專利名稱：Adamts－8蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ADAMTS-8蛋白及其衍生物和調節(jié)劑，以及使用它們治療疾病的方法，其中所述疾病表征為蛋白聚糖切割(proteoglycan cleavage)或代謝缺陷或異常。
背景技術：
ADAMTS(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondinmotifs，含血小板反應蛋白基序的解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)家族包含至少19個基于它們共同結構域而彼此相關的成員。與ADAM家族成員相比，ADAMTS蛋白缺少跨膜結構域，但包含至少一個血小板反應蛋白1型基序。典型的ADAMTS蛋白從N末端到C末端包含信號序列、前域、金屬蛋白酶催化結構域、解聯(lián)蛋白樣結構域、中央血小板反應蛋白I型重復、富含半胱氨酸結構域和間隔結構域。參見Cal等人，GENE，28349-62(2002)。許多ADAMTS蛋白還在間隔結構域之后包含一個或多個血小板反應蛋白1型重復。ADAMTS蛋白能夠通過間隔結構域和一個或多個血小板反應蛋白1型重復內的相互作用與胞外基質的組分結合。見Kuno和Matsushima，J.BIOL.CHEM.，27313912-13917(1998)。
已經(jīng)闡明了小亞型ADAMTS家族成員的生理作用，而且在一些病例中已經(jīng)暗示了其在人類疾病中的異常表達。報道稱ADAMTS-2、ADAMTS-3和ADAMTS-14起前膠原酶(procollagenase)的作用。已經(jīng)確定ADAMTS-2為負責加工I型和II型前膠原的前膠原IN-蛋白酶(pNPI)。I型前膠原加工的缺失導致保持著氨基端前肽的膠原纖維(I型pN膠原蛋白)積累。由I型pN膠原蛋白組成的纖維不能提供正常水平的抗張強度，從而導致與疾病相關的結締組織缺陷。VIIC型Ehlers-Danlos綜合癥是由于不能將I型前膠原蛋白加工為膠原蛋白，從而導致關節(jié)完整性喪失和皮膚脆性的人類隱性基因病癥。在牛、羊和一些品系的貓中發(fā)現(xiàn)的相關疾病稱為皮膚脆裂癥(“皮膚流淚”)。這兩種疾病都與ADAMTS-2活性喪失有關。ADAMTS-2活性缺失時，殘余的I型膠原蛋白氨基前肽的切割，這導致發(fā)現(xiàn)ADAMTS-14也能在體外切割I型膠原蛋白。已經(jīng)提出，ADAMTS-3是主要的II膠原N前肽酶。已經(jīng)確定ADAMTS-13是在A2結構域內特定的酪氨酸-甲硫氨酸鍵處切割血管性血友病因子(vonWillebrand factor，vWF)的血漿蛋白酶。血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)是表征為微血管血栓形成、低血小板計數(shù)以及貧血的綜合癥。假定從內皮細胞釋放的大量vWF(UL-vWF)多聚體缺乏適當切割可以導致TTP。對4個家族TTP譜系的遺傳分析表明，ADAMTS-13基因突變是這種病癥的主要原因。
已經(jīng)表明ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5和ADAMTS-9能夠以不同程度的效率切割胞外基質的蛋白聚糖。例如，ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5能切割聚集蛋白聚糖球間(interglobal)結構域(IGD)中的谷氨酸373-丙氨酸374鍵。參見Caterson等人，MATRIXBIOLOGY，19333-344(2000)。這種蛋白酶解活性稱為聚集蛋白聚糖酶活性，而谷氨酸373-丙氨酸374鍵已知為聚集蛋白聚糖酶切割位點。具有聚集蛋白聚糖酶活性的蛋白稱為聚集蛋白聚糖酶。退行性關節(jié)疾病如骨性關節(jié)炎過程中，谷氨酸373-丙氨酸374鍵在體內被水解。證據(jù)表明，聚集蛋白聚糖酶負責軟骨降解過程中主要的IGD切割。參見Caterson等人，supra。也發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4在切割短小蛋白聚糖(成年人大腦中豐富的蛋白聚糖)中起作用，而且表明其和ADAMTS-1一起切割多功能蛋白聚糖。
血管發(fā)生中涉及ADAMTS-8(也已知為Meth2)。研究顯示，重組的ADAMTS-8能在體外抑制內皮細胞增殖，并在體內檢測中抑制血管形成。參見，例如Vazquez等人，J.BIOL.CHEM.，27423349-23357(1999)。ADAMTS-8在體內或體外都表現(xiàn)出比血小板反應蛋白-1或內皮抑制素(endostain)更加有效地破壞血管發(fā)生、但仍不及ADAMTS-1有效。ADAMTS-8未鑒定出蛋白酶活性。
發(fā)明簡述本發(fā)明的特征在于分離的ADAMTS-8蛋白切割蛋白聚糖的用途。適合這個目的的方法包括用分離的ADAMTS-8蛋白接觸蛋白聚糖分子，其中所述ADAMTS-8蛋白切割蛋白聚糖分子。在許多實施方案中，被切割的蛋白聚糖分子是聚集蛋白聚糖分子，而且該分離的ADAMTS-8蛋白在谷氨酸373-丙氨酸374鍵處切割聚集蛋白聚糖分子。本發(fā)明所用ADAMTS-8蛋白可以是全長、成熟的ADAMTS-8蛋白。在一個實例中，所用ADAMTS-8蛋白包含或者由SEQ ID NO28的214-890位氨基酸組成。在另一實例中，所用ADAMTS-8蛋白由GeneBank登錄號AF060153編碼，但缺失信號肽和前域。
本發(fā)明的特征也在于以分離的ADAMTS-8衍生物切割蛋白聚糖的用途。這些ADAMTS-8衍生物包括ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結構域，并且具有全長、成熟的ADAMTS-8蛋白的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。用這種ADAMTS-8衍生物接觸蛋白聚糖分子(例如聚集蛋白聚糖分子)來切割蛋白聚糖分子。在一個實例中，本發(fā)明所用ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結構域包含或者由SEQ ID NO28的214-439位氨基酸組成。ADAMTS-8衍生物還可以包含ADAMTS-8解聯(lián)蛋白樣結構域和/或ADAMTS-8中央血小板反應蛋白I型重復。
適合本發(fā)明的ADAMTS-8衍生物可以通過任意常規(guī)方法制備。在許多情況下，ADAMTS-8衍生物不包含信號肽或前域。ADAMTS-8衍生物可以從全長的ADAMTS-8蛋白通過刪除、插入或取代選定的氨基酸殘基來制備。在一個實施方案中，本發(fā)明所用ADAMTS-8衍生物包含或者由SEQ ID NO28的214-588位氨基酸組成。已經(jīng)表明，由相應氨基酸序列組成的ADAMTS-7或ADAMTS-9衍生物保持原始全長蛋白質的聚集蛋白聚糖酶活性。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于重組產生的ADAMTS-8蛋白或它們的衍生物切割蛋白聚糖的用途。適合這個目的的方法包括從重組表達載體中表達ADAMTS-8蛋白或其衍生物。該表達的ADAMTS-8蛋白或衍生物接觸后切割蛋白聚糖分子(例如聚集蛋白聚糖分子)。本文描述的任意ADAMTS-8蛋白或衍生物都可以重組產生。在許多實施方案中，在哺乳動物細胞中表達重組載體編碼的ADAMTS-8蛋白或衍生物，其中所述哺乳動物細胞將表達的蛋白質或衍生物分泌進入培養(yǎng)基或胞外基質區(qū)域。在一個實例中，本發(fā)明所用重組表達載體包含SEQ ID NO28的214-890位氨基酸的編碼序列。在另一實例中，本發(fā)明所用重組表達載體包含SEQ IDNO28的214-588位氨基酸的編碼序列。在另一實例中，本發(fā)明所用重組表達載體包含GeneBank登錄號AF060153的蛋白質編碼序列。
根據(jù)本發(fā)明被切割的蛋白聚糖可以定位于組織、組織培養(yǎng)物或細胞培養(yǎng)物中。分離或重組產生的ADAMTS-8蛋白或衍生物可以通過任意常規(guī)方法遞送至組織部位，其中所述任意常規(guī)方法例如通過腸胃外、靜脈內、局部、皮內、經(jīng)皮或皮下給予，或者通過向組織部位上選定的細胞中引入編碼ADAMTS-8蛋白或衍生物的表達載體。
本發(fā)明的特征也在于鑒定ADAMTS-8調節(jié)劑的方法。這些方法包括在存在或不存在目的試劑時，用蛋白聚糖分子(例如聚集蛋白聚糖分子)接觸ADAMTS-8蛋白或衍生物；并測定存在或不存在該試劑時，ADAMTS-8蛋白或衍生物的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
與不存在所述試劑時相比，存在該試劑時蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)的改變表明該試劑能夠調節(jié)ADAMTS-8蛋白或衍生物的蛋白聚糖切割活性。本文所述的任意ADAMTS-8蛋白或衍生物都可以用來篩選ADAMTS-8的調節(jié)劑。根據(jù)本發(fā)明鑒定的調節(jié)劑可以抑制(例如降低或消除)或增強ADAMTS-8蛋白的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
本發(fā)明的特征也在于ADAMTS-8調節(jié)劑治療疾病的用途，其中所述疾病表征為蛋白聚糖切割(例如聚集蛋白聚糖切割)缺陷或異常。適合這個目的的方法包括向需要其的哺乳動物施用治療有效量的ADAMTS-8調節(jié)劑。只要ADAMTS-8調節(jié)劑能夠到達預期組織部位、并在該部位有效地改變蛋白聚糖切割活性，那么可以使用任何給藥途徑。通過本發(fā)明鑒定的任意ADAMTS-8調節(jié)劑都可以用來治療蛋白聚糖缺陷或異常。
組織部位的蛋白聚糖切割活性也可以通過在該部位引入分離的ADAMTS-8蛋白或衍生物、或者通過在該部位表達重組的ADAMTS-8蛋白或衍生物來調節(jié)。此外，胞外基質區(qū)域中的蛋白聚糖切割活性可以通過抑制該區(qū)域所選細胞中ADAMTS-8的表達來調節(jié)。適合這個目的的方法包括但不局限于在所選細胞中引入或表達ADAMTS-8的RNAi或反義序列。許多情況下，所用RNAi或反義序列是ADAMTS-8基因特異的，并且不抑制其他蛋白酶基因的表達。
本發(fā)明的特征也在于包含ADAMTS-8蛋白或其衍生物或調節(jié)劑的藥物組合物。
本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點在下文的詳細描述中是顯而易見的。但是，應當理解的是，在說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時的詳細描述僅作為示例性說明，并不作為限制。從詳細描述中可見本發(fā)明范疇之內的多種改變或變更對本領域技術人員而言是顯而易見的。
附圖簡述附圖用來進行示例性陳述而不作為限制。


圖1闡明了ADAMTS家族成員的進化系統(tǒng)樹。用CLUSTALW比較了多個ADAMTS蛋白質的氨基酸序列，并用TreeView展示。系統(tǒng)發(fā)生圖基于序列相關性對蛋白質進行分組。
圖2A顯示從CHO條件培養(yǎng)基分離的，以Strep-tag純化(IBA，Germany)的ADAMTS-8蛋白的蛋白質級分的10％SDS-PAGE。SDS-PAGE用考馬斯亮藍染色。泳道1、CHO細胞的條件培養(yǎng)基；泳道2、超濾液(ultrafiltration)的流出級分(濾出液)；泳道3、濃縮超濾液的存留級分；泳道4、Streptactin柱流出級分；泳道5-9、Streptactin柱洗滌級分；泳道10-15、Streptactin柱洗脫級分。
圖2B是圖2A SDS-PAGE的Western印跡，其中使用抗Strep-TagII的多克隆抗血清(IBA)。
圖3A描述76種不同人組織中mRNA的多組織表達陣列，其中用人ADAMTS-8基因的cDNA片段探針探測。
圖3B顯示圖3A的多組織表達陣列中所用mRNA的來源?？瞻卓?blank box)表明在那些坐標處沒有mRNA被雜交上斑點。具有高相對豐度ADAMTS-8mRNA的組織是肺(A8)、主動脈(B4)和胎兒心臟(B11)，而在闌尾(G5)和大腦的多個區(qū)域(A1-G1、C3-H3和B3)檢測到低水平的ADAMTS-8mRNA。
圖4顯示通過實時PCR測定的無病和患骨性關節(jié)炎性軟骨的人臨床樣品中ADAMTS-8mRNA表達水平的柱狀圖。樣品W-04至W-13代表非OA感染(“無病”)的膝關節(jié)軟骨。樣品W-77M至W-96M代表代表晚期OA關節(jié)軟骨的可見非感染區(qū)域(“溫和OA”)。樣品88S-98S代表晚期OA關節(jié)軟骨的嚴重感染區(qū)域(“嚴重OA”)。每個樣品中ADAMTS-8mRNA的豐度都報道為標準值，其中用ADAMTS-8測得的平均數(shù)據(jù)除以同一樣品中GAPDH測得的平均數(shù)據(jù)。
圖5顯示用單克隆抗體AGG-C1進行競爭性抑制ELISA的結果。用生物素化的aggc1肽包被鏈霉親和素包被的微量滴定板。抑制分析用下列競爭劑進行合成肽GGLPLPRNITEGE(SEQ ID NO22，實心框)、GGLPLPRNITEGEARGSVILTVK-CONH2(SEQ ID NO23，空心框)、經(jīng)ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖(實心圓)和未經(jīng)消化的聚集蛋白聚糖(空心圓)。
圖6A是經(jīng)ADAMTS-4和ADAMTS-8消化的牛聚集蛋白聚糖，用單克隆抗體BC-3進行的Western印跡。將牛聚集蛋白聚糖不與或與ADAMTS-4或ADAMTS-8于37℃孵育16小時。用SDS-PAGE分離消化產物，并通過用單克隆抗體BC-3進行Western免疫印跡來顯示。泳道1、未加入酶；泳道2、經(jīng)ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖(1∶20摩爾比的酶∶底物)；泳道3-7、經(jīng)ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖，其中酶與底物的摩爾比如每泳道上所示)。印跡左側顯示球形蛋白質標準的遷移位置。
圖6B是經(jīng)ADAMTS-8消化的牛聚集蛋白聚糖，用單克隆抗體AGG-C1進行的Western印跡。將牛聚集蛋白聚糖不與或與摩爾比率逐漸增加的ADAMTS-8于37℃孵育16小時。用SDS-PAGE分離消化產物，并通過用單克隆抗體AGG-C1進行Western印跡來顯示。給出了每個消化物中酶∶底物的相對摩爾比率。
圖6C描述經(jīng)ADAMTS-4消化的牛聚集蛋白聚糖，用單克隆抗體AGG-C1進行的Western印跡。將牛聚集蛋白聚糖(12.5pmol)不與或分別與0.05ng、0.1ng、0.25ng、0.5ng或1ng ADAMTS-4于37℃孵育16小時。用SDS-PAGE分離消化產物，并通過用AGG-C1進行Wester免疫印跡來顯示。給出了每個消化物中酶∶底物的相對摩爾比率。
圖7顯示聚集蛋白聚糖酶活性的競爭性抑制ELISA結果。標準曲線通過用增加量的重組ADAMTS-4與牛聚集蛋白聚糖在37℃孵育16小時、隨后，往每個消化物中加入單克隆抗體AGG-C1制備。大約需要1ngADAMTS-4來產生導致競爭性抑制ELISA中45％抑制的聚集蛋白聚糖切割產物量。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特征在于ADAMTS-8蛋白或其衍生物切割蛋白聚糖分子的用途。本發(fā)明的特征也在于鑒定能夠抑制或增強ADAMTS-8蛋白酶解活性的ADAMTS-8調節(jié)劑的方法。此外，本發(fā)明提供了包含ADAMTS-8蛋白或其衍生物或調節(jié)劑的藥物組合物。這些藥物組合物可以用來治療表征為蛋白聚糖切割或代謝缺陷或異常的病癥。
下文部分詳細描述了本發(fā)明的多個方面。這些部分的用途不在于限制發(fā)明。每個部分都可以應用于發(fā)明的任何方面。在本申請中，除非另外說明，否則“或”都用來表示“和/或”。
I.ADAMTS-8蛋白及其功能性衍生物本發(fā)明的特征在于成熟的ADAMTS-8蛋白切割聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖分子的用途。成熟的ADAMTS-8蛋白缺少信號肽和前域。合適的成熟ADAMTS-8蛋白的實例包括但不局限于全長、成熟的ADAMTS-8蛋白(例如由GeneBank登錄號AF060153編碼、經(jīng)弗林蛋白酶加工的ADAMTS-8蛋白)，以及通過輔助結構域的可變性RNA剪接或蛋白酶解加工產生的ADAMTS-8同工型。已經(jīng)在ADAMTS-8家族的某些成員中觀察到可變性RNA剪接，其導致刪除一個或多個C末端血小板反應蛋白1型重復。也已經(jīng)報道，某些ADAMTS-8家族成員在成熟過程中蛋白酶解地移去C末端的輔助結構域。
本發(fā)明也涉及未加工的ADAMTS蛋白質切割聚集蛋白聚糖或其他聚糖分子的用途。這些未加工的蛋白質包含信號肽或前域。在許多情況下，未加工的ADAMTS-8蛋白在適當?shù)乃拗骷毎兄亟M表達，并分泌進入培養(yǎng)基或胞外基質區(qū)域。這些分泌的蛋白質一般缺少信號序列。這些蛋白質可以進一步進行蛋白酶解來除去前域。
本發(fā)明所用的ADAMTS-8蛋白可以是天然存在的蛋白質，例如由GeneBank登錄號AF060153編碼的蛋白質或其天然存在的蛋白酶解產物。在一個實例中，本發(fā)明所用的ADAMTS-8蛋白包含SEQ ID NO28的214-890位氨基酸。
本發(fā)明的特征也在于天然存在的ADAMTS-8蛋白變體切割聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖分子的用途。這些變體保持著原始蛋白質的蛋白聚糖切割活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。變體的氨基酸序列與原始蛋白質的氨基酸序列基本是同一性的。在一個實例中，變體的氨基酸序列具有與原始蛋白質至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的整體序列同一性或相似性。序列同一性或相似性可以用本領域已知的多種方法測定。例如，序列同一性或相似性可以用標準比對算法測定，如Altschul等人J.MOL.BIOL.，215403-410(1990)中描述的局部比對基本工具(Basic Local Alignment Tool，BLAST)、Needleman等人J.MOL.BIOL.，48444-453(1970)的算法、Meyers等人COMPUT.APPL.BIOSCI.，411-17(1988)的算法和點陣分析(dot matrixanalysis)。適合這個目的的軟件包括但不局限于國家生物技術信息中心(Bethesda，MD)提供的BLAST程序和DNASTAR公司(Madison，WI)提供的MegAlign。在一個實例中，序列同一性和相似性用GeneticsComputer Group(GCG)程序GAP(Needleman-Wunsch算法)測定。使用程序設計的默認值(例如序列之一中空位罰分為11，而延伸空位罰分為8)。相似的氨基酸可以用BLOSUM62取代矩陣定義。
ADAMTS-8蛋白變體可以天然存在，例如通過等位基因變異或多態(tài)現(xiàn)象，或是故意產生的。在許多實例中，可以在蛋白質序列中引入保守氨基酸取代而不顯著改變蛋白質的結構或生物學性質。保守氨基酸取代可以在殘基極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性或兩親性質相似的基礎上進行。例如，保守氨基酸取代可以在具堿性側鏈例如賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Am或R)和組氨酸(His或H)的氨基酸、具酸性側鏈例如天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)的氨基酸、具不帶電荷極性側鏈例如天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)和酪氨酸(Tyr或Y)的氨基酸、具非極性側鏈例如丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)、色氨酸(Trp或W)和半胱氨酸(Cys或C)的氨基酸之間進行。其他合適的氨基酸取代如表1所示。
表1.示例性氨基酸取代


非天然存在的氨基酸殘基也可以用于取代。這些氨基酸殘基一般通過化學肽合成引入，而非在生物系統(tǒng)中合成。
此外，ADAMTS-8變體可以包含增加分子穩(wěn)定性的氨基酸取代。其他期望的氨基酸取代(無論是保守的還是非保守的)也可以引入ADAMTS-8蛋白。例如，可以鑒定對ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解性質重要的氨基酸殘基。可以選擇能夠或者降低蛋白酶解活性的取代。
此外，ADAMTS-8變體可以包含糖基化位點修飾。這些修飾可以涉及O-連接或N-連接的糖基化位點。例如，可以取代或刪除與天冬酰胺連接的糖基化識別位點處的氨基酸殘基，從而導致部分糖基化或者糖基化的完全缺失。與天冬酰胺連接的糖基化識別位點一般包含被適當細胞糖基化酶識別的三肽序列。這些三肽序列可以是，例如天冬酰胺-X-蘇氨酸或天冬酰胺-X-絲氨酸，其中所述X一般為任意氨基酸。糖基化識別位點第一或第三個氨基酸位置上一處或兩處的多種氨基酸取代或刪除(或者第二個位置的氨基酸刪除)可以導致修飾的三肽序列處非糖基化。此外，細菌表達也導致產生非糖基化的蛋白質，即使糖基化位點未被修飾。
也可以在ADAMTS-8變體中引入其他類型的修飾。這些修飾可以通過天然發(fā)生過程例如翻譯后修飾，或者通過人工或合成過程引入。修飾可以發(fā)生在多肽的任意位置，其中包括主鏈、氨基酸側鏈、以及氨基或羧基末端。相同類型的修飾可以以相同或不同程度出現(xiàn)在變體的幾個位置。變體也可以包括許多不同類型的修飾。適合本發(fā)明的修飾包括但不局限于乙?；?、?；饔?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素共價吸附(covalentattachment)、血紅素部分共價吸附、核苷酸或核苷酸衍生物共價吸附、脂質或脂質衍生物共價吸附、磷脂酰肌醇共價吸附、交叉連接、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基作用、形成共價交叉連接、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸(pyroglutamate)、甲?；?、γ-羥基化、糖基化、形成GPI錨定、羧基化、碘化、甲基化、亞寇?；⒀趸?、pegylation、蛋白酶水解加工、磷酸化、異戊二烯化(prenylation)、外消旋化、selenoylation、硫酸鹽化、轉運RNA介導的蛋白質氨基酸加入、例如精氨酸(arginylation)、泛素化或其任意組合。多肽變體可以是分支的(例如泛素化的結果)，或者是具或不具分支的環(huán)形。
本發(fā)明所用ADAMTS-8變體可以與原始的ADAMTS-8蛋白在一個或多個區(qū)域基本相同，而在其他區(qū)域不同。ADAMTS-8變體可以保持原始ADAMTS-8蛋白的整體結構域結構。在一個實施方案中，變體通過修飾天然存在的ADAMTS-8序列至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50個或更多氨基酸殘基來制備。示例性修飾包括但不局限于取代、刪除和插入。取代可以是保守的、非保守的或者兩者兼而有之。這些修飾不顯著地影響原始蛋白質的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。例如，變體可以保持原始ADAMTS-8蛋白至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。變體也可以具有比最初ADAMTS-8蛋白提高了的蛋白酶解活性(例如提高了的聚集蛋白聚糖酶活性)。
本發(fā)明的特征還在于ADAMTS-8衍生物切割聚集蛋白聚糖或蛋白聚糖分子的用途。這些ADAMTS-8衍生物為具一個或更多氨基酸殘基刪除或修飾的經(jīng)修飾蛋白質。在一個實例中，ADAMTS-8衍生物包括刪除全長ADAMTS-8蛋白輔助結構域的實質部分。在另一實例中，ADAMTS-8衍生物包括從全長ADAMTS-8蛋白中刪除間隔結構域和C-末端血小板反應蛋白1型重復。也可為刪除間隔結構域和C末端血小板反應蛋白1型重復之后的任意區(qū)域。
在一個實施方案中，本發(fā)明所用ADAMTS-8衍生物包括刪除實質部分定位于SEQ ID NO28苯丙氨酸588之后的氨基酸殘基。已經(jīng)表明，具相應序列刪除的ADAMTS-7或ADAMTS-9截短保持著原始蛋白質的聚集蛋白聚糖酶活性。從全長ADAMTS-8蛋白刪除的氨基酸殘基可包括但不局限于定位在苯丙氨酸588C末端的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸殘基。被刪除的氨基酸殘基可以選自富含半胱氨酸的結構域、間隔結構域、C末端血小板反應蛋白1型重復或任何定位于其間或其后的區(qū)域。被刪除的殘基可以是連續(xù)或非連續(xù)的。在一個實例中，ADAMTS-8衍生物包含或由SEQ IDNO28的214-588位氨基酸組成。
也可以修飾ADAMTS-8蛋白N末端區(qū)域中的氨基酸殘基。例如，可以刪除或修飾信號序列、前域、金屬蛋白酶催化結構域、解聯(lián)蛋白樣結構域或中央血小板反應蛋白I型重復中的某些選定殘基，而不顯著降低ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
可以在ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的N末端或C末端融合附加多肽。這些多肽的非限制性實例包括肽標記、酶、抗體、受體、配體/受體結合蛋白或它們的組合。適合這個目的的抗體包括但不局限于多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、人的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、移植的或體外產生的抗體。也可以使用抗體片段。這些抗體的實例包含但不局限于Fab、F(ab’)2、Fv、Fd或dAb。
ADAMTS-8蛋白或其衍生物也可以加上肽標記。適當?shù)碾臉擞洶ǖ痪窒抻赟trep-tag(IBA)、多組氨酸或多組氨酸-甘氨酸標記、FLAG表位標記、KT3表位標記、流感HA標記多肽、c-myc標記、單純皰疹糖蛋白D、β-半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、鏈霉親和素標記、微觀蛋白表位肽、T7基因10蛋白肽標記和谷胱甘肽S-轉移酶。針對這些肽標記的抗體可以容易地從多種商品化來源獲得。代表性抗體包括抗流感HA標記多肽的抗體12CA5、以及抗c-myc標記的抗體8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10?？梢栽陔臉擞浐驮嫉鞍踪|之間加入肽接頭來增強肽標記的可及性。
可以在加入的多肽和原始蛋白質之間引入可蛋白酶解切割的位點。這些可切割位點使得能夠從加入的多肽中分離最初的蛋白質。適合這個目的的酶包括但不局限于Xa因子、凝血酶和腸激酶。
所加入的多肽可以用來方便蛋白質的純化、檢測、固定化、折疊或靶向、或者服務其他預期目的。這些多肽也可以用來增加融合蛋白的表達、可溶性或穩(wěn)定性。在許多實施方案中，所加入的多肽不顯著影響融合蛋白的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。
II.編碼ADAMTS-8蛋白或其衍生物的多核苷酸編碼ADAMTS-8蛋白或其衍生物的多核苷酸可以用多種方法制備。這些多核苷酸可以是DNA、RNA或其他可表達的核酸分子。它們可以是單鏈或雙鏈。
在一個實施方案中，用GeneBank登錄號AF060153來制備ADAMTS-8蛋白或其衍生物的編碼序列。可以用標準重組DNA技術在GeneBank登錄號AF060153的蛋白質編碼序列中引入刪除或其他修飾。DNA刪除/修飾的示例性技術包括但不局限于PCR介導的誘變、寡核苷酸指導的“環(huán)出”誘變、PCR重疊延伸、用外切核酸酶III進行的控時消化、megaprimer方法、反向PCR和自動DNA合成。
也可以用缺失文庫。這些缺失文庫包括N末端、C末端和中間缺失的ADAMTS-8蛋白的編碼序列。構建缺失文庫的示例性方法包括但不局限于Pues等人NUCLEIC ACIDS RES.，251303-1305(1997)中描述的方法。也可以用商品化的缺失試劑盒，例如EZ∷TN Plasmid-Based DeletionMachine和pWEB∷TNCTMDeletion Cosmid Transpositon Kit(Epicentre，Madison，WI)來產生ADAMTS-8缺失文庫。選擇保持著原始ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性的缺失。
本發(fā)明所用多核苷酸可以通過修飾來增加它們的體內穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǖ痪窒抻谠?’或3’末端加入側翼序列、在主鏈中用硫代磷酸酯或2-O-甲基代替磷酸二酯酶連接、以及包含非傳統(tǒng)性堿基例如肌苷、辮苷和懷丁苷以及乙?；?、甲基、硫代或其他修飾形式的腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶核苷。
本發(fā)明的特征也在于編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達載體。這些表達載體包含與編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的蛋白質編碼序列有效連接的5’或3’非翻譯調節(jié)序列。表達載體的設計取決于諸如對宿主菌和預期表達水平的選擇等因素。合適表達載體的非限制性實例包括細菌表達載體、酵母表達載體、昆蟲表達載體和哺乳動物表達載體。也可以使用病毒載體，例如逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、甲病毒、星狀病毒、冠狀病毒、正黏病毒、乳多空病毒、副黏病毒、細小病毒、小RNA病毒、痘病毒或披膜病毒。本發(fā)明所用表達載體可以受組成型或誘導型啟動子控制。
本發(fā)明也涉及組織特異性或發(fā)育調節(jié)性啟動子的用途。合適的組織特異性啟動子包括但不局限于軟骨特異性啟動子、腦特異性啟動子、肺特異性啟動子、主動脈特異性啟動子、闌尾特異性啟動子、肝特異性啟動子、淋巴特異性啟動子、胰特異性啟動子、乳腺特異性啟動子、軟骨細胞特異性啟動子、神經(jīng)元特異性啟動子、神經(jīng)膠質細胞特異性啟動子和T細胞特異性啟動子。發(fā)育調節(jié)性啟動子的實例包括但不局限于α-甲胎蛋白啟動子。組織特異性或發(fā)育調節(jié)性啟動子的使用使得ADAMTS-8蛋白或其衍生物在預定組織中或者在特定發(fā)育階段選擇性表達。
也可以用可調控的表達系統(tǒng)來表達ADAMTS-8蛋白或其衍生物。適合這個目的的系統(tǒng)包括但不局限于Tet開/關系統(tǒng)、蛻皮激素系統(tǒng)、孕酮系統(tǒng)和納巴霉素系統(tǒng)。
III.ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達和純化可以將編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達載體穩(wěn)定或瞬時地引入宿主細胞來進行表達。所表達的蛋白質可以用常規(guī)方法從宿主細胞中分離。適合這個目的的宿主細胞包括但不局限于真核細胞(如哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母)和原核細胞(例如細菌)。合適的真核宿主細胞的非限制型性實例包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa細胞、COS細胞、293細胞和CV-1細胞。真核宿主細胞通常提供預期的翻譯后修飾，例如所表達蛋白質的糖基化。合適的原核宿主細胞的非限制性實例包括大腸桿菌(E.coli)(例如HB101、MC1O61)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和假單胞桿菌屬(Pseudomonas)。本發(fā)明所用宿主細胞可以是細胞系、原代細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。它們也可以是轉基因或嵌合動物中的細胞。選擇合適的宿主細胞和培養(yǎng)、轉染/轉化、擴增、篩選以及產物生產和純化是本領域普通技術人員水平內的常規(guī)設計問題。
在一個實施方案中，ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物在哺乳動物宿主細胞中表達，其中所述哺乳動物宿主細胞將所表達的蛋白質分泌進入培養(yǎng)基。分泌的產物可以用標準分離/純化技術分離或純化，例如親和層析(包括免疫親和層析)、離子交換層析、疏水作用層析、大小排斥層析、HPLC、蛋白質沉淀(包括免疫沉淀)、差別溶解(differential solubilization)、電泳、離心、結晶或其任意組合?？梢杂眉兓瘶擞浝珂溍褂H和素標記、FLAG標記、多組氨酸標記或谷胱甘肽S-轉移酶來方便分離所表達的蛋白質。在所表達的蛋白質純化之后，可以將純化標記從其上切割下來。純化標記也可以用來從細胞裂解物中分離或純化非分泌的ADAMTS-8蛋白。
在另一個實施方案中，ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物在原核宿主細胞中表達，并在這些細胞的包涵體中濃縮。經(jīng)濃縮的蛋白質可以從包涵體中溶解、重折疊、然后用上述方法分離。
所分離的ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物可以用標準技術分析或鑒定，例如SDS-PAGE或免疫印跡。分離的蛋白質也可以通過蛋白質測序或質譜法分析。在一個實例中，手工從膠中切下SDS-PAGE中的目的蛋白質條帶，然后還原、烷化、并用胰蛋白酶或內肽酶Lys-C(Promega，Madison，WI)消化。消化可以用自動膠內消化儀器在原位進行。消化之后，濃縮肽抽提物，并用微電噴射(microelectrospray)反相HPLC分離。肽分析可以在Finnigan LCQ離子阱質譜儀(ThermoQuest，San Jose，CA)上進行。可以用包含在Finnigan Bioworks數(shù)據(jù)分析軟件包(ThermoQuest，San Jose，CA)的SEQUEST計算機算法進行MS/MS數(shù)據(jù)的自動分析。
本發(fā)明的特征也在于ADAMTS-8蛋白或其衍生物在無細胞轉錄和翻譯系統(tǒng)中的表達。適當?shù)臒o細胞表達系統(tǒng)包括但不局限于麥胚提取物、網(wǎng)織紅細胞裂解物和Hela核提取物。所表達的蛋白質可以用上述方法進行分離和純化。
IV.蛋白酶解活性檢測聚集蛋白聚糖酶活性可以用熒光肽測試、新肽Western印記、聚集蛋白聚糖ELISA或活性測試來評測。前兩個測試適合檢測在聚集蛋白聚糖IGD中谷氨酸373-丙氨酸374鍵的切割能力。
在熒光肽測試中，用包含聚集蛋白聚糖酶切割位點氨基酸序列的合成肽與ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)孵育。在合成肽的N末端或C末端標記熒光團，而在另一末端包含淬滅劑。肽的切割分離了熒光團和淬滅劑，從而誘導出熒光。相對熒光可以用來測定蛋白質的相對聚集蛋白聚糖酶活性。
在新肽Western印跡中，用完整的聚集蛋白聚糖與ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)孵育。然后將切割產物進行幾種生物化學處理，再通過SDS-PAGE分離。生物化學處理包括例如透析、軟骨素酶處理、冷凍干燥和重建。將SDS-PAGE中的蛋白質樣品轉移到膜(例如硝化纖維素膜)上，并用新肽特異性抗體染色。新肽抗體特異地識別由于聚集蛋白聚糖蛋白酶解切割而暴露的新N末端或C末端氨基酸酸序列?？贵w不結合最初或未切割分子的此類表位。合適的新肽抗體包括但不局限于抗體Mab BC-13、Mab BC-3和I19C。參見，例如Caterson等人，supra和Hashimoto等人FEBS LETTERS，494192-195(2001)。在一個實例中，經(jīng)切割的聚集蛋白聚糖片段用綴合有堿性磷酸酶的二抗以及氮藍四唑色原和溴氯吲哚磷酸鹽底物(NBT/BCIP)來顯示。條帶的相對密度表示相對聚集蛋白聚糖酶活性。
聚集蛋白聚糖ELISA可以用來檢測聚集蛋白聚糖分子中的任何切割。在這個測試中，用預先粘附至塑料孔的完整聚集蛋白聚糖與ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)孵育。對孔進行洗滌，然后與檢測聚集蛋白聚糖的抗體孵育?？着c二抗作用。如果孔中保持著最初數(shù)量的聚集蛋白聚糖，那么抗體染色將很密集。如果聚集蛋白聚糖被ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)消化，那么所粘附的聚集蛋白聚糖分子將從孔上掉下來，進而減弱隨后的抗體染色。這個測試可以用來檢測ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)是否能夠切割聚集蛋白聚糖。也可以用這個測試來測定相對切割活性。
在活性測試中，微量滴定板先用透明質酸(ICN)包被，然后用軟骨素酶處理的牛聚集蛋白聚糖包被。軟骨素酶可以從例如SeikagakuChemicals獲得。向聚集蛋白聚糖包被的板上加入包含ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)的培養(yǎng)基。洗去在IGD中的谷氨酸373-丙氨酸374處被切割的聚集蛋白聚糖。剩余的未切割聚集蛋白聚糖可以用抗體3B3(ICN)、然后用抗IgM-HRP二抗(Southern Biotechnology)檢測。用例如3，3”，5，5”四甲基聯(lián)苯胺(TMB，BioFx Laboratories)來獲得最終顯色。
對短小蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神經(jīng)蛋白聚糖或其他蛋白聚糖或胞外基質蛋白質的蛋白酶解活性也可以用常規(guī)方法評測。參見，例如，Somerville等人，J.BIOL.CHEM.，2789503-9513(2003)(描述了評測多功能蛋白聚糖酶活性的測試)。這些方法一般涉及用蛋白聚糖分子接觸ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)、然后檢測蛋白聚糖分子的任何切割。V.ADAMTS-8抑制劑、反義多核苷酸和RNAi序列的開發(fā)本發(fā)明的特征在于鑒定ADAMTS-8抑制劑。適合這個目的的篩選測試包括在存在或不存在目的化合物時用蛋白聚糖底物接觸ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)。評測存在或不存在待測化合物時，ADAMTS-8蛋白(或其衍生物)的蛋白酶解活性來測定該化合物是否對蛋白酶解活性具有抑制效應。參見，例如Hashimoto等人supra?？梢杂酶咄亢Y選測試或化合物文庫來方便ADAMTS-8抑制劑的鑒定。ADAMTS-8增強劑可以類似地鑒定。
也可以用三維結構分析或計算機輔助藥物設計來鑒定ADAMTS-8抑制劑。后一種方法使得可以基于ADAMTS-8蛋白或它們的蛋白聚糖底物(例如聚集蛋白聚糖)的三維結構來測定抑制劑的結合位點。選擇與ADAMTS-8或其底物上的結合位點反應的分子。然后測試候選分子以測定任何抑制效應。適合研發(fā)蛋白酶抑制劑的其他方法也可以用于鑒定ADAMTS-8抑制劑。
ADAMTS-8抑制劑可以是例如蛋白質、肽、抗體、化合物或小分子。在一個實施方案中，通過本發(fā)明鑒定的ADAMTS-8抑制劑可以抑制ADAMTS-8蛋白至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性(例如聚集蛋白聚糖酶活性)。在另一個實施方案中，通過本發(fā)明鑒定的ADAMTS-8抑制劑可以特異地抑制ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性，而不抑制其他非ADAMTS蛋白酶例如MMP。此外，在另一個實施方案中，通過本發(fā)明鑒定的ADAMTS-8抑制劑可以特異地抑制ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性，而不抑制其他ADAMTS家族成員。所述“特異地抑制”表示抑制劑能夠降低或消除靶蛋白的活性，而不顯著影響其他蛋白質的活性。在一些實例中，特異針對ADAMTS-8蛋白的抑制劑抑制其他蛋白質低于10％、5％或1％的活性。在其他一些實例中，特異針對ADAMTS-8蛋白的抑制劑對其他蛋白酶檢測不到效應。
本發(fā)明的ADAMTS-8抑制劑可以用來測定樣品中存在或不存在，或者定量ADAMTS-8蛋白。通過將ADAMTS-8蛋白的存在或其表達水平與疾病關聯(lián)，本領域技術人員可以將ADAMTS-8蛋白用作診斷疾病或測定其嚴重性的生物標記。
當ADAMTS-8抑制劑用于診斷目的時，可以預期對其進行修飾，例如用配體基團(例如生物素或其他具有特異結合配偶體的分子)或可檢測的標記基團(例如熒光團、發(fā)色團、放射性原子、電子致密反應物或酶)。具有特異結合配偶體的分子包括但不局限于生物素和抗生物素蛋白或鏈霉親和素IgG和蛋白A以及許多本領域已知的受體-配體對。與ADAMTS-8抑制劑綴合的酶標記可以通過它們的酶活性進行檢測。例如，辣根過氧化物酶可以通過其可將四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉化為可用分光光度計定量的藍色色素的能力進行檢測。
本發(fā)明的特征也在于與ADAMTS-8序列反義的多核苷酸。反義多核苷酸可以與正義多核苷酸形成氫健，其中所述正義多核苷酸編碼ADAMTS-8蛋白。反義多核苷酸也可以與ADAMTS-8序列的編碼區(qū)或非編碼區(qū)互補。反義多核苷酸可以與ADAMTS-8轉錄物全鏈互補，也可以僅與其部分互補。反義多核苷酸可以包括但不局限于大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸殘基。
本領域已知的任何方法都可以用來制備反義多核苷酸。在一個實施方案中，反義多核苷酸用天然存在的核苷酸化學合成。在另一個實施方案中，反義多核苷酸用經(jīng)修飾的核苷酸合成，以增加分子的生物學穩(wěn)定性，或者反義和正義多核苷酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性。經(jīng)修飾的核苷酸實例包括但不局限于硫代磷酸酯衍生物、吖啶取代的核苷酸、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖辮苷、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辮苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-isopentenyladen4exine、尿嘧啶-5-氧化乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧化乙酸甲酯、3-(3-氨基-3N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。反義多核苷酸也可以用天然存在和經(jīng)修飾的核苷酸一起制備。
在另一個實施方案中，反義多核苷酸用表達載體生物學產生。這些表達載體如下方向編碼多核苷酸，即從其轉錄的RNA為靶多核苷酸反義方向的方向。
在另一個實施方案中，反義分子為α-端基異構的多核苷酸分子。α-端基異構多核苷酸分子可以與互補RNA形成與通常的β單元不同的特異雙鏈雜交體，在所述雙鏈雜交中鏈彼此平行。此外，在另一個實施方案中，反義分子包括2’-o-甲基核糖核苷酸或嵌合RNA-DNA類似物。
此外，在另一個實施方案中，反義分子為核酶。核酶是能夠切割單鏈多核苷酸(例如mRNA)的催化性RNA分子，其中核酶具有與單鏈多核苷酸互補的區(qū)域。可以用本領域已知的多種方法設計或選擇ADAMTS-8RNA的特異性核酶。
在另一個實施方案中，反義分子能夠與ADAMTS-8基因的調節(jié)區(qū)形成三股螺旋結構，從而抑制ADAMTS-8基因轉錄。
反義多核苷酸一般以藥物組合物中給予受試者，或者從表達載體中原位產生。在一個實例中，直接將反義多核苷酸注射至組織部位(例如關節(jié)軟骨)。在另一實例中，全身施用反義多核苷酸。全身施用時，可以先修飾反義分子，使其能夠特異結合于所選細胞表面表達的受體或抗原。編碼反義分子的表達載體可以通過任意常規(guī)方法施用至組織部位。為了使反義分子達到足夠的胞內濃度，可以在表達載體中使用強啟動子，例如pol II或pol III啟動子。直接施用或載體產生的反義分子可以與細胞mRNA或基因組DNA雜交或結合，從而抑制ADAMTS-8蛋白的翻譯或轉錄。
本發(fā)明進一步涉及用RNA干擾(“RNAi”)來抑制ADAMTS-8蛋白的表達。RNAi提供了在mRNA水平使基因沉默的機制。本發(fā)明的RNAi序列可以具有任意預期長度。在許多實例中，RNAi序列具有至少10、15、20、25或更多個連接的核苷酸。RNAi序列可以是dsRNA或其他類型的多核苷酸，只要它們能夠形成降解靶mRNA轉錄物的功能性沉默復合體。
在一個實施方案中，本發(fā)明的RNAi序列包含或者由短干擾RNA(siRNA)組成。在許多應用中，siRNA為具有大約19-25個核苷酸的dsRNA。siRNA可以通過RNA酶III相關性核酸酶Dicer降解更長的dsRNA分子內源性產生。siRNA也可以外源性或者通過從表達載體轉錄來引入細胞。一旦產生，siRNA與蛋白質組分組裝，形成包含內切核酶的復合體，即已知的RNA誘導的沉默復合體(RISC)。激活的RISC切割并破壞互補的mRNA轉錄物。這個序列特異性mRNA降解導致基因沉默。
至少兩種方法可以用來實現(xiàn)siRNA介導的基因沉默。在第一個方法中，siRNA在體外合成，然后引入細胞來瞬時抑制基因表達。合成的siRNA提供了一種實現(xiàn)RNAi的簡單而有效方法。在許多實施方案中，siRNA為混合短多核苷酸的雙鏈體，其中所述混合短多核苷酸包括大約19-23個核苷酸，并且具有對稱二核苷酸3’突出端(例如UU或dTdT3’突出端)。這些siRNA能夠在哺乳動物細胞中特異地抑制靶基因翻譯，而不激活依賴DNA的蛋白質激酶(PKR)。已經(jīng)有報道，PKR的激活導致許多蛋白質翻譯的非特異性抑制。
在第二個方法中，siRNA從載體表達。這個方法可以用來在細胞或轉基因動物中穩(wěn)定或瞬時表達siRNA。在一個實施方案中，基因改造siRNA表達載體來驅使siRNA從聚合酶III(pol III)轉錄單元轉錄。在許多例子中，pol III轉錄單元采用短的富含AT的轉錄終止位點，這導致在發(fā)夾siRNA上加入2bp的突出端(例如UU)，該特征有助于siRNA的功能。pol III表達載體也可以用來產生表達siRNA的轉基因動物。此外，也可以用組織特異性啟動子在所選細胞或組織中表達siRNA。相似的方法也可以用來產生組織特異性敲除動物。在另一個實施方案中，首先，從載體表達長的雙鏈RNA(dsRNA)。然后，Dicer將長的dsRNA加工為siRNA來產生基因特異性沉默。
大量3’二核苷酸突出端(例如UU)可用于siRNA的設計。在許多情況下，在突出端中避免G殘基，以減少siRNA被RNA酶在單鏈G殘基處切割的風險。
在一個實施方案中，本發(fā)明的siRNA具有大約30-50％的GC含量。在另一個實施方案中，當設計從RNA pol III啟動子表達的siRNA時，避免靶序列中超過4個連續(xù)的T或A序列。此外，在另一個實施方案中，選擇靶mRNA序列不是構象化或與調控蛋白質高度結合的siRNA。此外，在另一個實施方案中，將可能的靶位點與適當?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫比較。不考慮與其他編碼序列具多于16-17個連續(xù)同源堿基對的靶序列。
在另一個實施方案中，將siRNA設計為具有兩個反向重復序列，其中所述反向重復序列用間隔序列分開，并且以一串作為轉錄終止位點的T結束。這個設計產生的RNA轉錄物將折疊為短發(fā)夾結構的siRNA。為了實現(xiàn)預期目的，可以改變下列參數(shù)，即對siRNA靶序列的選擇、編碼所假定發(fā)夾結構莖區(qū)的反向重復序列的長度、反向重復序列的順序、編碼發(fā)夾結構環(huán)的間隔序列的長度和組成以及5’突出端的存在或不存在。
在另一個實施方案中，構建的發(fā)夾結構siRNA表達盒包含靶標的正義鏈，隨后是短間隔、靶標的反義鏈和作為轉錄終止子的5-6個T。siRNA表達構建體中的正義和反義鏈的順序可以改變，而不影響發(fā)夾結構siRNA的基因沉默活性。然而，在一些情況下，順序的逆轉可能會導致基因沉默活性的部分降低。
在另一個實施方案中，用作siRNA表達盒莖區(qū)的核苷酸序列長度在大約19-29的范圍內。環(huán)的大小可以在3-23個核苷酸的范圍內。也可以使用其他莖區(qū)長度或環(huán)大小。
有多種方法可以選擇siRNA靶標。在一個實例中，掃描mRNA序列尋找二核苷酸AA，并記錄緊鄰該AA下游的19個核苷酸來選擇siRNA靶標。在另一實例中，siRNA靶序列的選擇純粹依賴于經(jīng)驗，只要靶序列以GC起始、并且通過BLAST搜索分析其與其他基因沒有顯著的序列同源性。在另一實例中，siRNA靶序列的選擇基于下列觀察結果，即靶向內源mRNA中能被合成的寡脫氧核糖核苷酸/RNA酶H法(Lee等人，NATUREBIOTECHNOLOGY，20500-505(2002))降解的可及位點。
在一個實施方案中，用于RNAi的靶序列為基于ADAMTS-8編碼序列選擇的21-mer序列片段。每個靶序列的5’末端包含二核苷酸“NA”，其中“N”可以是任意堿基，而“A”代表腺嘌呤。剩余的19-mer序列具有35％-55％的GC含量。此外，剩余的19-mer序列在一排中不包含任意4個連續(xù)的A或T(即AAAA或TTTT)、三個連續(xù)的G或C(即GGG或CCC)、或者7個“GC”。
對于RNAi靶序列設計也可以包括附加條件。例如，可以將剩余19-mer序列的GC含量限制在45％-55％之間。此外，可以排除任何具有三個連續(xù)同一堿基(即GGG、CCC、TTT或AAA)或具5個或更多個堿基的回文序列的19-mer序列。此外，剩余的19-mer序列可以選擇為與其他基因具有低的序列同源性。在一個實例中，用BLASTN對NCBI的人類UniGene簇序列數(shù)據(jù)庫搜索可能的靶序列。人類UniGene數(shù)據(jù)庫包含非冗余的基因起源聚簇集合。每個UniGene聚簇包含代表唯一基因的序列。選擇在BLASTN搜索下沒有命中其他人類基因的19-mer序列。進行搜索時，可以將e-值設置為嚴格值(例如“1”)。
可以用許多方法評測本發(fā)明siRNA序列的有效性。例如，可以將本發(fā)明的siRNA序列引入表達ADAMTS-8的細胞。檢測細胞中ADAMTS-8的多肽或mNRA水平。引入siRNA序列之后ADAMTS-8表達水平降低則表明引入的siRNA序列有效誘導RNA干擾。
也可以在引入siRNA序列之前或之后監(jiān)測其他基因的表達水平。選擇對ADAMTS-基因8表達具有抑制效應但不影響其他基因的siRNA序列。此外，可以在相同細胞中引入不同siRNA序列來抑制ADAMTS-8基因。
VI.疾病治療本發(fā)明的特征在于ADAMTS-8調節(jié)劑治療蛋白酶相關疾病的用途。ADAMTS-8調節(jié)劑包括但不局限于ADAMTS-8抗體、ADAMTS-8抑制劑、ADAMTS-8反義序列或RNAi序列，以及編碼或包含ADAMTS-8反義序列或RNAi序列的載體。本發(fā)明對應的蛋白酶相關疾病包括但不局限于癌、炎性關節(jié)疾病、骨性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、膿毒性關節(jié)炎、牙周疾病、角膜潰瘍、蛋白尿、動脈粥樣斑塊破裂的冠狀動脈血栓形成、動脈瘤性主動脈疾病、腸炎疾病、克隆病、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合癥、哮喘、慢性非梗阻肺病、阿爾茨海默病、腦和造血癌、骨質疏松癥、帕金森病、偏頭痛、抑郁癥、周圍神經(jīng)病、亨廷頓病、多發(fā)性硬化、眼血管發(fā)生、黃斑變性、主動脈瘤心肌梗塞、自身免疫紊亂、創(chuàng)傷性關節(jié)損傷后的退化軟骨丟失、頭部創(chuàng)傷、dystrophobic表皮水泡癥、脊髓損傷、急性和慢性神經(jīng)退行性疾病、骨質減少、顳下頜關節(jié)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病、器官移植毒性及排斥、惡病質、變態(tài)反應、組織潰瘍、再狹窄以及表征為胞外基質蛋白或蛋白聚糖分子異常降解的其他疾病。
治療可以包括治療處理，以及預防或防范方法。需要治療的個體包括已經(jīng)患有特定醫(yī)學病癥的個體以及最終會患病癥的個體。在許多實例中，所預期的治療調節(jié)ADAMTS-8的蛋白酶解活性或基因表達，從而預防或者改善疾病的臨床癥狀。ADAMTS-8調節(jié)劑可以通過例如預防ADAMTS-8與其蛋白聚糖底物的相互作用、降低或消除ADAMTS-8的催化活性、或者降低或消除ADAMTS-8基因的轉錄或翻譯起作用。
在一個實施方案中，ADAMTS-8調節(jié)劑(例如抗體或抑制劑)以藥物組合物中施用于人或動物。藥物組合物一般包含可藥用載體和治療有效量的ADAMTS-8調節(jié)劑?？伤幱幂d體的實例包括能與藥物施用兼容的溶劑、增溶劑、填料、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、基質、緩沖劑、潤滑劑、控釋載體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質、涂層、抗菌或抗真菌試劑、等滲和吸收延遲劑等。本領域熟知載體介質和藥劑對藥物活性物質的用途。補充劑也可以整合進入組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可與其期望的給藥途徑兼容性配制。給藥途徑的實例包括腸胃外給藥、靜脈內給藥、皮內給藥、皮下給藥、口服、吸入給藥、經(jīng)皮膚給藥、直腸給藥、跨粘膜給藥、局部給藥和全身給藥。在一個實例中，通過使用植入物進行給藥。
在一個實施方案中，用于腸胃外、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液包括下列組分無菌稀釋劑例如水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成的溶劑、抗菌劑例如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯、抗氧化劑例如抗壞血酸或硫酸氫鈉、鰲合劑例如乙二胺四乙酸、緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽、以及調節(jié)張力的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。藥物組合物的pH可以用酸或堿調節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。在一個實例中，腸胃外的制劑封裝在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制備的多劑量小管中。
本發(fā)明的藥物組合物可給予患者或動物，以便其中包含的ADAMTS-8調節(jié)劑的數(shù)量足以降低或消除所靶向的ADAMTS-8的活性或表達。ADAMTS-8抗體或抑制劑的合適治療劑量可不限于5mg-110mg、15mg-85mg、30mg-70mg或40mg-60mg之間。也可以使用低于5mg或高于100mg的劑量。ADAMTS-8抗體或抑制劑可以以單劑量或多劑量施用。這些劑量可以間隔施用，例如(不限于)每天一次、每周一次或者每月一次。施用ADAMTS-8抗體或抑制劑的劑量時間表可以基于下列因素調整，即例如抗體/抑制劑與其靶標點的親和力、抗體/抑制劑的半衰期和患者病癥的嚴重程度。在一個實施方案中，抗體或抑制劑以大丸劑劑量施用，以便最大化它們的循環(huán)水平。在另一個實施方案中，在大丸劑劑量之后使用連續(xù)輸注。
ADAMTS-8調節(jié)劑的毒性和治療功效可以在細胞培養(yǎng)模型或實驗動物模型中通過標準藥物學方法測定。例如，可以測定LD50(50％數(shù)量致死的劑量)和ED50(50％數(shù)量治療有效的劑量)。毒性和治療作用的劑量比率即為治療指數(shù)，其可表達為LD50/ED50的比率。在一個實例中，選擇呈現(xiàn)大治療指數(shù)的調節(jié)劑。
從細胞培養(yǎng)測試或動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用來確定在人類中使用的劑量范圍。在許多情況下，這類化合物或調節(jié)劑的劑量處于呈現(xiàn)低毒或無毒的ED50的循環(huán)濃度范圍之內。劑量依賴所用劑式和所用給藥途徑可以在這個范圍內變化。對于根據(jù)本發(fā)明使用的任意調節(jié)劑，其治療有效劑量都可以先在細胞培養(yǎng)測試或動物模型中進行評測。在一個實施方案中，在動物模型中，可將劑量確定為達到呈現(xiàn)IC50(即，達到最大抑制癥狀一半時的測試抑制劑濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍，其中所述IC50通過細胞培養(yǎng)測試測定。例如，可以通過高效液相層析測定血漿中的水平。任何特定劑量的作用都可以通過合適的生物測定檢測。生物測定的實例包括DNA復制測定、基于轉錄的測定、GDF蛋白質/受體結合測定、肌酸激酶測定、基于前脂肪細胞分化的測定、基于脂肪細胞中葡萄糖吸收的測定和免疫學測定。
施用本發(fā)明藥物組合物的劑量方案可以詢問醫(yī)師基于多種因素確定，例如病理學部位、疾病嚴重性、患者年齡、性別和食譜、任何炎癥的嚴重性、給藥時間以及其他臨床因素。在某些實施方案中，全身給藥或注射給藥起始于最低有效劑量，并且該劑量將在預定時間內增加直至觀察到陽性效應。隨后，在考慮任何可能出現(xiàn)的副作用的同時，將劑量的逐漸增加限制在產生相應增加作用的水平。在最終組合物中加入其他已知因子也可能影響劑量。
本發(fā)明也涉及由聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖異常聚集造成或相關疾病的治療。在一個實施方案中，治療包括向患有所述疾病的人或動物施用包含ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的藥物組合物。在另一個實施方案中，用基于載體的療法來校正蛋白聚糖的異常聚集。這些療法一般包括向需要其的人或動物引入編碼ADAMTS-8蛋白或其功能性衍生物的表達載體或基因呈遞載體。
應當理解的是，上述實施方案和下列實施例僅作為舉例，而不作為限制。在本發(fā)明范疇之內對本說明書所做的多種改變或修飾對于本領域技術人員而言是顯而易見的。
實施例實施例1.創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)生圖收集下列人ADAMTS家族成員的蛋白質來創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)生圖ADAMTS-1/AB037767、ADAMTS-2/AJ003125(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變W643C、P1001L和S1089C)、ADAMTS-3/AF247668、ADAMTS-4/AF148213、ADAMTS-5/AF142099、ADAMTS-6/美國專利申請公開20020120113中的“SEQ ID NO2”、ADAMTS-7/AF140675、ADAMTS-8/AF060153(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變L11P、F13L、L21P、P23Δ、L24Δ和L129Q，其中Δ表示缺失)、ADAMTS-9/AF261918(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變G64S和S96T)、ADAMTS-10/PCT公開號WO 02/60942中的“SEQ ID NO9”(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變V267I)、ADAMTS-12/AJ250725、ADAMTS-13/AJ305314、ADAMTS-14/AF358666(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變L937M)、ADAMTS-15/AJ315733、ADAMTS-16/PCT公開號WO 02/31163中的“SEQ ID NO4”、ADAMTS-17/AJ315735(已公開序列與系統(tǒng)發(fā)生圖中使用的序列相比有下列改變用氨基酸序列713GYIEAAVIPAGARRIRVVEDKPAHSFLALKDA743(SEQ ID NO1)替換氨基酸序列713ALKDA716)、ADAMTS-18/AJ311903ADAMTS-19/AJ311904和ADAMTS-20/PCT公開號WO 01/83782中的“SEQ ID NO57”。將這19個蛋白質序列文件連接成為一個多-FASTA文件，并將其輸入CLUSTALW1.81(見，例如網(wǎng)址www.ebi.ac.uk)，并在IRIX64上運行。CLUSTALW在默認設置下運行。所得.dnd樹文件(treefile)輸入TREEVIEW1.6.6(PAGE，COMPUT.APPL.BIOSCA.，12357-358(1996)，網(wǎng)址taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)來產生系統(tǒng)發(fā)生圖。
ADAMTS家族成員的系統(tǒng)樹如圖1所示?；谛蛄邢嚓P性，系統(tǒng)發(fā)生圖將蛋白質分組。被程序分為一組的ADAMTS家族成員與已表征的ADAMTS家族成員的已知功能信息相比較。例如，預測ADAMTS-2、3和14為前膠原蛋白加工酶。這些家族成員在序列同源性上彼此最相似，并且在進化系統(tǒng)樹上形成特有的簇(cluster)。對于另一實例，已經(jīng)顯示ADAMTS-13突變引起vWF加工缺陷，從而導致血栓性血小板減少性紫癜。這個家族成員在系統(tǒng)樹上形成起自己的節(jié)點。此外，已經(jīng)顯示ADAMTS-1、4、5和9能以不同效力切割聚集蛋白聚糖。序列同源性分析證實一個簇包含所有這些降解聚集蛋白聚糖的ADAMTS以及ADAMTS-8、15和20，這表明ADAMTS-8也可能具有聚集蛋白聚糖切割活性。隨后克隆、表達并純化ADAMTS-8來檢測其切割聚集蛋白聚糖的能力。
迄今，至少已經(jīng)鑒定了ADAMTS家族的19個成員。少于一半的ADAMTS蛋白質具有屬于它們的功能，剩下至少10個成員沒有已知功能?；诩易宄蓡T之間的序列相似性創(chuàng)建的系統(tǒng)樹(圖1)導致下列發(fā)現(xiàn)，即那些具相似功能(例如已證實的聚集蛋白聚糖降解活性和前膠原蛋白加工活性)的ADAMTS家族成員被分為一組。這表明，系統(tǒng)樹假定的“聚集蛋白聚糖降解”節(jié)點的其他成員可能具有顯著的聚集蛋白聚糖酶活性，并且可能比ADAMTS-4或ADAMTS-5顯示與骨性關節(jié)炎更高的疾病相關性。如下列實施例所述，“聚集蛋白聚糖降解”節(jié)點的另一成員ADAMTS-8能夠在骨性關節(jié)炎相關的谷氨酸373-丙氨酸374鍵處切割聚集蛋白聚糖，因此對于這個蛋白質由序列同源性預測的結構/功能聯(lián)系是正確的。
實施例2.構建ADAMTS-8表達載體ADAMTS-8的DNA序列由Vázquez等人，supra存放于GeneBank(登錄號AF060153)。為了分離基因，設計了跨越ADAMTS-8開放閱讀框的4套寡核苷酸引物對第一對引物包括ATGTTCCCCGCCCCCGCCGCCCCCCGGTG(SEQ ID NO2)和GGATCCCCCGAGGCGCTCGATCTTGAACT(SEQ ID NO3)。第二對引物包括GGATCCGGCCGGGCGACCGGGGGC(SEQ ID NO4)和CTCTAGAAGCTCTGTGAGATACATGGCGCT(SEQ ID NO5)。第三對引物包括CTCTAGACGGCGGGCACGGAGACTGTCTCCTGGATGCCCCTGGTGCGGCCCTGCCCCTCCCCACA(SEQ ID NO6)和ACGTGTATTTGACTTTTGGGGGGAAGACCTCGCCAGGGACTGTCAGGAGCTGCACTGTCAGAGGCTC(SEQ ID NO7)。第四對引物包括CACACGTTCTTTGTTCCTAATGACGTGGACTTTAG(SEQ ID NO8)和GCGGCCGCTCACAGGGGGCACAGCTGGCTTTC(SEQ ID NO9)。
成人肺cDNA文庫的PCR擴增使用Clontech的GC試劑盒，按照產品說明進行。PCR產物擴增在Perkin Elmer 9600上進行。將50微升PCR反應物加熱至95℃進行1分鐘的預先溫育步驟，然后立即進行25個由95℃溫育15秒、緊接著68℃溫育2分鐘組成的循環(huán)。純化所得PCR產物，并用適當限制酶(分別用EcoR I/BamH I、BamH I/Xba I、Xba I/Afl III、Afl III/Not I)消化，然后一起連接進入CHO表達載體pHTop(pED的衍生物)。PCR插入片段通過DNA測序確定。
通過加入Strep-tag序列(IBA)來修飾ADAMTS-8表達構建體。標記用具3’突出端、編碼5個氨基酸的接頭(GSGSA(SEQ ID NO10))、并跟隨編碼8個氨基酸的Strep標記(WSHPQFEK(SEQ ID NO11))的附加序列的PCR引物加入。這13個氨基酸作為C末端的翻譯融合加入到ADAMTS-8開放閱讀框最終的氨基酸中。PCR引物對由正向引物CTTCTAGACGGCGGGCACGGAGAC(SEQ ID NO12)和反向引物TTCTAGAGCGGCCGCCTTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAAGCAGATCCGGATCCCAGGGGGCATAGCTGGCTTTCGCA(SEQ IDNO13)組成。PCR產物擴增在Perkin Elmer 9600上進行。DNA聚合酶使用Pfu Turbo Hotstart(Stratagene)，而反應條件遵循制造商的建議。PCR反應物先加熱至94℃2分鐘，然后進行25個94℃15秒/70℃2分鐘的循環(huán)。最后一個循環(huán)后，將PCR反應物在72℃保持5分鐘。已純化的PCR產物用合適的限制酶(Bgl II/Not I)消化，然后一起與適當?shù)腁DAMTS-8片段連接在一起進入pHTop表達載體。
當比較AF060153和所克隆的序列時，鑒定出幾個氨基酸變異。所發(fā)現(xiàn)的改變限于信號肽和前域中。在提交的GeneBank數(shù)據(jù)庫序列(登錄號AAB74946)中也發(fā)現(xiàn)ADAMTS-8分離物(isolate)的信號序列中有兩個變異。ADAMTS-8分離物中所觀察到的變化不能歸因于等位基因變異(例如F13和F14刪除和L129Q)，所述變化導致25個氨基酸的信號肽和前域中的一個氨基酸改變。這些改變并不由于它們的定位而影響成熟蛋白質的表達和活性，而在表達構建體中保持不變。蛋白質成熟部分預測的蛋白質序列與AF060153一致。
實施例3.建立表達ADAMTS-8的CHO細胞系用CHO/A2細胞來建立ADAMTS-8穩(wěn)定表達的細胞系。CHO/A2細胞系來自通過穩(wěn)定整合轉錄激活因子tTA、包含Tet阻抑蛋白和皰疹病毒VP16轉錄結構域的融和蛋白的CHO DUKX B11。ADAMTS-8/pHTop表達載體在ADAMTS-8序列上游包含6個tet操縱子重復。在pHTop中，tTA與Tet操縱子結合即激活下游基因轉錄。也可以在pHTop表達載體中包含編碼二氫葉酸還原酶的基因，從而能夠通過病毒的氨甲蝶呤抗性來篩選穩(wěn)定轉染子。也可以通過用制造商建議的脂質轉染(InVitrogen的Lipofectin)方案將pHTop/ADAMTS-8 DNA轉染進入CHO/A2細胞來建立細胞外表達ADAMTS-8的CHO細胞系。用0.02μM的氨甲蝶呤篩選克隆。通過用Western印跡監(jiān)控CHO條件培養(yǎng)基中的ADAMTS-8抗原來篩選ADAMTS-8蛋白表達水平最高的細胞系，其中所述Western印跡使用綴合有辣根過氧化物酶(HRP)(Southern Biotech)的抗Strep標記抗體，然后進行ECL化學發(fā)光(Amersham Biosciences)和放射自顯影。
實施例4.純化ADAMTS-8收集表達ADAMTS-8的穩(wěn)定CHO細胞系的條件培養(yǎng)基(300ml)，并用裝有10KDa MWCO(分子量截短)濾器的攪拌杯(stir cell)(Amicon)超濾濃縮3倍(10ml)。用Sigma的固定有抗生物素蛋白的6％交聯(lián)珠狀瓊脂糖(1毫升)與濃縮的條件培養(yǎng)基在4℃混合1小時，以便移去任何污染的生物素。離心之后回收上清，并將其上樣于1毫升的Strep-Tactin柱(IBA)。用5等分試樣的1毫升W緩沖液(100mM Tris，pH8.0，150mMNaCl)洗滌柱子，然后用包含2.5mM脫硫生物素(Sigma)的W緩沖液洗脫所結合的蛋白質。通過10％SDS-PAGE凝膠分析(圖2A)分析等分試樣的濃縮條件培養(yǎng)基、柱流出液、洗滌級分和洗脫級分，然后用抗Srep-TagII多克隆抗血清(IBA)和通過放射自顯影的ECL檢測(圖2B)進行Western分析。
圖2A顯示來自CHO條件培養(yǎng)基的Strep-標記純化的ADAMTS-8蛋白級分的10％SDS-PAGE。用考馬斯亮藍染色SDS-PAGE。泳道1顯示CHO細胞的條件培養(yǎng)基；泳道2顯示超濾液的流出級分(濾出液)；泳道3是濃縮超濾液的存留級分；泳道4代表Strep-tactin柱的流出級分；泳道5-9是Strep-tactin柱洗滌級分；泳道10-15描述Strep-tactin柱洗脫級分。
圖2B顯示圖2A SDS-PAGE的Western印跡。該Western分析使用抗Strep-TagII的多克隆抗血清(IBA)。
包含Strep-Tag的未加工和弗林蛋白酶加工的ADAMTS-8的預期分子量分別為95KDa和75KDa，其不能說明由于糖基化作用引起的遷移率改變。純化的主要產物是兩條在SDS-PAGE上遷移時表觀分子量為110KDa和95KDa(圖2A，泳道12)、并且在Western印跡(圖2B，泳道12)上結合Strep-tag的條帶。在CHO/A2細胞中共表達可溶性PACE(弗林蛋白酶或成對的堿性氨基酸切割酶)和ADAMTS-8表達構建體，導致110KDa的前ADAMTS-8條帶的消除，同時伴隨著95KDa條帶的增加，這表明110KDa的條帶代表分泌的前ADAMTS-8。在成熟的ADAMTS-8蛋白中有5個假定的N連接糖基化位點，這有可能是成熟的ADAMTS-8的表觀分子量從預測的75KDa增加至所觀察到的95KDa的原因。純化的蛋白質級分的Western分析顯示全長蛋白質占優(yōu)勢，而降低分子量的免疫原性條帶只有很小的比例(圖2B，泳道12)。這些次要產物可能是成熟的ADAMTS-8蛋白自催化降解的結果。既包含前ADAMTS-8又包含經(jīng)加工成熟的ADAMTS-8的洗脫級分用于隨后的活性分析。
在這個實例中，全長的ADAMTS-8 cDNA附加有羧基末端Strep-Tag的編碼序列，并在CHO細胞中表達。蛋白質有效表達，并分泌進入條件培養(yǎng)基。全長蛋白質聚集在條件培養(yǎng)基中，并不略微蛋白酶解為更小的產物。這個觀察結果得到下列支持和驗證，即用抗Strep-tag抗體的Western印跡證實保持羧基末端標簽，并且大多數(shù)蛋白質能夠結合Strep-Tactin樹脂。相反，用于比較的重組ADAMTS-4在C末端結構域內的位點自發(fā)蛋白酶解產生缺少間隔結構域的截短分子。ADAMTS-4的截短似乎是自發(fā)蛋白酶解現(xiàn)象，因為通過E362Q活性位點突變使其催化活性喪失的ADAMTS-4修飾形式并沒有表現(xiàn)出這種自發(fā)C末端截短(Flannery等人，J.Bio.Chem.，27742775-42780(2002))。此外，重組ADAMTS-5(聚集蛋白聚糖酶-2)能自身截短其C末端。雖然通過已發(fā)表的報告還不清楚這是自發(fā)蛋白酶解事件還是通過其他蛋白酶介導的，但是重組的ADAMTS-12也表現(xiàn)出這種第二個C末端蛋白酶解的特性(Cal等人，J.Bio.Chem.，27617932-17940(2001))。此外，據(jù)報道，在293T細胞中表達ADAMTS-1產生三種形式的蛋白，即代表ADAMTS-1前體的p110形式、推斷為全長成熟ADAMTS-1的p87形式和在間隔結構域內組成成熟ADAMTS-1的C末端截短的p65形式(Rodrígues-Manzaneque等人，J.BIO.CHEM.，27533471-33479(2000))。與ADAMTS-4的觀察結果一致，活性位點突變的ADAMTS-1沒有C末端截短，這表明自發(fā)蛋白酶解機制負責移去C末端結構域。
基于這些數(shù)據(jù)，令人驚訝的是這個實施例中分離的大多數(shù)重組ADAMTS-8保留了它的C末端結構域、而且似乎不自發(fā)蛋白酶解或者被其他蛋白酶切割。這種重組ADAMTS-8蛋白的蛋白酶解活性通過使用α-2巨球蛋白結合測試來證實。因此，ADAMTS-8羧基末端的血小板反應蛋白和間隔結構域對于通過其自身催化活性或其他加工酶進行的第二處理是非特征性不反應的，這就提供了評測穩(wěn)定全長ADAMTS蛋白的催化效率的獨特機會。
實施例5從關節(jié)軟骨中分離RNA從Clinomics(Pittsfield，MA)獲得人非骨性關節(jié)炎的關節(jié)軟骨，從新英格蘭Bsptist醫(yī)院(Boston，MA)獲得人骨性關節(jié)炎的關節(jié)軟骨。樣品在采集時用液氮速凍并儲存于-80℃。為了分離RNA，取1克冷凍的關節(jié)軟骨在Spex Certiprep Freezer研磨器(型號6750)中以15Hz在液氮中研磨兩次(每次一分鐘，每次研磨之間有2分鐘的冷卻步驟)。然后根據(jù)McKenna等人，ANAL.BIOCHEM.，28680-85(2000)的方法分離RNA，并進行列修改。將研磨后的軟骨懸浮在4mL含2.5μl 2-巰基乙醇(2-ME)的冰冷4M異硫氰酸胍(GITC，Gibco-BRL)中。立即用Polytrin勻漿器(Kinematica AG)在冰上以最高速度勻漿懸浮液一分鐘。將勻漿的軟骨裂解液在4℃下以1500×g離心10分鐘，收集上清，并將所得沉淀再次如前與另外4mlGITC/2-ME勻漿，并在4℃下以1500×g下再離心10分鐘。合并每次勻漿的上清級分，并在合并的上清級分中加入0.65ml25％Triton-100(100％儲液購于Sigma，在無RNA酶去離子水中稀釋至25％)。在冰上孵育15分鐘后，加入8ml無RNA酶的3M NaOAc緩沖液(、pH5.5，Ambion)，將溶液在冰上再孵育15分鐘。然后用15ml酸性的5∶1的苯酚∶氯仿(pH4.5，Ambion)通過劇烈攪拌1分鐘、冰上孵育15分鐘、4℃下以15000×g離心20分鐘來抽提勻漿。然后回收水相，重新用酸性苯酚∶氯仿用上述相同步驟抽提。然后用15ml 25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶IAA(pH6.7/8.0)(Ambion)通過劇烈混勻1分鐘、冰上孵育15分鐘、然后4℃下以15000×g、離心20分鐘來第三次抽提經(jīng)第二次的酸性苯酚∶氯仿抽提的水相?；厥账啵⒓尤?.8倍體積的100％2-丙醇?；旌先芤海戏跤?分鐘，4℃下以15000×g下離心30分鐘。小心倒出所得上清，并將沉淀重新懸浮在0.9ml RLT+2-ME(Qiagen RNeasy kit)緩沖液。此步之后按照McKenna等人，supra所述的步驟完成方案。
實施例6.ADAMTS-8的組織分布用393bp的ADAMTS-8片段來探測人多組織表達陣列(CloneTech的MTE)的mRNA斑點免疫，其中所述ADAMTS-8片段是用Bgl II/Hind III消化ADAMTS-8序列(Genbank登錄號AF060153)相應的2070堿基對至2463堿基對的片段。該片段包含部分解聯(lián)蛋白結構域和部分中央1型TSP基序。將該片段序列用NCBI的局部比對搜索基本工具(版本2)(NCBI-BlastN)查詢GenBank。BlastN搜索發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中沒有其他人轉錄物與該ADAMTS-8探針序列顯著同源，這表明在MTE雜交條件下探針片段不與其他人轉錄物交叉反應。
純化ADAMTS-8探針片段，并用Amersham Pharmacia Biotech的Ready-To-Go DNA標記珠(-dCTP)按照使用說明進行放射性標記。用Nick柱(Amersham Pharmacia Biotech)按照使用說明將放射性標記的片段從引物和未整合的放射性核苷酸中純化出來，然后用來探測MTE。MTE的雜交條件以及隨后的洗滌條件遵從生產商針對放射性標記cDNA探針建議的條件(Clontech MTE Array用戶手冊)。
圖3A顯示用76種不同人組織mRNA的MTE雜交分析結果。圖3B顯示說明不同組織mRNA放置的關鍵因素。空白框表示那些坐標沒有mRNA被雜交上斑點。MTE雜交分析顯示，ADAMTS-8比有著廣泛組織分布的、降解聚集蛋白聚糖的ADAMTS-1和ADAMTS-4的轉錄物有著更窄的組織分布以及整體更低的轉錄物豐度。ADAMTS-8最高的表達水平之一可見于成人肺中(圖3，行A，列8)，但在胎兒肺中卻發(fā)現(xiàn)較低的水平(圖3，行G，列11)。除了大動脈顯示高表達水平(圖3，行B，列4)外，成人心臟中可以檢測到表達，但是較低(圖3，列4)。胎兒心臟(圖3，行B，列11)顯示中等水平的轉錄物豐度，而在大腦、闌尾和膀胱的多個亞區(qū)中見到中度至低水平的表達(例如，G5、A1-G1、C3-H3和B3)。多種癌細胞系(圖3，列10)表現(xiàn)出低水平或者無法檢測水平的表達。
實施例7.實時PCR在人關節(jié)軟骨中的組織表達通過使用TaqMan(Applied Biosystems)進行定量實時PCR來證實。用Applied Biosystems的Primer Express程序來設計下列ADAMTS-8引物和探針5P引物GGACCGCTGCAAGTTGTTCT(SEQ ID NO14)、3P引物GGACACAGCTGGCCAGTGTT(SEQ ID NO15)和探針CCATCAATCACCTTGGCCTCGAACA(SEQ ID NO16)。ADAMTS-8的探針重疊了外顯子/內含子邊界，從而使它不能和基因組DNA雜交。設計了如下的GAPDH的引物和探針5P引物CCACATCGCTCAGACACCAT(SEQ ID NO17)、3P引物GCGCCCAATACGACCAAA(SEQ ID NO18)和探針GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG(SEQ ID NO19)。TaqMan探針(由Wyeth Resea rch Core Technologies Group合成)包含5P-報告染料6-FAM和3P-淬滅劑TAMRA。
從未患骨性關節(jié)炎(無疾病)患者的膝關節(jié)、以及從患骨性關節(jié)炎患者膝關節(jié)的中度感染和嚴重感染病灶區(qū)域分離關節(jié)軟骨RNA。在進行實時PCR之前，通過下列方案將純化的關節(jié)軟骨RNA轉化為cDNA，并在mRNA反轉錄后，在無疾病和骨性關節(jié)炎的關節(jié)軟骨的cDNA第一鏈上進行TaqMan分析?？俁NA(5μg)與200pmol包含噬菌體T7啟動子位點和24個堿基的聚T尾巴(GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO20))的引物在70℃下孵育10分鐘。然后在20μl反應混合物中用10單位每微升的Superscript II(Invitrogen)于50℃反轉錄RNA1小時。反應混合物包含0.25μg/μl總RNA、10pmo/μl T7T24引物、1×第一鏈緩沖液(Invitrogen)、10mM DTT(Invitrogen)、0.5mM dNTP(Invitrogen)和1單位每微升的SUPERase-In(Ambion)。緊接著合成第一鏈，進行第二鏈合成。反應混合物終體積為150μl。反應物包含第一鏈混和物以及下列試劑(終濃度)即1×第二鏈緩沖液(Invitrogen)、0.2mMdNTP(Invitrogen)、0.067單位每微升的大腸桿菌連接酶(New England Biolabs)、0.27單位每微升的DNA聚合酶I(Invitrogen)和0.013單位每微升的RNase H(Invitrogen)。第二條鏈的合成反應物在16℃下孵育2小時。在孵育的最后5分鐘時，加入終濃度為0.067單位每微升的T4 DNA聚合酶(Invitrogen)。孵育之后，往反應物中加入16.67mM的EDTA，并用PerSeptive Biosystems的BioMag Carboxyl Terminated bead純化所得cDNA。向第二鏈的反應混合物中加入10％PEG-8000/1.25M NaCl，并加入10μl BioMag小珠(用0.5MEDTA預洗滌)。混和cDNA和洗滌后的BioMag小珠，并在室溫下孵育10分鐘。小珠借助于GibcoBRL的Magna-Sep磁體用300μl 70％乙醇洗滌2次。最后洗滌之后，小珠在室溫下干燥兩分鐘。用10mM Tris-乙酸鹽(pH 7.8)從小珠上洗脫經(jīng)純化的cDNA。洗脫的cDNA通過用分光光度計測量等份洗脫液280nm處的吸收值來定量。每個TaqMan PCR反應使用該ADAMTS-8探針/引物集的100ng關節(jié)軟骨cDNA，重復二次。用GAPDH探針/引物集(Applied Biosystems)標準化組織間的表達水平。反應物組分來自Applied Biosystems的TaqMan Universal PCR Master Mix，遵從使用說明，引物終濃度為900nmol/μl、探針終濃度為250nmol/μl。反應物在50℃孵育2分鐘，接著95℃孵育10分鐘，然后進行40個95℃15秒和60℃1分鐘的循環(huán)。最后一個循環(huán)后，反應物在25℃孵育2分鐘。
圖4圖示了用實時PCR測定的在無疾病和患有骨性關節(jié)炎(OA)的人軟骨臨床樣品中A，DAMTS-8mRNA表達水平的柱狀圖。樣品W-04至W-13代表非OA感染(“無病”)的膝關節(jié)軟骨。樣品W-77M至W-96M代表晚期OA關節(jié)軟骨的可見非感染區(qū)域(“溫和OA”)。樣品88S-98 S代表晚期OA關節(jié)軟骨的嚴重感染區(qū)域(“嚴重OA”)。每個樣品中ADAMTS-8mRNA的豐度稱為標準值，其中用ADAMTS-8測得的平均數(shù)據(jù)除以同一樣品中GAPDH測得的平均數(shù)據(jù)。TaqMan分析結果表明，未感染的軟骨與骨性關節(jié)炎軟骨(至少是本研究所用晚期OA軟骨)在平均轉錄物水平上沒有明顯差異。然而，ADAMTS-8的表達水平在OA軟骨樣品96M中顯著增加。這個觀察結果支持對軟骨組織中ADAMTS-8表達上升的選定患者采用個性化方法來治療骨性關節(jié)炎。
實施例8.生產單克隆抗體AGG-C1(MAb AGG-C1)將合成肽CGGPLPRNITEGE(肽aggc1，SEQ ID NO21)與載體蛋白KLH綴合，然后將該綴合體作為免疫原通過標準雜交瘤技術來生產單克隆抗體。簡而言之，用完全弗式佐劑中的20μg免疫原皮下免疫BALB/c小鼠。用不完全弗式佐劑中的肽重復注射兩次(每兩周一次)。對免疫小鼠取測試血，并通過ELISA評測血清對免疫肽和經(jīng)ADAMTS-4消化的牛關節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖(Flannery等人，supra)的活性。在雜交瘤融合前三天，對呈現(xiàn)最高抗體效價的小鼠進行無佐劑的最終免疫。分離這只小鼠的脾細胞，并與FO骨髓瘤細胞融合(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，然后在HAT選擇培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培養(yǎng)。通過ELISA篩選抗KLH-CGGPLPRNITEGE抗原的雜交瘤培養(yǎng)物上清，并通過Western印跡篩選抗經(jīng)ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖的雜交瘤培養(yǎng)物上清。陽性雜交瘤克隆通過有限稀釋來挑選亞克隆。在培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)單一的雜交瘤細胞系，命名為AGG-C1。用MouseMonoclonal Antibody Isotyping kit(Roche，Indianapolis，IN)確定抗體同種型為IgG1，然后通過蛋白A親和層析從1升培養(yǎng)基中純化IgG。
實施例9.競爭性抑制ELISA測試競爭性抑制ELISA測試用來證實MAb AGG-C1能特異識別合適的聚集蛋白聚糖新表位。通過每孔用100μl b-aggc1(100ng/ml)在室溫下孵育1小時來用N-末端生物素肽aggc1(b-aggc1)包被鏈霉親和素包被的微量滴定板(Pierce，Rockford，IL)。在用含0.01％Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS-Tween)洗滌4次后，孔用100μl含2％BSA的PBS-Tween在室溫下封閉1小時，然后用PBS-Tween洗滌4次。
為了驗證MAb AGG-C1的新表位性質，將包含MAb AGG-C1(0.04μg/ml)和1.0-1000nmol/ml合成肽GGLPLPRNITEGE(SEQ ID NO22)、GGLPLPRNITEGEARGSVILTVK-CONH2(SEQ ID NO23)、未消化聚集蛋白聚糖或ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖的競爭性混合物(100μl)在室溫下預孵育1小時。然后將混合物轉移至用b-aggcl包被的孔中。進一步在室溫下孵育1小時后，用PBS-Tween洗滌平板4次，然后與100μl綴合過氧化物酶的山羊抗鼠IgG二抗(1∶10000)在室溫下孵育1小時。隨后用PBS-Tween最后洗滌4次，并用TMB1組分微孔過氧化物酶底物(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)孵育孔。加入0.18M H2SO4來終止顯色，并分光光度地檢測450nm處的吸光度。
為了制備標準曲線，用ADAMTS-4(0.001ng-5ng)在37℃下消化牛聚集蛋白聚糖(25μg/50μl)16小時。然后向每個消化物中加入MAbAGG-C1(最終抗體濃度0.04μg/ml)，并在室溫下預孵育這些混合物1小時，隨后轉移到b-aggc1包被的平板上完成競爭性ELISA。
圖5顯示使用MAb AGG-C1進行的競爭性抑制ELISA的結果。合成肽GGLPLPRNITEGE(SEQ ID NO22，其C末端對應聚集蛋白聚糖核心蛋白的E373)和ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖(分別為實心框和實心圓)之間觀察到劑量依賴性競爭。合成肽GGPLPRNITEGEARGSVILTVK(SEQ ID NO23)和未消化的聚集蛋白聚糖在測試中沒有競爭(分別表示為空心框和空心圓)。
圖7顯示另一個針對聚集蛋白聚糖酶活性的競爭性抑制ELISA。標準曲線由用數(shù)量增加的重組ADAMTS-4和牛聚集蛋白聚糖在37℃孵育16小時、隨后在每個消化物中加入MAb AGG-C1產生。進行類似的測試來估測ADAMTS-8的相對聚集蛋白聚糖酶活性。在競爭性抑制ELISA中產生45％的抑制需要0.0135pM的ADAMTS-4，需要46.6±4.8pM的ADAMTS-8來獲得相似水平的活性。
實施例10.ADAMTS-8和ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖的Western印跡用兩種不同單克隆抗體-即MAb BC-3和MAb AGG-C1證實了ADAMTS-8在聚集蛋白聚糖酶切割位點(谷氨酸373-丙氨酸374)處切割聚集蛋白聚糖的能力，其中這種能力用來定義骨性關節(jié)炎相關聚集蛋白聚糖酶活性。MAb BC-3特異地檢測新表位N末端序列374ARGXX...(SEQ IDNO24)。MAb AGG-C1特異地檢測新表位C末端序列...NITEGE373(SEQID NO25)。這兩個新表位都由聚集蛋白聚糖酶切割位于聚集蛋白聚糖球間結構域的谷氨酸373-丙氨酸374鍵產生。
圖6A-6C顯示使用MAb BC-3和MAb AGG-C1對ADAMTS-4和ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖的Western印跡分析結果。圖6A顯示使用MAb BC-3的Western印跡。泳道1、未加入酶；泳道2顯示ADAMTS-4消化的聚集蛋白聚糖，其中酶∶底物的摩爾比1∶20；泳道3-7顯示ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖，其中酶∶底物的摩爾比分別為1∶2、1∶0.5、1∶0.2、1∶0.1和1∶0.07。MAb BC-3免疫反應條帶的密度隨ADAMTS-8蛋白相對聚集蛋白聚糖底物增加的量而增加(圖6A，泳道3-7)，這表明聚集蛋白聚糖在OA相關的位置被切割。但是，使用ADAMTS-4時，底物對應需要更多數(shù)量的酶(比較圖6A中的泳道3-7和泳道2)。
圖6B是使用AGG-C1的Western印跡。顯示了每個消化物中酶∶底物的相對摩爾比率。圖6B中顯示使用酶∶底物比率在1∶1到1∶0.3范圍內的MAb AGG-C1免疫反應條帶。在相同測試中，ADAMTS-4也產生MAbAGG-C1的免疫反應條帶，但酶∶底物的比率更低(圖6C，泳道2-6)。每個印跡左側顯示球形蛋白質標準的遷移位置。
作為陰性對照，高達2.5μg rhMMP-13消化的聚集蛋白聚糖(25μg)的Western印跡沒有產生免疫反應肽，這證明MAb AGG-C1并不識別由MMP切割聚集蛋白聚糖產生的新表位序列..DIPEN341(SEQ ID NO26)。此外，用與ADAMTS-8相似的酶∶底物比率的MMP-13消化的聚集蛋白聚糖與MAb BC-14有免疫反應，MAb BC-14能識別MMP產生的新表位序列342FFG..(SEQ ID NO27)，但不能被識別聚集蛋白聚糖酶產生的新表位序列373ARGXX..(SEQ ID NO24)的MAb BC-3識別。
Western印跡分析的詳細步驟闡明如下。將牛骨關節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖與純化的ADAMTS-8或ADAMTS-4在37℃下，與含100mM NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris(PH 7.3)孵育16小時。消化產物通過在存在軟骨素酶ABC(Seikagaku America，F(xiàn)almouth，MA；1mU/μg聚集蛋白聚糖)、角蛋白酶(keratanase)(Seikagaku；1mU/μg聚集蛋白聚糖)和角蛋白酶II(Seikagaku；0.02mU/μg聚集蛋白聚糖)下于37℃孵育2小時而去糖基化。消化產物在4-12％Bis-Tis NuPAGE SDS PAGE凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分離，然后經(jīng)電泳轉移至硝酸纖維素膜。免疫反應產物通過用MAb AGG-C1(0.04μg/ml)或者MAb BC-3(Caterson等人，supra)進行Western印跡檢測。隨后用綴合堿性磷酸酶的山羊抗鼠IgG二抗(Promega Corp.，Madsion，WI；1∶7500)與膜孵育，并用NBT/BCIP底物(Promega)來顯示免疫反應條帶。所有抗體孵育都在室溫下進行1小時，而免疫印跡與底物在室溫下孵育5-15分鐘來實現(xiàn)合適的顯色。
據(jù)報道，除了ADAMTS-4(聚集蛋白聚糖酶1)和ADAMTS-5(聚集蛋白聚糖酶2)，另外兩個ADAMTS家族成員(ADAMTS1和ADAMTS9)能在蛋白質某位點切割軟骨聚集蛋白聚糖蛋白，并且它們兩者在進化系統(tǒng)樹上分組在相同的節(jié)點，例如聚集蛋白聚糖酶1，聚集蛋白聚糖酶2和ADAMTS-8。圖6A-6C顯示ADAMTS-8與其他ADAMTS家族成員相比，作為聚集蛋白聚糖酶活性的效率。此外，ADAMTS-8的聚集蛋白聚糖酶活性似乎對谷氨酸373-丙氨酸374位點特異，這是因為用重組人ADAMTS-8消化的聚集蛋白聚糖的BC-3 Western印跡(監(jiān)測產生的C末端聚集蛋白聚糖切割片段)和AGG-C1 Western印跡(監(jiān)測產生的N末端切割片段)都顯示下列結果，即ADAMTS-8處理產生合適的新表位，而且所產生的兩個聚集蛋白聚糖片段似乎都保持完整而不進一步降解，這就表明在聚集蛋白聚糖的G1-G2球間結構域中存在特異切割。
圖6A-6C也表明，用BC-3新表位MAb能夠輕易地檢測到由1∶0.5酶∶底物比率的ADAMTS-8對牛骨關節(jié)軟骨聚集蛋白聚糖的切割，用AGG-C1新表位MAb甚至可能更低。這個在聚集蛋白聚糖谷氨酸373-丙氨酸374肽鍵處的切割效率和報道的ADAMTS-1和ADAMTS-9的聚集蛋白聚糖酶活性相當。
在相同Western印跡上比較ADAMTS-8和ADAMTS-4對聚集蛋白聚糖的切割，揭示在實驗條件下ADAMTS-8在谷氨酸373-丙氨酸374肽鍵處切割軟骨聚集蛋白聚糖的效率似乎比ADAMTS-4要低。已經(jīng)表明，ADAMTS-4的羧基末端蛋白酶解加工可能在激活其蛋白酶解活性和酶活化(mobilizing)中起著重要作用，其中所述酶活化是通過從催化結構域移去推定的C末端ECM結合結構域以及降低對胞外基質中存在的GAG的親和性。所以，存在這種可能，即ADAMTS-8的酶活性可受穩(wěn)定存在的C末端結構域的抑制，并且C末端截短的ADAMTS-8可顯示增強的聚集蛋白聚糖酶活性。為了說明這個問題，構建并表達了修飾的ADAMTS-8cDNA，其中刪除了C末端解聯(lián)蛋白和間隔結構域的編碼序列。有效地表達并分泌這個重組的C末端截短ADAMTS-8，并通過α2-巨球蛋白測試判定所純化的蛋白質是有活性的，但是AGG-C1 Western印跡發(fā)現(xiàn)其并不比全長重組的ADAMTS-8對聚集蛋白聚糖底物更有活性。然而，ADAMTS-8維持其C末端GAG結合結構域的能力可使ADAMTS-8在體內更加有效地切割軟骨聚集蛋白聚糖，這是通過將酶定位于軟骨基質而增加酶的有效濃度達到的。在正常和骨性關節(jié)炎人骨關節(jié)軟骨中存在ADAMTS-8導致對下列可能的進一步支持，即ADAMTS-8在體內作為聚集蛋白聚糖酶行使功能。
ADAMTS-8可以更加有效地切割其他相關的類透明質酸結合蛋白聚糖，例如神經(jīng)聚糖、短小蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖。在大腦的多種亞區(qū)可以輕易地檢測到ADAMTS-8mRNA，這與神經(jīng)聚糖和短小蛋白聚糖的表達模式一致。鼠ADAMTS-8最先描述為Meth2，其是血管發(fā)生測試(Vázquez等人，supra)中顯示抑制作用的兩個ADAMTS家族成員中的一個(ADAMTS-1是另外一個)。少數(shù)幾個ADAMTS-8mRNA表達最豐富的位點之一是大動脈，這是富含多功能蛋白聚糖的組織。多功能蛋白聚糖是一種重要的血管胞外基質蛋白質，其在細胞粘附、增殖以及遷移方面具廣泛作用。所以，可以嘗試下列猜測，即ADAMTS-8可能在內皮中行使多功能蛋白聚糖酶的功能，可能在G1結構域之后切割多功能蛋白聚糖并將其釋放到基質中。這種由ADAMTS-8介導的增殖性內皮細胞多功能蛋白聚糖缺失可以解釋所觀察到的ADAMTS-8抗血管生成活性。下列觀察結果支持這種可能性，即在體內發(fā)現(xiàn)在谷氨酸441-丙氨酸442鍵處被切割的大動脈多功能蛋白聚糖片段，反映了我們在本研究中顯示的ADAMTS-8切割特異性。ADAMTS-1和ADAMTS-4也已經(jīng)顯示出多功能蛋白聚糖酶活性，這增加了ADAMTS-8能夠以某種水平的效率和特異性切割多功能蛋白聚糖的可能性。
實施例11.表達載體本發(fā)明可以使用p91023(b)的衍生物哺乳動物表達載體pMT2CXM。pMT2 CXM載體與p91023(b)不同，前者包含用氨芐青霉素抗性基因取代了四環(huán)素抗性基因、并進一步包含cDNA克隆插入的Xho I位點。pMT2 CXM的功能元件包括腺病毒VA基因、SV40復制起點(包括72bp的增強子)、腺病毒主要晚期啟動子(包括腺病毒晚期mRNA上存在的5’剪接位點和大部分的腺病毒三聯(lián)前導序列)、3’剪接受體位點、DHFR插入片段、SV40早期多聚腺苷酸位點(SV40)和在大腸桿菌(E.coli)中繁殖必需的pBR322序列。
質粒pMT2 CXM通過EcoR I消化pMT2-VWF獲得，其中所述pMT2-VWF已經(jīng)保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCluture Collection，ATCC)、Rockvill、MD(美國)，入藏號為ATCC 67122。EcoRI消化切割pMT2-VWF中存在的cDNA插入序列，從而獲得線性形式的pMT2，其中所述線性形式的pMT2可以連接并用來轉化大腸桿菌HB 101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性。質粒pMT2 DNA可以通過常規(guī)方法制備。然后用環(huán)內/外誘變來構建pMT2 CXM。這移去了pMT2的SV40復制起點和增強子序列附近相對于Hind III位點的1075至1145位堿基。此外，其插入了包含限制性內切核酸酶Xho I識別位點的序列。名為pMT23的pMT2 CXM衍生物包含限制性內切核酸酶PstI、EcoR I、SalI和XhoI的識別位點。質粒pMT2 CXM和pMT23 DNA可以通過常規(guī)方法制備。
從pMT21衍生而來的pEMC2β1也合用于進行本發(fā)明。pMT21從pMT2衍生而來，而pMT2從pMT2-VWF衍生而來。如上所述，EcoRI消化切割pMT2-VWF中的cDNA插入序列，從而獲得線性形式的pMT2，其中所述線性形式的pMT2可以連接并用來轉化大腸桿菌HB 101或DH-5以獲得氨芐青霉素抗性。質粒pMT2 DNA可以通過常規(guī)方法制備。
pMT21由pMT2經(jīng)過下列兩種修飾衍生而得。首先，刪除DHFR cDNA的5’非翻譯區(qū)的75bp的片段，其中所刪除的片段包括來自cDNA克隆的G/C加尾的19個G殘基串。在這個過程中，Pst I、EcoR I和XhoI位點緊挨著插入在DHFR上游。
然后，通過用EcoRV和XbaI消化、用DNA聚合酶I的Klenow片段處理、并與ClaI接頭(CATCGATG)連接來引入唯一的ClaI位點。這刪除了腺病毒相關RNA(VAI)區(qū)域250bp的片段，但并不影響VAI RNA基因的表達和功能。pMT21用EcoRI和XhoI消化，然后用來產生pEMC2B1載體。
用EcoRI和PstI消化pMT 2-ECAT1，產生2752bp片段，從而獲得部分EMCV前導序列。用TaqI消化這個片段，產生508bp的EcoR I-TaqI片段，并用低熔點瓊脂糖膠電泳純化該片段。合成68bp，具5’TaqI突出末端和3’XhoI突出末端的銜接頭及其互補鏈。
銜接頭序列與EMC病毒前導序列的763-827位核苷酸匹配。它也將EMC病毒前導子內10位的ATG變成ATT，后面緊跟著Xho I位點。pMT21EcoR I-Xho I片段、EMC病毒EcoRI-TaqI片段和68bp多聚核苷酸接頭Taq I-Xho I銜接頭的三步連接產生載體pEMC2β1。
這個載體包含適當關系的SV40復制起點和增強子、腺病毒主要晚期啟動子、腺病毒三聯(lián)前導序列的大部分cDNA拷貝、小的雜交插入序列、SV40多聚腺苷酸信號和腺病毒VAI基因、DHFR和β-半乳糖苷酶標記和EMC序列，以在哺乳細胞中指導目的cDNA的高水平表達。
載體構建可涉及聚集蛋白聚糖酶相關DNA序列的修飾。例如，可以通過移去編碼區(qū)域5’和3’末端的非編碼核苷酸來修飾編碼聚集蛋白聚糖酶的cDNA?？梢詫⑺鶆h除的非編碼核苷酸置換或非置換為其他已知利于表達的序列。將這些載體轉化進入合適的宿主細胞來表達本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶。
在一個具體實施例中，用細菌序列消除或取代聚集蛋白聚糖酶編碼序列側翼的哺乳動物調節(jié)序列，從而產生胞內或胞外聚集蛋白聚糖酶分子表達的細菌載體?？梢赃M一步操作編碼序列(例如，與其他已知的接頭連接，或通過刪除其非編碼序列來修飾，或通過其他已知技術來改變其核苷酸)。然后用本領域技術人員熟知的方法將聚集蛋白聚糖酶編碼序列插入到已知的細菌載體中。該細菌載體可以轉化到細菌宿主細胞中來表達本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶。在細菌細胞中產生胞外聚集蛋白聚糖酶蛋白的胞外表達策略參照見例如歐洲專利申請177,343。
相似操作可以用來構建在昆蟲細胞中表達的昆蟲載體(見例如已公開的歐洲專利申請155,476中所述的步驟)。也可以用酵母調節(jié)序列構建酵母載體，以在酵母細胞中進行本發(fā)明蛋白質的胞內或者胞外表達(見例如已公開的PCT申請WO86/00639和歐洲專利申請123,289中所述的步驟)。
在哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲宿主細胞系統(tǒng)中產生高水平聚集蛋白聚糖酶蛋白的方法涉及構建包含多拷貝異源聚集蛋白聚糖酶基因的細胞。該異源基因可以連接可擴增的標記例如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，以便可以通過在增加氨甲蝶呤(MTX)濃度中培養(yǎng)來選擇含有增加的基因拷貝的細胞。這個方法可以應用于許多不同的細胞類型。
例如，可以通過多種方法將包含與其他能夠表達的質粒序列有效相連的聚集蛋白聚糖酶DNA序列的質粒和DHFR表達質粒(例如，pAdA26SV(A)3)共同引入DHFR缺陷的CHO細胞(DUKX-BII)中，其中所述多種方法包括磷酸鈣介導的轉染、電穿孔或原生質體融合。DHFR表達轉化體在含經(jīng)透析的胎牛血清的α培養(yǎng)基中進行選擇性生長，然后在增加濃度的MTX(例如，0.02、0.2、1.0和5μM MTX的連續(xù)步驟)下用氨芐青霉素進行選擇性生長?？寺∞D化體，然后用至少一種上述測試來監(jiān)測生物學活性的聚集蛋白聚糖酶的表達。聚集蛋白聚糖酶蛋白質的表達應當隨著MTX抗性水平的增加而增加。用本領域已知的標準技術來表征聚集蛋白聚糖酶多肽，例如脈沖標記35S甲硫氨酸或半胱氨酸，以及多聚丙稀酰氨凝膠電泳。相似方法可以用生產其他聚集蛋白聚糖酶。
實施例12.轉染表達載體作為一個實施例，將本發(fā)明的聚集蛋白聚糖酶核苷酸序列克隆進入表達載體pED6。通過脂質轉染(LF2000，Invitrogen)，將聚集蛋白聚糖酶序列瞬時轉染COS和CHO DUKX B11細胞(+/-在分離的PED6質粒上共轉染PACE)。每個目的分子進行重復轉染(a)一個轉染集合用來收獲條件培養(yǎng)基進行活性測試，而(b)另一個轉染集合用來進行35-S-甲硫氨酸/半胱氨酸代謝標記。
第1天，將為了進行活性測試而將待收獲的集合(a)的孔中的培養(yǎng)基換成加入1％熱滅活胎牛血清+/-100μg/ml肝素的DME(COS)或者α(CHO)培養(yǎng)基。48小時以后，收集條件培養(yǎng)基進行活性測試。第3天，集合(b)重復的孔換成加入1％熱滅活胎牛血清、100μg/ml肝磷脂和100μCi/ml35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(Redivue Pro mix，Amersham)的MEM(無甲硫氨酸/半胱氨酸)培養(yǎng)基。在37℃孵育6小時之后，收集條件培養(yǎng)基，并在還原條件下進行SDA-PAGE凝膠電泳。蛋白質通過放射自顯影顯示。
本發(fā)明的上述描述提供了實例和描述，但并不詳盡或者不將本發(fā)明限制在明確公開的某一點。修飾和變化可能與上述教導一致，或者可以從本發(fā)明的應用中獲得。所以，需要注意的是，本發(fā)明的范圍由權利要求書及其等同物定義。
序列表序列表<110>惠氏公司<120>ADAMTS-8蛋白及其用途<130>031896-034001(AM101372)<150>US 60/562,687<151>2004-04-16<160>28<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>31<212>PRT<213>人<400>1Gly Tyr Ile Glu Ala Ala Val Ile Pro Ala Gly Ala Arg Arg Ile Arg1 5 10 15Val Val Glu Asp Lys Pro Ala His Ser Phe Leu Ala Leu Lys Asp20 25 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人<400>2atgttccccg cccccgccgc cccccggtg29<210>3<211>29<212>DNA<213>人<400>3ggatcccccg aggcgctcga tcttgaact29
<210>4<211>24<212>DNA<213>人<400>4ggatccggcc gggcgaccgg gggc 24<210>5<211>30<212>DNA<213>人<400>5ctctagaagc tctgtgagat acatggcgct30<210>6<211>65<212>DNA<213>人<400>6ctctagacgg cgggcacgga gactgtctcc tggatgcccc tggtgcggcc ctgcccctcc 60ccaca 65<210>7<211>67<212>DNA<213>人<400>7acgtgtattt gacttttggg gggaagacct cgccagggac tgtcaggagc tgcactgtca 60gaggctc 67<210>8<211>35<212>DNA<213>人<400>8cacacgttct ttgttcctaa tgacgtggac tttag 35
<210>9<211>32<212>DNA<213>人<400>9gcggccgctc acagggggca cagctggctt tc 32<210>10<211>5<212>PRT<213>人<400>10Gly Ser Gly Ser Ala1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>人<400>11Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5<210>12<211>24<212>DNA<213>人<400>12cttctagacg gcgggcacgg agac 24<210>13<211>82<212>DNA<213>人<400>13ttctagagcg gccgccttat ttttcgaact gcgggtggct ccaagcagat ccggatccca 60
gggggcatag ctggctttcg ca82<210>14<211>20<212>DNA<213>人<400>14ggaccgctgc aagttgttct 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人<400>15ggacacagat ggccagtgtt 20<210>16<211>25<212>DNA<213>人<400>16ccatcaatca ccttggcctc gaaca 25<210>17<211>20<212>DNA<213>人<400>17ccacatcgct cagacaccat 20<210>18<211>18<212>DNA<213>人<400>18gcgcccaata cgaccaaa 18<210>19<211>25
<212>DNA<213>人<400>19gggaaggtga aggtcggagt caacg 25<210>20<211>63<212>DNA<213>人<400>20ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt60ttt 63<210>21<211>13<212>PRT<213>人<400>21Cys Gly Gly Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu1 5 10<210>22<211>13<212>PRT<213>人<400>22Gly Gly Leu Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu1 5 10<210>23<211>23<212>PRT<213>人<400>23Gly Gly Leu Pro Leu Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly1 5 10 15
Ser Val Ile Leu Thr Val Lys20<210>24<211>5<212>PRT<213>人<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>Xaa可以是天然存在的氨基酸<400>24Ala Arg Gly Xaa Xaa1 5<210>25<211>6<212>PRT<213>人<400>25Asn Ile Thr Glu Gly Glu1 5<210>26<211>5<212>PRT<213>人<400>26Asp Ile Pro Glu Asn1 5<210>27<211>3<212>PRT<213>人
<400>27Phe Phe Gly1<210>28<211>890<212>PRT<213>人<400>28Met Leu Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Trp Pro Pro Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Arg Gly Ala Pro Ala Arg Pro20 25 30Ala Ala Gly Gly Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Pro Thr Arg Leu Pro35 40 45Gly Ser Ala Gly Glu Leu Ala Leu His Leu Ser Ala Phe Gly Lys Gly50 55 60Phe Val Leu Arg Leu Ala Pro Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro Glu Phe65 70 75 80Lys Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ala Thr Gly Gly Glu Arg85 90 95Gly Leu Arg Gly Cys Phe Phe Ser Gly Thr Val Asn Gly Glu Pro Glu100 105 110Ser Leu Ala Ala Val Ser Leu Cys Arg Gly Leu Ser Gly Ser Phe Leu115 120 125Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Ile Gln Pro Gln Gly Ala Gly Gly Ser130 135 140Leu Ala Gln Pro His Arg Leu Gln Arg Trp Gly Pro Ala Gly Ala Arg145 150 155 160Pro Leu Pro Arg Gly Pro Glu Trp Glu Val Glu Thr Gly Glu Gly Gln165 170 175
Arg Gln Glu Arg Gly Asp His Gln Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ser Gln180 185 190Glu Glu Glu Ala Glu Gly Ala Ser Glu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala195 200 205Thr Ser Arg Thr Lys Arg Phe Val Ser Glu Ala Arg Phe Val Glu Thr210 215 220Leu Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Tyr Gly Ala Asp Leu225 230 235 240Gln Asn His Ile Leu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Arg Ile Tyr Lys245 250 255His Pro Ser Ile Lys Asn Ser Ile Asn Leu Met Val Val Lys Val Leu260 265 270Ile Val Glu Asp Glu Lys Trp Gly Pro Glu Val Ser Asp Asn Gly Gly275 280 285Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Arg Arg Phe Asn Gln Pro290 295 300Ser Asp Arg His Pro Glu His Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg305 310 315 320Gln Asn Phe Cys Gly Gln Glu Gly Leu Cys Asp Thr Leu Gly Val Ala325 330 335Asp Ile Gly Thr Ile Cys Asp Pro Asn Lys Ser Cys Ser Val Ile Glu340 345 350Asp Glu Gly Leu Gln Ala Ala His Thr Leu Ala His Glu Leu Gly His355 360 365Val Leu Ser Met Pro His Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Arg Leu Phe370 375 380Gly Pro Met Gly Lys His His Val Met Ala Pro Leu Phe Val His Leu385 390 395 400Asn Gln Thr Leu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Met Tyr Leu Thr Glu405 410 415
Leu Leu Asp Gly Gly His Gly Asp Cys Leu Leu Asp Ala Pro Arg Ala420 425 430Ala Leu Pro Leu Pro Thr Gly Leu Pro Gly Arg Met Ala Leu Tyr Gln435 440 445Leu Asp Gln Gln Cys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Asp Phe Arg His Cys450 455 460Pro Asn Thr Ser Ala Gln Asp Val Cys Ala Gln Leu Trp Cys His Thr465 470 475 480Asp Gly Ala Glu Pro Leu Cys His Thr Lys Asn Gly Ser Leu Pro Trp485 490 495Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser500 505 510Cys Leu Pro Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Val Ala Asp Gly515 520 525Gly Trp Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly530 535 540Gly Gly Val Gln Phe Ser His Arg Glu Cys Lys Asp Pro Glu Pro Gln545 550 555 560Asn Gly Gly Arg Tyr Cys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Tyr Gln Ser Cys565 570 575His Thr Glu Glu Cys Pro Pro Asp Gly Lys Ser Phe Arg Glu Gln Gln580 585 590Cys Glu Lys Tyr Asn Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Met Asp Gly Asn Leu595 600 605Leu Gln Trp Val Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Arg Asp Arg Cys610 615 620Lys Leu Phe Cys Arg Ala Arg Gly Arg Ser Glu Phe Lys Val Phe Glu625 630 635 640Ala Lys Val Ile Asp Gly Thr Leu Cys Gly Pro Glu Thr Leu Ala Ile645 650 655
Cys Val Arg Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp His Val Val Asp660 665 670Ser Pro Arg Lys Leu Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Lys Gly Asn675 680 685Ser Cys Arg Lys Val Ser Gly Ser Leu Thr Pro Thr Asn Tyr Gly Tyr690 695 700Asn Asp Ile Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Asn Ile Asp Val Lys705 710 715 720Gln Arg Ser His Pro Gly Val Gln Asn Asp Gly Asn Tyr Leu Ala Leu725 730 735Lys Thr Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ile Ser740 745 750Ala Ile Glu Gln Asp Ile Leu Val Lys Gly Thr Ile Leu Lys Tyr Ser755 760 765Gly Ser Ile Ala Thr Leu Glu Arg Leu Gln Ser Phe Arg Pro Leu Pro770 775 780Glu Pro Leu Thr Val Gln Leu Leu Thr Val Pro Gly Glu Val Phe Pro785 790 795 800Pro Lys Val Lys Tyr Thr Phe Phe Val Pro Asn Asp Val Asp Phe Ser805 810 815Met Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Thr Thr Asn Ile Ile Gln Pro Leu820 825830Leu His Ala Gln Trp Val Leu Gly Asp Trp Ser Glu Cys Ser Ser Thr835 840 845Cys Gly Ala Gly Trp Gln Arg Arg Thr Val Glu Cys Arg Asp Pro Ser850 855 860Gly Gln Ala Ser Ala Thr Cys Asn Lys Ala Leu Lys Pro Glu Asp Ala865 870 875 880Lys Pro Cys Glu Ser Gln Leu Cys Pro Leu885 890
權利要求
1.一種切割蛋白聚糖的方法，其包括用切割所述蛋白聚糖的分離ADAMTS-8蛋白接觸該蛋白聚糖。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖分子。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中所述ADAMTS-8蛋白是成熟的ADAMTS-8蛋白。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述成熟的ADAMTS-8蛋白由GeneBank登錄號AF060153編碼，但缺失信號肽和前域。
5.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述成熟的ADAMTS-8蛋白包含SEQ ID NO28的214-890位氨基酸。
6.一種切割蛋白聚糖的方法，其包括用分離的蛋白酶接觸所述蛋白聚糖來切割該蛋白聚糖，其中所述蛋白酶包含ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結構域。
7.權利要求6的方法，其中所述蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖分子。
8.權利要求6或7的方法，其中所述ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結構域由SEQ ID NO28的214-439位氨基酸組成。
9.權利要求6、7或8中任一項的方法，其中所述蛋白酶包含SEQ IDNO28的214-588位氨基酸。
10.一種切割蛋白聚糖的方法，其包括從重組表達載體表達蛋白酶，其中所述蛋白酶包含ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結構域，并且所述蛋白酶切割所述蛋白聚糖。
11.權利要求10的方法，其中所述蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖分子，并且所述重組表達載體在分泌所述蛋白酶的哺乳動物細胞中表達。
12.權利要求10或11的方法，其中所述重組表達載體包含SEQ IDNO28的214-890位氨基酸的編碼序列。
13.權利要求10、11或12中任一項的方法，其中所述重組表達載體包含SEQ ID NO28的214-588位氨基酸的編碼序列。
14.一種鑒定能夠調節(jié)ADAMTS-8蛋白的聚集蛋白聚糖切割活性的試劑的方法，所述方法包括在存在或不存在所述試劑時，用聚集蛋白聚糖分子接觸所述ADAMTS-8蛋白；并且測定存在或不存在所述試劑時，所述ADAMTS-8蛋白的聚集蛋白聚糖切割活性，其中與不存在所述試劑時相比，存在所述試劑時聚集蛋白聚糖切割活性的改變表明所述試劑能夠調節(jié)所述聚集蛋白聚糖的切割活性。
15.一種包含根據(jù)權利要求14的方法鑒定的所述試劑的藥物組合物。
16.一種在哺乳動物中治療聚集蛋白聚糖切割異常的方法，其包括向所述哺乳動物施用根據(jù)權利要求14的方法鑒定的所述試劑。
17.一種鑒定能夠調節(jié)ADAMTS-8蛋白的聚集蛋白聚糖切割活性的試劑的方法，所述方法包括在存在或不存在所述試劑時，用聚集蛋白聚糖分子接觸蛋白酶，所述蛋白酶包含ADAMTS-8的金屬蛋白酶催化結構域并且具有聚集蛋白聚糖切割活性；并且測定存在或不存在所述試劑時，所述蛋白酶的聚集蛋白聚糖切割活性，其中與不存在述試劑時相比，存在所述試劑時聚集蛋白聚糖切割活性的改變表明所述試劑能夠調節(jié)所述聚集蛋白聚糖的切割活性。
18.一種調節(jié)哺乳動物細胞胞外區(qū)域中聚集蛋白聚糖切割活性的方法，其包括在所述哺乳動物細胞中抑制ADAMTS-8的表達。
19.權利要求18的方法，其中所述抑制包括向所述哺乳動物細胞中引入包含或編碼ADAMTS-8RNAi或反義序列的多核苷酸。
20.一種在哺乳動物中治療聚集蛋白聚糖切割異常的方法，其包括在所述哺乳動物的選定細胞中抑制ADAMTS-8的表達。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于使用ADAMTS－8蛋白或其功能性衍生物切割聚集蛋白聚糖或其他蛋白聚糖分子的用途。本發(fā)明的特征也在于鑒定能夠抑制或增強ADAMTS－8蛋白酶解活性的ADAMTS－8調節(jié)劑的方法。此外，本發(fā)明的特征在于包含ADAMTS－8蛋白或其衍生物或調節(jié)劑的藥物組合物。這些藥物組合物可用來治療表征為蛋白聚糖切割或代謝缺陷或異常的疾病。
文檔編號A61K38/46GK1969043SQ200580019595
公開日2007年5月23日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權日2004年4月16日
發(fā)明者E·R·拉瓦利, L·A·科林斯-拉奇, C·J·科科倫, M·J·阿戈斯蒂諾, B·A·弗里曼, M·阿賴, C·R·弗蘭納里, M·X·吉恩 申請人:惠氏公司