。
“PA-I，或PA-I凝集素/粘附素，表達”指PA-I凝集素/粘附素的活性特征的生成或產(chǎn)生。典型地，PA-I凝集素/粘附素表達涉及編碼PA-I凝集素/粘附素的mRNA的翻譯，以生產(chǎn)具有PA-I凝集素/粘附素特征性的至少一種活性的PA-I凝集素/粘附素多肽。任選地，PA-I凝集素/粘附素還包括編碼PA-I凝集素/粘附素的DNA的轉(zhuǎn)錄，以生產(chǎn)前述的mRNA。
″上皮-誘導(dǎo)的激活″指通過上皮細胞直接或間接影響，增加給定靶物(例如，PA-I凝集素/粘附素)的活性。在本發(fā)明的上下文中，例如，上皮-誘導(dǎo)的PA-I凝集素/粘附素的激活指該多肽活性的增加，該增加可歸因于通過一個或多個上皮細胞直接接觸腸病原體而表現(xiàn)出來的上皮的間接影響。
″形態(tài)學(xué)變化″具有形式改變的其普通且慣用的含義。
″腸病原體″指能全部或部分地造成動物例如人的腸-衍生的膿毒病的病原微生物。該定義包括本領(lǐng)域已知的腸病原體，包括革蘭氏陰性細菌例如假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌)。
″改善″指疾病的程度或嚴(yán)重性的減輕，這與它的普通且慣用的含義相一致。
″致病數(shù)量″指足以啟動或維持?jǐn)?shù)量感知信號或通訊的數(shù)目的病原生物(例如，銅綠假單胞菌)的聚集或聯(lián)合，存在生物(例如，腸病原體)的閾值濃度或數(shù)目，如本領(lǐng)域已知的。
″相互作用″具有相互影響的其普通且慣用的含義，如兩種或多種生物產(chǎn)物(例如分子，細胞，等)之間的相互影響。
″跨上皮電阻″或TEER，具有本領(lǐng)域已經(jīng)接受的該短語的含義，它指跨上皮組織的電阻測量值，它非排它地用于評價上皮組織中的上皮細胞之間的緊密連接狀態(tài)。
″粘附″具有物理上結(jié)合超過瞬時時間段的其普通且慣用的含義。
″地形學(xué)上不勻稱的″指不對稱的三維物體(例如，細胞)表面的圖像、地形或其它表現(xiàn)。
″原子力顯微鏡″也稱作掃描力顯微鏡，是一種使懸臂探頭以光柵掃描橫貫樣品的表面，并使用高敏感度手段檢測探頭偏轉(zhuǎn)，獲取物質(zhì)的高分辨率地形圖的技術(shù)，如本領(lǐng)域會理解的。
″藥物組合物″指適用于治療性施用給活動物例如人患者的化合物制劑。優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含粘度、電解質(zhì)譜和滲透壓濃度平衡的溶液，其包含電解質(zhì)，葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，乳果糖，D-半乳糖，N-乙酰基D-半乳糖胺和5-20％PEG(15,000-20,000)。
“佐劑”，“載體”或“稀釋劑”每個都具有本領(lǐng)域已經(jīng)接受的這些術(shù)語的含義。佐劑是用于延長共同施用的免疫原的免疫原性的一種或多種物質(zhì)。載體是有利于操作的一種或多種物質(zhì)，例如通過攜帶的物質(zhì)的移位。稀釋劑是會降低暴露于該稀釋劑的給定物質(zhì)(稀釋物)的濃度的一種或多種物質(zhì)。
″HMW PEG-樣化合物″指相對高分子量PEG化合物，定義為具有超過3.5千道爾頓(kD)的平均分子量。優(yōu)選地，HMW PEG具有超過5千道爾頓的平均分子量，在特定的實施方案中，HMW PEG具有至少8千道爾頓、超過12千道爾頓、至少15千道爾頓和15至20千道爾頓的平均分子量。另外，“HMW PEG-樣化合物”包括HMW PEG衍生物，其中每種這樣的衍生物是含有至少一個另外的官能團的HMW PEG。優(yōu)選的HMW PEG衍生物是陽離子型聚合物。示例性的官能團包括烷氧基系列中的任一種，優(yōu)選C1-C10，芳氧基系列中的任一種，苯基和取代的苯基。這樣的官能團可以在任意的位點結(jié)合到HMW PEG分子上，包括在任一末端或在中間；也包括用于將較小的PEG分子或其衍生物連接成單個HMW PEG-樣化合物的官能團，例如，苯基和它的取代物。而且，具有另外的官能團的HMW PEG-樣分子可以具有一個這樣的基團或超過一個這樣的基團；每個分子還可以具有另外的官能團的混合物，只要這樣的分子能用于在輸送過程中穩(wěn)定至少一種治療劑，或用于治療、改善或預(yù)防上皮細胞的疾病、障礙或狀況。
“培養(yǎng)基”用于指本申請中的一種或多種細胞培養(yǎng)基?？梢詮拿看问褂玫纳舷挛闹锌闯鲈撁~的單數(shù)或復(fù)數(shù)。
總的來說，通過適合于待治療的狀況的任何方式，可以施用單獨的或與治療劑相組合的HMW PEG-樣化合物?？梢砸韵率龇绞捷斔突衔锝?jīng)口服，例如以片劑、膠囊、顆粒、粉末的形式，或用液體制劑，包括糖漿；通過舌下的、口含的或透皮的輸送；通過腸胃外的、皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的或胸骨內(nèi)的注射或輸注(例如，作為無菌注射含水或非水溶液或懸浮液)；經(jīng)鼻地，例如通過吸入噴霧劑；直腸地，例如以栓劑形式；陰道地或尿道地，通過栓劑或灌輸，例如，通過套管插入術(shù)，或通過脂質(zhì)體?？梢允┯煤袩o毒的、藥學(xué)上可接受的介質(zhì)或稀釋劑的劑量單位制劑?？梢砸赃m于立即釋放或延遲釋放的形式，施用化合物。利用本領(lǐng)域已知的合適的藥物組合物，可以實現(xiàn)立即釋放或延遲釋放。
示例性的經(jīng)口施用的組合物包括懸浮液，其可以含有例如，用于成形的微晶纖維素，作為助懸劑的海藻酸或海藻酸鈉，作為粘度增強劑的甲基纖維素，甜味劑或矯味劑，例如本領(lǐng)域已知的那些；和立即釋放的片劑，其可以含有例如，微晶纖維素，磷酸二鈣，淀粉，硬脂酸鎂和/或乳糖和/或其它賦形劑，粘合劑，填充劑，崩解劑，稀釋劑和潤滑劑，例如本領(lǐng)域已知的那些。通過舌下和/或口腔施用，例如，利用模制的、壓制的或冷凍干燥的片劑，可以經(jīng)口輸送本發(fā)明的化合物。示例性的組合物可以包含速溶稀釋劑例如甘露醇，乳糖，蔗糖，和/或環(huán)糊精。這樣的制劑還可以包含賦形劑，例如相對高分子量纖維素(AVICEL)或聚乙二醇(PEG；GoLytely，3.34kD)；用于輔助粘膜粘附的賦形劑，例如羥丙基纖維素(HPC)，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，羧甲基纖維素鈉(SCMC)，和/或馬來酸酐共聚物(例如，GANTREZ)。也可以加入潤滑劑，助流劑、矯味劑、著色劑和穩(wěn)定劑，以便于制造和使用。
示例性的經(jīng)鼻氣霧劑或吸入施用的組合物包括溶液，其可以含有例如，苯甲醇或其它合適的防腐劑，用于增強吸收和/或生物利用度的吸收促進劑，和/或其它增溶劑或分散劑，例如本領(lǐng)域已知的那些。
示例性的經(jīng)腸施用的組合物包括溶液或懸浮液，其可以含有例如，合適的無毒的稀釋劑或溶劑，例如甘露醇，1，3-丁二醇，水，林格溶液，等滲氯化鈉溶液，或其它合適的分散劑或潤濕劑和助懸劑，包括合成的單-或二酸甘油酯和脂肪酸，包括油酸。在本上下文中還包括栓劑，其可以含有例如，合適的無刺激的賦形劑，例如可可脂，合成的甘油酯或聚乙二醇(例如，GoLytely)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，可以確定本發(fā)明的化合物的有效量。任意特定對象的特定劑量水平和給藥頻率可以變化，且取決于多種因素，包括使用的特定化合物的活性，代謝穩(wěn)定性和該化合物的作用長度，對象的物種、年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食，給藥模式和時間，排泄速度，藥物聯(lián)合，和特定狀況的嚴(yán)重性。優(yōu)選的治療對象包括處于發(fā)生微生物-介導(dǎo)的上皮狀況或疾病(例如腸-衍生的膿毒病)的危險中的動物，最優(yōu)選哺乳動物例如人，和馴養(yǎng)的動物例如狗，貓，馬等。
下面的實施例例示了本發(fā)明的實施方案。實施例1描述了高分子量PEG提供給肝切除小鼠的對抗腸-衍生的膿毒病的保護。實施例2公開了HMW PEG如何預(yù)防病原體粘附到腸上皮細胞。實施例3揭示了HMWPEG如何總體抑制病原體毒力表達，和更具體地抑制PA-I凝集素/粘附素表達。實施例4顯示，PEG不影響病原體的生長或細胞膜完整性。實施例5使用原子力顯微鏡解釋了HMW PEG-包被的病原體的獨特的地形學(xué)構(gòu)象。實施例6描述了受HMW PEG影響的細胞-細胞相互作用。實施例7描述了使用本發(fā)明的組合物的預(yù)防方法。實施例8公開了監(jiān)測HMW PEG的施用的方法，例如在本發(fā)明的治療方法中，和對應(yīng)的試劑盒。實施例9描述了在30％肝切除后，HMW PEG-樣化合物對抗腸-衍生的膿毒病的保護作用。實施例10和11公開了HMW PEG-樣化合物在穩(wěn)定益生治療劑乳桿菌GG，或LGG(實施例10)和VSL3(實施例11)的輸送中的應(yīng)用。實施例12解釋了使用HMW PEG-樣化合物對化學(xué)或生物治療劑的施用。
實施例1在30％肝切除后，HMW PEG保護對抗腸-衍生的膿毒病使用常規(guī)方案，麻醉雄性Ba1b/c小鼠，并進行肝切除。沿著松軟下垂的左葉，進行30％不流血的肝切除。對照小鼠接受無肝切除的肝操作。實驗組和對照組各含有7只小鼠。在所有的小鼠中，通過直接針穿刺，將在鹽水、PEG 3.350或PEG 15-20(PEG)中稀釋的體積為200ul的107cfu/ml銅綠假單胞菌PA27853注射進盲腸基部。相對低分子量PEG可從市場上得到；具有15,000至20,000道爾頓的平均分子量的PEG 15-20，是共價結(jié)合到苯酚環(huán)上的PEG 7-8和PEG 8-10的組合。PEG 7-8具有7,000至8,000道爾頓的平均分子量,PEG 8-10具有8,000至10,000道爾頓的平均分子量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到，HMW PEG包括具有多種PEG亞基中任何亞基的化合物，其中具有多種平均分子量中的任一種的每個亞基彼此相連接(優(yōu)選共價地)或連接到一種或多種接頭分子上，后者是具有適用于PEG分子的連接的官能團的相對小分子。合適的接頭會基本上保留HMW PEG的生物學(xué)活性(保留足夠的生物學(xué)活性，以實現(xiàn)如本文所公開的有益的預(yù)防或治療作用)。
為了給持續(xù)48小時的實驗提供恒定的PEG來源，將針頭導(dǎo)入小腸(回腸)，將1ml鹽水、PEG 3.35或PEG 15-20逆行性地注射入近端的腸中。用縫合絲線系緊穿刺位點，用醇擦洗盲腸。將小鼠返回它們的籠子，在接下來的48小時只給予H2O。
在圖1的小圖b中，可以看到PEG 15-20的劑量效應(yīng)曲線。a.通過Fisher Exact檢驗，測定了PEG 15-20的統(tǒng)計學(xué)上顯著的保護作用(P＜0.001)。b.測得PEG 15-20的最小保護濃度為5％(P＜0.05)。c.在30％手術(shù)肝切除和直接盲腸注射1×107cfu/ml PA27853后24小時，盲腸內(nèi)容物(糞便)、洗過的盲腸粘膜、肝和血液的定量細菌培養(yǎng)。單向ANOVA證實了肝切除后小鼠盲腸內(nèi)容物、粘膜、肝和血液中細菌計數(shù)的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001)。對于PEG 3350，觀察到肝和血液細菌計數(shù)的顯著減少(P＜0.05)，而PEG 15-20完全阻止PA27853向小鼠的肝和血液播散。
銅綠假單胞菌株ATCC 27853(PA27853)是來自血液培養(yǎng)物的非粘液的臨床分離株。在先前進行30％不流血的手術(shù)肝切除的小鼠中直接盲腸注射菌株P(guān)A27853，導(dǎo)致臨床膿毒病狀態(tài)，在48小時時沒有存活者。類似地注射了銅綠假單胞菌的接受無肝切除的假剖腹術(shù)的小鼠(對照)，全部存活，沒有任何膿毒病的臨床征象(圖1a)。為了檢測PEG溶液在該模型中預(yù)防或降低死亡率的能力，將濃度為1×107cfu/ml的200ul PA27853，懸浮在兩種10％(w/v)聚乙二醇(PEG-3.35和PEG-15-20)溶液之一中。選擇PEG-3.35，因為它代表著在過去25年中已經(jīng)用于臨床用途的PEG的分子量(Golytely)。相比之下，使用的根據(jù)本發(fā)明的PEG溶液具有在15-20kD之間變化的分子量。通過直接穿刺，將懸浮的菌株導(dǎo)入盲腸。PEG3.35對肝切除后的小鼠的死亡率沒有作用，而PEG 15-20是完全保護性的。實際上，PEG 15-20具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的保護作用，如通過Fisher Exact檢驗所測得的(P＜0.001)。劑量效應(yīng)實驗證實，5％溶液是完全保護性的PEG 15-20的最小濃度(P＜0.05；見圖1b)，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到，預(yù)期低于5％的HMW PEG溶液會提供一些保護，因而也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。關(guān)于在實驗小鼠和對照小鼠中的細菌計數(shù)，單向方差分析(ANOVA)證實了肝切除后小鼠的盲腸內(nèi)容物、粘膜、肝和血液中的細菌計數(shù)的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001)。對于PEG 3350，觀察到肝和血液細菌計數(shù)的顯著減少(P＜0.05)，而PEG 15-20完全阻止PA27853向小鼠的肝和血液播散。PEG 15-20完全抑制了腸PA27853向小鼠的肝和血液的播散(圖1c)。數(shù)據(jù)表明，PEG溶液的作用涉及非-殺微生物的機理。在對哺乳動物細胞無毒的PEG濃度(即≤約10％)下，沒有表現(xiàn)出對細菌生長模式的作用。
該實施例證實，HMW PEG能降低接受部分肝切除形式的手術(shù)干預(yù)的小鼠中可歸因于腸-衍生的膿毒病的死亡率。該小鼠模型指示著，HMWPEG療法可以用于降低遭受生理應(yīng)激例如侵入手術(shù)(例如，部分肝切除)的動物物種的死亡率(即降低任何給定生物中的死亡可能性)，例如哺乳動物，如人。預(yù)期當(dāng)在生理應(yīng)激后(例如，在術(shù)后護理過程中)實施時，HMW PEG療法在預(yù)防與膿毒病有關(guān)的死亡或嚴(yán)重疾病的方法中將是有效的。而且，可以在生理應(yīng)激前(例如，術(shù)前護理)，在其中應(yīng)激的引入是可預(yù)測的情況下，使用HMW PEG療法，以降低嚴(yán)重疾病或死亡的危險。HMW PEG療法也可以用于改善與疾病或與腸-衍生的膿毒病有關(guān)的異常狀況相關(guān)的癥狀。
實施例2HMW PEG預(yù)防病原體向腸上皮的粘附緊密連接是在哺乳動物腸道的屏障功能中起關(guān)鍵作用的上皮細胞細胞骨架的動態(tài)成分。銅綠假單胞菌會導(dǎo)致緊密連接通透性的顯著改變，如通過Caco-2細胞和T-84細胞的跨上皮電阻(TEER)所測得的。Caco-2細胞是被充分表征的人結(jié)腸上皮細胞，其在培養(yǎng)中維持穩(wěn)定的TEER，且該細胞系能提供腸病原體的體內(nèi)行為的公認的體外模型。為了確定PEG對銅綠假單胞菌PA27853-誘導(dǎo)的培養(yǎng)的Caco-2細胞單層的TEER降低的保護作用，在有10％PEG 3.35或10％PEG 15-20存在下，將1×107cfu/ml PA27853從頂端接種到2個Caco-2細胞單層上。連續(xù)測量TEER 8小時，記錄TEER的最大下降。
只有PEG 15-20顯著保護對抗銅綠假單胞菌-誘導(dǎo)的TEER的降低(圖2a)。圖2中的數(shù)據(jù)代表著在頂端暴露于1×107cfu/ml PA27853的8小時過程中觀察到的一式三份培養(yǎng)物(n＝7)的TEER自基線％最大下降的平均值±SEM。通過單向ANOVA，揭示了TEER的統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低，如在暴露于PA27853的Caco-2細胞中所證實的(P＜0.001)。對于PEG 15-20，證實了對PA27853誘導(dǎo)的TEER下降的統(tǒng)計學(xué)上顯著的保護作用(P＜0.001)。圖2b顯示了在有PEG 3.35存在且頂端暴露于PA27853的情況下的Caco-2細胞。在有PEG 3.35存在下共培養(yǎng)4小時后，觀察到Caco-2細胞單層的破裂，表現(xiàn)出局灶粘附的細菌，細胞漂浮在單層支架以上30-40微米(圖2b)。相比之下，圖2c顯示了在有PEG 15-20存在下頂端暴露于PA278534小時的Caco-2細胞的圖像，其在任何檢查的平面中沒有表現(xiàn)出漂浮細胞的跡象。PEG 15-20對Caco-2細胞完整性的保護作用，與較少的細菌粘附有關(guān)，后者由暴露于1×106cfu/ml PA278534小時后細胞上清液中的細菌15-倍更高的回收率所反映。
PEG-培養(yǎng)的人腸上皮細胞對銅綠假單胞菌的屏障破壞作用的抵抗，如通過TEER的維持所判斷的，能提供在面臨來自侵入病原體的攻擊時穩(wěn)定緊密連接的屏障功能的實踐途徑。PEG 15-20的治療價值的其它證據(jù)是，該化合物不會影響上皮轉(zhuǎn)換功能(Na+/H+交換，葡萄糖轉(zhuǎn)運)。
因而，HMW PEG對于腸上皮屏障而言是相對惰性的，且對其具有穩(wěn)定作用。本發(fā)明包括通過將HMW PEG施用給動物，例如哺乳動物，且優(yōu)選人，治療與腸病原體例如銅綠假單胞菌有關(guān)的腸屏障異常的方法。通過本領(lǐng)域已知的任何診斷技術(shù)或其它手段，可以揭示腸屏障異常。但是，不必需在HMW PEG治療前鑒別腸屏障異常。與HMW PEG治療有關(guān)的低成本和高度安全性，使得該方法適用于預(yù)防性應(yīng)用，優(yōu)選地針對處于危險中的生物，以及適于應(yīng)用于表現(xiàn)出腸屏障異常特征性的至少一種癥狀的動物的治療方法。HMW PEG治療方法能改善與腸屏障異常有關(guān)的癥狀；優(yōu)選地，該方法能減少或消除治療的生物的腸-衍生的膿毒病的影響。
實施例3HMW PEG抑制病原體的毒力表達在肝切除后小鼠的盲腸中，銅綠假單胞菌PA27853中的PA-I凝集素/粘附素的表達有所增加，且在小鼠腸中銅綠假單胞菌的致死效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。通過促進PA27853向上皮的粘附，以及通過建立顯著的對細胞毒素(外毒素A和彈性蛋白酶)的屏障缺陷，PA-I在小鼠腸中起顯著的毒力決定因素的作用。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑RhIR和它的同源激活劑C4-HSL能調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌中的PA-I表達。不但通過暴露于C4-HSL，而且通過接觸Caco-2細胞，Caco-2細胞膜制品，和來自Caco-2細胞培養(yǎng)物的上清液，都會增加PA-I在PA27853中的表達。
RNA印跡雜交用于在轉(zhuǎn)錄水平分析PA-I的表達。通過改進的三-去污劑方法，分離銅綠假單胞菌的總RNA。使用PA-I引物F(ACCCTGGACATTATTGGGTG)(SEQ ID NO1)，R(CGATGTCATTACCATCG-TCG)(SEQ ID NO2)和16S引物F(GGACGGGTGAGTAATGCCTA)(SEQ IDNO3)，R(CGTAAGGGCCATGATGACTT)(SEQ ID NO4)，通過PCR產(chǎn)生了探針，并克隆進pCR2.1載體(Invitrogen，Inc.)。插入物是與PA-I或16S的序列相匹配的序列。用α32P-dCTP放射性標(biāo)記了對PA-I和16S特異性的cDNA探針。通過Storm 860 phosphorimager(MolecularDynamics，CA)，測量比放射活性，并在PA-I和16S的強度比的基礎(chǔ)上，計算與對照相比的相對百分比變化。使用兔親和-純化的多克隆抗-PA-I抗體，將蛋白印跡用于PA-I蛋白分析。用PBS洗滌1ml銅綠假單胞菌細胞，并在100℃，在裂解緩沖液(4％SDS，50mM Tris-HCl，pH6.8)中加熱；Tricine SDS-PAGE后，通過蛋白的電轉(zhuǎn)移，進行免疫印跡分析。通過ECL試劑(Amersham，NJ)，檢測PA-I凝集素。
銅綠假單胞菌PA27853向1mM數(shù)量-感知信號傳遞分子C4-HSL的暴露，導(dǎo)致PA-I蛋白表達的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001，單向ANOVA)，后者在有10％PEG 3.35存在下，受到部分抑制，且受到10％PEG 15-20更大程度的抑制(圖3)。PEG 15-20對C4-HSL-誘導(dǎo)的PA-I表達的最小完全抑制濃度是5％(P＜0.01，單向ANOVA)。對在有和沒有PEG存在下暴露于C4-HSL的各細菌細胞的電子顯微鏡檢查證實，C4-HSL造成了銅綠假單胞菌的形狀和菌毛表達的形態(tài)學(xué)變化(圖3b)。在有PEG 15-20的情況下，完全消除C4-HSL-誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)作用，但是在有PEG 3.35存在下不能徹底消除。在暴露于PEG 15-20的PA27853周圍，可以看到暈圈-型效應(yīng)(圖3b)。PA27853向0.1mM C4-HSL的暴露，導(dǎo)致PA-I mRNA表達的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001單向ANOVA)，如使用RNA印跡所評價的。PA-I表達受到10％PEG 15-20的極大抑制。圖3d表明，PEG 15-20抑制通過暴露于Caco-2細胞4小時誘導(dǎo)的PA-I mRNA的增加，但是PEG 3.35不能(P＜0.001單向ANOVA)。
本文所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，當(dāng)用10％PEG 15-20預(yù)處理細菌時，觀察到100uM-1mM C4-HSL誘導(dǎo)的PA27853中的PA-I表達(蛋白和mRNA)的顯著弱化(3-4倍減少)。用PEG 3.35沒有觀察到該作用(圖3a)。對于10％PEG 3.35，也觀察到C4-HSL-誘導(dǎo)的PA-I表達的弱化，盡管弱化程度顯著低于10％PEG 15-20。能抑制C4-HSL誘導(dǎo)的PA-I蛋白表達的PEG 15-20的最小濃度是5％(圖3b)。對暴露于C4-HSL的各細菌細胞的電子顯微鏡檢查法證實，C4-HSL造成了PA27853的形狀和菌毛表達的形態(tài)學(xué)變化(圖3b)。在有PEG 15-20存在下，完全消除了C4-HSL-誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)作用，但是PEG 3.35不能(圖3b)。在有PEG 15-20存在下，抑制了通過暴露于Caco-2細胞4小時誘導(dǎo)的PA-I表達(mRNA)，但是PEG 3.35不能(圖3b)。在過夜暴露實驗中，PEG 15-20仍然維持對Caco-2細胞-誘導(dǎo)的PA-I表達的保護作用。
HMW PEG也會影響響應(yīng)已知刺激引起的銅綠假單胞菌的毒力表達。PA27853中C4-HSL-誘導(dǎo)的PA-I表達的弱化，可能是PEG 15-20的主要保護作用，鑒于數(shù)量-感知信號傳遞是該病原體毒力表達的確立機理。預(yù)期PEG 15-20-誘導(dǎo)的對Caco-2細胞-誘導(dǎo)的PA-I表達的干擾，是PEG 15-20的保護作用的重要方面。發(fā)現(xiàn)PEG 15-20對宿主動物具有保護作用，這是通過來自30％肝切除小鼠的濾過的盲腸內(nèi)容物(糞便)引起的銅綠假單胞菌(PA27853)PA-I表達的弱化。預(yù)期PEG 15-20防護銅綠假單胞菌免受增加它的毒力表達的宿主因子影響的能力，是保護生物免于腸-衍生的膿毒病的另一種機理。
因此，本發(fā)明包括試劑盒形式的材料和相應(yīng)的給動物施用HMW PEG的方法，以預(yù)防或治療特征在于腸病原體(例如一種假單胞菌)表達毒力因子或決定因素的狀況。毒力決定因素可能直接或間接地促成毒力。間接貢獻的實例是，銅綠假單胞菌的PA/I凝集素/粘附素對腸病原體向腸上皮的粘附的作用，和/或生成對細胞毒素(外毒素A和彈性蛋白酶)的屏障缺陷。
實施例4PEG不會影響病原體的細胞生長或細胞膜完整性通過由SYTO 9和碘化丙啶組成的染色方法，評價了2種PEG溶液(PEG 3.35和PEG 15-20)對細菌膜完整性的作用。兩種PEG溶液對細菌膜通透性都沒有任何作用(圖4a)。使用活/死細菌生存力試劑盒L-3152(Molecular Probes)，測定膜完整性。通過涂布在不同的培養(yǎng)時間取的樣品的10-倍稀釋液，對細菌定量，并將計數(shù)表達為cfu/ml；在含有兩種PEG溶液之一的TSB培養(yǎng)基中過夜生長的銅綠假單胞菌的生長曲線，證實兩種PEG溶液對細菌數(shù)量都沒有抑制作用(圖4b)。實際上，在每種含有PEG的培養(yǎng)基中的生長模式，與在沒有PEG的TSB培養(yǎng)基中的生長模式不可區(qū)分。在生長的指數(shù)期和靜止期過程中的不同時間點，測量參與能量代謝的持家酶-乳酸脫氫酶(LDH)的活性。使用來自CytoTox 96(Promega)的底物混合物，在偶聯(lián)的黃遞酶酶測定中，測量LDH活性。使用BCA蛋白測定(Pierce)，檢測蛋白濃度。沒有觀察到在有PEG存在下生長的銅綠假單胞菌的無細胞上清液中LDH活性的變化。該實驗的結(jié)果表明，HMW PEG對細菌生長模式具有可忽略的作用。
本發(fā)明的方法，和對應(yīng)的產(chǎn)品(例如，試劑盒)，能提供預(yù)防或治療與腸-衍生的膿毒病有關(guān)的疾病或異常狀況的益處，而不顯著影響腸內(nèi)菌群的組成。類似地，本發(fā)明的方法和產(chǎn)品可以用于改善與這樣的疾病或異常狀況有關(guān)的癥狀，而不顯著改變腸的微生物組成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到，不顯著擾亂腸菌群的組成的方法(和試劑盒)是合乎需要的，因為預(yù)期這樣的方法不會導(dǎo)致由這樣的擾亂引起的繼發(fā)健康并發(fā)癥。
實施例5PEG-包被的病原體的原子力顯微鏡檢在有或沒有10％HMW PEG的情況下，在37℃，在胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)中，繼代培養(yǎng)過夜生長的PA27853培養(yǎng)物的1％等分試樣4小時。每種繼代培養(yǎng)物取一滴，用PBS充分洗滌銅綠假單胞菌PA27853細胞，在吹風(fēng)中在云母上干燥10分鐘，并立即成像。使用多模式納秒示波器IIIA掃描探頭顯微鏡(MMAFM，Digital Instruments)，在空氣中用輕打-模式AFM進行干燥細菌的成像。用10％HMW PEG處理亞匯合的Caco-2細胞4小時，并用PBS充分洗滌。不使用O-形環(huán)，在PBS中進行細胞的AFM成像。對于電子顯微鏡檢查法，將PA27853接種到含有或沒有1mM C4-HSL和10％HMW PEG的TSB中，過夜培養(yǎng)。用醋酸雙氧鈾將一滴1％銅綠假單胞菌染色，并用0.5M NaCl洗滌，然后在電子顯微鏡下檢查。
Caco-2細胞的原子力顯微鏡檢證實了具有刷狀緣微絨毛的經(jīng)典的不均勻的表面，而暴露于PEG 3.35的Caco-2細胞表現(xiàn)出上皮細胞表面上的光滑平面外觀(圖5a，c)。通過填充沿著地形學(xué)上限定的平面的不對稱，PEG 15-20似乎覆蓋Caco-2細胞(圖5e)，產(chǎn)生更復(fù)雜的地形學(xué)上限定的覆蓋物。以幾分類似的方式，暴露于PEG 3.35的PA27853細胞表現(xiàn)出聚合物以彌散扁平模式光滑包被到細菌細胞的模式(圖6d)，而PEG 15-20似乎以地形學(xué)上更不勻稱的方式，在周圍圍繞和緊抱細菌。PEG 15-20中的細菌直徑的原子力測量的橫斷面分析證實了PEG溶液中細菌/PEG外膜的顯著增加(圖5e，f)。換而言之，PEG 3.35在各細菌細胞周圍形成光滑的外膜(圖5e)，而PEG 15-20緊擁各細胞(圖5f)，并增加聚合物/細菌直徑(圖5g，5h)，從而使各細菌細胞彼此遠離。
不希望受理論的約束，HMW PEG可以僅僅通過使銅綠假單胞菌物理上遠離腸上皮而發(fā)揮它的有益作用?；蛘?，HMW PEG可以通過阻止由病原細胞的細胞-細胞相互作用引起的致病性數(shù)量-感知激活信號的形成而提供益處。同樣不希望受理論的約束，用HMW PEG包被生物學(xué)表面，可能導(dǎo)致包被PEG鏈的構(gòu)象自由度的喪失和接近蛋白的排斥。HMW PEG和Caco-2細胞之間的極性-極性相互作用，可影響PEG鏈的彈性，將某些HMW PEG側(cè)鏈限制為排斥蛋白的分子結(jié)構(gòu)。本文所示的數(shù)據(jù)支持下述結(jié)論，即HMW PEG-包被的Caco-2細胞比未包被的Caco-2細胞更排斥銅綠假單胞菌，可能是由于HMW PEG與Caco-2細胞的一些動態(tài)相互作用導(dǎo)致的″構(gòu)象熵″的喪失。
該實驗的結(jié)果確立了，HMW PEG處理對經(jīng)處理的細胞有作用，顯著地影響這樣的細胞的表面拓撲學(xué)。而且，HMW PEG暴露對這樣的細胞的作用，不同于PEG 3.35對這樣的細胞的作用。盡管不希望受理論的約束，本文公開的結(jié)果確實提供了HMW PEG與低分子量PEG(例如PEG 3.35)相比表現(xiàn)出的對細胞的顯著不同的作用的物理關(guān)聯(lián)。
實施例6HMW PEG影響細胞-細胞相互作用為了直接觀察PEG溶液對銅綠假單胞菌的空間定向的作用，用攜帶編碼綠色熒光蛋白的egfp基因的銅綠假單胞菌PA27853/EGFP的活菌株，進行實驗。在有和沒有Caco-2細胞的情況下，進行實驗。為了將PEG對細菌和它們與培養(yǎng)的上皮的相互作用的影響顯像，使用差動干擾對比(DIC)顯微鏡和GFP成像。
使用pBI-EGFP質(zhì)粒(Clontech)作為模板，擴增編碼綠色熒光蛋白的EGFP基因。使用引物TCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG(SEQ ID NO5)和GCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC(SEQ ID NO6)，導(dǎo)入XbaI和PstI限制位點。使用TA-克隆試劑盒(Invitrogen)，將PCR產(chǎn)物直接克隆進pCR2.1載體，然后將pCR2.1/EGFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5a。通過XbaI和PstI消化，將EGFP基因切離該構(gòu)建體，并將含有切離的基因的片段克隆進已經(jīng)用相同限制酶消化的大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭載體pUCP24。在25uF和2500V，將得到的在穿梭載體中含有EGFP基因的構(gòu)建體(即pUCP24/EGFP)，電穿孔進PA27853電-感受態(tài)細胞。在含有100ug/ml慶大霉素(Gm)的LB-瓊脂平板上，選擇含有PA27853/EGFP的細胞。
在含有100ug/ml Gm的LB中，過夜培養(yǎng)攜帶PA27853/EGFP的細胞，使用1％培養(yǎng)物，接種含有50ug/ml Gm的新鮮LB。生長3小時后，將異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加至0.5mM的終濃度，將培養(yǎng)物另外培養(yǎng)2小時。將100ul細菌培養(yǎng)物與1ml含有10％胎牛血清(HDMEM HF)和10％HMW PEG且用HEPES緩沖的HDMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)相混合。將1ml細菌懸液倒入0.15 mm-厚dTC3培養(yǎng)皿(Bioptech)。在含有或沒有HMW PEG的HDMEM HF中，將在0.15mm-厚dTC3培養(yǎng)皿(Bioptech)中在HDMEM HF中生長的4天齡的Caco-2細胞(p10-p30)洗滌1次。將1ml如上制備的細菌懸液加入含有Caco-2細胞的dTC3培養(yǎng)皿。以63X物鏡放大率，使用具有DIC和GFP熒光濾光鏡的Axiovert 100 TV熒光倒置顯微鏡，直接觀察dTC3培養(yǎng)皿中細菌細胞的分散模式。用Bioptechs恒溫溫度控制系統(tǒng)，調(diào)節(jié)溫度。鎢絲燈(100V)用于DIC和GFP激發(fā)。使用GFP濾光鏡，使用來自Intelligent Imaging Innovations的3D成像軟件(Slidebook)，對Z平面中的細菌細胞分散模式成像。在DIC圖像(圖6a1)和Z平面重建(圖6a2)上，觀察到?jīng)]有Caco-2細胞的培養(yǎng)基中均勻分散的浮游銅綠假單胞菌細胞。在有Caco-2細胞存在下，細菌細胞形成成團外觀(圖6b1)，并發(fā)現(xiàn)其粘附到Caco-2細胞上(圖6b2)。10％PEG 3350的溶液減少細菌的運動性，并誘導(dǎo)粘附到孔底部(圖6c2)的蘑菇狀的細菌小菌落(圖6c1)立即形成。在有Caco-2細胞存在下，細菌小菌落是在上皮細胞平面以上約8微米(圖6d1，2)。10％PEG 15-20的溶液極大地減少銅綠假單胞菌細胞的運動性。然而，對于在含有PEG 15-20的培養(yǎng)基中溫育的前0.5-1小時，細菌細胞形成蜘蛛腿狀的小菌落，其接近孔的底部(圖6e1，2)。在幾小時內(nèi)，蜘蛛腿狀的小菌落占據(jù)培養(yǎng)基的整個空間/體積。在有Caco-2細胞存在下，銅綠假單胞菌細胞喪失蜘蛛腿樣結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其升高高于上皮平面以上(30-40微米)(圖6f1，2)。
為了確定細菌-上皮細胞相互作用的三維空間定向，進行Z平面重建。圖像證實，取決于Caco-2細胞的存在與否，兩種PEG溶液對銅綠假單胞菌的成團行為具有不同的作用，且有差別地影響細菌的空間定向。在只有培養(yǎng)基的實驗中，觀察到銅綠假單胞菌顯示出均勻分散的模式(圖6a)。但是，在有Caco-2細胞存在下檢查的細菌細胞形成了成團的外觀，且發(fā)現(xiàn)其在孔底部鄰近上皮細胞平面(圖6b)。在只有PEG3.35存在下檢查的細菌細胞形成了大塊聚集體，并保留在培養(yǎng)孔的底部(圖6c)，而在含有PEG 3.35的培養(yǎng)基中有Caco-2細胞檢查的細菌細胞，保持懸浮在上皮細胞平面以上(約8微米)，維持它們成團的外觀(圖6 d)。在只有PEG 15-20存在下檢查的細菌細胞表現(xiàn)出均勻的微團模式(圖6e)，而在含有PEG 15-20的培養(yǎng)基中在Caco-2存在下檢查的細菌細胞以成團的結(jié)構(gòu)懸浮在高于上皮平面以上(約32微米)(圖6f)。在同步實驗中，觀察到PEG 3.35減少細菌運動性，PEG 15-20程度更大。
以與實施例5公開的實驗相類似的方式，本實施例提供了觀察到的HMW PEG對細胞-細胞相互作用的影響的物理關(guān)聯(lián)，這與本文公開的它的有益的預(yù)防和治療活性相一致。預(yù)期HMW PEG的應(yīng)用會減少或消除腸中有害的細胞-細胞相互作用(例如，腸上皮細胞和腸病原體例如假單胞菌之間)，降低與腸-衍生的膿毒病有關(guān)的疾病和/或異常狀況的危險。
實施例7預(yù)防疾病/異常狀況的方法本發(fā)明還提供了預(yù)防人和其它動物尤其是其它哺乳動物的多種疾病和/或異常狀況的方法。在這些方法中，將有效量的HMW PEG施用給有此需要的人患者或動物對象?？梢允褂猛ㄟ^本領(lǐng)域已知的常規(guī)優(yōu)化程序確定的施用方案，施用PEG。優(yōu)選地，PEG具有5,000-20,000道爾頓的平均分子量，更優(yōu)選地，10,000-20,000道爾頓。預(yù)期施用至少5％HMW PEG?？梢砸匀魏魏线m的形式，例如，作為溶液，作為凝膠或乳霜劑，作為適用于噴霧的溶液(例如，用于吸入應(yīng)用)，在包含HMW PEG的藥物組合物中，和在適于注射進動物的無菌等滲溶液中，施用HMW PEG?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)途徑，完成施用；特別地預(yù)期，經(jīng)口地或局部地(例如，透皮地)施用HMW PEG。在有些實施方案中，施用的HMW PEG組合物還包含選自下述的化合物葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，低聚果糖，N-乙?；?D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。在另一個實施方案中，施用的HMW PEG組合物還包含葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，一種或多種低聚果糖，N-乙?；?D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。
本發(fā)明提供了預(yù)防多種疾病和異常狀況的方法，例如游泳耳病，急性或慢性中耳炎，呼吸器相關(guān)性肺炎，腸-衍生的膿毒病，壞死性小腸結(jié)腸炎，抗生素-誘導(dǎo)的腹瀉，假膜性結(jié)腸炎，炎性腸病，易激性腸病，中性粒細胞減少性小腸結(jié)腸炎，胰腺炎，慢性疲乏綜合征，生態(tài)失調(diào)綜合征，鏡下結(jié)腸炎，慢性泌尿道感染，性傳播疾病，和感染(例如，暴露于被生物恐怖因子污染的環(huán)境，所述生物恐怖因子例如炭疽芽孢桿菌，天花病毒，腸致病性大腸桿菌(EPEC)，腸出血性大腸桿菌(EHEC)，腸聚集性大腸桿菌，(EAEC)，艱難梭菌，輪狀病毒，銅綠假單胞菌，粘質(zhì)沙雷菌，產(chǎn)酸克雷伯氏菌，陰溝腸桿菌，白色念珠菌，Candida globrata，等)。在預(yù)防慢性泌尿道感染或治療這樣的感染的方法的一個優(yōu)選的實施方案中，以膀胱沖洗劑的形式，輸送HMW PEG。對于性傳播疾病預(yù)防，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地用于潤滑避孕套。在預(yù)防生物恐怖因子感染的方法的一個優(yōu)選的實施方案中，以凝膠或乳霜劑、適于局部應(yīng)用的形式，提供根據(jù)本發(fā)明的組合物。預(yù)期這樣的局部應(yīng)用可以用于預(yù)防與任何生物恐怖因子有關(guān)或與威脅人或動物的存活、健康或舒適的多種化學(xué)的或物理化學(xué)的因子有關(guān)的多種疾病/異常狀況。這樣的化學(xué)的或物理化學(xué)的因子包括能燒灼或以其它方式傷害皮膚的那些因子，其在本發(fā)明的組合物中變得無活性或微溶。
在預(yù)防方法的一個實施方案中，麻醉雄性Ba1b/c小鼠，通過直接針穿刺，將水性的5％PEG 15-20溶液注射進盲腸基部。為了給持續(xù)48小時的實驗提供恒定的PEG來源，將針頭導(dǎo)入小腸(回腸)，將1mlPEG 15-20逆行性地注射進近端的腸中。用縫合絲線系緊穿刺位點，用醇擦洗盲腸。將小鼠返回它們的籠子，只給予H2O。48小時后，對小鼠進行常規(guī)的肝切除操作，包含沿著松軟下垂的左葉行30％不流血的肝切除。對照小鼠經(jīng)歷無肝切除的肝操作。預(yù)期包含HMW PEG的施用的預(yù)防性治療，會減少或消除小鼠中手術(shù)-有關(guān)的腸-衍生的膿毒病的發(fā)生率。
這些方法不僅僅適用于小鼠、豚鼠、狗和貓等寵物和牛、馬、山羊、綿羊、豬、雞、火雞、鴨、鵝等農(nóng)業(yè)上重要的動物和任何其它家養(yǎng)的動物的預(yù)防性護理。而且，預(yù)期這些預(yù)防方法還適用于人，提高許多患者或處于發(fā)生疾病和/或異常狀況的危險中的候選者的健康和預(yù)期壽命，例如游泳耳病，急性或慢性中耳炎，呼吸器相關(guān)性肺炎，腸-衍生的膿毒病，壞死性小腸結(jié)腸炎，抗生素-誘導(dǎo)的腹瀉，假膜性結(jié)腸炎，炎性腸病，易激性腸病，中性粒細胞減少性小腸結(jié)腸炎，胰腺炎，慢性疲乏綜合征，生態(tài)失調(diào)綜合征，鏡下結(jié)腸炎，慢性泌尿道感染，性傳播疾病，和感染因子(例如，生物恐怖組合物)，其包括但不限于，炭疽和天花。如上所述，預(yù)防方法包括，通過任何已知的或常規(guī)的施用途徑，將包含至少5％HMW PEG(5-20kD)的組合物施用給人或另一種動物。優(yōu)選地，對處于發(fā)生一種或多種前述疾病和/或異常狀況的危險中的那些個體，實施該預(yù)防方法，但是預(yù)期本發(fā)明的組合物和方法可以用于預(yù)防或治療用途，以廣泛地治療或預(yù)防人或其它動物的整個種群或亞種群的這樣的疾病或異常狀況。
實施例8監(jiān)測HMW PEG的施用的方法。
本發(fā)明也包括監(jiān)測HMW PEG的施用的方法，例如，在治療方法中。在這樣的監(jiān)測方法中，單獨地或與未標(biāo)記的HMW PEG相組合，施用標(biāo)記的HMW PEG，在連續(xù)的或間歇的治療方案過程中，檢測該標(biāo)記，包括簡單的終點測定。術(shù)語“標(biāo)記的”HMW PEG指，標(biāo)記或可檢測的化合物直接或間接結(jié)合到HMW PEG上，或HMW PEG結(jié)合到能將標(biāo)記與HMWPEG相關(guān)聯(lián)的報告化合物上(當(dāng)然，本發(fā)明也包括未結(jié)合HMW PEG或設(shè)計用于與其相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，如下所述)。使用本領(lǐng)域已知的任何可檢測的標(biāo)記，標(biāo)記HMW PEG，并將PEG標(biāo)記至足以檢測它的水平。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到，該水平隨標(biāo)記和檢測方法而異。使用常規(guī)優(yōu)化方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能優(yōu)化標(biāo)記程度。通過在使用中和優(yōu)選地在保藏中穩(wěn)定的非共價鍵或共價鍵，將標(biāo)記化學(xué)結(jié)合到HMW PEG上。優(yōu)選共價結(jié)合到HMW PEG上的標(biāo)記。調(diào)節(jié)標(biāo)記結(jié)合的密度，以基本上保持HMW PEG的生物學(xué)活性(保持足以實現(xiàn)本文公開的有益的預(yù)防或治療作用的生物學(xué)活性)。典型地，這通過調(diào)節(jié)HMW PEG標(biāo)記比來實現(xiàn)，如本領(lǐng)域已知的。鑒于HMW PEG平均分子的相對大小，預(yù)期多種標(biāo)記適用于結(jié)合到HMW PEG上，且基本上保持其生物學(xué)活性。
本發(fā)明預(yù)期本領(lǐng)域已知的那些標(biāo)記，包括放射性標(biāo)記、生色團、熒光團和報告分子(包括能催化可檢測的化合物的生成的酶，和結(jié)合配偶體例如能將可檢測的化合物定位在報告分子附近的抗體)。示例性的酶報告分子包括發(fā)光系統(tǒng)的酶組分和比色反應(yīng)的催化劑。更具體地，示例性的報告分子包括生物素，抗生物素蛋白，抗生物素蛋白鏈菌素，和酶(例如，辣根過氧化物酶，螢光素酶，堿性磷酸酶包括分泌的堿性磷酸酶(SEAP)，β-半乳糖苷酶；β-葡糖醛酸糖苷酶；氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶)。這樣的報告分子的使用，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的，且記載在，例如，美國專利號3,817,837，美國專利號3,850,752，美國專利號3,996,345，和美國專利號4,277,437。示例性的可以被報告酶轉(zhuǎn)化成可檢測的化合物的酶底物，包括5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷或Xgal，和Bluo-gal。酶底物，作為能轉(zhuǎn)化成可檢測的化合物的化合物，在某些實施方案中也可以是標(biāo)記，如本領(lǐng)域會理解的。教導(dǎo)標(biāo)記和它們的應(yīng)用的美國專利包括美國專利號3,817,837；美國專利號3,850,752；美國專利號3,939,350和美國專利號3,996,345。示例性的放射性標(biāo)記是3H，14C，32P，33P，35S，和125I；示例性的熒光團是熒光素(FITC)，羅丹明，Cy3，Cy5，水母發(fā)光蛋白，和綠色熒光蛋白。優(yōu)選的標(biāo)記是熒光團例如熒光素。
本發(fā)明的監(jiān)測方法也可以包含超過一種標(biāo)記。在一個實施方案中，一種標(biāo)記用于鑒別處理后或處理過程中HMW PEG的位置，而第二種標(biāo)記是對一種或多種微生物特異性的，其程度是該標(biāo)記可檢測地與至少一種微生物相關(guān)聯(lián)。例如，監(jiān)測方法可以包括以基本上保持HMW PEG的生物學(xué)活性的方式結(jié)合到HMW PEG上的熒光素，和用于檢測原核生物-特異性的β-半乳糖苷酶活性的游離的(即未結(jié)合的)Xgal或bluo-gal。熒光素會定位HMW PEG，而有色的(藍色)產(chǎn)物指示著代謝乳糖的原核微生物例如假單胞菌的存在。本發(fā)明也包括監(jiān)測方法，其中單個標(biāo)記提供該信息(即HMW PEG的位置和指示微生物的存在)。
在本發(fā)明的監(jiān)測方法中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何檢測技術(shù)。幾個因素會影響選擇的檢測技術(shù)，包括標(biāo)記的類型，進行監(jiān)測的生物材料(例如，皮膚的表皮細胞、耳道或腸；糞便，粘液或組織樣品)，需要的分辨水平，是否需要定量等。合適的檢測技術(shù)包括簡單地用肉眼目檢，用裝置目檢，所述裝置例如內(nèi)窺鏡，其任選地配有合適的光源和/或記錄攝像機；蓋氏計數(shù)器的常規(guī)應(yīng)用，x-射線底片，閃爍計數(shù)器等，和本領(lǐng)域已知的任何其它檢測技術(shù)。
技術(shù)人員能認識到，本發(fā)明的監(jiān)測方法可以用于優(yōu)化治療方法。例如，監(jiān)測方法可以用于優(yōu)化輸送給上皮細胞的HMW PEG的數(shù)量和/或濃度(例如，以達到需要的HMW PEG溶液或混合物的粘度)，所述上皮細胞例如耳道的上皮細胞，以預(yù)防或治療游泳耳病。作為其它實例，通過內(nèi)窺鏡檢查暴露于標(biāo)記的HMW PEG的腸道或通過監(jiān)測糞便樣品，可以促進對腸治療的優(yōu)化。
本發(fā)明的監(jiān)測方法包括檢測能粘附到腸上皮細胞上的微生物的糞便測定，包括接觸微生物和腸上皮細胞，并使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，檢測微生物向上皮細胞的粘附。在一個優(yōu)選的實施方案中，將腸上皮細胞固定化在合適的表面上，例如微量滴定孔的底部和/或側(cè)面。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在檢測步驟之前或過程中，加入直接標(biāo)記或間接標(biāo)記，例如能產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物的報告分子。監(jiān)測方法還可以包括游離標(biāo)記的加入。例如，將游離的Bluo-gal加入懷疑含有代謝乳糖的原核微生物的樣品中；如果存在，微生物酶β-半乳糖苷酶會剪切Bluo-gal，產(chǎn)生可檢測的藍色產(chǎn)物。
在一個實施方案中，使用常規(guī)技術(shù)，將商業(yè)上可得到的腸上皮細胞(例如，Caco-2細胞，ATCC HTB 37，和/或IEC-6細胞，ATCC CRL 1952)固定到微量滴定培養(yǎng)皿的孔中。收集糞便樣品，并與液體例如磷酸鹽緩沖鹽水相混合。得到含有懸浮微生物的混合物液相(例如，通過合適的過濾(即將流體懸浮液中的大固體與細菌相分離)，傾析等)，并在PBS中1∶100稀釋。將Bluo-gal加入活微生物懸浮液。在24℃，將微生物懸浮液加入微量滴定孔1小時，然后用合適的流體(例如，PBS)洗滌孔，以去除未結(jié)合的微生物。檢測未結(jié)合的和/或結(jié)合到固定化的上皮細胞上的微生物，例如，通過偏振光顯微鏡檢查計數(shù)。在替代實施方案中，使用免疫測定來檢測粘附，其中合適的免疫學(xué)試劑是微生物-特異性的單克隆或多克隆抗體，其任選地結(jié)合到標(biāo)記上，例如放射性標(biāo)記，熒光團或生色團。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到腸上皮細胞和微生物都不需要固定化，盡管這樣的固定化可能有利于精確檢測微生物向上皮細胞的粘附。例如，在一個實施方案中，使固定化的糞便微生物接觸未固定化的腸上皮細胞。而且，技術(shù)人員能認識到，可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的流體，來得到微生物懸浮液，其中優(yōu)選的流體是任何已知的等滲緩沖液。另外，如上所述，可以用任何已知的標(biāo)記來檢測細胞粘附。
在一個有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了用于測定微生物細胞粘附的試劑盒，其包含上皮細胞和關(guān)于測定微生物細胞向上皮細胞的粘附的方案說明書。該方案說明書描述了已知的檢測微生物的方法。優(yōu)選的試劑盒包含腸上皮細胞。本發(fā)明的其它試劑盒還包含標(biāo)記，例如熒光團或報告分子。
本發(fā)明包括的另一種監(jiān)測方法是關(guān)于微生物疏水性的測定。在該方法中，使用任一種常規(guī)技術(shù)，測定微生物細胞的相對或絕對疏水性。示例性的技術(shù)包含將任何微生物暴露于疏水相互作用色譜，如本領(lǐng)域已知的。Ukuku等，J.Food Prot.651093-1099(2002)，其在本文中整體引作參考。另一種示例性的技術(shù)是任何微生物的非極性∶極性流體分配(例如，1-辛醇∶水或二甲苯∶水)。見Majtan等，F(xiàn)oliaMicrobiol(Praha)47445-449(2002)，其在本文中整體引作參考。
在用于監(jiān)測PEG施用的疏水性測定的一個實施方案中，將糞便樣品懸浮在含有0.15M NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中。通過離心收集懸浮液中的微生物，并重新懸浮在相同的緩沖液中，重復(fù)該離心-重新懸浮循環(huán)。如果可行，將微生物重新懸浮在相同的緩沖液中，至在660nm為0.4的吸光度，這允許通過分光光度計監(jiān)測，無需使用標(biāo)記的PEG。用二甲苯處理微生物懸浮液(2.5∶1，v/v，Merck)，激烈攪拌懸浮液2分鐘，將懸浮液在室溫靜置沉降20分鐘。然后測定水相中是否存在微生物，例如通過分光光度計測定在660nm的吸光度。使用含有磷酸鈉緩沖液的空白消除背景。
在從糞便樣品得到在這些方法中使用的微生物細胞時，優(yōu)選地，HMW PEG相對不溶于用于得到微生物懸浮液的流體和用于稀釋微生物懸浮液的任何流體。
本發(fā)明還提供了用于執(zhí)行包含測定微生物疏水性的監(jiān)測方法的試劑盒，其包含腸上皮細胞和描述微生物疏水性的測定的方案說明書。優(yōu)選的試劑盒包括腸上皮細胞。相關(guān)的試劑盒還包含標(biāo)記，例如熒光團或報告分子。
此外，本發(fā)明提供了監(jiān)測方法，其包含得到腸菌群的樣品和檢測PA-I凝集素/粘附素活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的檢測PA-I凝集素/粘附素活性的任何技術(shù)。例如，可以使用能特異性地識別PA-I凝集素/粘附素的抗體(多克隆、單克隆、抗體片段例如Fab片段，單鏈，嵌合體，人源化的或本領(lǐng)域已知的任何其它形式的抗體)，檢測PA-I凝集素/粘附素。免疫測定采取本領(lǐng)域已知的任何免疫測定格式的形式，例如，ELISA，蛋白印跡，免疫沉淀等?；蛘?，可以檢測PA-I凝集素/粘附素的碳水化合物-結(jié)合能力，或可以測量PA-I凝集素/粘附素的腸上皮屏障攻破活性，例如，通過在暴露于樣品之前和/或過程中，監(jiān)測上皮層的跨-上皮電阻或TEER。在有關(guān)的試劑盒中，本發(fā)明提供了PA-I凝集素/粘附素結(jié)合配偶體和關(guān)于檢測PA-I凝集素/粘附素活性(例如，結(jié)合活性)的方案說明書。根據(jù)本發(fā)明的其它試劑盒包括已知能結(jié)合PA-I凝集素/粘附素的任何碳水化合物和關(guān)于檢測PA-I凝集素/粘附素活性(例如，結(jié)合活性)的方案說明書。
實施例9使用HMW PEG-樣化合物治療腸-衍生的膿毒病麻醉雄性Ba1b/c小鼠，進行30％手術(shù)肝切除，并通過直接針穿刺，將在鹽水、PEG 3.350(10％w/v)或單甲氧基PEG 15-20(mPEG)(10％w/v)中稀釋的200ul 107cfu/ml銅綠假單胞菌PA27853注射進盲腸基部，進行攻擊，都如實施例1所述。通過將相關(guān)的針頭導(dǎo)入小腸(回腸)提供鹽水、LMW PEG和HMW mPEG的恒定來源，將1ml鹽水、PEG3.35或HMW mPEG逆行性地注射進近端的腸中。用縫合絲線系緊穿刺位點，用醇擦洗盲腸。將小鼠返回它們的籠子，在接下來的48小時只給予H2O，所有都根據(jù)以上實施例1所述的方法。
預(yù)期結(jié)果與使用HMW PEG(15-20kD)得到的結(jié)果類似，見圖1和實施例1。使用Fisher Exact檢驗，確定任何保護作用的統(tǒng)計學(xué)顯著性(P＜0.001)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，任意的HMW PEG-樣化合物都適用于測定針對手術(shù)干預(yù)例如30％肝切除后發(fā)生的腸-衍生的膿毒病的保護作用。可以將具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的保護作用的那些化合物，如通過Fisher Exact檢驗(P＜0.0001)所揭示的，容易地鑒別為根據(jù)本發(fā)明的化合物。作為對照，可以進行盲腸內(nèi)容物、粘膜、肝和血液中的細菌計數(shù)的單向ANOVA，以確保在沒有HMW PEG-樣化合物的情況下進行手術(shù)和銅綠假單胞菌攻擊的生物的盲腸內(nèi)容物、粘膜、肝和血液中的細菌計數(shù)表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(P＜0.001)。在測定中可以包含的另一個對照是，對一些生物進行“假”操作，例如在經(jīng)歷肝切除的實驗生物的情況下的假剖腹術(shù)。預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的HMW PEG-樣化合物會產(chǎn)生肝和血液細菌計數(shù)的統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低(P＜0.05)，優(yōu)選地會預(yù)防可檢測水平的病原體的任何播散。而且，在這樣的測定中，可以使用對腸-衍生的膿毒病敏感的任何生物，且將生物置于發(fā)生腸-衍生的膿毒病的危險中的事件，可以是已知與增加的腸-衍生的膿毒病危險相關(guān)聯(lián)的任何事件，例如包含或多或少肝喪失的手術(shù)肝切除，其它手術(shù)操作或完全其它事件，只要已知這樣的事件與增加的腸-衍生的膿毒病危險相關(guān)聯(lián)。預(yù)期在生理應(yīng)激后(例如，在術(shù)后護理過程中)實施時，HMW PEG-樣療法在預(yù)防與膿毒病有關(guān)的死亡或嚴(yán)重病的方法中將有效。而且，在應(yīng)激的導(dǎo)入是可預(yù)見的情況下，可以在生理應(yīng)激前(例如，術(shù)前護理)，使用HMW PEG-樣療法，以降低嚴(yán)重病或死亡的危險。HMWPEG-樣療法也可以用于改善與腸-衍生的膿毒病有關(guān)的疾病、障礙或異常狀況的相關(guān)癥狀。
實施例10HMW PEG-樣化合物穩(wěn)定乳桿菌GG(一種益生菌治療劑)的輸送來自益生微生物乳桿菌GG(LGG)的條件培養(yǎng)基會誘導(dǎo)腸上皮細胞中細胞保護性熱休克蛋白hsp 25和hsp 72的表達。見2004年4月20日提交的名稱為“Cytoprotective Factors Derived fromProbiotic and Commensal Flora Microorganisms”、發(fā)明人為EugeneChang和Elaine Petrof的臨時美國專利申請?zhí)朹__________(代理人卷號27373/40049)，其在本文中整體引作參考。研究了治療性條件培養(yǎng)基的輸送，以確定在有HMW PEG-樣化合物存在下的施用是否會產(chǎn)生任何改善。
為了本實施例所述的實驗，將HMW PEG(15-20kD)用作HMW PEG-樣化合物，YAMC(年輕成年小鼠結(jié)腸)細胞是測定的對象。YAMC細胞是一種有條件地永生化的小鼠結(jié)腸上皮細胞系，其源自在MHC II類啟動子的干擾素-γ敏感部分控制下表達溫度敏感性SV40大T抗原(tsA58)的轉(zhuǎn)基因的Immortimouse。該細胞是R.Whitehead博士(Vanderbilt University，Nashville，TN)的慷慨贈品。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到，可以使用其它可容易地得到的非終末分化的腸細胞替代YAMC細胞。在允許的條件(33℃)下，將YAMC細胞維持在添加了ITS+Premix(BD Biosciences，Bedford，MA)的含有5％(v/v)胎牛血清，5U/ml鼠干擾素-γ(IFN-γ；GibcoBRL，Grand Island，NY)，50ug/ml鏈霉素，50U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在非允許的(非轉(zhuǎn)化的)條件下，在37℃，在沒有干擾素-γ(IFN-γ)的情況下，這些細胞經(jīng)歷分化，并形成成熟的上皮細胞功能和性質(zhì)，包括緊密連接形成，極性，微絨毛頂膜，和運輸功能。
以2.5×105/60mm組織培養(yǎng)皿的密度，平板接種細胞。在33℃生長24小時以允許細胞貼壁后，將培養(yǎng)基替換為沒有IFN的培養(yǎng)基，將細胞轉(zhuǎn)移到37℃(非允許的條件)24小時，允許分化的結(jié)腸細胞表型的形成。用LGG條件培養(yǎng)基(1∶10稀釋，或600ul)處理細胞過夜，或本文所述的其它條件，然后裂解，進行蛋白印跡分析。
處理后，洗滌細胞2次，然后在冰冷的HBS(150mM NaCl，5mM KCl，10mM HEPES pH7.4)中刮擦。沉淀細胞(14,000xg，20秒，室溫)，然后重新懸浮在冰冷的裂解緩沖液[10mM Tris pH7.4，5mM MgCl2，50U/ml DNA酶和RNA酶，加有完全蛋白酶抑制劑混合物(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)]中。使用雙金雞納酸方法，確定蛋白濃度。加入3X Laemmli終止緩沖液后，將樣品加熱至75℃5分鐘，然后在-80℃保藏，在1周內(nèi)使用。
為了蛋白印跡分析，在12.5％SDS-PAGE上分辨20微克蛋白/泳道，并在1XTowbin緩沖液(組成25mM Tris，192mM甘氨酸，pH8.8，15％vol/vol甲醇)中，轉(zhuǎn)到PVDF膜(Polyscreen，Perkin-Elmer NEN，Boston，MA)上，如本領(lǐng)域已知的。在室溫，在TBS-Tween(含有0.05％(v/v)Tween 20的Tris-緩沖的鹽水(150mM NaCl，5mM KCl，10mM Tris，pH7,4))中的5％(w/v)脫脂乳中，封閉膜1小時。將一抗加入TBS-Tween，并在4℃與特異性的抗-hsp 25抗體(SPA801，Stressgen，Victoria，BC，Canada)，抗-hsp 72抗體(SPA 810，Stressgen)，或抗-hsc 73抗體(SPA 815，Stressgen)溫育過夜。然后，在室溫，在TBS-Tween中洗滌印跡5次，每次10分鐘，再在室溫與過氧化物酶-綴合的二抗(Jackson lmmunoresearch Labs，Inc.Fort Washington，PA)溫育1小時。然后，在TBS-Tween中洗滌膜(5次×10分鐘)，最后在TBS(無Tween)中洗滌。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，用增強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑(Supersignal，Pierce，Rockford，IL)，使印跡可視化，并顯色。
初步的結(jié)果證實，單獨的HMW PEG不能在腸上皮細胞中誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(圖7，泳道2)，且LGG處理之前的HMW PEG處理顯示出會阻斷用LGG處理通常會看到的hsp表達的誘導(dǎo)，如果它在LGG之前施用(比較圖7的泳道3和4)。相反地，在HMW PEG之前施用LGG，導(dǎo)致與單獨的LGG無異的hsp表達(對比泳道3和5)，表明HMW PEG如果在LGG之后施用則不抑制hsp表達的誘導(dǎo)。
然后，使用多種不同比例的LGG+HMW PEG混合物，處理腸上皮細胞，以確定該組合是否會導(dǎo)致更強烈的熱休克蛋白反應(yīng)，并確定需要的最佳組合。數(shù)據(jù)表明，1∶1比例的LGG∶HMW PEG(圖7，泳道7)和1∶1.5比例(圖7，泳道10)，是能導(dǎo)致最強烈的熱休克蛋白表達的2種組合。實際上，后一種組合產(chǎn)生甚至比熱應(yīng)激更強烈的信號，所述熱應(yīng)激是通常用于刺激熱休克蛋白產(chǎn)生的金標(biāo)準(zhǔn)(對比圖7的泳道9和10)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到，可以改變治療劑(例如，LGG條件培養(yǎng)基)與HMW PEG-樣化合物的比例，且這樣的變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)然，也可以改變特定的HMW PEG-樣化合物，在使用前測定給定的HMW PEG-樣化合物的功效。盡管HMW PEG和HMW mPEG是目前優(yōu)選的化合物，預(yù)期許多種類的HMW PEG-樣化合物可以用于本發(fā)明中。另外，由于已經(jīng)揭示LGG的細胞保護性化合物存在于條件培養(yǎng)基中，技術(shù)人員可以使用眾多常規(guī)技術(shù)中的任一種，取得活性化合物的更純制品，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括，HMW PEG-樣化合物可以用于這樣的制品的施用。例如，本發(fā)明包含源自LGG的熱-穩(wěn)定的、酸-穩(wěn)定的且大小小于10kD的蛋白或肽治療劑，其在有HMW PEG-樣化合物存在下施用。更一般地，預(yù)期HMW PEG-樣化合物可以用于許多種類的益生治療劑的施用中，包括完整的微生物以及條件培養(yǎng)基，部分地純化的制品，純化成均勻同質(zhì)的制品，和化學(xué)合成的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的HMW PEG-樣化合物也可以用于輸送具有廣泛范圍的結(jié)構(gòu)(例如，肽，蛋白，小分子效應(yīng)物等)和治療作用的非-益生治療劑。
實施例11HMW PEG-樣化合物穩(wěn)定VSL#3(一種益生治療劑)的輸送已經(jīng)顯示，來自益生微生物混合物VSL#3(VSLPharmaceuticals，Inc.，Gaithersburg，MD)的條件培養(yǎng)基通過誘導(dǎo)熱休克蛋白hsp 25和hsp 72的表達，和通過抑制IκBα(包括磷酸化的IκBα)的降解，可能是通過它對細胞例如上皮細胞內(nèi)的某些蛋白酶體活性的選擇性作用(抑制胰凝乳蛋白酶-樣活性，輕微抑制半胱天冬酶-樣活性，無可檢測抑制胰蛋白酶-樣活性)，影響腸上皮細胞。結(jié)果，VSL#3影響經(jīng)受NFκB基因表達調(diào)控的基因的表達。見2004年2月6日提交的臨時美國專利申請?zhí)?0/542,725和2004年4月20日提交的名稱為“Cytoprotective and anti-Inflammatory Factors DerivedFrom Probiotic and Commensal Flora Microorganisms”、發(fā)明人為Eugene Chang和Elaine Petrof的臨時美國專利申請?zhí)?代理人卷號27373/40027)，每一篇在本文中整體引作參考。研究了治療性條件培養(yǎng)基的輸送，以確定在有HMW PEG-樣化合物存在下的施用是否會產(chǎn)生任何改善。
使用作為HMW PEG-樣化合物的HMW PEG，來自VSL#3的條件培養(yǎng)基和YAMC細胞，進行本文所述的實驗。
YAMC細胞的生長，IFNγ的添加，在非允許的溫度的溫育，向含有或沒有HMW PEG-樣化合物的VLS#3條件培養(yǎng)基的暴露，細胞裂解和蛋白印跡分析，都如實施例11所述進行，用等量的VSL#3條件培養(yǎng)基替代其中所述的LGG條件培養(yǎng)基。
VSL#3條件培養(yǎng)基以時間-依賴性的方式，喪失它的益生生物活性，這似乎獨立于它的保藏溫度。將幾批已經(jīng)開始喪失它們的生物學(xué)活性和誘導(dǎo)熱休克蛋白的能力的VSL#3條件培養(yǎng)基，分別與HMW PEG相組合，以嘗試恢復(fù)它們的效力。通常，600ul條件培養(yǎng)基是用于誘導(dǎo)腸上皮細胞的熱休克反應(yīng)的最佳量。這些減弱批次的VSL#3條件培養(yǎng)基都需要觀察到效應(yīng)通常所需量的2倍，且僅能較弱地誘導(dǎo)反應(yīng)(見圖8的泳道2，6，和10)。
將以前在LGG實驗中確定的相同比例(見實施例10)保持作為益生菌-HMW PEG混合物的最佳比例，將600ul減弱的VSL#3條件培養(yǎng)基與600ul HMW PEG相混合，并應(yīng)用于上皮細胞表面。盡管600ul單獨的VSL#3不能誘導(dǎo)任何熱休克反應(yīng)，(圖8的泳道1，5，和9)，HMW PEG的添加不但能增強熱休克蛋白表達，還能完全恢復(fù)3個獨立批次的減弱的VSL3#條件培養(yǎng)基的效力(對比圖8的泳道3，7，和11)。在批次H的情況下，HMW PEG的添加，恢復(fù)了已經(jīng)完全喪失的活性(即檢測不到的；將圖8的泳道9和10與泳道11相對比)。
進行實驗，以確定進行洗出研究是否能消除HMW PEG的增強作用，即在細胞上應(yīng)用VSL-HMW PEG混合物，并放置10分鐘，然后吸掉，并將培養(yǎng)基替換為新鮮的培養(yǎng)基。16小時后，收獲細胞，評價熱休克蛋白表達。用單獨的VSL#3減弱的條件培養(yǎng)基進行這樣的處理，不產(chǎn)生信號，但是對于VSL-HMW PEG混合物，對所有3個減弱的批次都觀察到了強烈的熱休克蛋白誘導(dǎo)(圖8的泳道4，8，和12)。這表明，向益生混合物添加HMW PEG，不僅能增強它們的效力，還能延長它們的半衰期。不希望受理論的約束，半衰期延長可能是由于HMW PEG的粘附性質(zhì)，這可能會使益生的生物活性因子保持接觸上皮細胞，甚至在洗出處理后。也作為非限制性的理論觀察，可能HMW PEG也穩(wěn)定益生因子的結(jié)構(gòu)。還顯示了熱休克的陽性對照細胞(圖8，泳道14)和未處理的陰性對照細胞(圖8，泳道13)。
如實施例10所指出的，可以改變治療劑(例如，VSL#3條件培養(yǎng)基)與HMW PEG-樣化合物的比例，且這樣的變化是本發(fā)明可預(yù)期的，如同使用的特定HMW PEG-樣化合物的變化。另外，包括VSL#3條件培養(yǎng)基中的活性化合物的更純制品，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可以對VSL#3條件培養(yǎng)基進行其它的純化努力，以生產(chǎn)具有小于10kD的平均分子量的酸穩(wěn)定的且醚可提取的蛋白或肽的更純制品，且這樣的治療劑包含在本發(fā)明的方法和應(yīng)用中。根據(jù)本發(fā)明的HMW PEG-樣化合物可以用于輸送益生的和/或非-益生的治療劑，其具有廣范圍的結(jié)構(gòu)(例如，肽，蛋白，小分子效應(yīng)物等)，且表現(xiàn)出廣范圍的治療作用。
實施例12HMW PEG-樣化合物在體內(nèi)輸送過程中穩(wěn)定治療劑的應(yīng)用廣泛種類的化學(xué)和生物治療劑和藥物適于使用包含HMW PEG-樣化合物的輸送系統(tǒng)輸送給上皮細胞。預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的化合物的保護或穩(wěn)定方面，能拓寬適于施用(例如施用給上皮粘膜例如腸)的治療劑的范圍。突出的實例是治療性蛋白胰島素，其尚不適于經(jīng)口輸送，對于許多糖尿病患者需要每日注射。合適的蛋白治療劑的另一個實例包含激素療法。關(guān)于本發(fā)明的涉及輸送系統(tǒng)在施用蛋白性的(例如，蛋白，多肽或肽)治療劑中的應(yīng)用的方面，本發(fā)明包含以能有效地打開上皮細胞(例如，腸的上皮細胞)的緊密連接的量另外添加PA-I凝集素/粘附素，以促進蛋白性的治療劑的攝取。
通過本發(fā)明的系統(tǒng)輸送的治療劑范圍的示例是小分子治療劑，例如用于治療癌性狀況的小分子化療劑。可以容易地測定該范圍的化學(xué)試劑中任一種使用本文公開的輸送系統(tǒng)的合適性，包括本領(lǐng)域已知的放射化學(xué)的和生物的包括蛋白性的治療劑。預(yù)期大量的這樣的治療劑可以使用該輸送系統(tǒng)施用，打開新的輸送途徑，或增強已知的輸送治療劑的途徑。根據(jù)本文提供的說明，施用這樣的治療劑。見例如實施例1，9，10和11。
本發(fā)明的該方面的其它示例性的實施方案是，使用本發(fā)明的HMWPEG-樣輸送系統(tǒng)，施用治療劑，以預(yù)防、治療或改善性傳播疾病的癥狀。例如，AIDS的治療，包含通過陰道的、經(jīng)口的或直腸的(例如，作為栓劑)輸送，施用在HMW PEG-樣化合物(例如HMW PEG)的溶液中的有效量的抗-HIV治療劑。在一個實施方案中，治療劑是益生微生物或源自它的活性組分；在其它實施方案中，治療劑是任意的已知的抗-HIV治療劑。這樣的治療劑和實際上本文公開的或本領(lǐng)域已知的任何治療劑的有效量，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定，且取決于變量如年齡、體重、一般健康等，如本領(lǐng)域會理解的?？紤]到報道說為提供臨床用疫苗進行抗-HIV疫苗開發(fā)可能還需要十年，預(yù)期這些治療輸送系統(tǒng)會提供顯著的健康益處。
考慮上面的教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進和變化是可能的，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物的完整內(nèi)容，在這里引作參考。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)品，其包含標(biāo)簽包裝材料和包含在所述包裝材料內(nèi)的有效量的高分子量聚乙二醇-樣(HMW PEG-樣)化合物，其中所述包裝材料包含標(biāo)簽或包裝說明書，其指示著所述HMW PEG-樣化合物可以用于治療、改善或預(yù)防選自發(fā)炎的上皮和包含屏障機能障礙的上皮的狀況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述HMW PEG-樣化合物是高分子量聚鏈烷、聚烯烴或聚烷撐二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中所述高分子量(HMW)聚鏈烷、聚烯烴或聚烷撐二醇選自HMW聚丙二醇，HMW聚乙二醇(HMW PEG)和其混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的產(chǎn)品，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMWPEG。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中所述HMW PEG-樣化合物選自HMWPEG，HMW聚甲氧基PEG，HMW單甲氧基PEG，HMW聚丙二醇和其混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的產(chǎn)品，還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的產(chǎn)品，其中所述官能團是甲氧基。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的產(chǎn)品，還包含選自下述的接頭直鏈C1-C10烷基，有支鏈的C1-C10烷基，芳基和其混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的產(chǎn)品，其中所述接頭是苯基。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中所述HMW PEG-樣化合物是在水溶液中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的產(chǎn)品，其中所述HMW PEG-樣化合物是以至少5％(w/v)的濃度存在于溶液中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的產(chǎn)品，其中所述HMW PEG-樣化合物是以10％至20％(w/v)的濃度存在于溶液中。
13.根據(jù)權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中所述HMW PEG-樣化合物具有大于12,000道爾頓的平均分子量。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的產(chǎn)品，其中所述平均分子量是至少15,000道爾頓。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的產(chǎn)品，其中所述平均分子量大于15,000道爾頓且小于20,000道爾頓。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述標(biāo)簽包裝材料提供了施用化合物來治療、改善或預(yù)防選自上皮炎癥和上皮屏障機能障礙的狀況的說明。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的產(chǎn)品，其中所述狀況選自腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的產(chǎn)品，其中所述狀況是選自下述的免疫障礙白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙和其混合。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的產(chǎn)品，其中所述狀況是選自下述的炎性腸病潰瘍性結(jié)腸炎，克羅恩病和其混合。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)品，還包含治療有效量的治療劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的產(chǎn)品，其中所述治療劑選自益生微生物制劑，源自至少一種益生微生物的組合物，鎮(zhèn)痛化合物，抗炎化合物，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑，抗生素，抗癌劑，抗?jié)儎?，生長因子，細胞因子，蛋白激素，三葉蛋白和其混合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中所述治療劑選自5-氨基水楊酸，包含5-氨基水楊酸部分的化合物，皮質(zhì)類甾醇，甲氨蝶呤，6-巰基嘌呤，環(huán)孢菌素，萬古霉素，甲硝唑，頭孢菌素，紫杉烷，包含紫杉烷部分的化合物，喜樹堿，包含喜樹堿部分的化合物，5-氟尿嘧啶，包含5-氟尿嘧啶部分的化合物，抗雄激素化合物，抗雌激素化合物，表皮生長因子，腸三葉因子，胰島素，生長抑素，干擾素和其混合。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中所述治療劑是益生乳酸菌。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的產(chǎn)品，其中所述治療劑是選自下述的微生物制劑乳桿菌GG(LGG)，VSL#3和其混合。
25.向有此需要的對象的上皮施用治療組合物的方法，包括施用包含HMW PEG-樣化合物和有效量的治療劑的組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述治療劑選自益生微生物制劑，源自至少一種益生微生物的組合物，鎮(zhèn)痛化合物，抗炎化合物，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑，抗生素，抗癌劑，抗?jié)儎?，生長因子，細胞因子，蛋白激素，三葉蛋白和其混合。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述治療劑選自5-氨基水楊酸，包含5-氨基水楊酸部分的化合物，皮質(zhì)類甾醇，甲氨蝶呤，6-巰基嘌呤，環(huán)孢菌素，萬古霉素，甲硝唑，頭孢菌素，紫杉烷，包含紫杉烷部分的化合物，喜樹堿，包含喜樹堿部分的化合物，5-氟尿嘧啶，包含5-氟尿嘧啶部分的化合物，抗雄激素化合物，抗雌激素化合物，表皮生長因子，腸三葉因子，胰島素，生長抑素，干擾素和其混合。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMWPEG。
29.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述上皮選自腸粘膜，肺粘膜，鼻粘膜，尿道粘膜，食道粘膜，口腔粘膜和皮膚。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述對象是哺乳動物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述對象是人。
32.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中通過選自下述的途徑，施用所述組合物經(jīng)口施用，直腸施用，腸道清洗，局部施用，靜脈內(nèi)注射，腹腔內(nèi)注射，尿道內(nèi)施用，陰道施用，套管插入術(shù)和輔助呼吸。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述治療劑是蛋白性的化合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，還包括施用有效量的PA-I凝集素/粘附素。
35.治療對象中微生物-介導(dǎo)的上皮狀況的方法，包括給需要的對象施用有效量的HMW PEG-樣化合物，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMW PEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述HMW PEG-樣化合物是在包含至少10％且小于20％HMW PEG-樣化合物(w/v)的水溶液中。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述對象是哺乳動物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述對象是人。
39.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述上皮選自腸粘膜，肺粘膜，鼻粘膜，尿道粘膜，陰道粘膜，食道粘膜，口腔粘膜和皮膚。
40.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中通過選自下述的途徑，施用化合物經(jīng)口施用，直腸施用，陰道施用，向腸施用，局部施用，靜脈內(nèi)注射，腹腔內(nèi)注射，套管插入術(shù)和呼吸。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述狀況選自腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合。
42.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述狀況選自白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙和其混合。
43.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMWPEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合，且其中所述狀況選自腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合。
44根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述狀況選自白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙和其混合。
45.改善根據(jù)權(quán)利要求43的狀況的癥狀的方法，包括給需要的對象施用有效量的HMW PEG-樣化合物，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMW PEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。
46.預(yù)防根據(jù)權(quán)利要求43的狀況的方法，包括給需要的對象施用有效量的HMW PEG-樣化合物，其中所述HMW PEG-樣化合物是HMWPEG，其還包含至少一個共價結(jié)合的選自下述的官能團直鏈C1-C10烷氧基，有支鏈的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。
47.根據(jù)權(quán)利要求25-46中的任一項的HMW PEG-樣化合物在制備用于治療選自下述的狀況的藥物中的應(yīng)用腸-衍生的膿毒病，炎性腸病，腸易激綜合征，上皮的燒傷，上皮的化學(xué)接觸損傷，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，免疫障礙，嚴(yán)重的嗜中性粒細胞減少癥，中毒性結(jié)腸炎，腸病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍亂，粘膜炎癥，皮膚炎癥和其混合。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中所述狀況是選自下述的免疫障礙白血病，淋巴瘤，AIDS，銀屑病，炎性腸病，紅斑狼瘡，硬皮病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，化療-誘導(dǎo)的免疫障礙，輻射-誘導(dǎo)的免疫障礙和其混合。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于通過經(jīng)上皮的途徑輸送廣范圍的化學(xué)和生物治療劑包括蛋白治療劑的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含用于與治療化合物一起使用的高分子量聚乙二醇－樣(HMW PEG－樣)化合物。任選地，該系統(tǒng)包含一種組合物，其含有一種或多種HMW PEG樣化合物和一種或多種治療劑，其中添加了保護性聚合物例如葡聚糖和/或必需的病原體營養(yǎng)物例如L－谷氨酰胺。單獨施用時，所述HMW PEG－樣化合物也會提供治療益處。還提供了預(yù)防或治療上皮疾病、障礙或狀況的方法，例如處于發(fā)生腸－衍生的可歸因于腸病原體的膿毒病的危險中的上皮；以及監(jiān)測HMW PEG－樣化合物的施用的方法。
文檔編號A61K31/765GK1964725SQ200580018362
公開日2007年5月16日 申請日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月20日
發(fā)明者J·C·阿爾弗迪, E·B·張, E·O·佩特羅夫 申請人:芝加哥大學(xué)