專利名稱：包含乳酸和乳鐵傳遞蛋白的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防泌尿生殖道中病癥的包含乳酸的組合物。
本發(fā)明還涉及所述組合物在制備治療和/或預(yù)防泌尿生殖道中病癥的藥物中的用途以及治療和/或預(yù)防泌尿生殖道中病癥的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)信，酸性是陰道的一種保護(hù)性機(jī)制。酸性與諸如衣原體、陰部支原體、滴蟲(chóng)病、尿道感染的感染風(fēng)險(xiǎn)的降低以及在陰道口中細(xì)菌攜帶的減少相關(guān)(Hanna，N等人1985，1975，Stamey TA and KaufmanMF 1975，Stamey TA and Timothy MM 1975)。
相反，陰道微生物群的不均衡、細(xì)菌性陰道病(BV)與早產(chǎn)、性傳播疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加、HIV感染風(fēng)險(xiǎn)的增加以及盆腔炎相關(guān)(Schwebke，JR，2003，Obstet Gynecol Clin North Am.30685-94；Eschenbach，DA，1993，Am J Obstet Gynecol，Vol 169441-5；Taha等人，Aids，1998，Vol 121699-706，Hillier，SL，等人，1996，Am J Obstet Gynecol，Vol 175435-41)。
在圍產(chǎn)期和從月經(jīng)初期到絕經(jīng)期，陰道是非常酸性的。據(jù)信是由于陰道糖原厭氧代謝成酸性產(chǎn)物，主要是乙酸和乳酸而導(dǎo)致陰道酸化。該代謝是否是由陰道細(xì)菌和/或上皮細(xì)胞完成仍然存在爭(zhēng)議(見(jiàn)Pybus和Onderdonk 1999的綜述)。
通常存在利于乳酸產(chǎn)生微生物群的環(huán)境，其導(dǎo)致粘膜分泌物中pH約為4。然而，該環(huán)境在月經(jīng)周期的特定階段及絕經(jīng)期受到諸如雌激素濃度變化的因素的擾亂，也受到不同類型分泌增加，例如延長(zhǎng)的月經(jīng)出血、經(jīng)前出血、周期中出血和射精的擾亂。陰道中的外來(lái)體，例如避孕環(huán)、陰道栓和那些例如與抗生素治療結(jié)合的插入物，或清洗也可能導(dǎo)致健康微生物群被破壞，由此使pH升高。當(dāng)pH升高到4.5以上，將會(huì)出現(xiàn)厭氧細(xì)菌生長(zhǎng)增加的趨勢(shì)。
粘膜中沒(méi)有炎癥反應(yīng)的陰道中正常微生物群的破壞稱作BV并且導(dǎo)致令人不快的排泄物以及pH值超過(guò)4.5，但是它們通常不作為實(shí)際的疾病被提及。但是，BV是防治感染的指示，該感染可以部分地被低pH值已經(jīng)被削弱并且處于不利的環(huán)境下，這導(dǎo)致實(shí)質(zhì)的感染所提示。
微生物群的改變與陰道pH的改變相關(guān)(Caillouette JC等1997)。在BV期間，陰道pH值升高并且觀察到從乳酸菌占優(yōu)勢(shì)變成陰道加德納氏菌和厭氧菌控制的生物群占優(yōu)勢(shì)的變化。厭氧菌的存在導(dǎo)致在pH值升高(大約4.5)時(shí)令人不快的排泄物和揮發(fā)性胺的產(chǎn)生。
由于胺的存在，BV中陰道液的pH值增加會(huì)產(chǎn)生氣味。在BV中，排泄物包含由厭氧菌脫羧基產(chǎn)生的濃度增加的幾種胺。胺變得具有揮發(fā)性并且因此當(dāng)其以未質(zhì)子化的形式(游離堿)存在時(shí)產(chǎn)生氣味。然而，在加入強(qiáng)酸后胺被轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)子化形式(鹽)并且不具有揮發(fā)性。乳酸為強(qiáng)酸并且因此適于減少惡臭的排泄物。
通過(guò)用乳酸降低陰道的pH值，將使乳酸菌種類再遍布陰道變得容易，從而恢復(fù)對(duì)與BV相關(guān)細(xì)菌的過(guò)度生長(zhǎng)的自然抗性。在包含用于乳酸菌的生長(zhǎng)底物(糖原)的凝膠中給定的乳酸鹽(即乳酸的鹽)顯示具有有效抗BV中升高的pH和不良?xì)馕兜男Ч?見(jiàn)EP 0257007)乳酸鹽-凝膠提供了酸性的乳酸霜，包含糖原而不含防腐劑。在育齡婦女的陰道上皮細(xì)胞中富含糖原并且對(duì)乳酸菌是重要的營(yíng)養(yǎng)底物。
與僅包含乳酸的霜?jiǎng)┗虬栏瘎┑乃嵝运獎(jiǎng)┫啾?，乳酸鹽-凝膠在體外對(duì)乳酸菌的存活顯示了兩倍有利的作用。其因此可被用于在BV情況下重建正常環(huán)境。
由于其低pH值，乳酸鹽凝膠也已經(jīng)顯示具有一些抗某些BV-相關(guān)細(xì)菌種類的抗菌作用。(見(jiàn)Andersch B等；″Treatment ofBacterial Vaginosis with an Acid CreamA Comparison betweenthe Effect of Lactate-Gel and Metroni-dazole″，Gynecol obstetInvest 2119-25(1986))。然而，觀察不到其抗酵母，諸如白色假絲酵母和克魯斯氏假絲酵母的作用。
治療陰道中的真菌感染的常規(guī)方法通常包括施用抗生素，例如咪唑衍生物。當(dāng)然也有許多減少抗生素使用的動(dòng)機(jī)，例如由于抗藥性的發(fā)展。
進(jìn)一步地，診斷病人是否患有BV或真菌感染是有困難的。這就會(huì)為預(yù)防而開(kāi)出抗生物處方，從而產(chǎn)生不必要的過(guò)量使用抗生素。
獲得非抗生素治療當(dāng)然也是非常有用的，其除了具有降低陰道pH和減輕氣味的上述特征外，對(duì)治療或預(yù)防BV和/或真菌感染及特別是酵母感染也是有效的。理想地，治療應(yīng)當(dāng)是有效的，與病人是否患有或具有BV或真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。直到目前，都沒(méi)有提供這種可能性。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供治療泌尿生殖病癥的一個(gè)更有效的組合物，其降低pH值并且有效抗難聞氣味，并且其對(duì)治療細(xì)菌性陰道病和真菌感染，尤其是由酵母種引起的真菌感染也是有效的。
這個(gè)目的通過(guò)包含乳酸的組合物而達(dá)到，該組合物的特征在于包含乳鐵傳遞蛋白(LF)和/或其肽片段。
LF、和/或其肽片段的結(jié)合增強(qiáng)了組合物的抗菌活性并且其可以由此用于抑制泌尿生殖道，尤其是陰道中的非理想細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)和/或殺死其的目的。
LF和/或其肽片段的濃度可以在0.0001至100mg/ml，尤其是0.001至10mg/ml或0.01至5mg/ml的范圍內(nèi)，并且所述LF可以是重組人LF。所述乳鐵傳遞蛋白的肽片段可以是合成的或重組體。
乳酸的濃度可以在0.1至10％(即1到100mg/ml)的范圍內(nèi)。
組合物可以進(jìn)一步包含中和物質(zhì)，并且優(yōu)選乳酸和中和物質(zhì)的濃度可使pH值在3.5至4.5的范圍內(nèi)。
組合物可以進(jìn)一步包含用于乳酸細(xì)菌的生長(zhǎng)底物，并且乳酸相對(duì)于生長(zhǎng)底物的重量比率優(yōu)選在20∶1至500∶1，更優(yōu)選約50∶1的范圍內(nèi)。
組合物可以進(jìn)一步包含惰性載體和/或稠度劑。
組合物可以例如以霜?jiǎng)?、凝膠、陰道栓劑、片劑或噴霧劑的形式存在。
此外，本發(fā)明涉及前述組合物在制備預(yù)防和/或治療泌尿生殖道中病癥的藥物的應(yīng)用。該藥劑具有抗微生物活性。
待治療和/或預(yù)防的病癥包括泌尿生殖道中pH升高和/或紊亂的微生物群。紊亂的陰道微生物群的特征為BV-相關(guān)的細(xì)菌(厭氧革蘭氏陰性菌、厭氧革蘭氏陽(yáng)性球菌、葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌)和/或假絲酵母屬的異常的高水平以及乳酸桿菌的異常低水平。
本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療上述病癥的方法。
根據(jù)本發(fā)明的組合物有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)·組合物不作用于乳酸桿菌。
·在獨(dú)立組合物中乳酸和LF的組合產(chǎn)生出人意料的協(xié)同作用，因?yàn)槠浣档蚿H，減輕氣味并且抑制BV-相關(guān)的細(xì)菌和酵母的生長(zhǎng)。
·無(wú)論病人是否患有BV或假絲酵母屬-感染，組合物都是有效的，如果不能確定可信賴的診斷，這當(dāng)然也是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，特別是在自我護(hù)理的情況下。
·可以減少抗生素的使用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示的是在乳酸鹽(a)和氯化氫(b)存在下LF抗白色假絲酵母的抗真菌活性。LF與用0.2％細(xì)菌用蛋白胨稀釋的不同濃度的乳酸鹽和白色假絲酵母一起培育2h。隨后分析每種溶液中可存活的數(shù)量。
圖2顯示的是LF(2mg/ml)對(duì)兩種通常在陰道微生物群中找到的乳酸菌菌株的作用。細(xì)菌在用0.34％BHI稀釋的不同濃度的乳酸鹽中培育3h，并且在CO2中培育。
圖3顯示的是在相同條件(0.34％BHI，CO2，培育2h)下LF和乳酸鹽對(duì)加氏乳桿菌和大腸桿菌的抗菌活性。
圖4顯示的是陰道加德納氏菌(Gv 14)和兩種雙路普雷沃氏菌菌株(Pb 57，Pb 62)在不同濃度的LF存在下的生長(zhǎng)抑制。細(xì)菌在0.34％的BHI中在厭氧條件下培育20小時(shí)。通過(guò)分光光度分析生長(zhǎng)抑制。
圖5顯示的是在乳酸鹽(濃度5和1％，用0.2％細(xì)菌用蛋白胨稀釋)存在下LF和rHLF對(duì)白色假絲酵母和大腸桿菌的殺微生物作用。溶液被培育2h并且隨后通過(guò)存活數(shù)量分析。
圖6顯示的是在乳酸鹽(0.2％細(xì)菌用蛋白胨中的濃度1和0.2％)存在下LF和rHLF對(duì)白色假絲酵母的殺真菌作用。溶液培育2和20h并且通過(guò)存活數(shù)量來(lái)分析。
圖7顯示的是在乳酸鹽(5，1和0.2％，用0.2％細(xì)菌用蛋白胨稀釋)存在下LF(2mg/ml)和rHLF(2mg/ml)的殺細(xì)菌活性。溶液培育2h并且通過(guò)存活數(shù)量分析。
圖8顯示的是在不同濃度乳酸鹽(5，1，0.2，和0.04％，用0.2％細(xì)菌用蛋白胨稀釋)存在下LF肽HL2(250μg/ml)的殺真菌活性。溶液培育2h并且通過(guò)存活數(shù)量來(lái)分析。欄中給出的百分比代表了接種體的存活分?jǐn)?shù)。
發(fā)明詳述被描述成抗菌物質(zhì)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和免疫調(diào)節(jié)蛋白的乳鐵傳遞蛋白(LF)為單鏈鐵-結(jié)合糖蛋白。LF可以在初乳和成熟乳汁中發(fā)現(xiàn)，水平為2-7g/l。在初乳中，LF占全部蛋白含量的43％。其它外分泌腺的分泌物像唾液、眼淚、支氣管粘液、和宮頸陰道液體中也包含LF(表1)。
LF顯著抵抗由胰蛋白酶和胰蛋白酶樣酶的蛋白降解。然而，胃蛋白酶消化產(chǎn)生了肽片段-乳鐵結(jié)合蛋白(Lactoferricin)，其對(duì)體外的廣譜細(xì)菌有強(qiáng)殺菌作用。LF和乳鐵結(jié)合蛋白在體外具有殺細(xì)菌和殺真菌作用。
表1

維持陰道中微生物之間的平衡是十分重要的。在BV(由沒(méi)有炎癥的陰道微生物群不平衡引起的令人不快的排泄物)的治療中，重新確定乳酸菌占優(yōu)勢(shì)的微生物群是十分重要的。
在研究工作中產(chǎn)生了本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)結(jié)合上述已知的乳酸鹽與LF和/或其肽片段可以獲得出人意料的良好的協(xié)同作用。
因此，本發(fā)明提供了包含LF和/或其肽片段的酸性乳酸組合物。按照本發(fā)明的組合物通過(guò)幫助重新建立乳酸桿菌的生產(chǎn)環(huán)境、降低pH以及通過(guò)發(fā)揮對(duì)許多微生物，例如白色假絲酵母、大腸桿菌，金黃色釀膿葡萄球菌、陰道加德納氏菌和普雷沃氏菌屬的抗菌活性增強(qiáng)了陰道粘膜的天然保護(hù)機(jī)制。
用于本發(fā)明的LF可以為人LF、重組人LF(rHLF)，或者牛LF。
人LF是指從人體，例如從人乳汁中純化的LF。
重組的人LF是指在原核或真核細(xì)胞(細(xì)菌、真菌細(xì)胞、植物或動(dòng)物)中通過(guò)DNA雜交技術(shù)生產(chǎn)的LF。
LF的肽片段也可以用于本發(fā)明中，可單獨(dú)使用或聯(lián)合LF共同使用。也可能使用任一種肽片段或兩種或多種不同種類的肽片段。
“LF的肽片段”是指不同大小的肽，其基于N-末端的LF分子中的抗微生物區(qū)域。肽片段序列是基于由從N-末端計(jì)算的人LF的氨基酸(a.a.)1-40，尤其是氨基酸12-40組成的序列。也可以使用合成以及重組的肽。LF肽的一個(gè)例子是乳鐵結(jié)合蛋白。另一個(gè)例子可以是分別從N-末端起算在位置16或18開(kāi)始的a.a.殘基25或23個(gè)氨基酸長(zhǎng)肽。適用于本發(fā)明的LF肽在公開(kāi)號(hào)為WO 00/01730的國(guó)際申請(qǐng)中描述。
LF和/或其肽片段的濃度可以例如在0.0001至100mg/ml，0.0001至1mg/ml，0.001至10mg/ml，0.01至5mg/ml，或1至50mg/ml的范圍內(nèi)。特別地，LF和/或其肽片段的濃度在0.001至10mg/ml的范圍內(nèi)，或者在0.01至5mg/ml的范圍內(nèi)。
乳酸的濃度可以在1至100mg/ml或10至100mg/ml的范圍內(nèi)。
此外，乳酸鹽，即乳酸的鹽，可以用于本發(fā)明中。
組合物可以包含緩沖乳酸的pH值的中和物質(zhì)。中和物質(zhì)的例子為氫氧化鈉或氨水。
乳酸和中和物質(zhì)的含量可以是使得pH值在3.5至4.5，優(yōu)選接近3.8的范圍內(nèi)的量。pH值優(yōu)選不太低以免酸刺激組織或者削弱需要適當(dāng)?shù)乃岘h(huán)境的乳酸桿菌的環(huán)境。據(jù)顯示，3.7-3.9的pH值是特別有利的。
組合物可以進(jìn)一步包含用于乳酸細(xì)菌的生長(zhǎng)底物。生長(zhǎng)底物優(yōu)選為包含α(1-6)分支的α(1-4)葡聚糖。
合適的生長(zhǎng)底物的例子為糖原，其富含在育齡婦女的陰道上皮細(xì)胞中并且是乳酸桿菌的重要營(yíng)養(yǎng)底物。糖原用作乳酸桿菌的生長(zhǎng)底物，以使治療不僅僅通過(guò)供給乳酸的方式調(diào)節(jié)pH水平至一個(gè)較低的數(shù)值，而且重新建立乳酸桿菌生長(zhǎng)的有利環(huán)境以重建自然環(huán)境。生長(zhǎng)底物的其它例子為乳糖、右旋糖、葡萄糖和支鏈淀粉。
以比生長(zhǎng)底物高的多的重量比例加入乳酸，例如為20∶1至500∶1，優(yōu)選為50∶1的重量比。
按照本發(fā)明的組合物可以以霜?jiǎng)?、凝膠、噴霧、片劑或陰道栓劑的形式存在。按照本發(fā)明的組合物由此具有霜?jiǎng)┗蚰z稠度、片劑稠度、適于噴霧給藥的稠度，或者以陰道栓劑或片劑的形式。
按照本發(fā)明的組合物可以陰道、口服或經(jīng)皮給藥。
可以加入用于組合物的活性組分的載體以形成可用的藥物產(chǎn)品。按照本發(fā)明的組合物可以包含在該結(jié)合中惰性類型的載體，并且其提供霜?jiǎng)┗蚰z樣的稠度，或者適于噴霧給藥的稠度?？蛇x擇地，惰性載體為在體溫和在體液中熔化的物質(zhì)。
如果要制備陰道栓劑，需要使其能形成在室溫和在干燥環(huán)境下是相對(duì)固體但是在體溫和與體液接觸時(shí)熔化的載體。在這個(gè)組合中，可以使用聚乙二醇，PEG，其在陰道環(huán)境中逐漸熔化。
霜?jiǎng)┑囊粋€(gè)合適載體是丙二醇，但是其它惰性種類的物質(zhì)，例如，甘油三酸酯也公知可作為載體用于該組合中。
本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含稠度劑，例如在霜?jiǎng)┖湍z的例子中的纖維素的甲基羥丙醚。可以提及的商業(yè)產(chǎn)品的一個(gè)例子是Hypromellosum@90 HG 4000。另一個(gè)稠度劑的例子是玉米淀粉。
“泌尿生殖道中的病癥”表示女性和/或男性在泌尿道或生殖器官中的失調(diào)或紊亂。特別的，本發(fā)明適合陰道中病癥的治療。
依照本發(fā)明治療的病癥包括泌尿生殖道中升高的pH值和/或被擾亂的菌群。通過(guò)“提高的pH值”表示超過(guò)4.5的pH值。
通過(guò)“被擾亂的微生物群”表示具有異常高水平的BV-相關(guān)細(xì)菌，例如陰道加德納氏菌，厭氧革蘭氏陰性菌(普雷沃氏菌屬、類桿菌-和梭菌屬)，厭氧革蘭氏陽(yáng)性球菌、動(dòng)彎桿菌屬和/或異常高水平的大腸桿菌、葡萄球菌(金黃色釀膿葡萄球菌)和鏈球菌，并合并有異常低水平的乳酸桿菌的生物群?？蓪?dǎo)致陰道病的高水平假絲酵母也被認(rèn)為是被擾亂的陰道微生群。
“異常高水平”表示高于常人水平100到1000倍的水平。
“異常低水平”表示不占優(yōu)勢(shì)，即不存在或在每個(gè)顯微鏡視野少于一個(gè)乳酸菌態(tài)模標(biāo)本，或在每個(gè)視野少于或等于其它態(tài)模標(biāo)本。(根據(jù)“Nugent評(píng)分系統(tǒng)”評(píng)估，其在國(guó)際上被用于描述陰道分泌物中的細(xì)菌不均衡。參見(jiàn)Nugent RP等人1991，J Clin Microbiol29297-301.)“抗微生物活性”表示抑細(xì)菌、抑真菌、殺細(xì)菌和/或殺真菌活性，即分別延緩和殺死某些細(xì)菌或真菌的能力。
“預(yù)防和/或治療病癥”表示用于治愈或減輕上述病癥，或預(yù)防該病癥發(fā)展的治療。
欲用本發(fā)明組合物治療的病癥的例子是細(xì)菌性陰道病、中間型陰道微生物群(intermediate vaginal microbiota)和酵母感染，如假絲酵母感染(假絲酵母陰道病，假絲酵母陰莖頭炎)。
此外，本發(fā)明的組合物可以被用于治療衣原體、生殖器支原體、滴蟲(chóng)病、泌尿道感染、盆腔炎和由人乳頭瘤病毒(HPV)導(dǎo)致的感染。此外，任何前述病癥的組合都可以用本發(fā)明的組合物治療。
本發(fā)明的組合物也可以治療例如真菌濕疹、潰瘍性乳頭(ulcerousnipples)，或作為性傳播疾病的預(yù)防劑，或作為助流劑。
本發(fā)明的組合物也可以被用于治療口腔、咽喉和/或鼻子中細(xì)菌和/或病毒感染。此外，它可以被用于治療由細(xì)菌和/或病毒引起的皮膚感染。
“藥學(xué)有效量”表示導(dǎo)致預(yù)期藥學(xué)和/或治療效果的本發(fā)明組合物的量。如上所述，預(yù)期的藥學(xué)和/或治療效果是治愈或減輕和/或預(yù)防泌尿生殖道中病癥的發(fā)展。
“病患”表示任何需要用本發(fā)明所述組合物和/或方法治療的女性或男性的，人類或非人哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其它物質(zhì)，例如佐劑、載體、防腐劑、維生素、礦物質(zhì)、雌激素等。
此外，還可以結(jié)合本發(fā)明的組合物和其它泌尿生殖道病癥的常規(guī)藥物治療，例如用抗生素和/或抗真菌劑，如咪唑制劑治療。
組合物可以是濃縮物的形式，由用戶在使用前進(jìn)行稀釋。這種濃縮物適于用如純水、水溶液或鹽水稀釋。
本發(fā)明組合物的具體例子如下列示例組合物所示。
霜?jiǎng)?

霜?jiǎng)?

實(shí)施例材料和方法細(xì)菌和真菌菌株在微量培養(yǎng)板試驗(yàn)中使用細(xì)菌菌株金黃色釀膿葡萄球菌1800(CCUG 1800)、大腸桿菌06和酵母-白色假絲酵母(ATCC 64549)。所有的微生物在腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)中于37℃振蕩器上培養(yǎng)過(guò)夜。部分培養(yǎng)基被轉(zhuǎn)移至包含BHI的新試管中并且在振蕩器上再培養(yǎng)兩個(gè)小時(shí)。在指數(shù)階段收集細(xì)菌，洗滌一次并且隨后懸浮在用于微量培養(yǎng)板試驗(yàn)的肉湯培養(yǎng)基中。通過(guò)分光光度測(cè)定調(diào)整懸浮液，將其稀釋至在650nm大約每毫升4×106個(gè)細(xì)胞。
加氏乳桿菌和詹氏乳桿菌在巧克力瓊脂平皿上于5％CO2/95％空氣的條件下培養(yǎng)24h。隨后收集它們并將其加至BHI(0.34％)中。洗滌后分光光度測(cè)定調(diào)整細(xì)菌溶液，將其稀釋至每毫升8×106個(gè)細(xì)菌。
陰道加德納氏菌和雙路普雷沃氏菌在巧克力-GL-平皿上于無(wú)氧條件下培養(yǎng)48h。收集細(xì)菌并將其懸浮于BHI中以進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)(37℃下4小時(shí))。細(xì)菌在細(xì)菌用蛋白胨(BP，0，2％)中洗滌兩次。分光光度測(cè)定調(diào)整濃度，將其稀釋至每毫升1×107個(gè)細(xì)菌。
LF和肽源自人乳的LF購(gòu)自Sigma(Saint Louis，USA)。從Agennix獲得重組的人LF。通過(guò)fmoc-策略合成基于人LF抗菌區(qū)域的由23個(gè)氨基酸組成的肽片段。
最小殺微生物和抑制濃度，MMC.
將洗滌過(guò)的細(xì)胞懸浮于0.2％BP(pH7.0)或稀釋1/10的BHI培養(yǎng)基(0.34％，pH6.7-6.9)(Difco，USA)中。分光光度測(cè)定調(diào)整細(xì)菌或真菌細(xì)胞的濃度。LF或肽，在BHIdil或BP中通過(guò)兩個(gè)步驟被連續(xù)稀釋(除非另有規(guī)定)，一式三份的加入到微量滴定平皿(200μl/孔)的孔中。加入10μl體積的細(xì)菌或酵母細(xì)胞溶液以達(dá)到大約每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的最終濃度。始終通過(guò)活菌計(jì)數(shù)來(lái)檢查儲(chǔ)備溶液的濃度。除非另有規(guī)定，于37℃在潮濕空間內(nèi)培養(yǎng)微量培養(yǎng)板2h。從每個(gè)孔中取5μl滴加至血液瓊脂平皿上并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。在一些實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行更加徹底的活菌計(jì)數(shù)，殺菌率表示為與接種體相比殘余的集落形成單位。微生物檢測(cè)的下限為200CFU/ml。
有關(guān)陰道加德納氏菌和雙路普雷沃氏菌的殺菌試驗(yàn)的程序如上所述，除了微量培養(yǎng)板在無(wú)氧條件下培養(yǎng)(2h)。隨后在于37℃下無(wú)氧培養(yǎng)48h后，于血液瓊脂平皿上分析溶液液滴中存活的細(xì)菌。
實(shí)施例1乳酸鹽和LF的抗微生物活性通過(guò)上述的殺微生物試驗(yàn)分析人LF的抗微生物活性。分析不同的微生物，如白色假絲酵母，大腸桿菌和金黃色釀膿葡萄球菌在包含LF的乳酸鹽(不含使凝膠不適于殺微生物試驗(yàn)的惰性凝膠成分)中的生存情況。
圖1顯示在存在乳酸鹽(a)和氯化氫(b)的情況下LF對(duì)白色假絲酵母的抗真菌活性。LF與在0.2％細(xì)菌用蛋白胨中稀釋的各種濃度的乳酸鹽和白色假絲酵母共同培養(yǎng)2小時(shí)。此后分析每個(gè)溶液的活菌計(jì)數(shù)。
我們的結(jié)果顯示，除了0.5mg的稀釋度1％的乳酸鹽(圖1a)外，當(dāng)乳酸鹽稀釋五倍或更多(≤1％)時(shí)對(duì)于所有的LF濃度，LF都增強(qiáng)乳酸鹽對(duì)白色假絲酵母的抗微生物效果。LF在乳酸鹽濃度為0.2％，0.04％和0％的乳酸鹽中減少99.9％的酵母細(xì)胞。在未稀釋的乳酸鹽中，觀察到抗真菌活性。1％的乳酸鹽減少65％的假絲酵母。然而，在存在2和5mg/ml LF的情況下分別殺死92和98.2％的接種物。用與乳酸鹽相同pH的HCl替換乳酸鹽在未稀釋時(shí)導(dǎo)致殺假絲酵母活性的降低(圖1b)。這些試驗(yàn)也顯示不僅是低pH值，而且乳酸鹽本身對(duì)于抗真菌活性也很重要(在未稀釋的乳酸鹽溶液中)。
在不存在或存在LF的情況下，乳酸鹽對(duì)大腸桿菌和金黃色釀膿葡萄球菌的抗菌活性都很好(表2和3)。
還分析了LF和乳酸鹽對(duì)陰道中常見(jiàn)的兩種乳酸菌(加氏乳桿菌和詹氏乳桿菌)的效果(圖2)。
圖2顯示LF(2mg/ml)對(duì)加氏乳桿菌和詹氏乳桿菌的效果。細(xì)菌在用0.34％BHI稀釋的不同濃度的乳酸鹽中培養(yǎng)3h，并在CO2中培養(yǎng)。加氏乳桿菌在試驗(yàn)體系中比詹氏乳桿菌生存的更好。未稀釋的乳酸鹽(5％)影響乳酸菌的存活。在1％的乳酸鹽中，詹氏乳桿菌無(wú)法存活，但是LF處理的18％的加氏乳桿菌存活。
在接下來(lái)的試驗(yàn)中，比較大腸桿菌和加氏乳桿菌以查明是否不同的培養(yǎng)條件(0.34％BHI，CO2培養(yǎng)器)將會(huì)改變LF的效果。因此，用與加氏乳桿菌相同的方式處理大腸桿菌。
如前面所發(fā)現(xiàn)的一樣，大腸桿菌對(duì)于乳酸鹽敏感，加氏乳桿菌在包含或不包含LF的乳酸鹽中比大腸桿菌更具抗性(圖3)。
表2通過(guò)殺微生物微量培養(yǎng)板-小滴試驗(yàn)分析的不同濃度乳酸鹽中LF的殺微生物活性。數(shù)字表示與接種體相比殘余細(xì)菌的百分比。+++表示在5μl液滴中包含的集落形成單位(CFU)的數(shù)量形成細(xì)菌的平滑層，++表示發(fā)現(xiàn)“有褶飾邊的”區(qū)域，最后0表示在一式三份5μl的樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CFU(＞99.95的接種體被殺死)。

表3通過(guò)殺微生物微量培養(yǎng)板-小滴試驗(yàn)分析的不同濃度乳酸鹽中LF的殺微生物活性。數(shù)字表示與接種體相比殘余的細(xì)菌的百分比。+++＝在5μl液滴中包含的集落形成單位的數(shù)量形成細(xì)菌的平滑層。(括號(hào)＝與對(duì)照相比向有褶飾邊區(qū)域的傾向)。0＝在一式三份5μl的樣品中沒(méi)有細(xì)菌(＞99.95的接種體被殺死)。

試驗(yàn)表明加氏乳桿菌與大腸桿菌相比對(duì)乳酸鹽和LF組合的影響更具抗性，盡管在沒(méi)有乳酸鹽的LF中加氏乳桿菌存活率很低。
還分析了LF對(duì)陰道加德納氏菌和雙路普雷沃氏菌的抗菌活性。在該試驗(yàn)中，即使在無(wú)氧條件下，細(xì)菌菌株無(wú)法在我們的試驗(yàn)體系中存活。(參見(jiàn)下面實(shí)施例2的進(jìn)一步試驗(yàn))總之，LF增強(qiáng)乳酸鹽對(duì)C.albicans和大腸桿菌的抗微生物活性(雖然活性的大小在某種程度上依賴于對(duì)C.albicans的LF和乳酸鹽濃度)。
在未稀釋的乳酸鹽濃度下，當(dāng)對(duì)白色假絲酵母、金黃色釀膿葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行分析時(shí)，在沒(méi)有LF的情況下抗菌活性是完全的。這也表明不僅pH值對(duì)于抗菌活性是重要的，而且導(dǎo)致低pH值的分子的類型也是重要的。因此，α-羥化丙酸、乳酸鹽在存在LF的情況下比HCl更具活性(圖1)。
似乎LF與乳酸鹽的聯(lián)合對(duì)于宿主抵抗異味和抗微生物不均衡是有益的。
實(shí)施例2LF對(duì)陰道加德納氏菌和P.bivia的抗菌活性修改殺菌試驗(yàn)以便得到陰道加德納氏菌和雙路普雷沃氏菌的存活條件。使用0.34％的BHI替代0.2％的BP。在孔中只加入不同濃度的LF的情況(不存在乳酸鹽)下分析細(xì)菌菌株。平皿培養(yǎng)20小時(shí)。
在所有測(cè)試的菌株中都發(fā)現(xiàn)由LF導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制(圖4)。
在第二個(gè)系列的試驗(yàn)中，為陰道加德納氏菌的7個(gè)菌株測(cè)定99％殺菌率下的最小殺菌濃度(MBC)(表4)。在這些之外，僅有一個(gè)在與2.5mg LF培養(yǎng)時(shí)顯示少許生長(zhǎng)。因而，確定了LF對(duì)雙路普雷沃氏菌和G.vaginalis的抗菌活性。
表4LF的殺菌活性。通過(guò)連續(xù)步驟將LF稀釋五倍。獲得產(chǎn)生99％殺菌率的濃度，定義為MBC99。

使用的濃度為2500，500，100，20，4μg/ml實(shí)施例3乳酸鹽和rHLF的抗微生物活性目的是為了檢測(cè)是否rHLF可以增強(qiáng)乳酸鹽的抗微生物效果至與人乳汁中純化的LF(Sigma)相同的程度。
通過(guò)微量培養(yǎng)板試驗(yàn)分析包含rHLF的乳酸鹽(不包括凝膠成分)的抗微生物活性。分析微生物白色假絲酵母、大腸桿菌和金黃色釀膿葡萄球菌。
在我們第一個(gè)試驗(yàn)中，在沒(méi)有乳酸鹽的條件下比較rHLF和LF(沒(méi)有顯示)。微量培養(yǎng)板試驗(yàn)分析顯示兩種LF制劑在對(duì)大腸桿菌的抗菌活性上類似，雖然LF在0.25和0.125mg/ml的濃度下在某種程度上對(duì)金黃色釀膿葡萄球菌和白色假絲酵母更具活性(培養(yǎng)2h)。
在存在乳酸鹽的情況下，未稀釋的乳酸鹽(5％)獲得對(duì)白色假絲酵母最強(qiáng)的活性，因?yàn)闆](méi)有酵母細(xì)胞存活(圖5a)。然而，在1％的乳酸鹽濃度下，rHLF(0.5-1.0mg/ml)對(duì)接種物幾乎達(dá)到99％的殺菌率。在0.2％的乳酸鹽濃度下，1mg/ml的任一種LF制劑都幾乎達(dá)到99％的殺菌率。關(guān)于對(duì)大腸桿菌的殺菌率，沒(méi)有細(xì)菌在未稀釋的乳酸鹽(5％)中存活，雖然兩種LF制劑都增強(qiáng)1％乳酸鹽濃度下的殺菌率(圖5b)。1mg/ml的rHLF是0.2％乳酸鹽濃度下和無(wú)乳酸鹽溶液中兩種LFs中最有效率的。
在下面的試驗(yàn)中，研究更高濃度的LF和rhLF對(duì)白色假絲酵母的殺真菌效果(圖6)。再一次，rHLF與LF相比在1％乳酸鹽濃度下獲得更強(qiáng)的效果。在0.2％乳酸鹽下，僅在更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間(20h，圖6)后觀察到rHLF更強(qiáng)的效果。
根據(jù)用2mg rHLF獲得的結(jié)果(見(jiàn)圖6)，分析LF制劑對(duì)兩種來(lái)自陰道菌群的乳酸菌，加氏乳桿菌和詹氏乳桿菌的效果(圖7)。在培育2h時(shí)，rHLF與存在乳酸鹽時(shí)所導(dǎo)致的相比對(duì)加氏乳桿菌存活沒(méi)有附加的效果(圖7a)，雖然兩種LF制劑在1％乳酸鹽下都增強(qiáng)詹氏乳桿菌的殺菌率。在0.2％的乳酸鹽下，詹氏乳桿菌對(duì)rhLF的抗菌效果更具抗性。因此，詹氏乳桿菌與加氏乳桿菌相比更容易受LF制劑效果的影響，尤其是在1％的乳酸鹽的情況下(圖7b)，且兩個(gè)乳酸菌種都對(duì)rhLF更具抗性。
總之，通過(guò)加入rHLF到乳酸鹽中可以獲得協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)在稀的BHI培養(yǎng)基(0.34％)中檢測(cè)時(shí)，rHLF與LF相比在抗微生物活性上稍弱。相反，除了使用乳酸桿菌的時(shí)候外，當(dāng)存在乳酸鹽(1或0.2％)的情況下rHLF與LF相比稍強(qiáng)。這種相反的效果對(duì)宿主是有益的，因?yàn)槿樗釛U菌屬于健康的正常菌群。結(jié)果表明2mg/ml的rHLF是乳酸鹽中合適的濃度。
實(shí)施例4乳酸鹽和LF肽，HL2的抗微生物活性分析包含23個(gè)氨基酸的基于LF分子抗微生物區(qū)域的肽片段在存在乳酸鹽時(shí)的殺真菌活性。如圖8中所示，加入HL2降低在任何乳酸鹽濃度下和沒(méi)有加入乳酸鹽時(shí)的酵母細(xì)胞的生存能力。然而在未稀釋的乳酸鹽濃度(5％)下，即使沒(méi)有HL2，乳酸鹽的效果也是完全的。
因此，短LF肽片段增加了乳酸鹽溶液的抗真菌活性。
總結(jié)總結(jié)實(shí)施例，向乳酸鹽中加入LF增加了它的抗微生物效果。
當(dāng)聯(lián)合乳酸鹽和LF/rHLF時(shí)，獲得了對(duì)細(xì)菌如大腸桿菌的協(xié)同效應(yīng)(圖5b)。關(guān)于乳酸鹽對(duì)假絲酵母的抗真菌活性，向乳酸鹽中加入特定的rHLF也顯示出協(xié)同效應(yīng)(圖5a和圖6)。
該協(xié)同效應(yīng)是出人意料的，因?yàn)樵黾雍韶?fù)電的分子(乳酸鹽)被認(rèn)為會(huì)和細(xì)菌表面的負(fù)電荷基團(tuán)競(jìng)爭(zhēng)與陽(yáng)離子LF的相互作用。通常認(rèn)為與微生物的荷負(fù)電表面的靜電相互作用是LF殺微生物活性的第一步。例如，已顯示增加濃度的磷酸鹽和重碳酸鹽可以降低人LF的殺真菌活性(Soukka等人，1992，F(xiàn)EMS Microbiology letters90223-228)。
還需要強(qiáng)調(diào)的是無(wú)論是否加入rHLF(圖7a)，乳酸桿菌，如加氏乳桿菌都出人意料地同樣良好存活。
權(quán)利要求
1.用于治療和/或預(yù)防泌尿生殖道中病癥的包含乳酸的組合物，其特征在于包含乳鐵傳遞蛋白和/或其片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中乳鐵傳遞蛋白和/或其肽片段的濃度在0.0001至100mg/ml的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中乳鐵傳遞蛋白和/或其肽片段的濃度在0.001至10mg/ml的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中乳鐵傳遞蛋白和/或其肽片段的濃度在0.01至5mg/ml的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述乳鐵傳遞蛋白是重組人乳鐵傳遞蛋白。
6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述乳鐵傳遞蛋白的肽片段是合成的或重組的。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中乳酸的濃度在1至100mg/ml的范圍內(nèi)。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其進(jìn)一步包含中和物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中乳酸和中和物質(zhì)的含量使得pH值在3.5至4.5的范圍內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的組合物，其中所述中和物質(zhì)是氫氧化鈉。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其進(jìn)一步包含用于乳酸桿菌種屬的生長(zhǎng)底物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中乳酸與生長(zhǎng)底物的重量比率在20∶1至500∶1的范圍中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中乳酸與生長(zhǎng)底物的重量比率為50∶1。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一的組合物，其中所述生長(zhǎng)底物是包含α(1-6)支鏈的α(1-4)葡聚糖。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中所述生長(zhǎng)底物選自糖原、支鏈淀粉、葡萄糖、右旋糖和乳糖。
16.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其進(jìn)一步包含惰性載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中所述惰性載體是丙二醇或聚乙二醇。
18.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其進(jìn)一步包括稠度劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中所述稠度劑是纖維素的甲基羥丙醚。
20.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，以霜?jiǎng)⒛z、陰道栓劑、片劑或噴霧劑的形式存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一組合物制備用于預(yù)防和/或治療泌尿生殖道病癥的藥物中的應(yīng)用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述藥物具有抗微生物活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的應(yīng)用，其中所述病癥包括泌尿生殖道中升高的pH和/或被擾亂的微生物群。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中所述被擾亂的微生物群的特征在于與異常低水平的乳酸桿菌聯(lián)合的異常高水平的BV-相關(guān)細(xì)菌(厭氧革蘭氏陰性菌、厭氧革蘭氏陽(yáng)性球菌、葡萄球菌鏈球菌、大腸桿菌)和/或假絲酵母。
25.根據(jù)權(quán)利要求21-24的任一應(yīng)用，其中所述病癥選自細(xì)菌性陰道病、中間型陰道微生物群和酵母感染。
26.預(yù)防和/或治療泌尿生殖道中病癥的方法，其包括給需要的患者施用藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1至20任一的組合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述病癥包括泌尿生殖道中提高的pH值和/或被干擾的微生物群。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述被干擾的微生物群的特征在于與異常低水平的乳酸桿菌聯(lián)合的異常高水平的BV-相關(guān)細(xì)菌(厭氧革蘭氏陰性菌、厭氧革蘭氏陽(yáng)性球菌、葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌)和/或假絲酵母。
29.權(quán)利要求26-28任一的方法，其中所述病癥選自細(xì)菌性陰道病、中間型陰道微生物群和酵母感染。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了治療和/或預(yù)防泌尿生殖道中病癥的組合物，包含乳酸和乳鐵傳遞蛋白和/或其肽片段。還公開(kāi)了所述組合物制備治療和/或預(yù)防泌尿生殖道中病癥的藥物的用途，及其治療方法。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1972683SQ200580020697
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日
發(fā)明者I·馬茨比－巴爾策, B·安德施 申請(qǐng)人:內(nèi)斯托爾醫(yī)藥股份公司