專利名稱：治療和預(yù)防前列腺癌中的黃佩瑞任和雞骨常山堿組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于前列腺癌預(yù)防和治療的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及黃佩瑞任(Flavopereirine)和雞骨常山堿組合在預(yù)防和治療前列腺癌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
前列腺癌是最常見的男性癌癥。診斷是基于活組織切片檢查，前列腺小切片的顯微鏡檢。當活組織切片含有癌細胞時，治療選擇通常包括放射性和化學治療，激素治療以及外科手術(shù)移除前列腺。公知地，對于患者這些治療經(jīng)常是破壞性的，并且盡管這些治療，前列腺癌的死亡率仍舊高居不下。
對于預(yù)防前列腺癌的進展的藥劑存在緊急需求。事實上，在本國每年進行大約一百萬前列腺的活組織切片檢查，到目前為止大多數(shù)是陰性的。然而，這些男性遭受與升高的PSA水平相關(guān)的一定范圍的癥狀和影響泌尿和性功能的良性前列腺增生的折磨。具有BPH(良性前列腺增生)或升高的PSA，或具有PIN(前列腺上皮內(nèi)瘤形成)，但是具有陰性的活組織切片的這一大組男性是處于癌癥前期的他們處于發(fā)展侵入性前列腺癌的高風險中，并且沒有有效的預(yù)防治療。在這一人群中預(yù)防或顯著地延遲癌癥發(fā)作的藥劑具有顯著的治療價值。
另一大群男性被診斷患有前列腺癌，但是他們的活組織切片表現(xiàn)出所述疾病的低級形式。這一組處于公知的‘等待觀察(watchful waiting)’或‘積極監(jiān)視(active surveillance)’類別，并且當他們PSA水平的增加速率相對快速時，他們要經(jīng)受上文提及的治療干預(yù)。這一大組男性--處于等待觀察的那些和具有更短的PSA倍增時間的那些，需要這樣的藥劑，即，抑制他們的癌癥，減緩PSA增加的速率，并且防止他們癌癥進展到更高的級別和更加侵入性的形式。這樣的藥劑將填補男性衛(wèi)生保健的一個重要的空白。
第三群男性經(jīng)受一種常規(guī)治療，在這種情形中，他們的恢復(fù)通過監(jiān)測他們的PSA水平變化速率或倍增時間來進行評估，PSA水平變化速率或倍增時間作為他們的癌癥可能多么快速地復(fù)發(fā)的指示。有效地降低PSA水平和調(diào)節(jié)PSA倍增時間的藥劑可以用來與常規(guī)治療結(jié)合，以幫助預(yù)防前列腺癌的復(fù)發(fā)，因此顯著地延長這一癌癥患者群體的生命。
發(fā)明概述本發(fā)明包括用于減輕和避免與前列腺癌相關(guān)的癥狀的發(fā)作，用于治療低級前列腺癌和防止它們進展成為更加高級的癌癥，以及用于降低PSA倍增時間并且因此預(yù)防或延緩轉(zhuǎn)移性前列腺癌的組合物和方法。所述組合物包括黃佩瑞任和雞骨常山堿的混合物。黃佩瑞任和雞骨常山堿相對于彼此以定義的比例存在。所述黃佩瑞任和雞骨常山堿可以作為植物提取物而存在。含有黃佩瑞任的提取物衍生于Pao Pereira，和含有雞骨常山堿的提取物衍生于Rauwolfia Vomitora。黃佩瑞任提取物與雞骨常山堿提取物的比例約為3-4∶1，并且是基于以提取物形式的活性成分，即，Pao Pereira提取物與Rauwolfia Vomitora提取物。備選地，黃佩瑞任和雞骨常山堿可以以純化的化學形式而存在，即，合成的黃佩瑞任和合成的雞骨常山堿的組合。在活性成分是提取物形式的情形中，預(yù)計所述比例可以取決于活性組分的純度而有些改變。所述量足以在前列腺癌細胞中誘導程序性細胞死亡和破壞細胞周期和DNA損傷應(yīng)答途徑。
預(yù)見了這種類型的化合物的任何常規(guī)施用模式。目前，口服施用是可考慮的。這種類型的典型模式將包括片劑和膠囊。這些將以試劑盒形式包裝，具有書面的用法指導，以使治療方案更容易。
預(yù)計用黃佩瑞任和雞骨常山堿混合物治療的群體分成3組1)認為易感前列腺癌的那些受試者；2)患有具有低和高PSA倍增時間的低級形式的前列腺癌的那些受試者；和3)與傳統(tǒng)藥物治療(特別是外科手術(shù)、放射性和冷凍和/或化學治療)聯(lián)合治療的那些受試者。群體數(shù)目1可以包括高危組，諸如具有高PSA計數(shù)，BPH癥狀(良性前列腺增生)或患有PIN(前列腺上皮內(nèi)瘤形成)的男性。這一組具有陰性的組織活檢，并且將被認為是處于癌癥前期?；旌衔锏挠昧侩S著時間足以減輕BPH(良性前列腺增生)的癥狀，或降低升高的PSA水平。群體數(shù)目2應(yīng)該已被診斷為患有前列腺癌并且因此可能具有陽性的組織活檢，但是具有以更低的Gleason得分為特征的非侵入性(non-aggressive)腫瘤。這一群體將包括具有相對低的PSA增加速率的男性以及具有更高的PSA增加速率的男性?；旌衔锏挠昧孔阋詼p緩前列腺癌向更侵入性階段進展并且降低PSA水平和PSA倍增時間。群體數(shù)目3應(yīng)該具有或?qū)⒄诮?jīng)受一些形式的前列腺癌治療(外科手術(shù)、放射性、冷凍或化學治療)。與這些治療聯(lián)合應(yīng)用，混合物的用量足以降低PSA倍增時間。
本發(fā)明還包括這兩種提取物以相對量的新組合，以預(yù)防前列腺癌或減輕BPH癥狀，特別是在癌癥前期的男性中，包括診斷為患有前列腺上皮內(nèi)瘤形成(PIN)的男性。所述提取物發(fā)揮有益作用，而沒有通常與抗癌治療相關(guān)的副作用。變成癌細胞的癌癥前期細胞被所述混合物選擇性地殺死，并且正常細胞不受影響。
本發(fā)明還包括在具有前列腺癌的癌癥前期前體、升高的PSA、和良性前列腺增生，但是還沒有患有前列腺癌的患者中預(yù)防前列腺癌發(fā)生的方法。本發(fā)明還包括用于減少PSA水平和/或減輕BPH癥狀的方法。
本發(fā)明還包括治療患有局部(非遷移性的)前列腺癌的男性的方法，以預(yù)防更高級腫瘤和更加侵入性疾病的發(fā)展。癌癥細胞被所述混合物選擇性地殺死，并且正常細胞不受影響。
本發(fā)明還包括治療具有長和短的PSA倍增時間的男性并且延長PSA倍增時間的方法。本發(fā)明將幫助維持具有長PSA倍增時間的男性的‘等待觀察’狀況，并且?guī)椭A(yù)防具有短PSA倍增時間的男性更加侵入性或遷移性疾病的發(fā)作。
本發(fā)明還提供給個體施用以膠囊或片劑形式的口服有效劑量的提取物的方法。
本發(fā)明提供用于阻抑或抑制前列腺癌發(fā)生、PSA水平減少、和BPH癥狀減輕的方法，其通過施用由衍生于Pao Pereira和Rauwolfia Vomitora的天然提取物的組合組成的預(yù)防性藥劑而實現(xiàn)。
本發(fā)明提供預(yù)防性藥劑通過在癌細胞中誘導細胞程序性死亡和細胞周期和DNA損傷應(yīng)答途徑分裂的作用機制。在最理想的濃度，這種機制對癌細胞是選擇性的，并且它還提供所述預(yù)防性藥劑在降低PSA水平和BPH癥狀中的功效。
附圖簡述

圖1顯示在用Rauwolfia和Pao提取物治療后LNCaP細胞生長分析的結(jié)果。
圖2顯示根據(jù)PARP分解和胱天蛋白酶-3活性，在LNCaP細胞中通過Rauwolfia和Pao提取物處理24小時后誘導的細胞程序性死亡。
圖3顯示通過FACS進行細胞周期分析。
圖4(A和B)顯示前列腺細胞瘤生長實驗的結(jié)果。
圖5顯示TUNEL染色檢測的結(jié)果。
圖6顯示TUNEL染色檢測相應(yīng)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
圖7顯示闡明Rauwolfia對LNCap腫瘤異種移植物生長的抑制的實驗結(jié)果。
發(fā)明詳述綜述本發(fā)明基于M.Beljanski的科學研究，他首次發(fā)展了這些提取物，并且在實驗室實驗和在動物研究中證明它們針對癌細胞的選擇活性。Beljanski提供了這樣的證據(jù)，即，這些化合物的毒性是基于它們與不穩(wěn)定DNA之間的相互作用，他發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定的DNA是癌細胞的基本特征。
本文所描述的工作支持前列腺細胞中DNA損傷的程度與前列腺癌的相互關(guān)系；這也支持前列腺癌癥前期病況的具體診斷。本發(fā)明也描述了證明在前列腺癌細胞中包括細胞程序性死亡的誘導和細胞周期和DNA損傷應(yīng)答途徑的分裂的作用機制的工作。這在組織培養(yǎng)物和在動物異種移植物模型中顯示。揭示黃佩瑞任和雞骨常山堿的不同作用機制支持應(yīng)用所述提取物的特殊組合以獲得增強的治療效果的觀點。
前列腺DNA損傷的中間或癌癥前期階段的分類表明，這些化合物將特定地在處于向癌癥狀態(tài)轉(zhuǎn)化的癌癥前期細胞上行使它們的毒性作用，由此在高危險性男性中預(yù)防癌癥，并且應(yīng)答了非常大的患者群體的迫切需求。這些化合物還在癌細胞上行使它們的毒性作用，由此防止向更高級和更加侵入性形式的前列腺癌發(fā)展。
Pao Pereira和Rauwolfia Vomitora提取物抗癌作用的發(fā)現(xiàn)按照美國專利號5,519,028中的流程制備來自Pao Pereira的提取物。按照歐洲專利號EP-A-0059817中的方法制備來自Rauwolfia Vomitora的提取物。這一方法包括從產(chǎn)物中消除有毒的化合物(例如，利血平)的部分純化步驟。
首先在叫作致癌檢測(Oncotest)的體外檢測(U.S.Pat.No.4,264,729)中分析這兩種提取物的生化活性。這一檢測最初是設(shè)計成對于它們的致癌潛力而篩選化合物，并且是基于從癌細胞和從正常細胞分離的DNAs二級結(jié)構(gòu)的差異(Beljanski，IRCSMed.Sci.1979.7476)。當用作體外DNA合成的模板時，相對于純化的正常DNA，純化的癌細胞DNA表現(xiàn)出更大的chromicity(紫外光吸收)和更大的活性(Beljanski等，Expl.Cell.Biol.，1981.49220-231)。這表明癌DNA雙螺旋中的氫鍵被可再生地斷裂，形成增加UV吸收和增強體外酶促活性的開口或環(huán)。結(jié)構(gòu)上的這種基本的差異，癌DNA的更大的鏈分離特征，叫作DNA不穩(wěn)定(Beljanski，Proceedings of theinternational seminarTraditional Medicinea Challenge to the 21st Century.1992.Oxford and IBH Publishing Co.)。
當將已知的致癌物質(zhì)添加到致癌檢測時，它們在用正常模板的DNA合成中促進少量的增加，但是在用癌癥模板的DNA合成中促進高得多的增加(5-10倍)(Beljanski等.Third NCI-EORTC Symposium on new drugs incancer therapy.1981.Institut Bordet，Bruxelles)。認為這樣的化合物通過進一步打開癌癥DNA已經(jīng)比較松散的結(jié)構(gòu)而作用，由此增加酶對模板的接近，并且使得更多的DNA被合成。
當將Pao和Rauwolfia提取物用于致癌檢測時，它們具有致癌物質(zhì)相反的作用chromicity減少并且從癌DNA模板合成DNA得到抑制(Beljanski，Expl.Cell.Biol.1982.5079-87)。所述提取物的生化分析，包括DNA結(jié)合分析，鑒定了活性化合物為黃佩瑞任(在Pao Pereira中)和雞骨常山堿(在Rauwolfia Vomitora中)。由于所述提取物和它們各自的化合物所表現(xiàn)出的抑制作用是對癌DNA特異的，由于對正常DNA沒有作用，并且由于所篩選的幾百中化合物中很少給出這些結(jié)果，所以對于它們作為抗癌藥劑的潛力，進一步評估這些提取物和相應(yīng)的活性化合物。
所述提取物經(jīng)受長系列的檢測，以檢驗它們對培養(yǎng)的癌細胞(Beljanski等.，IRCS Med.Sci.1984.12587-588)，對患有各種癌癥的動物(Beljanski等.，Oncology，1986.43198-203)，和最終在眾多人類病例研究中的作用。所述提取物表現(xiàn)出一些一致的和顯著的特點。第一，在最適濃度，它們阻止在實驗室中維持的癌細胞系的增殖，而不傷害健康的細胞。它們對小鼠的癌細胞是毒性的，但是對小鼠沒有傷害。它們證明對一定范圍的人類惡性腫瘤具有抗癌作用，但是沒有表現(xiàn)出顯著的副作用。這些提取物的活性是對癌DNA、癌細胞、和對患有癌癥的生物體的腫瘤的選擇性。存在這樣的證據(jù)，即，這種選擇性部分是由于在這些細胞外膜上發(fā)生的改變使得它們優(yōu)先進入癌細胞(Beljanski等.International Journal of Oncology，1996.81143-1148)。在這些實驗過程中，Pao Pereira提取物(黃佩瑞任)的活性(Beljanski，Genetics and Mol.Biol.，2000.23，129-33)和RauwolfiaVomitora提取物(雞骨常山堿)的活性(未發(fā)表數(shù)據(jù))顯示出將人前列腺癌細胞系(PC3)的增殖抑制到相似的程度。由于它證明了混合物中的兩種活性化合物針對如PC-3這樣對激素沒有反應(yīng)的癌細胞有效，所以這一結(jié)果在本發(fā)明的上下文中是顯著的。
對于致癌檢測，從一定范圍的癌組織和細胞，包括乳房、肺、卵巢、神經(jīng)癌、埃利希腹水腫瘤細胞(Ehrlich ascites tumor cells)，KB和Hela和L細胞，分離癌DNA。正常的DNA從健康的乳房、肺、卵巢、腦、初級腎(primary kidney)、培養(yǎng)液中的Vero細胞和SIRC細胞分離。暴露于Pao Pereira提取物的細胞系包括u251，CCF-STTG-1 SW 1088和C6(腦)；LoVo，CaCo-2(結(jié)腸)；Sk-Hep 1(肝)；A498(腎)；G-36l(皮膚)；Es 2，Sw 626(卵巢)，ZR-75-1，MCF-7(乳房)；MIA PaCa2(胰腺)；PC3(前列腺)；和TT(胸腺)。用Pao Pereira檢測的正常細胞系包括CRL 1656(腦)；CCD-18Co(結(jié)腸)；Clone 9(肝)；NRK-49F(腎)；和CCD-97Sk(皮膚)。關(guān)于所述提取物用于治療人癌癥患者的應(yīng)用的軼事信息的概述可以在Beljanski，Mirko Beljanski ou La Chronique d′une″Fatwa″Scientifique，2001，EVI Liberty Corp中找到。
癌細胞中的DNA不穩(wěn)定性應(yīng)用傅立葉轉(zhuǎn)化質(zhì)譜的Malins等最近的研究(Cancer related changes inprostate DNA as men age and early identification of metastasis in primaryprostate tumors.Proc.Natl.Acad.Sci.2003 April 29100(9)5401-5406)已經(jīng)表明，前列腺癌細胞中的DNA的確不同于正常前列腺細胞的DNA。Malins等將所述不同稱為相對于正常DNA癌DNA紊亂的增加，并且這些變化與年齡和明顯地與暴露于致癌物質(zhì)有關(guān)。Malins等還能夠可再現(xiàn)地檢測到反應(yīng)前列腺的癌癥前期狀況的疾病的過渡階段(Malins等.Models of DNAstructure achieve almost perfect discrimination between normal prostate，benign prostatic hyperplasia(BPH)，and adenocarcinoma and have a highpotential for predicting BPH and prostate cancer.Proc.Natl.Acad.Sci.1997January 7；94(1)259-264)。這種癌癥前期狀況似乎與已知為前列腺上皮內(nèi)癌形成(PIN)的臨床病況相對應(yīng)。
Malins等報道致癌物質(zhì)在前列腺中的存在引起物理性損傷DNA的自由基的產(chǎn)生，產(chǎn)生‘潛在地上十億的改變的結(jié)構(gòu)’。這些改變中有許多將影響穩(wěn)定DNA雙鏈的氫鍵。這可能在Beljanski報道的螺旋結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生開口。
支持Pao Pereira和Rauwolfia Vomitora提取物用于預(yù)防前列腺癌的應(yīng)用的新數(shù)據(jù)1.細胞程序性死亡的誘導黃佩瑞任作用的基本機制黃佩瑞任和雞骨常山堿是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的β-咔啉族生物堿。存在這樣的證據(jù)，即，它們進入癌細胞中DNA相對開放的鏈，并且插入臨近的核苷酸之間，它們的存在明顯地干預(yù)了DNA的新陳代謝(Calvez，黃佩瑞任isan intercalating agent for non-supercoiled DNA，Cancer Detection andPrevention 1998；22(Supplement 1))。有效地，癌細胞不穩(wěn)定的DNA是這些生物堿的靶點，并且最終結(jié)果是細胞死亡。在表明Pao和Rauwolfia提取物都在組織培養(yǎng)液中抑制LNCaP前列腺癌細胞的生長的新的實驗中(圖1)，證實癌細胞的毒性。并且，這些提取物對LNCaP細胞表現(xiàn)出比對正常前列腺細胞的原代培養(yǎng)液顯著更高的毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。
我們最近的實驗也已經(jīng)表明，黃佩瑞任的基本作用機制是誘導細胞程序性死亡，而雞骨常山堿在這一途徑的誘導中具有相對較小的作用。PaoPereira提取物和Rauwolfia Vomitora提取物都能在前列腺癌細胞系LNCaP中引發(fā)細胞程序性死亡，如由PARP分解和胱天蛋白酶-3的誘導所確定的那樣[圖2]，但是Rauwolfia提取物的作用顯著地低于Pao提取物的作用。
細胞程序性死亡--也叫作程序性細胞死亡--是一種引發(fā)細胞自殺的內(nèi)在的生化途徑。這一途徑通常在發(fā)育過程中(例如，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中)應(yīng)用，通過免疫系統(tǒng)來保護機體免受改變細胞(例如，被病毒感染的細胞)，并且作為對DNA損傷的細胞反應(yīng)(例如，如果不破壞的話，這些細胞可能變成癌細胞)。在許多癌癥中，包括許多前列腺癌，誘導細胞程序性死亡的機制是有缺陷的，因此應(yīng)該正常自殺的細胞存活下來并且生長形成了腫瘤。許多癌癥治療實際上通過在某些類型的癌細胞中誘導細胞程序性死亡而其作用。
細胞程序性死亡的誘導是前列腺癌研究團體的中心主題，并且PaoPereira和(到顯著更低的程度)Rauwolfia Vomitora提取物表現(xiàn)出這樣的作用的事實使得它們極端有吸引力成為潛在的抗前列腺癌藥劑。
2.基于對凋亡途徑、對細胞周期和對DNA損傷應(yīng)答途徑的不同作用，黃佩瑞任和雞骨常山堿協(xié)同作用的潛力盡管兩種提取物都誘導細胞程序性死亡，并且都對前列腺癌細胞有毒，通過熒光性激活的細胞分類分析它們在細胞周期中的作用揭示了不同的作用。如圖3所示，Pao Pereira提取物引起LNCaP細胞在SubG0的累積，而Rauwolfia Vomitora阻礙細胞從G1到S期的進展。這一結(jié)果突出了所述兩種提取物作用機制的不同，它們的生化本質(zhì)尚未確定，盡管推測起來可能是基于黃佩瑞任和雞骨常山堿物理結(jié)構(gòu)的不同。一種可能是它們可以通過不同的途徑(例如，p53-依賴型和p53-不依賴型)誘導細胞程序性死亡，并且另一種可能是它們可以以稍微不同的動力學而起作用。不管所述的原因，這種在活性上的不同具有治療價值這兩種提取物的組合具有以互補方式作用的潛力，即，它們在它們的抗癌作用上潛在地是協(xié)同的。組合治療經(jīng)常用于癌癥治療，并且被廣泛地認為提供比單獨應(yīng)用單一的抗癌藥劑顯著的優(yōu)點。
為了進一步研究這兩種提取物對前列腺癌細胞的作用，進行了一系列微點陣檢測，其應(yīng)用含有3套不同的人基因的陣列，所述人基因?qū)儆?種不同的生化途徑細胞程序性死亡，細胞周期，和DNA損傷。在每種情形中，用于所述檢測的RNAs從已經(jīng)暴露于所述提取物24小時的LNCaP細胞分離。從這些微點陣實驗獲得的數(shù)據(jù)全部在表I中提到。參見附件。注意，應(yīng)用實時PCR來抽查在這些檢測中觀察到的變化的真實性。
盡管分析這些數(shù)據(jù)和綜合Pao和Rauwolfia提取物對這些復(fù)雜的途徑的作用的連貫描述的方法正在進行，并且將需要額外的實驗，但是可以進行一些觀察，以突出所述兩種提取物在所有3種微點陣中誘導不同的反應(yīng)的事實。例如，在DNA損傷反應(yīng)點陣中，Pao提取物對14種基因(以粗體表示)的表達具有潛在地顯著作用，而Rauwolfia提取物對30種轉(zhuǎn)錄物具有潛在地顯著反應(yīng)。更深入的檢驗揭示兩種提取物對僅僅4種常見基因(ATM，DDIT3，ERCC1，和PDCD8)的表達具有顯著作用。甚至更顯著的是受這兩種提取物影響的4種基因種僅有2種以相同的方式受到影響DDIT3和ERCC1都是被增量調(diào)節(jié)。其它2種微點陣分析也揭示了PaoPereira和Rauwolfia Vomitora提取物的有分歧的結(jié)果，這強烈地證實這些提取物以組合方式應(yīng)用以獲得它們的互補作用。
3.在異種移植物動物模型中，黃佩瑞任和雞骨常山堿是有抗前列腺癌腫瘤的活性在無胸腺的小鼠(例如，Balb/c，nu/nu)中，人腫瘤長成異種移植物的能力為研究對人癌癥治療的生物反應(yīng)提供了有用的體內(nèi)模型。由于人腫瘤首次成功的異種移植到無胸腺的小鼠中，所以許多不同的人腫瘤細胞系(例如，乳腺，肺，泌尿生殖器，胃腸，頭和頸，成膠質(zhì)細胞瘤，骨，和惡性黑素瘤)已經(jīng)被移植并且成功地在裸鼠中生長。這一系統(tǒng)的應(yīng)用使得能夠分析本發(fā)明的化合物在哺乳動物--一種用于人類的比基于細胞的檢測更好的模型中，對LNCaP細胞前列腺癌異種移植體的活性?？梢詰?yīng)用許多檢測來確定所述化合物的活性、特異性和作用水平，并且在這種情形種，腫瘤體積和免疫組織化學是終點。
應(yīng)用Pao Pereira提取物的異種移植物實驗的結(jié)果的圖表，具有腫瘤大小(立方毫米)針對時間(天數(shù))作圖的測量，在圖4A中顯示。與對照動物和與用50mg/kg每天治療的動物相比較，Pao Pereira提取物10和20mg/kg的日常劑量在腫瘤體積上引起統(tǒng)計學顯著的減少。圖4B顯示的對數(shù)轉(zhuǎn)化清楚地表明所述結(jié)果分成兩類。應(yīng)用Rauwolfia Vomitora提取物的異種移植物實驗的結(jié)果的圖表在圖7中顯示。在這種情形中，相對于對照，所有3種劑量的提取物在腫瘤體積上引起統(tǒng)計學顯著地減小[p＜0.0001]。最后，來自應(yīng)用從動物移除的腫瘤部分的2種免疫組織化學檢測的數(shù)據(jù)證實Pao的作用機制是誘導劑量依賴性的細胞程序性死亡。TUNEL染色檢測的結(jié)果在圖5中顯示，并且相對應(yīng)的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)在圖6中顯示。在BrdU染色檢測中獲得一致的結(jié)構(gòu)[數(shù)據(jù)未顯示]。對于RauwolfiaVomitora相似的免疫組織化學實驗?zāi)壳罢谶M行中。
這些提取物在減小腫瘤體積中的顯著作用必須也被認為是根據(jù)在這些實驗中動物的健康沒有被任何不利的方式另外危及到的顯著的事實。例如，治療和對照小鼠的重量在整個實驗過程中沒有表現(xiàn)出顯著的不同。兩種提取物抗前列腺癌的作用以及不存在副作用為本發(fā)明中所描述的權(quán)利要求提供了強有力的科學基礎(chǔ)。
配制和施用黃佩瑞任和雞骨常山堿組合可以作為藥物組合物配制。所述組合物可以包含在藥物試劑盒中。取決于要治療的受試者，理想的施用模式，和治療的類型--例如，防止，預(yù)防，治療；黃佩瑞任和雞骨常山堿組合以與這些參量一致的方式配制。這些技術(shù)的綜述在Remington′s PharmaceuticalSciences，最新版本，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.中找到。
一般而言，對于在治療或預(yù)防中的應(yīng)用，黃佩瑞任和雞骨常山堿組合可以單獨應(yīng)用，或與其它化學治療藥劑化合物組合應(yīng)用。黃佩瑞任和雞骨常山堿的混合物可以單獨施用或與其它藥物活性成分組合施用，并且以單一的或多次施用。混合物制劑可以以適于全身施用的方式而配制。全身性制劑包括設(shè)計成注射的那些，例如，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)或皮下注射，或可以制備成經(jīng)皮的，經(jīng)粘膜的(transmucosl)或口服施用的。所述制劑通常包括稀釋劑，以及，在一些情形中，佐劑，緩沖劑，防腐劑，等等。黃佩瑞任和雞骨常山堿混合物還可以應(yīng)用常規(guī)技術(shù)以脂質(zhì)體組合物或作為微乳劑而施用。
如果口服施用，本發(fā)明的黃佩瑞任和雞骨常山堿組合可以應(yīng)用適宜的腸衣而在胃中免于降解。
用于本發(fā)明的混合物施用和配制的方式將取決于病況性質(zhì)，病況嚴重性，要治療的具體受試者，和執(zhí)行醫(yī)生的判斷，配制將取決于施用的模式。由于本發(fā)明的混合物包括小分子，所以它便利地通過口服施用而施用，通過將它們與適當?shù)乃幬镔x形劑混合物以便提供片劑、膠囊、糖漿、等?？诜┯玫倪m宜的制劑還可以包括次要成分，諸如緩沖劑、調(diào)味劑等。典型地，制劑中活性成分的量將處于總制劑的1％-99％范圍，但是取決于載體寬泛的變化是允許的。適宜的載體包括蔗糖、膠質(zhì)、硬脂酸鎂、乳糖、花生油、橄欖油、水等。
所述混合物還可以通過注射施用，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)注射。用于這樣的應(yīng)用的典型的制劑是在等滲載體中的液體制劑，諸如Hank′s溶液或Ringer′s溶液。
適當?shù)膫溥x制劑還包括脂質(zhì)體制劑、緩慢釋放制劑等。
可以應(yīng)用任何適宜的制劑。在Remington′s Pharmaceutical Sciences，latest edition，Mack Publishing Company，Easton，Pa.中可以找到領(lǐng)域已知的制劑的綱要。參考這本手冊是本領(lǐng)域的慣例。
本發(fā)明的化合物的劑量將取決于許多因素，其隨患者和患者而變化。
口服劑量形式包括膠囊和片劑。膠囊或片劑可以容易地配制，并且可以制備成易于吞咽。片劑可以包含適當?shù)妮d體、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑、流動誘導劑、或熔融劑。片劑可以通過壓縮或鑄型而制備，任選地與一種或多種添加成分一起。壓縮的片劑可以通過壓縮以自由流動的形式(例如，粉劑、粒劑)的活性成分而制備，任選地與粘合劑(例如，明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如，甘醇酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素)、表面活性劑或分散劑混合。適宜的粘合劑包括淀粉，明膠，天然糖，諸如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜味劑，天然和合成的樹脂，諸如阿拉伯樹膠，黃芪膠，或藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙二醇，蠟，等。用于這些劑量形式的潤滑劑包括油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯甲酸鈉，乙酸鈉，氯化鈉，等。崩解劑包括，例如，淀粉，甲基纖維素，瓊脂，膨潤土，黃原膠，等。鑄型的片劑可以通過在適當?shù)臋C器中將用惰性液體稀釋劑潤濕的粉碎的活性成分混合物定型而制備。
片劑可以任選地被包被或刻痕(scored)，并且可以配制成提供活性成分的緩慢或可控制的釋放。片劑還可以任選地以具有腸衣提供，以提供在腸部分而不是在胃中的釋放。
如上文所述，黃佩瑞任和雞骨常山堿混合物可以被包含在試劑盒形式中。所述混合物將被配制成用作藥物。所述試劑盒可以包括一種或多種容器，其包含所述混合物的藥物形式，所述混合物包括以單位劑量形式的治療有效量的混合物。這樣的試劑盒還可以包括，如果需要的話，一種或多種不同的常規(guī)藥物試劑盒成分，諸如，例如，具有一種或多種藥用載體的容器，附加的容器，等等，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很容易顯而易見的。用法指導，諸如打印的用法指導，例如，作為插入物或作為標簽，標明要施用的成分的量的說明，施用指導，和/或與添加成分進一步混合的指導，也可以包含在試劑盒中。
表方案 Pao Pereira細胞程序性死亡100μg/ml Pao 24hr/LNCaP目錄# Oligo GEAarray人細胞程序性死亡微點陣密度 平均Clover Clover關(guān)陣列總數(shù) 2總組數(shù) 2背景 空白點位置117，114，116標準化 選擇基因位置126點陣名稱 C apoptosis light.tif T apoptosis.tif分配組 組1 組2*作為默認，組1被用作對照組。

方案 Rauwolfia細胞程序性死亡500μg/ml 24hr LNCaP目錄# Oligo GEAarray人細胞程序性死亡微點陣密度 平均CloverClover關(guān)陣列總數(shù) 2總組數(shù)2背景 空白點位置117，114，116標準化選擇基因位置1，121，123，124，125，126點陣名稱 Rauwolfia ApoptosisRauwolfia Apoptosis Rx.tif分配組組1組2*作為默認，組1被用作對照組。

方案Pao細胞周期 100μg/ml 24hr LNCaP目錄# Oligo GEAarray人細胞周期微點陣密度平均Clover Clover關(guān)陣列總數(shù)2總組數(shù) 2背景空白點位置117，114，116標準化 選擇基因位置125點陣名稱T cell cycle light.tif T cell cycle light.tif分配組 組1組2*作為默認，組1被用作對照組。

方案 Rauwolfia細胞周期500μg/ml 24hr LNCaP目錄# Oligo GEAarray人細胞周期微點陣密度 平均Clover Clover關(guān)陣列總數(shù) 2總組數(shù) 2背景 空白點位置117，114，116標準化 選擇基因位置1，121，122，123，124，125，126點陣名稱 Rauwolfia Rx Cell cycle.tif分配組 組1 組2*作為默認，組1被用作對照組。

方案Pao Pereira DNA損傷100μg/ml Pao，24hr，LNCaP目錄# Oligo GEAarray人DNA損傷信號途徑微點陣密度平均Clover Clover關(guān)陣列總數(shù)2總組數(shù) 2背景空白點位置117，116標準化 選擇基因位置1，121，123，124，125，126點陣名稱Pao Rx DNA damage scan dark.tif分配組 組1組2*作為默認，組1被用作對照組。

方案 Rauwolfia DNA損傷 500μg/ml Pao 24hr LNCaP目錄# Oligo GEAarray人DNA損傷信號途徑微點陣密度 平均Clover Clover關(guān)陣列總數(shù) 2總組數(shù) 2背景 空白點位置117，116標準化 選擇基因位置1，121，123，124，125，126點陣名稱 Rauw Rx DNA damage scans.tif1分配組 組1 組2*作為默認，組1被用作對照組。
權(quán)利要求
1.一種用于治療前列腺癌或延緩其發(fā)作的方法，其包括給懷疑易感或患有癌癥前期或前列腺癌的受試者施用有效量的黃佩瑞任和雞骨常山堿混合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述黃佩瑞任和雞骨常山堿分別包含在天然提取物中。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述天然提取物分別衍生于Pao Pereira和Rauwolfia Vomitora。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述Pao Pereira的提取物含有黃佩瑞任，和Rauwolfia Vomitora提取物含有雞骨常山堿。
5.權(quán)利要求4的方法，其以X∶Y的比例組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述黃佩瑞任和雞骨常山堿是合成的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述黃佩瑞任和雞骨常山堿是以純化的形式。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述混合物由將黃佩瑞任和雞骨常山堿分別施用給受試者而形成。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是處于高危組中。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述高危組包括具有高PSA計數(shù)、BPH(良性前列腺增生)癥狀或前列腺上皮內(nèi)瘤形成(PIN)癥狀的受試者。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者已被診斷患有前列腺癌，但是具有如更低的Gleason得分所證明的非侵入性的腫瘤。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者正經(jīng)受癌癥治療，包括外科手術(shù)、化學治療、冷凍治療或放射性治療。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述用量足以減輕BPH(良性前列腺增生)的癥狀或降低升高的PSA水平。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述施用是口服施用。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述口服施用是通過片劑或膠囊。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述有效量足以在癌細胞中誘導細胞程序性死亡。
17.一種用于治療前列腺癌的組合物，其包括有效量的黃佩瑞任和雞骨常山堿的混合物。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述黃佩瑞任和雞骨常山堿分開包含在天然提取物中。
19.權(quán)利要求17的組合物，其中所述有效量足以減輕BPH(良性前列腺增生)的癥狀或降低升高的PSA水平。
20.權(quán)利要求17的組合物，其是以適于口服施用的形式。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述形式是片劑或膠囊。
22.權(quán)利要求13的組合物，其中所述天然提取物分別衍生于Pao Pereira和Rauwolfia Vomitora。
23.權(quán)利要求18的組合物，其中所述Pao Pereira的提取物含有黃佩瑞任，和Rauwolfia Vomitora的提取物含有雞骨常山堿。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述提取物是以X∶Y的比例組合。
25.權(quán)利要求17的組合物，其中所述有效量足以在癌細胞中誘導細胞程序性死亡。
26.權(quán)利要求17的組合物，其中所述黃佩瑞任和雞骨常山堿是合成的。
27.權(quán)利要求17的組合物，其中所述黃佩瑞任和雞骨常山堿是以純化的形式。
28.一種試劑盒，其包括權(quán)利要求17的組合物。
全文摘要
一種通過施用有效量的黃佩瑞任和雞骨常山堿混合物而用于預(yù)防前列腺癌和/或降低PSA水平和/或減輕BPH(良性前列腺增生)或PIN(前列腺上皮內(nèi)瘤形成)癥狀的方法和組合物。一種在具有表現(xiàn)出相對低的Gleason得分和非侵入性的、緩慢進展的前列腺癌的形態(tài)學特征的陽性組織活檢的男性中，用于治療低級前列腺癌和預(yù)防遷移性疾病的發(fā)作和/或減少PSA水平倍增時間的方法和組合物。黃佩瑞任和雞骨常山堿可以以分別衍生于Pao Pereira和Rauwolfia Vomitora的天然提取物的形式。備選地，這兩種活性化合物可以以純化的形式施用。所述組合物可以與在治療方案中應(yīng)用的用法說明一起被包含在試劑盒中。
文檔編號A61K35/00GK101027070SQ200580019877
公開日2007年8月29日 申請日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日
發(fā)明者J·L·霍爾, S·貝連斯基 申請人:自然來源國際公司