專利名稱：治療免疫炎性疾病的方法和試藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及免疫炎性疾病的治療、預(yù)防和減輕。進(jìn)一步地，為鑒別候選化合物和用于治療、預(yù)防或減輕這些癥狀的策略提供篩選方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及免疫炎性疾病的治療、預(yù)防或減輕。
免疫炎性疾病，其特征為機(jī)體免疫防御不適當(dāng)?shù)募せ?。免疫?yīng)答對準(zhǔn)且損害機(jī)體本身的組織或移植組織，而非對準(zhǔn)有傳染性的侵入物。被免疫系統(tǒng)作為靶向的組織隨疾病而變化。例如，在多發(fā)性硬化癥中，免疫應(yīng)答對準(zhǔn)神經(jīng)元組織，而在克羅恩病中，消化道是靶點(diǎn)。免疫炎性疾病影響數(shù)百萬的個(gè)體且包括癥狀如哮喘、變應(yīng)性眼內(nèi)炎性疾病、關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性濕疹、糖尿病、溶血性貧血、炎性皮膚病、炎性腸道或胃腸道疾病(例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、搔癢/炎癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝硬化和全身性紅斑狼瘡。
免疫炎性疾病的現(xiàn)有治療方法通常依賴免疫抑制劑。這些藥物的效果可能變化且其使用通常伴有不良副反應(yīng)。因此，改善免疫炎性疾病治療的治療藥物和方法是必要的。
發(fā)明概述本發(fā)明以治療、預(yù)防和減輕免疫炎性疾病的組合物、方法和藥盒為特征。
一方面，本發(fā)明其特征為組合物，包含增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動(例如糖皮質(zhì)激素受體激動劑如潑尼松龍和地塞米松)的藥物和調(diào)節(jié)至少一種(預(yù)期地2、3或多種)下列信號途徑的信號活動的非類固醇類藥物NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答(例如趨化因子產(chǎn)生、細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá))。當(dāng)給予哺乳動物時(shí)，這些藥物以足以減致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答的量存在。如果需要，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物在組合物中以低劑量存在。組合物可以制成局部或全身給藥。
本發(fā)明也以一種治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病的方法為特征，其通過給予哺乳動物增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和調(diào)節(jié)一種或多種下列信號途徑的信號活動的非類固醇類藥物聯(lián)用NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答。第一和第二種藥物同時(shí)給予或在彼此給藥28天內(nèi)給予，其量一起足以治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病。兩種藥物期望在彼此給藥14天內(nèi)給予，更期望在彼此給藥7天內(nèi)，甚至更期望在彼此給藥24小時(shí)內(nèi)，或甚至同時(shí)(即并發(fā)地)。如果需要，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物以低劑量給予。
本發(fā)明進(jìn)一步的以一種減少炎癥細(xì)胞(例如T細(xì)胞)中炎性細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生的方法為特征。該方法包括炎癥細(xì)胞與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和非類固醇類藥物接觸，該非類固醇類藥物調(diào)節(jié)一種或多種下列信號途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答。
在所有本發(fā)明的上述方面中，非類固醇類藥物可以是增強(qiáng)或降低信號分子表達(dá)水平或生物活性(例如酶活性、磷酸化狀態(tài)或結(jié)合活性)的藥物，以便調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或降低)一種或多種信號途徑(例如NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑)的信號活動。例如，非類固醇類藥物可以是NF-κB途徑調(diào)節(jié)劑、NFAT途徑調(diào)節(jié)劑、AP-1途徑調(diào)節(jié)劑或Elk-1途徑調(diào)節(jié)劑。非類固醇類藥物可以是降低信分子表達(dá)水平的反義化合物或RNAi化合物以便調(diào)節(jié)一種或多種信號途徑(例如NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑)的信號活動。或者，非類固醇類藥物可以是信號分子的顯性負(fù)相形式或編碼顯性負(fù)相的表達(dá)載體，以便調(diào)節(jié)一種或多種NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑或Elk-1途徑的信號活動。非類固醇類藥物也可以是結(jié)合信號分子且降低信號分子生物活性的抗體，以便調(diào)節(jié)一種或多種NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑的信號活動。另外，非類固醇類藥物可以是影響染色質(zhì)構(gòu)象的藥物，如組蛋白脫乙?；?HDAC)或組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)劑。非類固醇類的藥物也可以是致炎細(xì)胞因子mRNA穩(wěn)定復(fù)合物(例如TIA-1、TIAR、TTP)或?qū)е逻@些復(fù)合物激活的途徑的抑制劑。
如果需要，另外的治療化合物可以和本發(fā)明的聯(lián)用一起制成制劑或給藥。例如，另外的治療化合物可以是NSAID、小分子量免疫調(diào)節(jié)劑、COX-2抑制劑、DMARD、生物制品、黃嘌呤、抗膽堿能化合物、β受體激動劑、支氣管擴(kuò)張藥、非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑、維生素D類似物、補(bǔ)骨脂素、維甲酸類或5-氨基水楊酸。
本發(fā)明還以鑒別治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病癥狀的候選化合物及策略的各種篩選方法為特征。例如，一種鑒別可用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病的聯(lián)用的方法，其包括步驟(a)炎癥細(xì)胞(例如T細(xì)胞)在體外與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和候選化合物接觸；并且(b)相對于在與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與候選化合物接觸的細(xì)胞中致炎細(xì)胞因子的釋放或產(chǎn)生，測定增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和候選化合物的聯(lián)用是否減少致炎細(xì)胞因子從這些細(xì)胞釋放或在這些細(xì)胞中產(chǎn)生。致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生的減少認(rèn)為此聯(lián)用對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的聯(lián)用。
鑒別候選化合物對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的另一個(gè)篩選方法包括步驟(a)提供已降低糖皮質(zhì)激素受體信號活動的炎癥細(xì)胞；(b)上述細(xì)胞與候選化合物接觸；以及(c)相對于不與候選化合物接觸的細(xì)胞，測定候選化合物在所述的細(xì)胞中是否減少細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生。細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少認(rèn)為候選化合物對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的化合物。
本發(fā)明也以一種鑒別對于治療治療免疫炎性疾病是有用的化合物的方法為特征，包括步驟(a)炎癥細(xì)胞在體外與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和候選化合物接觸；且(b)相對于細(xì)胞因子從與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與候選化合物接觸的細(xì)胞釋放或產(chǎn)生，測定增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和候選化合物的聯(lián)用在上述炎癥細(xì)胞中是否減少細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生。細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生的減少鑒定了組合作為對治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的組合。
本發(fā)明進(jìn)一步以鑒別對治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的化合物的方法為特征，包括步驟(a)提供設(shè)計(jì)的在一種或多種NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑中減少信號活動的炎癥細(xì)胞；(b)上述細(xì)胞與候選化合物接觸；以及(c)相對于沒有和候選化合物接觸的細(xì)胞，測定候選化合物是否降低致炎細(xì)胞因子從細(xì)胞中釋放或在其中產(chǎn)生。細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少認(rèn)為候選化合物對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的化合物。
本發(fā)明也以一種鑒別組合對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的方法為特征，包括步驟(a)鑒別調(diào)節(jié)一種或多種NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑的信號活動的化合物；(b)炎癥細(xì)胞在體外與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和步驟(a)中鑒別的化合物接觸；以及(c)相對于與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與步驟(a)中鑒別的化合物接觸或與步驟(a)中鑒別的化合物接觸而未與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸的細(xì)胞，測定增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物與步驟(a)中鑒別的化合物的組合是否減少致炎細(xì)胞因子從上述細(xì)胞中釋放或在其中產(chǎn)生。致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少認(rèn)為組合對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的組合。
本發(fā)明也以一種鑒別對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的組合的方法為特征，此方法包括步驟(a)鑒別調(diào)節(jié)一種或多種NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑的信號活動，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答的化合物；(b)炎癥細(xì)胞在體外與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和步驟(a)中鑒別的化合物接觸；以及(c)相對于在與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與步驟(a)中鑒別的化合物接觸或者與步驟(a)中鑒別的化合物接觸而未與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸的細(xì)胞，測定上述藥物組合是否減少致炎細(xì)胞因子從所述細(xì)胞中釋放或在其中產(chǎn)生。致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少認(rèn)為了組合對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用生的。
本發(fā)明也以一種藥盒為特征，包含(i)含有增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和非類固醇類藥物的組合物，后者調(diào)節(jié)一種或多種下列途徑的信號活動的NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答；以及(ii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者上述組合物的說明書。
本發(fā)明還以一種藥盒為特征，包含(i)增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物；(ii)非類固醇類藥物，其調(diào)節(jié)一種或多種下列途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答；以及(iii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和非類固醇類藥物的說明書。
在本發(fā)明中提供的另一種藥盒包含(i)增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物；以及(ii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者上述藥物和非類固醇類藥物的說明書，后者調(diào)節(jié)一種或多種下列途徑的信號活動NF-κB、NFAT、AP-1和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答。
或者，本發(fā)明提供一種藥盒，包含(i)非類固醇類藥物，其調(diào)節(jié)一種或多種下列途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任意其它炎癥應(yīng)答；以及(ii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者上述藥物和增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物的說明書。
對于“治療、減輕或預(yù)防免疫炎性疾病”意指在這些癥狀發(fā)生前或后將其改善。與等量的未處理對照相比較，通過任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量的這種減輕或預(yù)防程度至少為5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％。由于免疫炎性疾病正被治療的患者是被醫(yī)生診斷為患有這種癥狀的人。診斷可以通過任何適宜的方法。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)理解這些患者已經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)檢測或已鑒定，沒有檢查，由于存在一種或多種危險(xiǎn)因素處于高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)，如家族史。
對于“患者”意指任何動物(例如人)。能使用本發(fā)明的方法、組合物和藥盒治療的其它動物包括馬、狗、貓、豬、山羊、兔、倉鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、綿羊、牛、魚和鳥。
對于“信號途徑”意指一系列細(xì)胞內(nèi)的分子信號，其作為外部細(xì)胞刺激結(jié)果而產(chǎn)生，最終導(dǎo)致引起細(xì)胞或生物學(xué)效應(yīng)(例如炎癥)的特異性效應(yīng)器受體表達(dá)。例如，配基在細(xì)胞表面可以結(jié)合受體，導(dǎo)致各種細(xì)胞蛋白(例如蛋白激酶)的補(bǔ)充和激活。一旦這些原始細(xì)胞內(nèi)的蛋白被激活，外部信號通過其它細(xì)胞內(nèi)蛋白補(bǔ)充和激活進(jìn)一步傳播和放大，導(dǎo)致可引出生物或細(xì)胞表型(例如炎癥)的效應(yīng)器蛋白質(zhì)(例如致炎細(xì)胞因子)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。相對于未暴露于外部刺激的細(xì)胞，外部刺激可以使細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)器蛋白表達(dá)增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。依賴開始刺激，相對于對照細(xì)胞內(nèi)的這種激活或表達(dá)，信號途徑內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)信號分子的生物活性或表達(dá)水平增加或減少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
對于“增加糖皮質(zhì)激素受體的信號活動”意指增加或降低包含在糖皮質(zhì)激素受體信號途徑中的任何信號分子表達(dá)水平或生物活性。結(jié)果，該分子下游的信號途徑被放大，并且最終糖皮質(zhì)激素受體信號途徑的全部輸出量增加。信號活動內(nèi)的此增加可以是信號途徑中信號分子表達(dá)水平或生物活性增加或降低的結(jié)果，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的或此處所述的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定，相對于未處理的對照，增加或降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
對于“減少信號途徑的信號活動”意指減少信號途徑中任何信號分子的表達(dá)水平或生物活性，因此妨礙該分子信號途徑下游的傳播，并最終妨礙信號途徑的所有輸出量。這種減少可以是細(xì)胞途徑中信號分子表達(dá)水平或生物活性增加或降低的結(jié)果，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的或此處所述的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定，相對于未處理的對照，增加或降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。最終，通過降低信號途徑(例如一種或多種NFκB、NFAT、AP-1或Elk-1途徑)的信號活動，相對于對照細(xì)胞，效應(yīng)器蛋白(例如致炎細(xì)胞因子)的表達(dá)減少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。或者，信號途徑的生物輸出量，如致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，相對于對照減少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
除增加糖皮質(zhì)激素受體途徑的信號活動外，根據(jù)本發(fā)明治療、預(yù)防或降低免疫炎性疾病通過調(diào)節(jié)一種或多種包含以下效應(yīng)器蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄因子的信號途徑的信號活動達(dá)到NFκB、NFAT、AP-1和Elk-1以至于減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答。該調(diào)節(jié)由包含這些途徑(如

圖1所示)中任何信號分子的表達(dá)水平或生物活性增加或降低引起或通過調(diào)節(jié)圖1中的所述的任何信號活動。例如，NFAT信號途徑的信號活動可由干擾或降低一種或多種以下活動而減少鈣流、鈣調(diào)節(jié)蛋白激活、神經(jīng)鈣蛋白激活、NFAT脫磷酸作用、NFAT易位或NFAT轉(zhuǎn)錄激活。NFκB途徑的信號活動可以通過抑制或減少PKC激活、NIK激活、IKK激活、IκB磷酸化和破壞、NFκB易位、NFκB DNA結(jié)合、NFκB磷酸化(在p65)和NFκB轉(zhuǎn)錄激活而降低。AP-1的信號活動可以通過降低下列一種或多種作用而減少PKC激活、MLK磷酸化、MAP激酶磷酸化和激活(例如MMKK3/6磷酸化、JNK1/2磷酸化、MEKK4磷酸化、MKK4/7磷酸化、p38磷酸化、Raf磷酸化、MEK1/2磷酸化、ERK1/2磷酸化和cJun磷酸化)、AP-1 DNA結(jié)合和AP-1轉(zhuǎn)錄激活。例如，可以調(diào)節(jié)的以至于降低至少一種NFκB、NFAT、AP-1和Elk-1途徑的信號事件和信號分子如圖1所示。因?yàn)镹FκB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑可能增加致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，調(diào)節(jié)一種或多種這些途徑引起治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病。
對于“充足的量”意指在本發(fā)明的聯(lián)用中，在臨床有關(guān)的方法中，要求治療或預(yù)防免疫炎性疾病的化合物的量。對于治療處理由免疫炎性疾病引起的或?qū)е旅庖哐仔约膊〉陌Y狀，用于實(shí)踐本發(fā)明的活性化合物的充足的量依賴于給藥方法、哺乳動物或患者的年齡、體重和一般健康狀況而變化。最終，醫(yī)師將決定適宜的量和給藥方案。另外，有效量可以是本發(fā)明聯(lián)用中化合物的量，較由監(jiān)管當(dāng)局測定和批準(zhǔn)的各成分單用，其在患有免疫炎性疾病的患者治療中是安全有效的。
對于“更有效”意指治療較另一比較的治療發(fā)揮更大的效能，或較低的毒性、更安全，更方便或花費(fèi)更少。效能可以通過熟練的醫(yī)師使用任何適用于給出的適應(yīng)癥的標(biāo)準(zhǔn)方法測定。
術(shù)語“免疫炎性疾病包含多種癥狀，包括自身免疫性疾病、增生性皮膚病和炎性皮膚病。免疫炎性疾病通過炎癥過程導(dǎo)致健康組織的破壞、免疫系統(tǒng)失調(diào)和惱人的細(xì)胞增生。免疫炎性疾病的實(shí)例為尋常性痤瘡、急性呼吸窘迫綜合征、阿狄森氏病、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性眼內(nèi)炎性疾病、ANCA相關(guān)性小血管血管炎、強(qiáng)直性脊柱炎、關(guān)節(jié)炎、哮喘、動脈粥樣硬化、特應(yīng)性皮炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、貝切特氏病、貝爾氏麻痹、大皰性類天皰瘡、大腦局部缺血、慢性阻塞性肺疾患、肝硬化、寇甘氏綜合征、接觸性皮炎、COPD、克羅恩病、柯興氏綜合征、皮肌炎、糖尿病、盤狀紅斑狼瘡、嗜酸細(xì)胞性筋膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑、剝脫性皮炎、纖維肌痛、局灶性腎小球硬化癥、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥、巨細(xì)胞動脈炎、痛風(fēng)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、手部濕疹、亨諾-許蘭二氏紫癜、妊娠皰疹、多毛癥、自發(fā)性角膜-鞏膜炎、特發(fā)性肺纖維變性、特發(fā)性血小板減少性紫癜、免疫性血小板減少性紫癜、炎性腸道或胃腸道病癥、炎性皮膚病、扁平苔癬、狼瘡性腎炎、淋巴瘤氣管支氣管炎、黃斑水腫、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、非特異性纖維性肺病、骨關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、妊娠性類天皰瘡、尋常天皰瘡、牙周炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、風(fēng)濕性多肌病、陰囊瘙癢、搔癢癥/炎癥、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、肺組織胞漿菌病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、由肉樣瘤病引起的酒糟鼻、由硬皮癥引起的酒糟鼻、由斯威特氏綜合征引起的酒糟鼻、由全身性紅斑狼瘡引起的酒糟鼻、由蕁麻疹引起的酒糟鼻、由帶狀皰疹相關(guān)性疼痛引起的酒糟鼻、肉樣瘤病、硬皮癥、節(jié)段性腎小球硬化、敗血癥性休克綜合征、肩腱炎或滑囊炎、斯耶格倫氏綜合征、斯締爾氏病、休克引起的腦細(xì)胞壞死、斯威特氏病、全身性紅斑狼瘡、全身性硬化癥、高安氏動脈炎、顳動脈炎、中毒性表皮壞死溶解、移植排斥和移植排斥相關(guān)性綜合征、結(jié)核病、1-型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎、眼色素層炎、血管炎和韋格納氏肉芽腫病。
“非皮膚的炎性疾病”包括，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、哮喘和慢性阻塞性肺疾患。
“皮膚炎性疾病”或“炎性皮膚病”包括，例如，牛皮癬、急性熱性嗜中性白細(xì)胞皮膚病、濕疹(例如干性濕疹、汗皰、泡狀掌跖的濕疹)、漿細(xì)胞性局限性龜頭炎、龜頭包皮炎、貝切特氏病、離心性環(huán)形紅斑、持久性皮膚變色性紅斑、多形性紅斑、環(huán)形肉芽腫、光澤苔癬、扁平苔癬、硬化萎縮苔癬、單純慢性苔癬、小棘苔癬、錢幣狀皮炎、壞疽性膿皮癥、肉樣瘤病、角質(zhì)層下膿皰皮膚病、蕁麻疹和一時(shí)性棘層松解性皮膚病。
對于“增生性皮膚病”意指良性或惡性疾病，其特征為在表皮或真皮加速細(xì)胞分裂。增生性皮膚病的實(shí)例為牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、非特異性皮炎、原發(fā)刺激性接觸性皮炎、過敏性接觸性皮炎、皮膚基底部和上皮鱗狀細(xì)胞癌、片層狀魚鱗癬、表皮松解性角化過度癥、惡化前的角化病、痤瘡和脂溢性皮炎。
正如將被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的那樣，特別的疾病、紊亂和癥狀以增生性皮膚病和炎性皮膚病為特征。這類疾病的實(shí)例為牛皮癬。
對于“低劑量”意指較最低標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量低至少5％(例如至少10％、20％、50％、80％、90％，甚或95％)，其為治療任何人類疾病或癥狀約定的給藥途徑的特殊化合物制劑的劑量。例如，增加糖皮質(zhì)激素受體信號活動通過吸入給藥的藥物的低劑量將不同于同樣的用于口服給藥的藥物的低劑量。
對于“高劑量”意指較用于治療任何人類疾病或癥狀的特殊的化合物的最大標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量高至少5％(例如至少10％、20％、50％、100％、200％，甚或300％)。
對于“候選藥物”意指一化學(xué)藥品，其天然存在或人工衍生。候選化合物可包括，例如，肽、多肽、合成的有機(jī)分子、天然存在的有機(jī)分子、核酸分子、肽核酸分子及其成分和衍生物。
本發(fā)明中有用的化合物包括那些在此所述的化合物的可藥用鹽形式，包括異構(gòu)體如非對映體和對映體、其鹽類、酯類、溶劑化物和多晶型物，以及此處所述化合物的消旋混合物和純的異構(gòu)體。
對于“皮質(zhì)類固醇”意指任何天然存在的或合成的化合物，其特征為氫化的環(huán)戊烷多氫菲環(huán)系統(tǒng)并具有免疫抑制和/或抗炎活性。天然存在的皮質(zhì)類固醇類通常由腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生。合成的皮質(zhì)類固醇通?？杀畸u化。皮質(zhì)類固醇的實(shí)例在此處提供。
對于“非類固醇類的親免疫因子依賴性的免疫抑制劑”或“NsIDI”意指任何減少致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生或分泌，結(jié)合親免疫因子或引起促炎癥反應(yīng)向下調(diào)節(jié)的非類固醇類藥物。NsIDI包括神經(jīng)鈣蛋白抑制劑如環(huán)孢霉素A、他克莫司、子囊霉素、吡美莫司，以及其它抑制神經(jīng)鈣蛋白磷酸酯酶活性的藥物(肽、肽片斷、化學(xué)改性肽或擬態(tài)肽)。NsIDIs也包括雷怕霉素(西羅莫司)和依維莫司，其與FK506-結(jié)合蛋白、FKBP-12結(jié)合并阻斷抗原引起的白細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌增加。
對于“小分子免疫調(diào)節(jié)劑”意指非類固醇類的、非NsIDI化合物，其在親免疫因子依賴的方法中減少致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生或分泌，引起促炎癥反應(yīng)向下調(diào)節(jié)，或在其它方面調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。小分子免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例為p38 MAP激酶抑制劑如VX 702(Vertex Pharmaceuticals)、SCIO 469(Scios)、doramapimod(Boehringer Ingelheim)、RO 30201195(Roche)和SCIO 323(Scios)，TACE抑制劑如DPC 333(Bristol MyersSquibb)，ICE抑制劑如pranalcasan(Vertex Pharmaceuticals)，以及IMPDH抑制劑如麥考酚酯(Roche)和merimepodib(VertexPharamceuticals)。
本發(fā)明其它的特征和優(yōu)點(diǎn)將從詳細(xì)內(nèi)容和權(quán)利要求中突顯。
附圖簡述圖1是示意圖，描述了NFκB、NFAT、Elk-1和AP-1信號途徑。
圖2A-2C是一系列圖解，顯示了阿莫沙平和帕羅西汀抑制NFAT途徑。T細(xì)胞用PMA(90ng/ml)/伊屋諾霉素(5μg/ml)激活，有或沒有漸增量的受試藥物阿莫沙平、帕羅西汀、潑尼松龍和環(huán)孢霉素A。圖2A顯示了T細(xì)胞系CCRF-CEM，其在用賦形劑或藥物治療預(yù)培養(yǎng)前用NFAT熒光素酶指示器轉(zhuǎn)染4小時(shí)(n＝4個(gè)試驗(yàn))。圖2B顯示了用NFAT1-特異性抗體純化和處理的原代T細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡。圖2C顯示了藥物處理20分鐘和刺激后1小時(shí)以及免疫熒光處理的T細(xì)胞系CCRF-CEM的核轉(zhuǎn)運(yùn)分析。
圖3A-3C為一系列圖解，顯示了阿莫沙平和帕羅西汀抑制NF-κB途徑。T細(xì)胞用PMA/伊屋諾霉素激活，有或沒有漸增量的受試藥物阿莫沙平、帕羅西汀、潑尼松龍、環(huán)孢霉素A或CAPE。圖3A顯示了T細(xì)胞系CCRF-CEM的結(jié)果，其在用賦形劑或藥物處理預(yù)培養(yǎng)前用NF-κB熒光素酶指示器轉(zhuǎn)染4小時(shí)(n＝4個(gè)試驗(yàn))。圖3B顯示了用NFAT1-特異性抗體純化和處理的原代T細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。圖3C顯示了免疫熒光處理的T細(xì)胞系CCRF-CEM的核轉(zhuǎn)運(yùn)分析。
圖4A-4D是圖解，顯示了阿莫沙平和帕羅西汀抑制AP1途徑。原代T細(xì)胞在用PMA和伊屋諾霉素激活之前用賦形劑或藥物預(yù)培養(yǎng)30分鐘。后提取細(xì)胞30分鐘，用phospospecific和識別所有蛋白質(zhì)的抗體處理以進(jìn)行蛋白印跡分析。圖4AERK；圖4Bp38；圖4CJNK)。印跡用作為負(fù)荷試驗(yàn)對照的α微管蛋白進(jìn)行探測。圖4D是一圖解，描述了用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AP1指示器質(zhì)粒進(jìn)入CCRF-CEM細(xì)胞和隨后用PI激活作用測定的AP1-依賴性轉(zhuǎn)錄。
詳細(xì)內(nèi)容盡管其有效，但是長期使用糖皮質(zhì)激素治療免疫炎性疾病通常與嚴(yán)重的全身副作用相關(guān)。雖然通過甾類分子的結(jié)構(gòu)修飾為增寬甾類的治療窗帶進(jìn)行了廣泛的努力，但是此方法遇到了混合的成功。在這里，我們開發(fā)了第一個(gè)發(fā)現(xiàn)“融合”療法的高流量平臺，其包括相互協(xié)同作用以提高治療并將副作用降到最低的化合物聯(lián)用。
本發(fā)明其特征為給予有效量的藥物的方法、組合物和藥盒，該藥物增加糖皮質(zhì)激素受體(例如糖皮質(zhì)激素受體激動劑)的信號活動，與調(diào)節(jié)一種或多種下列途徑的信號活動的藥物聯(lián)用NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答?；诒景l(fā)明，給予此組合通過減少促炎癥反應(yīng)化學(xué)增活素或細(xì)胞因子引起炎癥減輕，如TNF-α，因此導(dǎo)致治療、預(yù)防和減輕免疫炎性疾病。人們希望增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物與調(diào)節(jié)一種以上NFκB、NFAT、AP-1和Elk-1途徑信號活動的藥物一起被制成制劑或給藥，以便減少致炎細(xì)胞因子的分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答(例如調(diào)節(jié)NFκB和NFAT信號途徑的信號活動)。
本發(fā)明的組合物、方法和藥盒用于治療、預(yù)防和減輕免疫炎性疾病、增生性皮膚病、器官移植排斥或移植物抗宿主病。多種藥物并用也是人們期望的。例如，甲氨蝶呤、羥氯喹和柳氮磺吡啶通常給予治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，因此也與此處所述的聯(lián)用一起給予。
下面更詳細(xì)的描述了本發(fā)明。
增加糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物在本發(fā)明的方法、組合物和藥盒中，增加糖皮質(zhì)激素受體活動的藥物與減少一種或多種以下途徑的信號活動的藥物一起聯(lián)用NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。增加糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物最終增加糖皮質(zhì)激素受體-驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄。例如，活動的這種增加由增加一種或多種以下活動引起受體結(jié)合、受體/GC易位、受體/GC DNA結(jié)合、受體/GC轉(zhuǎn)錄激活或受體/GC反式阻抑?？稍诒景l(fā)明的方法、組合物和藥盒中使用的示范性藥物包括在下列專利中所述的化合物美國專利號6,380,207、6,380,223、6,448,405、6,506,766和6,570,020，美國專利申請公開號20030176478、20030171585、20030120081、20030073703、2002015631、20020147336、20020107235、20020103217和20010041802以及PCT公開號WO 00/66522，上述各專利在此引入作為參考。在本發(fā)明的方法、組合物和藥盒中可使用的其它藥物是在美國專利號6,093,821、6,121,450、5,994,544、5,696,133、5,696,127、5,693,647、5,693,646、5,688,810、5,688,808和5,696,130中敘述，上述各專利在此引入作為參考。
調(diào)節(jié)NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑信號活動的藥物增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物與調(diào)節(jié)一種或多種以下途徑信號活動的非類固醇類藥物一起制成制劑或給藥NFκB、NFAT、Elk-1和AP-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答。此非類固醇類藥物可增加或減少上述途徑中任何一種信號分子的表達(dá)水平或生物活性，以便最終結(jié)果在一種或多種NFκB、NFAT、Elk-1和AP-1信號途徑的信號活動中是一種調(diào)節(jié)。例如，有用的藥物在Palanki，Curr.Med.Chem.9219-27(2002)中所述。
調(diào)節(jié)NFκB途徑信號活動的藥物例如，調(diào)節(jié)NFκB信號途徑信號活動的藥物可以調(diào)節(jié)一種或多種以下活動PKC激活、NIK激活、IKK激活、IκB磷酸化和破壞、NFκB易位、NFκB DNA結(jié)合、NFκB磷酸化(p65)或NFκB轉(zhuǎn)錄激活。例如，這些化合物在美國專利申請公開號20040092430、20040058930和20030013170、20030078246和20030078246，以及2003年9月24日提交的美國S.N.10/670,488中所述，所有專利在此引入作為參考。這類藥物包括α-硫辛酸、α-生育酚、anetholdithiolthione(ADT)、還原蝦紅素、二丁香酚、丁羥基茴香醚(BHA)、千金藤堿咖啡酸苯乙酯(3，4-二羥基肉桂酸，CAPE)、鼠尾草酚、卡維地洛、兒茶酚衍生物、durcumin(diferulolylmethane)、二苯甲基丁內(nèi)酯木聚糖、二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDC)、iferoxamine、二氫硫辛酸、地拉齊普和非諾貝酸、二甲二硫氨基甲酸(DMDTC)、姜黃(diferulolylmethane)、雙硫侖、依布硒啉、EPC-Kl(維生素E和維生素C磷酸二酯化合物)、表沒食子兒茶精-3-酸酯(EGCG；綠茶多酚)、麥角硫因、乙基丙酮酸酯、乙二醇四乙酸酯(EGTA)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、靈芝多糖、銀杏葉提取物品、谷光苷肽、氧化蘇木精、IRFI 042(類維生素E化合物)、ron tetrakis、拉西地平、拉扎洛依、羽扇醇、厚樸酚、二氧化錳超氧物歧化酶(Mn-SOD)、N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC)、nacyselyn(NAL)、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)、鄰位二氮雜菲、酚抗氧化劑(例如對苯二酚和叔丁基對苯二酚)、氧化苯胂(PAO，酪氨酸磷酸酶抑制劑)、吡咯啉二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)、橡黃素、Rg(3)(人參衍生物)、魚藤酮、S-烯丙基-半胱氨酸(SAC)、sauchinone、(5-(4-氯苯基)-N-羥基-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-1H-吡唑-3-丙酰胺)tepoxaline、α-torphryl琥珀酸、α-torphryl醋酸、PMC(2，2，5，7，8-五甲基-6-羥基色原烷)及益智酮A和B。NFκB抑制劑也包括蛋白體抑制劑，如肽醛(ALLnL(N-乙?；?leucinyl-leucynil-norleucynal，MG101)、LLM(N-乙?；?leucinyl-leucynil-methional)、Z-LLnV(芐氧羰基-leucinyl-leucynil-norvalinal，MG115)、Z-LLL(芐氧羰基-leucinyl-leucynil-leucynal，MG132)、lactacystine、b-內(nèi)酯、硼酸肽、泛激素連接酶抑制劑、PS-341、環(huán)孢霉素A、FK506(他克莫司)、脫氧精胍菌素、APNE(N-乙酰基-DL-苯丙氨酸-b-萘酯)、BTEE(N-苯甲?；鵏-酪氨酸-乙酯)、DCIC(3，4-二氯異香豆素)、DFP(二異丙基氟磷酸)、TPCK(N-a-甲苯基磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮)、calagualine(蕨類衍生物)、LY29和LY30、pefabloc(絲氨酸蛋白酶抑制劑)、rocaglamides(米仔蘭屬衍生物)、格爾德霉素、BMS-345541(4(2′-氨乙基)氨基-1，8-二甲基咪唑(1，2-a)喹啉)、2-氨基-3-氰基-4-芳基-6-(2-羥基-苯基)pryridine類似物(化合物26)、anandamide、AS602868、BMS-345541、flavopiridol、jesterone二聚體、5，7，4′-三羥基黃酮、HB-EGF(肝素連接的表皮生產(chǎn)因子類生長因子、LF15-0915(15-deoxyspergualine類似物)、MX781(維甲酸拮抗劑)、itrosylcobalamin(維生素B12類似物)、survanta、PTEN(腫瘤抑制劑)、水飛薊素、柳氮磺吡啶、piceatannol、槲皮黃素、十字孢堿、蟛蜞菊內(nèi)酯、樺木腦酸、熊果酸、茴腦、阿司匹林、水楊酸鈉、疊氮胸苷(AZT)、BAY-117082、(E3((4-甲基苯基)-磺酰)-2-丙烯腈)、BAY-117083、(E3((4-丁基苯基)-磺酰)-2-丙烯腈)、苯甲基異硫氰酸酯、cacospongionolide B、calagualine、卡鉑、絨毛膜促性腺激素、環(huán)頂環(huán)氧菌素、1-羥基-2-羥甲基-pent-1-烯苯酚、洋地黃毒苷、4-羥基壬烯醛(HNE)、加貝酯、glossogyne tenuifolia、對苯二酚、布洛芬、靛玉紅-3′-肟、nterferon-α、甲氨蝶呤、單氯胺、甲磺酸卡萘司他、夾竹桃苷、panduratin A、petrosaspongiolide M、肌醇六磷酸(肌醇六磷酸)、前列腺素A1，20(S)-原人參萜三醇(人參皂苷代謝產(chǎn)物)、血根堿(血根堿，1，3-甲基-[1，3]-苯并間二氧雜環(huán)戊烯-[5，6-c]-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯-4，5菲啶)、水飛薊素、SOCS1、舒林酸、THI 52(1-萘基乙基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉)、維納啉酮、YopJ(被耶爾森菌包圍的假結(jié)核病)對乙酰氨基酚、α-促黑素細(xì)胞激素(α-MSH)、3′，8′-雙-4′，5，7-三羥(基)黃酮、艾屬毛細(xì)管thunb提取物、桃葉珊瑚甙、β-拉帕醌、辣椒堿(8-甲基-N-香草基-6-壬酰胺)、丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV)、cyclolinteinone(海綿二倍半萜)、二酰胺(酪氨酸磷酸酶抑制劑)、E-73(放線菌酮類似物)、依卡倍特鈉、布洛芬(3-甲基-1，6，8-三羥基蒽醌)、erbstatin(酪氨酸激酶抑制劑)、磷霉素、真菌支霉菌素、加貝酯、染料木黃酮(酪氨酸激酶抑制劑)、格列美脲、硫酸氨基葡萄糖、γ-glutamycysteine合成酶、次氯酸鹽、isomallotochromanol、異野梧桐色烯、K1L(痘苗病毒蛋白)、Kochiascoparia果(甲醇提取物)、來氟米特代謝物(A77 1726)、losartin、LY294002[2-(4-嗎啉基)-8-苯并色酮]、5′-甲硫腺苷、U0126、pervanadate、苯胂氧化物(PAO，酪氨酸磷酸酶抑制劑)、前列腺素15-脫氧-δ(12，14)-PGJ(2)、resiniferatoxin、倍半萜內(nèi)酯(銀膠菊內(nèi)酯、ergolide、愈創(chuàng)木內(nèi)酯)、硫噴妥鈉、TNP-470、富含甘油三酸的脂蛋白、環(huán)氧苯醌A單體、Ro106-9920、conophylline MOL 294(小分子)、大黃酸、芹菜苷配基(4′，5，7-三羥基黃酮)、二英、黃芪甙IV、阿伐他汀、脫羥基甲基環(huán)氧醌霉素(DHMEQ)、15-脫氧精胍菌素、核液o，o′-二肉豆蔻酰二硫硫胺(BMT)、煙酰胺、3-氨基苯甲酰胺、7-氨基-4-甲基香豆素、氨吡酮、血管生成素-1、青蒿素、atrovasta、黃芩苷元(5，6，7-三羥基黃酮)、苯磷硫胺膽綠素、雙酚丙烷、campthothecin、caprofin、capsiate、梓甙、7-(4′-羥基-3′-甲氧基苯基)-1-苯基七-4-烯-3-酮二芳基庚酸酯、DTD(4，10-二氯吡啶并[5，6:4，5]噻吩并[3，2-d′:3，2-d]-1，2，3-二三嗪)、E3330(苯醌衍生物)、環(huán)氧氫醌A、氟尼辛葡胺、氟比洛芬、己酮可可堿(1-(5′-氧代己基)3，7-二甲基黃嘌呤，PTX)、6(5H)-phenanthridinone和苯甲酰胺、苯基-N-叔丁基氧化氰(PBN)、甲苯吡啶酮、巰氧吡啶、quinadril雷索司特、雷巴米特、利巴韋林、利福酰胺、eolipram、桑根酮C、SUN C8079、T-614、tyrphostin AG-126、APC0576、D609、鹽酸環(huán)靈桿菌素、普侖司特、鞘氨醇半乳糖甙、喹唑啉、白藜蘆醇、R031-8220、saucerneol D和saucerneol E、曲尼司特[N-(3，4-二甲氧基肉桂酰)維生素L]、3，4，5-三甲氧基-4′-氟查耳酮、雷公藤內(nèi)酯、美沙拉秦、17-烯丙基-17-二甲氧基格爾德霉素、6-氨基喹唑啉衍生物、毛地黃黃酮、四硫鉬酸鹽、三亞麻油酸甘油酯、曲格列酮、渥曼青霉素和利福平。減少任何MAP激酶的藥物也可以減少NFκB信號活動并進(jìn)一步在下面描述。
調(diào)節(jié)NFAT途徑信號活動的藥物鈣敏感磷酸酯酶神經(jīng)鈣蛋白牽涉包括淋巴細(xì)胞活化的各種生物系統(tǒng)。作為神經(jīng)鈣蛋白的酶作用底物，NFAT族的轉(zhuǎn)錄因子在淋巴細(xì)胞活化中起重要作用。調(diào)節(jié)NFAT信號途徑信號活動的藥物可分為兩類，蛋白質(zhì)抑制劑和小分子抑制劑。這些抑制劑中的一些結(jié)合神經(jīng)鈣蛋白并抑制脫磷酸活性。例如，調(diào)節(jié)NFAT-驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的藥物包括調(diào)節(jié)任意一種以下活動的藥物鈣流、鈣調(diào)節(jié)蛋白激活、神經(jīng)鈣蛋白激活、NFAT脫磷酸作用、NFAT易位或NFAT轉(zhuǎn)錄激活(見圖1)。阻止NFAT核轉(zhuǎn)位的蛋白質(zhì)抑制劑包括AKAP79、其為阻止神經(jīng)鈣蛋白底物相互作用的一種支架蛋白質(zhì)；CABIN蛋白質(zhì)，其阻斷神經(jīng)鈣蛋白活性；神經(jīng)鈣蛋白B同系物，CHP；以及MCIPl，2，3蛋白質(zhì)，其具有阻止NFAT2磷酸化和核輸入的能力。NFAT小分子抑制劑包括環(huán)孢霉素A和FK506。機(jī)械學(xué)上，環(huán)孢霉素A和FK506通過抑制神經(jīng)鈣蛋白活性間接抑制NFAT。這些藥物以NFAT特異性途徑為靶點(diǎn)并通過抑制同種異體反應(yīng)性T-細(xì)胞充當(dāng)免疫抑制劑。其它的藥物包括A-285222、D-43787和3，5-二三氟甲基吡唑(BTP)衍生物，其抑制Th1和Th2細(xì)胞因子基因表達(dá)，因此間接抑制NFAT的核定位。其它減少NFAT信號的示范性藥物如Martinez-Martinez et al.，CurrentMedicinal Chemistry 11997-1007，在美國專利申請公開號20040002117和2002013230，以及PCT WO 03/0103647所述。調(diào)節(jié)任意MAP激酶的藥物也可以調(diào)節(jié)NFAT信號活動，并進(jìn)一步在下面描述。
調(diào)節(jié)AP-1和Elk-1途徑信號活動的藥物本發(fā)明的糖皮質(zhì)激素受體激動劑可以與調(diào)節(jié)AP-1信號途徑、Elk-1信號途徑或兩者都的信號活動的藥物一起給予。這一類藥物可以調(diào)節(jié)一種或多種以下活動PKC激活、MLK磷酸化、MAP激酶激活和/或磷酸化(例如Raf、MEKl/2、Erkl/2、MEKK1-3、MEK4/7、JNK1/2、Tak1、MEK3/6或p38)、DNA結(jié)合活性或AP-1轉(zhuǎn)錄激活。調(diào)節(jié)任何MAP激酶的藥物也可以調(diào)節(jié)AP-1和Elk-1的信號活動并進(jìn)一步如下所述。
MAP激酶抑制劑因?yàn)镸AP激酶蛋白質(zhì)家族是NFκB、NFAT、AP-1和Elk-1信號途徑的中心，所以任何調(diào)節(jié)MAP激酶蛋白磷酸化狀態(tài)、激活或兩者都的藥物在任何此處所述的聯(lián)用中是有用的。因此，例如，可以與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物一起使用Raf、Mek1/2、ERK1/2、MEKK1/3、MEK4/7、JNK、p38、MEK3/6、Takl蛋白的任何抑制劑。例如，調(diào)節(jié)MAP激酶蛋白質(zhì)信號活動的藥物由Ravingerova et al.，Mol. Cell Biochem.247127-38(2003)和Chang et al. Leukemia.171263-93(2003)所述。例如，MEK抑制劑在美國專利申請公開號20040087583中所述。例如，Erk激酶抑制劑在美國專利申請公開號20040082631、20040048861、20040029857、20030225151、20030195241、20030049820、20020151574、20030158238、20030092714、20030040536和20020177618中所述。Erk激酶抑制劑進(jìn)一步由Rubinfeld et al.，Methods Mol. Biol.2501-28(2004)和Kohno et al.，Prog.Cell Cycle Res.5219-24(2003)描述。例如，調(diào)節(jié)Raf信號途徑的信號活動的藥物由Bollag et al.，Curr.Opin.Invest.Drugs.41436-41(2003)所述。
P38抑制劑N-(3-叔丁基-1-甲基-5-吡唑基)-N′-(4-(4-吡啶甲基)苯基)尿素、RPR200765A、SB203580、SB202190、UX-745、UX-702、UX-850和SC10-469是示范性p38抑制劑。其它p38抑制劑在下列專利中描述美國專利號5,716,972、5,686,455、5,656,644、5,593,992、5,593,991、5,663,334、5,670,527、5,559,137、5,658,903、5,739,143、5,756,499、5,716,955、WO 98/25619、WO 97/25048、WO 99/01452、WO 97/25047、WO99/01131、WO 99/01130、WO 97/33883、WO 97/35856、WO 97/35855、WO 98/06715、WO 98/07425、WO 98/28292、WO 98/56377、WO98/07966、WO 99/01136、WO 99/17776、WO 99/01131、WO 99/01130、WO 99/32121、WO 00/26209、WO 99/58502、WO 99/58523、WO99/57101、WO 99/61426、WO 99/59960、WO 99/59959、WO 00/18738、WO 00/17175、WO 99/17204、WO 00/20402、WO 99/64400、WO00/01688、WO 00/07980、WO 00/07991、WO 00/06563、WO 00/12074、WO 00/12497、WO 00/31072、WO 00/31063、WO 00/23072、WO00/31065、WO 00/35911、WO 00/39116、WO 00/43384、WO 00/41698、WO 97/36587、WO 97/47618、WO 97/16442、WO 97/16441、WO97/12876、WO 98/7966、WO 98/56377、WO 98/22109、WO 98/24782、WO 98/24780、WO 98/22457、WO 98/52558、WO 98/52941、WO98/52937、WO 98/52940、WO 98/56788、WO 98/27098、WO 99/00357、WO 98/47892、WO 98/47899、WO 99/03837、WO 99/01441、WO99/01449、WO 99/03484、WO 95/09853、WO 95/09851、WO 95/09847、WO 95/09852、WO 92/12154、WO 94/19350、WO 99/15164、WO98/50356、DE 19842833、JP 2000 86657以及美國專利申請公開號20040092547、20040082551、20040077682、20040077647、20040053923、20040053958、20040053942、20040044044、20040023992、20030216446、20030203905、20030195355、20030149041、20030149037、20030144529、20030144520、20030139462、20030134888、20030130319、20030100756、20030100588、20030096817、20030092717、20030083327、20030078432、20030078275、20030078166、20030073687、20030064982、20030064981、20030055068、20030055044、20030036543、20030004164、20030004161、20020156114、20020156081、20020115671、20020103245、20020086869、20020019393、20020016477、20020013354、20020010170、20010025044和20010044538。p38抑制劑也在下列文獻(xiàn)中描述Rupert et al.，Bioorg Med Chem Lett.13347-50(2003)；Dumas et al.，Bioorg MedChem Lett.121559-1562(2002)；Dumas et al.，Bioorg Med Chem Lett.102051-2054(2000)；Redman et al.，Bioorg Med Chem Lett.119-12(2001)；Wan et al.，Bioorg Med Chem Lett.131191-4(2003)；Reganet al.，J Med Chem.452994-3008(2002)；Liverton et al.，J Med Chem.422180-90(1999)；Dumas，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.5718-27(2002)；Stelmach et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.13277-80(2003)；Cirillo et al.，Curr.Top.Med.Chem.21021-35(2002)；Pargellis et al.，Curr.Opin.Investig.Drugs.4566-71；Dumas et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.102047-50(2000)；Trejo et al.，J.Med.Chem.464702-13(2003)；Mclay et al.Bioorg.Med.Chem.9537-54(2001)；Lee et al.，Immunopharmacology 47185-201(2000)；Adams et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.112867-70(2001)；Regan et al.，J.Med.Chem.464676-4686(2003)；Laufer et al.，J.Med.Chem.452733-40(2002)；Colletti etal.，J.Med.Chem.46349-52(2003)，Branger et al.，J.Immunol.1684070-7(2002)；Henry et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.83335-40(1998)；Adams et al.，Prog.Med.Chem.381-60(2001)；Revesz et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.101261-4(2000)；Ottosen et al.，J.Med.Chem.465651-62(2003)；Thurmond et al.，Eur.J.Biochem.2685747-54(2001)；Jackson et al.，Curr.Top.Med.Chem.21011-20(2002)；Jeohn et al.，Neuroscience 114689-97(2002)；Revesz et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.122109-12(2002)；Orchard，Curr.Opin.Drug Discov.Devel. 5713-7(2002)；Nishikori et al.，Eur.J.Pharmacol.451327-33(2002)；Foster et al.，Drug News Perspect.13488-97(2000)；Boehm et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.111123-6(2001)；Huntet al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.13467-70(2003)；de Laszlo et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.82689-94(1998)；McIntyre et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.12689-92(2002)；Haddad et al.，Curr.Opin.Investig.Drugs.21070-6(2002)；Collis et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.11693-6(2001)。
JNK激酶抑制劑例如，JNK激酶抑制劑在Bogoyevitch et al.，Biochim.Biophys.Acta.169789-101(2004)以及美國專利申請公開號20040092562、20040087642、20040087615、20040082509、20040077877、20040072888、20040063946、20040023963、20030220330、20030162794、20030153560、20030108539、20030100549、20030096816、20030087922、2003073732、20020111353、20020103229、20020119135和20040077632中描述。
其它治療藥物如果需要，本發(fā)明的聯(lián)用，包含增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和調(diào)節(jié)一種或多種NFκB、NFAT、Elk-1或AP-1信號途徑的信號活動的非類固醇類藥物，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答，該聯(lián)用可以和另外的治療劑一起制成制劑或給予。這類藥物包括，例如，皮質(zhì)激素、NSAID、COX-2抑制劑、DMARD、生物制品、黃嘌呤、抗膽堿能化合物、β受體激動劑、支氣管擴(kuò)張藥、非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑、維生素D類似物、補(bǔ)骨脂素、維甲酸類和5-氨基水楊酸。
皮質(zhì)激素任選地，激素可與本發(fā)明的組合物一起制成制劑或給予根據(jù)本發(fā)明需要治療的哺乳動物。適宜的皮質(zhì)激素包括11-α，17-α，21-三羥基孕-4-烯-3，20-二酮、11-β，16-α，17，21-四羥基孕-4-烯-3，20-二酮、11-β，16-α，17，21-四羥基孕-1，4-二烯-3，20-二酮、11-β，17-α，21-三羥基-6-α-甲基孕-4-烯-3，20-二酮、11-脫氫皮質(zhì)甾酮、11-脫氧皮質(zhì)甾醇、11-羥基-1，4-雄烯-3，17-二酮、11-酮基睪酮、14-羥基雄甾-4-烯-3，6，17-三酮、15，17-二羥基孕酮、16-甲基氫化可的松、17，21-二羥基-16-α-甲基孕-1，4，9(11)-三烯-3，20-二酮、17-α-羥基孕-4-烯-3，20-二酮、17-α-羥基孕甾烯醇酸、17-羥基-16-β-甲基-5-β-孕-9(11)-烯-3，20-二酮、17-羥基-4，6，8(14)-孕三烯-3，20-二酮、17-羥基孕-4，9(11)-二烯-3，20-二酮、18-羥皮質(zhì)甾酮、18-羥基可的松、18-氧代皮質(zhì)醇、21-脫氧醛固酮、21-脫氧皮質(zhì)素、2-脫氧蛻皮素、2-甲基可的松、3-脫氧蛻皮素、4-孕烯-17-α，20-β，21-三醇-3，11-二酮、6，17，20-三羥基孕-4-烯-3-酮、6-α-羥基氫化可的松、6-α-氟強(qiáng)的松龍、6-α-甲基潑尼松龍、6-α-甲基潑尼松龍21-醋酸酯、6-甲基潑尼松龍21-半琥珠酸酯鈉鹽、6-β-羥基氫化可的松、6-α，9-α-二氟潑尼松龍21-醋酸酯17-丁酸酯、6-羥腎上腺皮質(zhì)甾酮、6-羥基地塞米松、6-羥基潑尼松龍、9-氟可的松、二丙酸阿氯米松、醛固酮、阿爾孕酮、alphaderm(1％氫化可的松乳膏)、阿馬地酮、安西奈德、阿那孕酮、雄烯二酮、醋酸阿奈可他、倍氯米松、二丙酸倍氯米松、二丙酸倍氯米松一水合物、17-戊酸倍他米松、倍他米松醋酸鈉、倍他米松磷酸鈉、戊酸倍他米松、勃拉睪酮、布地奈德、卡普睪酮、氯地孕酮、氯潑尼松、醋酸氯潑尼松、膽固醇、氯倍他索、丙酸氯倍他索、氯倍他松、氯可托龍、特戊酸氯可托龍、氯孕酮、氯潑尼醇、腎上腺酮、氫化可的松、醋酸氫化可的松、丁酸氫化可的松、環(huán)戊丙酸氫化可的松、辛酸氫化可的松、氫化可的松磷酸鈉、氫化可的松琥珀酸鈉、戊酸氫化可的松、可的松、醋酸可的松、可托多松、daturaolone、地夫可特、21-脫氧氫化可的松、脫氫表雄酮、地馬孕酮、脫氧皮質(zhì)甾酮、地潑羅酮、地西龍、地奈德、地羥米松、dexafen、地塞米松、地塞米松21-醋酸酯、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸鈉、二氯松、二氟拉松、二氟拉松二醋酸鹽、二氟可龍、dihydroelatericina、多潑尼酯、多倍他索、蛻皮素、蛻皮甾酮、恩甲羥松、甘草次酸、flucinolone、氟氫可的松、醋酸氟氫可的松、氟孕酮、氟米松、特戊酸氟米松、氟莫奈德、氟尼縮松、氟輕松、氟輕松、醋酸氟輕松、9-氟可的松、氟可龍、氟代羥雄烯二酮、氟米龍、醋酸氟米龍、氟甲睪酮、氟潑尼定、氟潑尼龍、氟氫縮松、氟替卡松、丙酸氟替卡松、甲酰勃龍、氟美坦、氟莫可他、孕諾酮、glyderinine、哈西奈德、西加小冠花甙、鹵米松、鹵潑尼松、鹵孕酮、環(huán)戊丙酸氫化可的松、氫化可的松、21-丁酸氫化可的松、醋丙氫可的松、醋酸氫化可的松、丁丙酸氫化可的松、丁酸氫化可的松、環(huán)戊丙酸氫化可的松、半琥珀酸氫化可的松、氫化可的松probutate、氫可松磷酯鈉、氫化可的松琥珀酸鈉、戊酸氫化可的松、羥孕酮、牛膝甾酮、異氟潑尼龍、醋酸異氟潑尼龍、異潑尼定、甲氯松、特戊酸強(qiáng)的松龍、美屈孕酮、甲羥孕酮、甲羥松、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美侖孕酮、甲潑尼松、美雄酮、甲潑尼龍、醋丙甲潑尼龍、醋酸甲潑尼龍、半琥珀酸甲潑尼龍、甲潑尼龍琥珀酸鈉、甲睪酮、美曲勃龍、莫米松、糠酸莫米松、糠酸莫米松一水合物、潑尼松、諾美孕酮、諾孕美特、諾乙烯酮、羥甲睪酮、帕拉米松、醋酸帕拉米松、坡那睪酮、潑尼索酯、潑尼松龍、21-半琥珀酸潑尼松龍、醋酸潑尼松龍、法尼酸潑尼松龍、半琥珀酸潑尼松龍、21(β-D-葡糖苷酸)-潑尼松龍、間磺基苯甲酸潑尼松龍、潑尼松龍磷酸鈉、司替潑尼松龍、叔丁乙酸潑尼松龍、四氫鄰苯二甲酸潑尼松龍、潑尼松、戊酸潑尼松龍、潑尼立定、孕烯諾龍、普西奈德、曲洛奈德、黃體酮、普美孕酮、漏蘆甾酮、利美索龍、羅昔勃龍、紅莧甾酮(紫莖牛膝甾酮)、stizophyllin、巰氫可的松、托普雄酮、曲安西龍、曲安奈德、21-棕櫚酸曲安奈德、雙醋酸曲安西龍、己曲安奈德、曲美孕酮、土克甾酮和渥曼青霉素。
各種類固醇/疾病聯(lián)用的標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量列于下表1中。
表1皮質(zhì)激素的標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量
皮質(zhì)激素其它的標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量在，例如墨克診療手冊(the MerckManual of Diagnosis & Therapy 17版.MH Beers et al.，Merck & Co.)和醫(yī)師案頭手冊(Physicians′Desk Reference)2003(57版.MedicalEconomics Staff et al.，Medical Economics Co.，2002)中提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予皮質(zhì)激素的劑量與潑尼松龍的劑量相同，如在此處使用的。例如，可以認(rèn)為低劑量皮質(zhì)激素與低劑量潑尼松龍是同等的劑量。
在本發(fā)明的的方法、組合物和藥盒中，可用作替代物或除皮質(zhì)激素外的其它化合物為A-348441(Karo Bio)、腎上腺皮質(zhì)提取物(GlaxoSmithKline)、阿沙克肽(Aventis)、安布可特(Schering AG)、阿洛米松(Taisho)、ATSA(Pfizer)、比托特羅(Elan)、CBP-2011(InKinePharmaceutical)、西巴西坦(Novartis)、CGP-13774(Kissei)、環(huán)索奈德(Altana)、環(huán)去氫可的松(Aventis)、丁氯倍他松(GlaxoSmithKline)、氯潑尼醇(Hoffmann-La Roche)、collismycin A(Kirin)、葫蘆苦素E(NIH)、地夫可特(Aventis)、丙酸地潑羅酮(SSP)、乙呋地塞米松(Schering-Plough)、亞油酸地塞米松(GlaxoSmithKline)、纈草酸地塞米松(Abbott)、二氟潑尼酯(Pfizer)、多潑尼酯(Hoffmann-La Roche)、依比拉肽(Aventis)、etiprednol dicloacetate(IVAX)、氟扎可特(Vicuron)、氟莫奈德(Hoffmann-La Roche)、丁基氟可丁酯(ScheringAG)、氟可龍一水合物(Schering AG)、GR-250495X(GlaxoSmithKline)、鹵米松(Novartis)、鹵潑尼松(Dainippon)、HYC-141(Fidia)、醋丁艾可米松(Hovione)、伊曲奈德(AstraZeneca)、L-6485(Vicuron)、Lipocort(Draxis Health)、地西洛可龍(Aventis)、甲氯松(Schering-Plough)、萘非可特(Bristol-Myers Squibb)、NCX-1015(NicOx)、NCX-1020(NicOx)、NCX-1022(NicOx)、尼可奈德(Yamanouchi)、NIK-236(Nikken Chemicals)、NS-126(SSP)、Org-2766(Akzo Nobel)、Org-6632(Akzo Nobel)、P16CM、丙基美睪酮(ScheringAG)、RGH-1113(Gedeon Richter)、羅氟奈德(AstraZeneca)、棕櫚酸羅氟奈德(AstraZeneca)、RPR-106541(Aventis)、RU-26559(Aventis)、Sch-19457(Schering-Plough)、T25(Matrix Therapeutics)、TBI-PAB(Sigma-Tau)、丙酸替卡貝松(Hoffmann-La Roche)、替氟朵(Solvay)、替莫貝松(Hoffmann-La Roche)、TSC-5(Takeda)和ZK-73634(Schering AG)。
特殊疾病治療劑慢性阻塞性肺疾患在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法、組合物和藥盒用于治療慢性阻塞性肺疾患(COPD)。如果需要，通常用來治療COPD的一種或多種藥物也可以作為替代物或加入本發(fā)明的方法、組合物和藥盒中的聯(lián)用中。這些藥物包括黃嘌呤(例如膽茶堿)、抗膽堿能化合物(例如異丙托銨、噻托銨)、生物制品、小分子免疫調(diào)節(jié)劑和β受體激動劑/支氣管擴(kuò)張藥(例如硫酸異丁特羅、甲磺酸比托特羅、腎上腺素、富馬酸福莫特羅、異丙腎上腺素、鹽酸左異丁特羅、硫酸間羥異丙腎上腺素、醋酸吡布特羅、沙美特羅昔萘酸酯和特布他林)。
牛皮癬本發(fā)明的方法、組合物和藥盒可用于治療牛皮癬。如果需要，通常用來治療牛皮癬的一種或多種抗牛皮癬藥物可作為替代物使用或加入本發(fā)明的聯(lián)用中。這些藥物包括生物制品(例如alefacept、英夫利昔單抗、adelimumab、efalizumab、依那西普和CDP-870)、小分子免疫調(diào)節(jié)劑(例如VX 702、SCIO 469、doramapimod、RO 30201195、SCIO 323、DPC 333、pranalcasan、麥考酚酯和merimepodib)、非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(例如環(huán)孢霉素A、他克莫司、吡美莫司和ISAtx247)、維生素D類似物(例如卡泊三烯、卡泊三醇)、補(bǔ)骨脂素(例如甲氧沙林)、維甲酸類(例如阿昔曲丁、tazoretene)、DMARDs(例如甲氨蝶呤)和蒽林。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征為下列藥物并用增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物，減少一種或多種NFκB、NFAT、AP-1、Elk-1信號途徑信號活動的非類固醇類藥物和抗牛皮癬藥物，以及隨其治療牛皮癬的方法。
炎性腸病本發(fā)明的方法、組合物和藥盒可用于治療炎性腸病。如果需要，在本發(fā)明的方法、組合物和藥盒中，通常用于治療炎性腸病一種或多種藥物可加入特征性聯(lián)用中。這些藥物包括生物制品(例如英夫利昔單抗、adelimumab和CDP-870)、小分子免疫調(diào)節(jié)劑(例如VX 702、SCIO 469、doramapimod、RO 30201195、SCIO 323、DPC 333、pranalcasan、麥考酚酯和merimepodib)、非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(例如環(huán)孢霉素A、他克莫司、吡美莫司和ISAtx247)、5-氨基水楊酸(例如美沙拉秦、柳氮磺吡啶、巴柳氮二鈉和奧柳氮鈉)、DMARDs(甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)以及阿洛司瓊。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征為聯(lián)用以下藥物增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物，減少一種或多種NFκB、NFAT、AP-1、Elk-1信號途徑信號活動的非類固醇類藥物和前述任何藥物，以及隨其治療炎性腸病的方法。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎本發(fā)明的方法、組合物和藥盒可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。如果需要，在本發(fā)明的方法、組合物和藥盒中，通常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種或多種藥物可加入特征性聯(lián)用中。這些藥物包括NSAIDs(例如萘普生鈉、雙氯芬酸鈉、雙氯芬酸鉀、阿司匹林、舒林酸、雙氟尼酸、吡羅昔康、吲哚美辛、布洛芬、萘丁美酮、三水楊酸膽堿鎂、水楊酸鈉、水楊酰水楊酸(雙水楊酸)、非諾洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、甲氯滅酸鈉、美洛昔康、奧沙普秦、舒林酸和托美丁)、COX-2抑制劑(例如羅非考昔、塞來考昔、伐地考昔和lumiracoxib)、生物制品(例如英夫利昔單抗、adelimumab、依那西普、CDP-870、利妥昔單抗和atlizumab)、小分子免疫調(diào)節(jié)劑(VX 702、SCIO 469、doramapimod、RO 30201195、SCIO 323、DPC 333、pranalcasan、麥考酚酯和merimepodib)、非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(例如環(huán)孢霉素A、他克莫司、吡美莫司和ISAtx247)、5-氨基酸水楊酸(例如美沙拉秦、柳氮磺吡啶、巴柳氮二鈉和奧柳氮鈉)、DMARDs(甲氨蝶呤、來氟米特、米諾環(huán)素、金諾芬、硫代蘋果酸金鈉、金硫葡糖和硫唑嘌呤)、硫酸羥氯喹和青霉胺。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征為聯(lián)用以下藥物增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物，減少一種或多種NFκB、NFAT、AP-1、Elk-1信號途徑信號活動的非類固醇類藥物和前述任何藥物，以及隨其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。
哮喘本發(fā)明的方法、組合物和藥盒可用于治療哮喘。如果需要，在本發(fā)明的方法、組合物和藥盒中，可以使用通常用于治療哮喘的一種或多種藥物，除皮質(zhì)激素外。這些藥物包括β2激動劑/支氣管擴(kuò)張劑/白細(xì)胞三烯調(diào)節(jié)物(例如扎魯司特、孟魯司特和齊留通)、生物制品(例如omalizumab)、小分子免疫調(diào)節(jié)劑、抗膽堿能化合物、黃嘌呤、麻黃堿、愈創(chuàng)木酚甘油醚、色甘酸鈉、奈多羅米鈉和碘化鉀。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征為聯(lián)用以下藥物增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物，減少一種或多種NFκB、NFAT、AP-1、Elk-1信號途徑信號活動的非類固醇類藥物和前述任何藥物，以及隨其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。
非類固醇類的親免疫因子依賴性的免疫抑制劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明以使用下列藥物的方法、組合物和藥盒為特征增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物，減少一種或多種NFκB、NFAT、AP-1、Elk-1信號途徑信號活動的非類固醇類藥物和非類固醇類的親免疫因子依賴性的免疫抑制劑(NsIDI)。
在健康個(gè)體中，免疫系統(tǒng)使用細(xì)胞效應(yīng)器，如B-細(xì)胞和T-細(xì)胞，其以有傳染性的微生物和異常細(xì)胞型為靶點(diǎn)同時(shí)離開完好的正常細(xì)胞。在患有自身免疫性疾病或移植器官的個(gè)體中，活化的T-細(xì)胞損害健康組織。神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(環(huán)孢霉素、他克莫司、吡美莫司)和雷怕霉素以多種類型的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞為靶點(diǎn)，包括T-細(xì)胞，并在器官移植和自身免疫性疾病中抑制免疫應(yīng)答。
環(huán)孢霉素環(huán)孢霉素是真菌代謝產(chǎn)物，其包含充當(dāng)免疫抑制劑的一類環(huán)狀寡肽。環(huán)孢霉素A和其氘化的類似物ISAtx247是包括11個(gè)氨基酸的疏水性環(huán)狀多肽。環(huán)孢菌素A與細(xì)胞內(nèi)受體cyclophilin結(jié)合并形成復(fù)合物。環(huán)孢霉素A/cyclophilin復(fù)合物結(jié)合并抑制神經(jīng)鈣蛋白，Ca2+-鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性的絲氨酸-蘇氨酸特異性蛋白質(zhì)磷酸酶。神經(jīng)鈣蛋白介導(dǎo)對于T-細(xì)胞激活是必需的信號轉(zhuǎn)錄事件(在Schreiber et al.，Cell70365-368，1991中綜述)。環(huán)孢霉素及其功能和結(jié)構(gòu)類似物通過抑制抗原-觸發(fā)器信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制T-細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答。這種抑制降低致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-2。
許多環(huán)孢霉素(例如環(huán)孢霉素A、B、C、D、E、F、G、H和I)由真菌產(chǎn)生。市售的環(huán)孢霉素A商品名為NEORAL，來自諾華(Novartis)。環(huán)孢霉素A的結(jié)構(gòu)和功能類似物包括具有一個(gè)或多個(gè)氟化氨基酸的環(huán)孢霉素(例如，在美國專利號5,227,467中所述)，具有修飾氨基酸的環(huán)孢霉素(例如，在美國專利號5,122,511和4,798,823中所述)，以及氘化的環(huán)孢霉素，如ISAtx247(在美國專利公開號20020132763中所述)。另外的環(huán)孢霉素A類似物在美國專利號6,136,357、4,384,996、5,284,826和5,709,797中敘述。環(huán)孢霉素A類似物包括，但不限于，D-Sar(α-SMe)3Val2-DH-Cs(209-825)、Allo-Thr-2-Cs、原纈氨酸-2-Cs、D-Ala(3-乙酰氨基)-8-Cs、Thr-2-Cs和D-MeSer-3-Cs、D-Ser(O-CH2CH2-OH)-8-Cs以及D-Ser-8-Cs，上述物質(zhì)在Cruz et al.(Antimicrob.Agents Chemother.44143-149，2000)中描述。
環(huán)孢霉素是非常疏水的且在水(例如與體液接觸時(shí))存在下容易制備。具有改善的生物利用度的環(huán)孢霉素A制劑的制備方法在美國專利號4,388,307、6,468,968、5,051,402、5,342,625、5,977,066和6,022,852中描述。環(huán)孢霉素A微乳劑組合物在美國專利號5,866,159、5,916,589、5,962,014、5,962,017、6,007,840和6,024,978中描述。
環(huán)孢霉素能由靜脈內(nèi)或口服給予，但是優(yōu)選口服給予。為抵抗環(huán)孢霉素A的疏水性，靜脈注射的環(huán)孢霉素A通常在乙醇-聚氧乙基化蓖麻油賦形劑中制備，其給予之前必須稀釋。環(huán)孢霉素A可被制成，例如在25mg或100mg片中或在100mg/ml口服溶液中的微乳劑(NEORALTM)。
通常，患者口服環(huán)孢霉素A的劑量根據(jù)患者的癥狀變化，但是在現(xiàn)有技術(shù)的治療方案中的一些標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量在此處提供。器官移植的患者通常接受口服環(huán)孢霉素A的起始劑量為12-15mg/kg/day。然后劑量以每周5％的量減少直至達(dá)到7-12mg/kg/day的維持劑量。對于靜脈注射給藥，多數(shù)患者優(yōu)選2-6mg/kg/day。診斷為克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎的患者，通常給予的劑量為6-8mg/kg/day。診斷為全身性紅斑狼瘡的患者，通常給予的劑量為2.2-6.0mg/kg/day。對于牛皮癬或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，劑量通常為0.5-4mg/kg/day。其它使用劑量包括0.5-5mg/kg/day、5-10mg/kg/day、10-15mg/kg/day、15-20mg/kg/day或20-25mg/kg/day。通常環(huán)孢霉素與其它免疫抑制劑，如乳糖皮質(zhì)激素聯(lián)合給予。另外的信息在表2中提供。
表2-NsIDIs
注解CsA＝環(huán)孢霉素ARA＝類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎UC＝潰瘍性結(jié)腸炎
SLE＝全身性紅斑狼瘡他可莫司他克莫司(PROGRAF，F(xiàn)ujisawa)，也稱為FK506，是免疫抑制劑，其以T-細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為靶點(diǎn)。他克莫司與細(xì)胞內(nèi)蛋白FK506的結(jié)合蛋白(FKBP-12)結(jié)合，該結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)上與cyclophilin(Harding et al.Nature 341758-7601，1989；Siekienka et al.Nature341755-757，1989和Soltoff et al.，J.Biol.Chem.26717472-17477，1992)不相關(guān)。FKBP/FK506復(fù)合物與神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合并抑制神經(jīng)鈣蛋白的磷酸酶活性。這種抑制作用防止脫磷酸作用和NFAT的核轉(zhuǎn)位，NFAT是一種啟動淋巴因子(例如IL-2、γ干擾素)產(chǎn)生和T-細(xì)胞激活所必需的基因轉(zhuǎn)錄的成分。因此，他克莫司抑制T-細(xì)胞激活。
他克莫司是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由鏈霉菌屬tsukubaensis產(chǎn)生。它抑制免疫系統(tǒng)并延長移植器官的存活。它當(dāng)前以口服制劑或注射劑使用。他克莫司膠囊在一粒膠囊殼中含有0.5mg、1mg或5mg無水他克莫司。注射劑在蓖麻油和酒精中含有5mg無水他克莫司，其在注射前用9％氯化鈉或5％葡萄糖稀釋。雖然優(yōu)選口服給予，但是不能口服膠囊的患者可以接受可注射的他克莫司。起始劑量應(yīng)在移植后不超過6小時(shí)通過持續(xù)靜脈輸注給予。
他克莫司及其類似物由Tanaka et al.，(J.Am.Chem.Soc.，1095031，1987)敘述，并且在美國專利號4,894,366、4,929,611和4,956,352中敘述。FK506相關(guān)化合物，包括FR-900520、FR-900523和FR-900525，在美國專利號5,254,562中敘述；O-芳基、O-烷基、O-烯基和O-炔基大環(huán)內(nèi)酯類在美國專利號5,250,678、532,248、5,693,648中描述；氨基O-芳基大環(huán)內(nèi)酯類在美國專利號5,262,533中描述；亞烷基大環(huán)內(nèi)酯類在美國專利號5,284,840中描述；N-雜芳基、N-烷基雜芳基、N-烯基雜芳基和N-炔基雜芳基在美國專利5,208,241中描述；氨基大環(huán)內(nèi)酯類及其衍生物在美國專利5,208,228中描述；氟代大環(huán)內(nèi)酯類在美國專利號5,189,042中描述；氨基O-烷基、O-烯基和O-炔基大環(huán)內(nèi)酯類在美國專利號5,162,334中描述；以及鹵代大環(huán)內(nèi)酯類在美國專利號5,143,918中描述。
雖然建議劑量隨患者的癥狀而變化，但是在現(xiàn)有技術(shù)的治療方案中使用的標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量在下面提供。診斷為患有克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎的患者給予口服他克莫司0.1-0.2mg/kg/day。器官移植的患者通常接受口服他克莫司的劑量為0.1-0.2mg/kg/day。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者通常接受口服他克莫司1-3mg/kg/day。對于牛皮癬的治療，給予患者口服他克莫司0.01-0.15mg/kg/day。特應(yīng)性皮炎可通過受累區(qū)域一日兩次使用含0.03-0.1％他克莫司的乳膏治療。接受口服他克莫司膠囊的患者通常在器官移植后不超過6小時(shí)使用第一個(gè)劑量，或靜脈注射他克莫司注射劑后8-12小時(shí)停止。其它建議他克莫司的劑量包括0.005-0.01mg/kg/day、0.01-0.03mg/kg/day、0.03-0.05mg/kg/day/、0.05-0.07mg/kg/day、0.07-0.10mg/kg/day、0.10-0.25mg/kg/day或0.25-0.5mg/kg/day。
他克莫司被混合功能氧化酶系統(tǒng)廣泛代謝，尤其是被細(xì)胞色素P-450系統(tǒng)。主要的代謝機(jī)理為脫甲基作用和羥基化作用。盡管各種他克莫司代謝物有可能發(fā)揮免疫抑制生物活性，但是有報(bào)道13-脫甲基代謝物具有與他克莫司相同的活性。
吡美莫司和子囊霉素衍生物子囊霉素是FK506的結(jié)構(gòu)相近的類似物，且是有效的免疫抑制劑。它與FKBP-12結(jié)合并抑制其脯氨酸旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶的活性。子囊霉素-FKBP復(fù)合物抑制神經(jīng)鈣蛋白，一種2B型磷酸酶。
吡美莫司(也稱為SDZ ASM-981)是子囊霉素的33-epi-氯代衍生物。它有鏈霉菌屬菌株hygroscopicus var.ascomyceitus產(chǎn)生。與他克莫司一樣，吡美莫司(ELIDELTM，諾華)結(jié)合FKBP-12，抑制神經(jīng)鈣蛋白磷酸酶活性，并通過阻斷早期細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄抑制T-細(xì)胞活性。尤其是，吡美莫司抑制IL-2產(chǎn)生和其它致炎細(xì)胞因子的釋放。
吡美莫司的結(jié)構(gòu)和功能類似物在美國專利號6,384,073中敘述。吡美莫司對于治療特應(yīng)性皮炎特別有效。目前吡美莫司以1％乳膏使用。盡管個(gè)體劑量隨患者癥狀變化，但是一些標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量在下面提供?？诜撩滥究山o予治療牛皮癬或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，量為40-60mg/day。對于治療克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎，可給予吡美莫司的量為80-160mg/day。器官移植的患者可給予吡美莫司160-240mg/day。診斷為患有全身性紅斑狼瘡的患者可給予吡美莫司40-120mg/day。其它吡美莫司的使用劑量包括0.5-5mg/day、5-10mg/day、10-30mg/day、40-80mg/day、80-120mg/day，甚或120-200mg/day。
雷怕霉素雷怕霉素(Rapamune西羅莫司，惠氏Wyeth)是由Steptomyceshygroscopicus產(chǎn)生的環(huán)狀內(nèi)酯。雷怕霉素是抑制T-淋巴細(xì)胞激活和增殖的免疫抑制劑。與環(huán)孢霉素、他克莫司和吡美莫司一樣，雷怕霉素與親免疫因子FKBP-12形成復(fù)合物，但是雷怕霉素-FKBP-12復(fù)合物不抑制神經(jīng)鈣蛋白磷酸酶活性。雷怕霉素-親免疫因子復(fù)合物結(jié)合并抑制哺乳動物的雷怕霉素靶點(diǎn)(mTOR)，其為細(xì)胞分裂周期進(jìn)程所必需的激酶。mTOR激酶活性的抑制作用阻斷T-淋巴細(xì)胞增值和淋巴素分泌。
雷怕霉素的結(jié)構(gòu)和功能類似物包括單-和二酰化的雷怕霉素衍生物(美國專利號4,316,885)、雷怕霉素的水溶性前體藥物(美國專利號4,650,803)，羧酸酯(PCT公開號WO 92/05179)、氨基甲酸酯(美國專利號5,118,678)，酰胺酯(美國專利號5,118,678)，生物素酯(5,504,091)，氟化酯(美國專利號5,100,883)，縮醛(美國專利號5,151,413)，甲硅烷基酯(美國專利號5,120,842)，二環(huán)衍生物(美國專利號5,120,725)，雷怕霉素二聚體(美國專利號5,120,727)，O-芳基、O-烷基、O-烯基和O-炔基衍生物(美國專利號5,258,389)及氘化雷怕霉素(美國專利號6,503,921)。另外的雷怕霉素類似物在美國專利號5,202,332和5,169,851中描述。
依維莫司(40-O-(2-羥乙基)雷怕霉素，CERTICANTM，諾華)是免疫抑制的大環(huán)內(nèi)酯，其結(jié)構(gòu)上與雷怕霉素相關(guān)，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)與環(huán)保霉素A并用時(shí)，其預(yù)防器官移植的急性排斥特別有效。
目前雷怕霉素可用的口服給藥為液體或片劑劑型。RAPAMUNETM液體含有1mg/mL雷怕霉素，其在使用前在水或橙汁中稀釋。含有1或2mg雷怕霉素的片劑也是可用的。雷怕霉素優(yōu)選在移植后盡快給予，一日一次?？诜o藥后其快速完全吸收。通常，雷怕霉素的患者劑量根據(jù)患者的癥狀而變化，但是一些標(biāo)準(zhǔn)推薦劑量在下面提供。雷怕霉素的初始負(fù)荷劑量為6mg。后來2mg/day的維持劑量是常見的。或者，3mg、5mg、10mg、15mg、20mg或25mg的負(fù)荷劑量可與1mg、3mg、5mg、7mg或10mg的每日維持劑量一起使用。在體重低于40kg的患者中，雷怕霉素的劑量通常根據(jù)體表面積調(diào)整；通常使用3mg/m2/day的負(fù)荷劑量和1-mg/m2/day維持劑量。
肽部分天然的、合成的或化學(xué)修飾的肽、擬肽、肽片斷，損害NFAT、NFкB、AP-1或Elk-1信號途徑，適用于本發(fā)明的實(shí)踐中。作為神經(jīng)鈣蛋白抑制劑而抑制NFAT激活和NFAT轉(zhuǎn)錄因子的肽的實(shí)例由，例如Aramburu et al.，Science 2852129-2133，1999)和Aramburu et al.，Mol.Cell 1627-637，1998)敘述。作為一類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑，這些藥物用于本發(fā)明的方法中。
示范性抑制劑包括減少靶蛋白量或降低RNA水平的化合物(例如，反義化合物、dsRNA、RNA構(gòu)成酶)以及與內(nèi)源性有絲分裂驅(qū)動蛋白或蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶競爭結(jié)合配體的化合物(例如顯性負(fù)相蛋白或編碼相同蛋白的多聚核苷酸)。
反義化合物有絲分裂驅(qū)動蛋白和/或蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的生物活性通過使用直接編碼靶蛋白的RNA的反義化合物而被降低。減少信號分子表達(dá)的反義化合物可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被鑒別。例如，mRNA信號分子靶點(diǎn)的易接近區(qū)域可通過使用RNA二級結(jié)構(gòu)折疊程序預(yù)測，如MFOLD(M.Zuker，D.H.Mathews & D.H.Turner，Algorithms andThermodynamics for RNA Secondary Structure PredictionAPractical Guide.InRNA Biochemistry and Biotechnology，J.Barciszewski & B.F.C.Clark，eds.，NATO ASI Series，KluwerAcademic Publishers，(1999))。預(yù)測的mRNA最穩(wěn)定折疊的5％內(nèi)的自由能的次級折疊使用200個(gè)堿基窗口預(yù)測，其中殘基能發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充堿基以形成堿基對。未形成堿基對的開放區(qū)域與各次級折疊和預(yù)測區(qū)域相加，因?yàn)殚_放被認(rèn)為更易與反義核堿基低聚物接近。反義設(shè)計(jì)的其它方法在，例如，美國專利號6,472,521，Antisense Nucleic Acid DrugDev.1997 7439-444，Nucleic Acids Research 282597-2604，2000和Nucleic Acids Research 314989-4994，2003中描述。
RNA干擾信號分子的生物活性能通過使用RNA干擾(RNAi)降低，使用，例如，在序列中指向信號分子的雙鏈RNA(dsRNA)或小分子干擾RNA(siRNA)(見，例如Miyamoto et al.，Prog.Cell.Cycle Res.5349-360，2003；美國申請公開號20030157030)。設(shè)計(jì)這種干擾性RNAs的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。例如，可用的設(shè)計(jì)干擾性RNA的軟件來自O(shè)ligoengine(Seattle，WA)。
顯性負(fù)相蛋白質(zhì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道怎樣制備信號分子定向的顯性負(fù)相蛋白質(zhì)。這種顯性負(fù)相蛋白在，例如，Gupta et al.，J.Exp.Med.，186473-478，1997；Maegawa et al.，J.Biol.Chem.27430236-30243，1999；Woodford-Thomas et al.，J.Cell Biol.117401-414，1992中敘述。
測定致炎細(xì)胞因子抑制的活性本發(fā)明聯(lián)用的治療或抗炎效應(yīng)通過任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的或在此處所述的標(biāo)準(zhǔn)方法測定。例如，包括在靶向信號途徑中的任何信號分子的表達(dá)水平或生物活性可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如磷酸化研究、西部和北部分析、ELISA和免疫組織化學(xué))測定。若在未治療對照中的與這種表達(dá)或生物活性相關(guān)的信號分子的表達(dá)或生物活性降低，則根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物被鑒別為是有用的。遇此情況，信號分子有信號途徑靶點(diǎn)的作用下游區(qū)。如果需要，也可以測定NFкB、NFAT、AP-1和Elk-1的表達(dá)水平或信號途徑。
除測定信號途徑中的信號分子的表達(dá)水平或生物活性外，本發(fā)明聯(lián)用的抗炎作用可以通過檢測致炎細(xì)胞因子(如在此所述的)的釋放或產(chǎn)生來測定。TNF-α的產(chǎn)生可以通過，例如，測定TNF-α轉(zhuǎn)錄或用ELISA通過測定TNF-α蛋白水平來評估。化合物稀釋法基質(zhì)可以測定如下所述的TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4和IL-5的抑制作用。
TNFα通過用終濃度為2μg/mL脂多糖(Sigma L-4130)處理，刺激在聚苯乙烯384-孔板(NalgeNunc)的各孔中含有100μl人白細(xì)胞稀釋混懸液分泌TNFα。在刺激時(shí)間加入各受試化合物的各種濃度。在增濕的保溫箱中于37℃培育16-18小時(shí)后，將板離心并將上清夜轉(zhuǎn)移至白色不透光的涂有抗TNFα抗體(PharMingen，#551220)的聚苯乙烯384孔板中(NalgeNunc，Maxisorb)。培養(yǎng)2-4小時(shí)后，用含0.1％吐溫20的PBS洗板(Tecan PowerWasher 384)，并用另一種生物素標(biāo)記(PharMingen，#554511)的抗TNFα抗體和與strepavidin(PharMingen，#13047E)耦合的HRP再培養(yǎng)1小時(shí)。板用0.1％吐溫20/PBS洗后，將HRP-發(fā)光的底物加入各板并使用LJL分析板光度計(jì)測定光強(qiáng)度。
IFNγ通過用終濃度為10ng/mL 12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(Sigma，P-1585)和750ng/mL伊屋諾霉素(Sigma，1-0634)處理，刺激在聚苯乙烯384-孔板(NalgeNunc)的各孔中含有100μl人白細(xì)胞稀釋混懸液分泌IFNγ。在刺激時(shí)間加入各受試化合物的各種濃度。在增濕的保溫箱中于37℃培育16-18小時(shí)后，將板離心并將上清夜轉(zhuǎn)移至白色不透光的涂有抗IFNγ抗體(Endogen，#M-700A-E)的聚苯乙烯384孔板中(NalgeNunc，Maxisorb)。培養(yǎng)2-4小時(shí)后，用含0.1％吐溫20(聚氧乙酸脫水山梨醇單月桂酸酯)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗板(TecanPowerWasher 384)，并用另一種生物素標(biāo)記(Endogen，M701B)的抗IFNγ抗體和與strepavidin(PharMingen，#13047E)耦合的辣根過氧化物酶(HRP)再培養(yǎng)1小時(shí)。板用0.1％吐溫20/PBS洗后，將HRP-發(fā)光的底物加入各板并使用LJL分析板光度計(jì)測定光強(qiáng)度。
IL-1β通過用終濃度為2μg/mL脂多糖(Sigma L-4130)處理，刺激在聚苯乙烯384-孔板(NalgeNunc)的各孔中含有100μl人白細(xì)胞稀釋混懸液分泌IL-1β。在刺激時(shí)間加入各受試化合物的各種濃度。在增濕的保溫箱中于37℃培育16-18小時(shí)后，將板離心并將上清夜轉(zhuǎn)移至白色不透光的涂有抗IL-1β抗體(R&D，#MAB-601)的聚苯乙烯384孔板中(NalgeNunc，Maxisorb)。培養(yǎng)2-4小時(shí)后，用含0.1％吐溫20的PBS洗板(Tecan PowerWasher 384)，并用另一種生物素標(biāo)記(R&D，BAF-201)的抗TNFα抗體和與strepavidin(PharMingen，#13047E)耦合的HRP再培養(yǎng)1小時(shí)。板用0.1％吐溫20/PBS洗后，將HRP-發(fā)光的底物加入各板并使用LJL分析板光度計(jì)測定光強(qiáng)度。
IL-2通過用終濃度為10ng/mL 12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(Sigma，P-1585)和750ng/mL伊屋諾霉素(Sigma，I-0634)處理，刺激在聚苯乙烯384-孔板(NalgeNunc)的各孔中含有100μl人白細(xì)胞稀釋混懸液分泌IL-2。在刺激時(shí)間加入各受試化合物的各種濃度。在增濕的保溫箱中于37℃培育16-18小時(shí)后，將板離心并將上清夜轉(zhuǎn)移至白色不透光的涂有抗IL-2抗體，(PharMingen，#555051)的聚苯乙烯384孔板中(NalgeNunc，Maxisorb)。培養(yǎng)2-4小時(shí)后，用含0.1％吐溫20的PBS洗板(Tecan PowerWasher 384)，并用另一種生物素標(biāo)記(Endogen，M600B)的抗IL-2抗體和與strepavidin(PharMingen，#13047E)耦合的HRP再培養(yǎng)1小時(shí)。板用0.1％吐溫20/PBS洗后，將HRP-發(fā)光的底物加入各板并使用LJL分析板光度計(jì)測定光強(qiáng)度。
IL4 and IL-5IL-4和IL-5細(xì)胞因子表達(dá)的分子使用BD PharMingen Cytometric6 Bead Array系統(tǒng)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。簡單的說，血沉棕黃層測定板的上清夜用標(biāo)記的細(xì)胞因子檢測小球雞尾酒培養(yǎng)。然后將樣品洗，重新混懸并在BD Pharmingen FACsCalibur流式細(xì)胞測定器上讀數(shù)。然后數(shù)據(jù)使用BD Pharmingen CBA 6 Bead Analysis軟件分析。
實(shí)施例1通過阿莫沙平和帕羅西汀抑制平行的信號途徑材料和方法藥物除阿莫沙平用0.1mM MES(2-(N-嗎啉代乙磺酸)(Sigma)緩沖液制備外，所有藥物的原液均在DMSO中制備。豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)(100μg/ml)原液和在DMSO中的伊屋諾霉素(5mg/ml)在培養(yǎng)介質(zhì)中稀釋以產(chǎn)生最終濃度的PMA(10ng/ml，16.2nM)和伊屋諾霉素(750μg/ml，1μM)。
細(xì)胞和細(xì)胞系從捐贈的人全血(紅十字會，Rhode Island)制備新鮮的血沉棕黃層制品通過Ficoll-Plaque(Pharmacia)分層離心用于分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。T細(xì)胞使用″Pan T cell Isolation Kit II-human″，(Miltenenyibiotec，Germany)從PBMCs純化。淋巴系白血病T細(xì)胞系(CCRF-CEM)從American Type Cell Culture(ATCC)獲得。所有細(xì)胞在補(bǔ)充入10％血清(Gibco)和1％Pen-Strep溶液(Cellgro)的RPMI1640介質(zhì)(Cellgro)中生長。對于核轉(zhuǎn)位研究，細(xì)胞在含0.1％血清的血清饑餓的介質(zhì)中生長。
細(xì)胞因子篩選的ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的抗體從BD Pharmingen獲得。夾心酶聯(lián)免疫分析用一些變化的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。血沉棕黃層或分離的T細(xì)胞用384孔板中含化合物和誘導(dǎo)物的(PMA/ionomycin(PI))培養(yǎng)基稀釋。板于37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)。離心后取出上清夜并轉(zhuǎn)移至含捕獲抗體的384-孔板中。捕獲抗體于4℃被涂層過夜并在加入上清夜之前抽吸。培養(yǎng)2小時(shí)后，用PBS(0.1％吐溫20)洗板，并加入檢測抗體。熒光強(qiáng)度用熒光素酶底物(Amersham)通過光度計(jì)(LJL或Wallac)測定。
轉(zhuǎn)活測定使用nucleofection(Nucleofector；AMAXA，德國)將受體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CCRF-CEM細(xì)胞。表達(dá)熒火蟲熒光素酶(Luc)的受體質(zhì)粒購自Stratagene。pNFAT-Luc含有四個(gè)NFAT結(jié)合位點(diǎn)；pGRE-Luc含有四個(gè)GRE位點(diǎn)，以及pAP1-Luc含有七個(gè)AP1結(jié)合位點(diǎn)。NFкB蟲熒光素酶受，p(IL6кB)3-50hu.IL6-luc+，含有三個(gè)NFкB位點(diǎn)并且由Dr.De Bosscher(University of Ghent，Belgium)大量贈予。將懸浮在100μL Amaxa′R′細(xì)胞系溶液中的107細(xì)胞轉(zhuǎn)移至試管中。含一定比例(10∶1)受體質(zhì)粒(熒火蟲熒光素酶)和對照質(zhì)粒(pRL-TK-Renilla)(Renilla熒光素酶)(Promega)的一μL(1μg/μL)溶液加入細(xì)胞混懸液中。用Amaxa Nucleofector使用程序T-14進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其用CCRF-CEM細(xì)胞產(chǎn)生最大效應(yīng)。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞混懸于200μL介質(zhì)中，允許恢復(fù)1小時(shí)，加入等量的含2X藥物的介質(zhì)并于37℃培養(yǎng)30min。然后再用PI刺激細(xì)胞5小時(shí)。如在Promega Luciferase檢測藥盒中每一程序測定各質(zhì)粒和對照Renilla-質(zhì)粒的熒光素酶活性。
西式吸印雜交試驗(yàn)用各種藥物在37℃預(yù)處理純化的原代人T-細(xì)胞(在1×106細(xì)胞/ml中的107T-細(xì)胞)30min，然后用PMA和伊屋諾霉素刺激30分鐘。然后將細(xì)胞質(zhì)粒并用2X蛋白質(zhì)負(fù)荷染料(Invitrogen，NP0008)提取。將所有的細(xì)胞溶菌產(chǎn)物煮沸并在負(fù)荷之前離心。每泳道10-15μL溶菌產(chǎn)物(約250000個(gè)細(xì)胞)在10-12％Tris-Bis凝膠或3-8％Tris-Acetate凝膠(從Invitrogen中預(yù)凝成決的)展開。蛋白質(zhì)使用Owl半干燥電印跡系統(tǒng)在穩(wěn)定素PVDF膜(Millipore)穩(wěn)定印跡30min。膜用4％牛奶阻斷2小時(shí)，然后用適宜的原抗體孵化，洗三次，然后用次級抗體探測。加入Chemi-glowTM(Alpha Innotech)chemilluminescent檢測溶液并顯像且使用Alpha Imager 8900(Alpha Innotech)捕獲。NFAT1使用來自BD Transduction Laboratory(#610703)的抗體顯像。IкB-α使用來自Santa Cruz Biotechnology(#sc371)的抗體顯像。細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)使用得自Cell Signaling的下列顯像ERK p44/p42(磷光體，#9101；總，#9102)、p38(磷光體，#9211，總，#9212)和JNK/SAPK(磷光體，#9251；總，#9252)。
易位測定CCRF-CEM細(xì)胞在密度為2×105細(xì)胞/ml的完整介質(zhì)(10％血清，RPMI 1640)中生長，然后在血清饑餓介質(zhì)(0.1％FBS，RPMI 1640)中過夜16小時(shí)。細(xì)胞滴入涂聚L-賴氨酸的蓋玻片(Fisher)上，并允許加上蓋玻片15分鐘。涂細(xì)胞的蓋玻片用藥物預(yù)孵化20分鐘，然后用1XPMA+伊屋諾霉素或潑尼松龍?jiān)谘屦囸I介質(zhì)中刺激1小時(shí)。用藥物加刺激劑孵化后，抽吸介質(zhì)，細(xì)胞用在PBS中的3.7％甲醛固定15分鐘。細(xì)胞用1×PBS，0.2％Triton洗三次，在″Superblock″TM(Pierce)阻斷兩次15分鐘，并用基本抗體(1∶5000稀釋)孵化30分鐘。NFAT1用得自BD Transduction Laboratory(#610703)的抗體顯像。NFкB(p65組分)用得自Santa Cruz Biotechnology(#sc-372)的抗體顯像。蓋玻片在加入標(biāo)示的次級抗體(AlexaFluor#，Molecular Probes)之前再洗三次。細(xì)胞核用DAPI(Sigma)標(biāo)記。最后，蓋玻片用PBS/Triton洗一次，并用FluoromountTM固定在載玻片上，以在Nikon熒光顯微鏡下觀察。易位至細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子用載玻片盲法評分定量。
結(jié)果阿莫沙平和帕羅西汀抑制NFAT途徑T細(xì)胞激活的結(jié)果為增加激活神經(jīng)鈣蛋白、絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的細(xì)胞內(nèi)鈣。神經(jīng)鈣蛋白反過來脫去觸發(fā)NFAT核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞質(zhì)NFAT的磷酸。在細(xì)胞核中，NFAT結(jié)合促炎癥反應(yīng)基因的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，包括促成其轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的TNFα。在我們的研究中，我們檢測了阿莫沙平和帕羅西汀在NFAT激活三個(gè)階段的效應(yīng)i)NFAT蛋白的脫磷酸，ii)NFAT易位至細(xì)胞核以及iii)依賴NFAT的轉(zhuǎn)錄的激活。
T細(xì)胞從年齡為35-55歲的男性供者的血沉棕黃層中分離。這些T細(xì)胞用PMA/伊屋諾霉素(PI)在體外激活30分鐘并且NFAT的磷酸化用西部蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移吸印技術(shù)的泳動率變動分子。在活化的T細(xì)胞中脫磷酸的NFAT隨在SDS PAGE中的大量泳動而移動，從而產(chǎn)生了帶移。結(jié)果在圖2B中顯示。正如預(yù)期的，環(huán)孢霉素A預(yù)孵化，神經(jīng)鈣蛋白的直接抑制劑阻止了3nM以下的帶移。相似地，用阿莫沙平(3μM)和帕羅西汀(輕度作用約30μM)預(yù)孵化阻止帶移。潑尼松龍直至3μM對NFAT脫磷酸作用沒有影響。觀察到阿莫沙平和帕羅西汀的帶移臨界濃度從1000-倍分離，其與在PI刺激的TNFα釋放測定中觀察到的其效能差異非常匹配。
在PI-激活的CCRF-CEM細(xì)胞中進(jìn)入細(xì)胞核中的NFAT易位通過免疫熒光跟蹤(圖2C)。再次如所預(yù)期的，環(huán)孢霉素A抑制NFAT易位，產(chǎn)生的IC50值為5nM，其與在細(xì)胞因子抑制和NFAT帶移測定中環(huán)孢霉素A的行為接近平行。阿莫沙平和帕羅西汀抑制NFAT易位，IC50分別為4μM和30μM。在本測定中潑尼松龍無活性。NFAT易位研究的所有結(jié)果與在細(xì)胞因子和西部蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移吸印技術(shù)分子中觀察到的化合物效能的等級次序一致。
最后，NFAT依賴的轉(zhuǎn)錄通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NAFT受體質(zhì)粒進(jìn)入CCRF-CEM細(xì)胞并隨后用PI激活來測定。結(jié)果在圖2A中顯示。環(huán)孢霉素A在抑制PI-刺激的NFAT轉(zhuǎn)錄是有效的，IC50為5nM，與在細(xì)胞因子、帶移和易位測定中觀察到的效應(yīng)抑制。阿莫沙平和帕羅西汀產(chǎn)生的IC50分別為2μM和9μM。潑尼松龍即使在高劑量下也不顯示較強(qiáng)的抑制作用。
阿莫沙平和帕羅西汀抑制NF-кB途徑與NFAT一樣，NFкB是激活致炎細(xì)胞因子基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。NFкB在與IкB的復(fù)合物中的細(xì)胞質(zhì)中分離。在T細(xì)胞激活上，IкB被磷酸化并降解，游離的NFкB易位至細(xì)胞核并激活炎癥相關(guān)因子。我們評估了阿莫沙平和帕羅西汀對IкB降解、NFкB易位至細(xì)胞核和依賴NFкB的轉(zhuǎn)錄激活的作用。
原代T細(xì)胞在體外用PI(30min)激活并萃取供西部蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移吸印技術(shù)分析。環(huán)孢霉素A、阿莫沙平和帕羅西汀使IкB穩(wěn)定(圖3B)，但效能不同。環(huán)孢霉素A最有效，在30nM起效。阿莫沙平和帕羅西汀的作用分別在25μM和15μM開始。此觀察結(jié)果與這些化合物在TNFα抑制檢測中觀察到的效能等次次序相反。潑尼松龍對IкB降解沒有作用。
NFкB的核轉(zhuǎn)位在激活的CCRF-CEM細(xì)胞中通過使用NFкB的p65組分抗體的免疫熒光檢測。結(jié)果在圖3C中顯示，環(huán)孢霉素A有效抑制NFкB易位的IC50為20nM。阿莫沙平和帕羅西汀有幾乎相同的抑制曲線，均發(fā)生在IC50為20μM。潑尼松龍對NFкB易位沒有作用。
依賴NFкB的轉(zhuǎn)錄通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NFкB受體質(zhì)粒進(jìn)入CCRF-CEM細(xì)胞并隨后用PI激活測定。此試驗(yàn)的結(jié)果在圖3A中描述。正如所預(yù)期的，NFкB抑制劑CAPE抑制，但是環(huán)孢霉素A達(dá)1μM在NFкB轉(zhuǎn)錄測定中幾乎沒有作用。環(huán)孢霉素A和阿莫沙平在高濃度下行為相似(IC50＝20μM)，而帕羅西汀在最高濃度30μM時(shí)達(dá)到40％抑制作用。潑尼松龍?jiān)?μM時(shí)顯示30％的抑制作用，其與報(bào)道的NFкB轉(zhuǎn)錄的糖皮質(zhì)激素反式阻抑作用一致。
阿莫沙平和帕羅西汀抑制MAP激酶途徑T細(xì)胞激活觸發(fā)多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。除NFAT和NFкB激活外，MAP激酶級聯(lián)也被激活。該級聯(lián)包括在ERK、p38和JNK激活中達(dá)到頂點(diǎn)的三個(gè)主要目標(biāo)。這些MAP激酶的一些底物包括轉(zhuǎn)錄因子，如ELK1、ERG和AP1，其反過來調(diào)節(jié)促炎癥反應(yīng)基因表達(dá)。我們展示跟蹤了在阿莫沙平或帕羅西汀存在下ERK、p38和JNK的激活。
純化的原代T細(xì)胞激活30分鐘并提取供西部蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移吸印技術(shù)分析。各MAKP激活使用在各型MAKP上調(diào)節(jié)位點(diǎn)的磷酸特異性抗體跟蹤，通過測定各MAKP種類的總量來標(biāo)準(zhǔn)化(圖4A-4C)。即使在檢測的最高劑量環(huán)孢霉素A(1μM)、潑尼松龍(3μM)、阿莫沙平(30μM)和帕羅西汀(30μM)在阻止ERK1/2磷酸化中沒有效果。相反，30nM以上的環(huán)孢霉素A，顯示一些磷酸-p38抑制作用。帕羅西汀在10μM以上顯示一些抑制磷酸-p38的作用，而阿莫沙平和潑尼松龍?jiān)趐38測定中沒有作用。當(dāng)分析JNK激活時(shí)，觀察到環(huán)孢霉素A在30nM以上抑制JNK激活。阿莫沙平和帕羅西汀在10-20μM以上顯示相似的抑制作用。潑尼松龍對JNK沒有作用。
AP1依賴的轉(zhuǎn)錄通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄AP1受體質(zhì)粒進(jìn)入CCRF-CEM細(xì)胞并隨后用PI激活(圖4D)測定。環(huán)孢霉素A至1μM時(shí)顯示幾乎沒有作用，這個(gè)水平較產(chǎn)生TNF-PI近完全抑制作用的濃度高100多倍。相反，阿莫沙平和帕羅西汀在IC50為20-30μM范圍內(nèi)顯示相似的抑制曲線，在這個(gè)水平這些藥物在細(xì)胞因子測定中有作用。潑尼松龍?jiān)?00nM時(shí)產(chǎn)生30％抑制作用，與觀察到的AP1轉(zhuǎn)錄的糖皮質(zhì)激素反式阻抑作用一致。
給藥在本發(fā)明任意方法的特別的實(shí)施方案中，化合物彼此在10天內(nèi)、彼此在5天內(nèi)、彼此在24小時(shí)內(nèi)或同時(shí)給予?；衔锟梢宰鳛橐粋€(gè)組合物一起制成制劑，或可以分別制成制劑并給藥。一個(gè)或兩個(gè)化合物可以低劑量或高劑量給予，均如此處所確定的。有希望給予患者其它化合物，如皮質(zhì)類固醇、NSAID(例如萘普生鈉、雙氯芬酸鈉、雙氯芬酸鉀、阿司匹林、舒林酸、二氟尼柳、吡羅昔康、吲哚美辛、布洛芬、萘丁美酮、三水楊酸膽堿鎂、水楊酸鈉、水楊酰水楊酸、非諾洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、甲氯滅酸鈉、美洛昔康、奧沙普秦、舒林酸和托美丁)、COX-2抑制劑(例如羅非考昔、塞來考昔、伐地考昔和lumiracoxib)或DMARD。本發(fā)明的聯(lián)合治療對于治療免疫炎性疾病特別有用，與其它抗細(xì)胞因子劑或調(diào)節(jié)確實(shí)影響疾病的免疫應(yīng)答的藥物并用，如影響細(xì)胞粘附的藥物或生物制品(即阻斷IL-6、IL-1、IL-2、IL-12、IL-15或TNFα活動的藥物(例如依那西普、adelimumab、英夫利昔單抗或CDP-870)。在本實(shí)施例中(其中有阻斷TNFα作用的藥物)，聯(lián)合治療減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，依那西普或英夫利昔單抗作用于炎性細(xì)胞因子的剩余片斷，提供了增強(qiáng)的治療。
根據(jù)本發(fā)明的治療可以單獨(dú)或與其它治療聯(lián)合進(jìn)行，并且可以在家、醫(yī)生診室、診所、醫(yī)院的門診部或醫(yī)院內(nèi)提供。治療任選在醫(yī)院開始以便醫(yī)生能密切地觀察療效并進(jìn)行任何必要的調(diào)整，或可以在門診病人基礎(chǔ)上開始。治療期間取決于被治療的疾病或功能障礙的類型、患者年齡和癥狀、患者疾病的階段和類型以及患者對治療的反應(yīng)。另外，患有具較大發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的炎性疾病的患者(例如經(jīng)歷年齡相關(guān)的激素變化的人)可以接受抑制或延緩癥狀發(fā)作的治療。
各種實(shí)施方案的給藥途徑包括，但不限于，局部的、經(jīng)皮的和全身用藥(如靜脈、肌內(nèi)、皮下、吸入、直腸、口腔含化、陰道、腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、眼內(nèi)或口服給藥)。如在此處使用的，“全身用藥”是指所有非皮膚給藥途徑，并特別除局部和經(jīng)皮給藥途徑外。
在聯(lián)合治療中，并用的各組分的劑量和給藥途徑能獨(dú)立地控制。例如，一個(gè)化合物可以每天給予3次，而第二個(gè)化合物可以每天給予1次。聯(lián)合治療可在包括休息期的服藥停藥的周期中給予，以便患者身體有機(jī)會從任何迄今無法預(yù)料的副作用恢復(fù)?；衔镆部梢员灰黄鹬瞥芍苿┮员阋淮谓o藥服用兩種化合物。
藥物組合物制劑給予本發(fā)明的組合物可以通過任何適宜的在靶向區(qū)域?qū)е乱种浦卵准?xì)胞因子水平的方法?；衔锟梢匀魏芜m宜的量被包含在任何適宜的載體物質(zhì)中，且通常以組合物總重量的1-95％(重量比)的量存在。組合物可以在適于下列給藥途徑的劑型中提供口服、胃腸外(例如靜脈、肌內(nèi))、直腸、皮膚、鼻、陰道、吸入、皮膚(貼)或眼。因此，組合物可以以下面的形式，例如，片劑、膠囊、丸劑、粉劑、顆粒、混懸液、乳劑、溶液、包括水凝膠的凝膠、糊劑、軟膏劑、乳膏劑、硬膏劑、灌服劑、滲透性輸送裝置、栓劑、灌腸劑、注射劑、埋植劑、噴霧劑或氣霧劑。藥物組合物可以根據(jù)常規(guī)的制劑技術(shù)(見，例如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，20th edition，2000，ed.A.R.Gennaro，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrickand J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，New York)制成制劑。
并用的各化合物可以用本領(lǐng)域內(nèi)的眾所周知的的方法制成制劑。例如，第一個(gè)藥物(增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物)和第二個(gè)藥物(即減少一種或多種NFкB、NFAT、AP-1或Elk-1途徑信號活動的非類固醇類藥物)可以一起或分別制成制劑。希望地，為同時(shí)或幾乎同時(shí)給予藥物，第一種和第二種藥物一起制成制劑。這種共同制成制劑的組合物可包括在同一丸劑、膠囊、液體等中一起制成制劑的兩種藥物。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)指的是這種并用的制劑時(shí)，使用的制劑技術(shù)對于并用的各個(gè)藥物制劑以及本發(fā)明的其它聯(lián)用也是有用的。通過不同藥物使用的不同的制劑策略，各藥物的藥代動力學(xué)類型能適當(dāng)匹配。
各個(gè)或個(gè)別地制成制劑的藥物可以一個(gè)藥盒包裝在一起。非限制性實(shí)例包括藥盒，其含有，例如，2個(gè)丸劑、1個(gè)丸劑和1包粉劑、一枚栓劑和一瓶液體、兩管局部用乳膏等。藥盒能包括有助于給予患者單位劑量的任選的組件，例如重組粉劑的小瓶、注射器定制的IV輸送裝置、吸入器等。另外，單位劑量藥盒可能含有制備和給予組合物的說明書。藥盒可以以一位患者一次使用的單位劑量，特殊患者多次使用量(常用劑量或各個(gè)化合物隨治療進(jìn)程在效能中變化)制造；或者藥盒可含有適于給予多位患者的多重劑量(“散裝”)。藥盒組件可裝配在紙盒、泡罩包裝，瓶子、管子等中。
劑量通常，當(dāng)給予人類時(shí)，降低一種或多種NFкB、NFAT、AP-1或Elk-1途徑信號活動的非類固醇類藥物的劑量取決于藥物的性質(zhì)，并且由本領(lǐng)域內(nèi)的的技術(shù)人員很容易確定。通常，這些劑量正常地為約每天0.001mg-2000mg，希望地為每天約1mg-1000mg，且更希望地為每天約5mg-500mg。每天劑量至200mg是必需的。
當(dāng)人類全身給藥時(shí)，在本發(fā)明聯(lián)用中使用的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物劑量正常地為每天約0.1mg-1500mg，希望地為每天約0.5mg-10mg，且更希望地為每天約0.5mg-5mg。
在聯(lián)用中各藥物的給予能獨(dú)立地一日1-4次至一年，并且患者甚至可以終身使用。慢性長期給藥將在許多病例中指出。
另外的應(yīng)用本發(fā)明的化合物可在免疫調(diào)制或機(jī)械學(xué)的測定法中使用，該測定法使用本領(lǐng)域內(nèi)的通常都知道的測定法，在此處所述的實(shí)施例，測定其它聯(lián)用或單一藥物在抑制致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中是否與所述的聯(lián)用同樣有效。例如，候選化合物可以和增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物或降低一種或多種NFкB、NFAT、AP-1或Elk-1途徑信號活動的非類固醇類藥物聯(lián)用，并用于刺激PBMCs。適宜的時(shí)間后，檢查細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或其它適宜的免疫應(yīng)答。聯(lián)用的相對效應(yīng)彼此比較，和與單一藥物比較，并確定有效的化合物和聯(lián)用。
本發(fā)明的聯(lián)用在闡述關(guān)于涉及炎癥的生物途徑的機(jī)械學(xué)信息中也是有用的工具。這些信息能導(dǎo)致抑制由致炎細(xì)胞因子引起的炎癥的新聯(lián)用或單一藥物的開發(fā)。本領(lǐng)域內(nèi)的已知的用于測定生物學(xué)途徑的方法能用于測定通過與本發(fā)明的化合物接觸的細(xì)胞刺激以產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子影響的途徑或網(wǎng)絡(luò)路徑。這些方法能包括，與未處理的、陽性或陰性對照化合物和/或新的單一藥物和組合物相比較，分析與本發(fā)明的化合物接觸后被表達(dá)或抑制的細(xì)胞成分，或分析一些細(xì)胞其它的代謝物的活性如酶活性、營養(yǎng)素?cái)z取和增殖。分析的細(xì)胞內(nèi)組分可能包括基因轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)表達(dá)。適宜的方法可能包括標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)技術(shù)，放射標(biāo)記本發(fā)明的化合物(例如14C或3H標(biāo)記)，并觀察與蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物，例如使用2d凝膠劑、基因表達(dá)輪廓。一旦確證，這些化合物可能在體內(nèi)模型使用以進(jìn)一步驗(yàn)證此工具或開發(fā)新的抗炎藥物。
其它實(shí)施方案在本說明書中的所有公布內(nèi)容、專利申請書和提及的專利在此引入作為參考。
本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的各種修改和變更對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是顯然的，沒有脫離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明已在相聯(lián)系的特別預(yù)期的實(shí)施方案中敘述，但是應(yīng)該理解，如申請專利的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)乇幌拗圃谏鲜鎏厥獾貙?shí)施方案中。實(shí)際上，執(zhí)行本發(fā)明的預(yù)期模式的各種修改，對于醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是明顯的，都意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含(a)一種藥物，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動；和(b)一種非類固醇類藥物，調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答，其中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和所說的非類固醇類藥物存在的量為當(dāng)給予哺乳動物時(shí)，足以減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的非類固醇類藥物調(diào)節(jié)兩種或更多種信號途徑的信號活動。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述的非類固醇類藥物調(diào)節(jié)三種或更多種信號途徑的信號活動。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的致炎細(xì)胞因子是TNF-α。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物在所說的組合物中以低劑量存在。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中所說的非類固醇類藥物是一種增強(qiáng)或降低信號分子表達(dá)水平或生物學(xué)活性的藥物以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所說的非類固醇類藥物是NF-κB途徑抑制劑、NFAT途徑抑制劑、AP-1途徑抑制劑或Elk-1途徑抑制劑。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的非類固醇類藥物是反義化合物或RNAi化合物，其降低信號分子的表達(dá)水平以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的非類固醇類藥物是信號分子的顯性負(fù)相或編碼所說顯性負(fù)相的表達(dá)型載體以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。
10.權(quán)利要求1的化合物，其中所說的非類固醇類藥物是結(jié)合信號分子并降低所說信號分子生物學(xué)活性的抗體以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。
11.權(quán)利要求6或10的組合物，其中所說的生物學(xué)活性是酶活性、磷酸化狀態(tài)或結(jié)合活性。
12.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含另外的治療的化合物。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中所說的另外的治療的化合物選自NSAID、小分子免疫調(diào)節(jié)劑、COX-2抑制劑、DMARD、生物制品、黃嘌呤、抗膽堿能化合物、β受體激動劑、支氣管擴(kuò)張藥、非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑、維生素D類似物、補(bǔ)骨脂素、維甲酸類和5-氨基水楊酸。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的NSAID是布洛芬、雙氯芬酸或萘普生。
15.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的COX-2抑制劑是羅非考昔、塞來考昔、伐地考昔和lumiracoxib。
16.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的生物制品是adelimumab、依那西普或英夫利昔單抗。
17.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的DMARD是甲氨蝶呤或來氟米特。
18.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的黃嘌呤是膽茶堿。
19.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的抗膽堿能化合物是異丙托銨或噻托銨。
20.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的β受體激動劑硫酸異丁特羅、甲磺酸比托特羅、腎上腺素、富馬酸福莫特羅、異丙腎上腺素、鹽酸左異丁特羅、硫酸間羥異丙腎上腺素、醋酸吡布特羅、沙美特羅昔萘酸酯或特布他林。
21.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑是環(huán)孢霉素A、他克莫司、吡美莫司或ISAtx247。
22.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的維生素D類似物是卡泊三烯或卡泊三醇。
23.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的補(bǔ)骨脂素是甲氧沙林。
24.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的維甲酸類是阿昔曲丁或tazoretene。
25.權(quán)利要求13的組合物，其中所說的5-氨基水楊酸是美沙拉秦、柳氮磺吡啶、巴柳氮二鈉和奧柳氮鈉。
26.權(quán)利要求1-25任意一項(xiàng)的組合物，其中所說的組合物制成用于局部給予。
27.權(quán)利要求1-25任意一項(xiàng)的組合物，其中所說的組合物制成用于全身給藥。
28.一種治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病的方法，所說的方法包含給予哺乳動物聯(lián)用(a)一種藥物，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動；和(b)一種非類固醇類藥物，調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答，其中第一種和第二種藥物同時(shí)給予或在彼此給藥28天之內(nèi)給予，其量一起足以治療、預(yù)防或減輕所說的免疫炎性疾病。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所說的非類固醇類藥物調(diào)節(jié)兩種或更多種信號途徑的信號活動。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所說的非類固醇類藥物調(diào)節(jié)三種或更多種信號途徑的信號活動。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所說的聯(lián)用減少致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所說的致炎細(xì)胞因子是TNF-α。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物在所說的組合物中以低劑量存在。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所說的非類固醇類藥物是一種增強(qiáng)或降低信號分子表達(dá)水平或生物學(xué)活性的藥物以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所說的非類固醇類藥物是NF-κB途徑抑制劑、NFAT途徑抑制劑、AP-1途徑抑制劑或Elk-1途徑抑制劑。
36.權(quán)利要求28的方法，其中所說的非類固醇類藥物是反義化合物或RNAi化合物，其降低信號分子的表達(dá)水平以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。
37.權(quán)利要求28的方法，其中所說的非類固醇類藥物是信號分子的顯性負(fù)相或編碼所說顯性負(fù)相的表達(dá)型載體以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑。
38.權(quán)利要求28的方法，其中所說的非類固醇類藥物是結(jié)合信號分子并降低所說信號分子生物學(xué)活性的抗體以便調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、所說的NFAT途徑、所說的AP-1途徑或所說的Elk-1途徑。
39.權(quán)利要求34或38的方法，其中所說的生物活性是酶活性、磷酸化狀態(tài)或結(jié)合活性。
40.權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包含給予所說的哺乳動物另外的治療的化合物。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所說的另外的治療的化合物選自NSAID、小分子免疫調(diào)節(jié)劑、COX-2抑制劑、DMARD、生物制品、黃嘌呤、抗膽堿能化合物、β受體激動劑、支氣管擴(kuò)張藥、非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑、維生素D類似物、補(bǔ)骨脂素、維甲酸類和5-氨基水楊酸。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所說的NSAID是布洛芬、雙氯芬酸或萘普生。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所說的COX-2抑制劑是羅非考昔、塞來考昔、伐地考昔和lumiracoxib。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所說的生物制品是adelimumab、依那西普或英夫利昔單抗。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所說的DMARD是甲氨蝶呤或來氟米特。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所說的黃嘌呤是膽茶堿。
47.權(quán)利要求41的方法，其中所說的抗膽堿能化合物是異丙托銨或噻托銨。
48.權(quán)利要求41的方法，其中所說的β受體激動劑硫酸異丁特羅、甲磺酸比托特羅、腎上腺素、富馬酸福莫特羅、異丙腎上腺素、鹽酸左異丁特羅、硫酸間羥異丙腎上腺素、醋酸吡布特羅、沙美特羅昔萘酸酯或特布他林。
49.權(quán)利要求41的方法，其中所說的非類固醇類神經(jīng)鈣蛋白抑制劑是環(huán)孢霉素A、他克莫司、吡美莫司ISAtx247。
50.權(quán)利要求41的方法，其中所說的維生素D類似物是卡泊三烯或卡泊三醇。
51.權(quán)利要求41的方法，其中所說的補(bǔ)骨脂素是甲氧沙林。
52.權(quán)利要求41的方法，其中所說的維甲酸類是阿昔曲丁或tazoretene。
53.權(quán)利要求41的方法，其中所說的5-氨基水楊酸是美沙拉秦、柳氮磺吡啶、巴柳氮二鈉和奧柳氮鈉。
54.權(quán)利要求28-53的方法，其中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和所說的非類固醇類藥物是在彼此給藥的14天內(nèi)給予。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和所說的非類固醇類藥物是在彼此給藥的7天內(nèi)給予。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和所說的非類固醇類藥物是在彼此給藥的1天內(nèi)給予。
57.權(quán)利要求28-56任意一項(xiàng)的方法，其中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物、所說的非類固醇類藥物或二者都局部或全身給予。
58.一種減少炎癥細(xì)胞中致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生的方法，包含炎癥細(xì)胞與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和非類固醇類藥物接觸，后者調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答。
59.一種鑒別可以用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病的聯(lián)用的方法，所說的方法包含步驟(a)炎癥細(xì)胞在體外與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和候選化合物接觸；和(b)相對于在與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與候選化合物接觸的細(xì)胞中致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，測定所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和所說的候選化合物聯(lián)用是否在所說的細(xì)胞中減少致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，其中致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少說明該聯(lián)用用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的聯(lián)用。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所說的細(xì)胞是T細(xì)胞。
61.一種鑒別用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病的候選化合物的方法，所說的方法包含步驟(a)提供已減少糖皮質(zhì)激素受體信號活動的炎癥細(xì)胞；(b)所說的細(xì)胞與候選化合物接觸；和(c)相對于未與所說的候選化合物接觸的細(xì)胞，測定所說的候選化合物在所說的細(xì)胞中是否減少細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少說明該候選化合物用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的化合物。
62.一種鑒定可用于治療免疫炎性疾病的聯(lián)用的方法，所說的方法包含步驟(a)炎癥細(xì)胞在體外與增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和候選化合物接觸；和(b)相對于從與所說的糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與所說的候選化合物接觸的細(xì)胞中細(xì)胞因子的釋放或產(chǎn)生，測定在所說的炎癥細(xì)胞中所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體化合物信號活動的藥物和所說的候選化合物是否減少細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少說明該聯(lián)用用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的聯(lián)用。
63.一種鑒定可用于治療、預(yù)防或減少炎性疾病的化合物的方法，所說的方法包含步驟(a)提供設(shè)計(jì)的已調(diào)節(jié)選自以下途徑的一種或多種信號途徑的信號活動的炎癥細(xì)胞NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑；(b)所說的細(xì)胞與候選化合物接觸；和(c)相對于未與所說的候選化合物接觸的細(xì)胞，測定候選化合物是否減少致炎細(xì)胞因子在所說的細(xì)胞中釋放或產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生減少說明所說的候選化合物用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的化合物。
64.一種鑒定可用于治療、預(yù)防或減少炎性疾病的聯(lián)用的方法，所說的方法包含步驟(a)鑒定調(diào)節(jié)選自以下途徑的一種或多種信號途徑的信號活動的化合物NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答；(b)炎癥細(xì)胞在體外與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和在步驟(a)中鑒定的化合物接觸；和(c)相對于與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與在步驟(a)中鑒定的化合物接觸或與在步驟(a)中鑒定的化合物接觸而未與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸的細(xì)胞，測定所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和在步驟(a)中鑒定的化合物聯(lián)用在所說的細(xì)胞中是否減少致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生的減少說明該聯(lián)用用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病是有用的聯(lián)用。
65.一種鑒定可用于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性疾病的聯(lián)用的方法，所說的方法包含步驟(a)鑒定調(diào)節(jié)選自以下途徑的一種或多種信號途徑的信號活動的化合物NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答；(b)炎癥細(xì)胞在體外與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和在步驟(a)中鑒定的化合物接觸；和(c)相對于在與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸而未與在步驟(a)中鑒定的化合物接觸或與在步驟(a)中鑒定的化合物接觸而未與所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物接觸的細(xì)胞中的細(xì)胞因子的釋放或產(chǎn)生，測定所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和所說的在步驟(a)中鑒定的化合物聯(lián)用在所說的細(xì)胞中是否減少致炎細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子釋放或產(chǎn)生的減少說明該聯(lián)用對于治療、預(yù)防或減輕免疫炎性癥狀是有用的。
66.一種藥盒，包含(i)一種組合物，包含(a)一種藥物，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動；和(b)一種非類固醇類藥物，調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答；以及(ii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者所說的組合物的說明書。
67.一種藥盒，包含(i)一種藥物，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動；(ii)一種非類固醇類藥物，調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答；(iii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和所說的非類固醇類藥物的說明書。
68.一種藥盒，包含(i)一種藥物，增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動；(ii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者所說的增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物和非類固醇類的說明書，后者調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答。
69.一種藥盒，包含(i)一種非類固醇類藥物，調(diào)節(jié)選自下列信號途徑的一種或多種途徑的信號活動NF-κB途徑、NFAT途徑、AP-1途徑和Elk-1途徑，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生或任何其它炎癥應(yīng)答；和(ii)給予診斷為免疫炎性疾病的患者所說的藥物和增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體信號活動的藥物的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫炎性疾病的治療、預(yù)防和減輕，包括增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體(例如糖皮質(zhì)激素受體激動劑)信號活動的藥物和調(diào)節(jié)一種或多種選自NF－κB途徑、NFAT途徑、AP－1途徑和Elk－1途徑的信號途徑的信號活動的藥物聯(lián)用，以便減少致炎細(xì)胞因子分泌或產(chǎn)生，或任意其它炎癥應(yīng)答。進(jìn)一步地，為鑒別候選化合物和用于治療、預(yù)防或減輕這些癥狀的策略提供篩選方法。
文檔編號A61K31/192GK1980649SQ200580023004
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者P·馬尼瓦薩坎, E·R·喬斯特-普賴斯, J·斯陶恩頓, C·凱思 申請人:康賓納特克斯公司