專利名稱：細(xì)菌感染的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療艱難梭菌(Clostridium difficile)感染的化合物、藥物和治療劑，以及新的分離的抗體和它們在治療艱難梭菌感染中的用途。本發(fā)明還涉及預(yù)防和治療屎鏈球菌(E.faecium)和糞鏈球菌(E.faecalis)感染，并提供用于預(yù)防和治療屎鏈球菌和糞鏈球菌感染的藥物和治療劑。
艱難梭菌(C. difficile)為革蘭氏陽性厭氧菌，并被認(rèn)為是引起從輕度腹瀉至爆發(fā)性假膜性結(jié)腸炎(PMC)(合稱為艱難梭菌抗生素相關(guān)性腹瀉(CDAD))的疾病譜的重要的人類病原體。CDAD是常見的、醫(yī)源性、醫(yī)院內(nèi)感染疾病，具有一定發(fā)病率和死亡率，尤其是在老年人中。在CDAD的發(fā)病機(jī)理中，有兩個(gè)因素起主要作用，即施用抗生素對固有的腸道菌群的抑制和由細(xì)菌生成了兩種高分子量的毒素細(xì)菌(外毒素A和外毒素B)。
細(xì)菌在醫(yī)院很普遍，研究已經(jīng)表明在住院時(shí)，在重癥監(jiān)護(hù)病房接受抗生素治療的患者中約三分之一受到艱難梭菌感染(Kyne，L.，etal.，2002，Clin.Infect.Dis.34(3)，pp346-53，PMID11774082)。在這些患者中，超過半數(shù)會發(fā)展成CDAD，其余的為無癥狀攜帶者。CDAD是患者住院時(shí)間延長的主要因素，有估計(jì)表明，在美國，該疾病每年的花費(fèi)超過11億美元(Kyne，L.，et al.，Supra)?；加蠧DAD的患者對包括停藥刺激性抗生素的治療和抗生素甲硝唑和萬古霉素的治療有良好的應(yīng)答。對最初的抗生素治療的應(yīng)答率可以很高(達(dá)95％)，但是達(dá)20％的患者在初次治療的一至兩周內(nèi)復(fù)發(fā)，隨著每次復(fù)發(fā)使復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)不斷增加。典型地，可用抗生素治療復(fù)發(fā)，這表明復(fù)發(fā)是由不同的艱難梭菌菌株感染所致。此外，有證據(jù)表明艱難梭菌正變得對甲硝唑有耐藥性，并且對萬古霉素有部分耐藥性，這證實(shí)在CDAD的治療中需要新的選擇。
由細(xì)菌致病菌株生成的外毒素A和B具有細(xì)胞毒性、腸毒性和促炎性，并被認(rèn)為是該非侵入性微生物的主要致病因子。然而，并非所有的產(chǎn)毒菌株感染都會導(dǎo)致疾病，這提示應(yīng)研究其它的致病因子。細(xì)菌表面表達(dá)抗原代表候選致病因子，并且也被認(rèn)為非常重要，因?yàn)檫@種蛋白質(zhì)可能介導(dǎo)重要功能(例如在建群的第一步中粘附至腸道上皮層或與局部免疫介質(zhì)相互作用)。與許多其它細(xì)菌一樣，艱難梭菌在細(xì)胞外表面表達(dá)結(jié)晶或類結(jié)晶表層(S-層)。這種S-層包含在細(xì)菌外表面上形成規(guī)則排列晶格的蛋白質(zhì)或糖蛋白，且在先前已被表明對病原體例如殺鮭變形菌(Aeromanas salmonicida)和胎兒彎曲桿菌(Campylobacter fatus)的毒性是必需的。與大多數(shù)包含一個(gè)S-層的細(xì)菌相反，已知艱難梭菌包含兩個(gè)重疊的類結(jié)晶S-層，每一S-層由糖蛋元亞單位構(gòu)成，所述亞單位的表觀分子量在不同的艱難梭菌菌株中有輕微改變。大多數(shù)艱難梭菌菌株表達(dá)兩個(gè)主要的S-層蛋白質(zhì)(SLP)，一個(gè)為32-38kDa(低分子量SLP)，另一個(gè)為42-48kDa(高分子量SLP)。該低分子量SLP顯示呈免疫顯性，是CDAD患者可識別的最普遍的抗原，并且是在對兔抗整個(gè)艱難梭菌細(xì)胞中出現(xiàn)的抗血清所識別的細(xì)菌EDTA提取物中的唯一抗原(Calabi，E.et al.，2001，Mol.Microbiol.，40(5)p1187-99，PMID11401722)。
在微生物感染過程中，免疫系統(tǒng)應(yīng)用了多種適應(yīng)性策略。其中一種可以說是最重要的策略是產(chǎn)生抗體應(yīng)答。制備能結(jié)合由感染原所展示的抗原的抗體，并將其與微生物結(jié)合以通過補(bǔ)體激活、巨噬細(xì)胞的募集和通過與微生物本身直接相互作用而殺死微生物。能結(jié)合給定抗原的抗體的治療效力是變化的，這體現(xiàn)在免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體在感染過程中成熟并變得能夠集中于使患者成功抗擊感染的事實(shí)。
B細(xì)胞儲備庫引發(fā)抗體應(yīng)答，其中每個(gè)B細(xì)胞各自生成結(jié)構(gòu)不同的抗體分子。該B細(xì)胞/抗體儲備庫的實(shí)際大小是未知的，但據(jù)估計(jì)，在培養(yǎng)的B細(xì)胞中，對給定抗原的反應(yīng)性的隨機(jī)克隆頻率可高達(dá)1/100,000(Nobrega，A.，et al.，Eur J Immunol.1998 Apr；28(4)1204-15；PMID9565360)。在感染過程中，選擇能結(jié)合病原體的抗體，以通過B細(xì)胞群的變化而使得關(guān)鍵抗體能大量產(chǎn)生。這些變化的機(jī)制包括克隆性增殖、同種型轉(zhuǎn)換和免疫球蛋白可變區(qū)的體細(xì)胞突變。負(fù)責(zé)產(chǎn)生能夠結(jié)合抗原的抗體的B細(xì)胞增殖，因而，改變B細(xì)胞儲備庫并改變B細(xì)胞的比例。
在小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)抗艱難梭菌外毒素A的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體受到保護(hù)，并且發(fā)現(xiàn)有艱難梭菌建群但沒有癥狀的患者具有提高的抗-外毒素AIgG滴度。顯示出這種提高的血清抗-外毒素AIgG滴度以應(yīng)答建群的被感染患者患上CDAD的可能性較那些不顯示出這種提高的滴度的患者少48倍。因此，如使用抗-艱難梭菌外毒素A抗體一樣，用艱難梭菌外毒素A接種疫苗也被認(rèn)為是一種治療策略(Giannasca PJ and Warny M.，Vaccine，2004Feb 17；22(7)848-56；PMID15040937)。
用于治療/預(yù)防艱難梭菌感染的基于非抗生素的治療方案是基于接種疫苗和被動(dòng)免疫。接種疫苗治療包括給患者施用編碼艱難梭菌表層蛋白或其變體或類似物的免疫原性片段的核酸序列或等價(jià)多肽片段(如在WO 02/062379中公開的)。典型地，被動(dòng)免疫療法通過給患者施用特異于病原體產(chǎn)生的免疫原的單克隆抗體實(shí)現(xiàn)。一般而言，被動(dòng)免疫療法對于治療不能對接種疫苗產(chǎn)生應(yīng)答的無免疫應(yīng)答患者，和急需治療且不能等待接種疫苗見效的患者特別有效。在艱難梭菌感染的情況下，被動(dòng)免疫依靠給患者施用毒素中和多克隆免疫球蛋白(如在WO 99/20304中公開的)，或產(chǎn)生的抗全部細(xì)菌和毒素的抗體(如在WO 96/07430中公開的)。
因此，艱難梭菌感染的有效治療非常重要，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)這種治療的目標(biāo)應(yīng)為抗艱難梭菌外毒素A、抗所述表層蛋白的接種疫苗或被動(dòng)免疫療法，或?yàn)樘禺愋钥刮磋b定的細(xì)菌毒素的多克隆血清。
然而，本申請發(fā)明人已經(jīng)鑒定了用于治療的特異性靶點(diǎn)。下面的實(shí)驗(yàn)表明艱難梭菌感染患者產(chǎn)生了特異性抗乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)的抗體提高的滴度，且抗-乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)抗體本身在治療艱難梭菌感染中是有用且有效的。此外，當(dāng)抗-乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶抗體，尤其是從來自艱難梭菌感染患者的最主要的CDR序列構(gòu)建的合成抗體，與抗生素萬古霉素或慶大霉素一起使用時(shí)，會產(chǎn)生對艱難梭菌感染的協(xié)同治療。
因此，本發(fā)明的第一方面提供了乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑在制備用于治療或預(yù)防艱難梭菌感染的藥物中的用途。
除非另有明確說明，本申請所使用的術(shù)語“治療”具有廣泛的含義。因此，通過“治療”意指在治愈、緩解、消除或減輕人類或動(dòng)物體感染性疾病或機(jī)能障礙的癥狀，或預(yù)防或減少這種可能性。因此，術(shù)語“治療”意指疾病的治療及它們的預(yù)防。
特別地，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可來自艱難梭菌，且其可具有SEQ ID NO43的序列。
大量的抑制劑可用于特異性抗乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶。特別地，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可以與抑制劑形成特異性結(jié)合對(specificbinding pair，sbp)，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶為該對的第一個(gè)成員，抑制劑為第二個(gè)成員。
在本申請中，“特異性結(jié)合對的成員”是兩個(gè)不同分子中的一個(gè)，所述分子在表面上或空腔中具有與另一分子特異性結(jié)合從而被定義為與另一分子的特定空間或極性結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的區(qū)域。所述特異性結(jié)合對的成員被稱作配體和受體(反配體(antiligand))、sbp成員和sbp配偶體、sbp成員等。這些通常是免疫學(xué)配對的成員例如抗原-抗體，盡管該術(shù)語沒有更廣泛地包括其它特異性結(jié)合對例如RNA-蛋白、DNA蛋白等。
因此，所述抑制劑可以是抗體或其抗原結(jié)合片段，且其可以特異性地抗由SEQ ID NO47的肽所展示的表位。
如在下面實(shí)驗(yàn)部分詳述的那樣，由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位已被鑒定為在各種抗原中是保守的，并因此被鑒定為展示由那些抗原所共享的保守表位的肽.
本申請所使用的各種語法形式的術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部位，即含有抗體結(jié)合位點(diǎn)或抗原互補(bǔ)位的分子。這樣的分子也被稱為免疫球蛋白分子的“抗原結(jié)合片段”。
示例性抗體分子有完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和含有抗原互補(bǔ)位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本領(lǐng)域中已知的那些部分如Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv和F(v)?？贵w及其制備和用途是本領(lǐng)域所眾所周知的(例如Harlow，E.and Lane，D.，″Using AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1998)。
如在下面的實(shí)驗(yàn)中所詳述的那樣，已經(jīng)克隆了艱難梭菌感染患者所產(chǎn)生的抗體的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)，對其進(jìn)行測序并鑒定它們的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。結(jié)果已顯示存在高免疫原性VH鏈CDR1-3(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，和高免疫原性VL鏈CDR1-3(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。
因此，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VH鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其分別具有SEQ ID NO2-4的序列。特別地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VH鏈，該VH鏈具有SEQ ID NO1的序列。
類似地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VL鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。特別地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VL鏈，VL鏈具有SEQ ID NO16的序列。
已制備和使用了具有上述序列的合成抗體，因此，所述抗體可具有SEQ ID NO41的序列。下面詳述的具有SEQ ID NO41的抗體也包含N-末端S-標(biāo)記和C-末端His-標(biāo)記。所述標(biāo)記可用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，但對于治療性抗體是非必需的，盡管它們(或其它標(biāo)記)可能被認(rèn)為是有用的。因此，所述抗體可以額外地包含His-標(biāo)記，例如C-末端His-標(biāo)記。
下面的實(shí)驗(yàn)也表明不僅乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑本身可有效地實(shí)現(xiàn)治療艱難梭菌感染，而且，當(dāng)其與現(xiàn)有的抗生素特別是慶大霉素和萬古霉素聯(lián)合使用時(shí)也是有效的，這種應(yīng)用可提供協(xié)同作用。初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明使用甲硝唑也實(shí)現(xiàn)了協(xié)同。
因此，所述藥物可以額外地包含至少一種選自以下一組的抗生素慶大霉素、萬古霉素和甲硝唑。
自然地，本發(fā)明的醫(yī)藥制劑可包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences和US Pharmacopoeia，1984，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA；United StatesPharmacopoeia，ISBN1889788031)。
如上述，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑本身可有效地實(shí)現(xiàn)治療艱難梭菌感染。因此，本發(fā)明也提供了包含至少以下之一的分離的和/或純化的抗體(i)VH鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其分別具有SEQ ID NO2-4的序列；和(ii)VL鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，具有SEQ ID NO17-19的序列。
如上述，所述VH鏈可以具有SEQ ID NO1的序列。所述VL鏈可以具有SEQ ID NO16的序列。所述抗體可以具有SEQ ID NO41的序列。
本發(fā)明還提供了編碼這種抗體的核酸分子。所述核酸分子可以是分離的和/或純化的。特別地，所述核酸分子可具有SEQ ID NO46的序列。
本發(fā)明還提供了乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑和萬古霉素在制備用于預(yù)防或治療屎鏈球菌或糞鏈球菌感染，尤其是萬古霉素耐藥性屎鏈球菌感染的藥物中的用途。
下述實(shí)驗(yàn)不僅表明使用乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑和萬古霉素可產(chǎn)生艱難梭菌感染的協(xié)同治療，而且也產(chǎn)生屎鏈球菌感染尤其是萬古霉素耐藥性屎鏈球菌感染的協(xié)同治療。初步的實(shí)驗(yàn)也已表明在糞鏈球菌感染的治療中也觀察到了協(xié)同作用。
所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可以來自艱難梭菌。
所述抑制劑可以是抗體或其抗原結(jié)合片段，且其可特異性地抗由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VH鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其分別具有SEQ ID NO2-4的序列。所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VH鏈，該VH鏈具有SEQ ID NO1的序列。
所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VL鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有VL鏈，該VL鏈具有SEQ ID NO16的序列。
所述抗體或其抗原結(jié)合片段可具有SEQ ID NO41的序列。
當(dāng)本發(fā)明涉及提供含有兩種或多種活性成分(例如抗體和抗生素)時(shí)，本發(fā)明還提供了包含這種活性成分的組合制劑。例如，可提供兩種組分分別包裝(two-pack)的制劑。
因此，本發(fā)明還提供了用于治療艱難梭菌感染的組合制劑，其包含(i)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑；和(ii)至少一種選自慶大霉素、萬古霉素和甲硝唑的抗生素。
本發(fā)明還提供了用于治療屎鏈球菌或糞鏈球菌感染的組合制劑，其包含(i)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑；和(ii)萬古霉素。
所述屎鏈球菌或糞鏈球菌可以是對萬古霉素耐藥性的。
本發(fā)明也涉及治療患者的方法。因此，本發(fā)明還提供了治療艱難梭菌感染的方法，包括給有需要的患者施用治療有效量的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。該方法還可包括施用治療有效量的至少一種選自慶大霉素、萬古霉素和甲硝唑的抗生素。
本發(fā)明還提供了治療治療屎鏈球菌或糞鏈球菌感染的方法，包括給有需要的患者施用治療有效量的(i)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑；和(ii)萬古霉素。
所述屎鏈球菌可以具有萬古霉素耐藥性。
根據(jù)以下描述，本發(fā)明將變得更加顯而易見，以下描述僅通過實(shí)施例的形式顯示了治療艱難梭菌和屎鏈球菌感染的形式。
試驗(yàn)在以下的實(shí)驗(yàn)中，已用來自艱難梭菌感染患者的最主要的VH和VL抗體序列構(gòu)建了合成抗體。利用這一合成抗體，分離并純化抗原，并利用電噴射質(zhì)譜鑒定所分離蛋白質(zhì)的推定的部分序列。搜索匹配的艱難梭菌基因組序列鑒定到可能的候選匹配序列。對候選艱難梭菌序列的比較鑒定到被分類為乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)大量同源蛋白質(zhì)，并證實(shí)其為該家族的成員。最匹配的序列是來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的NP_349376，其在391個(gè)氨基酸的長度上顯示出68％的同源性。候選蛋白質(zhì)的克隆、表達(dá)和純化得到了所述合成抗體強(qiáng)結(jié)合的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步試驗(yàn)已表明特異性抗艱難梭菌乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)的抗體與萬古霉素和慶大霉素在艱難梭菌感染的治療中顯示出協(xié)同作用。初步試驗(yàn)也表明使用甲硝唑也會產(chǎn)生協(xié)同。
實(shí)驗(yàn)同樣顯示出所述合成抗體和萬古霉素之間在萬古霉素耐藥性屎鏈球菌的治療中的協(xié)同。初步試驗(yàn)(未顯示)還顯示出所述合成抗體和萬古霉素之間在治療糞鏈球菌感染中的協(xié)同。
除非另有說明，利用可適用的標(biāo)準(zhǔn)方法和以下廠商的使用說明進(jìn)行所有程序。用于各項(xiàng)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法包括PCR、分子克隆、操縱和測序、抗體的制備、表位作圖和模擬表位(mimotope)設(shè)計(jì)、細(xì)胞培養(yǎng)和噬菌體展示，公開于文獻(xiàn)例如McPherson，M.J.et al.(1991，PCRA practical approach，Oxford University Press，Oxford)、Sambrook，J.etal.(1989，Molecular cloninga laboratory manual，Cold Spring HarbourLaboratory，New York)、Huynh and Davies(1985，″DNA Cloning Vol I-APractical Approach″，IRL Press，Oxford，Ed.D.M.Glover)、Sanger，F(xiàn).etal.(1977，PNAS USA 74(12)5463-5467)、Harlow，E.and Lane，D.(″Using AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1998)、Jung，G. and Beck-Sickinger，A.G.(1992，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，31367-486)、Harris，M.A.and Rae，I.F.(″General Techniques of Cell Culture″，1997，Cambridge UniversityPress，ISBN 0521 573645)、″Phage Display of Peptides and ProteinsALaboratory Manual″(Eds. Kay，B.K.，Winter，J.，and McCafferty，J.，Academic Press Inc.，1996，ISBN 0-12-402380-0)中。
在本申請中詳述的方法或其它方法中有用的試劑和裝置可獲自例如Amersham(www.amersham.co.uk)、Boehringer Mannheim(www.boehringer-ingeltheim.com)、Clontech(www.clontech.com)、Genosys(www.genosys.com)、Millipore(www.millipore.com)、Novagen(www.novagen.com)、Perkin Elmer(www.perkinelmer.com)、Pharmacia(www.pharmacia.com)、Promega(www.promega.com)、Qiagen(www.qiagen.com)、Sigma(www.sigma-aldrich.com)和Stratagene(www.stratagene.com)。
本申請中所討論的各參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，包括其中引用的參考文獻(xiàn)，通過引用以其整體合并入本申請中。
給出的出版物“PMID”參考文獻(xiàn)號為美國國家醫(yī)學(xué)書館(US National Library of Medicine)分配的PubMed標(biāo)識號，在www.ncbi.nlm.nih.gov上可獲得每篇出版物的完整著錄信息和摘要。這也能提供完整的出版物電子版的直接入口，尤其是例如PNAS、JBC和MBC的出版物。
使用如在National Center for Biotechnology Information，USA(www.ncbi.nlm.nih.gov)上的具有默認(rèn)參數(shù)的BLAST2程序(TatusovaTA et al.，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.1999 May 15；174(2)247-50；PMID10339815)確定序列同源性。
鑒定來自艱難梭菌感染患者的主要VH和VL抗體序列為了鑒定來自艱難梭菌感染患者的抗體序列并確定主要抗體序列，特別是CDR序列，使用了WO 03/052416中所詳述的方法。利用以下基本步驟鑒定產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，對其進(jìn)行測序和分析(參見WO 03/052416)(1)從人類患者的循環(huán)B細(xì)胞中分離VH和/或VL編碼區(qū)域；(2)確定VH和/或VL儲備庫的核苷酸序列；(3)確定VH和/或VL初級氨基酸序列；(4)在硅片上提取CDR區(qū)域-加入到數(shù)據(jù)庫中；(5)測定VH和/或VL儲備庫中主要CDR和框架區(qū)；(6)自主要抗體序列構(gòu)建和生產(chǎn)治療性重組體抗體。
對來自四名感染患者(D01、D02、D03和D04)的抗體片段進(jìn)行測序。
重鏈(CDH1)CDH1是來自艱難梭菌感染患者的最常見的VH鏈。其已通過分析來自患者抗體VH鏈的CDR3序列得到證實(shí)。來自艱難梭菌感染患者的226/1011(22.4％)的克隆抗體具有相同的CDR3序列(以下稱CDR-H3)。發(fā)現(xiàn)CDH1存在于四分之三的患者中。其CDR3序列在來自患者D01的184/318(57.9％)的克隆中出現(xiàn)；在D03中，其在40/291(13.7％)的克隆中出現(xiàn)；在D04中，其在2/252(0.8％)的克隆中出現(xiàn)。最常見的完整VH序列為SEQ ID NO1。
在該VH鏈序列中，CDR(互補(bǔ)決定區(qū))序列如下CDR-H1SEQ ID NO2CDR-H2SEQ ID NO3CDR-H3SEQ ID NO4同源性搜索已鑒定到與所述CDR-H3序列(SEQ ID NO4)具有高于70％的同源性的其它幾條CDR3序列，這些序列都來自艱難梭菌患者。所述CDR3序列為SEQ ID NO5-15。
輕鏈(CDL1)H1L1的輕鏈衍生自具有來自艱難梭菌感染患者的最常見的CDR3序列的克隆。CDL1在患者D01中以84/251(33.5％)的頻率存在。最常見的含有這一CDR3序列的VL序列為SEQ ID NO16。
在該VL鏈序列中，CDR(互補(bǔ)決定區(qū))序列如下CDR-L1SEQ ID NO17CDR-L2SEQ ID NO18CDR-L3SEQ ID NO19同源性搜索已鑒定到與CDR-L3序列具有高于70％的同源性其它幾條CDR3序列，這些序列都來自艱難梭菌患者。所述CDR3序列為SEQ ID NO20-40。
抗體H1L1的構(gòu)建和克隆按照如下構(gòu)建合成抗體H1L1分別從測序載體PCR擴(kuò)增CDH1和CDL1，并克隆到克隆載體pGEM-T easy(Promega Corporation)中以便于DNA測序。根據(jù)廠商的使用說明，使用QIAquick PCR純化離心柱(Qiagen，UK)制備3μg PCR產(chǎn)物用于限制性酶切。將DNA從旋轉(zhuǎn)柱上洗脫到40μL的EB緩沖液中。將純化的PCR產(chǎn)物(2μL)與1μL pGEM-T easy載體、6μL水和1μLDNA連接酶混合，將混合物于室溫連接1小時(shí)。然后，通過電穿孔將連接物轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)E.coli TGl細(xì)胞中(Stratagene)，并涂于含氨芐青霉素(100μg/ml)、IPTG(100μM)和X-gal(0.006％w/v)的瓊脂平皿上。允許菌落于37℃生長過夜，然后貯存于4℃。在該培養(yǎng)基上，重組菌落被鑒定為白色菌落。
這得出具如下通式結(jié)構(gòu)的抗體S-標(biāo)記-CDH1-接頭-CDL1-His-標(biāo)記其具有SEQ ID NO41的氨基酸序列，含有N-末端S-標(biāo)記和C-末端His-標(biāo)記。
抗體H1L1-乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)的靶點(diǎn)的鑒定材料和方法樣品制備將在血液瓊脂平皿上生長的艱難梭菌細(xì)胞(NCTC 11204)懸浮于10mM的PBS(磷酸鹽緩沖液)中，在冰上超聲處理5×1分鐘。以13000rpm離心細(xì)胞裂解液5分鐘，并將300μl上清液在于冷丙酮中的20mL 10％的三氯乙酸和20mM DTT(二硫蘇糖醇)中沉淀45分鐘。通過離心回收蛋白質(zhì)，用含有20mM DTT的冷丙酮洗滌沉淀三遍。
2D-凝膠電泳將蛋白質(zhì)沉淀溶于樣品再水合溶液(7M尿素、2M硫脲、3％(w/v)CHAPS、0.002％溴酚藍(lán)水溶液)中，并用相同的溶液進(jìn)行稀釋用于等電聚焦。使用Zoom IPGRunner(RTM)系統(tǒng)(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)在3-10(7em)的非線性pH范圍內(nèi)進(jìn)行等電聚焦共1700Vh，每一條帶裝載約15μg蛋白質(zhì)。在進(jìn)行第二向分離前，在含有5mM DTT的平衡緩沖液中(50mM Tris-HCl pH8.8，6M尿素、30％甘油、2％(w/v)SDS、0.002％溴酚藍(lán)的水溶液)平衡每一條帶15分鐘，然后在含有125mM碘代乙酰胺的相同緩沖液中再平衡15分鐘。
使用NuPage 4-12％Bis-TrisZoom凝膠和MOPS緩沖液(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)進(jìn)行第二向分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至Invitrolon PVDF膜(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)上，并在10mM PBS(含5％脫脂乳、0.1％Tween20)中封閉1小時(shí)。
免疫印跡為了鑒定抗體H1L1的靶點(diǎn)，在含5％脫脂乳及0.1％Tween20的10mM PBS中用純化的H1L1抗體溫育所述膜1小時(shí)。洗滌后，使用與辣根過氧化物酶(Santa Cruz Biotechnologies)結(jié)合的抗-His抗體，用0.1％Tween20以1∶500的比例稀釋于10mM PBS中，檢測結(jié)合的H1L1。用含0.1％Tween20的10mM PBS溶液洗滌后，應(yīng)用ECL(Amersham biosciences，Little Chalfont，UK)使印跡顯影。
為了在艱難梭菌感染患者中顯現(xiàn)IgG抗體的靶點(diǎn)，用以0.1％Tween20按1∶20-1∶50稀釋于10mM PBS中的血清溫育膜1小時(shí)。當(dāng)使用SigmaFast(RTM)5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑片(Sigma)顯影時(shí)，使用與辣根過氧化物酶(用于ECL)或堿性磷酸酶(Sigma)結(jié)合的抗IgG-抗體。
電噴射質(zhì)譜將從凝膠上切下的蛋白質(zhì)條帶或蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在25mM碳酸氫銨中洗滌10分鐘，并用25mM碳酸氫銨乙腈1∶2脫水15分鐘。重復(fù)碳酸氫銨洗滌和脫水步驟，在SpeedVac(RTM)中干燥凝膠片。加入少量體積的胰島素(10μg/ml，于25mM碳酸氫銨中)直到凝膠片恢復(fù)至它們的最初大小，加入少量25mM碳酸氫銨以使凝膠片在消化期間保持濕潤。于37℃消化樣品4.5小時(shí)，通過添加80μl乙腈萃取肽15分鐘。在SpeedVac中干燥上清液直至蒸發(fā)掉所有的乙腈。用C-18 Zip-Tips(Millipore)對樣品脫鹽，并利用納噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF，Micromass，Manchester，UK)對樣品進(jìn)行分析。
結(jié)果使用2D凝膠和免疫印跡分離抗體H1L1的靶點(diǎn)將2D凝膠和免疫印跡相結(jié)合用以精確定位2D凝膠上的抗原。比較兩個(gè)印跡，一個(gè)使用來自患者的血清，其最豐富的抗體是用于H1L1的模版；一個(gè)使用被表達(dá)且被純化的H1L1。兩者都與相同的蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)。相同的蛋白質(zhì)在四名從艱難梭菌引起的腹瀉中恢復(fù)的患者中具有抗原性。
使用柱方法分離靶蛋白于37℃，在補(bǔ)充了巰基乙酸和L-半胱氨酸-HCl的腦心浸液肉湯中，厭氧培養(yǎng)艱難梭菌的臨床分離株(本申請中指菌株CD14000287，分離自艱難梭菌感染患者)48小時(shí)。在Sorval RC-3B離心機(jī)中，以5000rpm離心細(xì)胞懸浮液20分鐘以沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞顆粒一次，如上述再次沉淀。將經(jīng)洗滌的細(xì)胞顆粒重懸于PBS中，并貯存于-20℃至進(jìn)一步使用。解凍2ml冷凍細(xì)胞懸浮液的等分試樣，在臺式微量離心機(jī)上以14000rpm離心5分鐘以沉淀所述細(xì)胞，將沉淀的細(xì)胞重懸于4ml的6M鹽酸胍(pH8.0)中。通過于20℃，在Beckman L8-70M超速離心機(jī)上以45000rpm離心1小時(shí)，使胍萃取的蛋白質(zhì)澄清。室溫下，用2升的20mM碳酸鈉緩沖液(pH9.5)透析上清液三次，以使萃取的蛋白質(zhì)交換進(jìn)入相容的緩沖液中用于AminoLink(Perbio提供)柱。按照廠商的使用說明(Perbio)，將于20mM碳酸鈉(pH9.5)中的2ml H1L1抗體溶液(～2mg/ml)在預(yù)填充的2ml柱中與以20mM碳酸鈉(pH9.5)平衡的AminoLink樹脂共價(jià)結(jié)合。然后，將含有艱難梭菌抗原的萃取物(1.5ml)用于共價(jià)結(jié)合的H1L1柱上，并于室溫用樹脂溫育1小時(shí)。用12ml的20mM碳酸鈉緩沖液(pH9.5)洗滌未結(jié)合的物質(zhì)過柱，用8ml的0.1M甘氨酸緩沖液(pH2.5-3.0)洗脫結(jié)合的抗原。用1M Tris(pH9.0)中和洗脫的蛋白質(zhì)，然后在Amicon 15ml濃縮器連接管上濃縮至約200μl。然后通過10％(w/v)SDS-PAGE分析該濃縮的蛋白質(zhì)物質(zhì)，并通過考馬斯藍(lán)染色顯影。然后，通過質(zhì)譜鑒定與H1L1相互作用的蛋白質(zhì)條帶。
利用質(zhì)譜鑒定分離的蛋白質(zhì)從凝膠上切下蛋白質(zhì)條帶或斑點(diǎn)，于37℃用胰島素進(jìn)行消化。利用納米電噴射飛行時(shí)間質(zhì)譜對樣品進(jìn)行分析，得到SEQ ID NO42的序列。
從2D凝膠試驗(yàn)的樣品中和使用基于柱的方法分離的蛋白質(zhì)的樣品中發(fā)現(xiàn)了相同的肽。
使用Sanger Institute(www.sanger.ac.uk/projects/C difficile/)的BLAST搜索搜索艱難梭菌基因組，得到匹配序列SEQ ID NO43。
理論pI5.74，分子量43430.30Da，其與在2D凝膠上的蛋白質(zhì)(其中分子量為約44kD，pI5.5-6)的定位關(guān)系密切。
使用SEQ ID NO43的蛋白質(zhì)序列，利用默認(rèn)設(shè)置，在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)NCBI BLAST搜索中揭示出與乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)登錄號NP_349376有很高的相似性，即在391個(gè)氨基酸上有68％的相同性。
乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的克隆為了在大腸桿菌(E.coli)中克隆和表達(dá)編碼乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的序列，將其從艱難梭菌基因組DNA中直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)廠商的使用說明利用DNeasy旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen)進(jìn)行制備。
通過直接與編碼與乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶匹配的候選物的艱難梭菌基因組DNA序列進(jìn)行比較而確定和設(shè)計(jì)所使用的PCR引物，即SEQ ID NO44和45，通過SIGMA Genosys合成。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)進(jìn)行擴(kuò)增，使得不需要連接而直接克隆到表達(dá)載體pBAD-TA(Invitrogen)中，將C-末端融合的六組氨酸-標(biāo)記添加到位于阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子araBAD控制下的被表達(dá)的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶上。將該克隆混合物轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株TOP10(Invitrogen)中，利用SDS-PAGE鑒定重組體，使用單克隆抗-His-標(biāo)記過氧化物酶-結(jié)合抗體(SIGMA)進(jìn)行免疫印跡。所得到的質(zhì)粒在本申請稱為pThioll。
乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和純化為了過表達(dá)6-組氨酸-標(biāo)記硫解酶融合蛋白，將大腸桿菌菌株TOP10(pThioll)培養(yǎng)至指數(shù)生長末期(于37℃，200rpm振蕩時(shí)OD6001.0)，通過添加阿拉伯糖至終濃度為0.2％誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。再培養(yǎng)240分鐘后，通過離心(500g，10分鐘，4℃)收集細(xì)菌，以1/20起始體積將沉淀重懸于裂解緩沖液(6M鹽酸胍、50mM Tris-HCl pH8)中，并于室溫混合1小時(shí)進(jìn)行溶解。通過進(jìn)一步的離心步驟(10000g，于室溫10分鐘)除去不溶性物質(zhì)，按照廠商的使用說明將上清液用于Qiagen spin-prep Ni-NTA柱。用600μl的裂解緩沖液洗滌所述柱三遍，之后用600μl的洗滌緩沖液1(8M尿素、50mMTris/HCl pH8)洗滌三遍，再用600μl的洗滌緩沖液2(8M尿素、50mM TrisHCl pH8、25mM咪唑)洗滌三遍。用100μl的洗脫緩沖液(8M尿素、50mM Tris/HCl pH8、250mM咪唑)從柱上洗脫組氨酸-標(biāo)記蛋白質(zhì)，重復(fù)該洗脫步驟，合并兩次級分。通過SDS-PAGE對樣品進(jìn)行分析。
抗體H1L1抗克隆的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)將克隆并純化的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶與加樣緩沖液和DTT以1∶1混合，然后在將其置于90℃的加熱器上5分鐘。利用NuPAGE-MES SDS電泳緩沖液(Invitrogen)在10％BisTris凝膠(Invitrogen)上分離5-15μl上述物質(zhì)35分鐘。
將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至Invitrolon PVDF膜(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)上，并在含5％脫脂乳及0.1％Tween20的10mM PBS溶液中封閉1小時(shí)。將該膜與H1 L1以1∶10(濃度約400μg/ml)的比例在含0.1％Tween20的10mM PBS中溫育1小時(shí)。用含0.1％Tween20的10mM PBS溶液洗滌三遍，每遍5分鐘，然后用S蛋白HRP結(jié)合物(Novagen)以1∶1000溫育1小時(shí)。用Sigma-Fast DAB染色顯影印跡，所述印跡對正好位于50kD標(biāo)記處的硫解酶條帶顯示出強(qiáng)應(yīng)答。
因此，來自艱難梭菌感染患者的抗體集中于抗艱難梭菌乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，從那些患者的主要輕鏈和重鏈CDR構(gòu)建的合成抗體特異性地抗艱難梭菌乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶。因此，艱難梭菌乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶為強(qiáng)抗原，抗體H1L1可用于與其結(jié)合。
保守表位在丙酮丁醇梭菌的丁醇/丁酸酯產(chǎn)生路徑中順序存在三種酶，其也存在于艱難梭菌染色體上。發(fā)現(xiàn)這些酶與抗來自艱難梭菌上清液蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的兔抗血清相互作用(Mullany P et al.，F(xiàn)EMS MicrobiolLett.，1994Nov 15；124(1)61-7；PMID8001771)。
假定所述酶共享有保守表位，則可以發(fā)現(xiàn)唯一的同源區(qū)域存在于硫解酶(登錄號P45362)的9-12位殘基，該區(qū)域也存在于巴豆酸酶(登錄號P45361)的5-8位殘基，這一保守序列為SEQ ID NO47。
屎鏈球菌和艱難梭菌組合藥物的MIC試驗(yàn)前準(zhǔn)備在哥倫比亞血液瓊脂平皿(CBA)上培養(yǎng)生物體以獲得單菌落，并于37℃溫育24小時(shí)(屎鏈球菌)或厭氧溫育48小時(shí)(艱難梭菌)。
根據(jù)NCCLS方法(M7-6A)制備抗微生物劑，得到14種用于萬古霉素和慶大霉素的濃度以及11種用于H1L1的濃度。在dH2O中制備萬古霉素和慶大霉素的初始稀釋液，首先將H1L1稀釋到制劑緩沖液中(在100ml中3.484g精氨酸(200mM)、3.006g尿素(0.5M)，pH9.5)。隨后，在使用的微生物的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中制備稀釋液。將制劑貯存于-20℃直至使用時(shí)。
濃度為所需終濃度的兩倍。
1.培養(yǎng)基制備屎鏈球菌培養(yǎng)基-陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton Broth(NCCLSM7-6A)向1升Mueller Hinton Broth(OXOID，MHB)中加入2ml的10mg/ml CaCl2和500μl的10mg/ml MgCl2。
艱難梭菌培養(yǎng)基-(1)Supplemented Brucella Broth(NCCLS M1 1-A5)向900ml布氏肉湯粉末(SIGMA)中加入1ml氯高鐵血紅素(5mg/ml)和1mlVitamin K(1mg/ml)。加入高壓滅菌后的100ml溶解的馬血(5％)。
(2)根據(jù)廠商的說明制備強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(RCM)將38g溶于1升dH2O中。
2.MIC平皿準(zhǔn)備-表1藥物1-萬古霉素或慶大霉素(終濃度為0.0625μg/ml至512μg/ml)在U-形96孔微量滴定板中沿著所述微量滴定板的第一行從左至右以所需濃度的兩倍加入萬古霉素或慶大霉素(50μl)，最后一孔為空白的。對其它行使用濃度降低2倍的萬古霉素重復(fù)這一操作。
藥物2-H1L1抗體(終濃度為0.25μg/ml至256μg/ml)沿著列加入H1L1(50ml)。沿著第一列中加入所需濃度兩倍的H1L1。對其它列，沿著平皿向前移動(dòng)(從左至右)使用濃度降低2倍的H1L1重復(fù)這一操作。最后一列為空白的。
最后一列僅含有100μl的生長培養(yǎng)基。
按如上相同的方式，但是在另一個(gè)微量滴定板上，以萬古霉素和慶大霉素的連續(xù)濃度進(jìn)行操作。H1L1濃度與上述濃度完全相同，與列12中僅有培養(yǎng)基做對照一樣。
接種物制備-直接的菌落懸浮液-在使用細(xì)菌前，立即制備接種物。
-通過將來自18-24小時(shí)(屎鏈球菌)或48小時(shí)(艱難梭菌)瓊脂平皿的菌落重懸于適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基或無菌生理鹽水中制備直接的菌落懸浮液。
-根據(jù)NCCLS M7-6A(屎鏈球菌)和NCCLS M11-A5(艱難梭菌)，其可被調(diào)節(jié)至0.5 MacFarlands標(biāo)準(zhǔn)，然后以1∶10稀釋于生長培養(yǎng)基中(約1×107cfu/ml)。
平皿接種--將如上制備的5μl的1∶10接種物懸浮液用于接種每一孔(最終接種物5×104cfu/ml)。
-從孔12至孔1接種所述板。
溫育--于37℃溫育所述板24小時(shí)(屎鏈球菌)或厭氧溫育48小時(shí)(艱難梭菌)。
-為了檢測接種物，將10μl生長對照稀釋于10ml無菌鹽水中(1∶1000)，將100μl涂抹于CBA平皿上，并于37℃溫育24小時(shí)(屎鏈球菌)或厭氧溫育48小時(shí)(艱難梭菌)。50個(gè)菌落相當(dāng)于5×104cfu/ml。
讀數(shù)結(jié)果MIC被定義為基本上抑制生物體生長的最低藥物濃度。
通過用存在第二種藥物的條件下的MIC除以不存在第二種藥物的條件下的MIC計(jì)算每種藥物的FIC(分級抑制濃度)。對于每種組合而言，這將產(chǎn)生兩個(gè)分?jǐn)?shù)，將其加合得到FICI(分級抑制濃度指數(shù))值≤0.5被定義為協(xié)同，值＞0.5至＜4被定義為無差異，值≥4.0被定義為拮抗。
結(jié)果這些結(jié)果證實(shí)了H1L1與萬古霉素和慶大霉素之間的協(xié)同作用。
結(jié)論這些結(jié)果證實(shí)了(i)H1L1和萬古霉素，和(ii)H1L1和慶大霉素對艱難梭菌14000287和艱難梭菌NCTC11204的協(xié)同作用。這表明了在萬古霉素耐藥性屎鏈球菌中萬古霉素和H1L1的協(xié)同作用。
艱難梭菌在存在可變短鏈脂肪酸(SCFA)和H1L1抗體濃度的條件下的生長SCFA制備使用的三種SCFA為乙酸、丙酸和丁酸。
如下將每種制備成1M的濃度將乙酸鈉FW82.03-82.03g溶于1升dH2O中將丁酸鈉FW110.09-110.09g溶于1升dH2O中將丙酸鈉FW96.06-96.06g溶于1升dH2O中分別以70∶20∶10的比例混合這三種溶液。因此，在最終的溶液中，醋酸鈉的濃度為0.7M，丁酸鈉為0.2M，丙酸鈉為0.1M。總SCFA的終濃度為1M。
利用強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(RCM、DIFCO)從這一儲備液制備濃度為5、10、20、30、40和50mM的總SCFA。
培養(yǎng)基制備根據(jù)廠商的說明制備強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(RCM)將38g溶于1升dH2O中。
生長曲線試驗(yàn)前日在使用前，立即從厭氧條件移去培養(yǎng)物。將其暴露于好氧條件下不超過30分鐘。
通過用來自經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)的艱難梭菌的哥倫比亞血液瓊脂平皿的菌落接種10ml RCM培養(yǎng)基制備艱難梭菌的過夜懸浮液。于37℃在厭氧條件下溫育該懸浮液24小時(shí)。
試驗(yàn)日對照平皿如表4中所列，將對照溶液(200μl)加入平底96孔微量滴定板的孔中。每個(gè)對照使用3個(gè)孔。
檢測平皿如下詳述，將檢測溶液(100μl)加入平底96孔微量滴定板的孔中，該滴定板的行被標(biāo)記為A-H，列被標(biāo)記為1-12。兩種檢測溶液，SCFA和H1L1，產(chǎn)生200μl的混合體積。每一檢測使用2個(gè)孔。行A的孔含50mM SCFA、行B的孔含40mM SCFA、行C的孔含30mMSCFA、行D的孔含20mM SCFA、行E的孔含10mM SCFA、行F的孔含0.5mM SCFA。列1和2的孔含16μg/ml H1L1、列3和4的孔含8μg/ml H1L1、列5和6的孔含4μg/ml H1L1、列7和8的孔含2μg/mlH1L1、列9和10的孔含1μg/ml H1L1、列11和12的孔含0.5μg/mlH1L1。行G的孔為空的。給行H的所有孔中加入200μl RCM用作平皿的生長對照。
接種物制備在使用前，立即從厭氧條件移去培養(yǎng)物。將其暴露于好氧條件下不超過30分鐘。
將處于培養(yǎng)的對數(shù)期后期的過夜懸浮液用于接種所述微量滴定板。除對照平皿上的培養(yǎng)基/陰性對照組外，給所有孔中加入20μl(約10％接種物)。
于37℃在厭氧條件下溫育平皿24小時(shí)。
在0和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行光密度讀數(shù)(OD600nm)。確定平均OD600nm讀數(shù)。
結(jié)果對照組-參見表5結(jié)論-1.10、20、30和40mM的SCFA本身沒有影響，但是50mM的SCFA有一些降低。
2.0.5、1、2、4和8μg/ml的H1L1沒有影響，但是16μg/ml的H1L1有抑制作用。
檢測-參見表6結(jié)論-與1、2和4μg/ml H1L1和5mM SCFA(數(shù)據(jù)未顯示)沒有差異。8μg/ml H1L1和10-50mM SCFA的協(xié)同，光密度在24小時(shí)下降至0.296-0.330。16μg/ml H1L1和50mM SCFA的效果最為明顯。
表1在這一階段的藥物濃度將為加入孔中的藥物濃度的一半。(50μl+50μl＝1∶2稀釋)。
A、B等＝萬古霉素或慶大霉素1、2、3等＝+H1L1
表2
表3
表4
表5
表6
序 列 表<110>紐泰克醫(yī)藥有限公司<120>細(xì)菌感染的治療<130>WA/MP101123WO<150>GB0414886.2<151>2004-07-02<160>47<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>126<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly20 25 30Ser Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Phe Ile Tyr Tyr Thr Gly Tyr Thr Ser Tyr Lys Ser Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Ser Leu Ser Val Asp Thr Ser Asn Asp Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr100 105 110Leu Gly Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>2<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens
<400>2Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Ser Trp Ser1 5 10<210>3<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Phe Ile Tyr Tyr Thr Gly Tyr Thr Ser Tyr Lys Ser Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>5<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Glu Val Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>6<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Glu Asn Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>7<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7
Glu Ile Arg Ala Pro Asn His His Asp Phe Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>8<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Glu Ile Arg Ala Pro His His His Asp Phe Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>9<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His His Phe Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>10<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Tyr Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>11<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Leu Ser Gly Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15<210>12<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Val Tyr Leu Gly Arg1 5 10 15
<210>13<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Leu Ser1 5 10<210>14<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>14Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr Pro Gly Arg1 5 10 15<210>15<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr Leu Gly Cys1 5 10 15<210>16<211>108<212>PRT<213>Homo sapiens<400>16Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln15 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Thr Gly Asn Gln85 90 95Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly100 105<210>17<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>17Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser1 5 10<210>18<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>18Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser1 5<210>19<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Asn Ser Arg Asp Ser Thr Gly Asn Gln Leu1 5 10<210>20<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>20Asn Ser Arg Asp Asn Thr Gly His His Val Val1 510<210>21<211>11
<212>PRT<213>Homo sapiens<400>21Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val1 5 10<210>22<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>22Ser Ser Arg Asp Asn Ser Gly Asp Arg Tyr Val1 5 10<210>23<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>23His Ser Arg Asp Thr Asn Gly Asp His Leu1 5 10<210>24<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>24Asn Ser Arg Asp Gly Thr Gly Asn Gln Leu1 5 10<210>25<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>25Asn Ser Arg Asp Thr Asn Gly Asp Gln Leu1 5 10<210>26<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens
<400>26Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Leu Gly Leu1 5 10<210>27<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>27Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Leu Gly Val15 10<210>28<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>28Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Tyr His Val Ile1 5 10<210>29<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>29Ser Ser Arg Asp Ser Lys Gly His Arg Tyr Val1 5 10<210>30<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30Ser Ser Arg Asp Ser Asn Gly Asn Arg Tyr Val1 5 10<210>31<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>31
Ser Ser Arg Asp Thr Lys Gly His Arg Tyr Val1 5 10<210>32<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>32Lys Pro Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val1 5 10<210>33<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>33Ser Arg Asp Ser Ser Gly His Val Ala Val1 5 10<210>34<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>34Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asp Pro Leu Gly Val1 5 10<210>35<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>35Ala Ser Arg Asp Ser Ser Gly His Val Ala Val1 5 10<210>36<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>36Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Leu Gly Cys1 5 10
<210>37<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>37Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Leu Gly Trp1 5 10<210>38<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>38Ser Ser Arg Asp Arg Asn Gly His Arg Tyr Val1 5 10<210>39<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>39Ser Ser Arg His Thr Lys Gly His Arg Tyr Val1 5 10<210>40<211>11<212>PRT<213>Homo sapiens<400>40Thr Ser Arg Asp Ser Asn Gly Asn Arg Tyr Val1 5 10<210>41<211>250<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>synthetic HlLl antibody<400>41Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly20 25 30Ser Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Phe Ile Tyr Tyr Thr Gly Tyr Thr Ser Tyr Lys Ser Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Ser Leu Ser Val Asp Thr Ser Asn Asp Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr100 105 110Leu Gly Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Lys Ser Ser130 135 140Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val145 150 155 160Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp165 170 175Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys180 185 190Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser195 200 205Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu210 215 220Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Thr Gly Asn Gln Leu Phe225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly245 250<210>42<211>22<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>putative sequence of antibody target<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(15)<223>any amino acid<400>42Ala Asn Ile Thr Pro Asp Met Ile Asp Glu Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Val1 5 10 15Leu Thr Ala Gly Leu Gly20<210>43<211>412<212>PRT<213>Clostridium difficile<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(88)<223>match with SEQ ID NO42<400>43Ile Lys Leu Phe Lys Lys Gln Phe Arg Ile Tyr Glu Lys Ser Asn Leu1 5 10 15Met Gly Val Met Asn Met Arg Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Ala Arg20 25 30Thr Ala Val Gly Ser Phe Gly Gly Ala Phe Lys Ser Val Ser Ala Val35 40 45Glu Leu Gly Val Thr Ala Ala Lys Glu Ala Ile Lys Arg Ala Asn Ile50 55 60
Thr Pro Asp Met Ile Asp Glu Ser Leu Leu Gly Gly Val Leu Thr Ala65 70 75 80Gly Leu Gly Gln Asn Ile Ala Arg Gln Ile Ala Leu Gly Ala Gly Ile85 90 95Pro Val Glu Lys Pro Ala Met Thr Ile Ash Ile Val Cys Gly Ser Gly100 105 110Leu Arg Ser Val Ser Met Ala Ser Gln Leu Ile Ala Leu Gly Asp Ala115 120 125Asp Ile Met Leu Val Gly Gly Ala Glu Asn Met Ser Met Ser Pro Tyr130 135 140Leu Val Pro Ser Ala Arg Tyr Gly Ala Arg Met Gly Asp Ala Ala Phe145 150 155 160Val Asp Ser Met Ile Lys Asp Gly Leu Ser Asp Ile Phe Asn Asn Tyr165 170 175His Met Gly Ile Thr Ala Glu Asn Ile Ala Glu Gln Trp Asn Ile Thr180 185 190Arg Glu Glu Gln Asp Glu Leu Ala Leu Ala Ser Gln Asn Lys Ala Glu195 200 205Lys Ala Gln Ala Glu Gly Lys Phe Asp Glu Glu Ile Val Pro Val Val210 215 220Ile Lys Gly Arg Lys Gly Asp Thr Val Val Asp Lys Asp Glu Tyr Ile225 230 235 240Lys Pro Gly Thr Thr Met Glu Lys Leu Ala Lys Leu Arg Pro Ala Phe245 250 255Lys Lys Asp Gly Thr Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Ile Ash Asp260 265 270Gly Ala Ala Met Leu Val Val Met Ala Lys Glu Lys Ala Glu Glu Leu275 280 285
Gly Ile Glu Pro Leu Ala Thr Ile Val Ser Tyr Gly Thr Ala Gly Val290 295 300Asp Pro Lys Ile Met Gly Tyr Gly Pro Val Pro Ala Thr Lys Lys Ala305 310 315 320Leu Glu Ala Ala Asn Met Thr Ile Glu Asp Ile Asp Leu Val Glu Ala325 330 335Asn Glu Ala Phe Ala Ala Gln Ser Val Ala Val Ile Arg Asp Leu Asn340 345 350Ile Asp Met Asn Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Ile Gly355 360 365His Pro Ile Gly Cys Ser Gly Ala Arg Ile Leu Thr Thr Leu Leu Tyr370 375 380Glu Met Lys Arg Arg Asp Ala Lys Thr Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile385 390 395 400Gly Gly Gly Met Gly Thr Thr Leu Ile Val Lys Arg405 410<210>44<211>19<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>PCR primer<400>44atgagagaag tagtaattg 19<210>45<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>PCR primer<400>45tctcttaact attaaagtag20<210>46<211>765
<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>coding sequence for antibody HlLl<400>46tgaggtgcag ctggtggagt ctggcccagg actggtgaag ccttcggaga ccctgtccct 60cacctgcact gtctctggtg gctccgtcag cagtggtagt tactcttgga gctggatccg 120ccagcgccca ggacagggcc tggagtggat tgggttcatc tactacactg ggtacacctc 180ctacaagtcg tccctcaaga gtcgagtctc cctgtcggtt gacacgtcta acgaccagtt 240ctccctgagc ctgagctctg taactgccgc ggacacggcc gtgtattact gtgcgaggga 300aattcgtgcc ccagatcacc atgattttag tggttatctc ggccgctggg gccagggaac 360cctggtcacc gtctcctcag gcgcgccggg tggtggcggc agcggtggcg gtggcagcgg 420tggcggcggt agcgctagct tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct 480tgggacagac agtcaggatc acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct 540ggtaccagca gaagccagga caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc 600cctcagggat cccagaccga ttctctggct ccagctcagg taacacagct tccttgacca 660tcactggggc gcaggcggaa gatgaggctg actactactg taactcccgg gacagcactg 720gtaaccagct gttcggcgga gggaccaagg tcaccgtcct aggta 765<210>47<211>4<212>PRT<213>Clostridium difficile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(4)<223>C.difficile thiolase conserved epitope<400>47Val Val Ile Ala權(quán)利要求
1.乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑在制備用于治療或預(yù)防艱難梭菌感染的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶來自艱難梭菌。
3.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，所述抑制劑為抗體或其抗原結(jié)合片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性地抗由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有VH鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其分別具有SEQ ID NO2-4的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的VH鏈具有SEQ ID NO1的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有VL鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的VL鏈具有SEQ ID NO16的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，所述抗全體或其抗原結(jié)合片段的VL鏈具有SEQ ID NO16的序列。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，所述藥物還包含至少一種選自慶大霉素、萬古霉素和甲硝唑的抗生素。
11.用于治療艱難梭菌感染的組合制劑，包含(i)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑；和(ii)至少一種選自慶大霉素、萬古霉素和甲硝唑的抗生素。
12.分離的和/或純化的抗體或其抗原結(jié)合片段，其由下組中的至少一個(gè)組成(i)VH鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其分別具有SEQ ID NO2-4的序列；和(ii)VL鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的和/或純化的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述VH鏈具有SEQ ID NO1的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的分離的和/或純化的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述VL鏈具有SEQ ID NO16的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的分離的和/或純化的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體具有SEQ ID NO41的序列。
16.編碼根據(jù)權(quán)利要求15的抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的核酸分子，其具有SEQ ID NO46的序列。
18.乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑和萬古霉素在制備用于預(yù)防或治療屎鏈球菌和糞鏈球菌感染的藥物中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，所述屎鏈球菌或糞鏈球菌具有抗萬古霉素抗性。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的用途，所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶來自艱難梭菌。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的用途，所述抑制劑為抗體或其抗原結(jié)合片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性地抗由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有VH鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其分別具有SEQ ID NO2-4的序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的VH鏈具有SEQ ID NO1的序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有VL鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的VL鏈具有SEQ ID NO16的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求21的用途，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有SEQ ID NO41的序列。
28.用于治療屎鏈球菌或糞鏈球菌感染的組合制劑，包含(i)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑；和(ii)萬古霉素。
29.治療艱難梭菌感染的方法，包括給有需要的患者施用治療有效量的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，還包括施用治療有效量的至少一種選自慶大霉素、萬古霉素和甲硝唑的抗生素。
31.治療屎鏈球菌或糞鏈球菌感染的方法，包括給有需要的患者施用治療有效量的(i)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑；和(ii)萬古霉素。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，所述屎鏈球菌或糞鏈球菌具有抗萬古霉素抗性。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療艱難梭菌(Clostridium difficile)感染的化合物、藥物和治療方法，以及新的分離的抗體和它們在治療艱難梭菌感染中的用途。本發(fā)明還涉及治療和預(yù)防屎鏈球菌(E.faecium)和糞鏈球菌(E.faecalis)感染，并提供用于治療和預(yù)防屎鏈球菌和糞鏈球菌感染的藥物和治療方法。
文檔編號A61K39/395GK101014621SQ200580022389
公開日2007年8月8日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月2日
發(fā)明者詹姆斯·彼得·伯尼, 露斯·克里斯蒂娜·馬修斯, 特雷西·卡特 申請人:紐泰克醫(yī)藥有限公司