專利名稱：新型半乳凝素8變體蛋白質以及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型半乳凝素8變體(突變體)蛋白質以及其用途。本發(fā)明特別是涉及連接區(qū)域被改變的半乳凝素8以及利用它的生化學、臨床檢查、醫(yī)療以及醫(yī)藥應用技術。
背景技術：
逐漸有證據發(fā)現(xiàn)特定的糖鏈和與其結合的蛋白質在哺乳動物的生體中在生理現(xiàn)象以及伴隨進化和成長的現(xiàn)象、以及各種各樣的病等方面發(fā)揮多種多樣的作用和功能。發(fā)現(xiàn)生體中存在特異性識別具有β-半乳糖苷結構的糖鏈的動物凝集素，作為這樣的凝集素類的一組-半乳凝素，迄今為止在哺乳動物種鑒定了至少14種的基因。半乳凝素家族按照其結構分為3個亞組，即、原型(prototype)、嵌合型(chimera)、和串連重復型(tandem repeat)，但是它們在生體內的功能幾乎不被人知道。特別是，對于具有2個糖鏈識別區(qū)域的串連重復型半乳凝素，研究的歷史也淺，還不清楚作為其標的的生體內的糖鏈(受體)，因此其功能也不清楚。但是，從探索識別細胞表面的復雜的糖鏈的蛋白質發(fā)現(xiàn)半乳凝素等這些細節(jié)，預測它們具有參與細胞的粘附、細胞間的信息傳導、細胞的活性化等功能，因此引起了人們的關注。此外，除了這些功能之外，還連續(xù)地獲得了預料有其它重要的種種功能這樣的研究成果。
串連重復型半乳凝素之一的半乳凝素8(galectin-8Gal-8)是在使用對胰島素受體基質的抗體的λZAP的表達文庫的篩選的過程中偶然發(fā)現(xiàn)的，克隆后得到的物質(非專利文獻1)，從大鼠肝臟的cDNA文庫克隆的，但是編碼人半乳凝素-8的cDNA是從人腦海馬的cDNA文庫以大鼠全長cDNA為探針而分離的(非專利文獻2GenBank/EMBLaccession no.X91790)。通過之后的研究，發(fā)現(xiàn)Gal-8比半乳凝素-4，-6，-9以及-12等的其它的串連重復型半乳凝素類，分布在更廣泛的范圍的哺乳動物的組織(例如，肝臟、心臟、肌肉、腎臟、腦等)中。Gal-8顯示了強力的血細胞凝集活性，與乳糖基?；?瓊脂糖結合。Gal-8的N-末端側CRD以及C-末端側CRD具有大約4 0％的氨基酸同源性。關于其生物學功能，Gal-8阻礙人癌細胞與被覆整聯(lián)蛋白的板粘合，誘導該細胞的凋亡(非專利文獻3)。Gal-8也顯示出對結腸癌的移動有影響(非專利文獻4)。有報道Gal-8mRNA在肺內表達高，但其表達量較少，也有報道其在肝、腎、脾、后腳、心肌等的各組織也表達。此外，還有報道其顯示了與作為人前列腺癌抗原的PCTA-1在蛋白質水平上高的同源性。
炎癥是導致白細胞或血漿中的分子群向感染巢和組織損傷部位等流入的反應。炎癥反應中有三個重要的要素。(1)炎癥巢中的血流的增加、(2)由于血管內皮細胞的收縮導致毛細血管透過性的亢進(由此，與通常不同的高分子游離于血管外，此外，免疫反應的可溶性分子群移動到炎癥的局部)、(3)向白細胞的血管外的游走和向周圍組織的浸潤(炎癥的初期時，多形核白細胞〔主要是嗜中性細胞〕最多，后半時單核細胞和淋巴細胞移動到炎癥的局部)。嗜中性細胞向炎癥部位的浸潤經過幾個獨立的過程進展。第一步驟與選擇蛋白(selectins)有關，引起嗜中性細胞向血管內皮細胞的弱粘合和嗜中性細胞跨過血管內皮細胞上。第二步驟中，通過趨化因子(chemoattractant)和整聯(lián)蛋白(integrins)的作用，嗜中性細胞與血管內皮細胞之間的粘合增強，嗜中性細胞停止在內皮細胞上。然后，嗜中性細胞通過內皮細胞的間隙，浸潤到組織內。該過程也與趨化因子和整聯(lián)蛋白有關。
嗜中性細胞與血管內皮細胞的強粘合通過整聯(lián)蛋白αLβ2(與淋巴細胞功能相關的抗原-1，Lymphocyte Function-AssociatedAntigen-1；LFA-1)、整聯(lián)蛋白αMβ2(巨噬細胞受體1，macrophagereceptor 1；Mac-1)、整聯(lián)蛋白αXβ2(p150/95)等的整聯(lián)蛋白(主要是LFA-1和Mac-1)和存在于內皮細胞表面的分子(配體/受體)的相互作用引起的。已知LFA-1與ICAM-1和ICAM-2結合，Mac-1與ICAM-1結合。已知整聯(lián)蛋白通常對配體不具有親合性，或者以顯示低親合性的惰性型存在，通過來自細胞內外的刺激變成具有高親合性的活性型(由立體結構的變化引起可逆性的活性化)。在對整聯(lián)蛋白的細胞外區(qū)域的單克隆抗體中，也引起該活性化，但是在體內的活性化的機理還不清楚。
嗜中性細胞本來對生體防御起到重要的作用。嗜中性細胞由于貪食作用，在對侵入的微生物破壞以及炎癥部位的修復的同時，放出具有強力的殺菌作用的酸、酶、活性氧等。但是，這些傷害性因子由于不具有抗體那樣的標的特異性，可能傷害到周邊的正常組織，所以生體具備限制這樣的反應的機構。該控制機構發(fā)生紊亂的話，嗜中性細胞產生的傷害性因子引起組織傷害。作為與嗜中性細胞有關的疾病，已知有種種慢性炎癥性疾病(貝切特疾病、克羅恩病等)、缺血再灌注障害、嗜中性細胞性皮膚癥(斯威特綜合癥等)、全身性炎癥反應綜合癥(SIRS)等。
這些嗜中性細胞向炎癥部位浸潤的最初步驟如果認為是與血管內皮細胞的相互作用，則期待通過控制把該階段阻礙等，抑制嗜中性細胞的過剩的作用等。特別是，在能預料心肌梗塞的治療時等嗜中性細胞引起的傷害發(fā)生的情況下，期待開發(fā)可以預防上使用的藥劑等。嗜中性細胞與血管內皮細胞的相互作用的步驟(+傷害性因子放出)中的異常也可能有嗜中性細胞的過剩作用的原因。進一步，如果特定該嗜中性細胞的過剩作用的原因，就能對診斷、治療的精密化有貢獻。從理解以炎癥為代表的種種生理的現(xiàn)象、控制炎癥等伴隨的病的狀態(tài)方面，來闡明嗜中性細胞所獲得的對控制內皮細胞的調控粘合性能的機理是重要的。由于控制嗜中性細胞的粘合性能對開發(fā)醫(yī)藥品、診斷藥、篩選法、診斷法等是有利的，所以要求闡明其機理。
最近，本發(fā)明人小組發(fā)現(xiàn)了人半乳凝素-8具有強力的嗜中性細胞粘合誘導能力，Gal-8的C末端CRD與整聯(lián)蛋白αM結合，另一方面半乳凝素-8的N末端CRD與proMMP-9結合，進一步，活化了proMMP-9，促進活性型MMP-9產生，此外發(fā)現(xiàn)了半乳凝素-8的C末端CRD例如具有促進嗜中性細胞等中的超氧化物產生的活性，這可以通過乳糖等的糖類似物進行阻礙等，本發(fā)明人小組為了研究■解析■測定、診斷、預防、治療例如半乳凝素-8和嗜中性細胞的相互作用(半乳凝素-8與整聯(lián)蛋白αM的相互作用，以及半乳凝素-8和proMMP-9的相互作用、包括proMMP-9的活性化)有關聯(lián)的應答■癥狀■疾病等，提供了種種試藥、方法等的技術(專利文獻1)。
專利文獻1特開2003-246749非專利文獻1Hadari et al.，J.Biol.Chem.，2703447-3453(1995)非專利文獻2 Hadari et al.，Trends in Glycoscience andGlycotechnology，Vol.9，No.45，pp.103-112(1997)非專利文獻3Hadari et al.，J.Cell Sci.，1132385-2397(2000)非專利文獻4N.Nagym et al.，Gut，50392-401(2002)發(fā)明內容通過利用這樣的半乳凝素8的多方面的作用，闡明了與癌治療、嗜中性細胞有關的疾病、生理作用和生物活性作用，由于經過糖鏈結合性等的糖鏈識別產生的細胞的粘合、細胞間的信息傳導、細胞的活性化等、此外還包括向腫瘤細胞的轉移。浸潤等有關的種種生體內功能和生物活性，期待治療各種疾病等。但是，重組體半乳凝素8具有的連接二個CRD的連接區(qū)域對蛋白酶的感受性高，相當容易地被酶消化，從而上述活性失活。
本發(fā)明人等進行了深入研究，結果，通過探索半乳凝素8所有的保持糖鏈識別活性且對蛋白酶更穩(wěn)定的分子結構，改變連接半乳凝素8的二個CRD的連接區(qū)域，成功地得到了避開了對上述活性的不良影響、提高穩(wěn)定性的改性分子，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供以下的發(fā)明。
(1)蛋白質或其鹽，其特征在于，半乳凝素8或者具有基本上與半乳凝素8同等活性的蛋白質的、連接肽或者其附近區(qū)域被改變。
(2)上述(1)所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，改變是由對半乳凝素8或者基本上與其具有同等的活性的蛋白質的、連接肽或者其附近區(qū)域的氨基酸序列中的1個或者其以上的氨基酸進行缺失、取代或添加的氨基酸序列構成，與半乳凝素8相比，至少改變對連接肽的分解感受性。
(3)上述(1)或者(2)所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，具有基本上與半乳凝素8同等的活性的蛋白質是與半乳凝素8的氨基酸序列至少具有70％的同源性。
(4)上述(1)～(3)的任一項所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，(1)半乳凝素8的N末端側的糖鏈識別區(qū)域(NCRD)或者具有與其基本上同等活性的多肽，和(2)半乳凝素8的C末端側的糖鏈識別區(qū)域(CCRD)或者與其基本上具有同等活性的多肽，通過(3)對半乳凝素8的連接肽的氨基酸序列中1個或者其以上的氨基酸進行缺失、取代或者添加的氨基酸序列構成的改變連接肽而結合。
(5)上述(1)～(4)的任一項所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，(1)具有序列編號3表示的氨基酸序列的多肽、或者具有基本上與其同等的活性且與序列編號3表示的氨基酸序列至少有70％的同源性的氨基酸序列的多肽、或者具有對序列編號3表示的氨基酸序列中至少1～8個的氨基酸殘基進行了缺失、取代或添加的氨基酸序列的多肽，和(2)具有序列編號4表示的氨基酸序列的多肽、或者具有基本上與其有同等的活性且與序列編號4表示的氨基酸序列至少有70％的同源性的氨基酸序列的多肽、或者具有對序列編號4表示的氨基酸序列中的至少1～21個的氨基酸殘基進行了缺失、取代或添加的氨基酸序列的多肽，通過(3)序列編號9或者10表示的氨基酸序列中對1個或者其以上的氨基酸進行了缺失(其中，不包括序列編號10中29～70位的序列的缺失)、取代或添加的氨基酸序列構成的改變連接肽而結合。
(6)核酸，其特征在于，具有編碼上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質的堿基序列。
(7)上述(6)所述的核酸，其特征在于，是多核苷酸。
(8)上述(6)或者(7)所述的核酸，其特征在于，是DNA或者RNA。
(9)重組體載體，其特征在于，含有上述(6)～(8)的任一項所述的核酸。
(10)上述(9)所述的重組體載體，其特征在于，除了含有上述(6)～(8)的任一項所述的核酸以外，還含有編碼標識蛋白質以及/或者肽的堿基序列。
(11)轉化體，其特征在于，載有上述(6)～(8)的任一項所述的核酸或者上述(9)或者(10)所述的重組體載體。
(12)上述(11)所述的轉化體，其特征在于，轉化體宿主細胞是原核細胞或者真核細胞。
(13)醫(yī)藥，其特征在于，含有作為有效成分的選自上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質、上述(6)～(8)的任一項所述的核酸、上述(9)或者(10)所述的重組體載體以及上述(11)或者(12)所述的轉化體的物質。
(14)上述(13)所述的醫(yī)藥，其特征在于，是免疫調節(jié)劑、抗炎癥劑或者內毒素休克抑制劑。
(15)上述(13)所述的醫(yī)藥，其特征在于，是抗腫瘤藥或者抗腫瘤轉移劑。
(16)上述(13)所述的醫(yī)藥，其特征在于，是利用選自(1)血細胞凝集活性、(2)凋亡誘導活性、(3)細胞粘附誘導活性、(4)整聯(lián)蛋白αM結合活性、(5)proMMP-9結合活性、proMMP-9活性化作用、或者活性型MMP-9產生促進活性、(6)超氧化物產生促進活性、(7)LPS誘導的炎癥的抑制活性、(8)LPS誘導的抑制TNF-α、IL-12、以及/或者IFN-γ產生的活性、以及(9)內毒素休克抑制活性中的活性進行治療或者預防病理狀態(tài)或者疾病的藥劑。
(17)分析或者檢查試藥或者試劑盒，其特征在于，含有作為有效成分的選自上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質、上述(6)～(8)的任一項所述的核酸、上述(9)或者(10)所述的重組體載體以及上述(11)或者(12)所述的轉化體的物質。
(18)嗜中性細胞粘合誘導劑，其特征在于，含有作為有效成分的上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質、上述(6)～(8)的任一項所述的核酸、上述(9)或者(10)所述的重組體載體以及上述(11)或者(12)所述的轉化體的物質。
(19)上述〔18〕所述的藥劑，誘導嗜中性細胞與選自血管內皮細胞、間質細胞、上皮細胞以及人工基質的粘合。
(20)嗜中性細胞粘合抑制劑的篩選法，其特征在于，在上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質的存在下，使試驗試料與嗜中性細胞接觸，測定嗜中性細胞粘合性能。
(21)proMMP-9(酶原型MMP-9)活性化抑制劑的篩選法，其特征在于，在上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質的存在下，使試驗試料與proMMP-9接觸，測定MMP-9。
(22)嗜中性細胞超氧化物產生抑制劑的篩選法，其特征在于，在上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質的存在下，使試驗試料與嗜中性細胞接觸，測定嗜中性細胞的超氧化物產生能力。
(23)半乳凝素-8抑制劑的篩選法，其特征在于，在試驗試料的存在下，使上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質與整聯(lián)蛋白αM接觸，測定由該蛋白質與整聯(lián)蛋白αM的相互作用所引起的生物學活性。
(24)利用對上述(1)～(5)的任一項所述的蛋白質的結合親合性的物質的分離以及/或者檢測法。
(25)上述(24)所述的分離以及/或者檢測法，其特征在于，物質是選自含有糖鏈的化合物、整聯(lián)蛋白αM、proMMP-9以及嗜中性細胞中的物質。
發(fā)明效果從半乳凝素8得到的半乳凝素8變體與野生型相比，對蛋白酶穩(wěn)定，所以能利用在闡明半乳凝素8所具有的在生體內的功能，可以應用在研究腫瘤化細胞的調控、免疫調節(jié)、進一步變態(tài)和炎癥的控制、以及LPS誘導的炎癥抑制、內毒素休克抑制(包括致死性的抑制作用)等種種生體反應的調控和調節(jié)中所發(fā)揮的半乳凝素8的功能和活性。另外，該半乳凝素8變體以及與其關聯(lián)的物質期望作為臨床應用、分子生物學的應用、生化學應用、醫(yī)學的應用中的試藥以及活性劑。
本發(fā)明的其它的目的、特征、優(yōu)點以及其所具有的觀點根據以下的記載，從業(yè)者就明白。但是，包括以下的記載以及具體的實施例等的記載的本件說明書的記載是表示本發(fā)明的優(yōu)選方式，希望理解成只是用于說明所例舉的。在本說明書中公開的本發(fā)明的意圖以及范圍內作種種的變化以及/或者改變(或者修飾)，根據以下的記載以及本說明書的其它的部分的知識，對從業(yè)者是容易理解的。本說明書中引用的全部的專利文獻以及參考文獻是為了說明的目的所引用的，這些應該解釋為作為本說明書的一部分，其內容包含在此。
附圖的簡單說明

圖1表示半乳凝素8變體(G8NC(null))表達載體的構建方法。
圖2表示半乳凝素8變體(G8NC(null))的氨基酸序列。
圖3表示半乳凝素8變體(G8NC(null))表達物以及精制處理物的電泳照片。
圖4表示在野生型半乳凝素8(G8(M))和半乳凝素8變體(G8NC(null))中，對蛋白酶的耐性進行比較的結果。左側的圖表示對彈性蛋白酶(elastase)的耐性考察的結果，右側的圖表示對胰蛋白酶(trypsin)的耐性考察的結果。圖表示電泳照片。
圖5表示野生型半乳凝素8(G9(M))與半乳凝素8變體(G8NC(null))之間比較生物活性的結果。是考察末梢血嗜中性細胞粘附誘導活性的結果。
圖6是考察內毒素投給小鼠中半乳凝素8變體(計為“G8”)的效果的結果(血清樣品中的TNF-α量)。
圖7是考察內毒素投給小鼠中半乳凝素8變體(表述為“G8”)的效果的結果(血清樣品中的IL-12(p70)量)。
圖8是內毒素投給小鼠中半乳凝素8變體(計為“G8”)的效果的結果(血清樣品中的IFN-γ量)。
具體實施例方式
本說明書中所述的發(fā)明參考之前發(fā)表的研究以及申請中的專利申請、例如，專利申請2002-46478(特開2003-246749號公報)、專利申請2003-9173，其內容含在本說明書公開的內容中。
所謂的“半乳凝素8變體”，是指這樣的一種物質，其提供對保持有半乳凝素8的糖鏈識別部位的特定的糖鏈，特異性結合的這樣的活性或者與其類似的活性(本活性中，可以包括定性的活性以及/或者定量的活性)。半乳凝素8具有血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等的細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、對特定的細胞的凋亡誘導活性等，本半乳凝素8變體可以是具有野生型半乳凝素8所具有的該活性中的一種或者與其類似的活性的半乳凝素8變體，也可以是半乳凝素8所具有的生物活性被改變或者修飾了的半乳凝素8變體，這在某些場合下優(yōu)選。本發(fā)明中特優(yōu)選的半乳凝素8變體，是指作為具有生物活性的試藥在臨床檢查的領域、分析的領域、或者醫(yī)學或醫(yī)藥等的領域中顯示至少一個比野生型半乳凝素8好的性質的半乳凝素8變體。
半乳凝素8變體包含例如，半乳凝素8或者具有與其基本上同等活性的蛋白質的、連接肽或者其附近區(qū)域被改變了的蛋白質或其鹽、半乳凝素8或者具有與其基本上同等活性的蛋白質的、連接肽或者其附近區(qū)域的氨基酸序列中1個或者其以上的氨基酸被缺失、取代或添加了的氨基酸序列，與半乳凝素8相比，至少對連接肽的分解感受性被改性了的實施改變的蛋白質或其鹽、可以是具有與半乳凝素8基本上同等的活性的蛋白質、且與半乳凝素8的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性、或者至少75％以上的同源性、或者至少80％以上的同源性、或者至少85％以上的同源性、或者至少90％以上的同源性、或者至少95％以上的同源性的蛋白質或其鹽、也可以是使(1)半乳凝素8的N末端側的糖鏈識別區(qū)域(NCRD)或者具有與其基本上同等活性的多肽、和(2)半乳凝素8的C末端側的糖鏈識別區(qū)域(CCRD)或者具有與其基本上同等活性的多肽，通過(3)半乳凝素8的連接肽的氨基酸序列中1個或者其以上的氨基酸被缺失、取代或添加了的氨基酸序列所構成的改變連接肽進行結合的蛋白質或其鹽等。
半乳凝素8的堿基序列以及氨基酸序列表示在例如數據庫NCBI上、NP_963837.galectin 8 isofor...[gi42544187]NM_201543.Homo sapiens lect...[gi42544186]；NP_963838.galectin 8isofor...[gi42544191]，NM_201544.Homo sapienslect...[gi42544190]；NP_963839.galectin 8isofor...[gi42544193]，NM_201545.Homo sapienslect...[gi42544192]中。半乳凝素8中，發(fā)現(xiàn)存在編碼區(qū)域的堿基序列上變異的情形，有報告發(fā)生8處變異，其中，作為氨基酸發(fā)生變異的地點，已知有4處(C.Maier et al.，European Urology，42，pp 301-307(2002))。如果參照序列編號5，在DNA序列的56位(a→t)，72位(c→t)，106位(t→c)，165位(t→c)，166位(g→a)，330位(a→g)，552位(c→g)，816位(c→t)上有發(fā)生變異的場合，而對于氨基酸序列，報告有在19位(Tyr→Phe)，36位(Cys→Arg)，56位(Val→Met)，184位(Ser→Arg)上發(fā)生變異。編碼人半乳凝素-8的基因，如上述那樣是公知的，可以適當用作為了獲得本發(fā)明的突變體的模板，另外地可以使用從表達人類表皮癌細胞系細胞(A431)等該基因的物質克隆的基因。代表性地，可以通過利用適當的堿基序列作為引發(fā)劑，購入規(guī)定的編碼基因部分進行使用。本發(fā)明的突變體多核苷酸(或者核酸)只要是在該堿基序列中啟始密碼子、例如，編碼Met的密碼子(以及終止密碼子、例如TGA、TAA或者TAG)存在或者缺失后添加它的物質，另外，只要是具有與編碼該堿基序列的蛋白質有至少80％的同源性的氨基酸序列且具有糖鏈結合活性或者同等的抗原性等的肽、編碼具有與其基本上同等的生物學活性的肽這樣的、含有與其等效的堿基序列的物質，可以是任意的物質。該多核苷酸(或者核酸)是一根鏈DNA、兩根鏈DNA、RNA、DNA:RNA雜交、合成DNA等的核酸，還有，也可以是人基因組DNA、人基因DNA文庫、人組織■細胞來源的cDNA、合成DNA的任一種。該多核苷酸(或者核酸)的堿基序列也可以被修飾(例如，添加、除去、取代等)，也包括這樣的被修飾了的堿基序列。進一步，如以下說明那樣，本發(fā)明的核酸是編碼本發(fā)明中記載的肽、特別是本發(fā)明的突變體(變體)肽或者其一部分的物質，作為優(yōu)選的，可舉出DNA。也包括來源于人、猩猩、猴子、小鼠、大鼠、牛、豬、山羊、綿羊、狗、貓、兔子等的哺乳動物的肽。另外，上述“等效的堿基序列”，可舉出例如在嚴格條件下與CRD的堿基序列中連續(xù)5個以上的堿基序列、優(yōu)選10個以上的堿基序列、更優(yōu)選15個以上的堿基序列、進一步優(yōu)選20個以上的堿基序列雜化，編碼在糖鏈結合性方面基本上同等的氨基酸序列的堿基序列等。
優(yōu)選方式中，半乳凝素8變體可舉出例如，(1)作為半乳凝素8的NCRD，序列編號3所示的氨基酸序列或者該序列中1個或者其以上的氨基酸被缺失、取代或添加了的、或者、具有與序列編號3所示的氨基酸序列有至少70％以上的同源性、或者至少75％以上的同源性、或者至少80％以上的同源性、或者至少85％以上的同源性、或者至少90％以上的同源性、或者至少95％以上的同源性的氨基酸序列，且具有乳糖結合活性的堿基序列、(2)作為半乳凝素8的CCRD，序列編號4中所示的氨基酸序列或者該序列中1個或者其以上的氨基酸被缺失、取代或添加的、或者、具有與序列編號3所示的氨基酸序列有至少70％以上的同源性、或者至少75％以上的同源性、或者至少80％以上的同源性、或者至少85％以上的同源性、或者至少90％以上的同源性、或者至少95％以上的同源性的氨基酸序列，且具有乳糖結合活性的堿基序列、(3)作為結合了上述(1)和(2)的連接區(qū)域，序列編號9所示的氨基酸序列或者該序列中1個或者其以上的氨基酸被缺失、取代或添加了的、優(yōu)選對于彈性蛋白酶等的蛋白質分解酶，比陰性的半乳凝素8更穩(wěn)定化的改變體。作為該連接區(qū)域(3)，還包括序列編號9所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基缺少1個以上(例如，1～2個、優(yōu)選3～4個、進一步優(yōu)選5～6個、進一步優(yōu)選7～8個、特別是1～9個或者9個以上等)的缺失類似物、該氨基酸殘基的1個以上(例如，1～9個、優(yōu)選1～8個、進一步優(yōu)選1～6個、進一步優(yōu)選1～4個、特別是1～2個或者9個以上等)用其它的殘基取代的取代類似物、添加1個以上(例如，1～28個、優(yōu)選1～20個、進一步優(yōu)選1～15個、進一步優(yōu)選1～10個、特別是1～5個等)的氨基酸殘基(其中，不包括序列編號10所示的氨基酸序列中，除去序列編號9所示的氨基酸序列部分所示的氨基酸序列)的添加類似物。代表性的場合是，作為該連接區(qū)域(3)，可舉出把序列編號9所示的氨基酸序列用HM，RIP，或者任意的2氨基酸的序列取代了的氨基酸序列等。氨基酸的取代、缺失、或者插入可以是對多肽的生理特性和化學特性不發(fā)生大的變化的修飾、在某些場合，優(yōu)選賦予變化的修飾。作為該氨基酸序列中的氨基酸的取代體，可以從屬于其氨基酸的組中的其它的氨基酸類進行選擇。例如，作為非極性(疏水性)氨基酸，可舉出丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等，作為極性(中性)氨基酸，可舉出甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，作為具有陽電荷的氨基酸(堿性氨基酸)，可舉出精氨酸、賴氨酸、組氨酸等，作為具有陰電荷的氨基酸(酸性氨基酸)，可舉出天冬氨酸、谷氨酸等。
另外，作為該連接區(qū)域(3)，可舉出把序列編號9或者10所示的氨基酸序列，除去序列編號10所示的氨基酸序列的29～70位的部分，用HM，RIP，或者任意的2氨基酸的序列取代的序列；序列編號9或者10所示的氨基酸序列中除去序列編號10所示的氨基酸序列的29～70位的部分，保留其中6個氨基酸，刪除除此之外的殘基的序列等。另外，作為該連接區(qū)域(3)，還包括，序列編號9或者10所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基(其中，例如，可以除去序列編號10所示的氨基酸序列的29～70位的部分)的1個以上(例如，1～5個、優(yōu)選3～10個、進一步優(yōu)選5～15個、進一步優(yōu)選7～20個、特別是1～28個等)缺失的缺失類似物、添加該氨基酸殘基的1個以上(例如，1～9個、優(yōu)選1～8個、進一步優(yōu)選1～6個、進一步優(yōu)選1～4個、特別是1～2個或者9個以上等)被其它的殘基取代的取代類似物、1個以上(例如，1～60個、優(yōu)選1～40個、進一步優(yōu)選1～20個、進一步優(yōu)選1～10個、特別是1～5個等)的氨基酸殘基(其中，不包括序列編號10所示的氨基酸序列中29～70位的部分所示的殘基)的添加類似物。
只要能維持天然的人半乳凝素8蛋白質的特征，即區(qū)域結構或者糖結合活性，上述各個突變體全部包括在本發(fā)明中?？梢哉J為本發(fā)明的肽或者多肽還包括與天然的人半乳凝素8蛋白質基本上同等的初級結構構象或者具有其一部分的肽或多肽，進一步可以認為還包括具有與天然的肽或多肽基本上同等的生物學活性的肽或多肽。進一步，例如，也可以是在N端側CRD和C端側CRD天然發(fā)生的突變體的之一。本發(fā)明的人來源的蛋白質(或者肽或者多肽)可舉出其各區(qū)域，例如與選自序列表的SBQ ID NO5～8的氨基酸序列，特別是與N端側CRD和C端側CRD的氨基酸序列，具有60％、根據場合具有高于70％的高同源性的肽或者多肽，更優(yōu)選對其具有80％或者90％以上的同源性的氨基酸序列的肽或者多肽。所謂的本發(fā)明的人來源的蛋白質的一部分的肽，是該人來源的蛋白質的一部分的肽(即、該蛋白質的部分肽)，只要是本發(fā)明的、具有與半乳凝素8蛋白質基本上同等活性的肽，可以是任意的。例如，可舉出該本發(fā)明的蛋白質的部分肽，具有該人半乳凝素8的構成氨基酸序列中至少5個以上、優(yōu)選20個以上、進一步優(yōu)選50個以上、更優(yōu)選70個以上、最優(yōu)選100個以上、某些場合，具有200個以上的氨基酸序列的肽，優(yōu)選是與這些連續(xù)的氨基酸殘基對應的肽、或者、例如，關于與序列表的SEQ ID NO5～8的任一項所示的氨基酸序列中對應的區(qū)域的同源性，可舉出具有與上述同樣的同源性的肽。
本說明書中，所謂的“基本上同等”，是指在蛋白質的活性、例如，血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、規(guī)定的細胞傷害活性、凋亡誘導活性、抗炎癥活性、LPS誘導的炎癥抑制活性、抗變態(tài)活性、免疫調節(jié)活性、LPS誘導的TNF-α、IL-12、以及/或者IFN-γ的產生抑制活性、內毒素休克抑制活性、糖鏈結合活性、生理活性、生物學活性方面，基本上相同。進一步還有，該用語的意思中，可以包含具有基本上同質的活性的場合，作為該基本上同質的活性，可舉出血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白結合活性、細胞傷害活性、凋亡誘導活性、內毒素休克抑制活性等。所謂的該基本上同質的活性，是指他們的活性在性質上顯示同質，例如，在生理上、藥理學上、或者生物學上顯示同質。例如，優(yōu)選血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等的細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白結合活性等的結合活性、細胞傷害活性、凋亡誘導活性、內毒素休克抑制活性等的活性同等(例如，約0.001～約1000倍、優(yōu)選約0.01～約100倍、更優(yōu)選約0.1～約20倍、進一步優(yōu)選約0.5～約2倍)，這些活性的程度、在蛋白質的分子量等的量化要素上也可以不同。
所謂的“半乳凝素8變體多肽”，包括野生型半乳凝素8的天然的序列的變體、其衍生物、類似體(類似物)、片斷、嵌合體、以及突變體。該多肽包括下述的多肽，即其通過設計成企圖在宿主細胞中表達、且編碼特定的半乳凝素8變體的重組而產生的多核苷酸序列所編碼的多肽。
所謂的“半乳凝素8變體治療劑”，是指含有來源于編碼半乳凝素8變體的多核苷酸(半乳凝素8變體多核苷酸)或者半乳凝素8變體多肽序列的分子、這樣的半乳凝素8變體多核苷酸或者多肽的變體、突變體、類似體、嵌合體、片斷等中至少一種的治療劑。所謂的多核苷酸的半乳凝素8變體治療劑，一般含有編碼半乳凝素8變體多肽的序列、且在宿主細胞中可以通過重組技術表達的多核苷酸。進一步，半乳凝素8變體治療劑也可以是半乳凝素8活性激動劑。作為其他的半乳凝素8變體治療劑，可以包括提供半乳凝素8變體的半乳凝素8變體治療劑、具有半乳凝素8變體有的活性且對與半乳凝素8活性的欠缺或者不足有關聯(lián)的疾患■疾病■異常的癥狀的預防以及/或者治療有效果的半乳凝素8活性的調節(jié)劑。作為半乳凝素8活性的調節(jié)劑，可以是例如，多核苷酸、多肽、或者低分子。
本說明書中使用的用語“診斷劑”，是指用于本發(fā)明中的診斷中的1種或者其以上的其診斷行為有作用的任意的藥劑。這些藥劑在診斷中的使用，包括用于決定半乳凝素8產生細胞的存在的方法或者用于決定提示半乳凝素8結合性物質的細胞的存在的方法。作為診斷劑，可舉出例如，含有選自編碼半乳凝素8變體(突變蛋白質)的DNA、穩(wěn)定化半乳凝素8變體(突變蛋白質)、以及具有該穩(wěn)定化半乳凝素8變體(突變蛋白質)的細胞或者細胞勻漿中的診斷劑。
本說明書中使用的用語“治療劑”，可以是本發(fā)明的治療中使用的1種或者其以上的達到其治療行為，或者對達到其治療行為有貢獻的任意的藥劑。例如，治療劑是設計成表達半乳凝素8變體多肽的多核苷酸的某些場合，該藥劑是投給哺乳動物、且能在細胞內表達的多核苷酸。該場合，藥劑的活性形態(tài)是被表達了的多肽。
半乳凝素8變體治療劑是具有半乳凝素8變體的生物活性的治療劑，或者是比天然的半乳凝素8變體長，具有與特定的糖鏈相結合的活性的多肽，與對彈性蛋白酶、胰蛋白酶等的蛋白質分解酶陰性的半乳凝素8相比，更穩(wěn)定的編碼半乳凝素8變體多肽的多核苷酸這樣的半乳凝素8變體由來的治療劑。該治療劑單獨，或者與其它的藥劑(例如，與半乳凝素8變體一起投給使用且對特定的腫瘤或者免疫疾病等其它的公知的處置法中所使用的藥物、或者在哺乳動物中容易進行半乳凝素8變體的表達那樣的基因送遞載體等)組合，達到其治療目的。例如，該治療劑可以包括為了其它的目的開發(fā)的半乳凝素8變體，進一步，還可以包括半乳凝素8激動劑、修飾或者調節(jié)半乳凝素8活性的藥物，例如，也可以是有機低分子化合物或者物質、肽、肽樣化合物或者物質、編碼半乳凝素8變體多肽的多核苷酸、半乳凝素8變體多肽、表達比對蛋白酶為陰性的半乳凝素8更穩(wěn)定化的半乳凝素8變體的嵌合體或者突變體等且被轉化的細胞。
本說明書中所謂的“配合治療劑”，是指一起投給的場合中產生它們各自的效果這樣的、包含幾個成分或者幾個藥劑的治療組合物，它們也可以是指為了處置疾病等一起投給的場合，產生協(xié)等效果這樣的藥劑。優(yōu)選可以比通過配合治療劑中的幾個成分或者幾個藥劑中的各自所得到的各自的作用效果，得到更大的治療效果、例如，從腫瘤的消失或者正?；?、包括自身免疫疾病的免疫疾病得到恢復以及長期生存那樣地進行組合它們。作為投給配合治療劑獲得的效果的例子，可舉出在短期內獲得癥狀的恢復和長期投給的后獲得癥狀的恢復的組合，或者減少對患者的特定型的各個細胞的自身免疫應答等不優(yōu)選的免疫應答，這樣的效果的組合。作為本發(fā)明的配合治療劑的例子，可舉出為了投給包含編碼半乳凝素8變體的多核苷酸與編碼IFN類、IL-2等的細胞因子類的至少一個的、多核苷酸的基因送遞載體的治療劑等。作為另外的例子，可以是也能使用2個基因送遞載體、例如，1個是表達半乳凝素8變體的、另一個是表達細胞因子類的至少一個的基因送遞載體。進一步，為了預期在標的細胞中為誘導細胞凋亡的半乳凝素8變體的投給并作正向調節(jié)，也可以投給IFN類，IL-2等、或者表達IFN-γ等的基因送遞載體。種種的治療劑可以將它們同時給予，例如，為了高效率治療，根據需要，將各個藥劑的一個或者全部藥劑反復投給，也可以加到相同的藥學上容許的載體中后投給。
所謂的“基因送遞載體”，是指把為了細胞中的多肽的表達的編碼序列送遞到細胞中可以容易進行的成分。該細胞可以存在于哺乳動物的體內，使體內基因治療，也可以在離體基因治療，為了轉染處理暫時從哺乳動物取出，再返回多肽哺乳動物中，使多肽表達?；蛩瓦f載體可以是能達到向細胞中的基因送遞那樣的任意的成分或者載體，例如，可以是質脂體、粒子、載體等。作為基因送遞載體，可舉出重組體載體(例如，重組體病毒載體)、核酸載體(例如，質粒)、裸露核酸分子(例如，基因)、與可凝集為中和核酸分子上的負電荷且折疊核酸分子的分子這樣的多陽離子分子復合體化的核酸分子、與質脂體結合的核酸(美國專利第5,166,320號說明書；第5,547,932號說明書；Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847851，1987)等。該基因送遞載體可以包含前體生產細胞這樣的特定的真核生物細胞，也可以是能把生物學上具有1個以上所期望的特性的核酸分子送遞到宿主細胞中的基因送遞載體。所謂的期望的特性，是指以下討論的，例如，可以包括表達蛋白質、酶、或者抗體等這樣的期望物質的能力以及/或者提供生物學活性的能力。即，利用基因送遞載體搬運的核酸分子表達期望的物質并不是必需的，而是其本身活性的藥劑。這樣的生物學活性的一個例子，是基因治療上發(fā)現(xiàn)的?；蛑委熤校鼓撤N的基因惰性化，阻斷該基因所指示的產物的制作，組合到送遞的核酸分子特異性進行表達的基因中。所謂的基因送遞載體，是指可以指示1個或者多個目的序列或者基因表達的集合體(assembly)。
基因送遞載體一般包括啟動子組件，還包括指示多腺苷酸化的信號。進一步，基因送遞載體包括，在被轉錄時，可操作地連結在與1個或者多個目的序列或者基因上，起到翻譯起始序列的作用的序列。另外，基因送遞載體也包括Neo、SV2Neo、TK、潮霉素、博來霉素(腐草霉素)、puromicin、組氨霉素、DHFR等的可以選擇的標記、1個以上的限制酶部位以及翻譯終止序列。本發(fā)明中使用的場合，所謂的基因送遞載體，還包括病毒載體(Jolly，CancerGen.Therapy，151-64，1994)、核酸載體、裸露DNA、質脂體DNA、粘粒、細菌、特定的真核生物細胞(包括前體生產細胞；參照美國專利第6,333,195號說明書)這樣的重組體載體。
所謂的“生物學活性”，是指保持特異性的活性的分子的場合中所使用的。例如，生物學上活性的半乳凝素8變體多肽，對載有半乳凝素8的糖鏈識別部位的特定糖鏈進行特異性結合這樣的活性或者具有與其基本上同等的性質的活性、且比對彈性蛋白酶、胰蛋白酶等的蛋白質分解酶陰性的半乳凝素8更穩(wěn)定的、以及/或者保持定量穩(wěn)定化的能力，例如，顯示半乳凝素8所具有的血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等的細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、LPS誘導的炎癥抑制活性、LPS誘導的TNF-α、IL-12、以及/或者IFN-γ的產生抑制活性、內毒素休克抑制活性、使誘導抗腫瘤活性或者凋亡的凋亡經路活性化的活性等。
所謂本說明書中所使用的用語“核酸分子”或者“多核苷酸”，是指編碼特定的氨基酸序列或者其相輔鏈的RNA或者DNA、進一步DNA:RNA雜化等的分子。所謂本說明書中使用的“編碼序列”，是指編碼特定的氨基酸序列或者其相輔鏈的RNA或者DNA、進一步DNA:RNA雜化等的任一種。多核苷酸可以包括例如，反義寡聚核苷酸、或者核酶，還可以包括基因的3′或者5′非翻譯區(qū)域那樣的序列、基因的內含子、不構成基因的編碼區(qū)域的這樣的基因的其它的區(qū)域。DNA和RNA一根鏈或者兩根鏈都可以。合成核酸和合成多核苷酸中也可以包括具有化學合成的核酸序列的，進一步也可以為了賦予分子對改性的抵抗性而化學上預先進行部分改變。多核苷酸，例如，可以通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增、使用互補的DNA或者RNA的重組表達等進行制造，或者也可以通過化學合成產生。
所謂的本說明書中用語“表達控制序列”和“調節(jié)序列”，是指含有對編碼多肽的基因的表達有影響，對包含為了轉錄和翻譯的信號的表達有影響的1個或者其以上的成分、且在該領域中使用的序列。適用于本發(fā)明的多肽的表達的表達控制序列根據為表達多肽的宿主系而不同。
作為本發(fā)明的“多肽”，只要是含有半乳凝素8變體多肽的，可以是任意的多肽，可舉出含有成熟蛋白質的半乳凝素8變體蛋白質的任意的部分，此外，還可舉出其短縮型、變體、等位基因體、類似物、衍生物等。作為變體，只要是從與關聯(lián)蛋白質相同基因表達的被拼接的變體衍生的即可。其它只要沒有特別的指示，這樣的多肽具有例如對特定的糖鏈特異性結合這樣的親合性結合性或者對特異性的配偶體的結合活性等的、該半乳凝素8蛋白質所具有的生物活性中的一種或者其以上的生物活性。本“多肽”用語并不限定為特定長度的基因產物。不拘泥于來源于人的或者來源于人以外的供給源，與半乳凝素8的N末端側糖鏈識別部位(NCRD)以及C末端側糖鏈識別部位(CCRD)有關的標的蛋白質或者成熟蛋白質是相同的，或者具有至少60％、優(yōu)選70％、更優(yōu)選80％、以及最優(yōu)選90％、進一步95％的同源性的多肽包含在本多肽的該定義內。因此，也包括基于等位基因的變體、以及含有氨基酸的取代、缺失、或者插入的基因產物的變體。氨基酸的取代是氨基酸的保存性的取代、或者糖基化部位、磷酸化部位、乙酰化部位等進行改變那樣的氨基酸的取代、或者對功能不必要的改變半胱氨酸殘基的位置，改變折疊模式的氨基酸取代，還有也可以是除去不是必須氨基酸殘基的這樣的取代。所謂氨基酸的保存性的取代，一般是指保存電荷、疏水性/親水性、以及/或者被取代的氨基酸的立體尺寸(大小)這樣的取代，例如，在Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/GIn、Ser/Cys/Thr、以及Phe/Trp/Tyr等這樣的組的元素間的取代是保存性的取代。
所謂的類似物，具有標的蛋白質樣的活性，作為肽樣類似物，可舉出廣為人知的具有肽模仿物質的一個或者其以上的肽等。本定義中，包括例如，含有1個或者其以上的氨基酸的類似物(例如，包括非天然型氨基酸等)的多肽、具有被取代了的連結部的多肽、天然存在的變異以及天然不存在的變異這樣的該技術領域中公知的其他的改變·修飾。
本說明書中的用語“多肽”可以是多肽表達后改變的肽，例如，糖基化、乙?；⒘姿峄?、豆蔻酰化等的肽。
所謂本說明書的用語“裸露DNA”，是指為了在哺乳動物中表達，投給哺乳動物的多核苷酸DNA。作為多核苷酸，可以是例如編碼序列，多核苷酸DNA可以是DNA一旦進入細胞內就容易表達編碼序列那樣地、與表達控制序列直接或者間接結合的多核苷酸。所謂的間接結合，包括為了在哺乳動物細胞使DNA的表達容易而結合調節(jié)區(qū)域和編碼序列，或者為了使其它的序列組合容易等，通過聯(lián)結子或者間隔物，2個多核苷酸區(qū)域一起結合。
所謂的本說明書中的“載體”，是指可以指示1個或者多個的目的序列或者基因的表達的集合體(assembly)。載體必須含有將下述其中的任一個，即，轉錄啟動子/強化因子、規(guī)定1或者多個的基因座的組件，進一步指示或者控制交替剪接、核RNA輸送、信使的翻譯后引起的修飾、或者蛋白質的轉錄后的修飾等這樣的過程的其它手段的控制基因表達的其它的組件。進一步，在被轉錄場合，載體還必須包括可操作地連結到對1個或者其以上的目的序列或者基因上且起到翻譯啟始序列作用那樣的序列。根據需要，載體包括指示多腺苷酸化的信號、Neo、TK、潮霉素、博來霉素(腐草霉素)、組氨霉素、DHFR等的選擇標記、還可以具有1個或者其以上的限制部位以及翻譯終結序列。進一步，如果在逆轉錄病毒中配置的場合，在載體必須包裝信號、長末端反復序列(LTR)，還有，如果其不存在，適于所使用的逆轉錄病毒的有義鏈或者負鏈的引發(fā)劑結合部位。
所謂的“組織特異性的啟動子”，是被限定了數目的組織型或者細胞型中優(yōu)先活性的啟動子，是指規(guī)定轉錄啟動子/強化因子或者基因座的組件、或者如上述那樣地控制基因表達的其它的組件。作為這樣的組織特異性的啟動子的代表的例子，可舉出例如，PEPCK啟動子、HER2/neu啟動子、酪蛋白啟動予、IgG啟動子、絨毛性胚抗原啟動子、彈性蛋白酶啟動子、膽色素源啟動子、胰島素啟動子、成長激素因子啟動子、酪氨酸羥化酶啟動子、白蛋白啟動子、α-胎兒蛋白質啟動子、乙酰膽堿受體啟動子、乙醇脫氫酶啟動子、α或者β珠蛋白啟動子、T細胞受體啟動子、成骨素啟動子等。
所謂的“事象特異性的啟動子(event-specific promoter)”，是指規(guī)定轉錄啟動子/強化因子或者基因座的組件、或者上述那樣地控制基因表達的其它的組件、且這些的轉錄活性在對細胞性刺激的應答時發(fā)生變化的。作為這樣的事象特異性的啟動子的代表的例子，可舉出例如胸腺激酶或者胸腺酸合成酶啟動子、α或者β干擾素啟動子、進一步激素(天然激素、合成激素、或者從其它的非宿主生物由來的激素的任一種，例如，昆蟲激素等)的存在中應答的啟動子等。
所謂的用語“融合蛋白質”或者“融合多肽”，是指產生多于1個的蛋白質或者包括多于1個的蛋白質的部分的1個多肽的表達這樣的載體，使用該載體的表達所產生的，且把載體或者連續(xù)的結合中的多于1個的異種編碼序列進行重組表達得到的蛋白質或者多肽。最優(yōu)選融合蛋白質包括具有為了構建該融合蛋白質所使用的來源蛋白質或者多肽具有的生物學活性中保持至少1種的多肽單元，優(yōu)選通過組合各自的蛋白質的部分形成信號多肽，使產生協(xié)同地被改良了的生物學活性的多肽。作為生成的融合蛋白質，可舉出在被表達的場合具有有功能的多肽的蛋白質、在表達的場合具有沒功能的肽的蛋白質。作為在該表達的場合沒有功能的肽，優(yōu)選舉出對表達有活性的多肽有作用的肽。作為本發(fā)明中有用的融合蛋白質的例子，從為了治療或者為了檢測或者測定，進一步為了分析或者分離和精制的利用的觀點，具有幾個優(yōu)點的基因操作的任意的半乳凝素8變體融合多肽。
所謂的用語“嵌合”或者“嵌合蛋白質”，可以認為與融合蛋白質或者融合多肽具有等價意義?！扒逗戏肿印笨梢允侨诤隙嚯摹⒒蛘呔幋a融合多肽的多核苷酸融合分子。嵌合，由連結的DNA編碼序列所構建，且在細胞系中被表達，或者通過載體載有投給，在動物中可以進行體內表達。例如，包含半乳凝素8變體的嵌合或者融合蛋白質可以在體內或者離體的基因治療操作說明下進行投給。
本說明書中所謂的“患者”，是指可以在活體生物中進行任意的治療或者預防處置的“患者”，包括真核生物或者原核生物，也不限定在這些中。例如，作為患者的真核生物，可以是脊椎動物和無脊椎動物。因此，例如，患者可以是魚、鳥、蠕蟲、昆蟲、哺乳動物、爬蟲類、兩棲類、菌類、植物，優(yōu)選哺乳動物。所謂的哺乳動物，例如，可舉出人。
以下說明本發(fā)明的半乳凝素8變體治療劑以及/或者診斷劑的一般的制造法以及使用法。1種方式中，本發(fā)明提供一種處置由于半乳凝素8所有的生理活性或者生物活性不足或者欠缺起因的疾病■病氣·異常狀態(tài)的技術。作為該處置技術，例如，可舉出提供半乳凝素8變體治療劑工序以及/或者對具有該疾病等的哺乳動物投給有效量的半乳凝素8變體治療劑的工序等。半乳凝素8變體，從具有血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等的細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、對惡性腫瘤細胞的細胞傷害活性、對惡性腫瘤細胞的凋亡誘導活性、對惡性腫瘤細胞的抗腫瘤活性(抗癌活性)、免疫調節(jié)活性、抗炎癥作用、抗變態(tài)作用、LPS誘導的炎癥抑制活性、LPS誘導的TNF-α、IL-12、以及/或者IFN-γ的產生抑制活性、發(fā)揮內毒素休克抑制活性來看，期待有抗腫瘤劑(抗癌劑)、抗變態(tài)劑、免疫調節(jié)劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑、激素代替用劑、內毒素休克抑制劑等的物質。該處置技術包括處置嗜中性細胞的異常狀態(tài)的方法。所謂的“自身免疫疾病”、“自身免疫疾病”、以及“自身免疫”，全部是指由哺乳動物中的自身免疫而賦予特征的障害(這是對自身成分的免疫系統(tǒng)的應答)。自身免疫應答能發(fā)展為表現(xiàn)臨床的兆候的癥狀。嚴格來說，移植排斥不是自身免疫反應，其中患者癥狀上接受取代或者移植細胞、組織、或者器官這樣的外科手術的場合，接受同種移植的個體，是對外來移植發(fā)生免疫學上反應的個體。從種的1個成員向其它種的細胞、組織、或者器官的同種移植中，受體(recipient)中為了排斥移植的細胞、組織、或者器官產生充分的免疫應答的場合，引起“移植排斥”。
作為根據本發(fā)明的方法以及治療劑可以處置的“腫瘤”的例子，可以包括惡性腫瘤，例如，轉移的腫瘤是惡性腫瘤，一般該惡性腫瘤認為是上皮性和非上皮性的腫瘤，在某些場合，也考慮將其分為癌、肉瘤、白血病等，在簡單地稱為“癌”的場合，一般人中多指的是惡性腫瘤。本說明書中所謂的“癌”，可以解釋為廣泛的意義，不應該單單解釋為上皮性的惡性腫瘤。本說明書中，所謂的“癌”，包括上皮性惡性腫瘤以及非上皮性惡性腫瘤(包括腫瘤形成性的，也包括非形成性的)，可舉出皮膚癌(也包括黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸惡性腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、咽頭■喉頭癌、舌癌、上顎癌、食道癌、胃癌、結腸■直腸癌、肺■支氣管癌、肝癌(包括肝細胞癌、肝內膽管癌)、肝外膽管■膽囊癌、胰臟癌、白血病、惡性淋巴腫瘤、形質細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性血管瘤、惡性血管內皮瘤、腦腫瘤(包括硬腦脊膜肉瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤等)等，但是并不限定在這些中，應該理解為通過使用本發(fā)明的半乳凝素8變體而得到良好結果的癌癥，進一步還包括與該半乳凝素8變體有關連，能得到任何的生理的或者生物學的應答的癌癥。
作為根據本發(fā)明的方法以及治療劑能處置的“自身免疫疾病”的例子，可舉出多發(fā)性硬化癥、橋本甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、Goodpasture’s綜合癥、天皰瘡、受體自身免疫、自身免疫溶血性貧血、自身免疫血小板減少性紫斑病、變形性關節(jié)癥、慢性類風濕性關節(jié)炎、由抗膠原抗體產生的強皮癥(scleroderma)、復合化結合組織病、多發(fā)性肌炎、惡性貧血、特發(fā)性艾迪生(Addison’s)病、自發(fā)性不妊癥、腎小球腎炎、水皰性類天庖瘡、腎上腺素作用性藥物耐性、慢性活性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、基于自身免疫的內分泌腺不全、白斑、脈管炎、心肌梗塞后遺癥(post-myocardial infarction)、心臟穿孔綜合癥、尋麻疹、特異性皮膚炎、基于自身免疫的哮喘、基于自身免疫的炎癥性反應、肉芽瘤癥障害、強直性(alkylizing)脊椎炎、連鏈球菌感染后(poststreptococcal)腎小球體腎炎、自身免疫溶血性貧血、腦炎、對淋巴腫瘤二次自身免疫反應、變性障害、萎縮性障害等。作為表達受體自身免疫的自身免疫疾病，可舉出例如，Gra ve’s病、重癥肌肉無力癥、胰島素耐性癥等。作為腎上腺素性藥物耐性的自身免疫疾病，可舉出例如，哮喘以及囊胞性纖維癥等。
作為本發(fā)明的其它的自身免疫疾病，可舉出例如，動物模型中存在的疾病，例如，Sjgren’s綜合癥(自身免疫淚腺炎(dacryodentis)或者免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)、炎癥性心臟病、水銀誘導性腎自身免疫、胰島素依存性糖尿病(I型糖尿病或者IDD)、胸腺切除術后自身免疫、中樞神經系(CNS)脫髓障害、CNS狼瘡、睡眠發(fā)作、免疫媒介PNS障害、變形性關節(jié)癥、慢性類風濕性關節(jié)炎、眼葡萄膜炎、髓質囊胞性纖維癥、自身免疫溶血性疾病、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾病、人強皮癥(scheroderma)等。作為以中樞神經系(CNS)脫髓障害為特征的自身免疫疾病，可舉出例如，多發(fā)性硬化癥(MS)等。末梢神經系(PNS)自身免疫疾病也可以是例如Guillain-Barre綜合癥(GBS)。
作為半乳凝素8變體治療劑，可舉出多肽、多核苷酸、低分子的有機化合物、肽、或者肽樣化合物或者物質等。另外，半乳凝素8變體治療劑也包括半乳凝素8變體多肽、編碼半乳凝素8變體多肽的多核苷酸、含有該半乳凝素8變體多肽的一部分的融合多肽、編碼含有該半乳凝素8變體多肽的一部分的融合多肽的多核苷酸、半乳凝素8變體多肽的生物學上有活性的肽衍生物、來自半乳凝素8變體多肽的生物學上有活性的肽樣化合物或者物質、或者具有半乳凝素8變體活性且模仿半乳凝素8變體的結構的低分子的有機化合物(例如，包括激動劑)等。半乳凝素8變體多肽可以是半乳凝素8變體多肽變體、半乳凝素8變體多肽衍生物、變異的半乳凝素8變體多肽、或者短縮型半乳凝素8變體多肽那樣的生物學上有活性的半乳凝素8變體多肽。編碼半乳凝素8變體多肽的多核苷酸可以是編碼具有半乳凝素8的N端側CRD全長以及C端側CRD全長的變體多肽的多核苷酸序列、編碼半乳凝素8變體多肽的生物學上有活性的部分的序列、編碼來自半乳凝素8變體多肽的生物學上有活性的肽的序列、編碼可溶性半乳凝素8變體多肽的序列等。本發(fā)明的其它的實施方式是具有能表達編碼半乳凝素8變體多肽的多核苷酸序列的基因送遞載體的組合物。
本發(fā)明中，利用“基因重組技術”，可以獲得規(guī)定的核酸(多核苷酸)以及構建規(guī)定的肽(多肽)，以及分離■序列決定，制作重組體。作為本說明書中可以使用的基因重組技術(包括重組DNA技術)，可舉出該領域中已知的技術，例如，按照J.Sambrook，E.F.Fritsch &T.Maniatis，″Molecular CloningA Laboratory Manual(2ndedition)″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford UniversityPress(1995)；日本生化學會編、“續(xù)生化學實驗講義1、基因研究法II”、東京化學同人(1986)；日本生化學會編、“新生化學實驗講義2、核酸III(重組DNA技術)”、東京化學同人(1992)；M.J.Gait(Ed)，Oligonucleotide Synthesis，IRL Press(1984)；B.D).Hames and S.J.Higgins(Ed)，Nucleic Acid Hybridjzation，A Practical Approach，IRL Press Ltd.，Oxford，UK(1985)；B.D.Hames and S.J.Higgins(Rd)，Transcription and TranslationA Practical Approach(Practical Approach Series)，IRL Press Ltd.，Oxford，UK(1984)；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(2nd Edition)，JohnWiley & Sons，New York(1988)；J.H.Miller and M.P.Calos(Ed)，Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York(1987)；R.J.Mayer andJ.H. Walker(Ed)，Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology，Academic Press，(1987)；R.K.Scopes et al.(Ed)，ProteinPurificationPrinciples and Practice(2nd Edition，1987 & 3rdEdition，1993)，Springer-Verlag、N.Y.；D.M.Weir and C.C.Blackwell(Ed)，Handbook of Experimental Immunology，Vol.1，2，3and 4，Blackwell Scientific Publications，Oxford，(1986)；L.A.Herzenberg et al.(Ed)，Weir’s Handbook of ExperimentalImmunology，Vol.1，2，3 and 4，Blackwell Science Ltd.(1997)；R.W.Ellis(Ed)，Vaccines-new approaches to immunologicalproblems，Butterworth-Heinemann，London(1992)；R.Wu ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.68(Recombinant DNA)，AcademicPress，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)&101(Recombinant DNA，PartC)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，″Methods inEnzymology″，Vol.153(Recomhinant DNA，Part D)，154(RecombinantDNA，Part E)& 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，NewYork(1987)；J.H.Miller ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.204，Academic Press，New Vork(1991)；R.Wu et al.ed.，″Methods inEnzymology″，Vol.218，Academic Press，New York(1993)；S.Weissman(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.303，Academic Press，New York(1999)；J.C.Glorioso et al.(ed.)，″Methods inEnzymology″，Vol.306，Academic Press，New York(1999)等中所述的方法或者其中所引用的文獻中所述的方法或者與這些基本上同樣的方法以及改變法可以進行(這些中的某些記載通過參考其記載，包含在本說明書的記載中)〔以下，將這些全部稱為“基因重組技術”〕。
本說明書中，所謂的“同源性”是指在多肽序列(或者氨基酸序列)或者多核苷酸序列(或者堿基序列)中的2根鏈間構成該鏈的各氨基酸殘基彼此或者各堿基彼此相互的適合關系中可以決定為相同這樣的序列的數量(數)，表示兩個多肽序列或者兩個多核苷酸序列間的序列相關性的程度。同源性可以容易算出。測定兩個多核苷酸序列或者多肽序列間的同源性的方法已知有多個方法，“同源性”(也稱為“同源性”)用語對從業(yè)者為周知的(例如，Lesk，A.M.(Ed.)，Computational Molecular Biology，Oxford University Press，NewYork，(1988)；Smith，D.W.(Ed.)，BiocomputingInformatics andGenome Projects，Academic Press，New York，(1993)；Grifin，A.M. & Grifin，H.G.(Ed.)，Computer Analysis of Sequence DataPart I，Human Press，New Jersey，(1994)；von Heinje，G.，Sequence Analysis in Molecular Biology，Academic Press，NewYork，(1987)；Gribskov，M.& Devereux，J.(Ed.)，SequenceAnalysis Primer，M-Stockton Press，New York，(1991)等)。用于測定兩個序列的同源性的一般方法中，可舉出Martin，J.Bishop(Ed.)，Guide to Huge Computers，Academic Press，San Diego，(1994)；Carillo，H.& Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)等中公開的方法，但是并不限定于這些。作為用于測定同源性的優(yōu)選的方法，可舉出設計成試驗的兩個序列間獲得最大的適合關系部分的方法。這樣的方法可舉出組裝成計算機程序的方法。作為為了測定兩個序列間的同源性的優(yōu)選計算機程序法，可舉出GCG程序包(Devereux，J.et al.，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.etal.，J.Mol.Biol.，215403(1990))等，但是并不限定于此，可以使用該領域中公知的方法。
本說明書中，“聚合酶連鎖反應”或者”聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction)”或者“PCR”是指，一般的如美國專利第4,683,195號說明書等中所述的方法，例如，是指用于通過體外對期望的核苷酸序列進行酶擴增的方法。一般來說，PCR法適用模板核酸和可以優(yōu)先雜化的2個寡聚核苷酸引發(fā)劑，進行引發(fā)劑伸長合成那樣的反復循環(huán)的方法。典型的是，PCR法中使用的引發(fā)劑可以使用模板內部的對該擴增的核苷酸序列互補的引發(fā)劑，例如，優(yōu)選使用與應該對該擴增的核苷酸序列在其兩端相輔的，或者與應該對該擴增的核苷酸序列鄰接的引發(fā)劑。作為5′端側的引發(fā)劑，優(yōu)選含有至少開始密碼子，或者含有該開始密碼子能擴增地進行選擇，作為3′端側的引發(fā)劑，優(yōu)選含有至少終止密碼子，或者含有該終止密碼子能擴增地進行選擇。引發(fā)劑可舉出由優(yōu)選5個以上的堿基、進一步優(yōu)選10個以上的堿基構成的寡聚核苷酸、更優(yōu)選18～25個的堿基構成的寡聚核苷酸。
PCR反應可以通過在該領域中公知的方法或者基本上與其同樣的方法或者改變法進行，例如，可以按照R.Saiki，et al.，Science，2301350，1985；R.Saiki，et al.，Science，239487，1988；H.A.Erlich ed.，PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；M.A.Innis et al.ed.，″PCR Protocolsa guide to methods andapplications″，Academic Press，New York(1990))；M.J.McPherson，P.Quirke and G.R.Taylor(Ed.)，PCRa practicalapproach，IRL Press，Oxford(1991)；M.A.Frohman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002(1988)等中所述的方法或者對其修飾、改變了的方法進行。另外，PCR法可以使用與其相適的市售的試劑盒進行，根據試劑盒制造業(yè)者或者試劑盒販賣業(yè)者可以清楚地闡明的操作說明，也可以實施。
PCR反應，在代表性的場合下，例如把模板(例如，以mRNA為模板合成的DNA；第1根DNA)與基于該基因設計的引發(fā)劑，與10×反應緩沖液(添附了Taq DNA聚合酶)、dNTPs(三磷酸脫氧核糖核苷；dATP，dGTP，dCTP，dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶以及去離子蒸餾水混合。將混合物使用例如，GeneAmp 2400 PCRsystem，Perkin-Elmer/Cetus社等的自動熱循環(huán)控制裝置，在一般的PCR循環(huán)條件下反復該循環(huán)25～60回，為了擴增的循環(huán)數可以根據適宜目的，循環(huán)適當的回數。作為PCR循環(huán)條件，例如可舉出變性90～95℃5～100秒、退火40～60℃5～150秒、伸長65～75℃30～300秒的循環(huán)、優(yōu)選變性94℃15秒、退火58℃15秒、伸長72℃45秒的循環(huán)，退火的反應溫度以及時間根據適宜實驗可以選擇適當的值，改性反應以及伸長反應的時間也是根據預料的PCR產物的鏈長，選擇適當的值。退火的反應溫度通常優(yōu)選根據引發(fā)劑與模板DNA的雜交的Tm值而改變。伸長反應的時間通常每1000bp的鏈長，1分程度為大概的指標，也可以根據情形選擇更短的時間。
本說明書中，所謂的“寡聚核苷酸”是指比較短的一本鏈或者二本鏈的核苷酸，優(yōu)選可舉出多聚脫氧核苷酸，根據Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.28，p.716-734(1989)中所述的已知的方法、例如，磷酸三酯法、磷酸二酯法、亞磷酸酯法、亞磷酰胺法、磷酸酯法等的方法可以進行化學合成。已知通常的合成可以在被修飾的固體支持體上方便地進行合成，例如，可以采用自動化的合成裝置，該裝置在市售中。該寡聚核苷酸可以含有一個或者其以上的被修飾的堿基，也可以含有例如肌苷等的天然上不是通常的堿基或者三苯甲基化(tritylated)的堿基等，根據場合，也可以含有帶有標記的堿基。
為了鑒定規(guī)定的核酸，可以利用雜化技術。該雜化可以通過上述公開了“基因重組技術”的文獻中所述的方法或者與其基本上同樣的方法或者改變法進行。例如，雜化通過把含有DNA等的核酸的樣品轉錄在包含尼龍過濾器等的膜的擔載體上，根據需要，實施變性處理、固定化處理、洗滌處理等后，將轉錄在該擔載體(例如，膜等)的物質，根據需要與變性的標識探針DNA片斷在雜化用緩沖液中使其進行反應來進行。
雜化處理通常在約35～約80℃、更優(yōu)選在約50～約65℃，進行約15分鐘～約36小時，更優(yōu)選進行約1～約24小時，可以選擇最適的條件進行。例如，雜化處理在約55℃進行約18小時。作為雜化用緩沖液，可以從在該領域中通常使用的緩沖液中選擇使用，例如，可以使用Rapid hybridization buffer(Amersham社)等。作為轉錄的擔載體(例如，膜等)的變性處理，可舉出使用堿改性液的方法，優(yōu)選在該處理后在中和液或者緩沖液中處理。另外，作為擔載體(例如，膜等)的固定化處理，通常在約40～約100℃、更優(yōu)選在約70～約90℃，進行約15分鐘～約24小時、更優(yōu)選烘烤約1～約4小時進行，可以選擇適宜優(yōu)選的條件進行。例如通過將濾器等的擔載體在約80℃下進行約2小時烘烤，進行固定化。作為轉錄的擔載體(例如，膜等)的洗滌處理，可以通過用在該領域內通常使用的洗滌液、例如含有1M NaCl、1mM EDTA以及0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的50mMTris-HCl緩沖液，在pH8.0等下洗滌進行。作為含有尼龍濾器等的膜的擔載體，可以從在該領域中通常使用的擔載體中選擇使用。
作為上述堿改性液、中和液、緩沖液，可以從該該領域中通常使用的液體中選擇使用，作為堿改性液，可舉出例如含有0.5M NaOH以及1.5M NaCl的液體等，作為中和液，可舉出例如含有1.5M NaCl的0.5M Tris-HCl緩沖液，pH8.0等，作為緩沖液，可舉出例如，2×SSPE(0.36M NaCl、20mM NaH2PO4以及2mM EDTA)等。另外，在雜化處理之前，為了防止非特異性的雜化反應，根據需要，優(yōu)選將轉錄的擔載體(例如，膜等)進行預雜化處理。該預雜化處理通過在例如，預雜化溶液[50％甲酰胺、5×Denhardt′s溶液(0.2％牛血清白蛋白、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、5×SSPE、0.1％SDS、100μg/ml熱變性鮭精子DNA]等中浸漬，在約35～約50℃、優(yōu)選約42℃下使其反應約4～約24小時、優(yōu)選約6～約8小時來進行，這樣的條件只要是從業(yè)者就可以反復適宜的實驗，決定更優(yōu)選條件。用于雜化的標識探針DNA片斷的改性可以通過例如在約70～約100℃、優(yōu)選約100℃下，進行約1～約60分鐘、優(yōu)選約5分鐘加熱等進行。另外，雜化可以采用其本身公知的方法或者以其為基準的方法進行，本說明書中所謂的嚴格的條件，示出例如對于鈉濃度，為約15～約50mM、優(yōu)選約19～約40mM、更優(yōu)選約19～約20mM，對于溫度，約35～約85℃、優(yōu)選約50～約70℃、更優(yōu)選約60～約65℃的條件。
雜化完了后，充分洗滌處理濾器等的擔載體，進行取出經特異性的雜化反應的標識探針DNA片斷以外的標識探針等后可以進行檢測處理。濾器等的擔載體的洗滌處理可以從該領域中通常使用的處理方法中選擇使用，例如，可以通過采用含0.1％SDS的0.5×SSC(0.15MNaCl、15mM檸檬酸)溶液等進行實施。
雜化的核酸可以通過代表性的放射自顯影法檢測出，也可以從該領域中所用的方法中適宜選擇用于檢測。把相當于檢測的信號的核酸帶懸濁在適宜的緩沖液、例如，SM溶液(含有100mM NaCl以及10mMMgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液、pH7.5)等中，然后適當稀釋該懸濁液，分離■精制規(guī)定的核酸，然后用于進一步的的擴增處理。本說明書中所謂的“高同源性”的場合根據該對象序列的長度而不同，例如可以是50％以上、進一步60％以上、優(yōu)選70％以上、進一步優(yōu)選80％以上，在特定的場合，可以是95％以上，特優(yōu)選97％以上。所謂的該“等效的堿基序列”，可舉出例如在嚴格條件雜化為具有關注序列的堿基序列，例如與該堿基序列中連續(xù)5個以上的堿基序列、優(yōu)選10個以上的堿基序列、更優(yōu)選15個以上的堿基序列、進一步優(yōu)選20個以上的堿基序列雜化，編碼與該多肽基本上同等的氨基酸序列的堿基序列等。核酸也可以根據化學合成得到。該場合，也可以化學合成片斷，利用酶使其結合。
通過雜化處理，可以反復進行從含有基因文庫和cDNA文庫等的核酸樣品篩選目的核酸的處理。可以使用克隆的人來源的cDNA文庫、例如種種的人來源的組織或者培養(yǎng)細胞(特別是人的腎臟、腦、松果體、下垂體后葉、神經細胞、視網膜、視網膜血管細胞、視網膜神經細胞、胸腺、血管、內皮細胞、血管平滑肌細胞、血液細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、精巢、卵巢、子宮、腸、心臟、肝臟、胰臟、小腸、大腸、牙齦關聯(lián)細胞、皮膚關聯(lián)細胞、腎小球細胞、尿細管細胞、結合組織細胞等的組織■細胞、進一步，各種腫瘤組織、癌細胞等)cDNA文庫。進一步，作為模板等使用的cDNA文庫，也可以直接使用市售的種種組織來源的cDNA文庫，例如從Stratagene社，Invitrogen社，Clontech社等販賣的cDNA文庫。典型的例子，可以使用從人組織■細胞調制的基因文庫、例如人P1 artificial chromosome基因文庫(Human GenomeMapping Resource Center)、人組織cDNA文庫(例如，可以從Clontech社等購入)。可以使用探針篩選從種種的人組織或者培養(yǎng)細胞等構建的人基因DNA文庫或者人來源cDNA文庫。為了利用放射性同位體等標識探針等，可以使用市售的標識試劑盒、例如隨機引物法DNA標記試劑盒(Boehringer Mannheim社)等進行。例如，使用隨機引物法試劑盒(PharmaciaLKB社，Uppsala)等，用[α-32P]dCTP(Amersham社)等標識探針用DNA，可以得到具有放射活性的探針。
載有規(guī)定的核酸的噬菌體粒子、重組質粒、重組體載體等可以通過使用該領域中通常使用的方法將其精制分離，例如，可以利用丙三醇剃度超離心分離法(Molecular Cloning，alaboratorymanual，ed.T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory，2nded.78，1989)、電泳法等進行精制?？梢詮氖删w粒子等，用該領域中通常使用的方法精制分離DNA，例如，把得到的噬菌體等懸濁在TM溶液(含有10mM MgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液、pH7.8)等中用DNaseI以及RNase A等處理后、加入20mM EDTA、50μg/ml蛋白酶K以及0.5％SDS混合液等，在約65℃保溫約1小時后，將其用苯酚提取二乙醚提取后，用乙醇沉淀使DNA沉淀，然后把得到的DNA用70％乙醇洗滌后干燥，溶解在TE溶液(含有10mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液、pH8.0)中等獲得。另外，作為目的DNA，也可以通過亞克隆等大量獲得，例如亞克隆可以使用作為宿主的大腸菌，使用質粒載體等進行。通過這樣的亞克隆得到的DNA也可以與上述同樣地利用離心分離、酚提取、醇沉淀等的方法進行精制分離。
本說明書中，得到的PCR產物等的核酸(包括DNA)通常置于1～2％瓊脂糖凝膠電泳中，作為特異的帶從凝膠中切出，例如，使用genecleankit(Bio 101)等的市售的提取試劑盒進行提取。被提取的DNA用適當的限制酶切斷，根據需要進行精制處理，或者進一步根據需要，把5′末端用T4多核苷酸激酶等進行磷酸化后，連接到pUC18等的pUC系載體這樣的適當的質粒載體上，轉化適當的感受態(tài)細胞。被克隆的PCR產物解析其堿基序列。PCR產物的克隆，可以使用例如，p-Direct(Clontech社)，pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene社)，pGEM-T(Promega社)，pAmpTM(Gibco-BRL社)等的市售的質粒載體。為了宿主細胞的形質轉換，使用例如噬菌體載體，或者用鈣法、銣/鈣法、鈣/鎂法、TFB高效率法、FSB凍結感受態(tài)細胞法、迅速集落法、電穿孔等該領域中公知的方法或者與其基本上同樣的方法進行(D.Hanahan，J.Mol.Biol.，166557，1983等)。為了分離目的DNA，可以適當使用逆轉錄PCR(polymerase chain reaction coupledreverse transcription；RT-PCR)、RACE(rapid amplification ofcDNA ends)。RACE可以根據例如，M.A.Innis et al.ed.，″PCRProtocols″(M.A.Frohman，″a guide to methods andapplications″)，pp.28-38，Academic Press，New York(1990)等中記載的方法進行。
DNA可以根據需要進行克隆，可以利用例如質粒、λ噬菌體、粘粒、P1噬菌體、F因子、YAC等。優(yōu)選舉出λ噬菌體來源的載體，可以利用例如Charon 4A，Charon 21A，λgt10，λgt11，λDASHII，λFIXII，λEMBL3，λZAPIITM(Stratagene社)等。另外，對得到的DNA整合到如下述詳細說明地那樣的適當的載體，例如，質粒pEX，pMAMneo，pKG5等的載體中，下述詳細說明的適當的宿主細胞，例如，可以在大腸菌、酵母、CHO細胞、COS細胞等中使其表達。另外，該DNA片斷可以直接或者作為添加了適當的控制序列的DNA片斷，或者整合到適當的載體中，然后導入動物中，可以制作表達規(guī)定的基因的轉基因動物。作為動物，可舉出哺乳動物，例如，可舉出小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、牛等。優(yōu)選在小鼠等的動物的受精卵中導入該DNA片斷，可以制作轉基因動物。使該外來基因轉染，使用適于293T細胞、COS-1細胞等的轉染的動物細胞等進行規(guī)定的基因產物的確認。
作為把外來基因導入到哺乳動物等的動物細胞中的方法，可以用該領域中公知的方法或者與其基本上同樣的方法進行，例如舉出磷酸鈣法(例如，F(xiàn).L.Graham et al.，Virology，52456，1973等)、DEAE-右旋糖酐法(例如，D.Warden et al.，J.Gen.Virol.，3371，1968等)、電穿孔法(例如，E.Neumann et al.，EMBOJ，1841，1982等)、微量注射法、脂質體法、病毒感染法、噬菌體粒子法等。把這樣轉染了規(guī)定的基因的動物細胞所產生的基因產物也可以將其進行解析。
作為整合規(guī)定的基因等(本發(fā)明中得到的DNA等)的質粒，只要在基因工學的中常用的宿主細胞(例如，大腸菌、枯草菌等的原核細胞宿主、酵母、293T細胞、CHO細胞、COS細胞等的真核細胞宿主、Sf21等的昆蟲細胞宿主)中該DNA可以表達的質粒，可以是任何的質粒。當然，也可以使用添加到市售的試劑盒和試藥中的質粒進行選擇。這樣的序列內，例如可以包含為了在選擇的宿主細胞中表達，進行了適當修飾的密碼子，也可以設計限制酶部位，可以包含為了容易表達目的基因的表達控制序列、調節(jié)序列等、對結合目的基因有利的聯(lián)結子、轉接物等、進一步控制抗生物質耐性等，或者控制代謝，或對選擇等有用的序列(還包括編碼雜合蛋白質和融合蛋白質的序列)等。優(yōu)選適當的啟動子，例如把大腸菌為宿主的質粒中，使用色氨酸啟動子(trp)、乳糖啟動子(lac)、色氨酸■乳糖啟動子(tac)、脂蛋白質啟動子(lpp)、λ噬菌體PL啟動子等，在把動物細胞為宿主的質粒中可以使用SV40后期啟動子、MMTV LTR啟動子、RSV LTR啟動子、CMV啟動子、SR α啟動子等，在以酵母為宿主的質粒中，可以使用GAL1、GAL10啟動子等。進一步也可以使用CYC1，HIS3，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，EN0，TP1，AOX1等的調控系統(tǒng)。
為了促進編碼期望多肽的DNA的轉錄，可以將強化因子插入載體，作為這樣的強化因子，具有使啟動子活動，促進轉錄的作用，通?？膳e出約10～100bp具有cis作用的組件。很多強化因子由珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白質、胰島素等的哺乳動物基因中得知。代表性地，從真核細胞感染性病毒獲得的強化因子可以適合地使用，例如可以舉出復制起點的晚期區(qū)中存在的SV40強化因子(100-270bp)，巨細胞病毒的初期啟動子的強化因子，多瘤的復制起點的晚期區(qū)中存在的強化因子，腺病毒的強化因子等的例子。另外，根據需要，還可以使用添加宿主中所具有的信號序列，這些可以使用從業(yè)者熟知的強化因子。
作為以大腸菌為宿主的質粒，可舉出例如pBR322、pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pSP64，pSP65，pTZ-18R/-18U，pTZ-19R/-19U，pGEM-3，pGEM-4，pGEM-3Z，pGEM-4Z，pGEM-5Zf(-)，pBluescriptKSTM(Stratagene社)等。作為適合在大腸菌中表達的質粒載體，也可舉出例如pAS，pKK223(Pharmacia社)，pMC1403，pMC931，pKC30，pRSET-B(Invitrogen社)等。作為以動物細胞為宿主的質粒，可舉出例如SV40載體、多瘤■病毒載體、痘苗■病毒載體、逆轉錄病毒載體等，具體地，可舉出pcD，pcD-SRα，CDM8，pCEV4，pME18S，pBC12BI，pSG5(Stratagene社)等。作為以酵母為宿主的質粒，可舉出YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YCp型載體等，例如pGPD-2等。作為宿主細胞，宿主細胞為大腸菌的場合，可舉出例如來源于大腸菌K12株的宿主細胞，例如NM533，XL1-Blue，C600，DH1，DH5，DH11S，DH12S，DH5α，DH10B，HB101，MC1061，JM109，STBL2，作為B834株來源，可舉出BL21(DE3)pLysS等。作為細菌中的表達系，可以參照例如，Chang et al.，Nature(1978)275615；Goeddel et al.，Nature(1979)281544；Goeddel et al.，Nucleic Acid Res.，(1980)84057；EP36,776，美國專利第4,551,433號說明書；deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)8021-25；Siebenlist et al.，Cell(1980)20269等中的記載。在宿主細胞為酵母的場合，可舉出例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Schizosaccharomycesprombe，Pichia pastoris，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)株，Candida，Trichoderma reesia，其它的酵母株等。作為酵母中的表達系，可參照例如，Hinnen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)751929；Ito et al.，J.Bacteriol.(1983)153163；Kurtz etal..Mol.Cell.Biol.(1986)6142；Kunze et al.，J.BasicMicrobiol.(1985)25141；Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.(1986)1323459；Roggenkamp et al.，Mol.Gen.Genet(1986)202302；Das et al.，J.Bacteriol.(1984)1581165；De Louvencourtet al.，J.Bacteriol.(1983)154737；Van den Berg et al.，Bio/Technology(1990)8135；Kunze et al.，J.Basic Micr Biol.(1985)25141；Cregg et al.，Mol.Cell.Biol.(1985)53376；美國專利第4,837,148號說明書，同第4,92 9,555號說明書；Beachand Nurse，Nature(1981)300706；Davidow et al.，Curr.Genet.(1985)10380；Gaillardin et al.，Curr.Genet.(1985)1049；Ballance et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112284-289；Tilburn et al.，Gene(1983)2620 5-221；Yalton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)811470-1474；Kelly andHynes，EMBO J.，(1985)4475479；EP244,234；WO91/00357等中記載的表達系。
宿主細胞是動物細胞的場合，可舉出例如非洲灰長尾猴成纖維細胞來源的COS-7細胞、COS-1細胞、CV-1細胞、人腎細胞來源293細胞、人表皮細胞來源A431細胞、人結腸來源205細胞、小鼠成纖維細胞來源的COP細胞、MOP細胞、WOP細胞、中國倉鼠細胞來源的CHO細胞、CHO DHFR-細胞、人HeLa細胞、小鼠細胞來源C127細胞、小鼠細胞來源NIH3T3細胞、小鼠L細胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat細胞、其它的轉化得到的細胞系、通常的二倍體細胞、由體外的一次培養(yǎng)組織誘導的細胞株等。哺乳動物表達可以參照例如，Dijkema etal.，EMBOJ.(1985)4761；Gorman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)796777；Boshart et al.，Cell(1985)41521；美國專利第4,399,216號說明書；Ham and Wallace，Methods inEnzymology(1979)5844；Barnes and Sato，Anal.Biochem.(1980)102255；美國專利第4,767,704號說明書；同第4,657,866號說明書；同第4,927,762號說明書；同第4,560,655號說明書；WO90/103430；WO87/00195；美國專利第RE30,985號說明書等中記載的方法。作為昆蟲細胞，可舉出把蠶核多角體病病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus)、來源于它的病毒或者其它的適宜病毒作為載體，使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊)，Drosophila melangaster(fruitfly)，蠶幼蟲或者蠶培養(yǎng)細胞、例如BM-N細胞等(例如，Luckow et al.，Bio/Technology，6，47-55(1988)；Setlow，J.K.et al.(eds.)，Genetic Engineering，Vol.8，pp.277-279，Plenum Publishing，1986；Maeda et al.，Nature，315，pp.592-594(1985))。對于在昆蟲中的異種基因的表達，可以參照例如，美國專利第4,745,051號說明書；Friesen et al.(1986)，“TheRegulation of Baculovirus Gene Expression”，The MolecularBiology of Baculoviruses(W.Doerfler(Ed))；EP127,839；EP155,476；Vlak et al.，J.Gen.Virol.，(1988)69765-776；Miller et al.，Ann.Rev.Microbiol.(1988)42177；Carbonellet al.，Gene(1988)73409；Maeda et al.，Nature，(1985)315592-594；Lebacq-Verheyden et al.，Mol.Cell.Biol.(1988)83129；Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)828404；Miyajima et al.，Gene(1987)58273；Martin et al.，DNA(1988)799等中記載的。進一步，對于多數的桿狀病毒株以及變體以及宿主來源所對應的容許昆蟲宿主細胞，可以參照例如，Luckow et al.，Bio/Technology(1988)647-55；Miller et al.，GenericEngeneering(Serlow，J.K.et al.(Ed))Vol.8(PlenumPublishing，1986)pp.277-279；Maeda et al.，Nature(1985)315592-594等中記載的細胞。
利用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)等，也可以使用以植物細胞為宿主細胞，還有適于它們的載體，這些是該領域中廣為人知的。在本發(fā)明的基因工學的手法中，可以使用該領域中已知的或者通用的限制酶、逆轉錄酶、對為了適應克隆DNA片斷的結構進行修飾或者使用用于變換的酶DNA-修飾■分解酶、DNA聚合酶、末端轉核苷酸酶、DNA連接酶等。作為限制酶，可舉出例如，R.J.Roberts，Nucleic Acids Res.，13r165，1985；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York，1982；R.J.Roberts，D.Ma celis，Nucleic Acids Res.，19Suppl.2077，1991等中所述的酶。
根據本發(fā)明，用含有編碼多肽(或者蛋白質)的核酸的表達載體進行轉化的轉化體，根據需要，使用造當的選擇標記，進行反復克隆，由此可以得到具有穩(wěn)定高的表達能力的細胞株。例如，在作為宿主細胞使用動物細胞的轉化體中，通過利用dhfr基因作為選擇標記的場合，慢慢提高MTX濃度進行培養(yǎng)，選擇耐性株，使編碼本發(fā)明的多肽的DNA擴增，可以得到有更高表達的細胞株。本發(fā)明的轉化體可以在編碼本發(fā)明的多肽的核酸能表達的條件下進行培養(yǎng)，生成目的物并使其蓄積。該轉化體可以在該領域中通用的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，以大腸菌、枯草菌等的原核細胞宿主、酵母等作為宿主的轉化體可以優(yōu)選使用液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中，為該轉化體的發(fā)育，使其含有必要的碳源、窒素源、無機物等。作為碳源，可舉出例如葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等，作為窒素源，可舉出例如銨鹽類、硝酸鹽類、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、麥芽提取物、大豆粕、馬鈴薯提取液等的無機或者有機物質，作為無機物，可舉出例如，氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂、碳酸鈣等。另外，也可以添加酵母、維生素類、酪蛋白氨基酸、生長促進因子等。另外，根據需要，為了提高啟動子的效率，可以添加例如，3β-吲哚基丙烯酸酸這樣的藥劑。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約5～約8。
例如是大腸菌的情況下培養(yǎng)通常約15～約45℃下進行約3～約75小時，根據需要，也可以通氣或者攪拌。在培養(yǎng)宿主為動物細胞的轉化體時，作為培養(yǎng)基，使用例如含有約5～約20％的胎兒牛血清的MEM培養(yǎng)基、PRMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等。pH優(yōu)選為約6～約8。培養(yǎng)通常在約30～約40℃進行約15～約72小時，根據需要，施加通氣或攪拌。表達規(guī)定的基因產物的轉化體可以直接利用，也可以利用其細胞勻漿，也可以分離規(guī)定的基因產物進行使用。從上述培養(yǎng)細胞提取時，可以適當采用培養(yǎng)后用公知的方法收集菌體或者細胞，將其懸浮在適當的緩沖液中，通過超聲波、溶菌酶以及/或者凍結融解等破壞菌體或者細胞，之后通過離心分離或者過濾得到粗提取液的方法等。在緩沖液中也可以加入尿素或者鹽酸胍等的蛋白質變性劑，或者Triton X～100(商品名)、Tween-20(商品名)等的表面活性劑。在培養(yǎng)液中分泌目的生成物的場合，在培養(yǎng)結束后，采用其本身公知的方法分離菌體或者細胞與上清，收集上清。
這樣得到的培養(yǎng)上清、或者提取液中所含的目的生成物可以適當組合自身公知的分離■精制法進行其精制，例如硫酸銨沉淀法等的鹽析、利用Sephadex等的凝膠過濾法、例如使用具有二乙基氨基乙基或者羧甲基等的擔載體等的離子交換柱色譜法、例如采用具有丁基、辛基、苯基等疏水性基的擔載體等的疏水性柱色譜法、色素凝膠色譜法、電泳法、透析、超過濾法、親合色譜法、高效液相色譜法等進行精制獲得。優(yōu)選聚丙烯酰胺凝膠電泳、固定配體等的親合色譜法等處理可以進行精制分離處理。作為該配體，可舉出含有特異性識別的單克隆抗體的抗體或者其片斷、凝集素、糖、結合配對的一種等。例如，可舉出免疫■親合色譜法、明膠-瓊脂糖■親合色譜法、肝素-瓊脂糖色譜法等。
進一步，得到的本發(fā)明的多肽(或者蛋白質)可以用化學手法對其所含有的氨基酸殘基進行修飾，也可以使用肽酶、例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、內肽酶、肽鏈端解酶等的酶進行修飾，或者部分分解得到其衍生物等。本發(fā)明的多肽在C末端通常為羧基(-COOH)或者羧酸根(-COO-)，C末端也可以是酰胺(-CONH2)或者酯(-COOR)。這里，作為酯的R，例如，采用甲基，乙基、正丙基、異丙基或者正丁基等的C1-6烷基、例如，環(huán)戊基、環(huán)己基等的C3-8環(huán)烷基，例如，苯基、α-萘基等的C6-12芳基、例如，芐基、苯乙基等的苯基-C1-2烷基或者α-萘甲基等的α-萘基-C1-2烷基等的C7-14芳烷基，此外采用作為經口用酯常用的特戊酰氧甲酯等。本發(fā)明的蛋白質在C末端以外具有羧基(或者羧酸根)的場合，羧基被酰胺化或者酯化的物質含在本發(fā)明的多肽中。作為該場合的酯，使用例如上述的C末端的酯等。
進一步，本發(fā)明的多肽(或者蛋白質)還包括，在上述的多肽中，N末端的蛋氨酸殘基的氨基被保護基(例如，甲酰基、乙酰基等的C1-5烷基-羰基等的C1-6?；?保護的物質、N端側在生體內被切斷生成的谷氨酰胺基被焦谷氨酰胺化的物質、分子內的氨基酸的側鏈上的取代基(例如，-OH、-COOH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)用適當的保護基(例如，甲酰基、乙?；鹊腃1-6酰基等)保護的物質、或者結合了糖鏈的所謂的糖蛋白質等的復合蛋白質等。
進一步，通過把本發(fā)明的基因的堿基序列作為基礎，用基因工學上常用的方法，可以在規(guī)定的多肽的氨基酸序列中分別進行適當的1個至多個以上的氨基酸的取代、缺失、插入、轉移或者添加，制造與引入變異相當的多肽。作為這樣的變異■變換■修飾法，可舉出例如日本生化學會編、“續(xù)生化學實驗講義1、基因研究法II”、p105(廣瀨進)、東京化學同人(1986)；日本生化學會編 “新生化學實驗講義2、核酸III(重組DNA技術)”、p233(廣瀨進)、東京化學同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.154，p.350 & p.367，Academic Press，New York(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.100，p.457 &p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells et al.，Gene，34315，1985；T.Grundstroem et al.，Nucleic Acids Res.，133305，1985；J.Taylor et al.，Nucleic Acids Res.，138765，1985；R.Wu ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，Gene，44177，1986等中所述的方法。可舉出例如利用合成寡聚核苷酸等的利用的位置指定變異導入法(部位特異性的變異導入法)(Zoller etal.，Nucl.Acids Res.，106487，1987；Carter et al.，Nucl.AcidsRes.，134331，1986)，盒式變異導入法(cassettemutagenesisWells et al.，Gene，34315，1985)，限制部位選擇變異導入法(restriction selection mutagenesisWells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London Ser A，317415，1986)，丙氨酸■掃描法(Cunningham & Wells，Science，2441081-1085，1989)，PCR變異導入法，Kunkel法，dNTP[αS]法(Eckstein)，采用亞硫酸或者亞硝酸等的區(qū)域指定變異導入法等的方法。
另外，用基因重組法制造時，也可以使表達為融合多肽(融合蛋白質)，在生體內或者生體外，變換■加工成具有與期望的多肽基本上同等的生物學活性的多肽?；蚬W上可以使用常用的融合產生法，也可以將這樣的融合多肽利用其融合部通過親合色譜法等進行精制。作為這樣的融合多肽，可舉出融合在組氨酸標簽上的多肽、或者、融合在β-半乳糖苷酶(β-gal)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)，谷光苷肽-S-轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(TRX)或者Cre重組酶的氨基酸序列上的多肽等。同樣地，多肽也可以通過添加異種抗原表位的標簽，使用對該抗原表位特異性結合抗體的免疫親合色譜法進行精制來獲得。在更優(yōu)選地實施方式中，作為多組氨酸(poly-His)或者多組氨酸-甘氨酸(poly-His-Gly)標簽、以及該抗原表位標簽，可舉出例如AU5，c-Myc，CruzTag09，CruzTag22，CruzTag41，Glu-Clu，HA，Ha.11，KT3，F(xiàn)LAG(登錄商標，Sigma-Aldrich)，Omni-探針，S-探針，T7，LexA，V5，VP16，GAL4，VSV-G等(Field et al.，Molecular and CellularBiology，8pp.2159-2165(1988)；Evan et al.，Molecular andCellular Biology，5pp.3610-3616(1985)；Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6)pp.547-553(1990)；Hopp et al.，Bio Technology，6pp.1204-1210(1988)；Martin et al.，Science，255pp.192-194(1992)；Skinner et al.，J.Biol.Chem.，266pp.15163-15166(1991)；Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87pp.639 3-6397(1990)等)。也可以利用采用酵母的雙雜交法。
進一步，作為融合多肽，還可以是附加了作為能檢測出的蛋白質這樣的標記。更優(yōu)選的實施方式中，該能檢測的標記可以是生物素/抗生物素蛋白鏈菌素系的Biotin Avi標記、發(fā)出熒光的物質等。作為該發(fā)出熒光的物質，可舉出多管水母屬(Aequorea victorea)等的發(fā)光水母來源的綠色熒光蛋白質(green fluorescent proteinGFP)、將其改變的突變體(GFP變種)、例如，EGFP(Enhanced-humanizedGFP)，rsGFP(red-shift GFP)，黃色熒光蛋白質(yellow fluorescentproteinYFP)，綠色熒光蛋白質(green fluorescent proteinGFP)，紅色熒光蛋白質(cyan fluorescent proteinCFP)，藍色熒光蛋白質(blue fluorescent proteinBFP)，ウミシイタケ(Renillareniformis)來源的GFP等(宮腋敦史編、實驗醫(yī)學別冊后基因組時代的實驗講義3-GFP和Bioimaging、羊土社(2000年))。另外，也可以使用特異性識別上述融合標簽的抗體(包括單克隆抗體以及其片斷)進行檢測。這樣的融合多肽的表達以及精制可以使用適于其的市售的試劑盒進行，也可以通過試劑盒制造業(yè)者或者試劑盒販賣業(yè)者根據清楚寫明的操作說明進行實施。
作為獲得的蛋白質(也包含肽或者多肽)用酶免疫測定法等公知的手法將其結合在適當的擔載體或者固定相上進行固定化。固定相蛋白質、固定相肽可以便利地用于結合分析和物質的篩選。
多肽和蛋白質的結構的修飾■改變等可以參考例如日本生化學會編、“新生化學實驗講義1、蛋白質VII、蛋白質工學”、東京化學同人(1993)，用其中所述的方法或者其中引用的文獻中所述的方法，進一步與其基本上同樣的方法進行。另外，如下述，其生物學活性中，也包括具有免疫上的活性、例如抗原性。該修飾■改變，可以是脫氨基化、羥基化、羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙酰化等?；Ⅴセ?、酰胺化、開環(huán)、閉環(huán)、糖基化、改變含有糖鏈的種類、增減含有糖鏈的數目、脂質結合、取代為D-體氨基酸殘基等。這些方法在該領域是已知的方法(例如，T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，pp.79-86W.H.Freeman &Co.，San Francisco，USA(1983)等)。
利用本發(fā)明的半乳凝素8變體，可以篩選促進或抑制該半乳凝素8的規(guī)定生物學活性等功能(例如、血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、細胞傷害活性、凋亡誘導活性、LPS誘導的炎癥抑制的活性、LPS誘導的TNF-α、IL-12、和/或IFN-γ生產抑制活性、內毒素休克抑制活性、抑制惡性細胞轉移的活性等)的化合物(激動劑或拮抗劑)或它們的鹽。這意味著也提供該篩選試劑。因此，也可提供利用本發(fā)明中闡明的該半乳凝素8蛋白質等多肽、其一部分的肽或它們的鹽表現(xiàn)出的活性，就各種各樣的物質篩選促進或抑制本發(fā)明的該半乳凝素8蛋白質、其一部分的肽或它們的鹽等表現(xiàn)出的生物學活性等規(guī)定功能的化合物(激動劑或拮抗劑)或它們的鹽的篩選方法。
在該篩選中，對例如(i)使適當的試驗樣品與半乳凝素8變體蛋白質、其肽的一部分或它們的鹽(也可以包括表達該蛋白質的轉化體，以下同樣)等接觸的情形和(ii)在本發(fā)明的蛋白質、其肽的一部分或它們的鹽等中不存在關注試驗樣品情形進行比較。具體來說，在上述篩選中對該生物學活性(例如、有關各半乳凝素8蛋白質與生體成分之間相互作用的活性等)進行測定、比較。
在該篩選系也可以存在便于測定的那樣適當的檢測用底物。作為該底物，只要是可在測定中有效利用無論什么樣底物都可以。例如、可以選用眾所眾所周知的底物，優(yōu)選是使用合成的化合物等。底物可以直接使用，優(yōu)選是用熒光素等熒光、酶或放射性物質標記的底物。
作為試驗試樣，例如蛋白質、肽、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產物、植物提取物、動物等組織提取物、細胞提取物等。在試驗樣品中可使用的試驗化合物的例子中，優(yōu)選是含有抗半乳凝素抗體、酶抑制劑、細胞因子、具有各種抑制劑活性的化合物、特別是合成化合物等。這些化合物無論是新的化合物，還是眾所周知的化合物都可以。該篩選可以根據通常的結合活性或酶活性的測定法實施，例如可以參考該領域中眾所周知的方法等進行。另外可使用各種標記、緩沖液等其它合適的試劑等，根據在此說明的操作等進行。使用肽等可用活化劑處理，或預先將其前體或潛在活性型變換為活性型肽。測定通常可以在Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液等對反應不產生壞影響那樣的緩沖液中，例如、在pH約4～約10(優(yōu)選pH約6～約8)中進行。當在進行各個篩選時，優(yōu)選是通過各個方法的通常條件、操作法以及從業(yè)者通常技術考慮，構建與本發(fā)明的該半乳凝素8蛋白質或基本上與其具有同等活性的多肽或肽有關的測定系。有關這些一般的技術手段的詳細情況可以參照綜述、參考書等〔例如參照Methods in Enzymology，Academic Press社(USA)發(fā)行〕等)。
在本說明書中，半乳凝素8變體的活性指的是以下說明的活性。
半乳凝素8變體的有關細胞因子活性、細胞增殖活性(誘導或抑制活性)或細胞分化活性(誘導或抑制活性)、特定的細胞集團中的其它細胞因子的產生誘導活性可以進行試驗。人們已經了解了許多因子依賴性細胞增殖分析，例如，32D，DA2，DA1G，T10，B9，B9/11，BaF3，MC9/G，M+(preB M+)，2E8，RB5，DA1，123，T1165，HT2，CTLL2，TF-1，Mo7e，CMK等用于細胞株的分析。作為有關T細胞或胸腺細胞增殖活性的分析，對此沒有限定，例如John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，Warren Strober(Ed.)，Current Protocols in Immunology(以下、簡單稱為″J.E.Coliganet al.(Ed.)，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.″)(Chapter 3″In Vitro assays for Mouse LymphocyteFunction(3.1-3.19)″；Chapter 7″Immunologic studies inHumans″)，John Wiley & Sons，Inc；Takai et al.，J.Immunol.，1373494-3500(1986)；Bertagnolli et al.，J.Immunol.，1451706-1712(1990)；Bertagnolli et al.，Cellular Immunology，133327-341(1991)；Bertagnolli et al.，J.Immunol.，1493778-3783(1992)；Bowman et al.，J.Immunol.，1521756-1761(1994)所述的分析。作為有關脾臟細胞、淋巴節(jié)細胞和胸腺細胞的細胞因子生產和/或增殖活性的分析，對此沒有限定，例如J.E.Coligan et al.(Ed.)，Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons，Inc.(Chapter 3″In Vitro assays for MouseLymphocyte Function--Proliferative Assays for T Cell Function″and Chapter 6 ″Cytokines and Their CellularReceptors--Measurement of mouse and human Interferon γ″)所述的分析。作為有關造血性細胞和淋巴細胞產生性細胞的增殖和分化活性的分析，對此沒有限定，例如J.E.Coligan et al(Ed.)，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.(Chapter 6 ″Cytokines and Their CellularReceptors--Measurement of Human and Murine Interleukin 2 andInterleukin 4；--Measurement of mouse and human inter leukin 6；--Measurement of human Interleukin 11；--Measurement of mouseand human Interleukin 9)；deVries et al.，J.Exp.Med.，1731205-1211(1991)；Moreau et al.，Nature，336690-692(1988)；Greenberger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，802931-2938(1983)；Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，831857-1861(1986)中所述的分析。作為有關針對抗原的T細胞克隆的應答性的分析(特別是包括測定其增殖和細胞因子產生后，鑒定APC-T細胞相互作用和直接作用于T細胞的蛋白質)，對此沒有限定，例如J.E.Coligan et al.(Ed.)，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.(Chapter 3″In Vitro assays for MouseLymphocyte Function″；Chapter 6″Cytokines and Their CellularReceptors″；Chapter 7 ″Immunologic studies in Humans″)；Weinberger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，776091-6095(1980)；Weinberger et al.，Eur.J.Immun.，11405-405(1981)；Takai et al.，J.Immunol.，1373494-3500(1986)；Takai et al.，J.Immunol.，140508-512(1988)中所述的分析。
半乳凝素8變體的有關免疫刺激或抑制活性可以試驗?？梢栽囼瀸τ诟鞣N免疫缺陷和免疫障礙(包含重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID))的處置中的活性，例如，T和/或B淋巴細胞增殖的調節(jié)(正調節(jié)或負調節(jié))中的活性、以及NK細胞和其它細胞群發(fā)揮細胞溶解活性時半乳凝素8變體是否有活性。當該免疫缺陷可以是遺傳性的、或病毒(例如、HIV)以及由細菌或真菌感染引起的、以及由自身免疫障礙產生的。更具體講，其中也可以包括病毒、細菌、真菌或其它感染癥引起的感染性疾病(也包括HIV、肝炎病毒、皰疹病毒、分支桿菌、瘧疾等引起的感染和念珠菌癥那樣的各種各樣的真菌感染癥)。另外當象需要對免疫系進行刺激那樣的場合，也可以包括例如癌的治療等情況。作為該自身免疫障礙，例如、結締組織疾病、多發(fā)性硬化癥、全身性紅斑狼瘡、慢性風濕性關節(jié)炎、自身免疫性肺炎、急性熱病性多神經炎、自身免疫性甲狀腺炎、胰島素依賴性糖尿病、重癥肌無力癥、對宿主性移植片病、自身免疫性炎癥性眼病等。另外也可包括哮喘(特別是變態(tài)性哮喘)和其它的所謂呼吸道系統(tǒng)的疾病的變態(tài)反應和變態(tài)性癥狀的處置中的活性試驗。也包括希望對免疫進行抑制那樣的針對其它癥狀(例如、包含器官移植)的活性試驗。
半乳凝素8變體是否能夠進行免疫應答可以通過許多方法試驗。例如、負調節(jié)可以是對已經進行中的免疫應答進行抑制或封閉的方式，或包括防止免疫應答的誘導。通過抑制T細胞應答，或通過在T細胞中誘導特異的耐受性，或通過這兩個方面，都可以抑制活化T細胞的功能。一般來說，為了從免疫上抑制T細胞應答，需要使T細胞連續(xù)地接觸它的抑制因子那樣的、能動的而且是非抗原特異的過程。所謂耐受(包括T細胞中的非應答性或無反應性的誘導)一般來說是抗原特異的，在停止接觸耐受化因子后還持續(xù)這一點上與免疫抑制有區(qū)別。是否是該耐受性，在實際的操作中，當在耐受化因子不存在下，再度暴露于特異的抗原時，可通過觀察有無T細胞應答確認。在1個以上的抗原功能(并不限定于此，例如包含B淋巴細胞(例如B7那樣的)抗原功能)的負調節(jié)或抑制，例如由于活化T細胞導致的高水平的淋巴因子合成的抑制在組織、皮膚和器官移植的狀況以及對宿主性移植片病(GVHD)中是有用的。例如，如果抑制T細胞功能，應當可以減少組織移植中的組織破壞。代表性的情況，當移植組織時，移植片的排斥是通過T細胞將該組織片識別為外來物開始的，然后繼續(xù)破壞移植片那樣的免疫反應。如果在移植前給予可抑制或封閉B7淋巴細胞抗原和免疫細胞上的其天然配體(單個或多個)的相互作用的分子(具有B7-2活性的可溶性單體形態(tài)的肽單獨、或與其它的具有B淋巴細胞抗原(例如、B7-1、B7-3)活性的單體形態(tài)的肽或封閉抗體那樣的蛋白的組合)，可以導致分子與免疫細胞上的天然配體(單個或多個)分子結合，沒有傳遞對應的共同刺激信號。這樣一來如果對B淋巴細胞抗原功能進行封閉，可以阻止通過T細胞那樣的免疫細胞進行細胞因子合成，因此作為免疫抑制劑起作用。另外通過缺乏共同刺激也可以鈍化T細胞，由此有效地誘發(fā)對象物中的耐受性。通過B淋巴細胞抗原封閉劑引起的長期的耐受誘導可以避免反復給予該封閉劑的必要性。為了使靶受到充分免疫抑制或做到耐受，可能也需要對B淋巴細胞抗原組合功能進行封閉。
可以通過許多方法試驗半乳凝素8變體是否有、以及有多大程度的血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、LPS誘導導致的炎癥抑制活性、LPS誘導的TNF-α、IL-12、和/或IFN-γ的生產的抑制、內毒素休克抑制活性。而凋亡誘導活性測定法等可以參考田沼靖一監(jiān)修、“細胞工學別冊實驗操作說明系列、凋亡實驗操作說明”株式會社秀潤社、1995年1月20日(第1版第2刷)等，也可以使用市售的測定試劑盒。
在防止器官移植片排斥或GVHD時的特定封閉劑的效力可以使用對于預測人中效力有用的動物模型進行。作為可使用的適合的體系，例如大鼠的同種心臟移植片、小鼠的異種胰島細胞移植片等。就象Lenschow et al.，Science，257789-792(1992)和Turka et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8911102-11105(1992)所述那樣，為了研究在體內CTLA4Ig融合蛋白質的免疫抑制作用，兩者都使用。另外使用GVHD的小鼠模型(Paul(Ed.)，F(xiàn)undamental Immunology，Raven Press，New York，pp.846-847(1989))，也可以測定對于疾病發(fā)展的體內B淋巴細胞抗原功能封閉效果。而在自身免疫疾病的治療中對抗原功能進行封閉有時是有用的。很多自身免疫障礙是自身組織反應的結果，起因于與疾病有關的細胞因子和促進自身抗體產生的T細胞的不適當活化的結果。通過防止自身應答性T細胞的活化，可以減少或消除疾病的癥狀。通過借助于破壞B淋巴細胞抗原受體配體相互作用給予封閉T細胞的共同刺激那樣的藥劑，抑制T細胞活化，可以防止與疾病發(fā)展過程有關的那樣的自身抗體或來自T細胞的細胞因子的產生。另外通過封閉劑可以對能夠誘導長期減輕疾病那樣的自身反應性T細胞的抗原特異耐受性進行誘導成為可能。使用賦予對應于人的自身免疫疾病充分特征的很多動物模型，可以進行對于防止或改善自身免疫障礙的封閉劑的效力試驗。例如小鼠實驗的自身免疫性腦炎、MRL/lpr/lpr小鼠或NZB雜交小鼠的全身性紅斑狼瘡、小鼠自身免疫性膠原關節(jié)炎、NOD小鼠和BB大鼠的糖尿病、小鼠實驗的重癥肌無力癥等(Paul(Ed.)，F(xiàn)undamental Immunology，Raven Press，New York，840-856(1989)。另外，抗原功能(優(yōu)選是B淋巴細胞抗原功能)的正調節(jié)作為對免疫應答進行正調節(jié)的手段，治療上是有用的。免疫應答的正調節(jié)可以是增強已存的免疫應答的形態(tài)或誘起最初免疫應答的形態(tài)。例如，通過刺激B淋巴細胞抗原功能的免疫應答的增強對于病毒感染場合是有用的。另外通過全身給予刺激性形態(tài)的B淋巴細胞抗原，可以改善流感、通常的感冒、以及腦炎那樣的全身性病毒性疾病。抗原功能(優(yōu)選是B淋巴細胞抗原功能)的正調節(jié)或增強在腫瘤免疫性的誘導中也是有用的。例如，將使用編碼至少一種半乳凝素8變體的核酸轉染的腫瘤細胞(例如、肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、神經芽細胞瘤、癌瘤)給予靶后，研究是否可達到克服靶中的腫瘤特異耐受。
可以就半乳凝素8變體的造血調節(jié)活性進行試驗，進一步研究對于骨髓系或淋巴系細胞缺損癥的處置是否有用。適于研究造血細胞株的增殖和分化活性的分析法在該領域中已廣為人知，可以使用該分析法。有關胚胎干細胞的分化的分析(特別是對胚分化造血的作用)沒有限定，例如Johansson et al.，Cellular Biology，15141-151(1995)；Keller et al.，Molecular and Cellular Biology，13473-486(1993)；McClanahan et al.，Blood 812903-2915(1993)所述的分析法。有關干細胞的生存和分化(特別是對淋巴造血調節(jié)的作用)沒有限定，例如Methyleellulose eolony forming assays，F(xiàn)reshney，M.G.Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney等人編Vol 265-268頁，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY.1994；Hirayama等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895907-5911，1992；Primitive hematopoietic colony forming cells with highproliferative potential，MeNiece，I.K.和Briddell，R.A.Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney等人編Vol 23-39頁，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY.1994；Neben等人，Experimental Hematology 22353-359，1994；Cobblestone areaforming cell assay，Ploemacher，R.E.Culture of HematopoieticCells.R.I.Freshney等人編Vol 1-21頁，Wiley-Liss，Inc.，NewYork，NY.1994；Long term bone marrow cultures in the presenceof stromal cells，Spooncer，E.，Dexter，M.和Allen，T.Cultureof Hematopoietic Cells.R.I.Freshney等人編Vol 163-179頁，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY.1994；Long term cultureinitiating cell assay，Sutherland，H.J.Culture ofHematopoietic Cells.R.I.Freshney等人編Vol 139-162頁，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY.1994所述的內容。
有關半乳凝素8變體作為骨、軟骨、腱、韌帶和/或神經組織的成長或再生、以及創(chuàng)傷治愈和組織的修復和置換中使用的醫(yī)藥組合物，以及作為燙傷、裂傷和潰瘍的處置用劑的活性也可以進行研究。誘導骨不能正常形成那樣的狀態(tài)下的軟骨和/或骨的成長的活性在人和其它的動物的骨折和軟骨的損傷或欠損的治愈中是有用。有關半乳凝素8變體對于牙周病的處置和其它的牙修復加工的活性也可以進行試驗。誘引骨形成細胞，或刺激骨形成細胞的增殖，或誘導骨形成細胞的前體分化那樣的活性也可以研究。半乳凝素8變體存在著通過例如借助于骨和/或軟骨的修復的刺激，或封閉炎癥或炎癥過程介導的組織破壞的過程(膠原酶活性、破骨細胞活性等)在骨質疏松癥或骨關節(jié)炎的治療中表現(xiàn)出活性的可能性。另外，對于人和其它動物中的腱或韌帶的裂傷、變形和其它的腱或韌帶的損傷的治愈的活性也可以進行試驗。半乳凝素8變體對于神經細胞或神經組織的變性、死亡或與外傷有關的神經細胞的增殖以及神經和腦組織的再生，即對于中樞和末梢神經系疾病和神經障礙以及機械的和外傷性損傷的治療是否有活性也進行了試驗，更具體講，對末梢神經傷害、末梢神經障礙以及局部神經障礙那樣的末梢神經系疾病、和阿耳茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側索硬化癥和夏-德雷格綜合征那樣的中樞神經系疾病的活性進行研究。
可以試驗一個以上的有關半乳凝素8變體的整聯(lián)蛋白關聯(lián)活性、哺乳動物細胞(例如、包含單核細胞、成纖維細胞、嗜中性細胞、T細胞、肥大細胞、嗜酸性細胞、上皮細胞和/或內皮細胞)的趨化性/游走活性(包括粘附能力)、止血或血栓溶解活性、作為受體、受體配體或受體/配體相互作用的抑制劑或激動劑的活性、抗炎癥活性(包括與炎癥應答有關的細胞刺激活性)、LPS誘導的炎癥的抑制活性、LPS誘導的TNF-α、IL-12、和/或IFN-γ生產抑制的活性、內毒素休克抑制活性、包括抗腫瘤活性在內的與腫瘤有關的活性、下述的活性或效果包含細菌、病毒、真菌和其它寄生蟲(對此沒有限定)的感染性因子的增殖、感染或功能的抑制或殺傷；對包含身長、體重、體毛的色、眼的色、皮膚、肥瘦比(fat to lean ratio)或其它組織的色素沈著、或器官或身體部分的尺寸或形態(tài)(例如、豐胸或相反、骨的形態(tài)或形狀的變化)(不限定于這些)的身體特性的影響(抑制或增強)；對生物節(jié)律或心周期或節(jié)律的影響；對雄性或雌性對象的繁殖能力的影響；對攝取的脂肪、脂質、蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質、輔因子或其它營養(yǎng)因子或成分(單個或多個)的代謝、異化、同化、加工、利用、貯藏或排泄的影響；對包含食欲、性欲、應激、識別(包括識別障礙)、抑郁病(包括抑郁病性障礙)和暴力行為(不限定于這些)的行動特性的影響；提供鎮(zhèn)痛效果或減輕其它疼痛的效果；促進在造血系以外的系統(tǒng)的胚胎干細胞的分化和增殖；激素或內分泌活性；酶的場合、酶的缺損的修復和缺損相關疾病的處置；過剩增殖性障礙(例如、象牛皮癬)的治療；免疫球蛋白樣活性(例如、象與抗原或補體結合的能力)；以及疫苗組合物中作為抗原起作用后、引起對那樣的蛋白質或與那樣的蛋白質具有交差反應性的別的物質或物體的免疫應答的能力。
使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽是從上述試驗化合物，例如、肽、蛋白質、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等選出的化合物，是促進或抑制本發(fā)明蛋白質等功能的化合物。作為該化合物的鹽，例如藥學容許的鹽等。例如、與無機堿的鹽、與有機堿的鹽、與無機酸的鹽、與有機酸的鹽、與堿性或酸性氨基酸的鹽等。作為與無機堿的鹽的合適的例子，例如、鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽等堿土類金屬鹽、以及鋁鹽、銨鹽等。作為與有機堿的鹽的合適例子，例如與三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、環(huán)己胺、二環(huán)己胺、N，N′-二芐乙基二胺等的鹽。作為與無機酸的鹽的合適例子，例如、與鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等的鹽。作為與有機酸的鹽的合適例子，例如、與蟻酸、醋酸、丙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的鹽。作為與堿性氨基酸的鹽的合適例子，例如與精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等的鹽，作為與酸性氨基酸的鹽的合適例子，例如與天冬氨酸、谷氨酸等的鹽。
當作為醫(yī)藥成分使用本發(fā)明的活性成分〔例如、(a)當該半乳凝素8變體多肽、其肽的一部分或它們的鹽、以及相關的肽等、(b)編碼該半乳凝素8變體或其相關多肽的DNA等核酸等、(c)調控該半乳凝素8蛋白質的目的活性的化合物(促進或抑制■阻礙該半乳凝素8蛋白質的血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、細胞傷害活性、凋亡誘導活性、LPS誘導的炎癥的抑制活性、抑制LPS誘導的TNF-α、IL-12、和/或IFN-γ生產的活性、內毒素休克抑制活性、在不對正常細胞帶來壞影響下發(fā)揮規(guī)定效能的活性等現(xiàn)象，或促進或抑制和/或阻礙組織或蛋白質的變質■過剩生產或分解現(xiàn)象的生物學活性的化合物)或其鹽、調控該蛋白質產生的化合物或其鹽、(d)使用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的活性物質等〕時，通?？梢詥为毣蚺c藥理上容許的各種制劑補助劑混合后以醫(yī)藥組合物或醫(yī)藥制備物等給予。優(yōu)選是以適于經口給予、局部給予、或非經口給予等使用的制劑制備物的形態(tài)給予，也可以根據不同目的選用任意的給予方式(也包含吸入法、或直腸給予)給予。
而本發(fā)明的活性成分也可以與各種醫(yī)藥、例如抗腫瘤劑(抗癌劑)、腫瘤移轉抑制劑、血栓形成抑制劑、關節(jié)破壞治療劑、鎮(zhèn)痛劑、消炎劑、免疫調節(jié)劑和/或免疫抑制劑配合使用，只要是具有有利的作用，可以無限制地使用，例如可以從該領域中已知的制劑中選擇。
作為非經口給予方式，包含局部、經皮、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內或腹腔內給予，也可以直接給予到患部，在某些場合也是合適的。對于包括人在內的哺乳動物優(yōu)選是經口給予，或非經口方式(例如細胞內、組織內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、腹腔內、胸腔內、脊髓腔內、點滴法、注腸、經直腸、點耳、點眼和點鼻、涂布于牙、皮膚或粘膜等)給予。作為具體的制劑制備物的形態(tài)，如溶液制劑、分散制劑、半固形制劑、粉粒體制劑、成型制劑、浸出制劑等，例如、片劑、包衣片劑、包糖衣的制劑、丸劑、口含片、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊劑、埋入劑、粉末劑、散劑、顆粒劑、細粒劑、注射劑、液劑、酏劑、乳劑、灌注劑、糖漿制劑、水劑、乳劑、懸濁劑、擦劑、洗劑、氣霧劑、噴霧劑、吸入劑、噴霧劑、軟膏制劑、硬膏制劑、貼劑、糊劑、泥敷劑、乳膏劑、油劑、栓劑(例如、直腸栓劑)、酊劑、皮膚用水劑、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、涂布劑、輸液劑、用于注射用液劑等的粉末劑、冷凍干燥制劑、凝膠制備品等。
醫(yī)藥用的組合物可以根據通常的方法做成制劑。例如，根據相應的需要，可以單獨或組合使用生理學認可的載體、醫(yī)藥容許的擔載體、佐劑、賦形劑、補形劑、稀釋劑、香味劑、香料、甜味劑、膨脹劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、pH調節(jié)劑、緩沖劑、表面活性劑、基劑、溶劑、填充劑、增量劑、溶解助劑、可溶化劑、等滲劑、乳化劑、懸濁劑、分散劑、增粘劑、凝膠化劑、硬化劑、吸收劑、粘合劑、彈性劑、增塑劑、崩解劑、噴射劑、保存劑、抗氧化劑、避光劑、保濕劑、緩和劑、抗靜電劑、鎮(zhèn)痛劑等，通過一起與本發(fā)明的蛋白質等混和，可以制造一般認可的制劑實施所要求的單位用量形態(tài)。
作為適于非經口給予的制劑，如活性成分和水或其它藥學上容許的溶劑的無菌溶液、或懸濁液劑等，例如注射劑等。一般來說，水、鹽水、葡萄糖水溶液、其它相關的糖溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等二醇類可作為優(yōu)選的注射劑用液體載體。在制備注射劑時，通過使用象蒸餾水、林格液、生理鹽水那樣的載體、適當的分散劑或濕化劑和懸濁化劑等，利用在該領域中已知的方法制備成每次可注射的溶液、懸濁液、乳劑形態(tài)。
作為注射用水性液，例如生理鹽水、含有葡萄糖糖或其它補助藥(例如、D-山梨糖醇、D-甘露醇、鹽化鈉等)的等滲液等，也可以與藥理上容許的適當的溶解助劑、例如醇(例如乙醇等)、聚醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性表面活性劑(例如聚山梨酸酯80TM，HCO-50等)等并用。作為油性液，如芝麻油、大豆油等，也可以與作為溶解助劑的苯甲酸芐酯、苯甲醇等并用。另外也可以配合緩沖劑(例如、磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液等)或用于浸透壓調節(jié)的試劑、鎮(zhèn)痛劑(例如、烷基二甲基芐基氯化銨、鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(例如、人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如、苯甲醇、酚等)、抗壞血酸等抗氧化劑、吸收促進劑等。制備的注射液通常被填充到適當安瓿瓶。
對于非經口給予，加或不加表面活性劑和其它藥學上容許的助劑，做成象水、乙醇或油那樣的無菌的藥學上容許的液體中的溶液或懸濁液形態(tài)的制劑。作為制劑中使用的油性載體或溶劑，例如天然或合成或半合成的一或二或三甘油酯類，天然、半合成或合成的油脂類或脂肪酸類，例如花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如、該注射劑通常可以按照含有0.1～10重量％程度的本發(fā)明化合物那樣制備。
作為適于局部、例如口腔、或直腸使用的制劑，例如漱口劑、潔牙劑、口腔噴霧劑、吸入劑、軟膏劑、牙科填充劑、牙包被劑、牙糊劑、栓劑等。作為漱口劑、其它牙科用劑，可以使用藥理上容許的載體按照慣用的方法制備。作為口腔噴霧劑、吸入劑可以與本發(fā)明化合物本身或藥理上容許的非活性載體一起溶解于氣霧吸入或噴霧器用的溶液，或以吸入用微粉末給予牙等。軟膏劑可以通過添加通常使用的基劑、例如、軟膏基劑(白色凡士林、石蠟、橄欖油、聚乙二醇400、聚乙二醇軟膏等)等，按照慣用的方法制備。
涂布于牙、皮膚的局部涂布用的藥品可以制備成適當滅菌的水或非水賦形劑的溶液或懸濁液。作為添加劑，例如象亞硫酸氫鈉或依他酸二鈉那樣的緩沖劑；包含象醋酸或硝酸苯汞、烷基二甲基芐基氯化銨或洗必太那樣的殺菌和抗真菌劑的防腐劑和象羥丙甲纖維素的那樣的增稠劑。
栓劑可以使用在該領域中眾所周知的載體、最好是非刺激性的適當的賦形劑、例如聚乙烯二醇類、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等、優(yōu)選在常溫下為固體，而在腸道溫度下為液體，在直腸內融解釋放藥物的載體等，通過慣用的方法制備，通常含有0.1～95重量％左右本發(fā)明化合物。由于使用的賦形劑和濃度不同，藥品可以懸浮或溶解于賦形劑。象局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑那樣的補助藥可溶解于賦形劑。作為適于經口使用的制劑，例如象片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、顆粒劑、口含片那樣的固形組合物以及象液劑、糖漿制劑、懸濁劑那樣的液狀組合物等。制備制劑時可以使用在該領域中已知的制劑補助劑等。片劑和丸劑還可進一步進行包腸衣制造。當調劑單位形態(tài)是膠囊時，可以在上述類型的材料再含有象油脂那樣的液狀載體。
另外當活性成分為蛋白質或多肽時，由于聚乙二醇(PEG)在哺乳動物中毒性極低，所以與它結合特有用。而如果結合PEG，有時可以有效地減少異源化合物的免疫原性和抗原性。該化合物也可以加入到微膠囊裝置中。象PEG那樣的聚合物可以簡便地附著在附著于氨基末端的氨基酸的α-氨基、賴氨酸側鏈的ε-氨基、天冬氨酸或谷氨酸側鏈的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、或某種天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基的葡萄糖鏈的被活化的衍生物上。
已知存在著適于與蛋白質直接反應的許多已活化的形態(tài)的PEG。作為可用于與蛋白質的氨基反應的PEG試劑，如羧酸、羧酸衍生物的活性酯、特別是解離基為N-羥基琥珀酰亞胺、p-硝基苯酚、咪唑、或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸酯的PEG試劑。同樣含有氨肼或酰肼基的PEG試劑在與通過蛋白質中的過碘酸氧化生成醛的反應中是有用的。
本發(fā)明的診斷和治療通過對該哺乳動物進行診斷等開始實施，以便適合于包括哺乳動物表現(xiàn)出可能的特定自身免疫等的免疫有關的障礙■疾病、包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤、變態(tài)疾病、炎癥、LPS誘導的炎癥、LPS誘導的TNF-α、IL-12、和/或IFN-γ的生產上升、LPS誘導的內毒素休克。另外為了監(jiān)測治療的進行，和例如為了判斷在進行的治療中的給予量或給予次數那樣的參數是否要改變，作為治療步驟可以在治療期間繼續(xù)診斷。作為能夠有助于決定半乳凝素8變體治療藥給予的最適性那樣的診斷手法，如哺乳動物中半乳凝素8表達水平的分析、從自身免疫部位游離出的淋巴細胞等細胞與鄰近自身免疫部位的淋巴細胞等細胞之間的它們水平的比較、以及與炎癥部位附近的嗜中性細胞等細胞之間的這些細胞水平的比較等。要治療的哺乳動物的自身免疫疾病等障礙■疾病、包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤、變態(tài)疾病、炎癥等通過檢測細胞內的半乳凝素8抗原等可以進行監(jiān)測。該監(jiān)測可以包括使來自哺乳動物的樣品與半乳凝素8特異的抗體接觸，然后檢測抗體與樣品的結合。
基因治療用載體可以是把為了在哺乳動物中表達要遞送到哺乳動物的本發(fā)明的治療藥的含有編碼序列(例如、半乳凝素8變體編碼序列)的構建物(construct)進行遞送的載體，或是用于遞送包含以整個或部分半乳凝素8變體遞送的核酸序列的該構建物的載體，能夠以局部或全身任一種方法給予的載體。這些構建物在體內或離體方式可以利用通過病毒載體的途徑或非病毒載體形式途徑。為了表達這樣的編碼序列，可以通過使用內源性哺乳動物啟動子或異種啟動子進行誘導來進行。編碼序列在體內的表達可以是構建表達、或調節(jié)表達方式中的任一種。半乳凝素8變體在哺乳動物中表達時，可以以可溶性的半乳凝素8變體表達，在某些場合下也可以以前體型半乳凝素8變體表達。在兩種方式或其中的一種方式中，表達的產物可以是例如整個半乳凝素8變體、或半乳凝素8變體中有生物學活性的部分、變體、衍生物、或融合體等。
本發(fā)明提供能夠表達所要的半乳凝素8變體核酸序列的基因遞送載體。作為基因遞送載體，優(yōu)選病毒載體，更優(yōu)選逆病毒、腺病毒、腺(病毒)伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒、或甲病毒等病毒載體等。作為病毒載體，還有星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、細小病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒等病毒載體。有關該基因遞送載體一般可參照D.JoLLy，Cancer Gene Therapy，1(1)51-64(1994)；O.Kimura et al.，Human Gene Therapy，5845-852(1994)；S.Connelly et al.，Human Gene Therapy，6185-193(1995)；M.G.Kaplittetal.，Nature Genetics，8148-153(1994)等。
逆病毒載體，包括在該領域熟知的，例如B型、C型和D型逆病毒、嗜異性的逆病毒(例如、NZB-X1，NZB-X2，NZB9.1(參照R.R.O′Neill，J.Virol.，53100-106(1985))等)、多嗜性逆病毒(例如、MCF，MCF-MLV(參照M.Kelly，J.Virol.，45291-298(1983))等)、泡沫病毒、慢病毒等(參照R.L.Weissetal.(Eds.)，RNA TumorViruses，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，1985)的任意逆病毒基因治療載體都可以在本發(fā)明中使用。
基因治療逆病毒載體的一部可以是來自不同的逆病毒的部分。例如、逆病毒載體的LTR可以是來自小鼠肉瘤病毒的部分，而tRNA結合部位可以是來自羅斯肉瘤病毒的部位、包裝信號肽可以是來自鼠白血病病毒的信號肽，第二鏈合成起點可以是來自鳥白血癥病毒的起點。這些重組逆病毒載體在通過使它們導入適當的包裝細胞株，可使轉化的逆病毒載體粒子形成中使用(參照美國專利第5,591,624號說明書)。逆病毒載體可以通過使在逆病毒粒子內帶有稱為整合酶的、具有將目的DNA整合到宿主細胞DNA中特異部位的能力的整合酶構建。作為重組病毒載體優(yōu)選是復制能力缺損重組病毒。
作為適于與上述的逆病毒載體使用的包裝細胞株，如該領域中熟知的細胞株，而且容易制備(參照美國專利第6,013,517號說明書，WO92/05266)。該包裝細胞株可以使用用于制作產生重組體載體粒子的生產細胞株(載體細胞株，vector cell lineVCL)。包裝細胞株優(yōu)選是從人的母細胞(例如、HT1080細胞)或水貂的母細胞株制作，能夠做到在人血清中活化。
作為用于逆病毒基因治療載體構建的優(yōu)選的逆病毒，如人白血癥病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、水貂細胞灶形成病毒、鼠肉瘤病毒、網狀內皮組織增生病毒、羅斯肉瘤病毒等。作為鼠白血病病毒，特別優(yōu)選的例如、4070A和1504A(Hartley & Rowe，J.Virol.，1919-25(1976))、Abelson(ATCC No.VR-999)、Friend(ATCC No.VR-245)、Graffi，Gross(ATCC No.VR-590)、Kirsten、Harvey肉瘤病毒以及Rauscher(ATCC No.VR-998)、和Moloney小鼠白血病病毒(ATCC No.VR-190)等。
這樣的逆病毒可以從象American Type Culture Collection(ATCC，Rockville，Maryland，USA)那樣的委托機構或保存結構獲得，或使用通常可利用的技術從已知的供給源分離。
作為可在本發(fā)明使用的眾所眾所周知的逆病毒基因治療載體的例子，如GB 2200651，EP 0415731，EP 0345242，WO 89/02468，WO89/05349，WO 89/09271，WO 90/02806，WO 90/07936，WO 94/03662，WO 93/25698，WO 93/25234，WO 93/11230，WO 93/10218，WO 93/10218，WO 91/02805、美國專利第5,219,740號說明書、同第4,405,712號說明書、同第4,861,719號說明書、同第4,980,289號說明書、同第4,777,127號說明書、同第5,591,624號說明書、Vile，Cancer Res，533860-3864(1993)，Vile，Cancer Res，53962-967(1993)，Ra，Cancer Res，5383-88(1993)，Takamiya，J Neurosci Res，33493-503(1992)，Baba，J Neurosurg，79729-735(1993)，Mann，Cell 33153(1983)，Cane，Proc Natl Acad Sci USA，816349(1984)，Miller，Human Gene Therapy，15-14(1990)等所述的例子。
人的腺病毒基因治療載體也是在該領域中眾所周知的，可在本發(fā)明中使用，可以參照例如Berkne，Biotechniques，6616(1988)；Rosenfeld，Science，252431(1991)；WO 93/07283；WO 93/06223；WO 93/07282等。
作為可在本發(fā)明使用的已知的腺病毒基因治療載體的例子，如上述參考文獻所述的例子，以及例如、WO 94/12649；WO 93/03769；WO93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984；WO 95/00655；WO 95/27071；WO 95/29993；WO 95/34671；WO 96/05320；WO 94/08026；WO 94/11506；WO 93/06223；WO 94/24299；WO 95/14102；WO 95/24297；WO 95/02697；WO 94/28152；WO 94/24299；WO 95/09241；WO 95/25807；WO 95/05835；WO 94/18922；WO 95/09654等所述的例子。另外也可以象Curiel，Human Gene Therapy，3147-154(1992)所述那樣給予連接到滅活的腺病毒的DNA。
而作為本發(fā)明的基因遞送載體，如腺(病毒)伴隨病毒(AAV)載體。作為這樣的載體中可用于本發(fā)明的優(yōu)選例子，如象WO 93/09239公布的那樣的基于AAV-2的載體。作為最優(yōu)選的AAV載體，是含有2個AAV的末端反向重復序列的載體。該載體，天然的D序列通過核苷酸置換可以改變，其結果是可維持至少5個天然型的核苷酸和直至18個天然型核苷酸(優(yōu)選至少10個天然型核苷酸和直至18個天然型核苷酸、最優(yōu)選10個天然型核苷酸)，D序列剩余的核苷酸或缺失，或被非天然型的核苷酸置換。AAV末端反向重復區(qū)域的天然型的D序列是在各AAV末端反向重復序列中含有20個連續(xù)的核苷酸的序列(即，各末端存在1個序列)，該序列不參與HP形成。非天然型的置換的核苷酸可以是與在同一部位出現(xiàn)在天然型D序列中的核苷酸不同的任意的核苷酸。作為其它的可使用的AAV載體的例子，如pWP-19、pWN-1等(Nahreini，Gene，124257-262(1993))。作為這樣的AAV載體的另外的例子，如psub201等(Samulski，J.Virol.，613096(1987))。作為其它的AAV載體的例子，如Double-D ITR載體等。制作Double-D ITR的方法在美國專利第5,478,745號說明書已公開。此外AAV載體例如在美國專利第4,797,368號說明書、同第5,139,941號說明書、同第5,474,935號說明書、WO 94/288157號等已公開。作為可在本發(fā)明利用的AAV載體的另外例子，如SSV9AFABTKneo，該載體含有AFP增強子和白蛋白啟動子，而且趨向在肝臟優(yōu)先表達。該載體的構造和制作方法已公布在Su，Human Gene Therapy，7463-470(1996)。作為其它的AAV基因治療載體，如美國專利第5,354,678號說明書、同第5,173,414號說明書、同第5,139,941號說明書、同第5,252,479號說明書等報道的載體。
本發(fā)明的基因治療載體也可以是皰疹病毒載體。作為優(yōu)選的主要的皰疹病毒載體例子，如含有編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶多肽的序列的單純皰疹病毒載體(例如、美國專利第5,288,641號說明書和EP0176170公開的載體)。進一步，作為單純皰疹病毒載體的例子，如WO 95/04139等公布的HFEM/ICP6-LacZ，Geller，Sclence，2411667-1669(1988)、WO 90/09441、WO 92/07945等記載的pHSVlac，F(xiàn)ink，Human Gene Therapy，311-19(1992)記載的HSV Us3pgC-lacZ、EP 0453242A記載的HSV7134，2RH105和GAL4、以委托號ATCC VR-977和ATCC VR-260委托于ATCC的載體等。
在本發(fā)明中也可以使用甲病毒基因治療載體。作為優(yōu)選的甲病毒載體，如新培斯病毒載體、披膜病毒、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、委內瑞拉馬腦炎病毒((ATCC VR923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)、美國專利第5,091,309號、同第5,217,879號、和WO 92/10578報道的載體等。另外作為可使用的甲病毒載體，如美國專利第5,091,309號說明書、同第5,217,879號說明書、同第5,843,723號說明書、同第6,376,236號說明書、WO 94/21792、WO 92/10578、WO 95/07994等報道的載體。這樣的甲病毒可從ATCC(Rockville，Maryland，USA)那樣的委托機構或保存機構獲得，或使用一般可利用的技術，從已知的供給源分離。最好是使用可降低細胞傷害性的甲病毒載體(參照美國專利第6,391,632號說明書)。
DNA載體系(例如、真核生物級聯(lián)式表達系(eukarytic layeredexpression system)等)可用于表達本發(fā)明的半乳凝素8變體的核酸。有關真核生物級聯(lián)式表達系的詳細情況可參照WO 95/07994。作為本發(fā)明的真核生物階層型表達系優(yōu)選是來自于甲病毒載體的表達系，優(yōu)選的例如來自新培斯病毒載體的表達系。
作為適于本發(fā)明使用的其它病毒載體例如來自如下病毒的載體脊髓灰質炎病毒(例如、ATCC VR-58，Evans，Nature，339385(1989)，Sabin，J.Biol.Standardization，1115(1973)等報道的病毒等)；鼻病毒(例如、ATCC VR-1110和Arnold，J.Cell Biochem，L401-405(1990)報道的病毒等)；痘病毒(例如、金絲雀痘病毒等)或痘苗病毒(例如、ATCC VR-111，ATCC VR-2010等、Fisher-Hoch，Proc NatlAcad Sci USA，86317(1989)，F(xiàn)lexner，Ann NY Acad Sci，56986(1989)，F(xiàn)lexner，Vaccine，817(1990)、美國專利第4,603,112號說明書和同第4,769,330號說明書、以及WO 89/01973報道的病毒等)；SV40病毒(例如、ATCC VR-305和Mulligan，Nature，277108(1979)和Madzak，J.Gen.Vir，731533(1992)報道的病毒等)；流感病毒(例如、ATCC VR-797等)、利用美國專利笫5,166,057號說明書、Enami，Proc Natl Acad Sci USA，873802-3805(1990)，Enami & Palese，J Virol，652711-2713(1991)，Luytjes，Cell，59110(1989)，McMicheal.，N E J Med，30913(1983)，Yap，Nature，273238(1978)、和Nature，277108(1979)等報道的那樣的逆遺傳學技術制作的重組流感病毒；EP 0386882、Ruchschacher，J.Vir.，662731(1992)等報道的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒(例如、ATCC VR-67，VR-1247以及EP 0440219報道的病毒等)；奧拉病毒(例如、ATCC VR-368等)；比巴魯病毒(例如、ATCC VR-600和ATCC VR-1240等)；卡巴蘇病毒(例如、ATCC VR-922等)；切昆貢亞病毒(例如、ATCC VR-64，ATCC VR-1241等)；Fort Morgan病毒(例如、ATCC VR-924等)；蓋塔病毒(例如、ATCC VR-369，ATCCVR-1243等)；Kyzylagach病毒(例如、ATCC VR-927等)；馬亞羅病毒(例如、ATCCVR-66等)；穆茨布病毒(例如、ATCC VR-580，ATCCVR-1244等)；恩杜姆病毒(例如、ATCC VR-371等)；皮克子小納病毒(例如、ATCC VR-372，ATCC VR-1245等)；托萊特病毒(例如、ATCCVR-925等)；特里尼蒂病毒(例如、ATCC VR-469等)；烏納病毒(例如、ATCC VR-374等)；沃達羅河病毒(例如、ATCC VR-926等)；Y-62-33病毒(例如、ATCC VR-375等)；O′Nyong病毒、東部腦炎病毒(例如、ATCC VR-65，ATCC VR-1242等)；西部腦炎病毒(例如、ATCC VR-70，ATCC VR-125L，ATCC VR-622，ATCC VR-1252等)；冠狀病毒(例如、ATCC VR-740，Hamre，Proc Soc Exp Biol Med，121190(1966)報道的病毒)。
將本發(fā)明的組合物遞送到細胞并不限定于上述的病毒載體。也可以使用其它的遞送方法和媒介物，作為這樣的媒介物，例如核酸表達載體、僅與滅活的腺病毒連接的多陽離子性復合DNA(例如，參照Curiel，Hum Gene Ther，3147-154(1992))、連接配體的DNA(例如、Wu，J Biol Chem，6416985-16987(1989)參照)、真核生物細胞遞送載體細胞(參照例如美國專利第6,013,517號說明書、同第6,015,686號說明書等)、光聚合的水溶膠物質沉淀物、美國專利第5,149,655號說明書報道的那樣的攜帶型基因導入粒子槍、WO92/11033報道的電離放射線法、核電荷中和法、或與細胞膜的融合法等。其它的手法如Philip，Mol Cell Biol，142411-2418(1994)，Woffendin，Proc Natl Acad Sci USA，911581-585(1994)報道的手法等。
也可以使用粒子媒介基因轉移技術，序列被插入到含有用于高水平表達的慣用調控序列的通常的載體中，然后與合成基因轉移分子(例如、與細胞靶的配體(例如連接在象Wu et al.，J.Biol.Chem.，2624429-4432(1987)所報道的那樣的非唾液酸血清類粘蛋白，象Hucked，Biochem Pharmacol，40253-263(1990)所報道的那樣的胰島素、象Plank，Bioconjugate Chem，3533-539(1992)所報道的那樣的半乳糖、乳糖、或鐵傳遞蛋白等)連接的象聚賴氨酸、魚精蛋白、和白蛋白那樣的聚合物性DNA結合陽離子)溫育。
也可以使用裸露DNA，例如，作為裸露DNA的導入方法如WO90/11092和美國專利第5,580,859號說明書報道的方法等。整合效率通過使用生物降解類乳膠顆?？梢愿纳?。DNA包被乳膠顆粒，該顆粒被胞吞后可有效地被輸送到細胞。該方法通過使疏水性增大，由此容易使內吞小體容易破裂和使DNA釋放到細胞質那樣的顆粒處理可以進一步被改善。
能夠起到基因遞送載體作用那樣的脂質體在美國專利第5,422,120號說明書、WO 95/13796，WO 94/23697，WO 91/144445和EP 524,968已有報道。在非病毒的遞送法中，就象美國專利申請第60/023,867號報道的那樣，編碼半乳凝素8變體多肽的核酸序列可以插入到含有用于高水平表達的通常調控序列的慣用載體，然后與合成基因導入分子溫育。作為該合成基因導入分子，例如、與細胞靶的配體(例如、非唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖、鐵傳遞蛋白等)連接的聚合物性DNA結合陽離子。聚合性DNA結合陽離子，例如聚賴氨酸、魚精蛋白、白蛋白等。作為其它的遞送體系，如使用用于將含有各個組織特異的或偏在的活性的啟動子調控下的基因的DNA膠囊化的脂質體的體系。作為適于使用的非病毒的遞送法，還有機械的遞送體系(例如、Woffendin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(24)11581-11585(1994)報道的手法)。
另外，編碼序列和這樣的表達的產物可以通過光聚合的水凝膠物質的沉淀遞送。作為可在遞送編碼序列中使用的遞送基因的其它方法，例如、使用美國專利第5,149,655號說明書報道的攜帶型基因導入粒子槍的方法，為了使象WO 92/11033報道的那樣的導入基因活化使用電的例子，如美國專利第5,422,120號說明書和同第4,762,915說明書、WO 95/13796，WO 94/23697，WO 91/14445，EP 0524968，Stryer，Biochemistry，236-240(1975)，W.H.Freeman et al.，BiochemBiophys Acta，6001(1980)，Bayer，Biochem Biophys Acta，550464(1979)，Rivnay，Meth Enzymol，149119(1987)，Wang，ProcNatl Acad Sci USA，847851(1987)，Plant，Anal Biochem，176420(1989)等報道的例子。
本發(fā)明涉及到對煩惱于包括癌等惡性腫瘤在內的腫瘤、包括與變態(tài)性疾病、炎癥、免疫異常、嗜中性細胞和活化淋巴細胞(特別是如活化T細胞、也包括活化B細胞)相關的自身免疫疾病等疾病或障礙的哺乳動物通過給予半乳凝素8變體或來自半乳凝素8變體的治療劑(例如、作為治療活性成分含有編碼半乳凝素8變體多肽或可在哺乳動物表達的半乳凝素8變體多肽的多核苷酸等的組合物)進行治療的方法。作為通過本發(fā)明的方法和組合物可以治療的自身免疫疾病，如任意的自身免疫疾病或移植排斥(包括例如本說明書中列舉的自身免疫疾病，并不限定于這些)。
半乳凝素8變體可以以例如通過重組技術表達的多肽、或半乳凝素8變體多肽變體、其衍生物、或其融合蛋白質給予，可以通過局部或全身任一種方式遞送給哺乳動物。編碼半乳凝素8變體、半乳凝素8變體的衍生物或變體、或半乳凝素8變體融合體的核酸(DNA、RNA等)在基因治療實驗設計中，可以以含有在哺乳動物能夠表達的調節(jié)區(qū)域的裸質粒DNA，或以可在哺乳動物表達的病毒載體給予。用于表達的半乳凝素8變體多肽的遞送可以使用能夠容易遞送那樣的藥學容許的載體完成。對患有自身免疫疾病的哺乳動物用來自半乳凝素8變體的治療劑進行治療后，能夠達到自身免疫疾病的改善或緩解、或使起因于自身免疫的臨床癥狀消失。
本發(fā)明并不限定于本發(fā)明涉及到的半乳凝素8變體怎樣發(fā)揮作用的理論。通過對半乳凝素8變體進行表達，或使半乳凝素8變體表達，或給予來自半乳凝素8變體的治療劑，關注的活化淋巴細胞受到可被利用的半乳凝素8變體的影響，優(yōu)先定向凋亡。半乳凝素8變體多肽或來自半乳凝素8變體的治療劑可以給予表現(xiàn)出自身免疫的區(qū)域(例如、象特征為正在進行治療的特定的自身免疫疾病那樣的局部區(qū)域)。由此可以做到給予的半乳凝素8變體、以及其它治療劑與具有可在該區(qū)域的細胞表達的靶向物的活化T細胞等之間的接觸最適化。因此該區(qū)域的細胞可以作為在借助于基因遞送載體的幫助表達編碼給予到該區(qū)域的半乳凝素8變體多肽的多核苷酸時的良好候補。因此，對本發(fā)明進行各種變更，按照適用能夠表達半乳凝素8變體多肽進行操作，可以做到在處于受到活化T細胞等攻擊下的細胞中進行表達。對于移植排斥的場合，如與能夠結合在許多細胞類型的細胞表面上無處不在表達的蛋白質的分子的結合部融合的半乳凝素8變體多肽。該結合部分例如可以是肝素，而結合的細胞表面上的分子也可以是葡萄糖胺聚糖。另外該結合部分也可以是任意選擇的細胞表面抗原上特異的單鏈抗體的結合域。
關于本發(fā)明當對于包括癌等惡性腫瘤細胞在內的腫瘤細胞得到細胞傷害作用、或得到抗變態(tài)作用、或得到抗炎癥作用、或使免疫異常正?；l(fā)揮血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、LPS誘導的炎癥的抑制活性、抑制LPS誘導的TNF-α、IL-12、和/或IFN-γ的生產的活性、內毒素休克抑制活性等，對于活化淋巴細胞(特別是也包括活化T細胞)誘導凋亡時，也應當與上述自身免疫的場合同樣理解。
所謂本說明書中使用的“給予”或“進行給予”指的是將治療劑或治療劑的配合物遞送到哺乳動物的過程。給予過程可以根據治療劑(單個或多個治療劑)和所期望的效果不同進行改變。給予可以通過例如非經口的遞送或經口的遞送等適合治療劑的任意手段完成。作為非經口的遞送，例如向皮下、靜脈內、肌肉內、動脈內遞送、向器官組織的注射、粘膜、肺、局部的、或通過導管遞送等。經口的手段是經由口完成的手段，例如通過使用片劑或其它的經由胃腸的遞送手段(包括可飲用的液體)等進行。作為經由粘膜的遞送，例如鼻腔內遞送等。作為經由肺的遞送，可以使藥劑吸入。給予一般可以通過使用藥學容許的載體(例如、緩沖液、多肽、肽、多糖綴合物、脂質體、脂等)的遞送進行。所謂基因治療試驗設計，包括認為當在哺乳動物中將作為轉錄物或多肽表達時，能夠達到治療目的的多核苷酸作為治療劑給予的場合，此時可以適用非經口的遞送手段和經口的遞送手段任一種。這樣的給予手段可以按照適于治療的疾病那樣選擇。例如、當疾病是基于器官時，遞送可以是局部遞送，例如當疾病為全身時，遞送可以是全身的。
所謂并用給予指的是在某一患者進行治療中，給予1種或1種以上的治療劑。治療劑可以使用同樣的藥學的載體給予，或使用不同的載體給予。這些治療劑可以通過同樣的或不同的給予手段給予。藥劑既可以是同類型的藥劑或不同類型的藥劑，例如、作為不同的類型，如多核苷酸、多肽、或低分子的。給予時間可以是精確的相同的時間，1個治療劑也可以在給予其它藥劑前或后給予。因此，并用給予可以同時，也可以連續(xù)給予。為了將治療劑做成規(guī)定的組合的正確試驗設計可以考慮了藥劑和其它治療的狀態(tài)后決定。
所謂用語“體內給予”，指的是為了在哺乳動物中表達，將編碼多肽的多核苷酸給予患者(例如、哺乳動物)。特別是作為直接的體內給予，用編碼序列轉染哺乳動物細胞，而不是將細胞從哺乳動物取出。因此作為直接的體內給予，為了能夠在患者細胞發(fā)生表達，如可以將編碼目的多肽的DNA直接注射到有自身免疫疾病煩惱的區(qū)域。
所謂用語“離體給予”指的是從患者(例如、哺乳動物)取出細胞后，對細胞(例如、來自處于自身免疫攻擊下的細胞集團的細胞)進行轉染處理。轉染后，細胞返回到哺乳動物。離體給予通過從哺乳動物將細胞取出，根據需要，選擇要轉化的細胞(既受到自身免疫機構攻擊下的細胞)，將選擇的細胞做成不可復制，用編碼用于表達的基因(即半乳凝素8變體)的多核苷酸(也包括含有使表達容易進行的調節(jié)區(qū)域的多核苷酸) 轉化選擇的細胞，然后為了使半乳凝素8變體表達將轉化的細胞返回到患者而完成。作為治療的有效量，指的是產生所期望的治療結果的那樣的量。例如當所期望的治療效果是緩解自身免疫的場合，所謂的治療的有效量指的是使緩解容易那樣的量。所謂有用的治療量，例如可以是在包括數日或數周間給予那樣的投藥試驗設計中給予那樣的量。治療效果指的是例如在自身免疫疾病的癥狀出現(xiàn)期間，使哺乳動物的自身免疫應答的影響減輕時，所謂在哺乳動物實現(xiàn)這一目的的藥劑的有效量指的是導致自身免疫的癥狀減輕那樣的量。
所謂用語“藥學容許的載體”指的是用于給予治療劑(例如、多肽、多核苷酸、低分子、肽性物質、肽等)的載體，其本身對接受組合物的個體不誘導有害的抗體產生，沒有達到有問題那樣的毒性，可以給予的那樣的任意的藥學容許的載體。在本發(fā)明的另外的方式中，提供與藥學容許的載體或稀釋劑組合含有上述那樣的重組病毒載體的藥學的組合物。這樣的藥學的組合物可以制備成液體溶液的形態(tài)，也可以制備成給予前能夠懸浮于溶液那樣的固體形態(tài)(例如、冷凍干燥的固體)。另外，組合物可以使用適于給予表面、或適于注射、或適于經口給予、經直腸給予的擔載體或稀釋劑制備。藥學容許的載體或稀釋劑在使用的給予量和濃度下對于接受者實質上是無毒的。作為用于可注射的溶液的載體或稀釋劑的代表性的例子，如水、等滲生理鹽水溶液(優(yōu)選在生理pH能夠緩沖的溶液，例如、磷酸緩沖化生理鹽水或Tris緩沖生理鹽水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油、乙醇、多肽或蛋白質(例如、人血清白蛋白等)。作為特別優(yōu)選的組合物，如在10mg/ml甘露醇、1mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、和150mM NaCl中含有載體或重組病毒的組合物。此時，重組體載體可以是表現(xiàn)出約1mg的物質，高分子物質小于1％，總物質量(包括水)小于1/100,000。該組合物在20℃下至少穩(wěn)定約6個月。
本發(fā)明的藥學組合物可以含有刺激細胞分裂的因子，因此也包括刺激攝入或整合重組逆病毒載體的因子。重組病毒的保存法可以參照美國專利第5,792,643號說明書所述的方法。
用于實施本發(fā)明提供的治療法的所有治療劑可以加入到含有治療藥用的藥學容許的載體的合適的藥學組合物中。用于治療藥的藥學載體可以相同，也可以在各個治療藥中不同。作為合適的載體，可以是大的、緩慢代謝的巨大分子(例如、蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、粒子中的滅活病毒等)。這樣的載體是從業(yè)者眾所周知的。
作為藥學容許的鹽，例如無機酸鹽(例如、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等)；有機酸鹽(例如、醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、安息香酸鹽等))，可以將它們加入到該組合物使用。有關藥學容許的賦形劑可以參照例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.，USA，1991)。作為治療組合物中的藥學容許的載體，例如水、生理鹽水、甘油、乙醇等液體。作為助劑，也可以將例如濕潤劑、乳化劑等，pH緩沖物質等加入到這樣的載體中。代表的治療組合物可以制備成能夠注射的液體溶液或懸浮物中任一種；可以制備成適于在注射前使用液體載體做成液體或懸浮物的固體形態(tài)的組合物。在藥學容許的載體的定義中也包含脂質體。
也可以提供與藥學容許的載體或稀釋劑組合，含有重組逆病毒或一個上述的載體構建物的病毒的藥學的組合物。該組合物可以制備成液體溶液或給予前懸浮于溶液的固體形態(tài)(例如、冷凍干燥樣品)中的任一種。另外該組合物也可以使用適于給予表面、或注射、或經口給予、或經直腸給予的載體或稀釋劑進行制備。
作為藥學容許的載體或稀釋劑是在使用的給予量和濃度下對于接受者(recipient)是無毒的。作為用于可注射的溶液的載體或稀釋劑的代表性例子，如水、等滲生理鹽水溶液(優(yōu)選例如在生理pH緩沖化的溶液，例如、磷酸緩沖生理鹽水、Tris緩沖生理鹽水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油、乙醇、多肽或蛋白質(例如、人血清白蛋白)等。載體或重組病毒可以加入到含有10mg/ml甘露醇、1mg/ml HSA、20mMTris(pH7.2)、和150mM NaCl的藥學的組合物后進行遞送。此時，重組體載體約為1g物質，可以少于高分子物質的1％，可以少于總物質量(包括水)的1/100,000。該組合物于20℃下至少穩(wěn)定6個月。
藥學容許的載體或稀釋劑為了能夠做成液體溶液或給予前可以懸浮于溶液的固體形態(tài)的任一種方式(例如、冷凍干燥樣品)的組合物而與基因遞送載體組合。2個以上的基因遞送載體代表的做法可以借助于傳統(tǒng)的直接途徑(例如、口腔/舌下、直腸、經口、經鼻、局部(例如、經皮和眼等)、陰道、肺、動脈內、肌肉內、腹腔內、皮下、眼內、鼻腔內、或靜脈內)、或間接給予。
本發(fā)明的治療藥可以任意含有例如用于在哺乳動物中表達的多核苷酸，該治療藥可以通過該領域眾所周知的方法制成腸溶性片劑或膠囊劑等制劑。這些制劑制法可以參照以下專利例如美國專利第4,853,230號說明書、EP 225,189、AU 9,224,296、AU 9,230,801、和WO 92144,52等。這樣的膠囊可以經過經口給予，靶向腸。經口給予后1～4日間，通過使用抗該蛋白質的抗體等測定血漿和血液可以決定例如多肽是否進行了表達，或例如是否發(fā)生核酶或反義寡核苷酸引起的表達抑制。
基因遞送載體就象例如美國專利第4,411,648號說明書、同第5,222,936號說明書、同第5,286,254號說明書、WO 94/05369等報道的那樣，通過例如注射、粒子槍、局所的給予、非經口給予、吸入、或離子導入遞送等導入哺乳動物。
治療組合物或治療劑也可以與象能夠改善包括癌等惡性腫瘤的腫瘤、變態(tài)癥、炎癥、免疫異常、自身免疫疾病那樣的其它治療劑、或與象能夠增強通過給予半乳凝素8變體治療劑在治療上的利益那樣的其它治療劑一起給予。例如當為了治療變態(tài)反應給予時，為了能夠在存在于粘膜、鼻、支氣管、肺等組織的細胞表達也可以給予半乳凝素8變體多核苷酸的氣霧劑，為了有利治療，也可以在例如變態(tài)反應靜止之前的期間，每日數次通過鼻用噴霧或噴霧劑反復給予。
基因遞送載體可以直接給予哺乳動物的單一部位或多個部位，例如通過直接注射給予?；蜻f送載體也可以使用通過離體轉化導入的靶細胞給予。本發(fā)明也提供適于基因遞送載體給予的適當的藥學組合物(包括例如各種賦形劑)。
可以直接將半乳凝素8變體多肽、其變體、誘導體、類似體、變異體、或指示嵌合表達的載體構建物給予到包括癌等惡性腫瘤的腫瘤部位、表現(xiàn)出變態(tài)的部位、炎癥部位、表現(xiàn)出免疫異常的部位、顯示自身免疫的部位(例如、胰臟、腎臟、肝臟、關節(jié)、腦、脊髓液、皮膚、或身體的其它區(qū)域或器官)。為了直接給予載體構建物，可以在本發(fā)明的范圍內使用各種方法。例如，如果能夠鑒定在某區(qū)域起作用的動脈，為了將載體直接遞送到該部位，可以注射到那樣的動脈中。同樣，例如適用包含載體構建物的局部用藥劑組合物，可以直接將載體構建物給予皮膚表面。
在直接給予中，可以一起給予含有半乳凝素8變體治療劑和其它的抗自身免疫藥劑的配合治療劑。并用給予可以同時進行，例如在同一載體中配置編碼藥劑的多核苷酸，不管是否是多核苷酸、多肽、其它的藥物，將藥劑加入到同一藥劑組合物中，或通過在幾乎在相同的時間內、幾乎相同的位置能夠注射的其它的藥劑組合物的中加藥劑后給予而達到。不同時并用給予的場合(例如、在給予藥物前體活化劑后給予藥物前體那樣的場合)，第2個藥劑為了適于治療目的可以通過直接注射給予。因此，在例如象給予藥物前體那樣的場合，藥物前體應當在與藥物前體活化劑同樣的部位給予。因此作為并用給予試驗設計，也包括為了達到治療目的的給予的組合。另外并用給予需要的時候可以包括以后給予(例如、反復在體內進行直接注射給予半乳凝素8變體的處理那樣的給予)。
在本發(fā)明中，取出的細胞應當理解為能夠返回到同一動物或其它的同種異系的動物或哺乳動物。這樣的場合，一般來說優(yōu)選組織適合性與該動物一致(不限定于此，參照例如Yamamoto et al.，AIDSResearch and Human Retroviruses，7911-922(1991)；Yamamo toet al.，Journal of Virology，67601-605(1993))。
可以從患者的各個部位取出細胞。此外，在本發(fā)明的其它實施方式中可以將載體構建物導入例如來自皮膚的細胞(皮膚成纖維細胞等)或來自血液的細胞(例如、末梢血白血球等)。只要是所期望的，可以將細胞的特定的級分(例如、T細胞部分集合或干細胞等)特異地從血液取出(例如、參照WO 91/16116)。然后使利用上述的任意技術取出的細胞和載體構建物接觸，接下來可以使該細胞返回到恒溫動物(優(yōu)選表現(xiàn)出自身免疫的區(qū)域附近或附近內)。
一旦，例如對于哺乳動物等患者進行診斷，給予半乳凝素8變體治療劑，通過適于治療的特定的疾病(例如、腫瘤、變態(tài)、炎癥、自身免疫疾病等)的手法和用量給予哺乳動物治療劑，為了就治療劑的連續(xù)給予或給予的修正決定其必要性，實施包括對哺乳動物進行監(jiān)測等的本發(fā)明。本發(fā)明中所謂實施，包括對治療的疾病進行鑒定，決定可適用靶基因治療的可能的細胞型或身體區(qū)域。構建半乳凝素8變體多核苷酸(可以含有用于在哺乳動物表達的調節(jié)區(qū)域的質粒、或用于表達的病毒載體)，取出一些哺乳動物細胞，再用編碼半乳凝素8變體的多核苷酸進行轉染處理，然后為了半乳凝素8變體表達加入到哺乳動物。或為了使多核苷酸在例如疾病清楚的區(qū)域進行表達給予哺乳動物。
因此，例如象惡性腫瘤細胞的情況，可以用半乳凝素8變體在體內或離體對患部組織或臟器等該腫瘤細胞進行轉染處理。而對于例如象慢性風濕性關節(jié)炎的情況，可以用半乳凝素8變體以離體對從關節(jié)液得到的細胞進行轉染。
例如，在多發(fā)性硬化癥治療中，可以向受到影響的腦區(qū)域注射半乳凝素8變體，也能夠做到在處于自身免疫反應型的活化T細胞等攻擊下的細胞中容易進行半乳凝素8變體表達。另外作為一個例子，對于多發(fā)性硬化癥的情況，半乳凝素8變體DNA可以局部注射于哺乳動物腦，也可以取出來自脊髓液的細胞，然后用半乳凝素8變體DNA進行轉染處理，可以返回到脊髓區(qū)域。另外作為其它的例子，為了治療具有干燥綜合征(Sjgren-Larssen syndrome)的哺乳動物，作為該疾病的靶器官，可以選擇適于通過注射給予半乳凝素8變體多肽的靶器官。而對于患有干燥綜合征的哺乳動物，對罹患器官(例如、腎臟等)進行鑒定，可以將半乳凝素8變體DNA直接給予該器官，也可以取出來自器官的細胞，進行轉染處理，然后返回到身體以便在哺乳動物的那些細胞中能夠表達半乳凝素8變體。
對于例如預防移植排斥的情況，接受移植的動物為了殺死攻擊外來的細胞、外來的組織、或外來的器官那樣的活化患者細胞，可以局部或全身地給予半乳凝素8變體治療劑，或為了在患者身體內暫時保護器官，在移植前也能夠做到在器官外表面上的細胞中半乳凝素8變體多肽進行表達。接受移植的生物的免疫系在適應外來細胞、外來組織、或外來器官期間，需要連續(xù)給予半乳凝素8變體治療劑。
預期半乳凝素8變體治療劑的作用類似于天然的半乳凝素8。因此為了引起凋亡反應可以使用該治療劑。臨床醫(yī)療為了實現(xiàn)凋亡，可以從化學計量上得知給予哺乳動物需要表達的半乳凝素8變體的量。在本發(fā)明的其它方式中，本說明書中公布的載體構建物當然可以指示來自非載體的基因的表達。例如適于與半乳凝素8變體一起給予的藥物前體系可以起基因治療的安全機構的作用，或起并用治療劑的作用。
使藥物前體活化劑與半乳凝素8變體一起在載體中表達，可以確保安全機構。如果決定要終止該活化系，給予藥物前體，可以使該藥物前體活化劑活化。通過這樣的處置，賦予了臨床醫(yī)基因治療期間的控制手段。藥物前體活化劑/藥物前體系為了在哺乳動物(例如、自身免疫由于半乳凝素8變體表達惡化的那樣場合)鈍化轉染細胞是有用。藥物前體活化劑/藥物前體系為了能夠使用通過該系提供的藥物前體活化發(fā)揮細胞傷害作用，可以進行組合治療，與治療劑并用給予使用。
包括與藥物前體活化劑和藥物前體一起給予編碼半乳凝素8變體多肽的多核苷酸的治療可以是免疫調節(jié)性的治療。所謂免疫調節(jié)性指的是引起與性質或效力在因子不存在下發(fā)生的免疫應答不同的免疫應答的因子的使用，該因子可以是通過與免疫應答有關的1個以上的細胞制造的因子，也可以是由外因添加到細胞中的因子。應答的性質或效力可以通過測定從業(yè)者眾所周知的各種分析(例如、包括細胞增殖(例如、3H胸腺嘧啶脫氧核苷的攝入)的體外分析和體外細胞傷害分析(包括例如測定51Cr釋放))進行測定(參照Warner et al.，AIDSRes.and Human Retroviruses，7645-655(1991))。作為免疫調節(jié)因子是在體內和離體兩方都有活性的因子。這樣的因子的代表性例子如細胞因子(例如、白細胞介素2，4，6，12和15)、α干擾素、β干擾素、γ干擾素、GM-CSF、G-CSF、以及腫瘤壞死因子(TNF)等。其它的免疫調節(jié)因子例如CD3，ICAM-1，ICAM-2，LFA-1，LFA-3，MHC類I分子，MHC類II分子、β2-微球蛋白、伴侶、其類似物等。然而基因遞送載體在不表達作為細胞因子的免疫調節(jié)補因子時，該細胞因子可以包含在上述的組合物中，也可以與上述的組合物分別給予(同時或之后)。簡言之，在這樣的實施方式中，免疫調節(jié)補因子優(yōu)選是根據該領域中已知的標準試驗設計和給予量給予。例如α干擾素可以在2～4個月期間按照100～500萬單位/日的給予量給予，而IL-2可以在2～12周、按照1～3次/日、以10,000～100,000單位/kg體重的給予量給予。γ干擾素例如在為了通過給予半乳凝素8變體達到更好效果的治療，為了在活化T細胞中，正調節(jié)關注基因的表達，在2～12周間、按照2～3回/周、以150,000～1,500,000單位的給予量給予。
在并用治療劑中，藥物前體活化劑可以由用于該活化劑的載體進行表達，也可以由與半乳凝素8變體多肽相同的載體進行表達?？梢酝ㄟ^體內或離體手段給予任一個載體系(單一載體或2個載體)。在自身免疫治療中，例如、藥物前體活化劑的添加可以進一步促進支持通過半乳凝素8變體達到的效果的免疫調節(jié)效果，而且藥物前體添加可以進一步活化轉染細胞的殺傷。
伴侶分子可以在給予多核苷酸治療藥前、給予時同時給予，或給予后給予，而伴侶分子優(yōu)選是例如熱休克蛋白質(例如、hsp70)。另外可在哺乳動物中表達的多核苷酸例如為了確實只是在所期望的靶細胞表達多核苷酸為目的可以與誘導啟動子(例如、組織特異的啟動子)連接。為了有效地將多核苷酸遞送到組織，多核苷酸可以與適于整合到該組織的細胞基因組的核苷酸序列鄰接。
本發(fā)明的這種方式和許多方式，治療人的有效性可以在規(guī)定的自身免疫疾病的動物模型進行最初試驗。作為這樣的現(xiàn)存的動物模型，例如包括干燥綜合征(自身免疫淚腺炎或免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)、炎癥性心疾病、水銀誘導性腎臟自身免疫、胰島素依賴性糖尿病(I型糖尿病或IDD)、胸腺摘出后自身免疫、中樞神經系(CNS)脫髓障害、CNS狼瘡、嗜眠癥、重癥肌無力癥(MG)、格雷夫斯病、免疫媒介PNS障害、變形性關節(jié)癥、慢性風濕性關節(jié)炎、眼色素膜炎、髓質囊胞性纖維癥、自身免疫溶血性疾病、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾病、和人強皮癥(schleroderma)等在內的自身免疫疾病的動物模型。
可以將多個基因遞送載體給予動物或植物。在優(yōu)選的實施方式中，動物是溫血動物，更優(yōu)選小鼠、雞、牛、豬、寵物(例如、貓和狗)、馬、和人。關于多肽治療藥(例如、半乳凝素8變體或其他細胞因子)，給予量可以是約5～50μg/kg哺乳動物體重、或約50μg/kg～約5mg/kg、或約100～500μg/kg哺乳動物體重、和約200～約250μg/kg的范圍。
關于多肽治療藥(例如、天然或變異體的編碼半乳凝素8變體多肽的多核苷酸等)，就以組織作為靶給予來說，根據在患者(例如、哺乳動物)的多核苷酸表達，可以象下面那樣給予含有可表達編碼序列或非編碼序列的構建物的載體如果局部給予的基因治療試驗設計，可以給予約100ng～約200mg DNA、或約500ng～約50mg DNA、或約1μg～約2mg DNA、或約5μg DNA～約500μg DNA、而如果在基因治療試驗設計中的局部給予之間，可以按照約20μg～約100μg的范圍、例如、每次注射或每次給予按照約500μg的用量給予。在希望更多表達的場合下，遍及組織的更廣的區(qū)域，更多量的DNA或同樣的量的DNA按照連續(xù)給予試驗設計再給予，例如、向腫瘤部位的不同的鄰近或密接的組織部分給予幾次，這樣做為了帶來陽性治療結果認為還必要的。
關于低分子治療藥的給予，可以根據低分子的效力，改變給予量。如果是非常強力的抑制劑，其給予量以每千克哺乳動物體重的量給出，例如約1μg/kg～約500mg/kg、或約100μg/kg～約5mg/kg、或約1μg/kg～約50μg/kg、或例如約10μg/kg的范圍就夠了。如果給予肽和類肽，效力由于給予量不同而不一樣，可以是約1μg/kg～約500mg/kg哺乳動物體重、和約100μg/kg～約5mg/kg、和約1μg/kg～約50μg/kg的范圍。而通常的用量可以是約10μg/kg。
本發(fā)明的活性成分其給予量可以在很寬的范圍內進行選擇給予，其給予量和給予次數等可以根據治療患者的性別、年齡、體重、一般的健康狀態(tài)、飲食、給予時間、給予方法、排泄速度、藥物的組合、患者此時進行治療的病狀的程度，可考慮了這些因素或其它要因后決定。
在進行醫(yī)藥品制造時，其添加劑等和制備法等可以參考例如日本藥局方說明書編集委員會編、第十四改正日本藥局方說明書、平成13年6月27日發(fā)行、株式會社廣川書店；一番ケ瀬尚他編醫(yī)藥品的開發(fā)12卷(制劑素劑〔I〕)、平成2年10月15日發(fā)行、株式會社廣川書店；同、醫(yī)藥品的開發(fā)12卷(制劑素材〔II〕)平成2年10月28日發(fā)行、株式會社廣川書店等記載，根據需要從中適當選擇運用。
本發(fā)明的活性成分如說明書說明的(a)半乳凝素8變體和基本上與它具有均等生物活性的多肽等、(b)編碼半乳凝素8變體和基本上與它具有均等生物活性的多肽的多核苷酸、(c)利用半乳凝素8變體技術發(fā)現(xiàn)的因子等、(d)半乳凝素8變體和基本上與它具有均等生物活性的多肽基因遞送載體等，它們都表現(xiàn)出在利用人半乳凝素8顯示出血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、LPS誘導的炎癥的抑制活性、抑制LPS誘導的TNF-α、IL-12、和/或IFN-γ的生產的活性、內毒素休克抑制活性的這樣的性狀、對腫瘤細胞誘導凋亡，而對正常細胞不誘導凋亡的性狀、抑制惡性細胞轉移性的性狀、誘導凋亡的活性等任一活性方面都有用，有望做成抗腫瘤劑、抗變態(tài)劑、免疫調節(jié)劑、自身免疫疾病用劑、抗炎癥劑、內毒素誘起炎癥的抑制劑、內毒素休克抑制劑、利用與副腎上腺皮質甾類激素同樣活性的藥劑。
實施例以下給出實施例，對本發(fā)明進行具體說明，但這些實施例只是為了說明本發(fā)明，用于參考其具體的方式提供的。這些例示是為了說明本發(fā)明的特定的具體的方式的例子，并不表示限定或限制本申請涉及到的發(fā)明的范圍。在本發(fā)明應當理解為源于本說明書的思想的各種各樣的實施方式都是可能的。
所有的實施例除了另外詳細敘述以外都是可以使用標準的技術可以實施的實施例、或能夠實施的實施例，這對從業(yè)者人來說是眾所周知慣用的作法。而在以下的實施例，沒有特別指出時，具體的操作和處理條件等對于在DNA克隆中使用J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，″Molecular Cloning″，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和D.M.Gloveret al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford Univers ty Press(1995)；PCR法時，按照H.A.Erlich ed.，PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1，(The Practical Approach Series)，IRL Press，OxfordUniversity Press(1995)和M.A.Innis et al.ed.，″PCRProtocols″，Academic Press，New York(1990)所述的方法進行，而當使用而當使用市售的試劑或試劑盒時，按照附帶的指示書(protocols)和使用附帶的藥品等。
實施例1〔半乳凝素8變體的制造〕(A)從A432細胞提取總RNAA432細胞(來自人的細胞，skin tumor，carcinoma，squanouscell)從通過American Type culture Collection(ATCC CRL 1555)等獲得。細胞系于5％CO2的條件下37℃維持在添加了10％FBS的DME培養(yǎng)基(DMEM；Sigma、圣路易斯、美國)中。
從A432細胞提取總RNA如下進行。即將于90-mm板培養(yǎng)的A432細胞(使用含有10％FBS的DMEM)用PBS洗2次后，每一塊板加3ml的ISOGEN(商品名NIPPON GENE)，按照手冊(NIPPON GENE)提取總RNA。
ISOGEN(商品名NIPPON GENE)是含有苯酚和硫氰酸胍的均一液體，是為了在液層分離時便于著色的溶液，使用該ISOGEN(商品名NIPPON GENE)提取RNA基本上按照如下步驟進行。在試樣加ISOGEN(商品名NIPPON GENE)后溶解或勻漿后，加氯仿進行離心分離。一離心分離，勻漿液分離為水相、有機相和中間相3相。由于只有水相存在RNA，所以收集該水相，加異丙醇，使RNA沉淀，通過進行清洗處理，取得總RNA。
(B)從總RNA純化poly(A)+RNA和cDNA合成從總RNA純化poly(A)+RNA和cDNA合成如下進行。即將從A432細胞提起的總RNA按照濃度為1mg/ml那樣溶解于DEPC處理水。使用PolyATtractTMmRNA Isolation System(商品名Promega)按照手冊可以由總RNA純化poly(A)+RNA。將純化的poly(A)+RNA按照濃度為5μg/20μl溶解于DEPC處理水。
PolyATtractTMmRNA Isolation System(商品名Promega)是在利用生物素化的寡(dT)探針和磁性粒子上固化的抗生物素蛋白的系統(tǒng)，將總RNA樣品添加到RNase-free水中，然后在生物素化寡(dT)探針(Biotinylated-Oligo(dT)Probe)和2×SSC的存在下與探針進行退火。然后將退火的反應液與Streptavidin MagneSphereTM順磁粒子(Paramagnetic Particles)(SA-PMPs)混合。溫育后將含有SA-PMPs試管置于磁石架上，注意回收SA-PMPs沉淀團(pellet)，除去上清。將回收的SA-PMPs沉淀團再溶解于RNase-free水后，置于磁石架上回收SA-PMPs，取得含有洗脫出的mRNA含有水溶液。根據需要或進行干燥處理，除去溶劑，或進行醇沉淀處理進行濃縮。
使用第1根鏈cDNA合成試劑盒(First-Strand cDNA SynthesisKit)(商品名Amersham Biosciences)，根據實驗手冊由5μg的poly(A)+RNA合成cDNA(引物使用Not I-d(T)18)。將上述純化得到的poly(A)+RNA溶解于DEPC處理水調整到規(guī)定的濃度，于65℃下保持10分鐘，使模板變性后于0℃下保持2分鐘，作為poly(A)+RNA樣品液(RNA模板)。第1根鏈cDNA合成試劑盒(商品名AmershamBiosciences)由作為cDNA合成用引物的Not I-d(T)18引物、First-Strand Reaction Mixes(Cloned，F(xiàn)PLCpure M-MuLV逆轉錄酶；RNA guard；不含RNase/DNase的BSA；含有dATP，dCTP，dGTP & dTTP的Tris-HCl(pH8.0))、DTT液和不含RNase的水構成的試劑組，將RNA模板、Reaction Mix、引物、DTT液和RNase-Free水混合，于37℃下反應60分鐘，直至first-strand cDNA合成完了。
得到的cDNA可以直接在PCR中使用。
(C)半乳凝素8變體表達載體的構建在表達載體的制作中使用(1)由A432細胞的poly(A)+RNA級分制備的cDNA(2)pET-11a載體(STRATAGENE)(3)PCR用引物PEG8-1CGTCCTCATATGATGTTGTCCTTAAACAACCTAC 〔序列11〕PEG8NCRD2CGACCGCATATGCGAGCTGAAGCTAAAACCAAT 〔序列12〕PEG8CCRD1CGTCCTCATATGAGGCTGCCATTCGCTGCAAGG 〔序列13〕PEG8CCRD2CGACCGGGATCCCTACCAGCTCCTTACTTCCAG 〔序列14〕。
按照圖1所示順序在pET-11a載體的NdeI-BamHI位插入半乳凝素8的N-末端側糖鏈結合區(qū)域(N-terminal carbohydrate recognitiondomain，NCRD)和C-末端側糖鏈結合區(qū)域(CCRD)，制作缺少連接肽的改變型半乳凝素8(G8NC(null))的表達載體。
首先分別從半乳凝素8cDNA取得(1)對應于人半乳凝素8的C-末端側CRD的cDNA和(2)對應于人半乳凝素8N-末端側CRD的cDNA。即，使用PCR用引物PEG8CCRD1+PEG8CCRD2從cDNA擴增對應于人半乳凝素8C-末端側CRD的cDNA(G8CCRD)。將G8CCRD用限制酶(Nde I+BamHI)切后，插入到用同樣限制酶處理的pET-11a載體，得到pET-G8CCRD。PCR使用KOD DNA polymerase kit(TOYOBO Code No.KOD-101)進行。將PCR Reaction mixture(dNTP mix，25mM MgCl2，10×Buffer，KODDNA polymerase(0.05u)，引物和模型cDNA)按照以下那樣的PCR循環(huán)的條件進行反應94℃下處理2分鐘后、進行25次循環(huán)(98℃下處理15秒鐘、然后65℃下處理2秒鐘、74℃下處理30秒鐘)、最后于4℃下停止反應。PCR擴增的片段向載體的插入使用Ligation highkit(TOYOBO Code No.LGK-101)進行。將插入片段載體的摩爾比以約5∶1混合，加其總DNA溶液(體積)量的1/2(體積)量的試劑Ligationhigh混合后進行反應。通過于16℃下反應16小時(O/N)進行插入。
利用使用PCR用引物PEG8-1+PEG8NCRD2從該半乳凝素8cDNA擴增對應于人半乳凝素8N-末端側CRD的cDNA(G8NCRD)。將G8NCRD用限制酶(NdeI)切后，對得到的片段用同樣的限制酶(NdeI)處理，再插入到進行了脫磷酸的pET-G8CCRD得到pET-G8NC(null)。PCR擴增和整合到載體與上述同樣進行。pET-G8NC(null)編碼具有從人的M型半乳凝素8的第156位Asp(D)至第183位的Leu(L)為止的28個殘基的氨基酸序列置換為His-Met(HM)序列的氨基酸序列的多肽。即具有序列1所示堿基序列，編碼具有序列2所示氨基酸序列(圖2)的多肽。
(D)半乳凝素8變體重組蛋白質的表達和純化將上述工程(C)得到的表達用質粒載體pET-G8NC(null)導入大腸桿菌(BL21(DE3))。導入通過電穿孔法進行。即將感受態(tài)的(competent)BL21(DE3)和質粒載體水溶液混合，通過1.8kV電壓的電穿孔法進行轉染。
重組蛋白質的表達通過將大腸桿菌于含有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在600nm的吸光度達到0.7時添力0.1M異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(終濃度0.1mM)，誘導重組蛋白質的表達進行。于20℃下培養(yǎng)18小時后，通過離心收集菌體，懸浮于10mM Tris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，1mMDTT，1mM PMSF。將懸濁液進行10分鐘超聲波處理后，加10％(w/v)Triton X-100(終濃度1％)，于4℃下攪拌30分鐘。于15,000×g下離心30分鐘，將得到的上清液中的重組蛋白質通過使用乳糖-瓊脂糖的親合色譜法進行純化。
結果以高收率獲得了純度高的標準品。得到的重組蛋白質的電泳結果如圖3所示。SDS-PAGE條件如下Gel，丙烯酰胺-BIS(12％gel)，電泳用緩沖液，25mM Tris-192mM甘氨酸-0.1％SDS，泳動條件，180V，45min.，染色，CBB，60℃/30min.使電泳樣品吸附于Strata CleanTMResin(Stratagene)，用1×試樣緩沖液(62.5mM Tris-HCl，Ph6.8，2％(w/v)SDS，5％(W/V)2-ME，丙三醇)調整為0.2mg/ml，98℃/3min.的熱處理后，每條帶以約2μg的蛋白質量進行電泳。
純化的G8NC(null)在4℃下至少可以穩(wěn)定保存9周。而野生型的半乳凝素8(M-type、G8(M))在同樣的保存條件下1周以內大部分被分解了。認為分解是由于純化半乳凝素標準品中含有的來自大腸桿菌的蛋白酶導致的緣故。
實施例2對野生型的半乳凝素8(M-type、G9(M)帶有短的連接肽的同種型)和G8NC(null)比較對存在于人組織中的蛋白酶的敏感性。向溶解于PBS的半乳凝素加1/100(重量比)的彈性蛋白酶或胰蛋白酶，于37℃下保溫。G9(M)無論在那一種場合在15分鐘大部分被分解，而G8NC(null)即使在2小時后也幾乎沒有被分解(參照圖4)。
實施例3為了研究導入變異對半乳凝素8的生物活性的效果，研究對末梢血嗜中性細胞的粘附的效果。另外對影響嗜中性細胞的超氧化物產生的效果也進行了研究。
(1)體外細胞粘附分析嗜中性細胞通過將由健康的志愿者生產的末梢血白血球加到不連續(xù)濃度梯度的Percoll(Amersham Pharmacia Biotech)中進行分離。使污染的紅細胞于水中溶解20秒鐘，然后加等體積的2×PBS和4倍體積的RPMI-1640、10％FBS。離心分離后于RPMI-1640、10％FBS中再構成細胞。分離的細胞加到3塊24孔組織培養(yǎng)板(0.45ml的培養(yǎng)基/每孔2.5×105個細胞)中。添加50μl的分析樣品后，使細胞于37℃下粘附60分鐘。溫育期間結束用移液管進行急劇吸吹操作，用PBS進行清洗，緩慢地除去結合的細胞。結合的細胞通過0.25％胰蛋白酶/0.5mM EDTA于37℃下進行10分鐘處理回收后，于含有2M NaCl和2mM EDTA的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中進行超音波處理。超音波處理物的DNA含量使用小牛胸腺DNA作為標準，通過Labarca和Paigen的方法(Anal.Biochem.，102，344-352(1980))決定。
(2)超氧化物生成的判定O2-生成通過Yamaoka等人的方法(J.Immunol.，154，3479-3487(1995))決定。將懸浮在含有0.5mM MgCl2、0.8mM CaCl2和7.5mM葡萄糖的PBS中的純化的嗜中性細胞(2.5×106/2ml)配置在小杯內。在小杯中還含有馬心臟細胞色素c(75μM)。反應在細胞松弛素B(5μg/ml)存在時或不在時實施。在對照實驗中加超氧化物歧化酶(SOD、50μg/ml)。事前于37℃溫育5分鐘后，加刺激，測定550nm的吸收變化。O2-生成活性使用20.5 ×103M-1cm-1的摩爾吸光系數進行計算。
(3)結果在10％血清存在下，研究嗜中性細胞對培養(yǎng)皿的粘附，結果G8NC(null)與G8(M)比較表現(xiàn)出更高的活性(參照圖5)。而G8NC(null)幾乎與G8(M)同程度促進嗜中性細胞的超氧化物產生(參照表1)。
表1

實施例4以研究半乳凝素8(Gal-8)的內毒素和對與此有關的生體反應現(xiàn)象的生物活性為目的使用改變體半乳凝素8(穩(wěn)定化半乳凝素8)研究它發(fā)揮的作用效果。
將脂多糖(lipopolysaccharide；LPS)(其中LPS來自E.coli，0111B4、Sigma-Aldrich公司制)4μg給予到BALB/c小鼠(♀6周齡)的腹腔內。為了研究Gal-8的效果，將80μg重組人Gal-8(半乳凝素8變體G8NC(null)、在以下的圖和表中記為G8或Galectin-8)和4μg LPS一起給予腹腔內。
從小鼠的眼窩靜脈經時地采血，制備血清，然后進行用于細胞因子測定的ELISA(Pierce Endogen公司制)。就給予LPS或給予LPS和Gal-8(G8NC(null))1小時后的血清測定TNF-α，對于給予3小時后的血清測定IL-12(p70)，對于6小時后的血清和12小時后的血清測定IFN-γ。
測定結果如圖6～8所示。該結果在同時給予LPS和Gal-8(G8NC(null))時，與給予LPS給予相比，抑制TNF-α、IL-12(p70)、IFN-γ的生產。從該結果暗示Gal-8可抑制LPS誘導的炎癥的可能性，所以使用作為由LPS導致內毒素休克的模型的全身性內毒素出血性壞死反應(generalized Shwartzman reaction)，研究由于Gal-8導致的內毒素休克抑制效果。
本模型在將少量的LPS(5μg/小鼠)給予腹腔內時，通過在24小時以內再度給予LPS(65μg/小鼠)，引起致死性的休克。在第一次給予LPS時如果同時以80μg/小鼠給予Gal-8(G8NC(null))，與給予LPS的小鼠休克死相反，由于同時給予Gal-8(G8 NC(null))，6中有5只幸免于休克死，而存活著。測試結果如表2所示。
表2半乳凝素-8對Shwartzman反應的效果

由以上可知重組人Gal-8(G8NC(null))具有抑制LPS誘導的TNF-α、IL-12(p70)、IFN-γ的生產，防止內毒素休克的效果。即半乳凝素8(Gal-8)具有抑制LPS誘導的TNF-α、IL-12(p70)、IFN-γ的生產，防止內毒素休克的效果。
LPS是格蘭氏陰性菌特有的，對動物具有毒素活性，稱為內毒素(內毒素)。通常與細胞壁緊密結合，在發(fā)生細胞溶解等時游離，已知引起生體各種各樣的反應。內毒素與作為蛋白質毒素的外毒素不同，對熱、干燥、消毒劑具有強的抵抗性。活性的作用大致被認為是配體A部分的活性作用，但是由于配體A本身不溶于水，只是這種狀態(tài)不顯示活性。因此，人們認為由于多糖部分的大的親水性使其可溶，表現(xiàn)出在水溶液中形成微團可運動的活性。LPS在第2途徑使補體活化，由巨噬細胞或其它細胞釋放細胞因子或其它免疫調制物質。人們認為這些生理活性物質在起到宿主的生體防御機構的同時，在除去細菌的方面也起著作用。然而，這些細胞因子等一過剩，有時對宿主顯示出毒性，招致休克等死亡。作為LPS的生物活性，已知有(1)致死活性、(2)內毒素休克、(3)發(fā)熱、(4)佐劑活性、(5)巨噬細胞的活化、(6)補體系其它途徑活化、(7)參與物質的膜透過、(8)抗腫瘤作用、(9)病毒的受體、(10)循環(huán)器官障害、補體的活化、血管內血液凝固、(11)白血球全般的減少和增多、低血糖、低血壓、主要臟器的功能不全和致死性的休克作用、(12)在淋巴細胞或血管內皮細胞等由于通過LPS的刺激而分泌的細胞因子等引起的休克作用、(13)細胞因子或自體有效物質的誘導、(14)中樞神經細胞、肌肉細胞的障害、(15)凝固因子、排出促進物質的活化、血管的收縮和擴張、藥物代謝酶的阻礙、(16)Shwartzman反應(伴隨出血壞死的非免疫學的炎癥反應)、(17)包括由于血小板凝集引起的5-羥色胺的釋放等的血管系的障害、(18)干擾素的誘發(fā)、(19)游走性抑制、參與物質的膜透過等。所謂LPS的致死活性還包括血壓低下、由于心輸出量的低下導致的循環(huán)器官障礙、內毒素休克(例如、如果給予大量抗生素，一旦菌裂解，LPS流入血流，就會陷于休克狀態(tài))等現(xiàn)象。就內毒素休克來說，也包括例如由于大的膿腫等，LPS立刻從菌體放出，引起血壓低下等休克直至死亡那樣的癥狀。
產業(yè)上利用的可能性半乳凝素8變體與野生型的半乳凝素8相比對酶有抗性，所以在有效利用半乳凝素8表現(xiàn)出的多方面的作用■功能中有用。野生型半乳凝素8雖然暗示出誘導血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性等細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白αM結合活性、proMMP-9結合活性、活性型MMP-9產生促進活性、超氧化物產生促進活性、對特定細胞的凋亡誘導活性、對腫瘤細胞的增殖抑制■阻礙作用、癌的轉移抑制■退縮作用等活性，但預期本半乳凝素8變體會成為表現(xiàn)出同樣活性的更有利的活性物質。另外，通過使用半乳凝素8變體，觀察到具有抑制LPS誘起的炎癥的活性、內毒素休克抑制作用(包括致死性的抑制作用)，暗示半乳凝素8具有這樣的活性。由此可用于針對炎癥和炎癥性疾病的治療劑、內毒素休克抑制劑、癌治療藥或針對難治性的免疫疾病(包括自身免疫疾病)、變態(tài)疾病的治療藥的開發(fā)和半乳凝素8的功能的闡明■研究開發(fā)。
本發(fā)明除了上述說明和實施例特別敘述的以外顯然都可以實行。鑒于上述的教示，本發(fā)明很多的改變和變形都是可能的，因此這些改變和變形也是本件附帶的申請范圍的范圍內的內容。
<序列表自由文字>
序列編號1，人工序列的說明編碼半乳凝素-8變體G8NC(null)的多核苷酸序列編號2，人工序列的說明編碼半乳凝素-9變體的多核苷酸序列編號5，半乳凝素-8短鏈同種型(hGalectin-8(M))序列編號7，半乳凝素-8長鏈同種型(hGalectin-8(L))序列編號11，人工序列的說明起PCR引物作用的寡核苷酸序列編號12，人工序列的說明起PCR引物作用的寡核苷酸序列編號13，人工序列的說明起PCR引物作用的寡核苷酸序列編號14，人工序列的說明起PCR引物作用的寡核苷酸序列表<110>GALPHARMA Co.，Ltd.
<120>新型半乳凝素8變體蛋白質以及其用途<130>GL-06PCT<150>JP 2004-175086<151>2004-06-14<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>876<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼半乳凝素-8變體的多核苷酸<220>
<221>CDS<222>(1)..(876)<223>G8NC(null)<400>1atg atg ttg tcc tta aac aac cta cag aat atc atc tat aac ccg gta48Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val1 5 10 15atc ccg ttt gtt ggc acc att cct gat cag ctg gat cct gga act ttg96Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu20 25 30att gtg ata cgt ggg cat gtt cct agt gac gca gac aga ttc cag gtg144
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cta gca gga aaa tca aag gat att gct cta cac ttg aac cca cgc ctg624Leu Ala Gly Lys Ser Lys Asp Ile Ala Leu His Leu Asn Pro Arg Leu195 200 205aat att aaa gca ttt gta aga aat tct ttt ctt cag gag tcc tgg gga672Asn Ile Lys Ala Phe Val Arg Asn Ser Phe Leu Gln Glu Ser Trp Gly210 215 220gaa gaa gag aga aat att acc tct ttc cca ttt agt cct ggg atg tac720Glu Glu Glu Arg Asn Ile Thr Ser Phe Pro Phe Ser Pro Gly Met Tyr225 230 235 240ttt gag atg ata att tat tgt gat gtt aga gaa ttc aag gtt gca gta768Phe Glu Met Ile Ile Tyr Cys Asp Val Arg Glu Phe Lys Val Ala Val245 250 255aat ggc gta cac agc ctg gag tac aaa cac aga ttt aaa gag ctc agc816Asn Gly Val His Ser Leu Glu Tyr Lys His Arg Phe Lys Glu Leu Set260 265 270agt att gac acg ctg gaa att aat gga gac atc cac tta ctg gaa gta864Ser Ile Asp Thr Leu Glu Ile Asn Gly Asp Ile His Leu Leu Glu Val275 280 285agg agc tgg tag876Arg Ser Trp290<210>2<211>291<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>編碼半乳凝素-8變體的多核苷酸<400>2
Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val1 5 10 15Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu20 25 30Ile Val Ile Arg Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val35 40 45Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Met Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe50 55 60His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr65 70 75 80Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro85 90 95Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp100 105 110Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His115 120 125Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val130 135 140Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser His Met Arg Leu Pro145 150 155 160
Phe Ala Ala Arg Leu Asn Thr Pro Met Gly Pro Gly Arg Thr Val Val165 170175Val Lys Gly Glu Val Asn Ala Asn Ala Lys Ser Phe Asn Val Asp Leu180 185 190Leu Ala Gly Lys Ser Lys Asp Ile Ala Leu His Leu Asn Pro Arg Leu195 200 205Asn Ile Lys Ala Phe Val Arg Asn Ser Phe Leu Gln Glu Ser Trp Gly210 215 220Glu Glu Glu Arg Asn Ile Thr Ser Phe Pro Phe Ser Pro Gly Met Tyr225 230 235 240Phe Glu Met Ile Ile Tyr Cys Asp Val Arg Glu Phe Lys Val Ala Val245 250 255Asn Gly Val His Ser Leu Glu Tyr Lys His Arg Phe Lys Glu Leu Ser260 265 270Ser Ile Asp Thr Leu Glu Ile Asn Gly Asp Ile His Leu Leu Glu Val275 280 285Arg Ser Trp290<210>3<211>155
<212>PRT<213>人<400>3Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val1 5 10 15Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu20 25 30Ile Val Ile Arg Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val35 40 45Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Met Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe50 55 60His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr65 70 75 80Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro85 90 95Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp100 105 110Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His115 120 125Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val130 135 140
Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser145 150 155<210>4<211>134<212>PRT<213>人<400>4Arg Leu Pro Phe Ala Ala Arg Leu Asn Thr Pro Met Gly Pro Gly Arg1 5 10 15Thr Val Val Val Lys Gly Glu Val Asn Ala Asn Ala Lys Ser Phe Asn20 25 30Val Asp Leu Leu Ala Gly Lys Ser Lys Asp Ile Ala Leu His Leu Asn35 40 45Pro Arg Leu Asn Ile Lys Ala Phe Val Arg Asn Ser Phe Leu Gln Glu50 55 60Ser Trp Gly Glu Glu Glu Arg Asn Ile Thr Ser Phe Pro Phe Ser Pro65 70 75 80Gly Met Tyr Phe Glu Met Ile Ile Tyr Cys Asp Val Arg Glu Phe Lys85 90 95Val Ala Val Asn Gly Val His Ser Leu Glu Tyr Lys His Arg Phe Lys100 105 110
Glu Leu Ser Ser Ile Asp Thr Leu Glu Ile Asn Gly Asp Ile His Leu115 120 125Leu Glu Val Arg Ser Trp130<210>5<211>954<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(954)<223>半乳凝素-8短鏈同種型(hGalectin-8(M))<400>5atg atg ttg tcc tta aac aac cta cag aat atc atc tat aac ccg gta48Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val1 5 10 15atc ccg ttt gtt ggc acc att cct gat cag ctg gat cct gga act ttg96Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu20 25 30att gtg ata cgt ggg cat gtt cct agt gac gca gac aga ttc cag gtg144Ile Val Ile Arg Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val35 40 45gat ctg cag aat ggc agc agc atg aaa cct cga gcc gat gtg gcc ttt192Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Met Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe50 55 60cat ttc aat cct cgt ttc aaa agg gcc ggc tgc att gtt tgc aat act240
His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr65 70 75 80ttg ata aat gaa aaa tgg gga cgg gaa gag atc acc tat gac acg cct288Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro85 90 95ttc aaa aga gaa aag tct ttt gag atc gtg att atg gtg ctg aag gac336Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp100 105 110aaa ttc cag gtg gct gta aat gga aaa cat act ctg ctc tat ggc cac384Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His115 120 125agg atc ggc cca gag aaa ata gac act ctg ggc att tat ggc aaa gtg432Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val130 135 140aat att cac tca att ggt ttt agc ttc agc tcg gac tta caa agt acc480Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Leu Gln Ser Thr145 150 155 160caa gca tct agt ctg gaa ctg aca gag ata agt aga gaa aat gtt cca528Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Asn Val Pro165 170 175aag tct ggc acg ccc cag ctt agg ctg cca ttc gct gca agg ttg aac576Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu Arg Leu Pro Phe Ala Ala Arg Leu Asn180 185 190acc ccc atg ggc cct gga cga act gtc gtc gtt aaa gga gaa gtg aat624Thr Pro Met Gly Pro Gly Arg Thr Val Val Val Lys Gly Glu Val Asn195 200 205gca aat gcc aaa agc ttt aat gtt gac cta cta gca gga aaa tca aag672Ala Asn Ala Lys Ser Phe Asn Val Asp Leu Leu Ala Gly Lys Ser Lys210 215 220
gat att gct cta cac ttg aac cca cgc ctg aat att aaa gca ttt gta720Asp Ile Ala Leu His Leu Asn Pro Arg Leu Asn Ile Lys Ala Phe Val225 230 235 240aga aat tct ttt ctt cag gag tcc tgg gga gaa gaa gag aga aat att768Arg Asn Ser Phe Leu Gln Glu Ser Trp Gly Glu Glu Glu Arg Asn Ile245 250 255acc tct ttc cca ttt agt cct ggg atg tac ttt gag atg ata att tat816Thr Ser Phe Pro Phe Ser Pro Gly Met Tyr Phe Glu Met Ile Ile Tyr260 265 270tgt gat gtt aga gaa ttc aag gtt gca gta aat ggc gta cac agc ctg864Cys Asp Val Arg Glu Phe Lys Val Ala Val Asn Gly Val His Ser Leu275 280 285gag tac aaa cac aga ttt aaa gag ctc agc agt att gac acg ctg gaa912Glu Tyr Lys His Arg Phe Lys Glu Leu Ser Ser Ile Asp Thr Leu Glu290 295 300att aat gga gac atc cac tta ctg gaa gta agg agc tgg tag954Ile Asn Gly Asp Ile His Leu Leu Glu Val Arg Ser Trp305 310 315<210>6<211>317<212>PRT<213>人<400>6Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val1 5 10 15Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu20 25 30
Ile Val Ile Arg Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val35 40 45Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Met Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe50 55 60His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr65 70 75 80Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro85 90 95Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp100 105 110Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His115 120 125Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val130 135 140Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Leu Gln Ser Thr145 150 155 160Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Asn Val Pro165 170 175Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu Arg Leu Pro Phe Ala Ala Arg Leu Asn180 185 190
Thr Pro Met Gly Pro Gly Arg Thr Val Val Val Lys Gly Glu Val Asn195 200 205Ala Asn Ala Lys Ser Phe Asn Val Asp Leu Leu Ala Gly Lys Ser Lys210 215 220Asp Ile Ala Leu His Leu Asn Pro Arg Leu Asn Ile Lys Ala Phe Val225 230 235 240Arg Asn Ser Phe Leu Gln Glu Ser Trp Gly Glu Glu Glu Arg Asn Ile245 250 255Thr Ser Phe Pro Phe Ser Pro Gly Met Tyr Phe Glu Met Ile Ile Tyr260 265 270Cys Asp Val Arg Glu Phe Lys Val Ala Val Asn Gly Val His Ser Leu275 280 285Glu Tyr Lys His Arg Phe Lys Glu Leu Ser Ser Ile Asp Thr Leu Glu290 295 300Ile Asn Gly Asp Ile His Leu Leu Glu Val Arg Ser Trp305 310 315<210>7<211>1080<212>DNA<213>人
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1080)<223>半乳凝素-8長鏈同種型(hGalectin～8(L))<400>7atg atg ttg tcc tta aac aac cta cag aat atc atc tat aac ccg gta48Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val1 5 10 15atc ccg ttt gtt ggc acc att cct gat cag ctg gat cct gga act ttg96Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu20 25 30att gtg ata cgt ggg cat gtt cct agt gac gca gac aga ttc cag gtg144Ile Val Ile Arg Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val35 40 45gat ctg cag aat ggc agc agc atg aaa cct cga gcc gat gtg gcc ttt192Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Met Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe50 55 60cat ttc aat cct cgt ttc aaa agg gcc ggc tgc att gtt tgc aat act240His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr65 70 75 80ttg ata aat gaa aaa tgg gga cgg gaa gag atc acc tat gac acg cct288Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro85 90 95ttc aaa aga gaa aag tct ttt gag atc gtg att atg gtg ctg aag gac336Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp100 105 110aaa ttc cag gtg gct gta aat gga aaa cat act ctg ctc tat ggc cac384Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His115 120 125
agg atc ggc cca gag aaa ata gac act ctg ggc att tat ggc aaa gtg432Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val130 135 140aat att cac tca att ggt ttt agc ttc agc tcg gac tta caa agt acc480Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Leu Gln Ser Thr145 150 155 160caa gca tct agt ctg gaa ctg aca gag ata agt aga gaa aat gtt cca528Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Asn Val Pro165 170 175aag tct ggc acg ccc cag ctt cct agt aat aga gga gga gac att tct576Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu Pro Ser Asn Arg Gly Gly Asp Ile Ser180 185 190aaa atc gca ccc aga act gtc tac acc aag agc aaa gat tcg act gtc624Lys Ile Ala Pro Arg Thr Val Tyr Thr Lys Ser Lys Asp Ser Thr Val195 200 205aat cac act ttg act tgc acc aaa ata cca cct atg aac tat gtg tca672Asn His Thr Leu Thr Cys Thr Lys Ile Pro Pro Met Asn Tyr Val Ser210 215 220aag agg ctg cca ttc gct gca agg ttg aac acc ccc atg ggc cct gga720Lys Arg Leu Pro Phe Ala Ala Arg Leu Asn Thr Pro Met Gly Pro Gly225 230 235 240cga act gtc gtc gtt aaa gga gaa gtg aat gca aat gcc aaa agc ttt768Arg Thr Val Val Val Lys Gly Glu Val Asn Ala Asn Ala Lys Ser Phe245 250 255aat gtt gac cta cta gca gga aaa tca aag gat att gct cta cac ttg816Asn Val Asp Leu Leu Ala Gly Lys Ser Lys Asp Ile Ala Leu His Leu260 265 270aac cca cgc ctg aat att aaa gca ttt gta aga aat tct ttt ctt cag864Asn Pro Arg Leu Asn Ile Lys Ala Phe Val Arg Asn Ser Phe Leu Gln275 280 285
gag tcc tgg gga gaa gaa gag aga aat att acc tct ttc cca ttt agt912Glu Ser Trp Gly Glu Glu Glu Arg Asn Ile Thr Ser Phe Pro Phe Ser290 295 300cct ggg atg tac ttt gag atg ata att tat tgt gat gtt aga gaa ttc960Pro Gly Met Tyr Phe Glu Met Ile Ile Tyr Cys Asp Val Arg Glu Phe305 310 315 320aag gtt gca gta aat ggc gta cac agc ctg gag tac aaa cac aga ttt1008Lys Val Ala Val Asn Gly Val His Ser Leu Glu Tyr Lys His Arg Phe325 330 335aaa gag ctc agc agt att gac acg ctg gaa att aat gga gac atc cac1056Lys Glu Leu Ser Ser Ile Asp Thr Leu Glu Ile Asn Gly Asp Ile His340 345 350tta ctg gaa gta agg agc tgg tag1080Leu Leu Glu Val Arg Ser Trp355<210>8<211>359<212>PRT<213>人<400>8Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val1 5 10 15Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu20 25 30Ile Val Ile Arg Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val35 40 45
Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Met Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe50 55 60His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr65 70 75 80Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro85 90 95Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp100 105 110Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His115 120 125Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val130 135 140Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Leu Gln Ser Thr145 150 155 160Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Asn Val Pro165 170 175Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu Pro Ser Asn Arg Gly Gly Asp Ile Ser180 185 190Lys Ile Ala Pro Arg Thr Val Tyr Thr Lys Ser Lys Asp Ser Thr Val
195 200 205Asn His Thr Leu Thr Cys Thr Lys Ile Pro Pro Met Asn Tyr Val Ser210 215 220Lys Arg Leu Pro Phe Ala Ala Arg Leu Asn Thr Pro Met Gly Pro Gly225 230 235 240Arg Thr Val Val Val Lys Gly Glu Val Asn Ala Asn Ala Lys Ser Phe245 250 255Asn Val Asp Leu Leu Ala Gly Lys Ser Lys Asp Ile Ala Leu His Leu260 265 270Asn Pro Arg Leu Asn Ile Lys Ala Phe Val Arg Asn Ser Phe Leu Gln275 280 285Glu Ser Trp Gly Glu Glu Glu Arg Asn Ile Thr Ser Phe Pro Phe Ser290 295 300Pro Gly Met Tyr Phe Glu Met Ile Ile Tyr Cys Asp Val Arg Glu Phe305 310 315 320Lys Val Ala Val Asn Gly Val His Ser Leu Glu Tyr Lys His Arg Phe325 330 335Lys Glu Leu Ser Ser Ile Asp Thr Leu Glu Ile Asn Gly Asp Ile His340 345 350
Leu Leu Glu Val Arg Ser Trp355<210>9<211>28<212>PRT<213>人<400>9Asp Leu Gln Ser Thr Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser1 5 10 15Arg Glu Asn Val Pro Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu20 25<210>10<211>70<212>PRT<213>人<400>10Asp Leu Gln Ser Thr Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser1 5 10 15Arg Glu Asn Val Pro Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu Pro Ser Asn Arg20 25 30Gly Gly Asp Ile Ser Lys Ile Ala Pro Arg Thr Val Tyr Thr Lys Ser35 40 45Lys Asp Ser Thr Val Asn His Thr Leu Thr Cys Thr Lys Ile Pro Pro
505560Met Asn Tyr Val Ser Lys65 70<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>起PCR引物作用的寡核苷酸<400>11cgtcctcata tgatgttgtc cttaaacaac ctac34<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>起PCR引物作用的寡核苷酸<400>12cgaccgcata tgcgagctga agctaaaacc aat 33<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>起PCR引物作用的寡核苷酸
<400>13cgtcctcata tgaggctgcc attcgctgca agg33<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>起PCR引物作用的寡核苷酸<400>14cgaccgggat ccctaccagc tccttacttc cag3權利要求
1.蛋白質或其鹽，其特征在于，半乳凝素8或者具有基本上與半乳凝素8同等活性的蛋白質的、連接肽或者其附近區(qū)域被改變。
2.權利要求1所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，改變是由對半乳凝素8或者具有基本上與其同等的活性的蛋白質的、連接肽或者其附近區(qū)域的氨基酸序列中的1個或者其以上的氨基酸進行缺失、取代或添加的氨基酸序列構成，與半乳凝素8相比，至少改變對連接肽的分解感受性。
3.權利要求1或者2所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，具有基本上與半乳凝素8同等活性的蛋白質是與半乳凝素8的氨基酸序列至少具有70％的同源性的蛋白質。
4.權利要求1～3的任一項所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，(1)半乳凝素8的N末端側的糖鏈識別區(qū)域(NCRD)或者具有與其基本上同等活性的多肽，和(2)半乳凝素8的C末端側的糖鏈識別區(qū)域(CCRD)或者具有基本上與其同等活性的多肽，通過(3)對半乳凝素8的連接肽的氨基酸序列中1個或者其以上的氨基酸進行缺失、取代或者添加的氨基酸序列構成的改變連接肽而結合。
5.權利要求1～4的任一項所述的蛋白質或其鹽，其特征在于，(1)具有序列編號3表示的氨基酸序列的多肽、或者具有基本上與其有同等的活性且與序列編號3表示的氨基酸序列至少有70％的同源性的氨基酸序列的多肽、或者具有對序列編號3表示的氨基酸序列中至少1～8個的氨基酸殘基進行了缺失、取代或添加的氨基酸序列的多肽，和(2)具有序列編號4表示的氨基酸序列的多肽、或者具有基本上與其有同等的活性且與序列編號4表示的氨基酸序列至少有70％的同源性的氨基酸序列的多肽、或者具有對序列編號4表示的氨基酸序列中的至少1～21個的氨基酸殘基進行了缺失、取代或添加的氨基酸序列的多肽，通過(3)序列編號9或者10表示的氨基酸序列中對1個或者其以上的氨基酸進行了缺失(其中，不包括序列編號10中29～70位的序列的缺失)、取代或添加的氨基酸序列構成的改變連接肽而結合。
6.核酸，其特征在于，具有編碼權利要求1～5的任一項所述的蛋白質的堿基序列。
7.權利要求6所述的核酸，其特征在于，是多核苷酸。
8.權利要求6或者7所述的核酸，其特征在于，是DNA或者RNA。
9.重組體載體，其特征在于，含有權利要求6～8的任一項所述的核酸。
10.權利要求9所述的重組體載體，其特征在于，除了含有權利要求6～8的任一項所述的核酸以外，還含有編碼標識蛋白質以及/或者肽的堿基序列。
11.轉化體，其特征在于，載有權利要求6～8的任一項所述的核酸或者權利要求9或10所述的重組體載體。
12.權利要求11所述的轉化體，其特征在于，轉化體宿主細胞是原核細胞或者真核細胞。
13.醫(yī)藥，其特征在于，含有作為有效成分的選自權利要求1～5的任一項所述的蛋白質、權利要求6～8的任一項所述的核酸、權利要求9或者10所述的重組體載體以及權利要求11或者12所述的轉化體的物質。
14.權利要求13所述的醫(yī)藥，其特征在于，是免疫調節(jié)劑、抗炎癥劑或者內毒素休克抑制劑。
15.權利要求13所述的醫(yī)藥，其特征在于，是抗腫瘤藥或者抗腫瘤轉移劑。
16.權利要求13所述的醫(yī)藥，其特征在于，是利用選自(1)血細胞凝集活性、(2)凋亡誘導活性、(3)細胞粘附誘導活性、(4)整聯(lián)蛋白αM結合活性、(5)proMMP-9結合活性、proMMP-9活性化作用、或者活性型MMP-9產生促進活性、(6)超氧化物產生促進活性、(7)LPS誘導的炎癥的抑制活性、(8)抑制LPS誘導的TNF-α、IL-12、以及/或者IFN-γ產生的活性、以及(9)內毒素休克抑制活性中的活性，進行治療或者預防病理狀態(tài)或者疾病的藥劑。
17.分析或者檢查試藥，其特征在于，含有作為有效成分的選自權利要求1～5的任一項所述的蛋白質、權利要求6～8的任一項所述的核酸、權利要求9或者10所述的重組體載體以及權利要求11或者12所述的轉化體的物質。
全文摘要
以大腸菌作為宿主生產的重組體半乳凝素8具有血細胞凝集活性、嗜中性細胞粘附誘導活性、整聯(lián)蛋白α
文檔編號A61P29/00GK1989245SQ20058002416
公開日2007年6月27日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權日2004年6月14日
發(fā)明者西望, 平島光臣, 山內清明, 伊藤愛子 申請人:株式會社嘉爾藥物