專利名稱：用抗cd20抗體治療多軟骨炎和多發(fā)性單神經(jīng)炎的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)記諸如CD19或CD20的拮抗劑，如結(jié)合CD20的抗體來治療疾病。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞是造血作用過程中于骨髓中產(chǎn)生的許多種白細(xì)胞之一。有兩種主要的淋巴細(xì)胞群B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)。本文特別感興趣的淋巴細(xì)胞是B細(xì)胞。
B細(xì)胞在骨髓中成熟并離開骨髓在其細(xì)胞表面表達(dá)結(jié)合抗原的抗體。當(dāng)幼稚B細(xì)胞首次遭遇其膜結(jié)合抗體對(duì)之特異的抗原時(shí)，細(xì)胞開始快速分裂，其后代分化為記憶B細(xì)胞和稱為“漿細(xì)胞”的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞具有更長(zhǎng)的壽命，繼續(xù)表達(dá)與原始親本細(xì)胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不生成膜結(jié)合抗體，但轉(zhuǎn)而生成可分泌形式的抗體。分泌型抗體是體液免疫的主要效應(yīng)分子。
CD20抗原(也稱為人B淋巴細(xì)胞限制性分化抗原，Bp35)為疏水性跨膜蛋白，分子量約35kD，位于前B淋巴細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞上(Valentine等，J.Biol.Chem.264(19)11282-11287(1989)；和Einfeld等，EMBO J.7(3)711-717(1988))。該抗原也表達(dá)于超過90％的B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上(Anderson等，Blood63(6)1424-1433(1984))，但在造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞、正常漿細(xì)胞或其他正常組織上沒有發(fā)現(xiàn)(Tedder等，J.Immunol.135(2)973-979(1985))。CD20調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始和分化的激活進(jìn)程的早期步驟(Tedder等，同上)，可能作為鈣離子通道起作用(Tedder等，J.Cell.Biochem.14D195(1990))。
考慮到CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，此抗原可以作為這些淋巴瘤靶向的候選物。本質(zhì)上，這樣的靶向可以概括如下將特異于B細(xì)胞的CD20表面抗原的抗體施用于患者。這些抗CD20抗體特異地結(jié)合正常和惡性B細(xì)胞的CD20抗原(表面上)；結(jié)合于CD20表面抗原的抗體可導(dǎo)致贅生性B細(xì)胞的破壞和損耗。另外，可以將具有破壞腫瘤潛力的化學(xué)試劑或放射性標(biāo)記物綴合于抗CD20抗體以將試劑特異性地“遞送”到贅生性B細(xì)胞。不考慮方法，首要目標(biāo)是破壞腫瘤；可以由所使用的特定抗CD20抗體決定特定方法，這樣，可獲得的靶向CD20抗原的方法可以有相當(dāng)大的變化。
CD19是表達(dá)于B系細(xì)胞表面的另一抗原。象CD20一樣，CD19發(fā)現(xiàn)于該系所有分化細(xì)胞，自干細(xì)胞階段直至剛要最終分化為漿細(xì)胞前的那一點(diǎn)(Nadler，L.，Lymphocyte Typing II23-37和Appendix，Renling等編(1986)，Springer Verlag)。然而，與CD20不同，結(jié)合CD19的抗體使CD19抗原內(nèi)在化。CD19抗原由HD237-CD19抗體(也稱為″AB4″抗體)等鑒定(Kiesel等，Leukemia Research II，121119(1987))。CD19抗原存在于4-8％的外周血單核細(xì)胞和分離自外周血、脾、淋巴結(jié)或扁桃體的90％以上的B細(xì)胞上。在外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞、或粒細(xì)胞上沒有檢測(cè)到CD19。事實(shí)上，所有非T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和B細(xì)胞淋巴瘤都表達(dá)可用抗體B4檢測(cè)的CD19(Nadler等，J.Immunol.131244(1983)；和Nadler等，Progress in Hematology，Vol.XII，pp.187-206，Brown，E.編(1981)，Grune&Stratton，Inc.)。
已經(jīng)鑒定了識(shí)別由B細(xì)胞系細(xì)胞表達(dá)的分化階段特異性抗原的其他抗體。這些當(dāng)中有針對(duì)CD21抗原的B2抗體；針對(duì)CD22抗原的B3抗體；和針對(duì)CD10抗原(也稱為CALLA)的J5抗體。參見例如公布于1997年1月21日的美國(guó)專利5,595,721(Kaminski等)。
rituximab(RITUXAN)抗體是針對(duì)CD20抗原的遺傳工程化嵌合鼠/人單克隆抗體。Rituximab是公布于1998年4月7日的美國(guó)專利5,736,137(Anderson等)中稱為“AC2B8”的抗體。RITUXAN指定用于復(fù)發(fā)或難治的低級(jí)或?yàn)V泡性CD20陽性B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤患者的治療(Maloney等，Blood82(Suppl1)445a(1993)；Maloney等，Proc Am Soc Clin Oncol13993(1994))。體外作用機(jī)理研究已證明RITUXAN通過補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)結(jié)合人補(bǔ)體并裂解淋巴樣B細(xì)胞系(Reff等，Blood83(2)435-445(1994))。另外，它在抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)中具有顯著的活性。近來，已證明RITUXAN在氚標(biāo)記胸苷摻入試驗(yàn)中具有抗增殖效果，并直接誘導(dǎo)凋亡，而其他的抗CD19和CD20抗體不能(Maloney等，Blood88(10)637a(1996))。也已通過試驗(yàn)觀察到RITUXAN與化療和毒素之間的協(xié)同作用。特別地，RITUXAN使抗藥性人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系對(duì)多柔比星、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒素的細(xì)胞毒性作用敏感(Demidem等，Cancer Chemotherrapy & Radiopharrmaceuticals12(3)177-186(1997)；DemidemA等，F(xiàn)ASEB J9A206(1995))。體內(nèi)臨床前研究已證明RITUXAN損耗來自獼猴外周血、淋巴結(jié)、和骨髓的B細(xì)胞，可能是通過補(bǔ)體和細(xì)胞介導(dǎo)的進(jìn)程(Reff等，同上)。
也已在B細(xì)胞和自身抗體看起來在疾病病理生理學(xué)中起作用的多種非惡性自身免疫紊亂中研究了Rituximab。Edwards等，Biochem Soc.Trans.30824-828(2002)。已報(bào)導(dǎo)Rituximab潛在地減輕例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(Leandro等，Ann.Rheum.Dis.61883-888(2002)；Edwards等，ArthritisRheum.，46(Suppl.9)S46(2002)；Stahl等，Ann.Rheum.Dis.，62(Suppl.1)OP004(2003)；Emery等，Arthritis Rheum.48(9)S439(2003))、狼瘡(Eisenberg，Arthritis.Res.Ther.5157-159(2003)；Leandro等，Arthritis Rheum.462673-2677(2002)；Gorman等，Lupus，13312-316(2004))、免疫性血小板減少性紫癜(D′Arena等，Leuk.Lymphoma44561-562(2003)；Stasi等，Blood，98952-957(2001)；Saleh等，Semin.Oncol.，27(Supp12)99-103(2000)；Zaia等，Haematolgica，87189-195(2002)；Ratanatharathorn等，Ann.Int.Med.，133275-279(2000))、單純紅細(xì)胞發(fā)育不全(Auner等，Br.J.Haematol.，116725-728(2002))；自身免疫性貧血(Zaja等，Haematologica87189-195(2002)(在Haematologica87336(2002)中出現(xiàn)勘誤)、冷凝集素疾病(Layios等，Leukemia，15187-8(2001)；Berentsen等，Blood，1032925-2928(2004)；Berentsen等，Br.J.Haematol.，11579-83(2001)；Bauduer，Br.J.Haematol.，1121083-1090(2001)；Damiani等，Br.J.Haematol.，114229-234(2001))、嚴(yán)重胰島素抗性B型綜合征(Coll等，N.Engl.J.Med.，350310-311(2004))、混合冷球蛋白血癥(DeVita等，Arthritis Rheum.46Suppl.9S206/S469(2002))、重癥肌無力(Zaja等，Neurrology，551062-63(2000)；Wylam等，J.pediatr，143674-677(2003))、瓦格納氏肉芽腫(Specks等，Arthritis &Rheumatism442836-2840(2001))、難治性尋常天皰瘡(Dupuy等，ArchDermatol.，14091-96(2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)S1299(2002))、斯耶格倫氏綜合征(Somer等，Arthritis & Rheumatism，49394-398(2003))、活性II型混合冷球蛋白血癥(Zaja等，Blood，1013827-3834(2003))、尋常天皰瘡(Dupay等，Arch.Dermatol.，14091-95(2004))、自身免疫性神經(jīng)病(Pestronk等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry74485-489(2003))、副腫瘤性視性眼陣攣-肌陣攣綜合征(Pranzatelli等，Neurology60(Suppl.1)PO5.128A395(2003))、以及復(fù)發(fā)-緩和型多發(fā)性硬化(RRMS)的征候和癥狀。Cross等，(摘要)″Preliminary Results from a Phase II Trial ofRituximab in MS″，美國(guó)多發(fā)性硬化研究與治療委員會(huì)第八次年會(huì)，20-21(2003)。
已在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中進(jìn)行了II期研究(WA16291)，提供了有關(guān)Rituximab的安全性和功效的48周跟蹤數(shù)據(jù)。Emery等，Arthritis Rheum48(9)S439(2003)；Szczepanski等，Arthritis Rheum48(9)S121(2003)。將總共161名患者隨機(jī)地平均分為四個(gè)治療組甲氨蝶呤、僅rituximab、rituximab聯(lián)合甲氨蝶呤、rituximab聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CTX)。rituximab治療方案為第1天和第15天靜脈內(nèi)施用一克。大多數(shù)RA患者對(duì)輸注rituximab都很好地耐受，其中36％的患者在其首次輸注期間經(jīng)歷至少一種不良后果(與30％接受安慰劑的患者相比)?？偟恼f來，認(rèn)為大多數(shù)不良后果在嚴(yán)重程度上都是溫和至中度的，所有處理組之間都很平衡。48周中所有四個(gè)組共有19件嚴(yán)重的不良事件，其中rituximab/CTX組中稍多一些。所有組之間的感染發(fā)生率都很平衡。該RA患者群體中嚴(yán)重感染的平均比率為每100患者-年4.66，低于基于社會(huì)的流行病學(xué)研究所報(bào)導(dǎo)的需要住院的RA患者感染比率(每100患者-年為9.57)。Doran等，Arthritis Rheum.462287-2293(2002)。
所報(bào)導(dǎo)的rituximab在少數(shù)神經(jīng)病學(xué)紊亂患者中的安全譜，包括自身免疫性神經(jīng)病(Pestronk等，同上)、視性眼陣攣-肌陣攣綜合征(Pranzatelli等，同上)、和RRMS(Cross等，同上)，與在腫瘤學(xué)或RA中所報(bào)導(dǎo)的類似。正在RRMS患者中進(jìn)行的rituximab與干擾素-β(IFN-β)或醋酸格拉默聯(lián)合的研究者發(fā)起試驗(yàn)(IST)(Cross等，同上)中，10名受治療患者中有1個(gè)在首次rituximab輸注后經(jīng)歷了中度發(fā)燒和打寒戰(zhàn)，之后入院徹夜觀察，而其他9名患者完成了四次輸注方案，沒有報(bào)導(dǎo)任何不良事件。
關(guān)注CD20抗體和CD20結(jié)合分子的專利和專利出版物包括美國(guó)專利5,776,456，5,736,137，5,843,439，6,399,061，和6,682,734，以及US2002/0197255，US2003/0021781，US2003/0082172，US2003/0095963，US2003/0147885(Anderson等)；美國(guó)專利6,455,043和WO2000/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO2000/27428(Grillo-Lopez和White)；WO2000/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO2000/44788(Braslawsky等)；WO2001/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO2001/10460(White和Grillo-Lopez)；US2001/0018041，US2003/0180292，WO2001/34194(Hanna和Hariharan)；US2002/0006404和WO2002/04021(Hanna和Hariharan)；US2002/0012665和WO2001/74388(Hanna，N.)；US2002/0058029(Hanna，N.)；US2003/0103971(Hariharan和Hanna)；US2002/0009444和WO2001/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO2001/97858(White，C.)；US2002/0128488和WO2002/34790(Reff，M.)；WO2002/060955(Braslawsky等)；WO2002/096948(Braslawsky等)；WO2002/079255(Reff和Davies)；美國(guó)專利6,171,586和WO1998/56418(Lam等)；WO1998/58964(Raju，S.)；WO1999/22764(Raju，S.)；WO1999/51642，美國(guó)專利6,194,551，美國(guó)專利6,242,195，美國(guó)專利6,528,624和美國(guó)專利6,538,124(Idusogie等)；WO2000/42072(Presta，L.)；WO2000/67796(Curd等)；WO2001/03734(Grillo-Lopez等)；US2002/0004587和WO2001/77342(Miller和Presta)；US2002/0197256(Grewal，I.)；US2003/0157108(Presta，L.)；美國(guó)專利6,565,827，6,090,365，6,287,537，6,015,542，5,843,398，和5,595,721(Kaminski等)；美國(guó)專利5,500,362，5,677,180，5,721,108，6,120,767，和6,652,852(Robinson等)；美國(guó)專利6,410,391(Raubitschek等)；美國(guó)專利6,224,866和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO2001/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO2000/67795(Goldenberg)；US2003/0133930和WO2000/74718(Goldenberg和Hansen)；US2003/0219433和WO2003/68821(Hansen等)；WO2004/058298(Goldenberg和Hansen)；WO2000/76542(Golay等)；WO2001/72333(Wolin和Rosenblatt)；美國(guó)專利6,368,596(Ghetie等)；美國(guó)專利6,306,393和US2002/0041847(Goldenberg，D.)；US2003/0026801(Weiner和Hartmann)；WO2002/102312(Engleman，E.)；US2003/0068664(Albitar等)；WO2003/002607(Leung，S.)；WO2003/049694，US2002/0009427，和US2003/0185796(Wolin等)；WO2003/061694(Sing和Siegall)；US2003/0219818(Bohen等)；US2003/0219433和WO2003/068821(Hansen等)；US2003/0219818(Bohen等)；US2002/0136719(Shenoy等)；WO2004/032828(Wahl等)；以及WO2002/56910(Hayden-Ledbetter)。也可參見美國(guó)專利5,849,898和EP330,191(Seed等)；EP332,865A2(Meyer和Weiss)；美國(guó)專利4,861,579(Meyer等)；US2001/0056066(Bugelski等)；WO1995/03770(Bhat等)；US2003/0219433A1(Hansen等)；WO2004/035607(Teeling等)；WO2004/056312(Lowman等)；US2004/0093621(Shitara等)；WO2004/103404(Watkins等)；WO2005/000901(Tedder等)；US2005/0025764(Watkins等)；WO2005/016969(Carr等)；以及US2005/0069545(Carr等)。WO2004/032828述及復(fù)發(fā)性多軟骨炎作為將用抗CD20抗體治療的一系列免疫紊亂中的一種。
關(guān)注用rituximab治療的出版物包括Perotta和Abuel，“Response ofchronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab”摘要#3360Blood10(1)(part 1-2)p.88B(1998)；Perotta等，″Rituxan in the treatment of chronicidiopathic thrombocytopaenic purpura(ITP)″，Blood，9449(摘要)(1999)；Matthews，R.，“Medical Heretics”New Scientist(7April，2001)；Leandro等，“Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with Blymphocyte depletion”Ann Rheum Dis，同上；Leandro等，“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritisearly evidence for safety，efficacy and doseresponse″Arthritis and Rheumatism44(9)S370(2001)；Leandro等，“An openstudy of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthritis andRheumatism，462673-2677(2002)，其中在2周期間，每名患者接受兩次500mgrituximab輸注、兩次750mg環(huán)磷酰胺輸注、和高劑量口服皮質(zhì)類固醇，其中兩名受治療的患者分別在第7和8個(gè)月時(shí)復(fù)發(fā)，且已用不同方案再次治療；″Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus withrituximab maintenance therapy″Weide等，Lupus，12779-782(2003)，其中用rituximab治療的患者(375mg/m2x4，每周重復(fù)一次)，并且每5-6個(gè)月應(yīng)用更多的rituximab，然后每三個(gè)月用375mg/m2的rituximab進(jìn)行維持治療，且成功地用rituximab治療第二名難治的SLE患者且每三個(gè)月接受維持治療，兩名患者對(duì)rituximab治療都有較好的響應(yīng)；Edwards和Cambridge，“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed todeplete B lymphocytes”Rheumatology40205-211(2001)；Cambridge等，″Blymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritisserial studies ofimmunological parameters″Arthritis Rheum.，46(Suppl.9)S1350(2002)；Edwards等，“B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and otherautoimmune disorders”Biochem Soc.Trans.，同上；Edwards等，“Efficacy andsafety of rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibodyArandomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis and Rheumatism46(9)S197(2002)；Edwards等，″Efficacy ofB-celltargeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid 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Sarwal等，N.Eng.J. Med.349(2)125-138(July10，2003)報(bào)導(dǎo)了急性腎同種異體移植物排斥中由DNA微陣列分布所鑒定的分子異質(zhì)性。
復(fù)發(fā)性多軟骨炎是罕見的、慢性軟骨疾病，其特征在于身體多種組織軟骨炎癥的再發(fā)性發(fā)作。會(huì)發(fā)炎的含軟骨組織包括耳、鼻、關(guān)節(jié)、脊柱、以及氣管。具有的生物化學(xué)組成與軟骨類似的眼睛、心臟、和血管也可能受到影響。
復(fù)發(fā)性多軟骨炎的病因不明。懷疑該疾患由免疫系統(tǒng)紊亂(自身免疫)引發(fā)，其中機(jī)體免疫系統(tǒng)(其在正常情況下抗擊身體的入侵者，尤其是感染)受到誤導(dǎo)。這導(dǎo)致針對(duì)多種機(jī)體組織的炎癥。發(fā)現(xiàn)可通過抗炎藥和多種類固醇緩解。
多發(fā)性單神經(jīng)炎是痛苦的不對(duì)稱不同步感覺和運(yùn)動(dòng)周圍神經(jīng)病，涉及至少兩個(gè)分開的神經(jīng)區(qū)域的隔離損害。身體任意區(qū)域的多種神經(jīng)都能受到影響。狀況惡化時(shí)，其多灶性變得更少且更加對(duì)稱，類似于多神經(jīng)病。多發(fā)性單神經(jīng)病綜合征可以雙側(cè)、遠(yuǎn)端、和近端分布遍及全身。對(duì)神經(jīng)的損傷包括軸突的破壞(即神經(jīng)細(xì)胞中類似于電線之銅部分的部分)，因此在損傷部位干擾神經(jīng)傳導(dǎo)。常見病因包括糖尿病和多發(fā)性神經(jīng)壓迫，以及由血流減少或血管炎癥引起的缺氧。約三分之一的病例沒有鑒定病因。多發(fā)性特異性紊亂與多發(fā)性單神經(jīng)炎相關(guān)，包括(但不限于)血管疾病諸如結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎和其他血管炎性疾病、糖尿病、以及結(jié)締組織疾病諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。結(jié)締組織疾病是兒童中最常見的病因。不太常見的病因包括斯耶格倫氏綜合征(Sjgren′s syndrome)、韋格納氏肉芽腫(Wegener′s granulomatosis)、引起血管炎癥的超敏反應(yīng)(變態(tài)反應(yīng))、麻風(fēng)病、結(jié)節(jié)病、淀粉樣變性、多灶形式的糖尿病性神經(jīng)病、以及血液紊亂(諸如嗜曙紅細(xì)胞增多癥和冷球蛋白血癥)。參見例如Hattori等，Brain122(3)427-439(1999)，其中評(píng)估了28名與丘-施二氏綜合征相關(guān)的周圍神經(jīng)病患者的臨床病理學(xué)特征，感覺和運(yùn)動(dòng)關(guān)聯(lián)在初期主要表現(xiàn)為多發(fā)性單神經(jīng)炎樣式，發(fā)展為不對(duì)稱多神經(jīng)病，限于四肢。CD20陽性B淋巴細(xì)胞只是偶爾見到。
神經(jīng)病的治療取決于其病因，許多神經(jīng)病可以通過解決其根本病因(諸如維生素缺乏)來治療。其它的可以預(yù)防其發(fā)生。例如，控制糖尿病可以預(yù)防糖尿病性神經(jīng)病。如果病因是腫瘤或椎間盤破裂，則治療可能涉及去除腫瘤或修復(fù)破裂椎間盤的外科手術(shù)。在卡陷性或壓迫性神經(jīng)病中，治療可能由尺神經(jīng)或正中神經(jīng)的夾板或手術(shù)減壓組成。腓側(cè)和徑向壓迫性神經(jīng)病可能需要避免壓力。物理療法和/或夾板可能有助于預(yù)防攣縮(其中關(guān)節(jié)周圍縮短的肌肉引起異常且有時(shí)是關(guān)節(jié)的疼痛位置)?？梢酝ㄟ^針對(duì)免疫系統(tǒng)的異常特征的治療來改善與免疫性疾病相關(guān)的神經(jīng)病。這樣的治療包括靜脈內(nèi)免疫球蛋白、血漿交換和免疫抑制療法(Cook等，Neurology40212-214(1990)；Dyck等，N.Engl.J.Med3251482-1486(1991)；Emerudh等，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry55930-934(1992)；Blume等，Neurology451577-1580(1995)；Pestronk等，Neurology442027-2031(1994))。這些可能產(chǎn)生最小的功能改善。此外，所述治療可能是昂貴且費(fèi)時(shí)的。
有關(guān)針對(duì)B細(xì)胞表面膜標(biāo)志物的抗體定向治療的文獻(xiàn)非常有限。Levine和Pestronk描述了具有神經(jīng)病和針對(duì)GM1或MAG的免疫球蛋白M抗體的五名患者，其用rituximab來治療。在3-6個(gè)月的治療中，所有五名患者的機(jī)能都得到改善，且血清抗體滴度降低(Levine和Pestomk，Am.J.Neurol.521701-1704(1999))。
即使沒有特效療法，神經(jīng)病的疼痛通常也是可以控制的，諸如借助于鎮(zhèn)痛藥、疼痛藥療、三環(huán)抗抑郁藥、抗癲癇藥療、或神經(jīng)阻斷劑。
Sutton和Winer，Current Opinion in Pharmacology2/3291-295(June1，2002)指出血漿交換、靜脈內(nèi)免疫球蛋白和皮質(zhì)類固醇仍然是炎性神經(jīng)病治療的支柱。近來的試驗(yàn)表明將這些療法聯(lián)合起來與單一試劑治療相比并非顯著更為有效。由于開放式研究(open-label study)中的少數(shù)患者的治療，新的免疫療法和胞毒劑的有效性很難確定。
Lee等，Bone Marrow Transplantation30/153-56(2002)提示高劑量化療和自體外周血干細(xì)胞(PBSC)移植可能在因嚴(yán)重進(jìn)行性且治療抗性的未定性單克隆丙種球蛋白病(MGUS)繼發(fā)的周圍神經(jīng)病的治療中具有一定作用。Latov等，Neurology52A551(1999)披露RITUXAN在兩名與IgM單克隆丙種球蛋白病和抗MAG抗體活性相關(guān)的神經(jīng)病患者的治療中看起來是安全有效的。Canavan等，Neurology58/7(Suppl.3)A233(April2002)公開了RITUXAN與大多數(shù)接受治療的顯示與IgM自身抗體相關(guān)的多神經(jīng)病的患者持續(xù)的臨床改善相關(guān)。
關(guān)于用抗CD20抗體對(duì)干擾素-α抗性混合冷球蛋白血癥的單克隆抗體治療，Sansonno等，Blood101(10)3818-3826(May15 2003)披露了用RITUXAN治療周圍神經(jīng)病。
Hattori等，Brain122/3427-439(1999)評(píng)估了與丘-施二氏綜合征相關(guān)的周圍神經(jīng)病患者的臨床病理學(xué)特征，認(rèn)為CD20陽性B淋巴細(xì)胞只是偶爾見到。
Zaja等，Blood101(10)3827-3834(May15 2003)披露了在II型混合冷球蛋白血癥(MC)中RITUXAN可能是標(biāo)準(zhǔn)免疫抑制的安全有效的替代方案。證實(shí)RITUXAN對(duì)皮膚血管炎表現(xiàn)(潰瘍、紫癜、或蕁麻疹)、周圍神經(jīng)病的主觀癥狀、低級(jí)B細(xì)胞淋巴瘤、關(guān)節(jié)痛、和發(fā)燒是有效的。Zaidi等，Leukemia and Lymphoma45/4777-780(2004)公開了用RITUXAN成功治療了淋巴瘤樣肉芽腫(LYG)，它是罕見的淋巴增生性紊亂，第一年的死亡率接近60％，涉及肺、肝、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。然而，Trojan等，Annals ofOncology13/5802-805(2002)披露了RITUXAN對(duì)于因神經(jīng)淋巴瘤病而患有周圍神經(jīng)病的患者看起來是無效的。在嵌入式PET-CT系統(tǒng)上實(shí)施的融合PET-CT成像顯示，多發(fā)性小結(jié)節(jié)病變沿著相應(yīng)于轉(zhuǎn)化B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤早期復(fù)發(fā)的周圍神經(jīng)蔓延。
Binstadt等，Journal of pediatrics143/5598-604(November2003)斷定RITUXAN在難以用傳統(tǒng)免疫抑制藥療治療的多系統(tǒng)自身免疫性疾病的四名小兒患者中是安全有效的，其中每個(gè)都與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有關(guān)。一名自身免疫性血細(xì)胞減少癥和自身免疫性CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者其血細(xì)胞減少癥已經(jīng)解決，神經(jīng)學(xué)癥狀有了顯著改善；報(bào)道說該患者目前不再接受免疫抑制藥療。兩名具有淋巴漿細(xì)胞性結(jié)腸炎、肺結(jié)節(jié)和CNS疾病的半同胞其癥狀已經(jīng)改善。第四名患因原發(fā)性抗磷脂抗體綜合征而繼發(fā)舞蹈病和癲癇的患者在精巧性和總運(yùn)動(dòng)機(jī)能上已得到改善并且癲癇發(fā)作頻率降低。Saito等，Lupus12/10798-800(2003)披露RITUXAN可用于與高活性B淋巴細(xì)胞相關(guān)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)牽涉的難治性狼瘡腎炎和CNS患者的治療。
本領(lǐng)域需要更多的藥物以治療各種病癥，諸如多軟骨炎(polychondritis)和多發(fā)性單神經(jīng)炎(mononeuritis multiplex)。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明正如所要求的。具體而言，本發(fā)明在第一個(gè)方面提供了治療哺乳動(dòng)物中的多軟骨炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的結(jié)合CD20的抗體。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體未與另一分子偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體已與另一分子偶聯(lián)，例如胞毒劑，諸如放射性化合物，如Y2B8或131I-B1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包括rituximab或人源化2H7。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化2H7包括SEQ ID NO2和8中的可變區(qū)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人源化2H7包括具有改變N100A或D56A、N100A的SEQ ID NO8中的重鏈可變區(qū)和具有改變M32L、S92A、或M32L、S92A的SEQ ID NO2中的輕鏈可變區(qū)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化2H7包括SEQ ID NO30的輕鏈可變區(qū)(VL)序列和SEQ ID NO8的重鏈可變區(qū)(VH)序列，其中所述抗體進(jìn)一步包含VH-CDR2中的氨基酸替代D56A，且VH-CDR3中的N100用Y或W替代，更優(yōu)選所述抗體包括SEQID NO31的v511輕鏈序列和SEQ ID NO32的重鏈序列。
優(yōu)選以約20mg/m2至約250mg/m2所述抗體的劑量的哺乳動(dòng)物施用所述抗體，更優(yōu)選約50mg/m2至約200mg/m2。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括施用初始劑量的抗體，然后施用后續(xù)劑量，其中后續(xù)劑量中抗體的mg/m2劑量大于初始劑量中抗體的mg/m2劑量。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下施用所述抗體。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法本質(zhì)上由對(duì)哺乳動(dòng)物施用所述抗體組成。
在另一個(gè)優(yōu)選方面，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的免疫抑制劑、止痛劑、或化療劑。
在更多實(shí)施方案中，如果是治療多軟骨炎，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的非類固醇抗炎藥、類固醇、或免疫抑制劑諸如甲氨蝶呤(methotrexate)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、氨苯砜(dapsone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、青霉胺(penicillamine)或環(huán)孢霉素(cyclosporine)。如果是治療多發(fā)性單神經(jīng)炎，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的止痛劑、類固醇、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、血漿交換、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、環(huán)孢霉素、或霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)。
在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括容器和裝在容器中的組合物的制品，其中所述組合物包含結(jié)合CD20的抗體，且還包括指導(dǎo)用戶使用所述組合物以治療哺乳動(dòng)物中的多軟骨炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎的包裝插頁。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制品還包括裝有除所述抗體之外用于治療的藥劑的容器，且還包括有關(guān)用該藥劑治療哺乳動(dòng)物的說明書。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A為比較鼠2H7(SEQ ID NO1)、人源化2H7.v16變體(SEQ IDNO2)、和人κ輕鏈亞組I(SEQ ID NO3)每種的輕鏈可變區(qū)(VL)氨基酸序列的序列對(duì)比。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下CDR1(SEQ ID NO4)、CDR2(SEQ ID NO5)、及CDR3(SEQ ID NO6)。
圖1B為比較鼠2H7(SEQ ID NO7)、人源化2H7.v16變體(SEQ IDNO8)、和人重鏈亞組III共有序列(SEQ ID NO9)每種的重鏈可變區(qū)(VH)氨基酸序列的序列對(duì)比。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDR1(SEQ IDNO10)、CDR2(SEQ ID NO11)、及CDR3(SEQ IDNO12)。
圖1A和圖1B中，每條鏈中的CDR1、CDR2和CDR3都包括在括號(hào)內(nèi)，側(cè)翼為框架區(qū)FR1-FR4，如圖所示。2H7指鼠2H7抗體。兩行序列之間的星號(hào)指示兩種序列之間不同的位置。按照Kabat等，《Sequences ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)為殘基編號(hào)，插入顯示為a、b、c、d、和e。
圖2顯示了用于構(gòu)建2H7Fab質(zhì)粒的噬菌粒pVX4(SEQ ID NO13{5′序列}和SEQ ID NO14{3′互補(bǔ)序列})的核苷酸序列(參見實(shí)施例1)，以及用于CDR移植的抗IFN-α人源化抗體的Fab的輕鏈(SEQ ID NO15)和重鏈(SEQID NO16)氨基酸序列。
圖3顯示了編碼嵌合2H7.v6.8Fab的表達(dá)質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ IDNO17{5′序列}和SEQ ID NO18{3′互補(bǔ)序列})。顯示了輕鏈(SEQ ID NO19)和重鏈(SEQ ID NO20)的氨基酸序列。
圖4顯示了質(zhì)粒pDR1的核苷酸序列(SEQ ID NO21；5391bp)，該質(zhì)粒用于如實(shí)施例1所述免疫球蛋白輕鏈的表達(dá)。pDR1包含編碼無關(guān)抗體，人源化抗CD3抗體輕鏈的序列(Shalaby等，J.Exp.Med.175217-225(1992))，其起始和終止密碼子以粗體和下劃線表示。
圖5顯示了質(zhì)粒pDR2的核苷酸序列(SEQ ID NO22；6135bp)，該質(zhì)粒用于如實(shí)施例1所述免疫球蛋白重鏈的表達(dá)。pDR2包含編碼無關(guān)抗體，人源化抗CD3抗體重鏈的序列(Shalaby等，同上)，其起始和終止密碼子以粗體和下劃線表示。
圖6A和6B顯示了2H7.v16的輕鏈氨基酸序列，其中圖6A顯示包含DIQ前最初19個(gè)氨基酸的完整輕鏈(SEQ NO23)，所述最初19個(gè)氨基酸為成熟多肽鏈中所沒有的分泌信號(hào)序列，圖6B顯示成熟多肽輕鏈(SEQ IDNO24)。
圖7A和7B顯示了2H7.v16的重鏈氨基酸序列，其中圖7A顯示包含EVQ前最初19個(gè)氨基酸的完整重鏈(SEQ ID NO25)，所述最初19個(gè)氨基酸為成熟多肽鏈中所沒有的分泌信號(hào)序列，圖7B顯示成熟多肽重鏈(SEQ IDNO26)。將圖1B中的VH序列(SEQ ID NO8)與完整重鏈序列進(jìn)行比對(duì)，人γ1恒定區(qū)來自SEQ ID NO25的氨基酸位置114-471。
圖8A和8B顯示了2H7.v31的重鏈氨基酸序列，其中圖8A顯示包含EVQ前最初19個(gè)氨基酸的完整重鏈(SEQ ID NO27)，所述最初19個(gè)氨基酸為成熟多肽鏈中不存在的分泌信號(hào)序列，圖8B顯示成熟多肽重鏈(SEQ IDNO28)。L鏈與2H7.v16的(參見圖6)相同。
圖9為概括從鼠2H7到直至v75的人源化型式亞組的氨基酸變化的流程圖。
圖10為比較人源化2H7.v16變體(SEQ ID NO2)和人源化2H7.v138變體(SEQ ID NO29)的輕鏈氨基酸序列的序列對(duì)比。
圖11為比較人源化2H7.v16變體(SEQ ID NO8)和人源化2H7.v138變體(SEQ ID NO30)的重鏈氨基酸序列的序列對(duì)比。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述I.定義“B細(xì)胞表面標(biāo)志”或“B細(xì)胞表面抗原”在本文中指在B細(xì)胞表面上表達(dá)、可用與其結(jié)合的拮抗劑靶向它的抗原。例示性B細(xì)胞表面標(biāo)志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白細(xì)胞表面標(biāo)志。(關(guān)于介紹參見《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等編，Academic Press，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B細(xì)胞表面標(biāo)志包括RP105、FcRH2、CD79A、C79B、B細(xì)胞CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA和239287_at。特別感興趣的B細(xì)胞表面標(biāo)志是與哺乳動(dòng)物的其它非B細(xì)胞組織相比，優(yōu)先在B細(xì)胞上表達(dá)，且可以在前體B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞上表達(dá)。
“CD20”抗原或“CD20”是在超過90％來自外周血或淋巴樣器官的B細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的約35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B細(xì)胞及惡性B細(xì)胞上，但在干細(xì)胞上不表達(dá)。文獻(xiàn)中CD20的其它名稱包括“B淋巴細(xì)胞限制型抗原”和“Bp35”。例如，Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，821766(1985)中介紹了CD20抗原。
“CD22”抗原或“CD22”，也稱為BL-CAM或Lyb8，是1型整合膜糖蛋白，分子量約130(減少的)至140kD(未減少的)。它表達(dá)于B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。CD22抗原在B細(xì)胞淋巴細(xì)胞分化的早期出現(xiàn)，大約在與CD19抗原相同的階段。不像其他的B細(xì)胞標(biāo)志，CD22膜表達(dá)限于成熟B細(xì)胞(CD22+)和漿細(xì)胞(CD22-)之間所包含的晚期分化階段。例如，Wilson等，J.Exp.Med.173137(1991)和Wilson等，J.Immunol.1505013(1993)中描述了CD22抗原。
“非惡性疾患”在本文中指多軟骨炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎，優(yōu)選多發(fā)性單神經(jīng)炎。另外，它可以是脊髓-視神經(jīng)(spino-optical)多發(fā)性硬化；尋常天皰瘡；丘-施二氏血管炎或綜合征(Churg-Strauss vasculitis or syndrome，CSS)；狼瘡腦炎(cerebritis)；狼瘡腎炎；皮膚系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；除哮喘外IgE介導(dǎo)的疾病，具體是變應(yīng)性鼻炎、過敏性、或特應(yīng)性皮炎；慢性神經(jīng)?。灰曅匝坳嚁?肌陣攣綜合征(opsoclonus-myoclonus syndrome)；肺泡蛋白沉積；鞏膜炎；微觀多脈管炎(microscopic polyangiitis)；瘤外綜合征(paraneoplasticsyndrome)，它是腫瘤產(chǎn)生的遠(yuǎn)程效應(yīng)，諸如高血鈣癥，但不包括朗-伊二氏(Lambert-Eaton)、貧血、或低血糖癥；Rasmussen氏腦炎；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)血管炎；離子通道病，它是具有與離子通道機(jī)能障礙相關(guān)的多種性質(zhì)的疾病，諸如癲癇、偏頭痛、心律不齊、肌肉疾患、耳聾、失明、周期性麻痹、以及CNS離子通道病，但不包括CNS炎性疾患；孤獨(dú)癥；或神經(jīng)病性、肌病性、或CNS結(jié)節(jié)病。
“多軟骨炎”在用于本文時(shí)意指任何多軟骨炎，包括復(fù)發(fā)性多軟骨炎、Von Meyenburg氏病、Meyenburg氏病或綜合征、Meyenburg Altherr Uehlinger綜合征、多軟骨病、Askenazy、Jaksch Wartenhorst、Meyenburg、或Von JakschWartenhorst綜合征、軟骨溶解性(chondrolytic)、彌漫性或復(fù)發(fā)性軟骨膜炎、軟骨軟化性關(guān)節(jié)炎、或全軟骨炎。
“多發(fā)性單神經(jīng)炎”在用于本文時(shí)描述以身體無關(guān)部分的幾種神經(jīng)所引起的炎癥為特征的疾患，即該神經(jīng)損傷涉及對(duì)至少兩個(gè)分開的神經(jīng)區(qū)域的隔離損傷。惡化時(shí)，它可變得更為分散且更不集中于特定區(qū)域，類似于多神經(jīng)病。此類疾病的癥狀可包括麻木、虛弱、灼痛(尤其是在晚上)、以及反射喪失。所述疼痛可能很嚴(yán)重并致殘。
“拮抗劑”指在結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志后破壞或消減哺乳動(dòng)物B細(xì)胞和/或干擾一種或多種B細(xì)胞功能(例如通過減少或阻止由B細(xì)胞引發(fā)的體液反應(yīng))的分子。優(yōu)選的是，拮抗劑能夠在用其治療的哺乳動(dòng)物中消減B細(xì)胞(即降低循環(huán)B細(xì)胞水平)。這種消減可通過各種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，諸如ADCC和/或CDC、抑制B細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)B細(xì)胞死亡(如通過凋亡)。本發(fā)明范圍內(nèi)的拮抗劑包括抗體、合成或天然序列肽、以及與B細(xì)胞標(biāo)志結(jié)合的小分子拮抗劑，任選與胞毒劑綴合或融合。優(yōu)選的拮抗劑包括抗體，即結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體，隨后促使靶細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞NK細(xì)胞只表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92，1991中第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利5,500,362或5,821,337中所描述的?？捎糜谶@類測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes等，PNAS(USA)，95652-656，1998中所公開的。
“人效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括PBMC、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于它們的胞質(zhì)域。激活受體FcγRIIA在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(見Daёron，Annu.Rev.Immunol.，15203-234，1997)。FcR的綜述見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-492，1991；Capel等，Immunomethods，425-34，1994；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.，126330-341，1995。本文中術(shù)語“FcR”涵蓋其它FcR，包括未來將會(huì)鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體FcRn，它負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等，J.Immunol.，117587，1976和Kim等，J.Immunol.，24249，1994)。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指在存在補(bǔ)體時(shí)分子溶解靶的能力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(如抗體)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202163，1996中所描述的。
“生長(zhǎng)抑制性”拮抗劑指那些阻止或減少表達(dá)拮抗劑所結(jié)合抗原的細(xì)胞增殖的拮抗劑。例如，拮抗劑可在體外和/或在體內(nèi)阻止或減少B細(xì)胞增殖。
“誘導(dǎo)凋亡”的拮抗劑指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)凋亡測(cè)定法諸如膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破裂和/或膜囊形成(稱作凋亡小體)的測(cè)定，誘導(dǎo)例如B細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡的拮抗劑。
術(shù)語“抗體”在本文中使用其最廣泛的含義，具體覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、以及抗體片段，只要它們展示所需生物學(xué)活性。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
為了本文的目的，“完整抗體”指包含重鏈和輕鏈可變區(qū)以及Fc區(qū)的抗體。
“天然抗體”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的約150,000道爾頓的異型四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在具有不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，接著是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，而另一端是一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成了界面。
術(shù)語“可變”指可變區(qū)中的某些部分在不同抗體的序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)都包含四個(gè)FR，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成部分β-折疊結(jié)構(gòu)的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近地保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(見Kabat等，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示出多種效應(yīng)子功能，諸如ADCC中抗體的參與。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和殘余“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab′)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且仍能使抗原交聯(lián)。
“Fv”是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這個(gè)區(qū)域由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在VH-VL二聚體表面確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHl)。Fab’片段因在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab′)2抗體片段最初是作為成對(duì)Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。
來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作κ和λ。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將抗體歸入不同的類別。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。將與不同抗體類別對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作α、δ、ε、γ和μ。各種類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。
術(shù)語“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。
通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448，1993。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極少量存在的可能的天然存在變體之外。單克隆抗體是高度特異的，即針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。另外，與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在可以通過雜交瘤培養(yǎng)合成它們而不受其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示抗體由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature，256495(1975)描述的雜交瘤法來制備，或者可通過重組DNA法來制備(參見例如美國(guó)專利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可使用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)中描述的技術(shù)由噬菌體抗體庫(kù)分離。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及這類抗體的片段，只要它們展示所需生物學(xué)活性(美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855，1984)。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長(zhǎng)類(如舊大陸猴類(Old World Monkey)，諸如狒狒、恒河猴或獼猴)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列以及人恒定區(qū)序列的“靈長(zhǎng)類化(primatized)”抗體(美國(guó)專利5,693,780)。
非人(如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體將包含基本上不少于至少一個(gè)、通常兩個(gè)這樣的可變區(qū)，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones等，Nature，321522-525，1986；Riechmann等，Nature，332323-329，1988；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596，1992。
術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或來自“高變環(huán)”的殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重鏈可變區(qū)中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917，1987)?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指本文定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“結(jié)合”目的抗原例如B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑指以足夠親和力和/或親合力結(jié)合該抗原從而可作為治療劑用于靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞的抗體。
結(jié)合CD19抗原的抗體的例子包括Hekman等，Cancer Immunol.Immunother.32364-372(1991)和Vlasveld等，Cancer Immunol.Immunother.4037-47(1995)中的抗CD19抗體；和Kiesel等，Leukemia Research II，121119(1987)中的B4抗體。
“結(jié)合CD20的抗體”指以足夠親和力和/或親合力結(jié)合CD20抗原從而可作為治療劑用于靶向表達(dá)或過表達(dá)CD20抗原的細(xì)胞的抗體。這類抗體的例子包括現(xiàn)在稱作“rituximab”(“RITUXAN”)的“C2B8”(美國(guó)專利5,736,137)；稱作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN的釔[90]標(biāo)記2B8鼠抗體(美國(guó)專利5,736,137)；鼠IgG2a“B1”，也稱作“Tositumomab”，任選用131I標(biāo)記以產(chǎn)生“131I-B1”抗體(碘I131Tositumomab，BEXXARTM)(美國(guó)專利5,595,721)；鼠單克隆抗體“1F5″(Press等，Blood，69(2)584-591，1987和“框架修補(bǔ)”或人源化1F5(WO03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗體(美國(guó)專利5,677,180)；人源化2H7；huMax-CD20(Genmab，丹麥)；AME-133(Applied Molecular Evolution)；和可從國(guó)際白細(xì)胞分類研究組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得的單克隆抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等，《Leukocyte Typing III》，McMichael編，第440頁，牛津大學(xué)出版社，1987)。
術(shù)語“rituximab”或“RITUXAN”在本文中指針對(duì)CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國(guó)專利5,736,137中稱作“C2B8”，包括其保持結(jié)合CD20能力的片段。
純粹為了本文的目的，“人源化2H7”指結(jié)合人CD20的人源化抗體，或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體在體內(nèi)有效損耗靈長(zhǎng)類B細(xì)胞，所述抗體在重鏈可變區(qū)(VH)中至少包含來自抗人CD20抗體的CDR3序列SEQ IDNO12(圖1B)和基本上人重鏈亞組III(VHIII)的人共有框架(FR)殘基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種抗體還包含重鏈CDR1序列SEQ ID NO10和CDR2序列SEQ ID NO11，更優(yōu)選還包含輕鏈CDR1序列SEQ ID NO4、CDR2序列SEQ ID NO5、CDR3序列SEQ ID NO6和基本上人輕鏈κ亞組I(VκI)的人共有框架(FR)殘基，其中VH區(qū)可連接人IgG鏈恒定區(qū)，其中該區(qū)可以是例如IgG1或IgG3。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這類抗體包含VH序列SEQ ID NO8(v16，如圖1B所示)，任選還包含VL序列SEQ ID NO2(v16，如圖1A所示)，它可在重鏈中具有氨基酸替代D56A和N100A以及在輕鏈中具有S92A(v.96)。一種更優(yōu)選的這類抗體是2H7.v16，其分別具有輕鏈和重鏈氨基酸序列SEQ ID NO24和26，如圖6B和7B所示。另一種優(yōu)選的實(shí)施方案是所述抗體為分別具有輕鏈和重鏈氨基酸序列SEQ IDNO24和28的2H7.v31，如圖6B和8B所示。本文的抗體還可在Fc區(qū)中包含至少一個(gè)提高ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，諸如其中氨基酸替代是S298A/E333A/K334A的抗體，更優(yōu)選具有重鏈氨基酸序列SEQ IDNO28的2H7.v31(如圖8B所示)。任何這些抗體都還可在Fc區(qū)中包含至少一個(gè)降低CDC活性的氨基酸替代，例如至少包含替代K322A。優(yōu)選的是，這類抗體為與RITUXAN相比具有ADCC活性提高至少10倍的2H7.v114或2H7.v115。
優(yōu)選的人源化2H7為這樣的完整抗體或抗體片段，其包含輕鏈可變區(qū)序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO2)；和重鏈可變區(qū)序列EVQLVESGGGLVQPGGSLILSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO8)。
當(dāng)人源化2H7抗體是完整抗體時(shí)，優(yōu)選地是它包含輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTHLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO24)；和重鏈氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO26)或重鏈氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGIAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO28)。
“分離的”拮抗劑指已經(jīng)由其天然環(huán)境的一種成分鑒別和分離和/或回收的拮抗劑。其天然環(huán)境的污染成分指將會(huì)干擾拮抗劑的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將拮抗劑純化至(1)根據(jù)Lowry方法的測(cè)定，拮抗劑重量超過95％，最優(yōu)選重量超過99％，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式蛋白質(zhì)測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)通過使用考馬斯亮藍(lán)或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達(dá)到同質(zhì)。既然拮抗劑的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的拮抗劑包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位拮抗劑。然而，通常，分離的拮抗劑將通過至少一個(gè)純化步驟來制備。
對(duì)于治療目的來說，“哺乳動(dòng)物”指歸入哺乳類的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選的是，哺乳動(dòng)物是人。
“治療”指治療性處理和預(yù)防性措施二者。需要治療的受試者包括已經(jīng)患有疾病或紊亂的受試者以及要預(yù)防疾病或紊亂的受試者。因此，哺乳動(dòng)物可能已經(jīng)診斷為患有疾病或紊亂或者可能有患上疾病或紊亂的傾向或易感性。
表述“有效量”指有效預(yù)防、改善或治療所討論自身免疫病的拮抗劑數(shù)量。
術(shù)語“免疫抑制劑”在本文中用于輔助治療時(shí)指承擔(dān)抑制或掩蓋本文所治療哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。這類試劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國(guó)專利4,665,077)；霉酚酸酯諸如CELLCEPT；硫唑嘌呤(IMURAN，AZASAN/6-巰基嘌呤；溴隱亭(bromocryptine)；達(dá)扎唑(danazol)；氨苯砜；戊二醛(如美國(guó)專利4,120,649中所述，它掩蓋MHC抗原)；針對(duì)MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素(cyclosporin)A；類固醇，諸如皮質(zhì)類固醇和糖皮質(zhì)類固醇，如強(qiáng)的松(prednisone)、強(qiáng)的松龍(prednisolone)諸如PEDIAPRED(強(qiáng)的松龍磷酸鈉)或ORAPRED(強(qiáng)的松龍磷酸鈉口服液)、甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；甲氨蝶呤(口服或皮下)(RHEUMATREX，TREXALLTM)；羥氯喹(hydroxycloroquine)/氯喹(chloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗體包括抗干擾素-γ、-β、或-α抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫粘附素(ENBREL依那西普(etanercept))、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；多克隆或泛T抗體(pan-T antibodies)、或單克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶(streptodornase)；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T細(xì)胞受體(Cohen等，美國(guó)專利5,114,721)；T細(xì)胞受體片段(Offner等，Science，251430-432(1991)；WO1990/11294；Ianeway，Nature341482(1989)；和WO1991/01133)；T細(xì)胞受體抗體(EP340,109)諸如T10B9；環(huán)磷酰胺(CYTOXAN)；氨苯砜；青霉胺(CUPRIMINE)；血漿交換；或靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)。這些可以單獨(dú)使用，或者彼此組合，特別是類固醇與另一種免疫抑制劑的組合，或者在這種組合之后使用非類固醇試劑的維持劑量以減少對(duì)類固醇的需求。
“止痛劑”指發(fā)揮抑制或遏制疼痛作用的藥物，諸如非處方鎮(zhèn)痛藥或控制神經(jīng)痛的處方疼痛藥物，諸如非類固醇抗炎藥(NSAID)，包括布洛芬(ibuprofen)(MOTRIN)、萘普生(naproxen)(NAPROSYN)、以及用于減少可能發(fā)生的刺痛的其他多種藥物，包括抗驚厥藥(加巴噴丁(gabapentin)、苯妥英(phenytoin)、卡馬西平(carbamazepine))或三環(huán)抗抑郁藥。具體的例子包括醋氨酚(acetaminophen)、阿斯匹林、阿米替林(amitriptyline)(ELAVIL)、卡馬西平(TEGRETOL)、苯妥英(phenyltoin)(DILANTIN)、加巴噴丁(NEURONTIN)、(E)-N-香草基-8-甲基6-壬酰胺(noneamid)(CAPSAICIN)、或神經(jīng)阻斷劑。
術(shù)語“胞毒劑”在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或促使細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意欲包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素或其片段。
“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎T如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)膦酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯，諸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶類，諸如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替哌；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物拓?fù)涮婵?topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲類，諸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司??；抗生素，諸如烯二炔類(enediyne)抗生素(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(參見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186，1994))；蒽環(huán)類(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸鹽(bisphosphonate)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素、放線菌素、氨茴霉素、氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、carabicin、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素諸如絲裂霉素C、霉酚酸、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、羥甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美坦西醇(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖復(fù)合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；類紫杉醇類(taxoids)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANETM紫杉醇不含克列莫佛(Cremophor)的清蛋白改造納米顆粒劑型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)、和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-PoulencRorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；Gemzar吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異磷酰胺；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿(vincristine)；Navelbine長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質(zhì)的制藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。
該定義還包括起調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素藥，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲奧昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那斯酮(onapristone)、和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)、和ARIMIDEX阿納托唑(anastrozole)；及抗雄激素，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘附(abherant)細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，諸如VEGF表達(dá)抑制劑(如ANGIOZYME核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗、和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑；ABARELIXrmRH；及任何上述藥劑的制藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。
術(shù)語“細(xì)胞因子”指由一種細(xì)胞群釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。這類細(xì)胞因子的例子是淋巴因子；單核因子；白介素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時(shí)，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。
術(shù)語“激素”指多肽激素，通常由具有導(dǎo)管的腺器官分泌。激素包括例如生長(zhǎng)激素，諸如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；促乳素；胎盤催乳激素；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；Mullerian氏抑制性物質(zhì)；及血小板生成素。
術(shù)語“生長(zhǎng)因子”指促進(jìn)生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，包括例如肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF-β；血小板衍生生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor)；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-γ；及集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)、和粒細(xì)胞CSF(G-CSF)。
術(shù)語“整聯(lián)蛋白”指容許細(xì)胞結(jié)合和應(yīng)答胞外基質(zhì)且牽涉多種細(xì)胞功能諸如傷口愈合、細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞歸巢和凋亡的受體蛋白質(zhì)。它們是牽涉細(xì)胞-胞外基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的細(xì)胞黏附受體大家族的一部分。功能性整聯(lián)蛋白由非共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)跨膜糖蛋白亞基組成，稱為α和β。α亞基彼此都享有一定同源性，β亞基也是如此。受體總是含有一條α鏈和一條β鏈。例子包括α6β1、α3β1和α7β1。
術(shù)語“前體藥物”在用于本申請(qǐng)時(shí)指與母藥(parent drug)相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降那绑w和衍生物形式藥用活性物質(zhì)。參見如Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，Biochemical Society Transactions 14，375-382，615th Meeting Belfast，1986和Stella等，“ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt等編，247-267，Humana Press，1985。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽(酯)前體藥物、含硫代磷酸鹽(酯)前體藥物、含硫酸鹽(酯)前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含β-內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿甘前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。
“脂質(zhì)體”為由各種類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，可用于給哺乳動(dòng)物投遞藥物(諸如本文中披露的拮抗劑和任選的化療劑)的小囊泡。與生物膜的脂質(zhì)排列相似，脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式。
術(shù)語“包裝插頁”用于指通常包括在治療產(chǎn)品的商品包裝中的說明書，它們包含有關(guān)涉及這類治療產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)征、用途、劑量、施藥、禁忌癥和/或警告的信息。
II.拮抗劑的生產(chǎn)本發(fā)明的方法和產(chǎn)品使用或摻入了結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑。因此，本文將描述用于生成這類拮抗劑的方法。
用于生成或篩選拮抗劑的B細(xì)胞表面標(biāo)志可以是例如包含所需表位的抗原或其部分的可溶形式?；蛘?另外，在其細(xì)胞表面表達(dá)B細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞也可用于生成或篩選拮抗劑。可用于生成拮抗劑的其它形式的B細(xì)胞表面標(biāo)志對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見的。優(yōu)選的是，B細(xì)胞表面標(biāo)志是CD19或CD20抗原。
雖然優(yōu)選的拮抗劑是抗體，本文還設(shè)想了除抗體外的拮抗劑。例如，拮抗劑可包括任選融合或綴合有胞毒劑(諸如本文中描述的那些)的小分子拮抗劑?？舍槍?duì)本文感興趣的B細(xì)胞表面標(biāo)志篩選小分子文庫(kù)，以鑒定結(jié)合該抗原的小分子。還可對(duì)小分子篩選其拮抗特性和/或與胞毒劑綴合。
拮抗劑還可以是通過理性設(shè)計(jì)或通過噬菌體展示產(chǎn)生的肽(參見如1998年8月13日出版的WO1998/35036)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的分子可以是根據(jù)抗體的CDR設(shè)計(jì)的“CDR模擬物”或抗體類似物。雖然這類肽自身可具有拮抗性，但任選可將該肽與胞毒劑融合，以增加或增強(qiáng)肽的拮抗特性。
下面的描述例示了用于生產(chǎn)依照本發(fā)明使用的抗體拮抗劑的技術(shù)。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來生成。使用雙功能劑或衍生劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關(guān)抗原與在待免疫物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)綴合可能是有用的，如匙孔血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過將例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或綴合物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，并將溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，由此將動(dòng)物針對(duì)抗原、免疫原性綴合物、或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，通過多個(gè)部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或綴合物初始量的1/5-1/10對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗體效價(jià)。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化直到效價(jià)達(dá)到穩(wěn)定。優(yōu)選的是，將動(dòng)物用相同抗原的但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑綴合得到的綴合物進(jìn)行強(qiáng)化。綴合物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。此外，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以很少量存在的可能的天然存在突變之外。如此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征即不是分立抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature256495，1975描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國(guó)專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，諸如倉(cāng)鼠，以引發(fā)生成或能夠生成特異結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)的抗體的淋巴細(xì)胞。或者，可在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，《MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，那么雜交瘤培養(yǎng)基通常將含有阻止缺乏HGPRT的細(xì)胞生長(zhǎng)的次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持選擇的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如可從Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California USA)獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生系，及可從American Type Culture Collection(Manassas，Virginia USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。用于生成人源單克隆抗體的人源骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.1333001，1984；Brodeur等，《Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications》，pp.51-63，Marcel Dekker Inc.，New York，1987)。
可對(duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基測(cè)定針對(duì)抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson等，Anal.Biochem.107220，1980的Scatchard分析來測(cè)定。
在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，pp.59-103，Academic Press，1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。
可通過常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-SEPHAROSETM瓊脂糖層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分離。
也可重組生產(chǎn)單克隆抗體。編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規(guī)流程分離并測(cè)序(例如通過使用能夠特異結(jié)合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細(xì)胞用作這類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，諸如不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5256-262，1993和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188，1992。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從使用McCafferty等，Nature348552-554，1990中描述的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體文庫(kù)中分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature352624-628，1991和Marks等，J.Mol.Biol.222581-597，1991分別描述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠源和人源抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology10779-783，1992)，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.212265-2266，1993)，生成高親和力(nM范圍)的人源抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的常規(guī)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替換方法。
還可以修飾DNA，例如通過替代即用人源重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源鼠源序列(美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA816851，1984)，或通過共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列。
通常，用這類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區(qū)，或者用它們替代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，它包含對(duì)一種抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已經(jīng)描述了用于將非人源抗體人源化的方法。優(yōu)選的是，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人源氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化可本質(zhì)上依照Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones等，Nature321522-525，1986；Riechmann等，Nature332323-327，1988；Verhoeyen等，Science2391534-1536，1988)，通過用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人源抗體序列。因此，這類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567)，其中基本上少于整個(gè)人源可變區(qū)用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是其中一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基所替代的人源抗體。
用于制備人源化抗體的人源可變區(qū)的選擇，包括輕鏈和重鏈，對(duì)于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區(qū)序列對(duì)已知的人源可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人源序列作為人源化抗體的人源框架區(qū)(FR)(Sims等，J.Immunol.1512296，1993；Chothia等，J.Mol.Biol.196901，1987)。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈可變區(qū)亞組的所有人源抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894285，1992；Presta等，J.Immunol.1512623，1993)。
更為重要的是，抗體在人源化后保持對(duì)抗原的高親和力以及其它有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。通?？色@得三維免疫球蛋白模型，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力提高。通常，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
(iv)人源抗體作為人源化的替代方法，可生成人源抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況中能夠在免疫后生成人源抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在這類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人源抗體。參見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902551，1993；Jakobovits等，Nature362255-258，1993；Bruggermann等，Year in Immuno.733，1993；和美國(guó)專利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature348552-553，1990)可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因全集生成人源抗體和抗體片段。根據(jù)這一技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因的讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行；有關(guān)綜述參見例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology3564-571，1993。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature352624-628，1991從衍生自免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫(kù)分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體。可本質(zhì)上依照Marks等，J.Mol.Biol.222581-597，1991或Griffith等，EMBOJ.12725-734，1993描述的技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集，并分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國(guó)專利5,565,332和5,573,905。
還可通過體外激活B細(xì)胞(參見美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)來生成人源抗體。
(v)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto等，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods24107-117，1992和Brennan等，Science22981，1985)。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體文庫(kù)分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab′-SH片段，并通過化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology10163-167，1992)。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab′)2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)熟練技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO1993/16185；美國(guó)專利5,571,894；和美國(guó)專利5,587,458。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如美國(guó)專利5,641,870中描述的抗體。這類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的兩種不同表位。其它這類抗體可結(jié)合第一B細(xì)胞表面標(biāo)志并進(jìn)一步結(jié)合第二B細(xì)胞表面標(biāo)志?；蛘?，抗B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合臂可與結(jié)合白細(xì)胞上引發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcγR)，諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂組合，使得細(xì)胞防御機(jī)制集中于B細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于將胞毒劑定位于B細(xì)胞。這些抗體擁有B細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)合臂及結(jié)合胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻毒素A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。
用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的常規(guī)生成是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature305537-539，1983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadromas))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化非常麻煩，且產(chǎn)量低。WO1993/08829和Traunecker等，EMBO J.103655-3659，1991中公開了類似的流程。
根據(jù)一種不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比率沒有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。
在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)促進(jìn)所需雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法公開于WO1994/04690。關(guān)于制備雙特異性抗體的其它細(xì)節(jié)參見例如Suresh等，Methodsin Enzymology 121210，1986。
根據(jù)美國(guó)專利5,731,168中描述的另一種方法，可改造抗體分子對(duì)之間的界面，將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異型二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分CH3抗體恒定區(qū)。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生針對(duì)大側(cè)鏈的相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同型二聚體提高異型二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源綴合”抗體。例如，異源綴合物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，這類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980)，及用于治療HIV感染(WO1991/00360、WO1992/200373和EP03089)。可使用任何便利的交聯(lián)方法制備異源綴合抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域所熟知的，且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于例如美國(guó)專利4,676,980。
文獻(xiàn)中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)鍵合制備雙特異性抗體。Brennan等，Science 22981，1985描述了通過蛋白水解切割完整抗體生成F(ab′)2片段的流程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉時(shí)還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab′-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab′-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
近來的發(fā)展推動(dòng)了從大腸桿菌直接回收Fab′-SH片段，可對(duì)其進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)而形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.175217-225，1992描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的生成。各Fab′片段分別從大腸桿菌分泌并進(jìn)行體外定向化學(xué)偶聯(lián)而形成雙特異性抗體。由此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及引發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)人乳瘤靶的溶解活性。
還描述了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)出雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5)1547-1553，1992。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab′部分連接。抗體同型二聚體在鉸鏈區(qū)還原，形成單體，然后重新氧化，形成抗體異型二聚體。該方法還可用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448，1993描述的“雙抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替換機(jī)制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，該接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域不得不與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J.Immunol.1525368，1994。
設(shè)想了具有超過兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760，1991。
III.拮抗劑的綴合物和其他修飾任選將本文方法中所使用的或本文產(chǎn)品中所包含的拮抗劑與胞毒劑綴合。
上文已經(jīng)描述了可用于生成這類拮抗劑-胞毒劑綴合物的化療劑。
本文還設(shè)想了拮抗劑與一種或多種小分子毒素形成的綴合物，諸如加利車霉素、美登素(美國(guó)專利5,208,020)、單端孢菌素和CC1065。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將拮抗劑與一個(gè)和多個(gè)美登素分子綴合(例如每個(gè)拮抗劑分子綴合約1個(gè)至約10個(gè)美登素分子)。例如可將美登素轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，后者可還原為May-SH3并與經(jīng)修飾拮抗劑反應(yīng)(Chari等，Cancer Research52127-131，1992)產(chǎn)生美登木素生物堿-拮抗劑綴合物。
或者，將拮抗劑與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子綴合。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG和θI1(Hinman等，Cancer Research533336-3342，1993和Lode等，Cancer Research582925-2928，1998)。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(neomycin)和單端孢菌毒素類(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日出版的WO1993/21232。
本發(fā)明還設(shè)想了與具有核酸水解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)綴合的拮抗劑。
有多種放射性同位素可用于生成放射性綴合拮抗劑。例子包括At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素。
可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備拮抗劑和胞毒劑的綴合物，諸如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己胺-1-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺酯、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等，Science2381098，1987中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與拮抗劑綴合的例示性螯合劑。
參見WO1994/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research52127-131，1992)。
或者，可通過例如重組技術(shù)或肽合成法來制備包含拮抗劑和胞毒劑的融合蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將拮抗劑與“受體”(諸如鏈霉親合素)綴合，用于腫瘤的預(yù)定位，其中對(duì)患者施用拮抗劑-受體綴合物，隨后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的綴合物，然后施用與胞毒劑(如放射性核苷酸)綴合的“配體”(例如親合素)。
還可將本發(fā)明的拮抗劑與前體藥物活化酶綴合，后者將前體藥物(如肽基化療劑，參見WO1981/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥。參見例如WO1988/07378和美國(guó)專利4,975,278。
這類綴合物的酶成分包括能夠以這樣一種方式作用于前體藥物從而將其轉(zhuǎn)化為更具活性的細(xì)胞毒性形式的任何酶。
可用于本發(fā)明方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；可將無毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸替代的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物切割酶類，諸如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；及可將在其氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘?，可使用具有酶活性的抗體，本領(lǐng)域也稱作“抗體酶”，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(參見例如Massey，Nature328457-458，1987)?？扇绫疚乃鲋苽滢卓箘?抗體酶綴合物，用于將抗體酶投遞至腫瘤細(xì)胞群。
可通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將本發(fā)明的酶與拮抗劑共價(jià)結(jié)合，諸如使用上文討論的異雙功能交聯(lián)劑?；蛘撸墒褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建包含與本發(fā)明酶的至少功能活性部分連接的本發(fā)明拮抗劑的至少抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見例如Neuberger等，Nature312604-608，1984)。
本文還設(shè)想了拮抗劑的其它修飾。例如，可將拮抗劑與多種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種連接，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
本文公開的拮抗劑還可配制成脂質(zhì)體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法制備包含拮抗劑的脂質(zhì)體，諸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688，1985；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774030，1980；美國(guó)專利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日出版的WO1997/38731中所述。美國(guó)專利5,013,556中公開了具有延長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體。
特別有用的脂質(zhì)體可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)法生成。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器，產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。可如Martin等，J.Biol.Chem.257286-288，1982中所述，將本發(fā)明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體綴合。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見Gabizon等，J.NationalCancerInst.81(19)1484，1989。
設(shè)想了本文描述的蛋白質(zhì)或肽拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)拮抗劑的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。拮抗劑的氨基酸序列變體可通過將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円朕卓箘┖怂峄蛲ㄟ^肽合成法來制備。這類修飾包括例如拮抗劑氨基酸序列中的殘基刪除、和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有所需特性，可進(jìn)行刪除、插入和替代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可能改變拮抗劑的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
可用于鑒定拮抗劑中作為優(yōu)選突變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱作“丙氨酸掃描誘變”，由Cunningham和Wells，Science2441081-1085，1989描述。這里鑒定了一個(gè)殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選的是丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲對(duì)替代顯示功能敏感性的氨基酸位置。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點(diǎn)處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對(duì)表達(dá)的拮抗劑變體篩選所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基至包含一百個(gè)或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或與細(xì)胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括在拮抗劑N-或C-末端融合酶或提高拮抗劑的血清半衰期的多肽。
這些變體在拮抗劑分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用不同殘基替代。最感興趣在抗體拮抗劑中進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也設(shè)想了FR改變。保守替代在表1中顯示為“優(yōu)選替代”。如果這類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，那么可以引入表1中稱為“例示替代”的更多實(shí)質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸類別的進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。
表1
對(duì)拮抗劑生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾可通過選擇在保持以下幾個(gè)方面的效果上顯著不同的替代來完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共有的側(cè)鏈特性，將天然存在的殘基分為以下各組(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性的cys、ser、thr；(3)酸性的asp、glu；(4)堿性的asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈取向的殘基gly、pro；和(6)芳香族的trp、tyr、phe。
非保守替代必然用這些類別之一中的一個(gè)成員交換另一個(gè)類別的。
任何不涉及保持拮抗劑正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨酸，以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性和預(yù)防異常交聯(lián)。相反的，可向拮抗劑中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)拮抗劑是抗體片段諸如Fv片段時(shí))。
特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改進(jìn)的生物學(xué)特性。產(chǎn)生這類替代變體的一種便利方法是使用噬菌體展示進(jìn)行的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13的基因III產(chǎn)物的融合體。然后如本文所公開的對(duì)噬菌體展示變體篩選其生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變來鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。這類接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這類變體，如本文所述篩選該組變體，可選擇在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)。
拮抗劑的另一類氨基酸變體改變拮抗劑的原始糖基化樣式。改變意味著刪除在拮抗劑中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，和/或添加拮抗劑中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
多肽的糖基化典型的是N-連接的或O-連接的。N-連接是指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中這兩種三肽序列其中任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
向拮抗劑中添加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上文描述的三肽序列便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。這種改變還可通過向原始拮抗劑序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。
編碼拮抗劑氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對(duì)早期制備的變體或非變體形式拮抗劑進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變、和盒式誘變來制備。
可能希望在效應(yīng)物功能方面修飾本發(fā)明的拮抗劑，例如增強(qiáng)拮抗劑的ADCC和/或CDC。這可通過在抗體拮抗劑的Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代來實(shí)現(xiàn)。或者/另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和ADCC。參見Caron等，J.Exp.Med.1761191-1195，1992和Shopes，B.，J.Immunol.1482918-2922，1992。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體還可使用如Wolff等，CancerResearch532560-2565，1993中描述的異雙功能交聯(lián)劑制備?；蛘?，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，并因此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3219-230，1989。
為了提高拮抗劑的血清半衰期，可如例如美國(guó)專利5,739,277中所述將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入拮抗劑(尤其是抗體片段)。在用于本文時(shí)，術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。
IV.藥用制劑制備依照本發(fā)明使用的拮抗劑的治療用制劑，即將具有所需純度的拮抗劑與任選的制藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980)，以凍干制劑或水溶液的形式貯存?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無毒的，還包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。
例示性抗CD20抗體制劑描述于WO1998/56418。該出版物描述了一種液體多劑量制劑，其中包含40mg/mL rituximab、25mM醋酸鹽、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、和0.02％POLYSORBATETM20(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一種感興趣的抗CD20制劑在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL二水合檸檬酸鈉、0.7mg/mLPOLYSORBATETM80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)、和注射用無菌水pH6.5中包含10mg/mL rituximab。
適于皮下施用的凍干制劑描述于WO1997/04801。這類凍干制劑可用合適的稀釋劑復(fù)水成高蛋白質(zhì)濃度，且復(fù)水后的制劑可皮下施用于本文中待治療的哺乳動(dòng)物。
本文中的制劑還可包含所治療具體適應(yīng)癥所需的超過一種活性化合物，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的化合物。例如，可能還希望提供胞毒劑、化療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細(xì)胞的免疫抑制劑，諸如環(huán)孢菌素或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，例如結(jié)合LFA-1的抗體)。這類其它試劑的有效量取決于制劑中存在的拮抗劑的數(shù)量、疾病或紊亂或治療的類型、及上文討論的其它因素。這些通常以與上文所用相同的劑量和施藥路徑使用，或是迄今所用劑量的約1-99％。
活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中，分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。這類技術(shù)公開于《Remington′s PharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.編，1980。
可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有拮抗劑的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。
V.用拮抗劑治療將配制包含結(jié)合B細(xì)胞表面抗原的拮抗劑的組合物并配藥，以符合充分醫(yī)療實(shí)踐的形式施用。該上下文中所要考慮的因素包括正在治療的特定疾病或紊亂、正在治療的特定哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床癥狀、疾病或紊亂的病因、試劑的遞送位點(diǎn)、給藥方法、給藥計(jì)劃、以及醫(yī)學(xué)從業(yè)者所知的其它因素。所要施用的拮抗劑的治療學(xué)有效量將取決于這些考慮。包含結(jié)合B細(xì)胞表面抗原的拮抗劑的組合物將以與優(yōu)良醫(yī)學(xué)實(shí)踐相一致的形式進(jìn)行配制、服用和施用。在此內(nèi)容中考慮的因素包括治療的具體疾病或紊亂、治療的具體哺乳動(dòng)物、患者個(gè)體的臨床狀況、疾病或紊亂的起因、藥劑的投遞部位、施藥方法、施藥計(jì)劃以及醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。施用拮抗劑的有效量將由這類考慮事項(xiàng)決定。
作為一般性建議，腸胃外施用拮抗劑的每劑有效量范圍為約0.1至20mg/kg患者體重每天，所用拮抗劑的典型起始范圍在約2至10mg/kg范圍內(nèi)。
優(yōu)選的拮抗劑為抗體，例如諸如RITUXAN的抗體，沒有綴合胞毒劑。未綴合抗體的合適劑量為例如在約20mg/m2至約1000mg/m2范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體的劑量不同于目前對(duì)RITUXAN推薦的劑量。例如，可對(duì)患者施用一個(gè)或多個(gè)基本上小于375mg/m2抗體的劑量，例如所述劑量在約20mg/m2至約250mg/m2的范圍內(nèi)，例如約50mg/m2至200mg/m2。
另外，可施用一個(gè)或多個(gè)初始劑量的抗體，接下來施用一個(gè)或多個(gè)后續(xù)劑量，其中后續(xù)劑量中抗體的mg/m2劑量大于初始劑量中抗體的mg/m2劑量。例如，初始劑量可以在約20mg/m2至約250mg/m2的范圍內(nèi)(例如約50mg/m2至約200mg/m2)，后續(xù)劑量可以在約250mg/m2至約1000mg/m2的茫圍內(nèi)。
如上所述，然而，拮抗劑的這些建議量受制于大量治療學(xué)判斷。在選擇適當(dāng)劑量和計(jì)劃中的關(guān)鍵因素是如上所示獲得的結(jié)果。例如，對(duì)于治療發(fā)展中的和急性的疾病最初可能需要相對(duì)較高的劑量。為了獲得最有效的結(jié)果，根據(jù)疾病或紊亂，應(yīng)盡可能地在接近疾病或紊亂的最初征兆、診斷、表現(xiàn)、或發(fā)生時(shí)，或者在疾病或紊亂的消除過程中施用拮抗劑。
可以任何合適的手段施用拮抗劑，包括腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、吸入、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、和鼻內(nèi)以及，如果需要局部免疫抑制治療的話，損傷內(nèi)施用。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下施用。此外，拮抗劑可合適的通過脈沖輸注來施用，例如用遞減劑量的拮抗劑。優(yōu)選通過注射給予劑量給藥，最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于所述施用是短暫的還是長(zhǎng)期的。
可以與本文的拮抗劑一起施用一種或多種其它化合物，諸如胞毒劑、化療劑、免疫抑制劑、止痛劑、激素、整聯(lián)蛋白、生長(zhǎng)因子、和/或細(xì)胞因子，或者施行本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種其它療法。優(yōu)選的是，根據(jù)例如適應(yīng)癥的類型、適應(yīng)癥的程度或嚴(yán)重性、以及拮抗劑的類型，所施用的其它化合物是免疫抑制劑、止痛劑、或化療劑。
假如是治療多軟骨炎，諸如復(fù)發(fā)性多軟骨炎，如果癥狀不嚴(yán)重，則優(yōu)選所述其它化合物是非類固醇抗炎藥(NSAID)，包括布洛芬(MOTRIN)、萘普生(NAPROSYN)、或舒林酸(CLINORIL)，以控制炎癥。然而，通常需要可的松相關(guān)藥物，例如類固醇，諸如潑尼松和潑尼松龍。開始時(shí)高劑量的類固醇經(jīng)常是必需的，尤其是涉及眼睛或呼吸道時(shí)。另外，多數(shù)患者需要長(zhǎng)期使用類固醇。
可與拮抗劑聯(lián)合用于治療多軟骨炎的另一種優(yōu)選化合物是甲氨蝶呤(RHEUMATREX，TREXALLTM)，它已顯示出與類固醇聯(lián)合作為復(fù)發(fā)性多軟骨炎治療以及維持治療的前景。研究證明甲氨蝶呤能幫助降低類固醇需求。其它優(yōu)選化合物包括環(huán)磷酰胺(CYTOXAN)、氨苯砜、硫唑嘌呤(IMURAN，AZASAN)、青霉胺(CUPRIMINE)、環(huán)孢霉素(NEORAL，SANDIMMUNE)、以及這些藥物與類固醇的組合。
關(guān)于用另一種試劑治療多發(fā)性單神經(jīng)炎，如果不能獲得特效療法，通常可控制神經(jīng)病的疼痛。最簡(jiǎn)單的治療是非處方鎮(zhèn)痛藥，諸如醋氨酚(TYLENOL)、NSAID，諸如上文所述布洛芬、或阿斯匹林，接下來使用處方疼痛藥物。三環(huán)抗抑郁藥，諸如阿米替林(ELAVIL)和抗癲癇藥物，諸如卡馬西平(TEGRETOL)、苯妥英(DILANTIN)、或加巴噴丁(NEURONTIN)已用于減輕神經(jīng)病疼痛。負(fù)責(zé)紅辣椒發(fā)熱的化學(xué)藥品CAPSAICIN((E)-N-香草基-8-甲基-6-壬酰胺(noneamid))作為乳膏用于幫助減輕周圍神經(jīng)病疼痛。此外，神經(jīng)阻斷劑在減輕疼痛方面可能是有效的。用于治療周圍神經(jīng)病的其它優(yōu)選化合物包括自體PBSC移植、類固醇諸如皮質(zhì)類固醇包括其脈沖療法和潑尼松、潑尼松龍、以及甲基潑尼松龍包括其脈沖療法、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺(例如CYTOXAN)包括靜脈內(nèi)環(huán)磷酰胺脈沖療法、血漿交換或血漿去除術(shù)、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、環(huán)孢霉素諸如環(huán)孢菌素A、霉酚酸酯(例如CELLCEPT)、或化療劑(包括其高劑量)包括那些降低IgM濃度的，諸如FLUDARA(磷酸氟達(dá)拉濱)或LEUKERAN(苯丁酸氮芥)。用于該適應(yīng)癥的特別優(yōu)選的其它化合物為止痛劑、類固醇、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、血漿交換、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、環(huán)孢霉素、或霉酚酸酯。
聯(lián)合施用包括使用分開的制劑或單一的藥用制劑的共施用，以及以任一次序依序施用，其中優(yōu)選的是有一段時(shí)間所有兩種(或多種)活性劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。
除對(duì)患者施用蛋白質(zhì)拮抗劑外，本申請(qǐng)?jiān)O(shè)想通過基因療法來施用拮抗劑。這類編碼拮抗劑的核酸的施用涵蓋在表述“施用有效量的拮抗劑”中。關(guān)于使用基因療法產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體參見例如1996年3月14日出版的WO1996/07321。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者細(xì)胞，即體內(nèi)和回體(ex vivo)。對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要拮抗劑的部位將核酸直接注射到患者體內(nèi)。對(duì)于回體治療，采集患者細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過修飾的細(xì)胞或是直接施用于患者，或是例如裝入多孔膜內(nèi)并植入患者體內(nèi)(參見例如美國(guó)專利4,892,538和5,283,187)。有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至目的宿主的體外培養(yǎng)細(xì)胞還是體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在有些情況中，需要與核酸源一起提供靶向靶細(xì)胞的試劑，諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時(shí)，與胞吞作用相關(guān)細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝入，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、和靶向細(xì)胞內(nèi)定位和增加細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。例如，Wu等，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987和Wagner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，873410-3414，1990中描述了受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述參見Anderson等，Science，256808-813，1992。還可參見WO1993/25673及其引用的參考文獻(xiàn)。
VI.產(chǎn)品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了裝有可用于治療上文所述疾病或紊亂的物質(zhì)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包含一種容器及該容器上或與該容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可以用各種材料諸如玻璃或塑料制成。該容器裝有有效治療選擇的疾病或紊亂的組合物，且可具有無菌存取口(例如該容器可以是具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液包或小管)。所述組合物中的至少一種活性劑是結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)志的拮抗劑。所述標(biāo)簽或包裝插頁表明該組合物用于治療患有或易患自身免疫病的患者，諸如本文中所列舉的。所述產(chǎn)品還可包括第二容器，其中裝有制藥學(xué)可接受的稀釋緩沖劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和使用者觀點(diǎn)來看所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
下面的非限制性實(shí)施例闡明了本發(fā)明的更多細(xì)節(jié)。將說明書中所有引用的公開內(nèi)容明確收入本文作為參考。
實(shí)施例12H7抗CD20鼠單克隆抗體的人源化鼠抗人CD20抗體2H7(在本文中也稱為m2H7，m指鼠)的人源化是在一系列定點(diǎn)誘變步驟中實(shí)施的。已經(jīng)描述了鼠2H7抗體可變區(qū)序列和具有小鼠V和人C的嵌合2H7；參見例如美國(guó)專利5,846,818和6,204,023。通過將鼠2H7可變區(qū)的氨基酸序列(公開于美國(guó)專利5,846,818)與已知抗體的序列(Kabat等，《Sequences of proteins of immunological interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))相比較，鑒定了2H7的CDR殘基?；谛蛄懈咦冃?Kabat等，同上)確定了輕鏈和重鏈的CDR區(qū)，并分別顯示于圖1A和圖1B。利用合成的寡核苷酸(表2)，通過定點(diǎn)誘變(Kunkel，proc.Natl.Acad.Sci.82488-492(1985))將所有六個(gè)鼠2H7CDR區(qū)導(dǎo)入完整的人Fab框架中，所述框架對(duì)應(yīng)于質(zhì)粒pVX4(圖2)中所包含的共有序列VκI、VHIII(VLκ亞組I、VH亞組III)。
將噬菌粒pVX4(圖2)用于誘變以及在大腸桿菌中表達(dá)F(ab)。以pB0475(Cunningham等，Science2431330-1336(1989))的衍生物，噬菌粒pb0720為基礎(chǔ)，pVX4包含編碼人源化共有κ亞組I輕鏈(VLκI-CL)和人源化共有亞組III重鏈(VHIII-CHl)抗IFN-α(干擾素-α)抗體的DNA片段。pVX4還具有堿性磷酸酶啟動(dòng)子和Shine-Dalgamo序列，二者均衍生自先前描述的基于pUC119的質(zhì)粒，pAK2(Carter等，proc.Natl.Acad.Sci.USA894285(1992))。在編碼F(ab)輕鏈和重鏈的DNA之間導(dǎo)入唯一的Spel限制性位點(diǎn)。抗IFN-α重鏈和輕鏈二者的前23個(gè)氨基酸都是STII分泌信號(hào)序列(Chang等，Gene55189-196(1987))。
為了構(gòu)建2H7的CDR交換型(2H7.v2)，對(duì)pVX4的含脫氧尿苷模板實(shí)施定點(diǎn)誘變；將抗IFN-α的所有六個(gè)CDR都換成鼠2H7CDR。將所得分子稱為人源化2H7 2型(2H7.v2)，或2H7的“CDR交換型”；它具有m2H7CDR殘基，及圖1A和1B所示共有人FR殘基。將人源化2H7.v2用于進(jìn)一步人源化。
表2顯示了用于在重鏈和輕鏈中構(gòu)建每種鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苷酸序列。例如，CDR-H1寡核苷酸用于重建m2H7重鏈CDR1。CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別指重鏈CDR1、CDR2和CDR3；類似的，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3指每種輕鏈CDR。用兩種寡核苷酸CDR-H2A和CDR-H2B分兩步進(jìn)行CDR-H2中的替代。
表2用于在pVX4中將鼠2H7CDR的CDR交換體構(gòu)建到人框架中的寡核苷酸序列。用每個(gè)寡核苷酸改變的殘基標(biāo)有下劃線。
為了與人源化構(gòu)建體相比較，構(gòu)建了表達(dá)嵌合2H7Fab(包含鼠VL和VH結(jié)構(gòu)域，及人CL和CH1結(jié)構(gòu)域)的質(zhì)粒，即使用合成的寡核苷酸通過定點(diǎn)誘變(Kunkel，同上)將鼠框架殘基導(dǎo)入2H7.v2。所得質(zhì)粒構(gòu)建體的序列如圖3所示，用于表達(dá)稱為2H7.v6.8的嵌合Fab。所編碼的每條Fab鏈具有23個(gè)氨基酸的STII分泌信號(hào)序列，如上文對(duì)pVX4(圖2)的描述。
基于鼠2H7框架殘基與人VκI、VHIII共有框架(圖1A和1B)及先前的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894285-4289(1992))的序列比較，通過定點(diǎn)誘變向2H7.v2Fab構(gòu)建體中導(dǎo)入了幾個(gè)框架突變。這些突變導(dǎo)致某些人共有框架殘基變成鼠2H7框架中發(fā)現(xiàn)的那些殘基，所述改變處于可能影響CDR構(gòu)象或抗原接觸的位點(diǎn)。3型包含VH(R71V、N73K)，4型包含VH(R71V)，5型包含VH(R71V、N73K)和VL(L46P)，而6型包含VH(R71V、N73K)和VL(L46P、L47W)。
如下在大腸桿菌中表達(dá)人源化和嵌合Fab型m2H7抗體并純化。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL-1 Blue(Stratagene，San Diego，CA)中，用于制備雙鏈和單鏈DNA。對(duì)于每種變體，用雙脫氧核苷酸法(SEQUENASE標(biāo)記引物循環(huán)測(cè)序，U.S.Biochemical Corp.)對(duì)輕鏈和重鏈二者完全測(cè)序。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到MM294的衍生物，大腸桿菌菌株16C9中，在含5μg/ml羧芐青霉素的LB板上劃平板，并選擇單菌落用于蛋白質(zhì)表達(dá)。將所述單菌落在5ml LB-100μg/ml羧芐青霉素中于37℃培養(yǎng)5-8小時(shí)。將5ml培養(yǎng)物加到500ml AP5-100μg/ml羧芐青霉素中，使之在4L帶擋板搖瓶中于37℃生長(zhǎng)16小時(shí)。AP5培養(yǎng)基的組成為1.5g葡萄糖、11.0g HYCASE SFTM(酪蛋白水解產(chǎn)物)、0.6g酵母提取物(經(jīng)過驗(yàn)證的)、0.19g無水MgSO4、1.07g NH4Cl、3.73g KCl、1.2g NaCl、120ml 1M三乙醇胺，pH7.4，至1L水，然后經(jīng)由0.1μm SEAKLEEN抗生濾器無菌過濾。
通過在1L離心瓶(Nalgene)中以3000xg離心收獲細(xì)胞，移去上清。冷凍1小時(shí)后，將沉淀重懸于25ml冷的10mM MES-10mM EDTA，pH5.0(緩沖液A)中。添加250μl 0.1M苯甲基磺酰氟(PMSF)(Sigma)以抑制蛋白水解作用，并添加3.5ml儲(chǔ)液10mg/ml母雞卵白溶菌酶(Sigma)以幫助裂解細(xì)菌細(xì)胞壁。在冰上輕搖1小時(shí)后，將樣品以40,000xg離心15分鐘。用緩沖液A將上清液調(diào)至50ml，上樣到用緩沖液A平衡過的2ml DEAE柱上。然后將流出液施加到用緩沖液A平衡過的蛋白質(zhì)G-SEPHAROSECL-4BTM瓊脂糖(Pharmacia)層析柱(0.5ml柱床體積)上。用10ml緩沖液A沖洗柱子，并用3ml 0.3M甘氨酸，pH3.0將其洗脫到1.25ml 1M TRIS，pH8.0中。然后用CENTRICON-30離心過濾裝置(Amicon)將F(ab)緩沖液交換到磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，并濃縮至0.5ml終體積。所有F(ab)都進(jìn)行SDS-PAGE以確定純度，通過電噴霧質(zhì)譜分析證實(shí)每種變體的分子量。
在基于細(xì)胞的ELISA結(jié)合測(cè)定中(如下所述)，難以檢測(cè)到Fab，包括嵌合2H7Fab與CD20的結(jié)合。因此，將2H7Fab型重定格式為全長(zhǎng)IgG1抗體，以用于測(cè)試和進(jìn)一步誘變。
通過將嵌合2H7(v6.8)Fab以及人源化Fab2至6型的VL和VH結(jié)構(gòu)域亞克隆到先前描述的用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的pRK載體(Gorman等，DNAProt.Eng.Tech.23-10(1990))中，構(gòu)建了用于表達(dá)全長(zhǎng)IgG的質(zhì)粒。簡(jiǎn)單地說，用EcoRV和BlpI消化每種Fab構(gòu)建體以切下VL片段，將其克隆到質(zhì)粒pDR1(圖4)的EcoRV/BlpI位點(diǎn)中，用于表達(dá)完整輕鏈(VL-CL結(jié)構(gòu)域)。此外，用PvuII和ApaI消化每種Fab構(gòu)建體以切下VH片段，將其克隆到質(zhì)粒pDR2(圖5)的PvuII/ApaI位點(diǎn)中，用于表達(dá)完整重鏈(VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域)。對(duì)于每種IgG變體，通過將輕鏈表達(dá)質(zhì)粒和重鏈表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.3659-74(1977))中來實(shí)施瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)單地說，在轉(zhuǎn)染前那天打散293細(xì)胞，涂布到含血清培養(yǎng)基中。第二天，添加制備成磷酸鈣沉淀物的雙鏈DNA，然后是PADVANTAGETMDNA(Promega，Madison，WI)，將細(xì)胞在37℃保溫過夜。將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4天后收獲。利用蛋白質(zhì)A-SEPHAROSE CL-4BTM瓊脂糖層析從培養(yǎng)物上清液純化抗體，然后緩沖液交換到10mM琥珀酸鈉、140mM NaCl，pH6.0中，并用CENTRICON-10離心過濾裝置(Amicon)濃縮。通過定量氨基酸分析測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
為了測(cè)量對(duì)CD20抗原的相對(duì)結(jié)合親和力，開發(fā)了基于細(xì)胞的ELISA測(cè)定法。將人B類淋巴母細(xì)胞WIL2-S細(xì)胞(ATCC CRL8885，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)在補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺、20mM HEPES，pH7.2及10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640中在潮濕的5％CO2溫箱中培養(yǎng)。用含1％胎牛血清(FBS)的PBS(測(cè)定緩沖液)沖洗細(xì)胞，將其以250-300,000細(xì)胞/孔接種96孔圓底平板(Nunc，Roskilde，丹麥)。將測(cè)定緩沖液中標(biāo)準(zhǔn)品的兩倍連續(xù)稀釋液(15.6-1000ng/ml的2H7v6.8嵌合IgG)和樣品的三倍連續(xù)稀釋液(2.7-2000ng/ml)加到所述平板中。將平板埋在冰里保溫45分鐘。為了去除未結(jié)合的抗體，將0.1ml測(cè)定緩沖液加到孔中。將平板離心并去除上清。再用0.2ml測(cè)定緩沖液沖洗細(xì)胞兩次。通過將過氧化物酶綴合的羊抗人Fc抗體(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)加到所述平板中來檢測(cè)結(jié)合到平板上的抗體。保溫45分鐘后，如前所述沖洗細(xì)胞。向平板中添加TMB底物(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺；Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)。添加1M磷酸以終止反應(yīng)。用四參數(shù)非線性回歸擬合曲線程序(KALEIDAGRAPHTM，Synergy software，Reading，PA)擬合滴定曲線。測(cè)定滴定曲線中點(diǎn)處的吸光度(mid-OD)及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。然后測(cè)定在此mid-OD處每種變體的濃度，并用每種變體的濃度除以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。因此，這些值是每種變體相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合比率。試驗(yàn)之間相對(duì)親和力的標(biāo)準(zhǔn)偏差(當(dāng)量濃度)通常為+/-10％。
如表3所示，與嵌合2H7(v.6.8)相比，CDR交換變體(v.2)的結(jié)合急劇降低。然而，3至6型顯示結(jié)合提高。為了測(cè)定將結(jié)合親和力恢復(fù)至嵌合2H7的水平可能需要的最小突變數(shù)，通過定點(diǎn)誘變構(gòu)建額外的突變和突變組合，產(chǎn)生表4所示變體7至17。具體而言，這些包括VH突變A49G、F67A、I69L、N73K、和L78A；以及VL突變M4L、M33I、和F71Y。16和17型顯示最好的相對(duì)結(jié)合親和力，在嵌合型水平的2倍范圍內(nèi)，這兩者之間沒有顯著差異(s.d.＝+/-10％)。因此，為了最小化突變數(shù)，挑選只具有4個(gè)人框架殘基至鼠框架殘基突變的16型(表4)作為人源化形式，用于額外鑒定。
表3使用基于細(xì)胞的ELISA將人源化2H7IgG變體對(duì)CD20的相對(duì)結(jié)合親和力與嵌合2H7相比較。相對(duì)結(jié)合表示為嵌合2H7的濃度相對(duì)于等價(jià)結(jié)合所需的變體濃度；因此比率＜1顯示變體的親和力較弱。相對(duì)親和力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10％。可變區(qū)中的框架替代是相對(duì)于根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)(Kabat等，同上)的CDR交換型。
表4用于在人源化2H7 16型(2H7.v16)中構(gòu)建突變VH(A49G、R71V、N73K)和VL(L46P)的寡核苷酸序列。加下劃線的密碼子編碼指定氨基酸替代。對(duì)于VH(R71V、N73K)和VL(L46P)，這些寡核苷酸顯示為有義鏈，因?yàn)檫@些用于在Fab模板上誘變，而對(duì)于VH(A49G)，這些寡核苷酸顯示為反義鏈，因?yàn)樗cpRK(IgG重鏈)模板一起使用。16型的蛋白質(zhì)序列顯示于圖6和圖7。
實(shí)施例22H7的抗原結(jié)合決定簇(互補(bǔ)位)在2H7.v16或2H7.v17中進(jìn)行丙氨酸替代(Cunningham & Wells，Science2441081-1085(1989))以便測(cè)試抗體的個(gè)別側(cè)鏈在結(jié)合CD20中的貢獻(xiàn)。在293細(xì)胞中從pDR1和pDR2載體表達(dá)IgG變體，純化，并如上所述測(cè)定相對(duì)結(jié)合親和力。在WIL-2S細(xì)胞上，幾種丙氨酸替代導(dǎo)致對(duì)CD20的相對(duì)結(jié)合顯著降低(表5)。
表5利用基于細(xì)胞的ELISA(WIL2-S細(xì)胞)測(cè)量的人源化2H7.v16的CDR區(qū)中丙氨酸替代的影響。相對(duì)結(jié)合表示為2H7.v16親本的濃度相對(duì)于等價(jià)結(jié)合所需的變體濃度；因此比率＜1顯示變體的親和力較弱；比率＞1顯示變體的親和力較高。相對(duì)親和力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10％?？勺儏^(qū)中的框架替代是相對(duì)于根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)(Kabat等，同上)的2H7.v16。NBD意思是沒有可探測(cè)的結(jié)合。45型的兩個(gè)數(shù)值來自分開的試驗(yàn)。

實(shí)施例32H7CDR區(qū)內(nèi)的其他突變還測(cè)試了經(jīng)A1a掃描鑒定是重要的CDR位置的其他殘基替代和替代組合。幾種組合變體，特別是v.96，其結(jié)合看起來比v.16更牢固。
表6利用基于細(xì)胞的ELISA(WIL2-S細(xì)胞)測(cè)量的人源化2H7.v16的CDR區(qū)中突變組合和非丙氨酸替代的影響。對(duì)CD20的相對(duì)結(jié)合表示為2H7.v16親本濃度相對(duì)于等價(jià)結(jié)合所需的變體濃度；因此比率＜1顯示變體的親和力較弱；比率＞1顯示變體的親和力較高。相對(duì)親和力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10％?？勺儏^(qū)中的框架替代是相對(duì)于根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)(Kabat等，同上)的2H7.v16。

實(shí)施例4框架人源化替代位點(diǎn)的突變還在2H7.v16背景中測(cè)試了在人源化期間改變的框架位置的其他殘基替代。具體而言，在VL(P46)和VH(G49、V71、和K73)處進(jìn)行了在鼠2H7親本和人共有框架中均未發(fā)現(xiàn)的替代性框架替代。
這些替代通常引起很小的相對(duì)結(jié)合改變(表7)，表明這些位置的框架殘基有一定的靈活性。
表7框架替代在基于細(xì)胞(WIL2-S)的測(cè)定中的相對(duì)結(jié)合。顯示了相對(duì)于2H7.v16背景具有突變的IgG變體。相對(duì)結(jié)合表示為2H7.v6.8嵌合體的濃度相對(duì)于等價(jià)結(jié)合所需的變體濃度；因此，比率＜1顯示變體的親和力較弱；比率＞1顯示變體的親和力較高。相對(duì)親和力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10％?？勺儏^(qū)中的框架替代是相對(duì)于根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)(Kabat等，同上)的2H7.v16。
(*)以2H7.v16作為標(biāo)準(zhǔn)比較物測(cè)定的變體；相對(duì)值相對(duì)于嵌合體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
實(shí)施例5具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能的人源化2H7變體由于2H7能經(jīng)由CDC和ADCC二者介導(dǎo)B細(xì)胞的裂解，因而要尋找具有改善的CDC和ADCC活性的人源化2H7.v16變體。已經(jīng)描述了其它抗體Fc區(qū)內(nèi)經(jīng)由增強(qiáng)對(duì)補(bǔ)體成分Clq的結(jié)合來改善CDC的某些殘基的突變(Idusogie等，J.Immunol.1662571-2575(2001))。也已描述了經(jīng)由增強(qiáng)IgG對(duì)活化Fcγ受體的結(jié)合和削弱IgG對(duì)抑制性Fcγ受體的結(jié)合來改善ADCC的突變(Shields等，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001)；Presta等，Biochem.Soc.Trans.30487-490(2002))。具體而言，已經(jīng)鑒定了改善CDC和ADCC活性的三個(gè)突變S298A/E333A/K334A(在本文中也稱為三重Ala突變體或變體；Fc區(qū)的編號(hào)依據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)；Kabat等，同上)，如所描述的(Idusogie等，同上(2001)；Shields等，同上)。
為增強(qiáng)2H7的CDC和ADCC活性，構(gòu)建了2H7Fc的三重Ala突變體。已生成了抗HER2抗體4D5的人源化變體，其具有突變S298A/E333A/K334A，稱為4D5Fc110(即抗p185HER2IgG1(S298A/E333A/K334A)；Shields等，同上)。用ApaI和HindIII消化編碼抗體4D5Fc110的質(zhì)粒p4D5Fc110(Shields等，同上)，將Fc片段(含突變S298A/E333A/K334A)連接到2H7重鏈載體pDR2-v16的ApaI/HindIII位點(diǎn)中，生成pDR2-v31。31型完整重鏈的氨基酸序列如圖8所示。輕鏈與v16的輕鏈相同。
盡管IgG1抗體Fc區(qū)的恒定區(qū)在給定物種中是相對(duì)保守的，但存在等位基因變異(Lefranc和Lefranc的綜述，在The Human IgG Subclassesmolecular analysis of structure，function，and regulation中，pp.43-78，F(xiàn).Shakib編，Pergamon Press，Oxford(1990))。
表8Fc區(qū)中的替代對(duì)CD20結(jié)合的影響。在基于細(xì)胞(WIL2-S)的測(cè)定法中測(cè)量框架替代對(duì)CD20的相對(duì)結(jié)合。以EU編號(hào)(Kabat，同上)顯示Fc突變(*)，相對(duì)于2H7.v16親本。v.31Fc區(qū)中的三個(gè)Ala改變的組合描述為“Fc110”。顯示了相對(duì)于2H7.v16背景具有突變的IgG變體。相對(duì)結(jié)合表示為2H7.v6.8嵌合體的濃度相對(duì)于等價(jià)結(jié)合所需的變體濃度；因此，比率＜1顯示變體的親和力較弱。相對(duì)親和力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10％。
實(shí)施例6穩(wěn)定性增強(qiáng)的人源化2H7變體為了開發(fā)為治療用蛋白質(zhì)，希望選擇在合適的制劑緩沖劑中對(duì)氧化、脫酰胺、或可能影響產(chǎn)品質(zhì)量的其它進(jìn)程保持穩(wěn)定的變體。在2H7.v16中，幾個(gè)殘基鑒定為可能的不穩(wěn)定源VL(M32)和VH(M34、N100)。因此，在這些位點(diǎn)引入突變以同v16比較。
表9所設(shè)計(jì)的穩(wěn)定性和/或效應(yīng)物功能增強(qiáng)的2H7變體在基于細(xì)胞(WIL2-S)的測(cè)定法中對(duì)CD20的相對(duì)結(jié)合。顯示了相對(duì)于2H7.v16背景具有突變的IgG變體。相對(duì)結(jié)合表示為2H7.v6.8嵌合體的濃度相對(duì)于等價(jià)結(jié)合所需的變體濃度；因此，比率＜1顯示變體的親和力較弱。相對(duì)親和力測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10％?？勺儏^(qū)中的框架替代是相對(duì)于根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的2H7.v16，F(xiàn)c突變(*)以EU編號(hào)(Kabat等，同上)顯示。
(**)以2H7.v16作為比較物測(cè)量的變體；相對(duì)結(jié)合值相對(duì)于嵌合體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
基于先前報(bào)導(dǎo)的突變(Idusogie等，J.Immunol.1644178-4184(2000)；Idusogie等，J.Immunol.1662571-2575(2001)；Shields等，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))，將其他Fc突變與增強(qiáng)穩(wěn)定性或親和力的突變組合以改變或增強(qiáng)效應(yīng)物功能。這些改變包括實(shí)施例5中所述的S298、E333A、K334A；降低CDC活性的K322A；降低ADCC活性的D265A；增強(qiáng)CDC活性的K326A或K326W；以及測(cè)試Fc區(qū)中同種異型改變的影響的E356D/M358L。這些突變中沒有一個(gè)導(dǎo)致CD20結(jié)合親和力顯著不同。
為了測(cè)試穩(wěn)定性突變對(duì)蛋白質(zhì)降解速率的影響，將2H7.v16和2H7.v73以12-14mg/ml配制在10mM組氨酸、6％蔗糖、0.02％POLYSORBATE20TM乳化劑，pH5.8中，于40℃保溫16天。然后通過離子交換層析、聚集、和大小排阻層析片段化對(duì)保溫后的樣品測(cè)試負(fù)荷變體的變化，并在基于細(xì)胞(WIL2-S)的測(cè)定法中測(cè)試相對(duì)結(jié)合。
結(jié)果顯示，根據(jù)加速穩(wěn)定性條件下離子交換層析主峰部分的損耗，與2H7v.16相比，2H7v.73具有更高穩(wěn)定性。根據(jù)聚集、片段化、或結(jié)合親和力，沒有看到顯著區(qū)別。
實(shí)施例7WIL2-S細(xì)胞上抗體結(jié)合CD20的Scatchard分析用放射性標(biāo)記的2H7IgG測(cè)定了2H7IgG變體結(jié)合WIL2-S細(xì)胞的平衡解離常數(shù)(Kd)。在CHO細(xì)胞中生成IgG變體。用RITUXAN(對(duì)于所有試驗(yàn)來源都是Genentech，S.San Francisco，CA)和鼠2H7(BD PharMingen，SanDiego，CA)與人源化變體相比較。也可由其他來源獲得鼠2H7抗體，例如eBioscience和Caibiochem(兩者都位于San Diego，CA)、Accurate Chemical&Scientific Corp.(Westbury，NY)、Ancell(Bayport，MN)、和Vinci-Biochem(Vinci，意大利)。所有稀釋都在結(jié)合測(cè)定緩沖液(含1％牛血清清蛋白、25mM HEPESpH7.2、和0.01％疊氮鈉的DMEM培養(yǎng)基)中進(jìn)行。將濃度為0.8nM的125I-2H7.v16(用乳過氧化物酶碘化)等分試樣(0.025ml)分配到V形底96孔微量測(cè)定板的孔中，加入冷的抗體連續(xù)稀釋液(0.05ml)并混合。然后添加WIL2-S細(xì)胞(0.025ml中60,000個(gè)細(xì)胞)。密封平板并在室溫保溫24小時(shí)，然后以3,500RPM離心15分鐘。然后吸出上清液，沖洗細(xì)胞丸狀沉淀并離心。再次吸出上清液，將丸狀沉淀溶于1N NaOH，轉(zhuǎn)移到用于伽馬計(jì)數(shù)的試管中。數(shù)據(jù)用于利用Ligand程序(McPherson，Comput.Programs Biomed.17107-114(1983))進(jìn)行Scatchard分析(Munson和Rodbard，Anal.Biochem.107220-239(1980))。結(jié)果如表10所示，表明人源化2H7變體具有與鼠2H7相比相似的CD20結(jié)合親和力，和與RITUXAN相似的結(jié)合親和力。根據(jù)以上表8所示的結(jié)合，預(yù)期2H7.v31會(huì)具有與v.16非常相似的Kd。
表10來自Scatchard分析的2H7變體的平衡結(jié)合親和力
實(shí)施例8補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定本質(zhì)上如已描述的(Idusogie等，J.Immunol.1644178-4184(2000)；Idusogie等，J.Immunol.1662571-2575(2001))，對(duì)2H7IgG變體測(cè)定其介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性WIL2-S細(xì)胞裂解的能力，WIL2-S細(xì)胞為表達(dá)CD20的類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞系。從0.1mg/ml儲(chǔ)液1∶3連續(xù)稀釋抗體。將每個(gè)稀釋度的0.05ml等分試樣加至96孔組培板，其中包含0.05ml正常人補(bǔ)體溶液(Quidel，SanDiego，CA)。將50,000個(gè)WIL2-S細(xì)胞以0.05ml體積加到該混合物中。37℃保溫2小時(shí)后，添加0.05ml ALAMAR BLUETM刃天青溶液(AccumedInternational，Westlake，OH)，37℃繼續(xù)再保溫18小時(shí)。從板上移走蓋子，于室溫在軌道搖床上搖動(dòng)15分鐘。用530nm激發(fā)濾光片(excitation filter)和590nm發(fā)射濾光片(emission filter)讀取相對(duì)熒光單位(RFU)。用KALEIDAGRAPHTM軟件通過將RFU擬合為濃度的函數(shù)來計(jì)算每種抗體的EC50。
結(jié)果(表11)顯示了人源化2H7抗體在CDC中具有令人驚訝的改善，對(duì)于v.73其相對(duì)功效類似于RITUXAN，對(duì)于v.75比RITUXAN功效大3倍，而對(duì)于v.16比RITUXAN弱3倍。
表112H7抗體相對(duì)于RITUXAN的CDC活性。數(shù)值＞1表明CDC活性比RITUXAN弱，數(shù)值＜1表明活性比RITUXAN強(qiáng)。除了用(*)表示的瞬時(shí)生產(chǎn)以外，抗體由穩(wěn)定的CHO系所生產(chǎn)。
實(shí)施例9抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定本質(zhì)上如所描述的(Shields等，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))，用乳酸脫氫酶(LDH)讀出，對(duì)2H7IgG變體測(cè)定了其介導(dǎo)NK細(xì)胞裂解WIL2-S細(xì)胞的能力，WIL2-S細(xì)胞為表達(dá)CD20的類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞系。NK細(xì)胞由100ml肝素化血液制得，所述肝素化血液用100ml PBS稀釋，由已歸為FcγRIII同種型，也稱為CD16(Koene等，Blood 901109-1114(1997))的正常人供體獲得。在該試驗(yàn)中，NK細(xì)胞來自CD16雜合的(F158/V158)人供體。將稀釋血液在15ml淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(ICN Biochemical，Aurora，Ohio)上分層并以2000RPM離心20分鐘。將位于層間接觸面的白細(xì)胞分配到4個(gè)干凈的50ml試管中，試管中裝有含15％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。將試管以1400RPM離心5分鐘，棄去上清液。將丸狀沉淀重懸于MACS緩沖液(0.5％BSA，2mM EDTA)，按照廠商的方案(Miltenyi Biotech.)用珠子(NK細(xì)胞分離試劑盒，130-046-502)純化NK細(xì)胞。將NK細(xì)胞在MACS緩沖液中稀釋到2×106個(gè)細(xì)胞/ml。
將抗體在測(cè)定培養(yǎng)基(F12/DMEM 50∶50，無甘氨酸，1mM HEPES緩沖液pH7.2、青霉素/鏈霉素(100個(gè)單位/ml；Gibco)、谷氨酰胺、和1％熱滅活胎牛血清)中的連續(xù)稀釋液(0.05ml)加到96孔圓底組培板中。將WIL2-S細(xì)胞在測(cè)定緩沖液中稀釋到4×105個(gè)/ml的濃度。將WIL2-S細(xì)胞(每個(gè)孔0.05ml)在96孔板中與稀釋抗體混合，室溫保溫30分鐘以允許抗體結(jié)合CD20(調(diào)理作用)。
向每個(gè)孔添加0.1ml NK細(xì)胞以啟動(dòng)ADCC反應(yīng)。在對(duì)照孔中加入2％TRITONX-100烷基芳基聚醚醇。然后將所述平板在37℃保溫4小時(shí)。按照廠商的說明，用細(xì)胞毒性(LDH)檢測(cè)試劑盒(Kit#_1644793，RocheDiagnostics，Indianapolis，Indiana)測(cè)量釋放的LDH水平。向每個(gè)孔添加0.1mlLDH顯影劑，接下來混合10秒。然后用鋁箔覆蓋平板，于室溫暗處保溫15分鐘。然后讀取490nm處的光密度，用對(duì)照孔中測(cè)得的總LDH去除該光密度，用于計(jì)算％裂解。將所述裂解作為抗體濃度的函數(shù)來繪圖，使用4參數(shù)曲線擬合(KALEIDAGRAPHTM軟件)來測(cè)定EC50濃度。
結(jié)果顯示人源化2H7抗體在ADCC中有活性，對(duì)于v.31和v.75，它們的相對(duì)功效比RITUXAN高20倍，對(duì)于v.16，比RITUXAN強(qiáng)5倍，對(duì)于v.73，比RITUXAN高差不多4倍。
表12根據(jù)n次試驗(yàn)，與2H7.v16相比較的2H7抗體對(duì)WIL2-S細(xì)胞的ADCC活性。(數(shù)值＞1表示效力比2H7.v16低，數(shù)值＜1表示效力更強(qiáng))。
進(jìn)行其他ADCC測(cè)定以將2H7的組合變體與RITUXAN相比較。這些測(cè)定的結(jié)果表明與RITUXAN相比，2H7.v114和2H7.v115具有＞10倍改善的ADCC效力(表13)。
表13根據(jù)n次試驗(yàn)，與RITUXAN相比，2H7抗體對(duì)WIL2-S細(xì)胞的ADCC活性(數(shù)值＞1表明效力低于RITUXAN，數(shù)值＜1表明效力更強(qiáng))。
實(shí)施例102H7變體在獼猴初步研究中的體內(nèi)影響在正常雄性獼猴(Macaca fascicularis)中測(cè)試由CHO細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的2H7變體，以評(píng)價(jià)其體內(nèi)活性。其它抗CD20抗體，諸如C2B8(RITUXAN)已證明有能力在正常靈長(zhǎng)類中損耗B細(xì)胞(Reff等，Blood83435-445(1994))。
在一項(xiàng)研究中，比較了人源化2H7變體。在平行研究中，也在獼猴中測(cè)試了RITUXAN。五個(gè)劑量組中每個(gè)組使用四只猴子(1)媒介、(2)0.05mg/kg hu2H7.v16、(3)10mg/kg hu2H7.v16、(4)0.05mg/kg hu2H7.v31、和(5)10mg/kghu2H7.v31。以0、0.2、或20mg/ml的濃度靜脈內(nèi)施用抗體，共計(jì)兩個(gè)劑量，一次在研究的第1天，另一次在第8天。劑量給藥的第一天定為第1天，前一天定為-1天；康復(fù)的第一天(每個(gè)組中2只動(dòng)物)定為第11天。在第-19、-12、1(劑量給藥前)天、和第一次服藥后6小時(shí)、24小時(shí)、和72小時(shí)收集血樣。在第8天(劑量給藥前)、第10天(處死2只動(dòng)物/組前)、以及在第36和67天(對(duì)于康復(fù)的動(dòng)物)取更多樣品。
通過對(duì)CD3-/CD40+細(xì)胞計(jì)數(shù)的FACS方法測(cè)定外周B細(xì)胞濃度。用下述開啟策略獲得猴子樣品中CD3-CD40+B細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在前向散射/側(cè)向散射散點(diǎn)圖上標(biāo)記淋巴細(xì)胞群以確定區(qū)域1(R1)。用R1中的結(jié)果，顯示了CD40和CD3標(biāo)記的熒光強(qiáng)度點(diǎn)圖。熒光標(biāo)記的同種型對(duì)照用于測(cè)定各自的CD40和CD3陽性的截止點(diǎn)。
結(jié)果表明，2H7.v16和2H7.v31在10mg/kg劑量都能夠產(chǎn)生完全的外周B細(xì)胞損耗，在0.05mg/kg劑量都能產(chǎn)生部分的外周B細(xì)胞損耗。在劑量給藥的前72小時(shí)期間測(cè)量的B細(xì)胞損耗時(shí)程和程度對(duì)于兩種抗體來說是相似的。隨后對(duì)康復(fù)動(dòng)物的分析表明，與服用2H7.v16的相比，用2H7.v31治療的動(dòng)物顯示出延長(zhǎng)的B細(xì)胞損耗。具體而言，對(duì)于用10mg/kg 2H7.v16治療的康復(fù)動(dòng)物來說，在第10天和第36天取樣之間的某個(gè)時(shí)間，B細(xì)胞顯示出實(shí)質(zhì)性的B細(xì)胞恢復(fù)。然而，對(duì)于用10mg/kg 2H7.v31治療的康復(fù)動(dòng)物來說，B細(xì)胞直到第36天和第67天之間的某個(gè)時(shí)間才顯示出恢復(fù)。這說明，與2H7.v16相比，2H7.v31的完全損耗持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)了約一個(gè)月。
在低或高劑量的猴子研究中沒有觀察到毒性，總體病理學(xué)是正常的。在其它研究中，相隔兩周為這些猴子i.v.施用2個(gè)劑量，直至所評(píng)估的最高劑量(100mg/kg×2＝1200mg/m2×2)，v16都被很好地耐受。
獼猴中2H7.v16對(duì)比RITUXAN的數(shù)據(jù)說明，CDC活性減小5倍并未對(duì)效力造成不利影響。對(duì)于首次輸注反應(yīng)，具有強(qiáng)烈ADCC活性但CDC活性減小的抗體與具有更強(qiáng)CDC活性的抗體相比，可能具有更有利的安全譜。
實(shí)施例11具有增強(qiáng)的效應(yīng)物功能的巖藻糖缺陷型2H7變體抗體正常CHO和HEK293細(xì)胞向IgG寡糖添加巖藻糖至很高程度(97-98％)。來自血清的IgG也是高度巖藻糖基化的。
使用具有巖藻糖基化能力的二羥葉酸還原酶陰性(DHFR-)CHO細(xì)胞系DP12和蛋白質(zhì)巖藻糖基化缺陷的細(xì)胞系Lec13來生產(chǎn)抗體，以進(jìn)行該研究。CHO細(xì)胞系Pro-Lec13.6a(Lec13)從Yeshiva大學(xué)的Albert Einstein醫(yī)學(xué)院的Pamela Stanley教授處獲得。親本系為Pro-(脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型)和Gat-(甘氨酸、腺苷、胸苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型)。CHO-DP12細(xì)胞系是CHO-K1細(xì)胞系(ATCC#_CCL-61)的衍生物，其為二氫葉酸還原酶缺陷的，具有降低的胰島素需求。使用SUPERFECTTM轉(zhuǎn)染試劑法(Qiagen，Valencia，CA)用cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。表達(dá)轉(zhuǎn)染抗體的Lec13細(xì)胞的選擇在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中用10μg/ml二鹽酸嘌呤霉素(Calbiochem，San Diego，CA)進(jìn)行，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有L-谷氨酰胺、核糖核苷和脫氧核糖核苷的MEM Alpha培養(yǎng)基(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)，添加有10％滅活FBS(Gibco)、10mMHEPES、和1X青霉素/鏈霉素(Gibco)。CHO細(xì)胞類似的在含Ham氏F12不含GHT的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中選擇，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基為不含甘氨酸含NaHCO3的低葡萄糖DMEM，添加有5％FBS(Gibco)、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1X GHT (甘氨酸、次黃嘌呤、胸苷)、和1X青霉素/鏈霉素。
菌落在二至三周內(nèi)形成，合并菌落用于擴(kuò)增和蛋白質(zhì)表達(dá)。開始時(shí)以3×106個(gè)細(xì)胞/10cm平板接種細(xì)胞合并物，用于小批量蛋白質(zhì)表達(dá)。一旦細(xì)胞長(zhǎng)到90-95％匯合，就將其轉(zhuǎn)到無血清培養(yǎng)基中，3-5天后收集細(xì)胞上清液，在Fc IgG-和完整IgG-ELISA中測(cè)試以估計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)到PS24生產(chǎn)培養(yǎng)基中前一天，以約8×106個(gè)細(xì)胞/15cm平板接種Lec13和CHO細(xì)胞，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基添加有10mg/L重組人胰島素和1mg/L微量元素。
將Lec13細(xì)胞和DP12細(xì)胞在無血清生產(chǎn)培養(yǎng)基中保持3-5天。收集上清液并在150ml錐形管中離心澄清，以去除細(xì)胞和碎片。添加蛋白酶抑制劑PMSF和抑酶肽(Sigma，St.Louis，MO)，在馬上要用蛋白質(zhì)G層析(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)純化前，在攪拌細(xì)胞上用MWCO30TM過濾器(Amicon，Beverly，MA)將上清液濃縮5倍。用CENTRIPREP-30TM濃縮器(Amicon)將所有蛋白質(zhì)緩沖交換到PBS中并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。用A280吸光度數(shù)值測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并用氨基酸組成分析檢驗(yàn)。
用表達(dá)人源化2H7v.16、2H7v.31的載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并如所述的方法選擇。2H7v.16抗體保留野生型Fc區(qū)，而v.31(參見以上實(shí)施例5，表8)具有其中進(jìn)行了3個(gè)氨基酸改變(S298A、E333A、K334A)的Fc區(qū)，導(dǎo)致對(duì)FcγRIIIa受體的親和力更高(Shields等，J.Biol.Chem.276(9)6591-6604(2001))。轉(zhuǎn)染并選擇后，分離細(xì)胞的個(gè)別集落并評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平，最強(qiáng)的生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行甲氨喋呤選擇，以選擇具有擴(kuò)大的質(zhì)?？截悢?shù)并因此產(chǎn)生更高抗體水平的細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移到無血清培養(yǎng)基中達(dá)7天，然后收集所述培養(yǎng)基并加載到蛋白質(zhì)A柱子上，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)洗脫抗體。用測(cè)量完整抗體的ELISA測(cè)定抗體的終濃度。用CENTRIPREP-30TM濃縮器(Amicon)將所有蛋白質(zhì)緩沖交換到PBS中并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
天冬酰胺連接寡糖的基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析。
用Papac等，Glycobiology8445-454(1998)的方法，將N連接寡糖從重組糖蛋白中釋放。簡(jiǎn)單說，用100μl甲醇調(diào)節(jié)襯有聚偏二氟乙烯(PVDF)的96孔微量滴定板(Millipore，Bedford，MA)的孔，向MilliporeMULTISCREENTM真空歧管施加真空以使甲醇經(jīng)PVDF膜汲出。用3X250μl水沖洗經(jīng)調(diào)節(jié)的PVDF膜。在所有沖洗步驟之間，通過向多歧管稍微施加真空，將孔完全排干。用還原和羧甲基化緩沖液(RCM)沖洗所述膜，所述緩沖液由6M鹽酸胍、360mM TRIS、2mM EDTA，pH8.6組成。將糖蛋白樣品(50μg)加到各個(gè)孔中，再次通過稍微施加真空經(jīng)由PVDF膜汲出，用2X50μl RCM緩沖液沖洗孔。向每個(gè)孔添加50μl 0.1M二硫蘇糖醇(DTT)溶液并將微量滴定板于37℃保溫1小時(shí)，以還原固定化樣品。真空去除DTT并用4×250μl水沖洗孔。
添加50ul 0.1M碘乙酸(IAA)溶液以羧甲基化半胱氨酸殘基，碘乙酸溶液是在1M NaOH中新制備的，并用RCM緩沖液稀釋到0.1M。羧甲基化通過于周圍溫度在暗處保溫30分鐘來進(jìn)行。向平板施加真空以去除IAA溶液，并用4×250μl純化水沖洗孔。添加100μl 1％PVP-360(聚乙烯吡咯烷酮360,000MW)(Sigma)溶液并于周圍溫度保溫1小時(shí)，以封閉PVDF膜。稍加真空去除PVP-360溶液并用4×250μl水沖洗孔。將25μl l0mM TRIS醋酸pH8.4中25個(gè)單位/ml的PNGASE FTM酰胺酶(New England Biolabs，Beverly，MA)消化液添加到每個(gè)孔中，消化于37℃進(jìn)行3小時(shí)。消化后，將樣品轉(zhuǎn)移到500μl Eppendorf管中，每個(gè)樣品添加2.5μl 1.5M醋酸溶液。將酸化樣品在周圍溫度保溫3小時(shí)，將寡糖從糖基胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基形式。MALDI-TOF質(zhì)譜分析前，釋放的寡糖用0.7ml柱床的陽離子交換樹脂(氫形式的AG50W-X8TM樹脂)(Bio-Rad，Hercules，CA)脫鹽，所述樹脂漿化裝入小型反應(yīng)管(US Biochemical，Cleveland，OH)。
為了以陽性方式(positive mode)對(duì)樣品進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，用0.5μl 2，5-二羥基苯甲酸基質(zhì)(sDHB)將脫鹽的寡糖(0.5μl等分試樣)加到不銹鋼靶上，所述基質(zhì)通過將2mg 2，5-二羥基苯甲酸與0.1mg 5-甲氧基水楊酸(5-methoxyslicylic acid)一起溶于1ml乙醇/10mM氯化鈉1∶1(v/v)而制得。真空干燥樣品/基質(zhì)混合物。為了以陰性方式(negative mode)進(jìn)行分析，將脫鹽的N連接寡糖(0.5μl等分試樣)與0.5μl 2’，4’，6’-三羥基苯乙酮基質(zhì)(THAP)一起加到不銹鋼靶上，所述基質(zhì)在1∶3(v/v)的乙腈/13.3mM檸檬酸銨緩沖液中制得。真空干燥樣品/基質(zhì)混合物，然后在分析前使之吸收大氣濕氣。在PERSEPTIVE BIOSYSTEMSTMVOYAGER-DETM質(zhì)譜儀上以MALDI-TOF分析釋放的寡糖。用線性圖形(linear configuration)并利用延遲提取(delayedextraction)，以正或負(fù)模式(positive and negative mode)在20kV操作質(zhì)譜儀。用1300的激光功率并以數(shù)據(jù)加和的方式(240次掃描)獲得數(shù)據(jù)，以提高信噪比。用標(biāo)準(zhǔn)寡糖的混合物校準(zhǔn)儀器，在質(zhì)量賦值前用19點(diǎn)Savitsky-Golay算法平滑數(shù)據(jù)。用CAESAR7.0TM數(shù)據(jù)分析軟件包(SciBridge Software)完成質(zhì)譜數(shù)據(jù)的集成。
NK細(xì)胞ADCC。
如實(shí)施例9所述實(shí)施ADCC測(cè)定法。NK對(duì)比靶細(xì)胞(WIL2-S)的比率為4比1，測(cè)定運(yùn)行4小時(shí)，如前所述用乳糖脫氫酶測(cè)定法測(cè)量毒性。在添加NK細(xì)胞前用所顯示的抗體濃度調(diào)理靶細(xì)胞30分鐘。所用的RITUXAN抗體來自Genentech(S.San Francisco，CA)。
結(jié)果顯示，巖藻糖基化不足的抗體比巖藻糖完全補(bǔ)足的抗體更有效的介導(dǎo)NK細(xì)胞靶細(xì)胞殺傷。巖藻糖基化不足的抗體2H7v.31最有效的介導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷。該抗體在較低濃度即有效，在更高濃度時(shí)能夠比其它抗體以更高百分比介導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷?？贵w的活性如下Lec13衍生的2H7v31＞Lec13衍生的2H7v16＞Dp12衍生的2H7v31＞Dp12衍生的2H7v16＞或＝RITUXAN。蛋白質(zhì)和碳水化合物的改造是累加的。比較來自Lec13生產(chǎn)的和CHO生產(chǎn)的IgG的天然IgG上發(fā)現(xiàn)的碳水化合物，在半乳糖苷化程度上沒有顯示出可覺察的差異，因此該結(jié)果只能歸因于巖藻糖的存在與否。
實(shí)施例12獼猴CD20的克隆和抗體結(jié)合從獼猴脾cDNA文庫(kù)分離編碼CD20的cDNA后，測(cè)定獼猴(Macacafascicularis)的CD20DNA序列。使用用于cDNA合成和質(zhì)粒克隆的SUPERSCRIPTTM質(zhì)粒系統(tǒng)(Cat#18248-013，Invitrogen，Carlsbad，CA)稍加改造來構(gòu)建文庫(kù)。用限制性位點(diǎn)XhoI和NotI將該cDNA文庫(kù)連接到pRK5E載體中。從脾組織(California Regional Research Primate Center，Davis，CA)分離mRNA。根據(jù)人CD20的非編碼序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增編碼CD20的cDNA的引物。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用N端區(qū)引物5′-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3′(SEQ ID NO41)和C端區(qū)引物5′-AAGCTATGAACACTAATG-3′(SEQ ID NO42)克隆編碼獼猴CD20的cDNA。按照廠商的推薦方案(Gibco，Rockville，MD)用PLATINUM TAQ DNAPOLYMERASE HIGH FIDELITYTM系統(tǒng)實(shí)施PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物亞克隆到PCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)中并轉(zhuǎn)化到XL-1 blue大腸桿菌(Stratagene，La Jolla，CA)中。從個(gè)別克隆分離含所連接PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA并測(cè)序。
獼猴CD20的氨基酸序列如圖19所示。圖20顯示了獼猴和人CD20的對(duì)比。獼猴CD20與人CD20的相似度在97.3％，有8處不同。胞外域包含一處改變V157A，而其余7個(gè)殘基可在胞質(zhì)或跨膜區(qū)中找到。
對(duì)針對(duì)人CD20的抗體測(cè)定結(jié)合和置換FITC綴合的鼠2H7結(jié)合表達(dá)CD20的獼猴細(xì)胞的能力。從2只獼猴(California Regional Research PrimateCenter，Davis，CA)抽二十毫升血液置于肝素鈉中，直接運(yùn)到Genentech公司。同一天合并血樣并通過添加40ml PBS稀釋。在50ml錐形管(Cat#_352098，F(xiàn)alcon，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中，將20ml稀釋血液在4×20mlFICOLL-PAQUETMPLUS(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上分層，在SORVALTM7離心機(jī)(Dupont，Newtown，CT)中于室溫以1300rpm離心30分鐘。分離PBMC層并在PBS中沖洗。在0.2％NaCl溶液中裂解紅細(xì)胞，用等體積的1.6％NaCl溶液恢復(fù)到等滲，以1000RPM離心10分鐘。將PBMC丸狀沉淀重懸于含5％FBS的RPMI1640(Gibco，Rockville，MD)，分到10cm組培盤中，于37℃保溫1個(gè)小時(shí)。通過吸取除去未貼壁的B和T細(xì)胞群，離心，并計(jì)數(shù)。共計(jì)回收了2.4×107個(gè)細(xì)胞。將重懸的PBMC分到二十個(gè)12×75mm培養(yǎng)管(Cat#_352053，F(xiàn)alcon)中，每個(gè)管在0.25ml體積中含1×106個(gè)細(xì)胞。將管分為四組，每組五個(gè)管。向每個(gè)組添加培養(yǎng)基(RPMI1640，5％FBS)、滴定量的對(duì)照人IgG1抗體、RITUXAN、2H7.v16、或2H7.v31。每種抗體的終濃度為30、10、3.3和1.1nM。此外，還向每個(gè)管添加20μl異硫氰酸熒光素(FITC)綴合的抗人CD20(Cat#555622，BD Biosciences，SanDiego，CA)。輕輕混合細(xì)胞，在冰上保溫1小時(shí)，然后在冷的PBS中沖洗兩次。在EPIC XL-MCLTM流式細(xì)胞儀(Coulter，Miami，F(xiàn)L)上分析細(xì)胞表面染色，得出幾何平均數(shù)，并對(duì)抗體濃度繪圖(KALEIDAGRAPHTM，SynergySoftware，Reading，PA)。
數(shù)據(jù)顯示2H7v.16和2H7v.31競(jìng)爭(zhēng)性地置換FITC-鼠2H7結(jié)合獼猴細(xì)胞。此外，RITUXAN也置換FITC-鼠2H7結(jié)合，因此證明2H7和RITUXAN結(jié)合CD20上的交疊表位。另外，數(shù)據(jù)顯示2H7v.16、2H7v.31和RITUXAN的IC50值相似，落在4-6nM范圍內(nèi)。
實(shí)施例13中度至嚴(yán)重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中rhuMAb2H7(2H7.v16)的I/II期研究方案概要在患中度至嚴(yán)重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者中進(jìn)行PRO70769(rhuMAb2H7)劑量逐步擴(kuò)大的隨機(jī)、安慰劑對(duì)照、多通道、盲試I/II期安全性研究，所述受試者接受穩(wěn)定劑量的伴藥甲氨蝶呤(MTX)。
目的該研究的主要目的是評(píng)估在患中度至嚴(yán)重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的受試者中逐步擴(kuò)大PRO70769(rhuMAb2H7)的靜脈內(nèi)(IV)劑量的安全性和耐受性。
研究設(shè)計(jì)這是在患中度至嚴(yán)重RA受試者中進(jìn)行的與MTX聯(lián)合施用的PRO70769劑量逐步擴(kuò)大的隨機(jī)、安慰劑對(duì)照、多通道、盲試I/II期、研究者和受試者盲試安全性研究。該研究由劑量擴(kuò)大期和有大量受試者加入的第二期組成。主辦者將保持不參與治療分派。
加入的患中度至嚴(yán)重RA的受試者如下，一至五種緩和疾病的抗風(fēng)濕藥物或生物制劑無效，目前對(duì)MTX治療具有不令人滿意的臨床響應(yīng)。
在進(jìn)入研究前受試者需要接受至少12周的每周10-25mg范圍的MTX，且在接受他們的初始劑量的研究藥物(PRO70769或安慰劑)前要接受至少4周的穩(wěn)定劑量。受試者也可接受穩(wěn)定劑量的口服皮質(zhì)類固醇(可達(dá)每天10mg，或者同等的強(qiáng)的松)和穩(wěn)定劑量的非類固醇抗炎藥(NSAID)。按照下面的劑量擴(kuò)大計(jì)劃，受試者將在第1天和第15天以指定劑量接受兩次IV輸注PRO70769或等量安慰劑。
將按照特定標(biāo)準(zhǔn)并在內(nèi)部安全性數(shù)據(jù)評(píng)審委員會(huì)對(duì)安全性數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)審和評(píng)估急性毒性后擴(kuò)大劑量，所述急性毒性評(píng)估在對(duì)每個(gè)組最后一名受試者的第二次輸注后72小時(shí)進(jìn)行。劑量擴(kuò)大期之后，如果已經(jīng)證明在劑量擴(kuò)大期期間所述劑量水平是可耐受的，則另外40名受試者(32名活性藥和8名安慰劑)將隨機(jī)接受以下每個(gè)劑量水平2×50mg、2×200mg、2×500mg、和2×1000mg。將有大約205名受試者加入到該項(xiàng)研究中。
將獲得并記錄B細(xì)胞計(jì)數(shù)。在6個(gè)月功效評(píng)估之后，將在48周跟蹤期內(nèi)用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估B細(xì)胞計(jì)數(shù)。不會(huì)認(rèn)為B細(xì)胞損耗是劑量限制毒性(DLC)，反而認(rèn)為是所期待的PRO70769治療的藥效結(jié)果。
在可選的子研究中，將在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)從受試者獲得用于血清和RNA分析的血液以及尿樣。這些樣品可用于鑒定這樣的生物標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物可預(yù)測(cè)中度至嚴(yán)重RA受試者對(duì)PRO70769治療的響應(yīng)。
結(jié)果測(cè)量該研究的主要結(jié)果測(cè)量是PRO70769在中度至嚴(yán)重RA受試者中的安全性和耐受性。
研究治療按照下面的擴(kuò)大計(jì)劃，受試組將在第1天和第15天以指定劑量接受兩次PRO70769或等量安慰劑的IV輸注-10mg PRO70769或等量安慰劑4名受試者活性藥物，1名對(duì)照-50mg PRO70769或等量安慰劑8名受試者活性藥物，2名對(duì)照-200mg PRO70769或等量安慰劑8名受試者活性藥物，2名對(duì)照
-500mg PRO70769或等量安慰劑8名受試者活性藥物，2名對(duì)照-1000mg PRO70769或等量安慰劑8名受試者活性藥物，2名對(duì)照功效將通過ACR響應(yīng)來測(cè)量PRO70769的功效。將由處理組概括獲得ACR20、ACR50、和ACR70響應(yīng)的受試者的百分比，每個(gè)組將產(chǎn)生95％的置信區(qū)間。將通過治療和訪問概括這些響應(yīng)的成分及其從基線的變化。
實(shí)施例1-13的結(jié)論以上數(shù)據(jù)證明了生產(chǎn)人源化CD20結(jié)合抗體，特別是人源化2H7抗體變體的成功，它們保持甚至增強(qiáng)了它們的生物學(xué)特性。本發(fā)明的人源化2H7抗體以近似于鼠供體和嵌合2H7抗體的親和力結(jié)合CD20，在靈長(zhǎng)類中有效殺傷B細(xì)胞，導(dǎo)致B細(xì)胞損耗。相對(duì)于目前用于治療非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的一種嵌合抗CD20抗體，某些變體顯示出增強(qiáng)的ADCC，有利于在患者中使用更低劑量的治療用抗體。另外，盡管對(duì)于以有效實(shí)現(xiàn)完全B細(xì)胞損耗的劑量施用的具有鼠FR殘基的嵌合抗體可能必需避免針對(duì)它的抗體反應(yīng)，但根據(jù)具體疾病和患者的需要，可以以獲得部分或完全B細(xì)胞損耗的劑量、以不同的持續(xù)時(shí)間施用本發(fā)明的人源化抗體。另外，這些抗體在溶液中顯示出穩(wěn)定性。人源化2H7抗體的這些特性使得它們理想的用作CD20陽性自身免疫病治療中的免疫治療劑；預(yù)期這些抗體在人類患者中沒有免疫原性，或者至少免疫原性低于完全鼠源的或嵌合的抗CD20抗體。
實(shí)施例14更多人源化抗體的制備分別包含SEQ ID NO24和28的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體2H7.v31可以在Fc區(qū)中進(jìn)一步包含至少一個(gè)增強(qiáng)ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，諸如氨基酸替代S298A/E333A/K334A中的一個(gè)，更優(yōu)選2H7.v31具有SEQ ID NO28的重鏈氨基酸序列。所述抗體可以是2H7.v138，其分別包含SEQ ID NO29和30的輕鏈和重鏈氨基酸序列，分別如圖10和11所示，圖10和11是這些序列與2H7.v16的相應(yīng)輕鏈和重鏈氨基酸序列的比對(duì)?；蛘撸@類優(yōu)選的完整人源化2H7抗體是2H7.v477，其具有2H7.v138的輕鏈和重鏈序列，除氨基酸替代N434W外。任何這些抗體可以在Fc區(qū)中進(jìn)一步包含至少一個(gè)降低CDC活性的氨基酸替代，例如至少包含替代K322A。參見美國(guó)專利6,528,624B1(Idusogie等)。
一些優(yōu)選的人源化2H7變體是那些具有SEQ ID NO2的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO8的重鏈可變區(qū)的變體，即那些在Fc區(qū)中具有或沒有替代的變體，和那些具有SEQ ID NO8中含改變N100A或D56A和N100A的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO2中含改變M32L、或S92A、或M32L和S92A的輕鏈可變區(qū)的變體，即那些在Fc區(qū)中具有或沒有替代的變體。如果在Fc區(qū)中進(jìn)行替代，則優(yōu)選它們是下表中所列出的其中一個(gè)。
在本發(fā)明的一些各種優(yōu)選實(shí)施方案的概括中，基于2H7 16型的變體V區(qū)將具有v16的氨基酸序列，除下表指出的氨基酸替代位置之外。除非另有說明，2H7變體將具有與v16相同的L鏈。
除上述變體之外，完整人源化2H7抗體可以是138型，其包括輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO29)和重鏈氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO30)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，人源化2H7抗體可以包含SEQ ID NO43的輕鏈可變區(qū)(VL)序列和SEQ ID NO8的重鏈可變區(qū)(VH)序列，其中所述抗體進(jìn)一步包含VH-CDR2中的氨基酸替代D56A，且VH-CDR3中的N100用Y或W替代，其中SEQ ID NO43具有序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO43)。
在這最后一種人源化2H7抗體的實(shí)施方案中，N100用Y替代。在另一實(shí)施方案中，N100用W替代。另外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體在VH-CDR3中包含替代S100aR，優(yōu)選在Fc區(qū)中進(jìn)一步包含至少一個(gè)增強(qiáng)ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，諸如包含IgG1 Fc的抗體，其中包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A、K326A?；蛘?，所述抗體在VH-CDR3中包含替代S100aR，優(yōu)選在Fc區(qū)中進(jìn)一步包含至少一個(gè)增強(qiáng)ADCC但降低CDC活性的氨基酸替代，諸如至少包含氨基酸替代K322A的抗體，以及進(jìn)一步包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A的抗體。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是511型，它包含2H7.v511輕鏈序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO44)和2H7.v511重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO45)。
實(shí)施例15Rituximab在多軟骨炎中的臨床研究用RITUXAN抗體治療經(jīng)診斷患多軟骨炎的患者。所治療的患者不會(huì)有B細(xì)胞惡性腫瘤。
按照下面的任何劑量給藥計(jì)劃為患者靜脈內(nèi)(IV)施用RITUXAN(A)第1天IV50mg/m2第8、15和22天IV150mg/m2(B)第1天IV150mg/m2第8、15和22天IV375mg/m2(C)第1、8、15和22天IV375mg/m2可以將更多的輔助療法(諸如上文所述的免疫抑制劑)與RITUXAN療法聯(lián)合，但優(yōu)選在整個(gè)治療過程中用RITUXAN作為單一試劑治療患者。
根據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)參數(shù)測(cè)定的軟骨組織炎癥減輕為基礎(chǔ)測(cè)定總響應(yīng)率。施用RITUXAN將在如上所述治療的患者中改善任何一種或多種多軟骨炎癥狀。
實(shí)施例16Rituximab在多發(fā)性單神經(jīng)炎中的臨床研究用rituximab(RITUXAN)抗體治療臨床診斷為本文定義的多發(fā)性單神經(jīng)炎的患者，任選與類固醇療法聯(lián)合。所治療的患者不會(huì)有B細(xì)胞惡性腫瘤。詳細(xì)且完整的病史在確定可能的紊亂基本病因中是非常重要的。疼痛通常在腰部或臀部開始，并蔓延到一側(cè)的大腿和膝蓋。疼痛通常以深層的伴隨疊加刺痛的疼痛為特征，晚上最為嚴(yán)重。患有糖尿病的個(gè)體典型地存在一側(cè)嚴(yán)重大腿疼痛的急性發(fā)作，很快接下來是前部大腿肌肉虛弱無力和萎縮，并且膝跳反射喪失?；颊叻从车钠渌赡艿陌Y狀包括麻木、刺痛感、感覺異常、灼痛-感覺遲鈍、身體部分移動(dòng)困難-麻痹、身體部分受控運(yùn)動(dòng)缺乏。感覺和運(yùn)動(dòng)喪失可能與特定神經(jīng)機(jī)能障礙有關(guān)。檢查顯示除受影響更深刻的區(qū)域之外，仍然保留反射和充足的力量。多發(fā)性單神經(jīng)炎的一些常見發(fā)現(xiàn)可能包括(未按頻度順序排列)坐骨神經(jīng)機(jī)能障礙、股神經(jīng)機(jī)能障礙、腓總神經(jīng)機(jī)能障礙、輔助神經(jīng)機(jī)能障礙、橈神經(jīng)機(jī)能障礙、正中神經(jīng)機(jī)能障礙、尺神經(jīng)機(jī)能障礙、和自主神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能障礙，即控制不隨意身體機(jī)能例如腺體和心臟的部分神經(jīng)系統(tǒng)。
對(duì)治療顯示積極響應(yīng)表現(xiàn)為在下面列出的導(dǎo)致該差異的四個(gè)參數(shù)中，有兩個(gè)發(fā)生改善，同時(shí)還以先前的糖尿病性神經(jīng)病治療研究(Jaradeh等，Journal of Neurology，Neurosurgery and Psychiatry67607-612(1999))為基礎(chǔ)?；颊弑仨毣加杏秒娚韺W(xué)測(cè)試可測(cè)量的神經(jīng)病。排除患已知的糖尿病或遺傳性神經(jīng)病的患者。
根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)(數(shù)值應(yīng)當(dāng)在登記前2個(gè)月內(nèi)獲得)的測(cè)量，患者必須具有足夠的器官機(jī)能肝AST＜實(shí)驗(yàn)室正常值上限的3倍且膽紅素＜2.0mg/dl。腎肌酐＜3.0mg/dl。
將在門診(out-patient)環(huán)境中靜脈內(nèi)施用rituximab。不需要管線過濾器。前一個(gè)小時(shí)的初始速率是50mg/小時(shí)。如果看不到毒性，可以將所述速率以50mg/小時(shí)的增量30分鐘的間隔逐漸提高到400mg/小時(shí)的最大速率。如果第一個(gè)劑量被很好地耐受，則后續(xù)劑量的初始速率為100mg/小時(shí)，以100mg/小時(shí)的增量30分鐘的間隔逐漸提高，不超過400mg/小時(shí)。如果患者發(fā)燒且打寒戰(zhàn)，則停止抗體輸注。應(yīng)當(dāng)評(píng)估副作用的嚴(yán)重性。如果癥狀改善，則輸注繼續(xù)，開始時(shí)以先前速率的一般進(jìn)行?？贵w輸注之后，靜脈針應(yīng)當(dāng)留置以便需要時(shí)加藥。如果觀測(cè)1個(gè)小時(shí)后沒有并發(fā)癥，可以停止靜脈針。
本研究中登記的所有患者將每周接受rituximab，連續(xù)4周。劑量以實(shí)際表面積為基礎(chǔ)。施藥計(jì)劃為在第1、8、15和22天靜脈內(nèi)輸注rituximab，每周四次375mg/m2。所有患者應(yīng)當(dāng)在治療前30-60分鐘IV或PO給予650mgTYLENOL疼痛緩解藥和50mg BENADRYL過敏藥進(jìn)行前驅(qū)用藥以減少不良后果。施藥期間如果發(fā)生反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)能夠獲得治療過敏性反應(yīng)的藥物例如腎上腺素、抗組胺劑和皮質(zhì)類固醇以立即使用。另外，可以與rituximab一起聯(lián)合使用止痛劑諸如醋氨酚、阿斯匹林、阿米替林(ELAVIL)、卡馬西平(TEGRETOL)、苯妥英(DILANTIN)、加巴噴丁(NEURONTIN)、(E)-N-香草基-8-甲基6-壬酰胺(noneamid)(CAPSAICIN)、或神經(jīng)阻斷劑。
將用幾個(gè)不同的參數(shù)評(píng)估神經(jīng)病1)EMG/NCS2)定量感官測(cè)試3)神經(jīng)病損傷評(píng)分4)神經(jīng)病癥狀和變化調(diào)查表。
EMG/NCS由同一肌電圖描記器和同一技師在rituximab輸注后三、六和十二個(gè)月時(shí)進(jìn)行肌電描記和神經(jīng)傳導(dǎo)速率測(cè)量。用來自每項(xiàng)研究的概括數(shù)據(jù)與初始值比較，所述初始值包括平均感覺神經(jīng)動(dòng)作電位(腓神經(jīng)、正中神經(jīng)和尺神經(jīng))、平均復(fù)合(compound)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)動(dòng)作電位(前脛骨的腓神經(jīng)、脛神經(jīng)、尺神經(jīng)和正中神經(jīng))、和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的平均傳導(dǎo)速率。也將計(jì)算平均F波反應(yīng)時(shí)間和近側(cè)至遠(yuǎn)側(cè)運(yùn)動(dòng)振幅比率。目的響應(yīng)將需要自基線起改善≥10％。穩(wěn)定的疾病不會(huì)顯示出神經(jīng)病中的顯著變化(+/-≥10)。進(jìn)行性疾病會(huì)顯示出神經(jīng)病惡化(＞自基線起10％)。
定量感官測(cè)試除了末梢腳和手的排汗軸突反射測(cè)試(sudomotor axonreflex test，QSART)之外，還將由同一技師于rituximab輸注后三、六和十二個(gè)月時(shí)在腳和手背上進(jìn)行具有振動(dòng)檢測(cè)閾(VDT)、平息檢測(cè)閾(CDT)、和熱痛覺閾(HPT)的定量感官測(cè)試?？梢砸韵鄬?duì)于標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分比分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)將這些測(cè)試中的異常轉(zhuǎn)變?yōu)辄c(diǎn)數(shù)。自研究前測(cè)量值改變兩個(gè)百分點(diǎn)將認(rèn)為是顯著的。
神經(jīng)病損傷評(píng)分(NIS)該測(cè)試測(cè)量反射、感覺和肌力。進(jìn)行了有關(guān)以腳趾、腳后跟行走和由下跪姿勢(shì)起立的下肢功能評(píng)估。整個(gè)研究中由同一神經(jīng)病學(xué)家于rituximab輸注后三、六和十二個(gè)月時(shí)進(jìn)行評(píng)分。改善將定義為NIS減少5個(gè)點(diǎn)或更多(Dyck″Quantitating severity ofneuropathy″InDyck等編，Peripheral Neuropathy.PhiladelphiaWB Saunders，686-697(1993))。
神經(jīng)病癥狀和改變調(diào)查表(NSC)該調(diào)查表由38個(gè)以正確或錯(cuò)誤方式回答的項(xiàng)目組成。它評(píng)估神經(jīng)病癥狀存在與否、其嚴(yán)重程度和隨時(shí)間的變化。它在整個(gè)研究中對(duì)于每名患者將由同一神經(jīng)病學(xué)家進(jìn)行。自基線分?jǐn)?shù)10％的改變將認(rèn)為是顯著的。
所述研究的主要結(jié)果測(cè)量是患者的改善。如果患者對(duì)于以上列出的4個(gè)參數(shù)中的2個(gè)顯示出明顯的改善，而對(duì)于任何其它的測(cè)量沒有下降，則將他/她歸入為改善?；谶@種響應(yīng)分類，以二項(xiàng)式計(jì)算為基礎(chǔ)為響應(yīng)率計(jì)算了精確的95％置信區(qū)間。對(duì)于14名患者，如果正確的反應(yīng)率在30-70％之間，則該區(qū)間的寬度將小于約50％，如果所述速率在70-90％或10-30％之間，則為約40％，如果所述速率＞90％或＜10％，則為約30％。
將使用精確的二項(xiàng)式區(qū)間對(duì)患者中每個(gè)參數(shù)都具有成功結(jié)果的部分計(jì)算點(diǎn)估計(jì)值和95％置信區(qū)間。對(duì)于每個(gè)連續(xù)或計(jì)序測(cè)量，將通過Hodges-Lehmann統(tǒng)計(jì)學(xué)和Tukey區(qū)間(參見Hollender和Wolfe，Nonparametric Statistical Methods，第二版，Wiley，New York，1999，p51-56)對(duì)自基線的改變計(jì)算精確的95％置信區(qū)間。計(jì)算將使用STATEXACTTM(Cytel)統(tǒng)計(jì)軟件包完成。
神經(jīng)病損傷評(píng)分測(cè)試將提供神經(jīng)病性缺陷的單一分?jǐn)?shù)和與顱神經(jīng)機(jī)能、肌肉虛弱無力、反射、和感覺有關(guān)的子集分?jǐn)?shù)。在與年齡和性別相關(guān)患者比較時(shí)，將考慮身高、體重和體格健康狀況由檢查人對(duì)所述缺陷評(píng)分。如果正常則肌肉虛弱無力記分為0，如果25％虛弱無力則為1，如果50％虛弱無力則為2，如果75％虛弱無力則為3，如果肌肉相對(duì)重力移動(dòng)則為3.25，如果重力消除時(shí)有運(yùn)動(dòng)則為3.5，當(dāng)不運(yùn)動(dòng)時(shí)有顫動(dòng)則為3.75，如果有完全麻痹則為4。這將應(yīng)用到顱神經(jīng)III、VI、VII、X和XII。測(cè)試其力量的個(gè)別肌肉組包括呼吸、頸彎曲、肩外展、肘彎曲、肱橈肌(brachial radialis)、肘伸展、腕屈伸、手指彎曲和張開、拇指外展、臀部屈伸運(yùn)動(dòng)、膝蓋屈伸運(yùn)動(dòng)、踝背屈、踝跖面彎屈趾伸肌和屈肌，共計(jì)24個(gè)項(xiàng)目。每個(gè)組將在右側(cè)和左側(cè)測(cè)試。
反射記分為0＝正常，1＝降低，2＝缺失。將在每一側(cè)檢查纖維腱反射，包括二頭肌、三頭肌、肱橈肌(brachial radialis)、四頭肌、和小腿三頭肌。對(duì)于60歲或更年長(zhǎng)的患者，踝反射降低將評(píng)分為0，缺失將評(píng)分為1。
將在手指和拇趾背上進(jìn)行感覺檢查。將通過使用長(zhǎng)棉絮測(cè)量觸壓。將借助直針評(píng)估針刺。用165Hz音叉測(cè)試振動(dòng)感覺，將通過活動(dòng)食指和拇趾的末端指/趾骨來測(cè)試關(guān)節(jié)位置。將對(duì)每個(gè)極端進(jìn)行所述檢查，評(píng)分將為0＝正常，1＝降低，以及2＝缺失。
預(yù)期rituximab或人源化2H7相對(duì)于對(duì)照(無此抗體)將顯示出上文定義的患者改善，并因此治療多發(fā)性單神經(jīng)炎。
權(quán)利要求
1.治療哺乳動(dòng)物中的多軟骨炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的結(jié)合CD20的抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體未與另一種分子偶聯(lián)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體已與另一種分子偶聯(lián)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述其它分子是胞毒劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述胞毒劑是放射性化合物。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述胞毒劑包括Y2B8或131I-B1。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括rituximab。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括人源化2H7。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用約20mg/m2至約250mg/m2劑量的所述抗體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述劑量為約50mg/m2至約200mg/m2。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其包括施用初始劑量的所述抗體，然后施用后續(xù)劑量，其中后續(xù)劑量中抗體的mg/m2劑量大于初始劑量中抗體的mg/m2劑量。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中靜脈內(nèi)施用所述抗體。
14.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中皮下施用所述抗體。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的免疫抑制劑、止痛劑、或化療劑。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中治療多軟骨炎。
17.權(quán)利要求16的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的非類固醇抗炎藥、類固醇、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、氨苯砜、硫唑嘌呤、青霉胺、或環(huán)孢霉素。
18.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中治療多發(fā)性單神經(jīng)炎。
19.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的止痛劑、類固醇、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、血漿交換、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、環(huán)孢霉素、或霉酚酸酯。
20.一種制品，其包括容器和裝在容器中的組合物，其中所述組合物包含結(jié)合CD20的抗體，且還包括指導(dǎo)用戶使用所述組合物以治療哺乳動(dòng)物中的多軟骨炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎的包裝插頁。
21.權(quán)利要求20的制品，其還包括裝有除所述抗體以外用于治療的藥劑的容器，還包括有關(guān)用該藥劑治療哺乳動(dòng)物的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及用有效量的結(jié)合CD20的抗體，任選與有效量的治療所述紊亂的另一種試劑一起，治療哺乳動(dòng)物中的多軟骨炎或多發(fā)性單神經(jīng)炎。
文檔編號(hào)A61P25/00GK101022829SQ200580019923
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者保羅·G·布魯尼塔, 凱瑟琳·L·塞韋爾 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司