專利名稱：包含脂質(zhì)體的射線照相造影劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含脂質(zhì)體的射線照相造影劑及其制備方法，具體涉及包含脂質(zhì)體囊泡的射線照相造影劑，鈣造影劑是通過將脂膜組分與超臨界或亞臨界二氧化碳在至少一種含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下混合形成的，并且非離子型碘化合物被高效且穩(wěn)定地包封在脂質(zhì)體內(nèi)。
背景技術(shù)：
利用X射線檢查和診斷是當今醫(yī)學(xué)影像診斷的核心。所謂的硬組織如骨骼和牙齒能夠有效地吸收X射線，因此可以得到高對比度的X射線影像。反之，不同的軟組織之間吸收X射線的差別相對小，難于獲得高對比度的影像。在這種情況下，通常使用造影劑來獲得高對比度的影像。
當前實際應(yīng)用的X射線造影劑幾乎全部都是含有三碘苯基基團的水溶性化合物的造影劑材料。將造影劑送入內(nèi)腔區(qū)域中，例如血管、輸尿管或者輸卵管，用來檢查內(nèi)腔的形狀或狹窄。然而，上述化合物迅速從內(nèi)腔區(qū)域流出，沒有與組織或疾病區(qū)域相互作用，這不利于對組織或疾病區(qū)域具體例如癌組織的詳細檢查。所以，期望有一種X射線造影劑能夠選擇性積聚在目標組織或疾病區(qū)域之內(nèi)/或之上，由此獲得和周圍或其他區(qū)域具有清晰對比區(qū)別的影像。
轉(zhuǎn)運作為細小微粒且能增長血液中對靶組織的半衰期的造影劑的技術(shù)能夠有效克服上述問題。有方法研究了將造影劑化合物包封在脂質(zhì)體內(nèi)，該脂質(zhì)體由與生物膜類似的類脂構(gòu)成，并且顯示出低抗原性。例如，國際公開WO88/09165、WO89/00988、WO90/07491、JP-ANO.07-316079和2003-5596(在下文中，術(shù)語JP-A指日本專利申請公開)提出了一種包含非離子型造影劑的脂質(zhì)體。此外，在上面的方法中，盡管脂質(zhì)體作為原料在體內(nèi)顯示出高度安全性和最佳降解性，然而在制備過程中使用了有機溶劑，特別是含氯溶劑如氯仿和二氯甲烷，作為磷脂形成脂質(zhì)體膜的溶劑(專利文件1)。因此，由于殘留溶劑的毒性，上述方法均不能進行實際應(yīng)用(專利文件2)。
從另一方面來說，盡管脂溶性的化學(xué)物質(zhì)易于被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，但是由于其它因素包封量不一定很大。盡管通過化學(xué)物質(zhì)的電荷與帶電類脂電荷的相互作用，水溶性電解質(zhì)也能被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，但是對于水溶性的非電解質(zhì)，上述方法是行不通的。通常期望將基本上表現(xiàn)出低毒性的非離子型碘化合物而不是離子型造影劑化合物包封在脂質(zhì)體內(nèi)，從上述的原因來看，這并非易事。此外，成型的脂質(zhì)體容易形成多層膜，并且碘化合物的包封率低。將水溶性的非電解質(zhì)有效的包封在脂質(zhì)體內(nèi)的方法包括，例如，反相蒸發(fā)法和乙醚注射法。然而，在這些方法中使用了有機溶劑，會產(chǎn)生安全性問題。
JP-A NO.2003-119120(專利文件3)公開了一種通過使用超臨界二氧化碳制備含有脂質(zhì)體的化妝品或者皮膚外用藥品的方法，該方法具體實施在制備皮膚外用藥品中，使親水性和疏水性的藥用成分密閉在脂質(zhì)體內(nèi)。然而，盡管其中公開了水溶性電解質(zhì)作為藥用成分的例子，但是水溶性非電解質(zhì)通過這種方法是否能有效地包封在脂質(zhì)體內(nèi)是不清楚的。此外，這種方法需要利用輔助溶劑如乙醇來提高包封率，導(dǎo)致不使用有機溶劑就很難制備具有相對高包封率的脂質(zhì)體。即使造影劑材料能夠很好的包封在脂質(zhì)體內(nèi)，一些問題例如隨著時間推移造影劑的泄漏或者由于脂質(zhì)體自身環(huán)境而變得不穩(wěn)定都是必須要考慮的。進一步指出因為脂質(zhì)體導(dǎo)入生物體后幾乎總是陷進網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)中，例如肝或脾，因而并沒有達到預(yù)想的效果(Cancer Res.，43，5328(1983))。與包含自由形式的碘化合物的常規(guī)射線照相造影劑不同的是，當?shù)饣衔锇庠谥|(zhì)體內(nèi)，存在于脂質(zhì)體內(nèi)部和外部的造影劑材料的形式、包封率等等會影響造影劑的性能。因此，仍然期望一種制備脂質(zhì)體的方法，其能夠有效地包封和穩(wěn)定地保留非離子型碘化合物，并且不會產(chǎn)生安全性問題。
正如上文中所討論的，已經(jīng)開展了廣泛的研究來解決這些問題。本發(fā)明已經(jīng)形成一個結(jié)論，即利用脂質(zhì)體對造影劑材料的保留可以通過脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)(其通常由脂質(zhì)雙分子層組成)、其穩(wěn)定性和碘化合物的穩(wěn)定包封而進行改進。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種射線照相造影劑，其通過將造影劑材料包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)而顯示出增強了的轉(zhuǎn)運效率和選擇性。
具體地，本發(fā)明的目的在于提供一種包含脂質(zhì)體的射線照相造影劑及其制備方法，其中碘化合物被有效且穩(wěn)定地包封了并且沒有使用毒性有機溶劑及其制備方法。
專利文件1日本專利NO.2619037專利文件2JP-A NO.7-316079專利文件3JP-A NO.2003-119120發(fā)明內(nèi)容上述目的是通過以下方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明直接涉及制備含有脂質(zhì)體的射線照相造影劑的方法，該方法包括將磷脂和甾醇溶解在超臨界或亞臨界二氧化碳中，在含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下，向其中加入含有碘化合物的水溶液形成膠束，排出二氧化碳形成包封了碘化合物的脂質(zhì)體囊泡。
在上述制備射線照相造影劑的方法中，含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物優(yōu)選含有聚氧化亞烷基的化合物。
含有聚氧化亞烷基的化合物優(yōu)選含有聚氧化亞烷基的類脂，更優(yōu)選含有聚氧化乙烯基的類脂。
上述含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物優(yōu)選包含的量為超臨界或亞臨界二氧化碳重量的0.01到1％。
包含的碘化合物優(yōu)選碘原子的量每ml造影劑為100到350mg的I。
碘化合物優(yōu)選非離子型碘化合物。具體地，碘化合物優(yōu)選至少選自下面組中的一種碘美普爾(iomeprol)、碘帕醇(iopamidol)、碘海醇(iohexol)、碘噴托(iopentol)、碘普胺(iopromide)、碘昔蘭(ioxilane)、碘西胺(iosimide)、iobenzol、碘曲侖(iotrolan)、碘克沙醇(iodixanol)、碘西醇(iodecimol)、碘酞硫(iotasl)、甲泛葡胺和1，3-雙[N-3，5-二-(2，3-二羥丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基]-N-羥基乙酰基-氨基]-丙烷，更優(yōu)選至少選自下面組中的一種碘美普爾、碘帕醇、碘海醇、碘普胺、碘昔蘭、碘酞硫、碘曲侖和碘克沙醇。
脂質(zhì)體囊泡分散在水介質(zhì)中，優(yōu)選重量為70％到90％的碘化合物沒有包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)，而是存在于水介質(zhì)中。
造影劑中含有的全部類脂優(yōu)選每ml造影劑為20到100mg。
包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物與全部類脂的重量比優(yōu)選為3到8(g/g)。
脂質(zhì)體優(yōu)選基本上由單層或數(shù)層囊泡構(gòu)成。
包含的碘化合物優(yōu)選按照碘原子量計為每ml造影劑200到300mg的I(優(yōu)選240到300mg I每ml造影劑)，與造影劑中包含的全部類脂一起為20到80mg/ml。
磷脂(不包括PEG-磷脂)與甾醇的摩爾比優(yōu)選從100/60到100/90。
磷脂(不包括PEG-磷脂)與含有聚氧化亞烷基的類脂的摩爾比優(yōu)選從100/5到100/10。
上述脂質(zhì)體囊泡優(yōu)選平均尺寸為0.05到0.8μm。
含有碘化合物的水溶液優(yōu)選包含選自水溶性胺緩沖液、乙二胺四乙酸鈣二鈉(或EDTA Na2-Ca)、無機鹽、滲透壓調(diào)節(jié)劑和防腐劑中的至少一種。
存在于脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部和外部的水相均優(yōu)選包含作為鹽酸鹽、磷酸鹽或碳酸氫鹽的陽離子，且需滿足以下要求[Na+]+126.[Ca2+]+50.[K+]≤130其中[Na+]是指含量為20到70mM的鈉離子，[Ca2+]是指含量為0.1到0.6mM的鈣離子和[K+]是指含量為0.4到0.8mM的鉀離子，以及鎂離子的含量為0.5到0.8mM。
下面對本發(fā)明進行詳細描述。
本發(fā)明涉及制備包含了脂膜內(nèi)部水相中含有碘化合物的脂質(zhì)體囊泡的射線照相造影劑，脂質(zhì)體的制備是在含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下，通過將形成脂膜的脂膜組分與超臨或亞臨界二氧化碳混合，并且脂質(zhì)體基本不含任何含氯試劑或其他有機溶劑。
射線照相造影劑脂質(zhì)體通常是形成了脂膜結(jié)構(gòu)，即脂質(zhì)雙分子層。本發(fā)明的射線照相造影劑包含了基本不合含氯溶劑的脂質(zhì)體，其中作為造影劑材料的碘化合物被包封在脂膜內(nèi)部的水相中。在一個優(yōu)選的實施方案中，造影劑包含了在脂質(zhì)體膜內(nèi)部的水相中和分散脂質(zhì)體囊泡的水介質(zhì)中的碘化合物和至少一種輔助性添加劑(藥用輔助制劑)，其中各自的濃度優(yōu)選在膜內(nèi)和膜外基本相同。術(shù)語“基本相同”是指彼此的濃度幾乎一樣。在說明書中，把脂質(zhì)體膜也稱作脂膜。
輔助性添加劑是指與造影劑材料一起加入的化合物，根據(jù)制備造影劑的技術(shù)可以使用多種物質(zhì)。其中具體的例子包括生理可接受的緩沖劑、螯合劑如EDTA Na2-Ca(或為乙二胺四乙酸二鈉鈣鹽)或EDTA Na2(或為乙二胺四乙酸二鈉鹽)以及任選的滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑如α-維生素E和粘度調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選的包括水溶性胺類緩沖劑和螯合劑。作為pH緩沖劑，優(yōu)選胺類緩沖劑和碳酸鹽緩沖劑，其中更優(yōu)選胺類緩沖劑并且特別理想的是氨丁三醇(又被稱為氨基三丁醇或2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇)。螯合劑優(yōu)選EDTA Na2-Ca(乙二胺四乙酸二鈉鈣鹽)。
水介質(zhì)是指主要由可溶解碘化合物或輔助性添加劑的水組成的溶劑。這里是指不含放熱材料的可使用的滅菌水。除了脂質(zhì)體膜內(nèi)部的水相之外(或叫做包封水溶液)，還有一種水溶液，即其中分散了脂質(zhì)體囊泡的水介質(zhì)，也包含碘化合物和輔助性添加劑，如水溶性的胺類緩沖劑或螯合劑。因此，膜內(nèi)外的滲透壓沒有差別，由此可保持脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
造影劑化合物可用于造影劑材料的碘化合物優(yōu)選水溶性碘化合物。任何可用作造影劑的離子或非離子型的水溶性碘化合物均可應(yīng)用于本發(fā)明中。非離子的碘化合物，由于通常比離子型碘化合物顯示出較低的滲透壓而優(yōu)選。特別地，本發(fā)明優(yōu)選含有至少一個碘代苯基基團如2，4，6-三碘苯基基團(例如，非離子型三碘苯甲酸類)的水溶性非離子型碘化合物。這種碘化合物優(yōu)選按照碘原子的量為100到350mg I/ml造影劑被包含。
優(yōu)選的非離子型碘化合物的例子包括碘美普爾、碘帕醇、碘海醇、碘噴托、碘普胺、碘昔蘭、碘西胺、iobenzol、碘曲侖、碘克沙醇、碘西醇、碘酞硫、甲泛葡胺和1，3-雙[N-3，5-二-(2，3-二羥丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基]-N-羥基乙?；?氨基]-丙烷。
其中，更優(yōu)選碘美普爾、碘帕醇、碘海醇、碘普胺、碘昔蘭、碘酞硫、碘曲侖和碘克沙醇。
此外，非離子型碘化合物的例子包括泛影酸、泛影酸鈉、泛影葡甲胺、醋碘苯酸及其可溶性鹽、尿影酸、碘達酸、膽影酸鈉、膽影葡甲胺、碘馬尿酸及其可溶性鹽、碘代甲胺酸(iodomethamic acid)、碘吡拉啥、碘-2-吡啶酮-N-乙酸、3，5-二碘-4-吡啶酮-N-乙酸(碘吡拉啥)、上述酸類的二乙基銨鹽、碘拉酸、甲泛影酸及其鹽、碘番酸、碘醋胺酸、碘芬酸及其可溶性鹽、sodium thyropanoate、碘泊酸鈉和其它類似的碘化合物。
優(yōu)選造影劑中包含的全部碘化合物重量的70％到95％不是包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部，而是存在于分散囊泡的水介質(zhì)中。
全部類脂含量優(yōu)選為20到100mg每ml造影劑。
包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物與上述全部類脂重量比優(yōu)選為3到8(g/g)。
脂質(zhì)體囊泡均優(yōu)選為單層囊泡或數(shù)層囊泡，數(shù)層囊泡是指一個囊泡由幾層脂膜組成。
本發(fā)明的造影劑中的全部類脂含量優(yōu)選為20到100mg/ml，更優(yōu)選為20到80mg/ml，更優(yōu)選為40到90mg/ml，最優(yōu)選為50到80mg/ml。在這里，全部類脂是指形成脂質(zhì)體的所有類脂，包括磷脂、甾醇和乙二醇。全部類脂可以基本上認為是造影劑中包含的脂質(zhì)體的量。然而，脂質(zhì)體存在多種形式，因此全部類脂的量不能簡單的相當于脂質(zhì)體的量。作為本發(fā)明的射線照相造影劑的一個目的，為了獲得輸送的效率，脂質(zhì)體優(yōu)選盡可能多的包封碘化合物，但是過高濃度的溶液會帶來比如脂質(zhì)體囊泡的凝結(jié)或者造影劑粘度的增加等麻煩。
這些碘化合物可以單獨使用也可聯(lián)合使用。應(yīng)用于本發(fā)明中的碘化合物并不限于上述所列舉的化合物，并且不僅包括游離形式還包括其鹽和水合物形式。
在本發(fā)明中適合作為射線照相造影劑的碘化合物優(yōu)選碘美普爾、碘帕醇、碘曲侖和碘克沙醇，它們即使在相對高的濃度中也顯示出高親水性和低滲透壓。特別是二聚的非離子型碘化合物如碘曲侖和碘克沙醇更具優(yōu)勢，因為當在相同的碘濃度中制備時，它們制備得到的造影劑有更低的總分子量，會使?jié)B透壓降低。
根據(jù)本發(fā)明的造影劑中含有的水溶性碘化合物的濃度可根據(jù)以下因素任意設(shè)定例如造影劑化合物的性質(zhì)、作為藥物的預(yù)期劑量和臨床指南。脂質(zhì)體內(nèi)包封的水溶性碘化合物的量一般占造影劑包含的全部碘化合物重量的5％到95％，優(yōu)選5％到90％且更優(yōu)選5％到70％。特別地，本發(fā)明中為了防止脂質(zhì)體內(nèi)包封的碘化合物不穩(wěn)定，脂質(zhì)體內(nèi)包封的水溶性碘化合物通常占全部碘化合物重量的5％到35％，優(yōu)選5％到30％，更優(yōu)選5％到25％。如果被包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的水溶性碘化合物的比例占到造影劑中包含的全部碘化合物重量的5％到30％(優(yōu)選重量的5％到25％)，被包封的碘化合物流出到囊泡外的水分散體中，其中殘留物占重量的70％到95％(或者重量的75％到95％)，基本上可以被忽略。相應(yīng)地，由于脂質(zhì)體滲透壓的影響，碘化合物的包封能夠防止不穩(wěn)定性，從而增強造影劑材料的穩(wěn)定性。
根據(jù)前述，造影劑脂膜內(nèi)部的水相中包封的碘原子的重量為10到200mg/ml，優(yōu)選20到180mg/ml，更優(yōu)選70到110mg/ml。這也是由前面的包封率和全部碘含量定義的參數(shù)。
脂質(zhì)體在本發(fā)明的射線照相造影劑中，上述造影劑化合物以脂質(zhì)體內(nèi)包封物的形式被使用，脂質(zhì)體作為一種微型載體能夠有效且有選擇地將造影劑化合物轉(zhuǎn)運到目標區(qū)域例如靶器官或組織。應(yīng)用脂質(zhì)體的造影劑能增加在血液中的保留時間，促進血液的穩(wěn)定性，由此獲得有效的藥物轉(zhuǎn)運和靶向作用。需要通過與保留效果密切相關(guān)的改進如穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)和包封材料的保留穩(wěn)定性以及一些特性如血液穩(wěn)定性和血液保留性從而產(chǎn)生EPR(增強的滲透性和保留時間)效果，其對獲得極佳的腫瘤影像很有效。
在本發(fā)明的射線照相造影劑中，適當設(shè)計囊泡尺寸和包封造影劑化合物的脂質(zhì)體雙分子膜能夠獲得靶向作用，其中主動靶向作用和被動靶向作用都已考慮到了。前者通過調(diào)整囊泡尺寸、類脂成分或者脂質(zhì)體的電荷能夠控制生物學(xué)行為。通過隨后描述的方法可以很容易地將脂質(zhì)體的尺寸調(diào)整到狹窄的范圍。脂質(zhì)體膜表面的設(shè)計可以通過改變磷脂的種類和組分及包封材料來完成以提供想要得到的特性。
還應(yīng)考察主動靶向的引入，它能夠提高造影劑的完整性和選擇性。例如，引入能夠控制向靶向區(qū)域的指引過程的聚氧化亞烷基或者聚乙二醇(PEG)的聚合物鏈，是非常有好處的。適合本發(fā)明造影劑的脂質(zhì)體是表面經(jīng)聚氧化亞烷基或者PEG修飾的能夠延長在血液中的保留時間的脂質(zhì)體和不容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細胞如肝臟吞噬(binged)的脂質(zhì)體。沒有到達癌組織或者發(fā)病區(qū)域的造影劑，并沒有積聚在正常區(qū)域，而是在由脂質(zhì)體降解引起副作用之前就被排出體外。這可以通過在脂質(zhì)體設(shè)計中優(yōu)化控制脂質(zhì)體的穩(wěn)定性與向外排出的時間關(guān)系而實現(xiàn)。碘化合物作為造影劑材料能夠迅速經(jīng)腎排入尿中，因此能夠阻止由體內(nèi)無效保留引起的不利影響和延遲副作用的發(fā)生。
通常優(yōu)選磷脂和/或糖脂作為脂質(zhì)體脂膜(或脂雙層)的組分。在本發(fā)明中，射線照相造影劑中包含的脂質(zhì)體，如下所述地，是在至少一種含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下，通過將形成脂膜的組分與超臨界或亞臨界二氧化碳混合而制備的。
脂質(zhì)體中優(yōu)選的中性磷脂的例子包括從大豆或蛋黃中得到的卵磷脂和溶血卵磷脂，以及它們的氫化產(chǎn)物或氫氧化衍生物。此外，磷脂的例子還包括磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和神經(jīng)鞘磷脂，它們都來源于蛋黃、大豆或其它動植物，或者通過半合成的方法獲得；或通過合成的方法得到磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPS)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕櫚酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和二硬脂酰磷脂酸(DSPA)。
用于本發(fā)明的陽離子類脂的例子包括1，2-二油酰氧-3-(三甲銨)丙烷(DOTAP)、N，N-雙十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二甲基十八烷基溴化銨(DDAB)、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺-碳氧酰氨)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸銨鹽(DOSPA)和N-[1-(2，3-二肉豆蔻氧)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨(DMRIE)。
陽離子磷脂的例子包括磷脂酸和氨基醇的酯，例如，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)或二硬脂酰磷脂酸(DSPA)和羥基乙二胺的酯。包含的這些陽離子的重量是全部類脂重量的0.1％到5％，優(yōu)選重量的0.3到3％，更優(yōu)選重量的0.5％到2％。
這些磷脂可以單獨使用也可以兩種或兩種以上聯(lián)合使用。優(yōu)選所用的兩種或兩種以上帶電磷脂帶同種電荷，即全帶負電或全帶正電，這樣可以防止脂質(zhì)體的凝集。中性磷脂和帶電磷脂聯(lián)合使用優(yōu)選重量比為200∶1到3∶1，更優(yōu)選100∶1到4∶1，且更優(yōu)選40∶1到5∶1。
甘油糖脂的例子包括甘油類脂，例如雙半乳糖甘油二酯和雙半乳糖甘油二酯硫酸酯；鞘氨醇糖脂如半乳糖甘油酯、半乳糖甘油酯硫酸酯、乳糖甘油酯、神經(jīng)節(jié)苷脂G7、神經(jīng)節(jié)苷脂G6和神經(jīng)節(jié)苷脂G4。
除了上述的類脂外，也可以選擇性的含有其它物質(zhì)作為脂膜的組分。例如，用作脂層穩(wěn)定劑的有膽固醇、二氫膽固醇、膽固醇酯、植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇、膽甾烷醇、羊毛甾醇和2，4-二羥基羊毛甾醇。此外，甾醇的衍生物例如1-O-甾醇半乳糖甙、1-O-甾醇麥芽糖甙和1-O-甾醇半乳糖甙顯示對穩(wěn)定脂質(zhì)體有效(參見JP-A No.5-245357)，并且前面所述的甾醇，特別優(yōu)選膽固醇。
甾醇的用量通常為磷脂重量的0.05到1.5倍，優(yōu)選重量的0.2到1倍，更優(yōu)選重量的0.3到0.8倍，。小于重量的0.05倍不能通過增強混合類脂的分散性而起到穩(wěn)定作用，大于重量的2倍會抑制脂質(zhì)體的形成或得到不穩(wěn)定的形式。
被包封在脂膜內(nèi)的膽固醇能夠起到像錨(anchor)一樣的作用用來將聚氧化亞烷基引入。具體地，膽固醇作為脂膜組分包含在脂質(zhì)體中，可以選擇性地經(jīng)錨與聚氧化亞烷基基團連接。短鏈的烯基或氧化烯基可被用作錨。JP-ANo.9-3093公開了新的膽固醇衍生物，其中多種活性物質(zhì)能夠有效的固定在聚氧化烯烴鏈的上部，用作脂質(zhì)體的組分。
所用的甾醇優(yōu)選磷脂(不包括PEG-磷脂)/甾醇的摩爾比為100/60到100/90，更優(yōu)選100/70到100/85。摩爾比是基于不包括PEG-磷脂的磷脂的量。摩爾比小于100/60不能通過類脂混合物的分散作用達到穩(wěn)定作用。
除了上述的甾醇之外，也可以加入二醇作為脂質(zhì)體囊泡膜的組分。在制備脂質(zhì)體時，磷脂與二醇一起加入能增強包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的水溶性碘化合物的持有率。二醇的例子包括乙二醇、二甘醇、三甘醇、丙二醇、一縮二丙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、新戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇和頻哪醇。二醇的用量優(yōu)選為全部類脂重量的0.01％到20％，更優(yōu)選重量的0.5％到10％。
其它的添加劑化合物包括，例如，提供負電荷的物質(zhì)、磷脂酸烷基酯如二乙酰磷酸酯和提供正電荷的物質(zhì)，脂肪胺如硬脂酰胺。
制備脂質(zhì)體時，利用含有羥基或聚氧化亞烷基(PAO)基團的化合物(優(yōu)選含有聚氧化亞烷基或類似基團的磷脂或膽固醇)和超臨界或亞臨界狀態(tài)下的二氧化碳會產(chǎn)生顯示出相對高包封率的脂質(zhì)體，且沒有使用有機溶劑。為了克服一些問題如被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細胞俘獲和脂質(zhì)體本身的不穩(wěn)定性如破壞或凝集，試圖引入聚合物鏈如聚乙二醇(PEG)鏈(又稱為聚氧化乙烯基基團，(CH2CH2O)n-H)到脂質(zhì)體表面，參見JP-A NO.1-249717中的和FEBS letters268，235(1990)中的描述。
將聚氧化亞烷基鏈(又稱為聚氧化烯基鏈)或PEG鏈連接到脂質(zhì)體囊泡的表面上能夠給脂質(zhì)體帶來新的作用。例如，這種PEG修飾的脂質(zhì)體預(yù)計對于免疫系統(tǒng)具有更低的可識別性(所謂的隱身狀態(tài))。已經(jīng)證明脂質(zhì)體具有親水傾向會促進血液穩(wěn)定性，從而在很長一段時間可穩(wěn)定地保持血液濃度，參見Biochim.Biophys.Acta.，1066，29-36(1991)。JP-ANO.2002-37833中公開了一種技術(shù)，其中經(jīng)聚氧化亞烷基修飾的磷脂混入脂質(zhì)體膜中，來增加脂質(zhì)體在血液中的保留時間。這種脂質(zhì)體還顯示出改善的老化穩(wěn)定性。
上述性質(zhì)能夠使本發(fā)明的射線照相造影劑具有器官-特異性。例如，因為類脂成分容易積聚在肝臟，使用未含有或含有微量PEG的脂質(zhì)體預(yù)計有所選擇性的與肝臟對照。增加囊泡的尺寸到200nm或更大導(dǎo)致肝臟枯否氏細胞(Kupffer cells)吞噬作用迅速合并的可能性增加，引起在所述肝臟位點中的積聚。在給肝癌成像時，由于癌組織的枯否氏細胞比正常細胞少，造影劑脂質(zhì)體合并的量較少，能形成清晰的對照。
在其它器官的成像情況中，通過引入PEG，脂質(zhì)體成了隱身狀態(tài)，在肝臟中的聚集變的困難，所以，推薦使用PEG修飾的脂質(zhì)體。PEG的引入形成了水合球體，從而穩(wěn)定脂質(zhì)體和增強血液保留。通過改變PEG中氧化乙烯單元的長度和引入比例，可以調(diào)整其功能。作為PEG優(yōu)選具有10到3500(優(yōu)選100到2000)個氧化乙烯單元的聚乙二醇。按照構(gòu)成脂質(zhì)體的類脂量，優(yōu)選含有PEG為重量的1％到40％，更優(yōu)選重量的5％到25％。
脂質(zhì)體中的PEG進行修飾可以通過公知技術(shù)來完成。例如，連接在一種錨式化合物(如膽固醇)上的聚乙二醇(PEG)基團與作為膜組分的磷脂相混合形成脂質(zhì)體，該錨式化合物可與活化的PEG基團相連接。由于引入脂質(zhì)體表面的PEG基團與將在下面陳述的功能性材料(“functional material”)不發(fā)生反應(yīng)，很難將功能性材料固定在脂質(zhì)體表面上。與其相反，頂端經(jīng)化學(xué)修飾的PEG與磷脂結(jié)合，而作為制備脂質(zhì)體的組分。
可引入公知的聚氧化亞烷基基團代替聚乙二醇，聚氧化亞烷基基團用通式-(AO)n-Y表示，其中AO為具有2至4個碳原子的氧化烯基基團；n表示平均加成摩爾數(shù)，為1至2000的整數(shù)(優(yōu)選10到500，更優(yōu)選20到200)；Y為氫原子、烷基基團或者官能團。
具有2至4個碳原子的氧化烯基基團的例子包括氧化乙烯基基團、氧化丙烯基基團、氧化三亞甲基基團、氧化四亞甲基基團、氧-1-乙基乙烯基基團和氧-1，2-二甲基乙烯基基團。
當n≥2時，兩個以上的氧化烯基可相同或不同。對于后者，氧化亞烷基可以以隨機的形式或者嵌段共聚的形式而不同。為了使氧化烯基具有親水性，優(yōu)選只用氧化乙烯進行加成聚合反應(yīng)，其中n優(yōu)選≥10。在不同的氧化烯基之間發(fā)生加成聚合反應(yīng)的情況中，預(yù)計至少20mol％(優(yōu)選至少50mol％)的氧化烯基進行了加成聚合。為了使氧化烯基具有親油性，優(yōu)選增加除氧化乙烯之外的烯化氧的摩爾濃度。例如，包含聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(或稱聚氧乙烯嵌段共聚聚氧丙烯)的脂質(zhì)體是本發(fā)明優(yōu)選的一種實施例。
上述的Y的官能團是將功能性物質(zhì)如糖、糖蛋白、抗體、凝集素和細胞粘合因子連接到聚氧化亞烷基上的基團，其中具體實例包括氨基、氧化羰基咪唑基團和N-羥基琥珀酰亞胺。
錨向聚氧化亞烷基鏈且上部結(jié)合了前述的功能性物質(zhì)的脂質(zhì)體，不僅顯示出由于引入聚氧化亞烷基基團的效果，還能給出功能性物質(zhì)全面的作用，例如，識別部件的功能，如對具體器官的方向性和對癌組織的方向性。為了具有對癌組織的方向性，將相對應(yīng)于只存在在瘤細胞中的特定腫瘤抗原的抗腫瘤的單克隆抗體結(jié)合到脂質(zhì)體膜上，從而為脂質(zhì)體帶來高的目標選擇性(參見，例如，JP-A No.11-28087)。
含有聚氧化亞烷基的磷脂或膽固醇可單獨使用或者聯(lián)合使用?；谥|(zhì)體膜形成組分的總量計算，其含量優(yōu)選為0.001到50mol％，更優(yōu)選0.01到25mol％，且更優(yōu)選0.1到10mol％。含量小于0.001mol％會導(dǎo)致降低預(yù)期效果。
關(guān)于磷脂聚氧化亞烷基衍生物為提出的經(jīng)修飾的磷脂，由以下分子式表示(參見JP-A NO.7-165770)分子式 其中R1和R2分別為具有2至29個碳原子的烷基基團；M為氫原子或堿金屬原子如鈉或鉀；AO、n和Y分別同上述定義。
其中具體實例包括磷脂酰胺的聚氧乙烯(PEO)衍生物等，如二硬脂酰磷脂酰二乙醇胺聚氧乙烯(DSPE-PEO)。此外，JP-ANO.2002-37883公開了用于制備水溶性的多聚體修飾的脂質(zhì)體的、純度極高的聚氧化亞烷基修飾的磷脂，顯示出增強的血液保留性。還公開了在制備脂質(zhì)體時使用具有相對低單酰基含量的聚氧化亞烷基修飾的磷脂會給脂質(zhì)體分散體帶來非常出色的老化穩(wěn)定性。
脂質(zhì)體的制備根據(jù)本發(fā)明的射線照相造影劑的制備方法，其特征在于，在含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下，將作為脂膜組分的磷脂和至少一種陽離子類脂和甾醇與超臨界或亞臨界二氧化碳混合，然后將碘化合物的水溶液導(dǎo)入其中形成膠束(雙分子層膠束)，其后，排出二氧化碳形成包封了包含碘化合物的水性中心的脂質(zhì)體囊泡。碘化合物的水溶液進一步優(yōu)選含有輔助性添加劑。
這里還提出了多種制備脂質(zhì)體的方法。不同的方法經(jīng)常最終產(chǎn)生形狀和性質(zhì)差別很大的脂質(zhì)體，參見JP-A NO.6-80560。所以，應(yīng)根據(jù)所需脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)或特征選擇最適合的制備方法。通常，通過將類脂組分如磷脂、甾醇和凝集素幾乎沒有例外地溶解于有機溶劑如氯仿、二氯甲烷、乙醚、四氯化碳、乙酸乙酯、二噁烷或四氫呋喃(THF)中制備脂質(zhì)體。特別地，經(jīng)常使用含氯溶劑。這樣制備的脂質(zhì)體必然含有有機溶劑。因此，需要長時間多步驟的處理來去除殘留的有機溶劑。很難將殘留的有機溶劑特別是含氯溶劑完全去除，而這由于會對生物體產(chǎn)生副作用而引起關(guān)注。
制備本發(fā)明的脂質(zhì)體，使用了利用超臨界或亞臨界二氧化碳的方法來避免上述問題。選擇二氧化碳是因為它具有31.1℃的臨界溫度和75.3kg/cm2的臨界壓力且相對易于操作，為惰性氣體且即使殘留也對人體無毒，其高純度液體價廉且容易獲得。通過這種方法制備的脂質(zhì)體包封碘化合物作為射線照相造影劑具有優(yōu)勢和優(yōu)點，這將在下文中描述。
利用超臨界或亞臨界二氧化碳進行脂質(zhì)體的制備，需要將脂膜組分溶解或分散在超臨界狀態(tài)(包括亞臨界狀態(tài))下的二氧化碳中。溶解、分散或混合優(yōu)選在作為助溶劑(或稱為輔助性溶劑)的含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下進行。
上述的含有羥基的化合物(或稱為包含羥基的化合物)包括含有羥基、多元醇基團、聚亞烷基二醇醚基團、或者乙二醇/聚乙二醇醚基團的組合作為親水性基團的化合物。優(yōu)選使用含有羥基的化合物作為助溶劑，其顯示出對脂膜組分如磷脂或膽固醇的親合力且易于與其混合。顯示出最佳的親水性和親油性的兩親型化合物適于將脂膜組分分散在極性二氧化碳流體(或液體)中。
糖類也被用作含有羥基的化合物。具體地，單糖包括，例如，己糖如脫氫抗壞血酸、季戊四醇、山梨醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺和N-乙酰葡糖胺，以及戊糖如木糖、核糖和阿拉伯糖。寡糖包括，例如，二糖如麥芽糖、乳糖、海藻糖和異麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、甘露三糖、甘露三糖、麥芽四糖和麥芽五糖。此外多糖包括，例如，纖維素和直鏈淀粉(或為淀粉)，但并不限于這些。
由于擔(dān)心殘余助溶劑的毒性，根據(jù)安全性不使用低級醇作為含有羥基的化合物是可取的?？紤]到有效性和安全性，助溶劑優(yōu)選含有聚乙二醇基團的化合物，更優(yōu)選含有聚乙二醇基團的類脂，其中優(yōu)選具有10到3500個(優(yōu)選100到2000個)氧化乙烯單元的聚乙二醇。
一種或多種含有羥基的化合物的使用能增加包封率。含有羥基的化合物被用作助溶劑，其優(yōu)選用量為超臨界或亞臨界二氧化碳重量的0.01％到1％，且更優(yōu)選重量的0.1％到0.8％。
本發(fā)明中所用的超臨界或亞臨界二氧化碳的溫度通常是從25℃到200℃，優(yōu)選從31℃到100℃，且更優(yōu)選從35℃到80℃。其中壓力通常是從50到500kg/cm2，優(yōu)選從100到400kg/cm2，且特別優(yōu)選90到150kg/cm2。
以下面的方式制備本發(fā)明中用作射線照相造影劑的脂質(zhì)體。將液態(tài)二氧化碳加入到壓力容器中且置于在上述適宜的壓力和溫度下的超臨界狀態(tài)或亞臨界狀態(tài)中。將作為脂質(zhì)體脂膜組分的磷脂和穩(wěn)定脂膜的材料在上述含有羥基的化合物的存在下溶解或分散在超臨界(或亞臨界)二氧化碳內(nèi)。其中可加入陽離子的磷脂或含有聚氧化亞烷基的化合物(例如，聚氧化亞烷基修飾的磷脂)作為膜類脂?？蛇x擇地，將液態(tài)二氧化碳加入到預(yù)先加入上述化合物的壓力容器內(nèi)，且通過調(diào)整溫度和壓力置于超臨界狀態(tài)中。然后，將含有碘化合物的水溶液和任選的上述輔助性溶劑導(dǎo)入到已形成的含有磷脂和穩(wěn)定脂膜材料的超臨界二氧化碳中來形成膠束。加入部分和被加入部分是可以互換的?；旌贤瓿珊?，容器內(nèi)部抽真空排出二氧化碳以形成脂質(zhì)體內(nèi)部包封了碘化合物的水分散體。在這種情況下，碘化合物還可被包含在除脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部的水相之外的囊泡外面的水相中(外部水相)。既然上述的水溶液被包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部，則現(xiàn)在碘化合物不僅存在于外部水相中還主要存在于脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部的水相中，處于所謂的內(nèi)囊狀態(tài)。此外，脂質(zhì)體還要通過孔徑為0.1到1.0μm(優(yōu)選0.1到0.5μm)的多孔過濾器。然后，經(jīng)藥劑制備加工過程，如消毒處理和包裝，本發(fā)明的射線照相造影劑就制備完成了。
已經(jīng)證實通過超臨界或亞臨界二氧化碳制備脂質(zhì)體具有脂質(zhì)體高形成率、包封材料高包封百分率和脂質(zhì)體內(nèi)的被包封材料的高保持率，參見JP-ANO.2003-1191120。此外，本發(fā)明中的上述方法，甚至能達到工業(yè)化應(yīng)用程度，能使非離子型水溶性物質(zhì)在脂質(zhì)體中得到有效包封，基本上不需任何有機溶劑，適用于制備本發(fā)明的射線照相造影劑。上述表述“基本上不需任何有機溶劑”是指殘留的有機溶劑的含量不超過10μg/l。
射線照相造影劑的制備用于本發(fā)明的射線照相造影劑的脂質(zhì)體選自那些基本上由單層膜或數(shù)層膜組成的脂質(zhì)體。單層膜的脂質(zhì)體是指由單層的囊泡組成的脂質(zhì)體，也就是說，由單一的磷脂雙分子層形成的單層囊泡?；旧嫌蓡螌幽そM成的脂質(zhì)體是指由磷脂雙分子層構(gòu)成，利用冷凍斷裂復(fù)制技術(shù)經(jīng)透射式電子顯微觀察其復(fù)制品，幾乎均被識別為單層的。因此，當觀察保留在碳膜上的微粒印記時，那種沒有差別的可判斷為單層囊泡，那種具有兩種或兩種以上差別的是多層囊泡。上述術(shù)語“基本上”的含義是指，以總脂質(zhì)體的量也就是射線照相造影劑中含有的總囊泡量計，這種單層囊泡的量優(yōu)選含有至少80％，更優(yōu)選90％。
單膜脂質(zhì)體或由數(shù)層膜組成的脂質(zhì)體，即單層囊泡能夠利用上述超臨界二氧化碳作為類脂溶劑并經(jīng)水相分離方法得到有效地制備。反之，在傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備方法中，脂質(zhì)體由多層囊泡(MLV)構(gòu)成，即通常多層囊泡占相當大的比例。因此，需要一些如超聲處理或者經(jīng)特定大小的孔過濾操作以增加單層脂質(zhì)體的比例。單層囊泡具有使得加入的脂質(zhì)體量或特定的類脂量通常少于多層囊泡的優(yōu)點。
單層囊泡，特別是大單層囊泡(LUV)其優(yōu)勢是比多層囊泡具有更大的包封能力。應(yīng)用在射線照相造影劑中的脂質(zhì)體介于尺寸為0.2至1μm的LUV和小于0.05μm的小單層囊泡(SUV)之間。因此，保留體積超過了SUV且水溶性碘化合物的俘獲率即包封率變得更好，這將在后面描述。此外，與MLV或LUV所不同的是，這種囊狀脂質(zhì)體由于結(jié)合在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細胞內(nèi)而不會從血流中迅速消失。
然而，即使單層囊泡表現(xiàn)出較好的碘化合物包封率，當包封的碘化合物重量相對過多時會降低其穩(wěn)定性。特別地，據(jù)觀察由于離子強度的迅速改變而具有變?nèi)鮾A向。將用于本發(fā)明造影劑的脂質(zhì)體調(diào)整為相對小的囊泡尺寸并且結(jié)合選自含有聚氧化亞烷基的化合物(例如，磷脂)、甾醇和乙二醇中的至少一種化合物而形成囊泡膜能增強脂膜的穩(wěn)定性。結(jié)果證明這種脂質(zhì)體能夠抵抗鹽的沖擊。
作為微粒的脂質(zhì)體的囊狀微粒尺寸(或稱為脂質(zhì)體囊泡尺寸，下文也簡稱為囊泡尺寸)及其分布與增強血液保留性質(zhì)、靶向能力和轉(zhuǎn)運效率這些與本發(fā)明目有關(guān)的方面密切相關(guān)。囊泡尺寸可以通過以下方法測定，將含有包封了碘化合物的脂質(zhì)體囊泡的分散體冷凍并斷裂后，使碳蒸發(fā)沉積(vapor-deposited)在斷裂界面上，再通過電子顯微鏡觀察沉積的碳(冷凍斷裂TEM法)。囊泡尺寸可以通過設(shè)定或控制工藝條件來調(diào)整。例如，增加前述的超臨界壓力會導(dǎo)致脂質(zhì)體囊泡尺寸的減小。利用聚碳酸酯膜過濾以使囊泡尺寸分布在更窄范圍內(nèi)。因此，使脂質(zhì)體通過安裝了0.1到0.5μm孔徑過濾器的擠壓機可有效獲得具有不到0.4μm的平均囊泡尺寸的單層囊泡脂質(zhì)體。本發(fā)明中，平均囊泡尺寸是指特定數(shù)目的被觀察的造影劑的囊狀微粒的簡單(或算術(shù))平均值，例如，20個囊泡。該值通常與中心囊泡尺寸相同或接近，中心囊泡尺寸是指在囊泡尺寸分布中具有最高頻率的囊泡尺寸。除了前述的調(diào)整尺寸的操作，又加入了該擠壓操作，其具有的優(yōu)點如調(diào)整存在于脂質(zhì)體囊泡外部的碘化合物濃度、改變脂質(zhì)體分散溶液和除去雜質(zhì)。
脂質(zhì)體微粒的尺寸對增強脂質(zhì)體的主動靶向能力是重要的。例如，日本專利NO.2619037公開了將3μm或更大的脂質(zhì)體排除就可避免在肺毛細管中的不利保留。然而，0.5到3μm的脂質(zhì)體不一定表現(xiàn)出腫瘤的指向性。
用于本發(fā)明的造影劑的脂質(zhì)體的平均囊泡尺寸優(yōu)選0.05到0.5μm，更優(yōu)選0.05到0.2μm，而且更優(yōu)選0.05到0.13μm。囊泡尺寸可以根據(jù)X射線成像的目標進行調(diào)整。例如，目的是給腫瘤區(qū)域有選擇的成像時，優(yōu)選0.11到0.13μm。調(diào)整脂質(zhì)體囊泡尺寸為0.1到0.2μm的范圍內(nèi)(優(yōu)選0.11到0.13μm)可使造影劑選擇性的集中在癌組織。這被認為是EPR效應(yīng)。實體癌組織血管化壁上的孔異常地大于孔徑為30到80nm的正常組織毛細管壁微孔，因此即使是約0.1到約0.2μm的大分子也通過血管壁泄漏。因此，EPR效應(yīng)是由于癌組織血管壁的滲透性比正常組織的微血管壁的滲透性高。
由于淋巴管在癌組織周圍沒有充分生長，通過血管壁泄漏的造影劑不能回到血管中并在那里保留相對長的時間。EPR效應(yīng)是利用血流的被動轉(zhuǎn)運，因此需要增加的血液保留時間以有效的發(fā)展這種效應(yīng)。因此，造影劑微粒(或者包封碘化合物的脂質(zhì)體囊狀微粒)需要保留在血液中，并且很多次經(jīng)過靠近癌細胞的血管。本發(fā)明的射線照相造影劑，其沒有包含任何特別大的粒子，不易變成被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細胞俘獲的目標。脂質(zhì)體囊泡，其形狀與紅細胞相似并且行為也與紅細胞相似，在血液中長時間保留且不會迅速經(jīng)腎排出，被覆蓋時不會被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細胞吞噬。EPR效應(yīng)必然會加強造影劑化合物向靶器官或組織的轉(zhuǎn)移，并且有選擇地集中并積聚在癌組織中。瘤細胞/正常細胞累積比率的升高可以增強造影劑的對照效果。改進的腫瘤造影術(shù)使發(fā)現(xiàn)微小的轉(zhuǎn)移瘤成為可能，其到目前為止還是難于被檢測。
當?shù)饣衔锉话庠谧鳛槲⑿洼d體的脂質(zhì)體中時，除了造影劑材料的運載率和保留穩(wěn)定性外，還必須考慮脂膜的量。增加類脂的量會增高造影劑的粘度。包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物的量，其包含在包封于脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的水溶液中，按照包封在囊泡內(nèi)的碘化合物與形成囊狀膜的類脂的重量比，優(yōu)選從1到10，更優(yōu)選從3到8，且更優(yōu)選從5到8。
包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物的重量比小于1時需要注入相對大量的類脂，導(dǎo)致降低了的造影劑材料的轉(zhuǎn)運率。根據(jù)日本專利NO.2619037中的描述，根據(jù)當時的技術(shù)水平即使重量比為1也是相對高的值。因為射線照相造影劑的粘度取決于脂質(zhì)體中類脂的含量，表現(xiàn)出增強了保留體積和包封率的單膜形成的脂質(zhì)體(單層囊泡)或數(shù)層膜形成的脂質(zhì)體具有明顯地優(yōu)勢。相反，當包封的碘化合物與脂質(zhì)體膜的類脂的重量比超過10時，脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)會變得不穩(wěn)定，并且不可避免地在儲藏期間或者甚至在注射入生物體內(nèi)后碘化合物從脂膜中擴散或泄漏。此外，專利申請?zhí)枮镹O.9-505821的PCT國際申請的日本公開文本中描述到，即使在制備和分離脂質(zhì)體分散體系之后立即達到100％的包封，包封的組分也會在短時間內(nèi)減少由于滲透壓造成的不穩(wěn)定影像。
本發(fā)明的射線照相造影劑不是經(jīng)口服而是經(jīng)血管優(yōu)選經(jīng)靜脈內(nèi)如注射或滴注給予人類，然后在X射線下進行成像。在CT檢查中，特別是為了血管損害或腫瘤損害成像時，大多數(shù)情況下，經(jīng)常在短時間內(nèi)給予大量相對高濃度的造影劑。為了能夠如此大劑量的注射，用于成像的造影劑的必要條件是組分的流動性和低粘滯性。為了降低注射阻力以減少受試者的痛苦并且也為了避免血細胞滲出的危險，本發(fā)明組分的溶液的粘度優(yōu)選在37℃下不超過20mPa·s(用Ostwald法測量)，更優(yōu)選不超過18mPa·s，且更優(yōu)選不超過15mPa·s。有時候需要其具有一定程度的粘性可以經(jīng)腫瘤稀釋來減慢進程，這取決于身體被成像的位置。
相對高滲摩濃度會給心臟和循環(huán)系統(tǒng)帶來負擔(dān)。與血液是等滲的溶液或懸浮液是通過將造影劑材料以形成等滲溶液的濃度溶解或懸浮在介質(zhì)中而制備得到的。例如，當?shù)葷B溶液不能僅用造影劑化合物制備時，由于其低溶解性，可加入非離子型水溶性物質(zhì)，像鹽類如氯化鈉，或糖類如甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇來形成等滲溶液或懸浮液。
碘化合物的最佳濃度通常根據(jù)不同癥狀和不同X-射線成像檢查而設(shè)計。曾經(jīng)有人批露了在射線照相術(shù)中轉(zhuǎn)運到靶器官的碘化合物的量能達到指定的造影效果，例如，參見日本專利NO.2619037中的描述。這個量基本上相當于傳統(tǒng)的X-射線造影檢查中使用的碘類造影劑。脂質(zhì)體內(nèi)部的碘的總量或者脂質(zhì)體內(nèi)部和外部的碘的總量與常規(guī)劑量相同。實質(zhì)性器官的造影效果主要由每身體重量單位所給藥的碘量來控制，即(造影劑的濃度)×(造影劑的劑量)，并且經(jīng)常與給藥的碘量成比例的增加。例如，為了獲得肝臟實質(zhì)性器官足夠的造影效果，使用量為600mg I每kg(身體重量單位)。然而，在過高溶液濃度下，不利的情況如脂質(zhì)體囊泡的聚合或增加的粘度必須要考慮到。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備的造影劑的碘含量，在通常假定的溶液劑量為10到300ml時，通常為30到500mg I/ml，優(yōu)選為150到500mg I/ml，且更優(yōu)選為250到400mg I/ml。
優(yōu)選地，本發(fā)明的射線照相造影劑包含包封在脂質(zhì)體膜內(nèi)部水相中和膜外部水相中的碘化合物(即脂質(zhì)體囊泡分散的水介質(zhì)中)，且更優(yōu)選，碘化合物的濃度在脂質(zhì)體膜內(nèi)和膜外基本相同。同一碘化合物同時存在于脂質(zhì)體膜內(nèi)和膜外意味著在碘化合物在同一造影劑中以不同形式存在。存在于分散脂質(zhì)體的水介質(zhì)中的碘化合物與以自由形式存在的傳統(tǒng)的碘化合物以相似的行為在身體內(nèi)活動。從另一方面說，包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物在體內(nèi)是隨著脂質(zhì)體的活動而轉(zhuǎn)運。這種造影劑材料的狀態(tài)在診斷檢查中表現(xiàn)出以下優(yōu)點。根據(jù)本發(fā)明的射線照相造影劑的應(yīng)用，未被包封的造影劑材料和被包封在脂質(zhì)體內(nèi)的造影劑材料在體內(nèi)的擴散時間不同，使所呈現(xiàn)的影像隨著時間的流逝在分布行為上發(fā)生變化，這會提供有價值的診斷信息。正常的細胞與癌細胞在血管系統(tǒng)、靜脈性能和淋巴管的發(fā)展程度方面不同，其經(jīng)造影劑材料通過血液動力學(xué)和灌注狀態(tài)下的行為反映出來。即使僅僅是一次給藥，本發(fā)明的造影劑組分能夠收集大量的臨床數(shù)據(jù)。
實施例本發(fā)明將根據(jù)具體實施例作進一步的說明，實施例中應(yīng)用的裝置、其中的材料及其參數(shù)值如濃度、數(shù)量、處理時間、處理溫度等等和處理方法僅僅是落在本發(fā)明的范圍內(nèi)的優(yōu)選實施例。
實施例1碘化合物中碘的測定樣品(脂質(zhì)體分散體)用等滲鹽溶液進行透析，透析結(jié)束后，向其中加入乙醇破壞脂質(zhì)體，再用吸光測定法測定包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物的量。上述碘化合物的量與樣品中碘化合物的總量的比率用來表示包封率(wt％)。
造影劑的制備將86mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、38.4mg膽固醇和19.2mg PEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHT DSPE-020CN，經(jīng)聚乙二醇修飾的類脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生產(chǎn))加入到不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，加熱保持釜的溫度在60℃，然后，向其中加入13g液態(tài)二氧化碳。攪拌的同時，通過減小高壓釜內(nèi)部的容積使釜內(nèi)的壓力由50kg/cm2升高到120kg/cm2使二氧化碳處于超臨界狀態(tài)以使類脂分散和溶解在超臨界二氧化碳中。進一步地，用計量泵在50分鐘的時間內(nèi)持續(xù)向其中加入5ml含有306.2mg/ml碘帕醇溶液(碘含量為150mg/ml)、1mg/ml氨丁三醇和0.1mg/ml乙二胺四乙酸鈣二鈉(EDTANa2-Ca)的造影劑溶液，并且用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH大約為7。加入完成后，高壓釜內(nèi)部抽真空排出二氧化碳，得到包封了造影劑溶液的脂質(zhì)體分散體。所得的分散體加熱到60℃并經(jīng)由Advantech Co.生產(chǎn)的1.0μm和0.45μm的纖維素類過濾器進行壓力過濾。如此得到的含有脂質(zhì)體的造影劑命名為樣品1-1。
樣品1-2到1-5的制備同上述樣品1-1，只是與DPPC和膽固醇一起加入的乙醇或PEG-磷脂的量如表1中所示。
測量了樣品1-1到1-5的包封率(即包封在脂質(zhì)體內(nèi)部的碘帕醇與碘化合物總量的比率，其均由轉(zhuǎn)換為碘原子的當量表示)。
表1

*PEG-磷脂與CO2的比率(wt％)
實施例2造影劑樣品2-1到2-8的制備同實施例1中樣品1-1，只是造影劑溶液的數(shù)量或種類有所不同。
測量了如此制備的樣品的碘含量，用分光光度計測定了包封率(即即包封在脂質(zhì)體內(nèi)部的碘帕醇與碘化合物總量的比率)，如表2中所示。
表2

實施例3脂質(zhì)體囊泡尺寸脂質(zhì)體囊泡尺寸是通過以下方法測定的。將含有包封了碘化合物的脂質(zhì)體囊泡的分散體冷凍并斷裂后，使碳蒸發(fā)沉積在斷裂界面上，再通過電子顯微鏡觀察沉積的碳(冷凍斷裂TEM法)。
微粒尺寸定義為被觀察的20個脂質(zhì)體微粒的尺寸的算術(shù)平均值。
造影劑的制備將192mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、76.8mg膽固醇和38.4mg PEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHT DSPE-020CN，經(jīng)聚乙二醇修飾的磷脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生產(chǎn))加入到不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，加熱保持釜的溫度在60℃，然后，向其中加入13g液態(tài)二氧化碳。攪拌的同時，通過減小高壓釜內(nèi)部的容積使釜內(nèi)的壓力由50kg/cm2升高到120kg/cm2使二氧化碳處于超臨界狀態(tài)，以使類脂分散和溶解在超臨界二氧化碳中。進一步地，用計量泵在50分鐘的時間內(nèi)持續(xù)向其中加入10ml含有306.2mg/ml碘帕醇溶液(碘含量為200mg/ml)、1mg/ml氨丁三醇和0.1mg/ml乙二胺四乙酸鈣二鈉(EDTANa2-Ca)的造影劑溶液，并且用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH大約為7。加入完成后，高壓釜內(nèi)部抽真空排出二氧化碳，得到包封了造影劑溶液的脂質(zhì)體分散體。所得的分散體加熱到60℃并經(jīng)由Advantech Co.生產(chǎn)的1.0μm的纖維素類過濾器進行壓力過濾。如此得到的含有脂質(zhì)體的造影劑命名為樣品3-1。
根據(jù)前述的方法測定了包封在脂質(zhì)體內(nèi)部的碘的量(也簡稱為被包封碘的量)和包封率。按照上面的方法測定了脂質(zhì)體囊泡的尺寸。其結(jié)果如表3所示。
樣品3-2到3-4的制備同樣品3-1，只是造影劑濃度(碘含量)有所不同，如表3所示。
表3

評價壓力過濾速率的測定用在上述造影劑的制備中所用到的1.0μm纖維素過濾器(直徑為2cm)進行壓力過濾時間的測定，其被通過液體的量所除而測定出壓力過濾速率。根據(jù)工業(yè)生產(chǎn)效率不超過0.2ml/min的速率是不能被接受的。
分散體的老化穩(wěn)定性將制得的脂質(zhì)體造影劑分別置于一個20ml的小瓶內(nèi)并蓋上蓋子，蓋子的外圍用密封帶封好。將這些樣品放在23℃和55％RH的環(huán)境下的黑暗的地方放置1個月和3個月。
這些老化的樣品按照以下的標準用視力進行評價。
5沒有觀察到沉積物，制備以來也沒有發(fā)生變化；4觀察到輕微的混濁，但是沒有分離也沒有發(fā)現(xiàn)沉積；3觀察到程度較高的混濁，但是沒有分離也沒有發(fā)現(xiàn)沉積；2產(chǎn)生了沉積物；1透明的液體和白色的沉積物完全分離了。
從表中明顯可以看出，本發(fā)明的造影劑顯示出增加的被包封的碘的量和出色的1μm過濾器的壓力濾過率。進一步證明當造影劑濃度為240到300mg/ml時被包封的碘的含量更多，相對于其他濃度來說，這給造影劑帶來了優(yōu)勢。令人驚奇的是，造影劑濃度從240到300mg/ml時能增強分散體的穩(wěn)定性，因此即使三個月之后出色的分散體依然能保持住。
實施例4造影劑的制備將368.4mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、147.4mg膽固醇和111.5mgPEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHT DSPE-020CN，經(jīng)聚乙二醇修飾的磷脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生產(chǎn))加入到不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，加熱保持釜的溫度在60℃，然后，向其中加入13g液態(tài)二氧化碳。攪拌的同時，通過減小高壓釜內(nèi)部的容積使釜內(nèi)的壓力由50kg/cm2升高到120kg/cm2使二氧化碳處于超臨界狀態(tài)以使類脂分散和溶解在超臨界二氧化碳中。進一步地，用計量泵在50分鐘的時間內(nèi)持續(xù)向其中加入13ml含有306.2mg/ml碘帕醇溶液(碘含量為150mg/ml)、1mg/ml氨丁三醇和0.1mg/ml乙二胺四乙酸鈣二鈉(EDTANa2-Ca)的造影劑溶液，并且用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH大約為7。加入完成后，高壓釜內(nèi)部抽真空排出二氧化碳，得到包封了造影劑溶液的脂質(zhì)體分散體。所得的分散體加熱到60℃并經(jīng)由Advantech Co.生產(chǎn)的0.45μm的纖維素類過濾器進行壓力過濾。如此得到的含有脂質(zhì)體的造影劑命名為樣品4-1。
樣品4-2到4-8
樣品4-2到4-8的制備同樣品4-1，只是類脂組分、造影劑濃度或全部類脂的量有所不同，如表4所示。
樣品4-9是通過以下方法制備的。將368.4mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、147.4mg膽固醇和111.5mg PEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHTDSPE-020CN，經(jīng)聚乙二醇修飾的磷脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生產(chǎn))與10ml氯仿、乙醇和水的混合物(重量比為100∶20∶0.1)在燒瓶(messflask)中混合。將制得的混合物在水浴上(65℃)加熱并且用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)將溶劑蒸餾掉。殘余物在真空中干燥2小時以形成脂膜。進一步地，加入13ml上述造影劑溶液，且在65℃加熱期間用攪拌器攪拌所得的混合物大約10分鐘。進一步攪拌得到了含有造影劑溶液的脂質(zhì)體分散體。將所得的分散體加熱到60℃并經(jīng)由Advantech Co.生產(chǎn)的1.0μm和0.45μm的纖維素類過濾器進行壓力過濾得到包含脂質(zhì)體的造影劑。
表4

*摩爾比，基于DPPC**用0.45μm過濾器進行的壓力過濾評價脂質(zhì)體囊泡尺寸各個造影劑樣品的平均囊泡尺寸是根據(jù)前述的方法進行測定的。
包封率評價將得到的脂質(zhì)體造影劑樣品分別置于一個20ml的小瓶內(nèi)并蓋上蓋子，蓋子的外圍用密封帶封好。將這些樣品放在23℃和55％RH的環(huán)境下的黑暗的地方放置2個月。然后，將這些樣品分別用等滲鹽溶液進行透析，透析完成后，向其中加入乙醇破壞脂質(zhì)體，經(jīng)吸光測定法測定包封在脂質(zhì)體內(nèi)的碘化合物的量。包封的碘化合物的量與碘化合物的總量的比率用來表示包封率(％)。老化2個月后，不完整的或不穩(wěn)定的脂質(zhì)體微粒因為破裂、凝結(jié)或泄漏釋放出內(nèi)含物，導(dǎo)致包封率降低。
壓力過濾速率的測定利用在上述造影劑的制備中所用到的0.45μm纖維素過濾器(直徑為2cm)，按照實施例3進行壓力過濾速率的測定。
從表4中可以看出，根據(jù)本發(fā)明制備的造影劑顯示出增高的包封率和出色的壓力濾過率。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，提供了一種通過將造影劑材料包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)而表現(xiàn)出轉(zhuǎn)運效率和選擇性增強的射線照相造影劑。
這里還提供了一種包含脂質(zhì)體的射線照相造影劑及其制備方法，其有效且穩(wěn)定地包封了碘化合物而沒有使用毒性有機溶劑及其制備方法。
權(quán)利要求
1.一種制備包含脂質(zhì)體的射線照相造影劑的方法，其特征在于該方法包括在含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下，將作為脂膜組分的磷脂和甾醇溶解在超臨界或亞臨界二氧化碳中，向其中加入含有碘化合物的水溶液以形成膠束，以及排出二氧化碳以形成包封了碘化合物的脂質(zhì)體囊泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物為含有聚氧化亞烷基的化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于含有聚氧化亞烷基的化合物為含有聚氧化亞烷基的類脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于含有聚氧化亞烷基的類脂為含有聚氧化乙烯基的類脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于包含的含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的量為二氧化碳重量的0.01％到1％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于脂質(zhì)體囊泡為單層或數(shù)層囊泡。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于包含的碘化合物的量以碘原子的量計為每ml造影劑100到350mg的I。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于碘化合物為非離子型碘化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于碘化合物為選自碘美普爾、碘帕醇、碘海醇、碘噴托、碘普胺、碘昔蘭、碘西胺、iobenzol、碘曲侖、碘克沙醇、碘西醇、碘酞硫、甲泛葡胺和1，3-雙-[N-3，5-二-(2，3-二羥丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基]-N-羥基乙酰基-氨基]-丙烷中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于碘化合物為選自碘美普爾、碘帕醇、碘海醇、碘普胺、碘昔蘭、碘酞硫、碘曲侖和碘克沙醇中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于脂質(zhì)體囊泡分散在水介質(zhì)中，并且70％到95％重量的碘化合物沒有包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)而是存在于水介質(zhì)中。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于造影劑中含有的全部類脂為20到100mg/ml。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于包封在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)的碘化合物與全部類脂的重量比為3到8。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于包含的碘化合物的量以碘原子的量計為每ml造影劑200到300mg的I，以及造影劑中含有的全部類脂為20到80mg/ml。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于包含的碘化合物的量以碘原子的量計為每ml造影劑240到300mg的I。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于磷脂與甾醇的摩爾比為100/60到100/90。
17.根據(jù)權(quán)利要求3的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于磷脂與含有聚氧化亞烷基的類脂的摩爾比為100/5到100/10。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于脂質(zhì)體囊泡的平均尺寸為0.05到0.8μm。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于含有碘化合物的水溶液還包含選自水溶性胺緩沖液、乙二胺四乙酸鈣二鈉、無機鹽、滲透壓調(diào)節(jié)劑和防腐劑中的至少一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的制備射線照相造影劑的方法，其特征在于脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部和外部的水相中含有作為鹽酸鹽、磷酸鹽或碳酸氫鹽的陽離子，且需滿足以下要求[Na+]+126·[Ca2+]+50·[K+]≤130其中[Na+]是指含量為20到70mM的鈉離子，[Ca2+]是指含量為0.1到0.6mM的鈣離子，[K+]是指含量為0.4到0.8mM的鉀離子，以及鎂離子的含量為0.5到0.8mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含脂質(zhì)體的射線照相造影劑，其包含了在脂膜內(nèi)部和外部的水相中都含有的水溶性碘化合物。脂質(zhì)體是通過將構(gòu)成脂膜的脂膜組分與超臨界或亞臨界二氧化碳在至少一種含有羥基或聚氧化亞烷基的化合物的存在下相混合而制備得到的。得到的射線照相造影劑不含任何毒性溶劑如含氯溶劑，因而能夠保證具有很高的安全性。
文檔編號A61K47/44GK1988919SQ20058002419
公開日2007年6月27日 申請日期2005年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月21日
發(fā)明者上田榮一, 中島彰久, 長池千秋, 元杭康之 申請人:柯尼卡美能達醫(yī)療印刷器材株式會社