專利名稱：促濾泡素抑制素突變多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促濾泡素抑制素(フオリスタチン，follistatin)突變多肽，與對(duì)激活蛋白(アクチビン，activin)的抑制相比，它能選擇性抑制生長(zhǎng)/分化因子-8(growth/differentiation factor-8，GDF-8)的活性。
背景技術(shù)：
激活蛋白是一種生長(zhǎng)/分化因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，具有誘導(dǎo)成紅細(xì)胞分化、促進(jìn)垂體分泌促卵泡素(FSH)以及由FSH促進(jìn)黃體生成、維持神經(jīng)細(xì)胞生存、促進(jìn)胰島素產(chǎn)生等多種功能。
生長(zhǎng)/分化因子-8(GDF-8)，也叫做肌抑素(myostatin)，在發(fā)育過(guò)程中的及成體的骨骼肌中特異表達(dá)，是TGF-β超家族的一成員，屬于激活蛋白亞家族(Nature，(英國(guó))1997，第387卷，第6628號(hào)，83-90)。GDF-8具有負(fù)向調(diào)控肌細(xì)胞體積的作用，在GDF-8缺失的小鼠中，肌細(xì)胞體積比野生型小鼠增加2～3倍(Nature，(英國(guó))1997，第387卷，第6628號(hào)，83-90)。
促濾泡素抑制素與激活蛋白(Science，(美國(guó))1990，第247卷，第4944號(hào)，836-838)和GDF-8(Proceedings of the National Academy ofScience of the United States of America，美國(guó)，2001，第98卷，第16號(hào)，9306-9311)強(qiáng)力結(jié)合(對(duì)激活蛋白的解離常數(shù)是Kd＝540-680pmol/L)，中和它們的活性。此外，提示促濾泡素抑制素體內(nèi)直接和間接參與調(diào)控激活蛋白及GDF-8的各種生理活性的數(shù)據(jù)日益增多。通過(guò)微型滲透泵將促濾泡素抑制素連續(xù)施與小鼠，可顯著性減少骨髓和脾臟中成紅細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)目(Proceedings of the NationalAcademy of Science of the United States of America，美國(guó)，1992，第89卷，第5號(hào)，1553-1556)，在骨骼肌特異的啟動(dòng)子的支配下，表達(dá)促濾泡素抑制素的轉(zhuǎn)基因小鼠中，骨骼肌的重量顯著增加(Proceedingsof the National Academy of Science of the United States of America，美國(guó)，2001，第98卷，第16號(hào)，9306-9311)。
促濾泡素抑制素氨基酸序列分析表明，從N末端開(kāi)始包括N末端結(jié)構(gòu)域、促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I、促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域II、促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III四個(gè)結(jié)構(gòu)域(Proceedings of the National Academyof Science of the United States ofAmerica，美國(guó)，1988，第85卷，第12號(hào)，4218-4222)。因此認(rèn)為促濾泡素抑制素參與與激活蛋白及其它生長(zhǎng)因子的結(jié)合。
近年，有GDF-8參與多種疾病的報(bào)道。Zimmers等報(bào)道將穩(wěn)定表達(dá)GDF-8的細(xì)胞移植到裸鼠大腿部，可誘導(dǎo)骨骼肌和脂肪減少等惡液質(zhì)(cachexic)癥狀(Science，(美國(guó))2002，第296卷，第5572號(hào)，1486-1488)。也有伴隨體重減少的HIV感染者的肌肉中，抗GDF-8抗體陽(yáng)性的蛋白質(zhì)增加的報(bào)道(Proceedings of the National Academy ofScience of the United States of America，美國(guó)，1998，第95卷，第25號(hào)，14938-14943)。在Duchenne肌肉營(yíng)養(yǎng)不良的模型小鼠mdx小鼠與GDF-8缺失小鼠交配所得的小鼠中，其肌肉的重量、肌肉的功能均比mdx小鼠有所改善(Annals of Neurology，(美國(guó))，2002，第52卷，第6號(hào)，832-836)。另外，在GDF-8缺失小鼠中，可見(jiàn)到骨骼肌增加的同時(shí)脂肪量減少；在糖尿病模型小鼠中出現(xiàn)GDF-8基因的缺失，由此提示，由于抑制脂肪蓄積和葡萄糖代謝異常，所以GDF-8參與肥胖和II型糖尿病的發(fā)病及病情惡化(The journal of ClinicalInvestigation，(美國(guó))，2002，第109卷，第5號(hào)，595-601)。
由此，人們考慮通過(guò)抑制GDF-8活性，可對(duì)這些GDF-8參與發(fā)病或促進(jìn)病情惡化的疾病進(jìn)行治療，但為了減輕副作用，優(yōu)選不抑制激活蛋白的活性而選擇性抑制GDF-8活性的物質(zhì)。已知抑制GDF-8活性的物質(zhì)有促濾泡素抑制素(美國(guó)專利公開(kāi)第2002/0157126號(hào)說(shuō)明書(shū)，以及特表2002-506044號(hào)公報(bào))、抗GDF-8抗體(US6096506說(shuō)明書(shū))、GDF-8前肽(WO 02/09641號(hào)小冊(cè)子)、顯性失活GDF-8突變體(WO 01/53350號(hào)小冊(cè)子及WO 00/43781號(hào)小冊(cè)子)、GDF-8抗原(US 6369201說(shuō)明書(shū)、WO 01/05820號(hào)小冊(cè)子及WO 99/42573號(hào)小冊(cè)子)、GDF-8受體和GDF-8受體抗體(WO02/10214號(hào)小冊(cè)子)以及Smad2和Smad3磷酸化抑制劑(國(guó)際公開(kāi)第02/055077號(hào)小冊(cè)子)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能選擇性抑制GDF-8活性，而不抑制激活蛋白的活性的促濾泡素抑制素突變體，其中所述激活蛋白具有下垂體FSH分泌、黃體生成、成紅細(xì)胞分化、胰島素分泌等重要功能，所述GDF-8參與惡液質(zhì)、肌營(yíng)養(yǎng)不良、肥胖和II型糖尿病的發(fā)病和/或病情惡化。
本發(fā)明涉及下述的(1)～(28)(1) 一種促濾泡素抑制素突變體多肽，其特征在于(a)它包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號(hào)2或序列號(hào)29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨(dú)立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數(shù)；(c)與抑制激活蛋白的活性相比，選擇性抑制GDF-8的活性。
(2)(1)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I，缺失促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域II。
(3)(1)或(2)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它也不包括促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III。
(4)(1)～3任一項(xiàng)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括2個(gè)以上的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I。
(5)(1)～(4)任一項(xiàng)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它還包括N端結(jié)構(gòu)域。
(6)(1)或(2)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括選自FSI、FSI-FSI、FSI-FSI-FSIII、FSN-FSI、FSN-FSI-FSI、FSN-FSI-FSI-FSIII的任一結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，其中，F(xiàn)SI表示促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I，F(xiàn)SIII表示促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III，F(xiàn)SN表示N端結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域間可直接相連，或通過(guò)連接肽連接。
(7)(1)～(6)任一項(xiàng)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I是包含序列號(hào)1中氨基酸序列的多肽。
(8)(7)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括序列號(hào)4中30～166位的氨基酸序列。
(9)(1)～(8)任一項(xiàng)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的N端或C端融合了其它多肽。
(10) 一種多肽，它包含序列號(hào)6、8或10中的氨基酸序列。
(11) 一種多聚核苷酸，它編碼(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽。
(12) (11)中描述的多聚核苷酸，它包含序列號(hào)5、7或9所示的堿基序列。
(13) 一種載體，它包括(11)或(12)中描述的多聚核苷酸。
(14) 一種轉(zhuǎn)化體，它是將(13)中的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得的。
(15) 一種多肽的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(14)中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使該細(xì)胞中表達(dá)的(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽在培養(yǎng)基或該細(xì)胞中蓄積，從培養(yǎng)基或該細(xì)胞中收集該多肽。
(16) 一種GDF-8的選擇性抑制劑，它含有(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體，且其不抑制激活蛋白。
(17) 一種醫(yī)藥組合物，它含有(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(18) 一種骨骼肌增加劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(19) 一種脂肪減少劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(20) 一種肌肉萎縮癥的治療劑或預(yù)防劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(21) 一種伴隨有惡液質(zhì)、肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖或獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預(yù)防劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(22) (21)中描述的治療劑或預(yù)防劑，其中伴隨有肌肉萎縮的疾病是遺傳性的肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓小腦變性癥或帕金森病。
(23) 一種轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，它導(dǎo)入了含(11)或(12)中多聚核苷酸的外來(lái)基因。
(24) 一種增加非人動(dòng)物肌肉的方法，它向非人動(dòng)物中施用了(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(25) 一種減少非人動(dòng)物脂肪的方法，它向非人動(dòng)物中施用了(1)～(10)任一項(xiàng)中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(26) 一種驗(yàn)證待檢物質(zhì)的抑制激活蛋白及GDF-8功能的方法，它包括在激活蛋白、GDF-8、激活蛋白和待檢物質(zhì)，或GDF-8和待檢物質(zhì)存在的條件下培養(yǎng)具有報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因。
(27) (26)描述的方法，其中使用熒光素酶作為報(bào)告基因。
(28) (26)或(27)描述的方法，其中使用促濾泡素抑制素突變體多肽作為待檢物質(zhì)，所述促濾泡素抑制素突變體多肽(a)包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號(hào)2或序列號(hào)29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨(dú)立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數(shù)；。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示人、小鼠、大鼠、牛、豬、羊、馬、雞各促濾泡素抑制素氨基酸序列的比較，以及FSI和FSII的共有序列。在相當(dāng)于FSN、FSI、FSII和FSIII各結(jié)構(gòu)域的區(qū)域上面劃線，各促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基處用點(diǎn)表示。
圖2表示質(zhì)粒pGEM-T Easy(A)的制備過(guò)程。
圖3表示質(zhì)粒pGEM-T Easy(B)的制備過(guò)程。
圖4表示質(zhì)粒pBluescript SK(-)(B)的制備過(guò)程。
圖5表示質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B)的制備過(guò)程。
圖6表示質(zhì)粒pcDNA3(A+B)的制備過(guò)程。
圖7表示質(zhì)粒pcDNA3(B)的制備過(guò)程。
圖8表示質(zhì)粒pBluescript SK(-)/FS的制備過(guò)程。
圖9表示質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B+C)的制備過(guò)程。
圖10表示質(zhì)粒pcDNA3(A+B+C)的制備過(guò)程。
圖11表示質(zhì)粒pBluescript SK(-)(D)的制備過(guò)程。
圖12表示質(zhì)粒pcDNA3(A+B+D)的制備過(guò)程。
圖13表示質(zhì)粒pcDNA3(A+B+D)的制備過(guò)程。
圖14表示小鼠促濾泡素抑制素的FSII與小鼠FLRG的FSII樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比較。一致的氨基酸用|表示。
圖15表示通過(guò)Western Blotting檢測(cè)FS1-1。
圖16表示測(cè)定FS1-1對(duì)激活蛋白及GDF-8的活性抑制的報(bào)告基因檢驗(yàn)的結(jié)果。
圖17表示測(cè)定各促濾泡素抑制素突變體的激活蛋白活性抑制的報(bào)告基因檢驗(yàn)的結(jié)果。分別添加用+表示的多肽。
圖18表示測(cè)定各促濾泡素抑制素突變體抑制GDF-8活性的報(bào)告基因檢驗(yàn)的結(jié)果。分別添加用+表示的多肽。
圖19表示導(dǎo)入了FS1-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的各種骨骼肌的重量增大。
圖20表示導(dǎo)入了FS1-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠皮下脂肪和腎臟的內(nèi)在脂肪與體重的重量比減少。
圖21表示測(cè)定FS1-Fc抑制激活蛋白及GDF-8的活性的報(bào)告基因檢驗(yàn)的結(jié)果。
圖22表示測(cè)定FS1-1-Fc抑制激活蛋白及GDF-8的活性的報(bào)告基因檢驗(yàn)的結(jié)果。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式1.本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽制備本發(fā)明的突變體時(shí)可使用任何動(dòng)物種類作為促濾泡素抑制素的來(lái)源，優(yōu)選哺乳類或鳥(niǎo)類的促濾泡素抑制素，例如人、小鼠、大鼠、牛、豬、羊、馬、雞等的促濾泡素抑制素，特別優(yōu)選人促濾泡素抑制素。此外，由于mRNA剪切的不同或翻譯后的加工，產(chǎn)生C末端氨基酸序列不同的分子，任何一種均可。具體而言，包括由序列號(hào)4的30～344位氨基酸序列構(gòu)成的人促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為P47931的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構(gòu)成的小鼠促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為NP_032072的氨基酸序列的30～343位氨基酸序列構(gòu)成的小鼠促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為P21674的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構(gòu)成的大鼠促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為P50291的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構(gòu)成的牛促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為P10669的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構(gòu)成的豬促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為P31514的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構(gòu)成的羊促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為062650的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構(gòu)成的馬促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為NP_990531的氨基酸序列的29～343位氨基酸序列構(gòu)成的雞促濾泡素抑制素、由這些促濾泡素抑制素的C末端缺失了27位氨基酸或12位氨基酸的序列構(gòu)成的多肽、或者天然存在的這些多肽基因的等位基因突變和單堿基多態(tài)基因編碼的多肽。
本發(fā)明中促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域是指在促濾泡素抑制素內(nèi)重復(fù)3次、包括保守的10個(gè)半胱氨酸、由Cys-(Xaa)4-Cys-(Xaa)5-Cys-(Xaa)9-10-Cys-(Xaa)1-2-Cys-(Xaa)3-Cys-(Xaa)9-10-Cys-(Xaa)10-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)13-Cys表示的大約70個(gè)氨基酸序列(Xaa表示任意的氨基酸)構(gòu)成的區(qū)域，從N末端開(kāi)始分別是促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I(以下略作FSI)、促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域II(以下略作FSII)及促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III(以下略作FSIII)。例如，序列號(hào)4表示的促濾泡素抑制素前體氨基酸序列(編碼該氨基酸序列的堿基序列示于序列號(hào)3中)中95～164位的區(qū)域?yàn)镕SI、168～239位的區(qū)域?yàn)镕SII、245～316位的區(qū)域?yàn)镕SIII。此外，N端結(jié)構(gòu)域(以下略作FSN)是指從促濾泡素抑制素的N末端到FSI之間的區(qū)域，例如序列號(hào)4表示的促濾泡素抑制素前體氨基酸序列中30～94位的區(qū)域。圖1表示人、小鼠、大鼠、牛、豬、羊、馬、雞各種促濾泡素抑制素氨基酸序列與FSN、FSI、FSII、FSIII各結(jié)構(gòu)域的位置，F(xiàn)SI和FSII的共有序列。
與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽選擇性抑制GDF-8的活性，其特征在于，它包含F(xiàn)SI，不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys(式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨(dú)立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數(shù))所示且與序列號(hào)2或序列號(hào)29中的氨基酸序列有50％以上、優(yōu)選60％以上、更優(yōu)選80％以上、再優(yōu)選95％以上同源性(以下叫做FSII同源序列)的序列。這里“半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基”是指天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸及亮氨酸中的任意氨基酸。序列號(hào)2中的氨基酸序列是哺乳類及雞促濾泡素抑制素FSII的共有氨基酸序列。序列號(hào)29中的氨基酸序列是小鼠促濾泡素抑制素相關(guān)基因(follistatin related gene，F(xiàn)LRG)編碼的FLRG蛋白質(zhì)的2個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域樣序列的第2個(gè)促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域樣序列，與序列號(hào)2中的序列有61％的同源性。FSII同源序列中包含序列號(hào)2的氨基酸序列、序列號(hào)29的氨基酸序列。作為FSII同源序列包括，例如上面式(I)代表的氨基酸序列中(X1)a為序列號(hào)2的2～5位氨基酸序列或序列號(hào)29的2～5位氨基酸序列、(X2)b為序列號(hào)2的7～11位氨基酸序列或序列號(hào)29的7～11位氨基酸序列、(X3)c為序列號(hào)2的13～21位氨基酸序列或序列號(hào)29的13～21位氨基酸序列、(X4)d為序列號(hào)2的23～24位氨基酸序列或序列號(hào)29的23～24位氨基酸序列、(X5)e為序列號(hào)2的26～28位氨基酸序列或序列號(hào)29的26～29位氨基酸序列、(X6)f為序列號(hào)2的30～39位氨基酸序列或序列號(hào)29的31～40位氨基酸序列、(X7)g為序列號(hào)2的41～50位氨基酸序列或序列號(hào)29的42～51位氨基酸序列、(X8)h為序列號(hào)2的52～57位氨基酸序列或序列號(hào)29的53～58位氨基酸序列、(X9)i為序列號(hào)2的59～71位氨基酸序列或序列號(hào)29的60～72位氨基酸序列。
不包含F(xiàn)SII同源序列的促濾泡素抑制素突變體包括，例如缺失全部FSII的突變體、缺失FSII的包含1個(gè)以上半胱氨酸殘基的部分區(qū)域的突變體、缺失FSII的1個(gè)以上的半胱氨酸殘基或置換成其它氨基酸的突變體、FSII內(nèi)部插入了不包括FSII同源序列的10以上氨基酸的氨基酸序列的突變體等。只要是包含F(xiàn)SI不包含F(xiàn)SII同源序列的序列，F(xiàn)SI及FSII以外區(qū)域的氨基酸序列中氨基酸缺失、附加、置換的位置、數(shù)目不限。氨基酸突變(即氨基酸的缺失、附加或置換)的數(shù)目?jī)?yōu)選為1～50個(gè)，更優(yōu)選1～30個(gè)，更優(yōu)選1～20個(gè)，更優(yōu)選1～10個(gè)，特別優(yōu)選1～5個(gè)。此外，促濾泡素抑制素突變體多肽，其FSI的氨基酸序列中也可存在氨基酸的缺失、附加或置換，只要與抑制激活蛋白的活性相比，它能選擇性抑制GDF-8的活性即可。其FSI的氨基酸序列中氨基酸突變的數(shù)目?jī)?yōu)選1～10個(gè)，更優(yōu)選1～8個(gè)，更優(yōu)選1～5個(gè)。作為本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽，更優(yōu)選也缺失了FSIII的多肽。此外，F(xiàn)SI的數(shù)目可以是1個(gè)，優(yōu)選含2個(gè)以上。也可含F(xiàn)SN。
作為本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽包括具有FSI、FSI-FSI、FSI-FSI-FSIII、FSN-FSI、FSN-FSI-FSI、FSN-FSI-FSI-FSIII等結(jié)構(gòu)域的多肽，這些多肽的N末端或C末端融合了其它多肽的多肽。各結(jié)構(gòu)域間直接相連，或者連接了由1～50個(gè)、優(yōu)選1～10個(gè)、更優(yōu)選1～5個(gè)氨基酸構(gòu)成的接頭多肽。接頭多肽的氨基酸序列也可以是不包含半胱氨酸的任意序列。融合到N末端或C末端的多肽的序列，可以是不包含上述FSII同源序列的任意序列，也可是1個(gè)氨基酸。作為融合到N末端或C末端的多肽，包括免疫球蛋白的恒定區(qū)域、Protein A、Protein G、綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、多聚組氨酸、S肽、FLAG肽、HA表位肽、myc表位肽等。
FSI序列包括序列號(hào)4的95～164位的氨基酸序列，作為各哺乳類和雞的促濾泡素抑制素的FSI的共有序列的序列號(hào)1的氨基酸序列。FSII序列包括序列號(hào)4的168～239位的氨基酸序列，及作為各哺乳類和雞的促濾泡素抑制素的FSII的共有序列的序列號(hào)2的氨基酸序列。FSN序列是，例如序列號(hào)4的1～94位的氨基酸序列。FSIII序列是，例如序列號(hào)4的245～316位的氨基酸序列。
作為本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的具體例如，包含序列號(hào)6、8或10的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽也可是經(jīng)過(guò)修飾的多肽。本發(fā)明中所說(shuō)的“修飾”是包含化學(xué)修飾及生物學(xué)修飾的最廣義解釋。修飾的例子包括，例如烷基化、酯化、鹵化、或氨基化等功能團(tuán)導(dǎo)入，氧化、還原、添加或脫離等功能團(tuán)變化、糖化合物(單糖、二糖、寡糖、或多糖)或脂質(zhì)化合物導(dǎo)入、磷酸化、生物素化、或聚乙二醇修飾等，但并不限定于此。
上述本發(fā)明的多肽即可以游離形式提供，也可以酸附加鹽或堿附加鹽形式提供。酸附加鹽包括，例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等，或者p-甲苯磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽等有機(jī)酸鹽。堿基附加鹽包括，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等金屬鹽，銨鹽，甲基銨鹽、三乙銨鹽等有機(jī)銨鹽。有時(shí)與甘氨酸等氨基酸形成鹽，有時(shí)在分子內(nèi)形成平衡離子。
有時(shí)這些肽或其鹽以水合物或溶劑和物形式存在。本發(fā)明的多肽有多個(gè)不對(duì)稱碳原子，但這些不對(duì)稱碳原子的立體結(jié)構(gòu)無(wú)特殊限定，但優(yōu)選氨基酸殘基為L(zhǎng)-氨基酸?；谶@些不對(duì)稱碳原子的光學(xué)活性體、非對(duì)映異構(gòu)體等立體異構(gòu)體、立體異構(gòu)體的任意混合物、消旋體等均包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
以下對(duì)本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體的制備方法、活性評(píng)價(jià)方法及其使用方法進(jìn)行說(shuō)明。
2.促濾泡素抑制素突變體多肽的制備方法(1)編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的構(gòu)建根據(jù)1.中描述的條件，設(shè)計(jì)與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比能選擇性抑制GDF-8的促濾泡素抑制素突變體多肽的結(jié)構(gòu)，如下構(gòu)建編碼該多肽的DNA。
首先，獲得編碼促濾泡素抑制素全長(zhǎng)的DNA，或者獲得部分片段的DNA，該片段編碼包含對(duì)構(gòu)成所設(shè)計(jì)的促濾泡素抑制素突變體多肽必要的促濾泡素抑制素區(qū)域。各哺乳類以及雞的促濾泡素抑制素cDNA或基因組DNA的堿基序列是公知的，所以可依據(jù)這些序列信息設(shè)計(jì)引物，以從各哺乳類或雞的精巢分離出的cDNA為模板進(jìn)行PCR，可獲得該哺乳類或雞的促濾泡素抑制素cDNA的任意部分片段。此外，也可通過(guò)篩選精巢cDNA文庫(kù)克隆促濾泡素抑制素cDNA，以該cDNA為模板。各哺乳類以及雞的促濾泡素抑制素cDNA或基因組DNA的堿基序列包括NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為NM_013409(人促濾泡素抑制素cDNA)、NM_008046(小鼠促濾泡素抑制素cDNA)、NM_012561(大鼠促濾泡素抑制素cDNA)、NM_175801(牛促濾泡素抑制素cDNA)、M63123(羊促濾泡素抑制素cDNA)、AB010829(牛促濾泡素抑制素cDNA)、M19529(豬促濾泡素抑制素cDNA)、NM_205200(雞促濾泡素抑制素cDNA)等中描述的堿基序列。合成包含與獲得的區(qū)域的5’端15～30堿基序列、及3’端15～30堿基序列互補(bǔ)的DNA，作為引物。優(yōu)選在PCR的兩個(gè)引物的5’端添加適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別的序列，用于部分片段的連接和載體的插入。參照Sambrook，J.and Russel，D.W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rded.，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)等書(shū)中描述的方法進(jìn)行cDNA的制備和PCR。必要時(shí)，可以所得DNA作模板進(jìn)行同樣的操作，獲得編碼對(duì)構(gòu)成所設(shè)計(jì)的促濾泡素抑制素突變體多肽必要的區(qū)域的DNA的部分片段。
根據(jù)所設(shè)計(jì)的促濾泡素抑制素突變體多肽的結(jié)構(gòu)，以符合讀框的方式連接所得部分片段，必要時(shí)，可連接編碼其它多肽的DNA，將編碼終止密碼子的區(qū)域添加到3’端，通過(guò)導(dǎo)入突變而構(gòu)建成編碼該促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA。
如(3)中所述，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，當(dāng)促濾泡素抑制素突變體多肽分泌到細(xì)胞外時(shí)，要將存在于分泌蛋白前體N端的信號(hào)肽添加到設(shè)計(jì)的促濾泡素抑制素突變體多肽的N端，構(gòu)建編碼這樣多肽的DNA。信號(hào)肽可應(yīng)用，例如促濾泡素抑制素的信號(hào)肽。編碼促濾泡素抑制素信號(hào)肽的DNA，可在獲得上述編碼包含促濾泡素抑制素突變體多肽所必需的FSI的促濾泡素抑制素片段DNA時(shí)，通過(guò)擴(kuò)增包含促濾泡素抑制素信號(hào)肽的片段而獲得。
不分泌時(shí)，對(duì)于所設(shè)計(jì)的促濾泡素抑制素突變體多肽的N末端非甲硫氨酸的情況下，在編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的區(qū)域前添加起始密碼子(atg)。
例如，分泌具有FSN-FSI-FSI這樣結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的促濾泡素抑制素突變體多肽時(shí)，首先通過(guò)PCR分別獲得編碼包含信號(hào)肽-FSN-FSI區(qū)域的促濾泡素抑制素cDNA的部分片段A，以及編碼包含F(xiàn)SI區(qū)域的促濾泡素抑制素cDNA的部分片段B。將所得cDNA片段B連接到所得cDNA片段A的下游，制備成編碼具有信號(hào)肽-FSN-FSI-FSI這樣結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA。
此外，分泌具有FSN-FSI-FSI-FSIII這樣結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的促濾泡素抑制素突變體多肽時(shí)，通過(guò)PCR獲得編碼包含F(xiàn)SIII區(qū)域的促濾泡素抑制素cDNA的部分片段C，將cDNA片段B連接到上述cDNA片段A的下游，再將cDNA片段C連接到其下游，由此制備成編碼具有信號(hào)肽-FSN-FSI-FSI-FSIII這樣結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA。
(2)促濾泡素抑制素突變體表達(dá)載體的制備與宿主細(xì)胞的導(dǎo)入將(1)中制備的編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到適于宿主細(xì)胞表達(dá)用的載體中，制備成促濾泡素抑制素突變體表達(dá)載體。
可應(yīng)用細(xì)菌等原核生物、酵母等真核生物、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞等任何一種作為宿主細(xì)胞，只要是能表達(dá)促濾泡素抑制素突變體多肽即可。但為了使導(dǎo)入了促濾泡素抑制素突變體表達(dá)載體的細(xì)胞(以下稱做轉(zhuǎn)化細(xì)胞)表達(dá)的促濾泡素抑制素突變體多肽保持正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)、保持GDF-8特異的抑制活性，優(yōu)選用動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞等進(jìn)行表達(dá)。
也可應(yīng)用在上述宿主細(xì)胞中能自主復(fù)制、或者可能整合到染色體中、含有在宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子的載體作為插入了編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的表達(dá)載體。此外，為了制備應(yīng)用大腸桿菌的載體，優(yōu)選含有具備大腸桿菌用的內(nèi)源性啟動(dòng)子的耐藥基因、在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制所必需的復(fù)制起點(diǎn)的載體。大腸桿菌用的耐藥基因包括大腸桿菌來(lái)源的氨芐青霉素抗性基因(β-內(nèi)酰胺酶基因)、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制所必需的復(fù)制起點(diǎn)包括pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、colE1的復(fù)制起點(diǎn)等。
使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，可應(yīng)用具有在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào)的質(zhì)粒作為插入了編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的表達(dá)載體。
作為啟動(dòng)子可應(yīng)用在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用的任何啟動(dòng)子，例如，人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE(immediate early)基因的啟動(dòng)子、SV40的早期啟動(dòng)子、莫洛尼小鼠白血病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)、Rous肉瘤病毒的LTR、單純皰疹病毒(HSV)的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)基因的啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、SRα啟動(dòng)子、金屬硫蛋白的啟動(dòng)子等。也可與上述啟動(dòng)子一起應(yīng)用人CMV IE基因的增強(qiáng)子等。優(yōu)選能將編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到其下游的、具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦肝稽c(diǎn)的啟動(dòng)子。
可應(yīng)用任何多腺苷酸化信號(hào)作為多腺苷酸化信號(hào)，例如應(yīng)用SV40早期基因的多腺苷酸化信號(hào)、羊β珠蛋白基因的多腺苷酸化信號(hào)、牛生長(zhǎng)激素基因的多腺苷酸化信號(hào)等。
此外還可含有動(dòng)物細(xì)胞用的耐藥基因的表達(dá)單元(在啟動(dòng)子下游順次連接耐藥基因和多腺苷酸化信號(hào)的結(jié)構(gòu))。動(dòng)物細(xì)胞用的耐藥基因包括新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、殺稻瘟素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、零霉素抗性基因等?？蓱?yīng)用上述的啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào)。應(yīng)用具有耐藥基因的表達(dá)單元的表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，可通過(guò)在藥物存在的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞而獲得瞬時(shí)穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
應(yīng)用包含二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的表達(dá)單元的表達(dá)質(zhì)粒，以缺失dhfr基因的動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，在氨甲喋呤存在下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，通過(guò)階段性提高氨甲喋呤的濃度，使與dhfr基因一起導(dǎo)入的編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的拷貝數(shù)擴(kuò)增，獲得促濾泡素抑制素突變體多肽的表達(dá)量高的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
此外，也可具有動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所必需的復(fù)制起點(diǎn)?？蓱?yīng)用SV40的復(fù)制起點(diǎn)和EB病毒的復(fù)制起點(diǎn)oriP作為復(fù)制起點(diǎn)。由于具有SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體在表達(dá)SV40大T抗原的宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)增加，所以適于高表達(dá)目的基因。包含oriP的載體在表達(dá)EB病毒EBNA-1(Epsin-Barr virus nuclear antigen-1)的宿主細(xì)胞中不整合到宿主的染色體上，維持在染色體以外。
如上作為動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體包括pcDNA3(Invitrogen制)、pcDNA3.1(+)(Invitrogen制)、pSI(QIAGEN)、pSI-neo(QIAGEN)、pAGE107、pAGE103、pAMo[J.Biol.Chem.，268，22782(1993)]等。
將(1)中制備的編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到上述動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用載體的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成促濾泡素抑制素突變體多肽表達(dá)載體。
可應(yīng)用猴腎臟細(xì)胞株COS-1(ATCC號(hào)CRL-1650)和COS-7(ATCC號(hào)CRL-1651)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株CHO-K1(ATCC號(hào)CCL-61)和CHO/dhFr-(ATCC號(hào)CRL-9096)、人B淋巴細(xì)胞細(xì)胞株Namalwa(ATCC號(hào)CRL-1432)、人腎臟細(xì)胞株HEK293(ATCC號(hào)CRL-1573)、人子宮頸上皮細(xì)胞株HeLa(ATCC號(hào)CCL-2)、小鼠胎兒細(xì)胞株NIH/3T3(ATCC號(hào)CRL-1658)等作為宿主細(xì)胞。
作為重組載體的導(dǎo)入方法可應(yīng)用將DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的任意方法，例如電穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸鈣法(特開(kāi)平2-227075)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]、Virology，52，456(1973)中記載的方法等。此外，也可使用商品化的DNA導(dǎo)入試劑。DNA導(dǎo)入試劑有TransFast(Promega)、Lipofectamine 2000(Invitrogen制)、SuperFect(QIAGEN)、PolyFect(QIAGEN)等。
應(yīng)用昆蟲(chóng)細(xì)胞作宿主時(shí)，可根據(jù)例如桿狀病毒表達(dá)載體，ALaboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rded.，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)、Bio/Technology，6，47(1988)等描述的方法，獲得表達(dá)促濾泡素抑制素突變體多肽的昆蟲(chóng)細(xì)胞。
也就是說(shuō)，將重組的基因?qū)胼d體與桿狀病毒一起導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞，在昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得重組病毒后，再用重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得表達(dá)多肽的昆蟲(chóng)細(xì)胞。
該方法中所應(yīng)用的基因?qū)胼d體有，例如pVL1392和pVL1393(均為Pharmingen制)、pBlueBac4.5(Invitrogen制)等。
可應(yīng)用例如感染夜蛾科(Noctuidea)昆蟲(chóng)的病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒等作為桿狀病毒。
作為昆蟲(chóng)細(xì)胞，包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)來(lái)源的Sf9和Sf21(Invitrogen制)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)來(lái)源的High5(Invitrogen制)、家蠶(Bombyx mori)來(lái)源的Bm5(Invitrogen制)及N4等細(xì)胞株。
制備重組病毒時(shí)作為轉(zhuǎn)移載體與上述桿狀病毒共導(dǎo)入的方法包括，例如磷酸鈣法(特開(kāi)平2-227075)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
使用細(xì)菌等原核生物作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體要應(yīng)用在宿主原核生物中能自主復(fù)制、在啟動(dòng)子及其下游有插入核糖體結(jié)合序列，和可插入編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的克隆位點(diǎn)。雖不必要，但優(yōu)選在該克隆位點(diǎn)之后隨即配置轉(zhuǎn)錄終止序列的方法。此外，為了篩選轉(zhuǎn)化體，要包含表達(dá)耐藥基因等標(biāo)志基因的序列。將編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到核糖體結(jié)合序列下游的克隆位點(diǎn)。優(yōu)選核糖體結(jié)合序列與起始密碼子之間調(diào)整成適當(dāng)?shù)木嚯x(例如，大腸桿菌為宿主的載體中6～18個(gè)堿基)。
作為啟動(dòng)子只要能在宿主細(xì)胞中表達(dá)即可。例如，大腸桿菌作宿主時(shí)，可應(yīng)用trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子等大腸桿菌和噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子等。此外，還可應(yīng)用trp啟動(dòng)子2個(gè)串聯(lián)的啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、T7lac啟動(dòng)子、letI啟動(dòng)子等人為設(shè)計(jì)改造過(guò)的啟動(dòng)子等。枯草桿菌作宿主時(shí)，可使用枯草桿菌的噬菌體SP01和SP02的啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等。
作為表達(dá)載體的例子有，例如pGEMEX-1(Promega)、pQE-30(QIAGEN)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pTrS30[從大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備]、pGEX5X-3(Amersham BioScience制)、pET14(Novagen制)、pPROTet.E(Clontech制)、pRSET A(Invitrogen制)等。
作為宿主細(xì)胞可應(yīng)用屬于大腸桿菌屬、沙雷菌屬、桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、微桿菌屬、假單胞菌屬等菌屬的微生物，例如大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌BL21(DE3)pLysS、無(wú)花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)、枯草桿菌(Bacillus substilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066、谷氨酸棒桿菌棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒桿菌棒狀桿菌ATCC14067、谷氨酸棒桿菌棒狀桿菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、假單胞菌某種(Pseudomonas sp.)D-0110等。
作為重組載體的導(dǎo)入方法可應(yīng)用上述將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任意方法，例如電穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]、應(yīng)用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(特開(kāi)昭63-248394；Mol.Gen.Genet.，168，111(1979))等。
使用酵母作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體可應(yīng)用含有可在酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列和能表達(dá)酵母中作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記的基因、例如耐藥基因和TRP1、HIS3、LEU2等氨基酸合成體系的基因的序列。此外，為使表達(dá)載體的制備和維持容易，優(yōu)選能在大腸桿菌內(nèi)自主復(fù)制并能表達(dá)成為基因?qū)霕?biāo)記的耐藥基因的載體。
作為啟動(dòng)子只要能在酵母中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄即可，例如釀酒酵母的醇脫氫酶基因ADH1、半乳糖代謝體系基因GAL1和Gal10等的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶基因PH05啟動(dòng)子、磷酸甘油酸激酶PGK啟動(dòng)子、甘油醛3磷酸脫氫酶GAP啟動(dòng)子、熱休克蛋白基因啟動(dòng)子、α結(jié)合因子基因MF α1啟動(dòng)子、銅金屬硫蛋白基因CUP1啟動(dòng)子、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的醇脫氫酶基因AOX1的啟動(dòng)子等。
作為宿主細(xì)胞可應(yīng)用屬于酵母屬、裂殖酵母屬、畢赤屬的酵母菌株，具體而言，包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等。
作為重組載體的導(dǎo)入方法可應(yīng)用將DNA導(dǎo)入酵母的任意方法，例如電穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1991)、原生質(zhì)球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4889(1984)]、醋酸鋰法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]等。
(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)及促濾泡素抑制素突變體多肽的純化(2)中制備的轉(zhuǎn)化細(xì)胞為大腸桿菌等原核生物或酵母等真核生物時(shí)，培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基含有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等，只要是能有效進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)，無(wú)論是天然培養(yǎng)基還是合成培養(yǎng)基均可應(yīng)用。作為碳源可應(yīng)用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖類的糖蜜，淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機(jī)酸，乙醇、丙醇等醇類。作為氮源可應(yīng)用銨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽、其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆糟及大豆糟水解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。作為無(wú)機(jī)鹽可應(yīng)用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
通常培養(yǎng)在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)的條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度為15～40℃，培養(yǎng)時(shí)間為16～96小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中pH保持3.0～9.0。用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、銨等調(diào)節(jié)pH。必要時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素和四環(huán)素等抗生素。當(dāng)培養(yǎng)用應(yīng)用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，必要時(shí)向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑。例如，當(dāng)培養(yǎng)用應(yīng)用lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)向培養(yǎng)基中添加IPTG等，當(dāng)培養(yǎng)用應(yīng)用trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)向培養(yǎng)基中添加吲哚丙烯酸等。
(2)中制備的轉(zhuǎn)化細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基可使用常規(guī)使用的RPMI1640培養(yǎng)基[J.Am.Med.Assoc.，199，519(1967)]、Eagle的MEM培養(yǎng)基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基[virology，8，396(1959)]、199培養(yǎng)基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73，1(1950)]、MEM培養(yǎng)基、EX-CELL 301培養(yǎng)基(JRH BioScience)，或者應(yīng)用向這些培養(yǎng)基中添加了胎牛血清的培養(yǎng)基。通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下等條件下進(jìn)行1～7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，必要時(shí)向培養(yǎng)基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
(2)中制備的轉(zhuǎn)化細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基可使用常規(guī)使用的TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen制)、Sf-900II SFM培養(yǎng)基(Invitrogen制)、EX-CELL 400、EX-CELL 405培養(yǎng)基(JRHBioScience)、Grace的昆蟲(chóng)培養(yǎng)基[Nature，195，788(1962)]等。培養(yǎng)條件是pH6～7、培養(yǎng)溫度25～30℃、培養(yǎng)時(shí)間通常1～5天。培養(yǎng)過(guò)程中，必要時(shí)向培養(yǎng)基中添加慶大霉素等抗生素。
促濾泡素抑制素突變體多肽既可分泌到細(xì)胞外也可不分泌而在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但優(yōu)選分泌到細(xì)胞外。分泌到細(xì)胞外時(shí)，(2)中制備編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA時(shí)，要用編碼在設(shè)計(jì)的促濾泡素抑制素突變體多肽N末端添加信號(hào)肽的DNA構(gòu)建表達(dá)載體，然后獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。分泌時(shí)，由于信號(hào)肽被剪切，所以培養(yǎng)基中蓄積的是除去了信號(hào)肽的促濾泡素抑制素突變體多肽。
通過(guò)如上的培養(yǎng)，表達(dá)的促濾泡素抑制素突變體多肽在培養(yǎng)了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基中或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中蓄積。如下，從該培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離、純化促濾泡素抑制素突變體多肽。
促濾泡素抑制素突變體多肽分泌到細(xì)胞外時(shí)，回收培養(yǎng)基。當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮存在時(shí)，通過(guò)離心和過(guò)濾分開(kāi)培養(yǎng)基和細(xì)胞，獲得培養(yǎng)基?？赏ㄟ^(guò)應(yīng)用硫酸化cellulofine柱的親和層析，從回收的培養(yǎng)基中進(jìn)行高效純化。此外，也可組合應(yīng)用其它蛋白質(zhì)純化中常規(guī)使用的純化方法，例如凝膠過(guò)濾、離子交換色譜、逆相色譜及超濾等進(jìn)行純化。此外，也可應(yīng)用特異性識(shí)別促濾泡素抑制素FSI的抗體，通過(guò)親和層析進(jìn)行純化。
當(dāng)促濾泡素抑制素突變體多肽與其它多肽以融合蛋白存在時(shí)，可通過(guò)利用特異性結(jié)合所融合的其它多肽的物質(zhì)進(jìn)行親和層析進(jìn)行純化。例如，與IgG的恒定區(qū)域融合的蛋白質(zhì)時(shí)，利用固化了Protein A和抗IgG抗體的柱進(jìn)行親和層析；當(dāng)與Protein A融合時(shí)，應(yīng)用固化了IgG的柱進(jìn)行親和層析；當(dāng)與FLAG肽、S肽、HA表位肽、myc表位肽融合時(shí)，應(yīng)用固化了針對(duì)這些肽的抗體的柱進(jìn)行親和層析；當(dāng)與多聚組氨酸融合時(shí)，應(yīng)用固化了鎳離子的柱進(jìn)行親和層析；當(dāng)與谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合時(shí)，應(yīng)用固化了谷胱苷肽的柱進(jìn)行親和層析，進(jìn)行純化。
當(dāng)促濾泡素抑制素突變體多肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，回收轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在含蛋白酶抑制劑的適當(dāng)?shù)木彌_液中，通過(guò)勻漿和超聲等手段使回收的細(xì)胞破碎，通過(guò)離心回收上清，獲得細(xì)胞溶解液。用與從培養(yǎng)基進(jìn)行分離、純化同樣的手段進(jìn)行促濾泡素抑制素突變體多肽的分離、純化。
此外，也可按照公知的方法[J.Biomolecular NMR，6，129；Science，242，1162(1988)；J.Biochem.，110，166(1991)]，應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄、翻譯體系進(jìn)行促濾泡素抑制素突變體多肽的生產(chǎn)。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[SDS-PAGE，Nature，227，680(1970)]和Western Blotting法(Antibodies，Molecular CloningALaboratory Manual，3rded.，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter12(1988)；Monoclonal Antibodies，Principales and Practice，AcademicPress Limited(1996))等測(cè)定純化的促濾泡素抑制素突變體的分子量。
3.本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體GDF-8選擇性抑制的驗(yàn)證本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體“選擇性抑制GDF-8的活性”是指“與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8的活性”。“與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8的活性”是指用權(quán)利要求3中描述的方法，相同濃度的促濾泡素抑制素突變體多肽，測(cè)定其對(duì)激活蛋白活性的抑制與GDF-8活性的抑制時(shí)，其對(duì)GDF-8活性的抑制達(dá)50％以上，優(yōu)選60％以上，更優(yōu)選70％以上，更優(yōu)選80％以上，與此相對(duì)，其對(duì)激活蛋白活性的抑制不到50％，優(yōu)選在30％以下，更優(yōu)選10％以下，更優(yōu)選不抑制，與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，更強(qiáng)烈抑制GDF-8的活性。
本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽是與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8活性的促濾泡素抑制素突變體多肽，優(yōu)選不抑制激活蛋白的活性，只選擇性抑制GDF-8活性。如下確認(rèn)本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的活性(與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8活性的活性)，例如通過(guò)報(bào)告基因檢驗(yàn)測(cè)定激活蛋白和GDF-8具有的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。
制備導(dǎo)入了報(bào)告基因質(zhì)粒(CAGA)12-MLP-Luc[EMBO J.，17，3091(1998)]的動(dòng)物細(xì)胞。(CAGA)12-MLP-Luc的結(jié)構(gòu)包含其上游插入了12個(gè)叫做CAGA box的激活蛋白和GDF-8應(yīng)答序列(AGCCAGACA)的腺病毒的主要后期啟動(dòng)子、該啟動(dòng)子下游連接了作為報(bào)告基因熒光素酶基因。報(bào)告基因的導(dǎo)入按2中描述的方法進(jìn)行。對(duì)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞測(cè)定其分別添加(a)GDF-8，(b)激活蛋白，(c)促濾泡素抑制素突變體多肽，(d)GDF-8及促濾泡素抑制素突變體多肽，(e)激活蛋白及促濾泡素抑制素突變體多肽，(f)不添加任何物質(zhì)時(shí)的熒光素酶活性。與(f)不添加任何物質(zhì)時(shí)相比，分別添加(a)GDF-8及(b)激活蛋白時(shí)，轉(zhuǎn)錄活性活化，熒光素酶活性增加。此外，添加(c)促濾泡素抑制素突變體多肽時(shí)熒光素酶活性未增加。本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽選擇性抑制GDF-8活性可通過(guò)如下進(jìn)行驗(yàn)證(I)與添加(a)GDF-8時(shí)相比，添加(d)GDF-8及促濾泡素抑制素突變體多肽時(shí)熒光素酶活性降低，只添加(c)促濾泡素抑制素突變體多肽時(shí)或者(e)不添加任何物質(zhì)時(shí)熒光素酶活性相近，與此相反，(II)與添加(a)激活蛋白時(shí)相比，添加(d)激活蛋白及促濾泡素抑制素突變體多肽時(shí)未見(jiàn)到熒光素酶活性降低，熒光素酶活性的降低比添加GDF-8時(shí)的活性降低明顯的弱。
4.含本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的醫(yī)藥組成物由于本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽、施用該多肽的生物體內(nèi)表達(dá)的編碼該多肽的多聚核苷酸及包含該多聚核苷酸的載體，與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8的活性，所以可用于治療和預(yù)防其發(fā)病或進(jìn)展與GDF-8相關(guān)的癥狀和疾病，且預(yù)期可減少因激活蛋白受抑制而產(chǎn)生的副作用。這樣的癥狀和疾病包括，例如伴隨疾病、老化、臥床等的骨骼肌減少和萎縮、皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪等脂肪的增加、惡液質(zhì)、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖和獲得性免疫缺陷綜合癥等。伴隨肌肉萎縮的疾病包括Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)障礙等遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓小腦變性癥或帕金森病等因神經(jīng)病變而呈現(xiàn)出的繼發(fā)肌肉萎縮等疾病。
本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽、施用該多肽的生物體內(nèi)表達(dá)的編碼該多肽的多聚核苷酸及包含該多聚核苷酸的載體，可作為GDF-8的選擇性抑制劑、骨骼肌增加劑、脂肪降低劑、肌肉萎縮癥的治療劑或預(yù)防劑，以及惡液質(zhì)、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖和獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預(yù)防劑單獨(dú)使用，也可以常規(guī)的各種藥劑形式提供。此外，這些藥劑可用于動(dòng)物或人。
本發(fā)明的藥劑可單獨(dú)含有上述活性成分或其藥理學(xué)上可接受的鹽，或者與任何其它用于治療的有效成分以混合物形式存在。此外，可將活性成分與藥理學(xué)上可接受的一種或一種以上的載體一起混和，通過(guò)制藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中熟知的任意方法制備這些藥劑。
作為使用途徑，期望預(yù)防或治療時(shí)使用最有效的途徑，包括經(jīng)口或靜脈內(nèi)等非經(jīng)口途徑，但優(yōu)選非經(jīng)口途徑。
使用形式包括例如片劑、注射劑等。
適于經(jīng)口施用的片劑等，可應(yīng)用乳糖、甘露醇等賦形劑，淀粉等蓬松劑，硬脂酸鎂等潤(rùn)滑劑，羥丙基纖維素等結(jié)合劑，脂肪酸酯等表面活性劑，甘油等可塑劑等添加劑進(jìn)行制備。
適于非經(jīng)口施用的制劑優(yōu)選包含與接受者血液等滲的活性化合物的無(wú)菌水性劑。例如，注射劑時(shí)，應(yīng)用由鹽溶液、葡萄糖溶液或者鹽水與葡萄糖溶液的混合物構(gòu)成的載體等制備注射用的溶液。此外，這些非經(jīng)口藥劑中也可添加1種或1種以上選自經(jīng)口劑中示例的賦形劑、蓬松劑、潤(rùn)滑劑、結(jié)合劑、表面活性劑、可塑劑及稀釋劑、防腐劑、香料類等的輔助成分。
再者，通過(guò)適當(dāng)選擇添加脂質(zhì)、透明質(zhì)酸、溫度敏感性多聚體、水難溶性高分子、或表面活性劑等，達(dá)到肽吸收的持續(xù)化。
上述活性成分或其藥理學(xué)上可接受的鹽，用于上述目的時(shí)，通常全身或局部，以經(jīng)口或非經(jīng)口形式施用。施用量及施用次數(shù)根據(jù)施用的形式、患者的年齡、體重、治療中癥狀的性質(zhì)或嚴(yán)重程度等而不同，通常，經(jīng)口施用時(shí)，成人每人每次0.01～1000mg，優(yōu)選0.05～500mg，1日施用1次～數(shù)次。靜脈內(nèi)施用等非經(jīng)口施用時(shí)，通常成人每人0.001～1000mg，優(yōu)選0.01～300mg，1日施用1次～數(shù)次，或者1日1～24小時(shí)范圍內(nèi)靜脈內(nèi)持續(xù)施用。但是這些施用量及施用次數(shù)根據(jù)前述的各種條件而變動(dòng)。
此外，作為GDF-8的選擇性抑制劑、骨骼肌增加劑、脂肪降低劑、肌肉萎縮癥的治療劑或預(yù)防劑，惡液質(zhì)、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖和獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預(yù)防劑的有效成分，利用DNA和RNA等核酸進(jìn)行基因治療時(shí)，可單獨(dú)使用該DNA或RNA，或者將其插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等適當(dāng)載體后，按上面描述的常規(guī)方法制劑化，處方和施用；或者通過(guò)非病毒基因移入法施用。
按以下方法制備重組病毒載體。
制備作為有效成分使用的DNA(以下稱作目的DNA)片段。將該DNA片段插入到病毒載體內(nèi)的啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建成重組病毒載體。
制備RNA病毒載體時(shí)，制備與目的DNA同源的RNA片段，將其插入到病毒載體內(nèi)的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成重組病毒。RNA片段除雙鏈外，可根據(jù)病毒載體的種類選擇有義鏈或反義鏈中的任一鏈。例如，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)，選擇與有義鏈同源的RNA；應(yīng)用有義病毒載體時(shí)選擇反義鏈同源的RNA。
將該重組病毒載體導(dǎo)入到與之相適應(yīng)的包裝細(xì)胞內(nèi)。重組病毒載體至少缺失一個(gè)編碼病毒包裝所必要的蛋白質(zhì)的基因。作為包裝細(xì)胞，只要能補(bǔ)充重組病毒載體所缺失的蛋白質(zhì)，可使用任何一種細(xì)胞。例如，可使用人腎臟來(lái)源的HEK293細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3等。包裝細(xì)胞所補(bǔ)充的蛋白質(zhì)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)，可以是小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的gag、pol、env等；慢病毒時(shí)，可以是HIV來(lái)源的gag、pol、env、vpr、vpu、vif、tat、rev、nef等；腺病毒時(shí)，可以是腺病毒來(lái)源的E1A、E1B等；腺相關(guān)病毒時(shí)，Rep(p5、p19、p40)、Vp(Cap)等蛋白質(zhì)。
作為病毒載體，可應(yīng)用在上述包裝細(xì)胞中能生產(chǎn)重組病毒、并包含一種啟動(dòng)子使目的DNA可在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的病毒載體。作為質(zhì)粒載體可應(yīng)用MFG[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，6733(1995)]、pBabePuro[Nucleic Acids Res.，18，3587(1990)]、LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG[J.Virol.，72，8150(1998)]、pAedxI[Nucleic Acids Res.，23，3816(1995)]等。至于啟動(dòng)子，可使用任何一種，只要其能在人組織中發(fā)揮功能即可。例如人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE(immediate early)基因的啟動(dòng)子、SV40的早期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白的啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、SRα啟動(dòng)子等。此外，人CMV IE基因的增強(qiáng)子可與啟動(dòng)子一起使用。
將重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞的方法有，例如磷酸鈣法(特開(kāi)平2-227075)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
上述重組病毒載體的施用方法，上述方法聯(lián)合應(yīng)用脂質(zhì)體遞送的直接體內(nèi)(in vivo)基因?qū)氲姆椒?，可將病毒載體指向患者的癌組織。也就是說(shuō)，將適當(dāng)大小的目的DNA與腺病毒殼蛋白特異的多聚賴氨酸偶聯(lián)抗體一起制備復(fù)合體，通過(guò)將所得復(fù)合體與腺病毒載體結(jié)合，制備出病毒載體。該病毒載體能穩(wěn)定到達(dá)靶細(xì)胞，通過(guò)胞內(nèi)體攝取到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)分解，有效表達(dá)目的基因。
本發(fā)明中表達(dá)目的DNA的載體通過(guò)非病毒基因移入方法也能輸送到病灶。
該領(lǐng)域內(nèi)公知的非病毒基因移入方法包括磷酸鈣共沉淀法[Virology，52，456(1973)；Science，209，1414(1980)]、顯微注射法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5399(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，7380(1980)；Cell，27，223(1981)；Nature，294，92(1981)]、借助脂質(zhì)體的膜融合介導(dǎo)的移入法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)；Biochemistry，28，9508(1989)；J.Biol.Chem.，264，12126(1989)；Hum.Gene Ther.，3，267(1992)Science，249，1285(1990)；Circulation，83，2007(1992)]、或者直接攝取DNA及受體介導(dǎo)的DNA移入法[Science，247，1465(1990)；J.Biol.Chem.，266，14338(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，36559(1991)J.Biol.Chem.，264，16985(1989)；BioTechniques，11，474(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3410(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，4255(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，4033(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，8850(1991)；Hum.Gene Ther.，3，147(1991)]等。
借助脂質(zhì)體的膜融合介導(dǎo)的移入法通過(guò)將脂質(zhì)體制備物直接施用給目的組織，可在該組織的局部進(jìn)行基因的攝取及表達(dá)。將DNA直接靶向患者癌組織時(shí)，優(yōu)選直接DNA攝取技術(shù)。受體介導(dǎo)的DNA移入法，例如借助多聚賴氨酸，通過(guò)將DNA(通常，共有的閉環(huán)超螺旋質(zhì)粒的形式)偶聯(lián)到蛋白質(zhì)配體上進(jìn)行?；诎屑?xì)胞或組織細(xì)胞表面上存在的對(duì)應(yīng)的配體受體選擇配體。該配體-DNA軛合物可預(yù)期直接注射到血管內(nèi)，通過(guò)受體結(jié)合及DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的內(nèi)化而靶向靶細(xì)胞。為了防止DNA的細(xì)胞內(nèi)破壞，可同時(shí)感染腺病毒，破壞胞內(nèi)體的功能。
5.導(dǎo)入了包含編碼本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的多聚核苷酸的外源基因的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物通過(guò)將包含編碼本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的多聚核苷酸的外源基因?qū)敕侨瞬溉閯?dòng)物，可制備出轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。上述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物中，過(guò)量表達(dá)本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽，明顯的特征是骨骼肌重量增加。該轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物可用作骨骼肌形成結(jié)構(gòu)的研究、伴隨骨骼肌異常的疾病的研究時(shí)使用的模型動(dòng)物。
本說(shuō)明書(shū)中所言“非人哺乳動(dòng)物”的具體例包括小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔、狗、貓、羊、豬、山羊、牛或猴等，優(yōu)選小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、綿羊等嚙齒類動(dòng)物，最優(yōu)選小鼠。
以下對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。
(1)導(dǎo)入基因的制備將編碼本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA導(dǎo)入到目標(biāo)動(dòng)物時(shí)，一般應(yīng)用將該DNA連接到在導(dǎo)入的目標(biāo)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)該DNA的啟動(dòng)子下游的基因構(gòu)建物。按照常規(guī)方法，例如如下制備要導(dǎo)入的基因。
以導(dǎo)入的基因全長(zhǎng)互補(bǔ)的DNA為基礎(chǔ)，必要時(shí)，制備包含編碼該多肽部分的適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段，然后將該DNA片段或全長(zhǎng)互補(bǔ)DNA插入到適當(dāng)表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建重組載體。
作為導(dǎo)入到動(dòng)物的基因的表達(dá)載體，可應(yīng)用大腸桿菌來(lái)源的質(zhì)粒、枯草桿菌來(lái)源的質(zhì)粒、酵母來(lái)源的質(zhì)粒、λ噬菌體等噬菌體、莫洛尼白血病小鼠等的逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒或桿狀病毒等動(dòng)物病毒等。這些載體中優(yōu)選枯草桿菌來(lái)源的質(zhì)?；蚪湍竵?lái)源的質(zhì)粒，特別優(yōu)選大腸桿菌來(lái)源的質(zhì)粒。
本發(fā)明中應(yīng)用的啟動(dòng)子的具體例如本說(shuō)明書(shū)中上面描述的。本發(fā)明中應(yīng)用的表達(dá)載體優(yōu)選含有終止轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中目標(biāo)信使RNA轉(zhuǎn)錄的序列(通常叫做終止子)。例如，應(yīng)用病毒來(lái)源、各種哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類來(lái)源的各基因中包含的具有相同功能的序列，調(diào)控基因表達(dá)。優(yōu)選應(yīng)用猿病毒的SV40終止子等。此外，想更高表達(dá)目的基因時(shí)，可根據(jù)需要，將各基因的剪切信號(hào)、增強(qiáng)子區(qū)域、真核生物基因的內(nèi)含子部分連接到啟動(dòng)子區(qū)域的5’上游、啟動(dòng)子區(qū)域和翻譯區(qū)域之間或翻譯區(qū)的3’下游。
(2)轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物可通過(guò)將編碼本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA導(dǎo)入到目標(biāo)動(dòng)物而進(jìn)行制備。具體而言，通過(guò)將該基因?qū)氲匠蔀槟繕?biāo)的非人哺乳動(dòng)物的受精卵、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞、精子、未受精卵，可獲得編碼本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽的目的DNA整合到包括生發(fā)細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞的染色體上的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。該基因向受精卵、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞、精子、未受精卵的導(dǎo)入，優(yōu)選能確保存在于包括目標(biāo)非人哺乳動(dòng)物的生發(fā)細(xì)胞和體細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞的染色體上?；?qū)牒笊a(chǎn)的動(dòng)物的生發(fā)細(xì)胞中存在該導(dǎo)入的基因是指，生產(chǎn)的動(dòng)物的后代其生發(fā)細(xì)胞及體細(xì)胞均含有該導(dǎo)入基因。
個(gè)體的選擇可通過(guò)在蛋白質(zhì)或mRNA水平的確認(rèn)導(dǎo)入基因產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行。所述動(dòng)物的子孫繼承篩選出的個(gè)體的基因，具有該導(dǎo)入基因產(chǎn)物。獲得同源染色體雙方保持該導(dǎo)入基因的純合子，通過(guò)雌雄動(dòng)物交配，所有的后代均穩(wěn)定保持該基因。另外確認(rèn)具有該基因，可在常規(guī)的飼養(yǎng)環(huán)境下繁殖傳代。
通過(guò)將基因?qū)氲绞芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備，可應(yīng)用Manipulating Mouse Embryo 2nd；Gene Targeting，A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press(1993)；BioManualSeries 8；Gene Targeting；應(yīng)用ES細(xì)胞的突變小鼠的制作，羊土社(1995)；発生工學(xué)実験マニユアル，轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法，講談社(1987)等中描述的方法。通過(guò)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞的基因?qū)牒秃艘浦仓苽滢D(zhuǎn)基因動(dòng)物，可應(yīng)用Cibelli等(Science，280，1256，1998)、Schnieke等(Science，278，2130，1997)、Baguisi等(Nature Biotechnology，17，456，1999)等中報(bào)導(dǎo)的方法。通過(guò)將基因?qū)刖又苽滢D(zhuǎn)基因動(dòng)物，可應(yīng)用Perry等(Science，284，1180，1999)、Wakayama等(NatureBiotechnology，16，639，1998)中報(bào)導(dǎo)的方法。通過(guò)將基因?qū)胛词芫押腕w外受精制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可應(yīng)用Chan等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，14028，1998)中報(bào)導(dǎo)的方法。
6.家畜改良方面的應(yīng)用本發(fā)明的促濾泡素抑制素突變體多肽、用于施用該多肽的生物體內(nèi)表達(dá)的編碼該多肽的多聚核苷酸及包含該多聚核苷酸的載體，可通過(guò)施用給牛、豬、羊、雞等非人動(dòng)物，增加非人動(dòng)物的骨骼肌，降低脂肪。此外，與5中描述的方法同樣，通過(guò)制備導(dǎo)入了編碼本發(fā)明促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，可增加非人動(dòng)物的骨骼肌，降低脂肪。尤其是非人動(dòng)物為家畜時(shí)，可如上制作肉量多、脂肪少的家畜，所以可增加肉的產(chǎn)量，或生產(chǎn)出脂肪少的優(yōu)質(zhì)肉。此外，由于骨骼肌的增加，可改善家畜的勞動(dòng)力。
以下為本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的范疇并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1促濾泡素抑制素突變體多肽表達(dá)載體的制備用豬促濾泡素抑制素前體cDNA作探針，通過(guò)雜交從人精巢cDNA文庫(kù)[Clontech]克隆出人促濾泡素抑制素前體cDNA，將該促濾泡素抑制素前體cDNA[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，4218，(1988)]插入到質(zhì)粒pUC19(寶酒造)中的EcoRI位點(diǎn)和XbaI位點(diǎn)之間，構(gòu)建成促濾泡素抑制素突變體用的模板pUC19/FS。
向含0.2mmol/l dNTPs、1mmol/l氯化鎂的反應(yīng)液中添加100ng促濾泡素抑制素突變體用的模板，用具有序列號(hào)11和序列號(hào)12中所示堿基序列的合成DNA[Genset]作引物，向反應(yīng)液中添加各10pmol的引物，再添加2.5單位的Taq聚合酶(TaKaRa Ex Taq，寶酒造)，共25μl，進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件是94℃30秒、74℃15秒、72℃30秒3個(gè)循環(huán)，94℃30秒、70℃15秒、72℃30秒3個(gè)循環(huán)，94℃30秒、66℃15秒、72℃30秒3個(gè)循環(huán)，94℃30秒、62℃15秒、72℃30秒3個(gè)循環(huán)，94℃30秒、58℃15秒、72℃30秒3個(gè)循環(huán)，94℃30秒、54℃15秒、72℃30秒12個(gè)循環(huán)，其后，進(jìn)行72℃10分鐘的1個(gè)循環(huán)。將該反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收大約0.25kb的基因擴(kuò)增片段A(圖2)。基因擴(kuò)增片段A編碼的氨基酸序列中包含序列號(hào)4的95～168位序列，包含人促濾泡素抑制素的FSI。
用具有序列號(hào)13和序列號(hào)14中堿基序列的合成DNA[Genset]作引物，向反應(yīng)液中分別添加10pmol，用與上述基因擴(kuò)增片段A同樣的條件進(jìn)行PCR，將反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收大約0.6kb的基因擴(kuò)增片段B(圖3)?；驍U(kuò)增片段B編碼的氨基酸序列中包含序列號(hào)4的1～166位序列，包含人促濾泡素抑制素的FSN和FSI。
應(yīng)用pGEM-T Easy TA克隆試劑盒(Promega)，按照所附說(shuō)明書(shū)，分別將所得基因擴(kuò)增片段A和B連接到pGEM-T Easy載體中，獲得圖2和圖3中所示的質(zhì)粒pGEM-T Easy(A)和pGEM-T Easy(B)。
接下來(lái)，連接用限制性酶EcoRI(寶酒造)和HindIII(寶酒造)酶切質(zhì)粒pGEM-T Easy(B)獲得的含擴(kuò)增片段(B)的大約0.59kb的EcoRI-HindIII片段(B)，和用EcoRI和HindIII酶切質(zhì)粒pBluescript SK(-)(Stratagene)，獲得的大約2.95kb的EcoRI-HindIII片段。制備成圖4所示的質(zhì)粒pBluescript SK(-)(B)。
接下來(lái)，將用限制性酶SalI(寶酒造)和HindIII(寶酒造)酶切質(zhì)粒pGEM-T Easy(A)獲得的含擴(kuò)增片段(A)的大約0.27kb的HindIII-SalI片段(A)，和用SalI和HindIII酶切質(zhì)粒pBluescript SK(-)(B)，獲得的大約3.54kb的HindIII-SalI片段相連接。制備成圖5所示的質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B)。
然后，連接用限制性酶EcoRI和Spel(寶酒造)酶切質(zhì)粒pBluescriptSK(-)(A+B)獲得的含擴(kuò)增片段A和B的大約0.84kb的EcoRI-Spel片段(A+B)，及用EcoRI和Xbal(寶酒造)酶切動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen)，獲得的大約5.4kb的EcoRI-Xbal片段。獲得圖6所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(A+B)。pcDNA3(A+B)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區(qū)域的堿基序列示于序列號(hào)15中，該多肽的氨基酸序列示于序列號(hào)16中。序列號(hào)16中的1～29位的氨基酸序列為信號(hào)肽，多肽分泌時(shí)被剪切。因此，導(dǎo)入了pcDNA3(A+B)的動(dòng)物細(xì)胞分泌包含序列號(hào)6的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1-1)。FS1-1是包含人促濾泡素抑制素的FSN和2個(gè)FSI，但FSII和FSIII缺失的促濾泡素抑制素突變體多肽。
此外，連接用限制性酶EcoRI和XhoI(寶酒造)酶切質(zhì)粒pBluescript SK(-)(B)獲得的含擴(kuò)增片段B的大約0.6kb的EcoRI-XhoI片段，及用EcoRI和XhoI酶切動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用質(zhì)粒pcDNA3獲得的大約5.4kb的EcoRI-XhoI片段。獲得圖7所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(B)。pcDNA3(B)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區(qū)域的堿基序列示于序列號(hào)17中，該多肽的氨基酸序列示于序列號(hào)18中。序列號(hào)18中的1～29位的氨基酸序列為信號(hào)肽，多肽分泌時(shí)被剪切。因此，導(dǎo)入了pcDNA3(B)的動(dòng)物細(xì)胞分泌包含序列號(hào)8的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1)。FS1是包含人促濾泡素抑制素的FSN和1個(gè)FSI，但FSII和FSIII缺失的促濾泡素抑制素突變體多肽。
將用EcoRI酶切促濾泡素抑制素突變體用模板所得含促濾泡素抑制素前體cDNA的大約1.1kb的EcoRI片段插入到質(zhì)粒pBluescriptSK(-)的EcoRI位點(diǎn)，獲得如圖8所示的pBluescript SK(-)/FS。連接用EcoRV和XhoI酶切所得質(zhì)粒pBluescript SK(-)/FS獲得的大約0.4kb的EcoRV-XhoI片段C，和用EcoRV和XhoI酶切質(zhì)粒pBluescriptSK(-)(A+B)所得大約3.8kb的EcoRV-XhoI片段，構(gòu)建成如圖9所示的質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B+C)。
接下來(lái)連接用限制性酶EcoRI和XhoI酶切質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B+C)獲得的大約1.2kb的EcoRI-XhoI片段，及用EcoRI和XhoI酶切動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用質(zhì)粒pcDNA3獲得的大約5.4kb的EcoRI-XhoI片段。獲得圖10所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(A+B+C)。pcDNA3(A+B+C)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區(qū)域的堿基序列示于序列號(hào)19中，該多肽的氨基酸序列示于序列號(hào)20中。序列號(hào)20中的1～29位的氨基酸序列為信號(hào)肽，多肽分泌時(shí)被剪切。因此，導(dǎo)入了pcDNA3(A+B+C)的動(dòng)物細(xì)胞分泌包含序列號(hào)10的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1-1-3)。FS1-1-3是包含人促濾泡素抑制素的FSN和2個(gè)FSI和幾乎全部FS3，但FSII缺失的促濾泡素抑制素突變體多肽。
另外，以小鼠FLRG cDNA[J.Biol.Chem.，275，40788(2000)]為模板，用具有序列號(hào)21和序列號(hào)22中所示堿基序列的合成DNA[Genset]作引物，分別用10pmol，在與上述基因擴(kuò)增片段A同樣的條件下進(jìn)行PCR，將反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收大約0.3kb的基因擴(kuò)增片段D(圖11)。該基因擴(kuò)增片段編碼的氨基酸序列中包含小鼠FLRG的(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)BAB32663)的165～256位的氨基酸序列，包含小鼠FLRG的FSII樣結(jié)構(gòu)域(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)BAB32663的169～241區(qū)域)。如圖14所示，小鼠FLRG的FSII樣結(jié)構(gòu)域與小鼠促濾泡素抑制素的FSII的氨基酸序列有56％(41/73)的同源性，與序列號(hào)2的氨基酸序列有61.6％(45/73)的同源性。
用EcoRI酶切所得基因擴(kuò)增片段D，插入到pBluescript SK(-)的EcoRI位點(diǎn)，獲得圖11所示的pBluescript SK(-)(D)。連接用EcoRV和XhoI酶切所得質(zhì)粒pBluescript SK(-)(D)獲得的大約0.3kb的EcoRV-XhoI片段，和用EcoRV和XhoI酶切質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B)所得大約3.8kb的EcoRV-XhoI片段，構(gòu)建成如圖12所示的質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B+D)。
接下來(lái)連接用限制性酶EcoRI和XhoI酶切質(zhì)粒pBluescript SK(-)(A+B+D)獲得的大約1.1kb的EcoRI-XhoI片段，及用EcoRI和XhoI酶切動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)用質(zhì)粒pcDNA3獲得的大約5.4kb的EcoRI-XhoI片段。獲得圖13所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(A+B+D)。pcDNA3(A+B+D)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區(qū)域的堿基序列示于序列號(hào)23中，該多肽的氨基酸序列示于序列號(hào)24中。序列號(hào)24中的1～29位的氨基酸序列為信號(hào)肽，多肽分泌時(shí)被剪切。因此，導(dǎo)入了pcDNA3(A+B+D)的動(dòng)物細(xì)胞分泌包含序列號(hào)25的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1-1-2’)。FS1-1-2’是包含人促濾泡素抑制素的FSN和2個(gè)FSI，以小鼠FLRG的FSII樣結(jié)構(gòu)域取代FSII的促濾泡素抑制素突變體多肽。
實(shí)施例2應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)、純化促濾泡素抑制素突變體多肽(1)COS-7細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體的導(dǎo)入和培養(yǎng)應(yīng)用實(shí)施例1中所得促濾泡素抑制素突變體多肽表達(dá)載體pcDNA3(A+B)、pcDNA3(B)、pcDNA3(A+B+C)、pcDNA3(A+B+D)，如下進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)促濾泡素抑制素突變體多肽的表達(dá)。
通過(guò)電穿孔法(Cytotechnology，3，133(1990))將質(zhì)粒pcDNA3(A+B)導(dǎo)入COS-7(ATCC CRL-1651)細(xì)胞中，每1×106細(xì)胞應(yīng)用20μg的質(zhì)粒。然后懸浮到10ml添加了10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基[DMEM，Sigma-Aldrich]中，接種到直徑10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning)中。在5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、培養(yǎng)24小時(shí)后，換10ml的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天。在6個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行上述培養(yǎng)，回收約60ml的培養(yǎng)上清。同樣將pcDNA3(B)、pcDNA3(A+B+C)及pcDNA3(A+B+D)導(dǎo)入COS-7細(xì)胞內(nèi)，分別回收約60ml的培養(yǎng)上清。
(2)促濾泡素抑制素突變體多肽的純化和檢測(cè)將(1)中所得分別表達(dá)4種促濾泡素抑制素突變體多肽的COS-7細(xì)胞的約60ml的培養(yǎng)上清，過(guò)用20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，0.3mol/L NaCl，0.03％3-[(3-膽酰胺丙基)二乙氨]-1-丙磺酸(CHAPS)平衡過(guò)的2ml硫酸化cellulofine柱(生化學(xué)工業(yè)社)。其后，用共20ml的20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，0.3mol/L NaCl，0.03％CHAPS洗柱，接著用6ml的20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，0.5mol/L NaCl，0.03％CHAPS洗柱洗滌。其后，用共10ml的20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，1.0mol/LNaCl，0.03％CHAPS從柱上洗脫吸附的蛋白質(zhì)。應(yīng)用Ultrafree-15超濾器(裝著B(niǎo)ioMax-10膜的單元，Millipore)按照說(shuō)明書(shū)濃縮該洗脫液，獲得200μl的促濾泡素抑制素突變體多肽溶液。
化學(xué)合成人促濾泡素抑制素FSI的部分序列-包含序列號(hào)26的氨基酸序列的肽，以該肽作為抗原，按照常規(guī)方法[AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)]免疫兔，從抗體效價(jià)升高的兔子采集血清，作為兔抗促濾泡素抑制素多克隆抗體。該抗體的類型為IgG。
按照公知的方法[Nature，227，680(1970)]對(duì)所得各促濾泡素抑制素突變體多肽進(jìn)行SDS-PAGE。將電泳的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜(ImmobilonP，Millipore)，用5％脫脂牛奶(Nacalai Tesque)封閉膜，然后與兔抗促濾泡素抑制素多克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)。用辣根酶標(biāo)記的大鼠抗兔IgG抗體(Chemicon)和化學(xué)發(fā)光試劑(ECL檢測(cè)試劑，AmershamBioScience)進(jìn)行檢測(cè)。各促濾泡素抑制素突變體多肽均用兔抗促濾泡素抑制素多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。
圖15中顯示FS1-1的Western Blotting結(jié)果。FS1-1包含254個(gè)氨基酸構(gòu)成，推測(cè)的分子量約27kD。另一方面，用Western Blotting所得分子量為31kD、33kD、37kD。由于FS1-1有糖基化位點(diǎn)，所以認(rèn)為因附加了糖鏈而使分子量加大。
實(shí)施例3應(yīng)用報(bào)告基因檢驗(yàn)方法測(cè)定促濾泡素抑制素突變體多肽的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性將HEK293細(xì)胞(ATCCCRL-1573)接種到24孔培養(yǎng)板中，5×104細(xì)胞/孔。在1mL添加了10％FCS、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的高葡萄糖型DMEM培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)(以下稱作含血清DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)24小時(shí)。用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌，轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒(CAGA)12-MLP-Luc[EMBO J.，17，3091(1998)])(3μg/孔)和內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒CMV-β-gal(1g/孔)。轉(zhuǎn)染在添加了質(zhì)粒和陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Transfast，Promega)的混和液的無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基(200μl)中進(jìn)行，細(xì)胞在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。再添加含血清DMEM培養(yǎng)基(1ml)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
用PBS洗滌細(xì)胞后，分別添加含(a)激活蛋白(10ng/ml)、(b)GDF-8(15ng/ml)、(c)激活蛋白(10ng/ml)和促濾泡素抑制素(100ng/ml)、(d)GDF-8(15ng/ml)及促濾泡素抑制素(100ng/ml)、(e)激活蛋白(10ng/ml)及促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1溶液5μl、或(f)GDF-8(15ng/ml)及促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1溶液5μl的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基200μl/孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。用PBS洗滌后，添加細(xì)胞裂解緩沖液[1％9v/v]Triton X-100、15mmol/l MgSO4、4mmol/l乙二醇-二(2-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-4醋酸、1mmol/l DL-二硫蘇糖醇、25mmol/l甘氨酰甘氨酸、pH7.0]100μl/孔，0℃放置15分鐘，制備細(xì)胞裂解液。將50μl細(xì)胞裂解液與105μl熒光素酶檢測(cè)用緩沖液
混合，用熒光分光光度計(jì)[MicroLumatLP989，BERTHOLD]測(cè)定熒光量。計(jì)算從反應(yīng)開(kāi)始20秒間的相對(duì)光度(RLU)，作為熒光素酶活性。接下來(lái)，將35μl細(xì)胞裂解液與235μlβ-半乳糖苷酶用緩沖液[1.6mg/ml鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷、60mmol/l Na2HPO4、40mmol/l NaH2PO4、10mmol/l KCl、1mmol/l MgCL2、50mmol/l β-巰基乙醇]混合，用分光光度計(jì)[Microplate Reader Benchmark，BIO-RAD]測(cè)定吸光度(OD)。根據(jù)以下公式，將所給值作為標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性，作為轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性的指標(biāo)。
標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性＝RLU/OD測(cè)定結(jié)果如圖16所示。促濾泡素抑制素100％抑制由激活蛋白和GDF-8引起的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升。另一方面，促濾泡素抑制素突變體多肽抑制由GDF-8引起的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性上升的86％，與此相對(duì)，抑制因激活蛋白引起的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性上升的僅17％。
對(duì)促濾泡素抑制素突變體多肽FS1、FS1-1-3及FS1-1-2’也進(jìn)行與上述FS1-1同樣的檢驗(yàn)。其結(jié)果示于圖17和圖18，F(xiàn)S1、FS1-1-3與FS1-1同樣，幾乎完全抑制由GDF-8引起的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升，與此相對(duì)，幾乎不抑制因激活蛋白引起的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升。但是，F(xiàn)S1比FS1-1、或者FS1-1-3比FS1抑制標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性上升的程度更強(qiáng)，3種中FS1-1最能選擇性抑制GDF-8的活性。因此，為了選擇性抑制GDF-8的活性，促濾泡素抑制素突變體多肽中FSI的數(shù)目可達(dá)2個(gè)以上，優(yōu)選不僅FSII而且FSIII也缺失。此外，F(xiàn)S1-1-2’不僅抑制GDF-8引起的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升，而且抑制因激活蛋白引起的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升。因此，為了選擇性抑制GDF-8的活性，促濾泡素抑制素突變體多肽中優(yōu)選不含有FSII和FSIII樣結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例4過(guò)量表達(dá)促濾泡素抑制素突變體多肽的小鼠的骨骼肌重量的增加和脂肪量的減少將實(shí)施例1中制備的用EcoRI和SacI酶切pcDNA3(A+B)而得的包含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1的DNA的EcoRI-SacI片段，插入到載體pSP72(Promega)的EcoRI位點(diǎn)和SacI位點(diǎn)之間。用EcoRI和SmaI酶切所得質(zhì)粒，獲得含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1的DNA的EcoRI-SacI片段，將其插入到存在于MDAF2載體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，9306(2001)]肌球蛋白輕鏈啟動(dòng)子的下游的EcoRI位點(diǎn)和SacI位點(diǎn)之間，獲得質(zhì)粒MDAF2-FS1-1。
分離MDAF2-FS1-1的大約3.7kbp的ClaI片段，顯微注射到221個(gè)BDF1小鼠的受精卵中。將狀況良好的受精卵移植到接受小鼠中，自然生產(chǎn)，獲得33只仔鼠。維持確認(rèn)其基因組DNA中導(dǎo)入了MDAF2-FS1-1來(lái)源的DNA的轉(zhuǎn)基因小鼠的系統(tǒng)。由于肌球蛋白輕鏈啟動(dòng)子的作用，在轉(zhuǎn)基因小鼠中促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1在骨骼肌特異高表達(dá)。可以觀察到，如此所得轉(zhuǎn)基因小鼠，其骨骼肌顯著增加。例如，采集14周雄性轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的胸大肌、大殿肌、上腕二頭肌，測(cè)定其重量，結(jié)果如圖19所示。與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠中，測(cè)定的所有骨骼肌的重量均增加。
再測(cè)定所得轉(zhuǎn)基因小鼠的皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪，檢測(cè)促濾泡素抑制素突變體多肽對(duì)這些脂肪量的影響。分別測(cè)定其重量，以占體重的比率(％)為指標(biāo)。結(jié)果，轉(zhuǎn)基因小鼠，其皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪的量均比野生型小鼠顯著降低。作為示例，圖20中分別顯示了12周齡雌雄轉(zhuǎn)基因小鼠與12周齡雌性野生型小鼠其與體重相比的皮下脂肪量(％)和內(nèi)臟脂肪量(％)。野生型小鼠是3只的平均值。與雄性轉(zhuǎn)基因小鼠同樣，可見(jiàn)其皮下脂肪量和內(nèi)臟脂肪量顯著減少。需要指出的是，除骨骼肌增加和脂肪減少以外未觀察到其它異常。
實(shí)施例5促濾泡素抑制素突變體多肽與免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白質(zhì)對(duì)GDF-8特異的功能抑制(1)促濾泡素抑制素突變體多肽與免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體的制備分別如下制備促濾泡素抑制素突變體多肽FS1和FS1-1與免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。
以實(shí)施例1中制備的pGEM-T Easy(B)為模板，用含有序列號(hào)27和28所示堿基序列的合成DNA(Genset)作引物，各引物分別用10pmol，用與實(shí)施例1的基因擴(kuò)增片段A同樣的條件進(jìn)行PCR。反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收5’端附加了KpnI位點(diǎn)、3’端附加了BamHI位點(diǎn)、編碼FS1的擴(kuò)增片段。用KpnI和BamHI酶切所得擴(kuò)增片段，與用KpnI和BamHI酶切CD5-IgG1載體[Cell，61，1303(1990)]所得包含編碼人IgG1恒定區(qū)的基因組序列的KpnI-BamHI片段連接，構(gòu)建成FS1的C末端融合了人IgG1恒定區(qū)的融合蛋白質(zhì)(以下叫做FS1-Fc)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3FS1-Fc。由于CD5-IgG1載體中，將編碼人IgG1恒定區(qū)的序列插入到載體pcDNA3的啟動(dòng)子下游的XhoI位點(diǎn)-XbaI位點(diǎn)之間，所以pcDNA3FS1-Fc具有插入到pcDNA3的啟動(dòng)子下游的編碼FS1-Fc的序列的結(jié)構(gòu)。
將實(shí)施例1中制備的用EcoRI和EcoRV酶切pBluescript(A+B)所得包含編碼FS1-1序列的片段，插入到載體pSP72(Promega)的EcoRI位點(diǎn)-SmaI位點(diǎn)間。將用EcoRI和BamHI酶切所得質(zhì)粒得到包含編碼FS1-1序列的片段插入到pBluescriptSK(-)的EcoRI位點(diǎn)-BamHI位點(diǎn)間。用KpnIKpnI和BamHI酶切所得質(zhì)粒，獲得含編碼FS1-1序列的片段，將該片段與用KpnI和BamHI酶切CD5-IgG1載體所得的包含編碼人IgG1恒定區(qū)的基因組序列的KpnI-BamHI片段相連，構(gòu)建成FS1的C末端融合了人IgG1恒定區(qū)的融合蛋白質(zhì)(以下叫做FS1-1-Fc)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3FS1-1-Fc。pcDNA3FS1-1-Fc具有插入到pcDNA3的啟動(dòng)子下游的編碼FS1-1-Fc的序列的結(jié)構(gòu)。
(2)表達(dá)載體向CHO-K1細(xì)胞的導(dǎo)入和培養(yǎng)用脂質(zhì)體試劑Transfast(Promega)分別將pcDNA3FS1-Fc或pcDNA3FS1-1-Fc導(dǎo)入CHO-K1(ATCCCCL-61)細(xì)胞中后，獲得穩(wěn)定整合了所導(dǎo)入基因的單克隆。將各單克隆懸浮到10ml添加了10％FCS的αMEM培養(yǎng)基中，接種到直徑10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。5％CO2孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng)到匯合后，換成EX-CELL301培養(yǎng)基(JRHBioScience)，將6個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)1周，回收大約60ml的培養(yǎng)上清。
(3)FS1-Fc和FS1-1-Fc的純化向(2)中所得分別表達(dá)FS1-Fc和FS1-1-Fc的的CHO-K1細(xì)胞的培養(yǎng)上清中添加1/10量的肝素cellulofine(生化學(xué)工業(yè)社)，室溫混和2小時(shí)，使蛋白質(zhì)吸附。用洗滌緩沖液[20mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，0.15mol/L NaCl]洗滌肝素cellulofine后，用洗脫緩沖液[20mmol/LTris-HCl(pH 7.4)，1.5mol/L NaCl]洗脫下吸附的蛋白質(zhì)。應(yīng)用固化了與免疫球蛋白恒定區(qū)特異結(jié)合的Protein A的樹(shù)脂，按照常規(guī)方法，可分別獲得FS1-Fc溶液和FS1-1-Fc溶液。
(4)FS1-Fc和FS1-1-Fc的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性的驗(yàn)證分別在(a)僅緩沖液、(b)FS1-Fc(20μg/ml)、(c)激活蛋白(15ng/ml)、(d)激活蛋白(15ng/ml)和FS1-Fc(20μg/ml)、(e)GDF-8(15ng/ml)、(f)GDF-8(15ng/ml)及FS1-Fc(10μg/ml)、(g)GDF-8(15ng/ml)和FS1-Fc(20μg/ml)各條件下，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例3同樣的報(bào)告基因檢驗(yàn)，驗(yàn)證FS1-Fc的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性。如圖21所示，F(xiàn)S1-Fc幾乎完全抑制GDF-8造成的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升，相反，幾乎不抑制激活蛋白造成的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升。
同樣，分別在(a)僅緩沖液、(b)FS1-1-Fc(20μg/ml)、(c)激活蛋白(15ng/ml)、(d)激活蛋白(15ng/ml)和FS1-1-Fc(20μg/ml)、(e)GDF-8(15ng/ml)、(f)GDF-8(15ng/ml)及FS1-1-Fc(20μg/ml)各條件下，驗(yàn)證FS1-1-Fc的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性。如圖22所示，F(xiàn)S1-1-Fc幾乎完全抑制GDF-8造成的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升，相反，幾乎不抑制激活蛋白造成的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的上升。
通過(guò)以上結(jié)果可以確認(rèn)促濾泡素抑制素突變體多肽與免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白質(zhì)FS1-Fc和FS1-1-Fc、與FS1和FS1-1同樣能選擇性抑制GDF-8的活性。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明提供促濾泡素抑制素突變體多肽，與對(duì)激活蛋白活性的抑制相比，它能選擇性抑制GDF-8的活性。該促濾泡素抑制素突變體多肽可用于骨骼肌的增加和脂肪的減少。此外，可用于肌肉萎縮癥的治療、惡液質(zhì)、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖或獲得性免疫缺陷綜合癥的治療。
序列表<110>Techno Network Shikoku Co.，Ltd.
<110>Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.
<120>促濾泡素抑制素突變體多肽<130>A51236A<150>JP 2004-120023<151>2004-04-15<150>JP 2004-355293<151>2004-12-08<160>29<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>70<212>PRT<213>人工的<220>
<223>促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I共有序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Xaa是Glu或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>Xaa是Arg或Lys<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)<223>Xaa是Lys或Arg<220>
<223>發(fā)明人Tsuchida，Kunihiro；Murakami，Tatsuya<400>1Cys Xaa Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Xaa Met Asn Lys1 5 10 15Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr20 25 30Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu35 40 45Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val50 55 60Gln Tyr Gln Gly Xaa Cys65 70<210>2<211>72<212>PRT<213>人工的<220>
<223>促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域II共有序列<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(35)..(35)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(45)..(45)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(48)..(48)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<400>2Cys Arg Asp Val Xaa Cys Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gln1 5 10 15Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro20 25 30Xaa Ser Xaa Glu Gln Xaa Leu Cys Gly Asn Asp Gly Xaa Thr Tyr Xaa35 40 45Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile50 55 60
Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys65 70<210>3<211>1035<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1035)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>3atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile
65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag act tgt cgg gat gtt ttc tgt cca ggc agc 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser165 170 175tcc aca tgt gtg gtg gac cag acc aat aat gcc tac tgt gtg acc tgt 576Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys180 185 190aat cgg att tgc cca gag cct gct tcc tct gag caa tat ctc tgt ggg 624Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly195 200 205aat gat gga gtc acc tac tcc agt gcc tgc cac ctg aga aag gct acc 672Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr
210 215 220tgc ctg ctg ggc aga tct att gga tta gcc tat gag gga aag tgt atc 720Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile225 230 235 240aaa gca aag tcc tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt 768Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys245 250 255tta tgg gat ttc aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag 816Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu260 265 270ctg tgc cct gac agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat 864Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn275 280 285gcc act tat gcc agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca 912Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser290 295 300ggt gtg cta ctg gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg 960Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser305 310 315 320gaa gac acc gag gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt 1008Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe325 330 335cct ata tct tct att cta gag tgg taa 1035Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp340<210>4<211>344
<212>PRT<213>智人<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>4Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys180 185 190Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly195 200 205Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr210 215 220Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile225 230 235 240Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys245 250 255Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu260 265 270Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn275 280 285Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser290 295 300Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser305 310 315 320Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe325 330 335Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp340<210>5<211>678<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>FS-1-1<220>
<221>CDS<222>(1)..(678)<400>5ggg aac tgc tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg 48Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15tac aag acc gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg 96Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30agc acc tcg tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag 144Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45tgg atg att ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa 192Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60acg tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac 240Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc 288Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat 336Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110
gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa 384Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt 432Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc 480Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc 528Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca 576Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala180 185 190aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt 624Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205aaa aag act tgt gaa gat atc tcg agg caa tca cta gag ggc cct att 672Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile210 215 220cta tag 678Leu225<210>6<211>225<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>FS-1-1<400>6Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala
180 185 190Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile210 215 220Leu225<210>7<211>480<212>DNA<213>人工的<220>
<223>FS-1<220>
<221>CDS<222>(1)..(480)<400>7ggg aac tgc tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg 48Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15tac aag acc gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg 96Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30agc acc tcg tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag 144Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45tgg atg att ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa 192
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60acg tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac 240Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc 288Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat 336Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa 384Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag ctt atc gat acc gtc gac ctc 432Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu130 135 140gag cat gca tct aga ggg ccc tat tct ata gtg tca cct aaa tgc tag 480Glu His Ala Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys145 150 155<210>8<211>159<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FS-1<400>8
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu130 135 140Glu His Ala Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys145 150 155<210>9<211>936<212>DNA<213>人工的<220>
<223>FS-1-1-3<220>
<221>CDS<222>(1)..(936)<400>9ggg aac tgc tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg 48Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15tac aag acc gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg 96Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30agc acc tcg tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag 144Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45tgg atg att ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa 192Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60acg tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac 240Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc 288Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat 336Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa 384Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125
gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt 432Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc 480Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc 528Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca 576Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala180 185 190aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt 624Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205aaa aag act tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt tta 672Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu210 215 220tgg gat ttc aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag ctg 720Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu225 230 235 240tgc cct gac agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat gcc 768Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala245 250 255act tat gcc agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca ggt 816Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly260 265 270
gtg cta ctg gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg gaa 864Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu275 280 285gac acc gag gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt cct 912Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro290 295 300ata tct tct att cta gag tgg taa 936Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp305 310<210>10<211>311<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FS-1-1-3<400>10Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile
85 90 95Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala180 185 190Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu210 215 220Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu225 230 235 240Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala245 250 255Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly260 265 270Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu275 280 285Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro290 295 300
Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp305 310<210>11<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段A的引物<400>11gcaagctttg tgagaacgtg gactgtg 27<210>12<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段A的引物<400>12gcctcgagat atcttcacaa gtctttttac atctgcc37<210>13<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段B的引物<400>13cggaattcat ggtccgcgcg aggcaccag 29<210>14
<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段B的引物<400>14cgaagctttt tacatctgcc ttgg 24<210>15<211>765<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1-1<220>
<221>CDS<222>(1)..(765)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>15atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc 576
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat 624Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa 672Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act 720Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240tgt gaa gat atc tcg agg caa tca cta gag ggc cct att cta tag 765Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile Leu245 250<210>16<211>254<212>PRT<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1-1<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>16Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240
Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile Leu245 250<210>17<211>567<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1<220>
<221>CDS<222>(1)..(567)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>17atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60
tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt atc gat acc gtc gac ctc gag cat gca 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu His Ala165 170 175tct aga ggg ccc tat tct ata gtg tca cct aaa tgc tag 567Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys180 185<210>18<211>188<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>18Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu His Ala165 170 175Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys180 185<210>19<211>1023<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1-1-3<220>
<221>CDS<222>(1)..(1023)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>19atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc 576Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat 624
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa 672Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act 720Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt tta tgg gat ttc 768Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe245 250 255aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag ctg tgc cct gac 816Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp260 265 270agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat gcc act tat gcc 864Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala275 280 285agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca ggt gtg cta ctg 912Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu290 295 300gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg gaa gac acc gag 960Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu305 310 315 320gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt cct ata tct tct 1008Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser325 330 335att cta gag tgg taa 1023
Ile Leu Glu Trp340<210>20<211>340<212>PRT<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1-1-3<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>20Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190Pro Asp Cys Ser AsnIle Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe245 250 255Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp260 265 270Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala275 280 285Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu290 295 300Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu305 310 315 320Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser325 330 335
Ile Leu Glu Trp340<210>21<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段D的引物<400>21ccggaattct gtcaaaagtc ttgc 24<210>22<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段D的引物<400>22ccggaattcc tcgagtcaca cgaagttctc ttcctcctc 39<210>23<211>1017<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1-1-2’<220>
<221>CDS<222>(1)..(1017)
<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>23atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc 576Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat 624Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa 672Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act 720Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240tgt gaa gat atc gaa ttc tgt caa aag tct tgc gct cag gta gtg tgc 768Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val Cys245 250 255ccg cgt ccc cag tcg tgc ctt gtg gat cag acc ggc agc gca cac tgc 816Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys
260 265 270gtg gtg tgt cgc gct gcg ccc tgc cca gta cct tcc aac ccc ggc caa 864Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn Pro Gly Gln275 280 285gaa ctc tgt ggc aac aac aac gtt acc tac atc tcg tcg tgt cac ctg 912Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Leu290 295 300cgc cag gcc act tgc ttc ctg ggc cgc tcc att ggg gtt cgg cac cca 960Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Pro305 310 315 320ggc atc tgc aca ggt ggc ccc aaa gta cca gca gag gag gaa gag aac 1008Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asn325 330 335ttc gtg tga 1017Phe Val<210>24<211>338<212>PRT<213>人工的<220>
<223>帶有信號(hào)肽的FS-1-1-2’<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>24Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val Cys245 250 255Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys260 265 270Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn Pro Gly Gln275 280 285Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Leu290 295 300Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Pro305 310 315 320Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asn325 330 335Phe Val<210>25<211>309<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FS-1-1-2’<400>25Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala180 185 190Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln210 215 220Val Val Cys Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser225 230 235 240Ala His Cys Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn
245 250 255Pro Gly Gln Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser260 265 270Cys His Leu Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val275 280 285Arg His Pro Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu290 295 300Glu Glu Asn Phe Val305<210>26<211>12<212>PRT<213>智人<400>26Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg1 5 10<210>27<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>FS1-Fc的引物<400>27aagggtacca tggtccgcgc gaggcaccag30<210>28<211>26<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>FS1-Fc的引物<400>28tcgggatcca cgcagcgggg tttgtt26<210>29<211>73<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>29Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln1 5 10 15Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val20 25 30Pro Ser Asn Pro Gly Gln Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr35 40 45Ile Ser Ser Cys His Leu Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser50 55 60Ile Gly Val Arg His Pro Gly Ile Cys65 70
權(quán)利要求
1.一種促濾泡素抑制素突變體多肽，其特征在于(a)包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號(hào)2或序列號(hào)29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨(dú)立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數(shù)；(c)與抑制激活蛋白的活性相比，它選擇性抑制GDF-8的活性。
2.權(quán)利要求1中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I，缺失促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域II。
3.權(quán)利要求1或2中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它也不包括促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III。
4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括2個(gè)以上的促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它還包括N端結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求1或2中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括選自FSI、FSI-FSI、FSI-FSI-FSIII、FSN-FSI、FSN-FSI-FSI或FSN-FSI-FSI-FSIII的任一結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，其中FSI表示促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I，F(xiàn)SIII表示促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域III，F(xiàn)SN表示N端結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域間可直接相連，或通過(guò)連接肽連接。
7.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I是包含序列號(hào)1中氨基酸序列的多肽。
8.權(quán)利要求7中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括序列號(hào)4中30～166位的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的N端或C端融合了其它多肽。
10.一種多肽，其包含序列號(hào)6、8或10中的氨基酸序列。
11.一種多聚核苷酸，它編碼權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽。
12.權(quán)利要求11中所述的多聚核苷酸，它包括序列號(hào)5、7或9中的堿基序列。
13.一種載體，它包括權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸。
14.一種轉(zhuǎn)化體，它是將權(quán)利要求13中的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得的。
15.一種多肽的制備方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求14中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使該細(xì)胞中表達(dá)的權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽在培養(yǎng)基或該細(xì)胞中蓄積，從培養(yǎng)基或該細(xì)胞中收集該多肽。
16.一種GDF-8的選擇性抑制劑，它含有權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體，且其不抑制激活蛋白。
17.一種醫(yī)藥組合物，它含有權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
18.一種骨骼肌增加劑，它含有作為有效成分的權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
19.一種脂肪減少劑，它含有作為有效成分的權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
20.一種肌肉萎縮癥的治療劑或預(yù)防劑，它含有作為有效成分的權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
21.一種伴隨有惡液質(zhì)、肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖或獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預(yù)防劑，它含有作為有效成分的權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
22.權(quán)利要求21中所述的治療劑或預(yù)防劑，其中伴隨有肌肉萎縮的疾病是遺傳性的肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓小腦變性癥或帕金森病。
23.一種轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，它導(dǎo)入了含權(quán)利要求11或12中多聚核苷酸的外來(lái)基因。
24.一種增加非人動(dòng)物肌肉的方法，它向非人動(dòng)物中施用了權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
25.一種減少非人動(dòng)物脂肪的方法，它向非人動(dòng)物中施用了權(quán)利要求1～10任一項(xiàng)中的多肽，權(quán)利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
26.一種驗(yàn)證待檢物質(zhì)對(duì)激活蛋白及GDF-8的功能抑制活性的方法，它包括在激活蛋白、GDF-8、激活蛋白和待檢物質(zhì)或GDF-8和待檢物質(zhì)存在的條件下培養(yǎng)具有報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞，并檢測(cè)報(bào)告基因。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中使用熒光素酶作為報(bào)告基因。
28.權(quán)利要求26或27所述的方法，其中使用促濾泡素抑制素突變體多肽作為待檢物質(zhì)，所述促濾泡素抑制素突變體多肽(a)包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號(hào)2或序列號(hào)29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨(dú)立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供不抑制激活蛋白的活性而特異性抑制GDF－8活性的促濾泡素抑制素的突變體。本發(fā)明提供促濾泡素抑制素突變體多肽，其特征在于(a)包含促濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys－(X
文檔編號(hào)A61K48/00GK1993463SQ20058001986
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者土田邦博, 村上達(dá)也 申請(qǐng)人:四國(guó)技術(shù)網(wǎng)絡(luò)株式會(huì)社