專利名稱：癌癥基因治療中的噬菌體和原噬菌體蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對動物細(xì)胞具有增殖抑制活性或細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性的多肽的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供使用所述多肽的手段和方法和含有所述多肽的編碼區(qū)的相應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)所述多肽的載體，用于治療增生性病癥或疾病如癌癥的藥物組合物和治療方法。最后但并非最不重要的，本發(fā)明提供一種使用所述對動物細(xì)胞具有增殖抑制活性或細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性的多肽的基因治療方法。
背景技術(shù)：
作為死亡原因的癌癥的發(fā)展在具有良好衛(wèi)生保健的人群中和高百分比的老年人中是一個日益嚴(yán)重的問題。迄今為止，治療癌癥或者治愈患者只有有限的選擇，如手術(shù)或化療和放療。這是為什么基因治療方法已經(jīng)演變?yōu)橹饕杏谥委煱┌Y的一個原因。
一種基因治療方法使用所謂的自殺基因。自殺基因是這樣一種基因，其在細(xì)胞中的表達(dá)對于該細(xì)胞是致死性的。
大多數(shù)自殺基因通過編碼病毒、細(xì)菌、真菌、植物或人類的將具有低毒性的化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性化合物的酶來介導(dǎo)細(xì)胞殺傷效應(yīng)[1]。該方法也被稱為基因介導(dǎo)的酶前藥治療(GDEPT)，或者如果使用病毒載體輸送該基因，則被稱為病毒介導(dǎo)的酶前藥治療(VDEPT)。
這種前藥轉(zhuǎn)化或條件毒性自殺基因編碼的大多數(shù)酶通過破壞DNA復(fù)制來介導(dǎo)毒性，而自殺基因表達(dá)的產(chǎn)物誘導(dǎo)前藥轉(zhuǎn)化為其毒性代謝物，然后該代謝物作用于復(fù)制的DNA[1，6]。研究最多的一些酶是單純皰疹病毒(HSV)-1胸苷激酶[2]、來自細(xì)菌或酵母的胞嘧碇脫氨酶[3]、細(xì)菌硝基還原酶[56]和哺乳動物肝臟酶細(xì)胞色素P450[4，5]。一旦這些酶在靶細(xì)胞中表達(dá)，就能夠全身應(yīng)用相應(yīng)的前藥(分別為更昔洛韋、氟胞嘧啶、CB1954和環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺)，并且前藥將只在攜帶和表達(dá)相應(yīng)自殺基因的細(xì)胞中被活化。
在另一種方法中，植物酶基因linamarase(1is)將生氰葡糖苷底物亞麻苦苷(1in)水解為葡萄糖和細(xì)胞毒性氰化物[57]。
這些方法的缺點(diǎn)是全身施用前藥，這意味著高劑量，可能會引起副作用，特別是對于細(xì)胞色素P450，它在肝細(xì)胞中優(yōu)勢性地生理表達(dá)。
另一個缺點(diǎn)是癌細(xì)胞抗性的發(fā)展，這種抗性的發(fā)展或者是針對前藥或者是針對細(xì)胞殺傷的，在這種治療中細(xì)胞殺傷通常是由于細(xì)胞凋亡[7，8]，因此是由于攜帶相應(yīng)自殺基因的細(xì)胞的消耗而引起的。
另一個策略是利用編碼對細(xì)胞具有直接致死效應(yīng)的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)如促融膜蛋白如水泡性口膜炎病毒(VSV)糖蛋白或長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的基因[9-11]。促融膜蛋白一旦在靶細(xì)胞中表達(dá)，就會引起相鄰細(xì)胞的膜融合，導(dǎo)致形成大的多核合胞體，最后死于凋亡或壞死[12-14]。曾經(jīng)用于直接細(xì)胞殺傷的其他毒素有例如白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)毒素A[15-18]、霍亂毒素B[19，20]、炭疽(炭疽桿菌(Bacillus anthracis))毒素[21-24]、假單胞菌(綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))毒素[58]或篦麻毒素(蓖麻(Ricinuscommunis))[58]。
另一種方法利用所謂的凋亡誘導(dǎo)劑來激活凋亡途徑并且誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在這些研究中使用的基因是，例如，胱天蛋白酶-1/白介素-1β-轉(zhuǎn)化酶(ICE)[59]、胱天蛋白酶-3/CPP32β[60]、胱天蛋白酶-6[61]、胱天蛋白酶-8[62]、具有死亡域的Fas相關(guān)蛋白(FADD)[63]和Bax[64]。
自殺基因必須以確保它們被盡可能多的靶細(xì)胞攝取和表達(dá)，而同時限制它們被非靶細(xì)胞表達(dá)的方式被導(dǎo)入細(xì)胞中。對于癌癥的自殺基因治療理想地需要能夠區(qū)分靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞的載體。
對于病毒載體(綜述見[25])，當(dāng)編碼毒性基因來保護(hù)相應(yīng)的包裝細(xì)胞[26]不被過早殺死時，需要嚴(yán)格控制的生產(chǎn)系統(tǒng)。
雖然已經(jīng)知道一些細(xì)胞毒性自殺基因，但是仍然需要具有有利特征，特別是能夠殺死或清除患者中的靶細(xì)胞特別是癌細(xì)胞的另外的和替代的自殺基因。
因此本發(fā)明的一個目的是提供新的一組細(xì)胞毒性自殺基因和它們相應(yīng)的在真核細(xì)胞特別是動物或哺乳動物細(xì)胞包括人細(xì)胞中具有細(xì)胞生長抑制和/或細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)或多肽。
發(fā)明詳述我們茲證明，噬菌體和原噬菌體來源的α-螺旋型通道形成蛋白，特別是穴蛋白(holin)，其天然通過在細(xì)胞質(zhì)膜中形成孔而引起原核細(xì)胞裂解，當(dāng)被導(dǎo)入和/或在真核細(xì)胞特別是動物或人細(xì)胞中表達(dá)時，引起明顯的細(xì)胞生長抑制或者甚至細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“動物”或“動物細(xì)胞”是指屬于動物界的生物體或生物體的細(xì)胞，其分類是根據(jù)當(dāng)前的包括動物界、植物界、原生生物界、真菌界和原核生物(包括原核細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌)界的五界分類系統(tǒng)(Margulis和Schwartz，1998.Five Kingdoms.An illustratedGuide to the Phyla of Life on Earth.，W.H.Freeman，New York)。因此，術(shù)語“動物細(xì)胞”也包括“人”細(xì)胞。但是，為了強(qiáng)調(diào)，在本申請的幾個部分中另外也提到人細(xì)胞。在本發(fā)明下文中，“動物或人細(xì)胞”可以位于組織內(nèi)或動物或人的體內(nèi)(“體內(nèi)”)，或者可以從其天然環(huán)境如細(xì)胞系、原代細(xì)胞中分離出來(“體外”)。
術(shù)語特征在于細(xì)胞異常增殖的“增生性疾病”或“增生性病癥”在本文中廣義使用，包括需要控制細(xì)胞周期的所有疾病，例如癌癥和白血病，以及心血管疾病，如再狹窄和心肌病，自身免疫病，如腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，皮膚病，如牛皮癬，抗炎、抗真菌、抗寄生蟲病，如瘧疾、肺氣腫和脫發(fā)。在這些疾病中，噬菌體來源的蛋白質(zhì)，優(yōu)選本發(fā)明的穴蛋白，能夠用來在靶細(xì)胞群體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或保持停滯。
噬菌體來源的“穴蛋白”屬于一個由至少16個表現(xiàn)出共同結(jié)構(gòu)和功能特征的不同蛋白質(zhì)家族組成的功能性超家族。更具體而言，噬菌體編碼的穴蛋白是α-螺旋型通道形成蛋白的成員，并且是裂解被感染細(xì)菌細(xì)胞所需要的，因此是釋放噬菌體顆粒所需要的。然而，該家族的成員未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)顯著的序列相似性或同源性。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“噬菌體”包括噬菌體本身以及原噬菌體，原噬菌體是處于休眠狀態(tài)或者甚至缺陷的噬菌體。其基因組或者被整合到宿主細(xì)菌的基因組內(nèi)或者自主復(fù)制。
穴蛋白由革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的原噬菌體以及與這些生物體有關(guān)的噬菌體的基因編碼[28]。穴蛋白的主要功能似乎是將胞壁質(zhì)水解酶跨過細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞壁，這些酶在細(xì)胞壁水解肽聚糖細(xì)胞壁聚合體中的鍵，作為細(xì)胞裂解的前奏。當(dāng)由染色體編碼時，這些酶是自溶素。穴蛋白也可以促進(jìn)電解質(zhì)和營養(yǎng)物從細(xì)胞質(zhì)中流出，從而加速細(xì)胞死亡。胞壁質(zhì)水解酶缺乏N-末端信號序列，因此被認(rèn)為不能通過普通的分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)。穴蛋白肯定形成寡聚復(fù)合體，在細(xì)胞質(zhì)膜中形成孔。這些孔被認(rèn)為給它們的底物蛋白質(zhì)提供了被動轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。
本發(fā)明人非常驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)這些穴蛋白在人或動物細(xì)胞中表達(dá)時，在這些細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷或者抑制細(xì)胞生長。這些結(jié)果特別令人驚訝，因?yàn)檎婧思?xì)胞代謝完全不同于細(xì)菌系統(tǒng)的代謝。另外，真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組織也根本不同于細(xì)菌細(xì)胞，而且真核細(xì)胞不是噬菌體的宿主。因此，無法預(yù)測穴蛋白是否能在動物細(xì)胞或人細(xì)胞中表達(dá)，它們將使用哪些途徑，相應(yīng)地這些蛋白質(zhì)將位于細(xì)胞區(qū)室中的何處，它們的功能是被保持還是被改變，細(xì)胞代謝是受到影響還是被激活，最后但并非最不重要的，這些穴蛋白向真核細(xì)胞中的導(dǎo)入和在其中的表達(dá)將有何種效果。
在回答這些和其他基本研究問題時，發(fā)明人得以提供使用噬菌體來源的穴蛋白治療增生性疾病和癌癥的手段和方法。特別是，他們提供了用于治療癌癥的基因治療途徑的手段和方法。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述噬菌體來源的蛋白質(zhì)是α-螺旋型通道形成蛋白。這些蛋白質(zhì)選自但不限于雙鏈DNA噬菌體、單鏈DNA噬菌體或單鏈RNA噬菌體，更優(yōu)選地，它們選自λS105和λS107蛋白(Swiss-Prot登記號P03705)、Phi29 GP 14蛋白(Swiss-Prot登記號P11188)、噬菌體T4免疫蛋白(Swiss-Prot登記號P08986)、噬菌體P22蛋白13(Swiss-Prot登記號P09962)、噬菌體P2 TM蛋白Y(Swiss-Prot登記號P51773)、噬菌體PRD1的M蛋白(Swiss-Prot登記號P27389)、噬菌體A118的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q37975)、噬菌體A500的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q37977)、噬菌體Dp-1的DPH穴蛋白(Swiss-Prot登記號O03978)、噬菌體HP1的穴蛋白(Swiss-Prot登記號P51727)、噬菌體rlt的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q38134)、噬菌體T7(Swiss-Prot登記號P03802)和T3(Swiss-Prot登記號P10307)的裂解蛋白17.5、噬菌體P2 Ogr的NucE穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q54418)、分離自睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q48281)、噬菌體Phi-6的P10蛋白(Swiss-Prot登記號P11127)、噬菌體T4的蛋白rV(Swiss-Prot登記號P06808)、葡萄球菌噬菌體Phi-11穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q38020)和乳球菌噬菌體Tuc2009穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q38613)。
最優(yōu)選地，它們選自SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
也包括穴蛋白的“類似物”。基本上對應(yīng)于穴蛋白的類似物是具有保守改變或其中穴蛋白氨基酸序列的一個或多個氨基酸已經(jīng)被替換為另一種氨基酸、缺失和/或插入的多肽，只要獲得的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與其相應(yīng)的穴蛋白基本相同或甚至更高的生物活性。
“保守”改變是預(yù)計不會改變蛋白質(zhì)的活性、電荷或結(jié)構(gòu)，因此預(yù)計不會改變其生物學(xué)特性的改變。保守置換包括“類似物”，其中多肽中的至少一個氨基酸殘基已經(jīng)被保守置換為一個不同的氨基酸。適當(dāng)?shù)闹脫Q可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定，以提供合成多肽的改變的結(jié)構(gòu)和功能特性，而同時保持穴蛋白的生物活性。可以按照以下列表優(yōu)選產(chǎn)生一個或多個置換Ala(Gly，Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gln，His)；Asp(Glu)；Cys(Ser)；Gln(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Ala，Pro)；His(Asn，Gln)；Ile(Leu，Val)；Leu(Ile，Val)；Lys(Arg，Gln，Glu)；Met(Leu，Tyr，Ile)；Phe(Met，Leu，Tyr)，Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Thr)；Tyr(Trp，Phe)；和Val(Ile，Leu)。
在基因水平上，如Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manuel，CSH Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989所述，通常通過定點(diǎn)誘變編碼穴蛋白的DNA中的核苷酸來制備這些類似物。
雙鏈DNA(dsDNA)噬菌體，如噬菌體λ，使用雙系統(tǒng)進(jìn)行宿主細(xì)胞裂解，該雙系統(tǒng)包括(i)對肽聚糖的糖苷鍵、酰胺鍵或肽鍵具有酶活性的胞壁質(zhì)水解酶或內(nèi)溶素，和(ii)使缺乏任何分泌信號序列而在細(xì)胞質(zhì)中積累的內(nèi)溶素以時間方式接近肽聚糖，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的成孔穴蛋白[28，29]。穴蛋白功能對于內(nèi)溶素是非特異性的，因?yàn)橛蓙碓从诓煌删w的穴蛋白和內(nèi)溶素組成的人工裂解系統(tǒng)已經(jīng)表現(xiàn)出裂解能力[29]。這也證明了具有不同氨基酸序列因而在DNA或氨基酸水平上顯示沒有同源性的不同穴蛋白具有功能同源性。盡管由dsDNA噬菌體編碼的穴蛋白是各異的，但是它們通常表現(xiàn)出共同的特征(i)小的大小(60-145個氨基酸)，(ii)2、3或4個跨膜域，(iii)親水性N-末端，和(iv)高度極性的、富含電荷的C-末端域。已知N-和C-末端親水域在穴蛋白介導(dǎo)的通道形成的時間確定中起作用[30，31]。盡管有這些共同特征，但是可以把dsDNA噬菌體的穴蛋白分類為兩個一般的類別。I類穴蛋白，噬菌體λ(Lambda)的S(Sλ)是其原型，通常大小為95個氨基酸殘基或更長，并且攜帶三個潛在的跨膜域。II類穴蛋白，如噬菌體21的S21，通常較小，大小為65至95個氨基酸殘基，并且只含兩個跨膜域。
dsDNA噬菌體的穴蛋白形成寡聚復(fù)合體[32，33]。裂解細(xì)菌細(xì)胞只需要極少的穴蛋白分子。對于Sλ，已經(jīng)表明穴蛋白在每個細(xì)胞1-3×103個分子的濃度時對大腸桿菌細(xì)胞是致死性的[34]。通常，溶原性細(xì)菌培養(yǎng)物在裂解發(fā)生后數(shù)分鐘內(nèi)遭受裂解。這種精確的時序調(diào)節(jié)可能與膜的能量狀態(tài)有關(guān)，因?yàn)樵诟腥局芷谧銐蛲淼臅r候加入能量毒物如氰化物或二硝基苯酚能夠立即觸發(fā)感染噬菌體λ或其他噬菌體的細(xì)胞過早裂解[29]。對于噬菌體λ，宿主細(xì)胞裂解的確切時間由實(shí)際的穴蛋白和穴蛋白抑制劑的摩爾比(通常約為2∶1)來控制[35]。這兩種蛋白質(zhì)都由相同的開放閱讀框(ORF)編碼。實(shí)際的穴蛋白(S105)來源于第3號密碼子處的翻譯起始。穴蛋白抑制劑(S107)只長兩個氨基酸殘基，并且是第1號密碼子處翻譯起始的產(chǎn)物。這種雙起始基序(即由一個或兩個密碼子分隔開的兩個框內(nèi)ATG起始密碼子，其中至少一個帶正電荷[35])不僅在SλORF中發(fā)現(xiàn)，而且在許多其他的穴蛋白基因中也發(fā)現(xiàn)。不僅對于Sλ編碼的裂解系統(tǒng)，而且對于其他噬菌體編碼的裂解系統(tǒng)，穴蛋白/穴蛋白抑制劑對的存在已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中得到證明[30，36，37]，在此引入作為參考。
對于細(xì)菌細(xì)胞裂解，在最具吸引力的模型中[38]，穴蛋白以兩種構(gòu)象狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)膜中“前孔”狀態(tài)，其中穴蛋白在膜中積聚，和“ 孔”狀態(tài)，其中形成實(shí)際的孔。隨著膜中穴蛋白數(shù)目的增加，穴蛋白二聚體積累，它們是更高級寡聚體的構(gòu)建材料，最終與小的穴蛋白島融合。這些穴蛋白陣列是膜中的不穩(wěn)定區(qū)，并且認(rèn)為在某一點(diǎn)，熱波動在穴蛋白陣列內(nèi)打開一個孔，導(dǎo)致膜局部去極化。這種局部去極化然后觸發(fā)周圍的穴蛋白由前孔狀態(tài)向孔狀態(tài)發(fā)生構(gòu)象改變進(jìn)導(dǎo)致更大的孔以及膜電位完全崩潰。在鏈反應(yīng)中，膜電位的崩潰將觸發(fā)越來越多的穴蛋白構(gòu)象改變?yōu)榛钚詷?gòu)象，最終導(dǎo)致在細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生大孔。已經(jīng)表明孔本身為不規(guī)則的大小，但是至少必須大到足以使內(nèi)溶素通過。Wang等人已經(jīng)證明，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜中的Sλ孔甚至大到足以允許釋放480kDa的內(nèi)溶素/LacZ融合蛋白[39]。
與dsDNA噬菌體相反，簡單的裂解性噬菌體如ssDNA噬菌體(其代表為φX174、α3、G4、S13)和ssRNA噬菌體(其代表為MS2、GA、Qβ、SP)只帶有一個編碼小內(nèi)在膜蛋白的裂解基因。已經(jīng)表明這些噬菌體的裂解物不含任何胞壁質(zhì)水解酶活性，來自這些噬菌體的已知穴蛋白的氨基酸序列也沒有表現(xiàn)這種功能。單單質(zhì)粒編碼的φX174裂解基因E在大腸桿菌中的表達(dá)就足以引起有效的細(xì)胞裂解[40-42]。但是，在這種情況下，細(xì)胞裂解依賴于活躍生長的細(xì)胞[43，44]。此外已經(jīng)表明，野生型蛋白E引起的細(xì)胞裂解絕對需要編碼肽酰-脯氨酰-順反異構(gòu)酶(PPlase)的細(xì)菌宿主基因slyD[45]。SlyD可能參與蛋白E的正確折疊和穩(wěn)定或其向細(xì)胞質(zhì)膜的輸送[46]。
本發(fā)明以噬菌體λ-編碼的S105蛋白在動物細(xì)胞特別是人細(xì)胞例如人子宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)、乳腺癌細(xì)胞系(MCF7)、人胚腎細(xì)胞系(HEK 293)和鼠乳腺癌細(xì)胞(TSIA)中表達(dá)時[72]為例，描述了噬菌體穴蛋白的毒性作用。因此，本發(fā)明通過描述在誘導(dǎo)S105表達(dá)后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、對膜完整性的細(xì)胞毒性作用(即通過臺盼藍(lán)染色，膜聯(lián)蛋白V-PE/7AAD染色)和對細(xì)胞代謝的細(xì)胞毒性作用(即測定脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH水平或線粒體的膜電位)，顯示了S105的細(xì)胞毒性作用。借助于分類細(xì)胞分離、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)和透射電子顯微術(shù)，證明λS105蛋白優(yōu)選地在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中積累，導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)崩解和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。表明無論在體外還是在體內(nèi)，噬菌體穴蛋白的表達(dá)在動物特別是人細(xì)胞中都誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制活性和細(xì)胞殺傷效應(yīng)，如使用腫瘤細(xì)胞來源的異種移植物的動物研究所揭示的那樣。這種細(xì)胞生長抑制活性和細(xì)胞殺傷效應(yīng)特別可用于限制癌細(xì)胞的生長活性或者清除患者中的癌細(xì)胞，從而治療癌癥和其他增生性疾病。
為了根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用，噬菌體來源的蛋白質(zhì)，例如穴蛋白，需要在真核特別是動物或人細(xì)胞中表達(dá)。為此，噬菌體來源的蛋白質(zhì)的核酸序列，例如DNA、cDNA、RNA，或其功能片段，或其表達(dá)產(chǎn)物，需要轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。或者，編碼穴蛋白的核酸序列，例如RNA或mRNA，需要在細(xì)胞內(nèi)直接合成。在另一種方法中，可以將噬菌體來源的蛋白質(zhì)或由噬菌體來源的蛋白質(zhì)或其生物活性部分和穿梭蛋白組成的融合蛋白轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。
根據(jù)本發(fā)明的“核酸序列”包括編碼噬菌體來源的蛋白質(zhì)或具有穴蛋白樣功能的多肽例如穴蛋白或其生物活性部分的任何核酸序列，例如DNA、cDNA、RNA、mRNA。這一定義也包括編碼相同多肽或蛋白質(zhì)但由于已知的遺傳密碼子簡并性所允許的改變而與天然序列不同的核酸序列。這一定義也包括在嚴(yán)格雜交條件下能夠與所述核酸序列雜交的核酸，包括mRNA、cDNA、基因組DNA及其功能片段。特別地，該定義也包括編碼由穴蛋白或其生物活性部分和穿梭蛋白(例如HIV-1-Tat、HBV-PreS2-TLM、Sox10、VP22)組成的融合蛋白的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的“生產(chǎn)細(xì)胞”被定義為一種重組細(xì)胞，其被修飾后表達(dá)噬菌體來源的蛋白質(zhì)，例如穴蛋白、其“類似物”、其功能性片段或由“核酸序列”編碼的“融合蛋白”。
在本文中使用的術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”是指在此條件下核苷酸序列一般保持彼此雜交的雜交和洗滌條件。這些嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可見于例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1.ff?？梢詫NA和RNA進(jìn)行多種修飾，因此術(shù)語“核酸”也包括化學(xué)、酶或代謝修飾的形式。其自我解釋，“核酸”的定義中不包括只與polyA+序列如cDNA的任何3’末端polyA+串雜交的核酸，或與互補(bǔ)的T(或U)殘基段雜交的核酸，因?yàn)檫@樣的核酸將與含有poly(A)段或其互補(bǔ)片段的核酸分子雜交。
將核酸序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)可以使用幾種已知的載體系統(tǒng)、病毒載體或裸DNA。通常，根據(jù)本發(fā)明的載體是線性化或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA載體，如質(zhì)粒、粘?；蛉斯と旧w，它們除了所需的核酸序列外還含有調(diào)節(jié)序列、任選的選擇性標(biāo)記基因和任選的能使載體自主復(fù)制的復(fù)制子。
已知幾種方法，能用于將核酸序列轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn)生瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些方法包括物理和化學(xué)方法，如電穿孔、顯微注射、微粒轟擊、抗體-或配體-、葡聚糖-、脂質(zhì)體-、病毒體-、磷酸鈣-、荷電聚合物-或荷電脂質(zhì)-介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。也可以采用化學(xué)修飾，例如具有親脂結(jié)構(gòu)的肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸的衍生化，來提高向靶細(xì)胞內(nèi)的攝入。例如，可以將一種已知的親膜肽的序列與上述核酸序列融合，或者可以對穴蛋白進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化學(xué)修飾，如添加月桂?；苌铮蜓趸琢虬彼釟埢?，以產(chǎn)生亞砜基，或者將肽鍵替換為其酮亞甲基異酯，以提高膜通透性。或者，可以將已知結(jié)合細(xì)胞表面受體的分子與這些多肽、蛋白質(zhì)或核酸序列偶聯(lián)。有用的例子是糖、維生素、激素、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白，如US 5,108,921所述，在此引入作為參考。
根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明使用并且提供了用于將噬菌體來源的穴蛋白或其生物活性片段的編碼信息轉(zhuǎn)導(dǎo)到真核細(xì)胞內(nèi)的病毒載體系統(tǒng)。通常本發(fā)明可以使用允許核酸序列轉(zhuǎn)移以及隨后表達(dá)的任一種病毒載體系統(tǒng)。特別有用的是疸病毒表達(dá)載體、腺病毒表達(dá)載體、皰疹病毒表達(dá)載體、腺伴隨病毒載體、甲病毒載體、SV40載體、水泡性口膜炎病毒載體、麻疹病毒載體、辛德畢斯病毒載體、狂犬病病毒載體以及慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)基于復(fù)制型(例如，如WO 018240所述)或復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。雖然復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)率的優(yōu)點(diǎn)，但是它也具有非特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)的危險。因此基因表達(dá)的特異性需要由特異性調(diào)節(jié)元件如細(xì)胞特異性啟動子來控制。
與其相比，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，例如如EP 0779929所述的啟動子轉(zhuǎn)化載體(ProCon)，或如WO 99/35280所述的重建病毒(ReCon)載體(均在此引入作為參考)，顯示高細(xì)胞特異性，但是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效率較低。由于本領(lǐng)域中很好地描述了各種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易選擇合適的載體系統(tǒng)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)通常由兩種成分組成，第一成分，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體本身，是一種修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒(載體質(zhì)粒)，其中編碼病毒蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)被替換為將要轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中的任選含有標(biāo)記基因的目標(biāo)核酸序列。由于編碼病毒蛋白質(zhì)的基因的替換有效地使病毒缺陷，因此必須用該系統(tǒng)的第二成分來拯救，該第二成分編碼丟失的病毒蛋白質(zhì)。第二成分是產(chǎn)生大量病毒結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白質(zhì)的細(xì)胞系，但是缺乏產(chǎn)生復(fù)制型病毒的能力。該細(xì)胞系被稱為包裝細(xì)胞系，由被一種或多種質(zhì)粒瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系組成，所述質(zhì)粒攜帶能使修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被包裝的基因。這些質(zhì)粒引導(dǎo)病毒體產(chǎn)生所需的必需病毒蛋白質(zhì)的合成。為了產(chǎn)生病毒顆?；虮话b的載體，將第一成分或載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到包裝細(xì)胞系中。在這些條件下，由該載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄包含插入的治療性基因和任選的標(biāo)記基因的修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，并將其包裝到修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(重組病毒顆粒)內(nèi)。用這種重組病毒顆粒感染的細(xì)胞不能產(chǎn)生新的載體病毒，因?yàn)樵谶@些細(xì)胞中不存在病毒蛋白質(zhì)。但是，存在攜帶治療性基因和標(biāo)記基因的載體，并且該載體能夠在被感染的細(xì)胞中表達(dá)。
在另外一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使用如WO 99/35280所述的重建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該專利在此引用作為參考。在該載體系統(tǒng)中，使用病毒生活周期中的基因改組(genetic reshuffling)，其只在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞中允許由分開的元件重建功能性表達(dá)盒[52]。為此目的，將異源調(diào)節(jié)元件或啟動子以反方向插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的長末端重復(fù)(5’LTR)的獨(dú)特5’區(qū)(U5)。將治療性毒性基因以反方向插入3’長末端重復(fù)(3’LTR)的獨(dú)特3’區(qū)(U3)。逆轉(zhuǎn)錄后，這兩個獨(dú)特區(qū)都復(fù)制，在每個逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR內(nèi)重建了兩個功能性活性表達(dá)盒。使用組織特異性啟動子可以確保轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因只在或者優(yōu)先在相應(yīng)的靶細(xì)胞內(nèi)或特定組織的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。另外，所有啟動子都可以是組成活性的或條件活性的，是病毒或非病毒來源的。
在本文使用時，術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”意思是作為啟動子的核酸序列，即調(diào)節(jié)與該啟動子可操作連接的核酸序列的表達(dá)。這種“調(diào)節(jié)元件”或“ 啟動子”可以組成型地或可誘導(dǎo)地控制連接的核酸序列的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子的例子有四環(huán)素依賴的調(diào)節(jié)系統(tǒng)(綜述見[66])、熱休克、激素(例如蛻皮激素、多西環(huán)素、利福平)或金屬離子調(diào)節(jié)系統(tǒng)。許多系統(tǒng)表現(xiàn)出顯著水平的基礎(chǔ)表達(dá)。這種“滲漏(leakiness)”使得難以使用它們表達(dá)細(xì)胞毒性基因。本發(fā)明的“滲漏啟動子”是可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件，表現(xiàn)出連接的核酸的基礎(chǔ)表達(dá)，而沒有誘導(dǎo)。術(shù)語“組織特異性啟動子”(TSP)意思是只在或者主要在特定細(xì)胞或組織的特定細(xì)胞中有活性的調(diào)節(jié)元件(例如probasin啟動子、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子、人表面活性蛋白A1啟動子、Ksp-鈣粘蛋白(鈣粘蛋白16)啟動子、小鼠乳乳腺瘤病毒啟動子(MMTV-LTR)、乳清酸性蛋白啟動子(WAP))。
在另外一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使用如EP 0779929所述的啟動子轉(zhuǎn)化載體(ProCon)，該專利在此引用作為參考。根據(jù)ProCon原理，構(gòu)建一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中3’U3區(qū)被改變，但是保留了正常的5’U3結(jié)構(gòu)；利用位于5’U3區(qū)內(nèi)的正常的逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子可以將該載體正常地轉(zhuǎn)錄為RNA。但是產(chǎn)生的RNA只含有改變的3’U3結(jié)構(gòu)。在被感染的靶細(xì)胞中，在逆轉(zhuǎn)錄后，這種改變的U3結(jié)構(gòu)將位于逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)的兩個末端。
如果改變的區(qū)域攜帶例如多接頭而不是U3區(qū)，則可以容易地插入任何啟動子，包括引導(dǎo)組織特異性表達(dá)的啟動子。該啟動子將只應(yīng)用在靶細(xì)胞中用于表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的連接基因。如果需要，該啟動子可以是該載體中的唯一啟動子?？梢詫⑴c一種或多種細(xì)胞序列同源的另外的DNA區(qū)段插入多接頭中用于基因靶向。
在包裝細(xì)胞系中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的表達(dá)由正常的非選擇活性逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子調(diào)節(jié)。但是，一旦載體進(jìn)入靶細(xì)胞，就發(fā)生啟動子轉(zhuǎn)化，而由導(dǎo)入多接頭內(nèi)的選擇的組織特異性啟動子表達(dá)治療性基因。不僅實(shí)際上該系統(tǒng)可以包括任何組織特異性啟動子，以供多種不同的細(xì)胞型的選擇性靶向，而且在轉(zhuǎn)化事件之后，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)和特性不再類似于病毒。當(dāng)然，從安全的觀點(diǎn)來看這具有極為重要的結(jié)果，因?yàn)槠胀ǖ幕颥F(xiàn)有的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容易與包裝載體發(fā)生基因重組，產(chǎn)生潛在致病性病毒。啟動子轉(zhuǎn)化(ProCon)載體與逆轉(zhuǎn)錄病毒不相似，因?yàn)樗鼈冊谵D(zhuǎn)化后不再帶有U3逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子，因而降低了基因重組的可能性。與現(xiàn)有的普通載體相比，ProCon載體激活整合位點(diǎn)附近的細(xì)胞基因的可能性也較低。
在本發(fā)明的上下文中，為了評價所表達(dá)的基因的可能的毒性作用，使用一種嚴(yán)格控制的基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)使用病毒載體系統(tǒng)，其中病毒載體需要被包裝細(xì)胞包裝，而且當(dāng)然毒性基因在包裝細(xì)胞中的表達(dá)將殺死該細(xì)胞時，毒性基因表達(dá)的嚴(yán)格控制是特別重要的。只有在病毒載體被包裝于病毒顆粒內(nèi)之后，并且只有在病毒顆粒感染其宿主，優(yōu)選真核細(xì)胞，更優(yōu)選動物細(xì)胞，特別是哺乳動物或人細(xì)胞之后，毒性基因才應(yīng)當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
這可以通過例如使用與細(xì)胞毒性基因可操作連接的嚴(yán)格控制的誘導(dǎo)型啟動子來實(shí)現(xiàn)。在嚴(yán)格控制系統(tǒng)中，可以通過添加誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)基因表達(dá)。沒有誘導(dǎo)物則系統(tǒng)沉默，不發(fā)生基因表達(dá)。因此，通過只在病毒顆粒感染宿主細(xì)胞后添加誘導(dǎo)物，能夠使毒性基因的表達(dá)只在宿主細(xì)胞中發(fā)生。誘導(dǎo)型啟動子的例子是lac阻抑物/操縱基因、FK506/雷帕霉素、蛻皮激素誘導(dǎo)的、RU486/米非司酮、和四環(huán)素(Tc)誘導(dǎo)的系統(tǒng)[68，69]，或小鼠乳腺瘤病毒啟動子(MMTV-LTR)。
在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明確定了λ-S105、λ-S107和φ29-GP14作為毒性蛋白質(zhì)用于癌癥基因治療的價值，其使用(i)基于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的激素誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)，使用能被糖皮質(zhì)激素激活的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子[65]，和(ii)基于兩種不同質(zhì)粒載體的四環(huán)素/多西環(huán)素誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)[67，68]。使用這些誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)，能夠證明S105表達(dá)對HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞或HEK 293細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、膜完整性(即通過臺盼藍(lán)染色、膜聯(lián)蛋白V-PE/7AAD染色)和細(xì)胞代謝(即測定脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH水平或測量膜電位)的顯著影響(見實(shí)施例)。借助于熒光免疫細(xì)胞化學(xué)和分類細(xì)胞分離進(jìn)一步證明，λ-S105、λ-S107和φ-GP14當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時優(yōu)選在細(xì)胞的線粒體內(nèi)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，導(dǎo)致線粒體膜電位被快速破壞。使用動物異種移植模型，證明噬菌體來源的蛋白質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤生長速度比不表達(dá)治療性噬菌體來源的穴蛋白的未處理對照組顯著降低。因此，意外地證明噬菌體來源的穴蛋白在人細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長減慢，并且在體外以及在體內(nèi)特異性地殺死真核細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞，或者更特別的是哺乳動物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。
根據(jù)另外一個實(shí)施方案，也可以使用常規(guī)調(diào)節(jié)元件。由滲漏調(diào)節(jié)元件引起的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄可以通過在包裝系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)一種核酸序列而沉默化，這種核酸序列至少部分互補(bǔ)于細(xì)胞毒性基因的轉(zhuǎn)錄物(反義RNA)，但是仍然能夠有效地結(jié)合細(xì)胞毒性基因的轉(zhuǎn)錄物，因此抑制細(xì)胞毒性基因的翻譯，使得至少包裝系統(tǒng)的生存力提高，并且產(chǎn)生足夠的病毒載體顆粒。
根據(jù)另外一個實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種向真核細(xì)胞中導(dǎo)入和在其中表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制活性或細(xì)胞殺傷效應(yīng)的噬菌體來源的蛋白質(zhì)或融合蛋白或者至少其功能性部分的方法。為此，將編碼噬菌體來源的蛋白質(zhì)或融合蛋白、其功能部分或其類似物的核酸序列，和可操作連接的調(diào)節(jié)元件導(dǎo)入真核細(xì)胞中，然后在其中在適當(dāng)連接的調(diào)節(jié)元件的控制下表達(dá)。為了攝取，所述核酸序列可以作為裸DNA呈現(xiàn)給真核細(xì)胞，該真核細(xì)胞一定程度地攝取該核酸序列，并表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)。為了提高效率，可以使用眾所周知的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，如磷酸鈣，將質(zhì)粒或其他DNA載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。病毒載體，可以是重組病毒或病毒顆粒，用來感染真核細(xì)胞，從而將核酸序列轉(zhuǎn)移到所述細(xì)胞內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的“融合蛋白”由第一多肽和至少第二多肽組成，它們?nèi)急舜丝刹僮鞯剡B接，而每種多肽都保持其特定功能。
在融合蛋白被設(shè)計為從胞外基質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞中例如從組合物或膠囊釋放的實(shí)施方案中，噬菌體來源的蛋白質(zhì)可以與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)連接，或者換句話說，與易于被細(xì)胞攝取的穿梭蛋白連接。這樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)域的例子有單純皰疹病毒的VP22、觸角蛋白的PTD域、PDX-1的PTD或人免疫缺陷病毒蛋白Tat的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)成HIV Tat蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域的11個氨基酸殘基與噬菌體來源的蛋白質(zhì)或穴蛋白或優(yōu)選噬菌體λS105蛋白、噬菌體λS107蛋白或噬菌體Phi29 GP14蛋白的NH2末端連接。
在融合蛋白從生產(chǎn)細(xì)胞分泌到胞外基質(zhì)內(nèi)的實(shí)施方案中，編碼噬菌體來源的蛋白質(zhì)或由蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域和噬菌體來源的穴蛋白組成的融合蛋白的多核苷酸序列與編碼可切割信號肽序列的多核苷酸序列相連接。融合蛋白的信號肽引導(dǎo)該融合蛋白通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。不同蛋白質(zhì)的某些天然存在的信號肽在序列上不同源，但是它們通常包括幾個，優(yōu)選4-12個疏水性殘基，這些殘基是穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從而使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到高爾基體或胞吐釋放體內(nèi)所必需的。通常，在信號肽的疏水性序列的幾個殘基之前還有一個堿性殘基。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，信號肽與噬菌體來源的蛋白質(zhì)的N末端可操作地連接，更優(yōu)選地與由蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域和噬菌體來源的穴蛋白組成的融合蛋白可操作地連接，進(jìn)一步優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域由HIV Tat的11個氨基酸殘基組成，而該穴蛋白選自噬菌體λS105、噬菌體λS107或Phi29 GP14?？稍诒景l(fā)明中使用的可切割信號肽的例子選自例如前原白蛋白、前-IgG輕鏈、前溶菌酶、前催乳素、前青霉素酶、前水泡性口膜炎病毒糖蛋白或前脂蛋白。進(jìn)一步優(yōu)選使用骨粘連蛋白/SPARC/BM40信號肽。
本發(fā)明的“融合蛋白”可以通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、化學(xué)技術(shù)和體內(nèi)重組/基因重組。另外，也可以使用如Sambrook等人(1989)所述的自動合成儀進(jìn)行DNA和RNA合成。
這種融合蛋白的制備通常需要制備第一和第二DNA編碼區(qū)和這些區(qū)域在閱讀框內(nèi)功能性連接或接合，以制備編碼所需融合蛋白的單一編碼區(qū)。在本文中，編碼噬菌體來源的蛋白質(zhì)、優(yōu)選穴蛋白、進(jìn)一步優(yōu)選λS105蛋白的DNA序列與編碼穿梭蛋白(例如HIV-1-Tat、HBV-PreS2-TLM、Sox10或VP22)的DNA序列在閱讀框內(nèi)連接。通常認(rèn)為治療劑-靶向劑的哪個部分制備為N末端區(qū)或C末端區(qū)并不特別重要。依賴于用作融合蛋白一部分的穿梭蛋白，可能必須提供肽間隔區(qū)來連接融合蛋白的兩個部分。這些肽間隔區(qū)可以是可切割的或不可切割的。這些重組產(chǎn)生的融合蛋白可以被純化以及配制用于施用于人類?；蛘?，編碼融合蛋白的核酸可以通過基因治療來輸送。盡管可以使用裸重組DNA或質(zhì)粒，但優(yōu)選使用脂質(zhì)體或載體。
另外，可以使用交聯(lián)劑形成分子橋而將兩個不同分子的官能團(tuán)在化學(xué)上連接在一起。為了分步連接兩個不同的蛋白質(zhì)，優(yōu)選不會形成不希望的均聚物的異雙功能交聯(lián)劑。異雙功能交聯(lián)劑含有兩個反應(yīng)基一個通常與伯胺基反應(yīng)(例如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))，另一個通常與巰基反應(yīng)(例如吡啶基二硫化物、馬來酰亞胺、鹵素等)。通過伯胺反應(yīng)基，交聯(lián)劑可以與一個蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基反應(yīng)，并且通過巰基反應(yīng)基，已經(jīng)連接到第一蛋白質(zhì)的該交聯(lián)劑與另一蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基(游離的巰基)反應(yīng)。
因此，多肽或蛋白質(zhì)通常具有，或者經(jīng)衍生化后具有，可用于交聯(lián)目的的官能團(tuán)。這一要求不認(rèn)為是限制，因?yàn)橛卸喾N基團(tuán)能夠以這種方式使用。例如，可以使用伯胺基或仲胺基、酰肼或肼基、羧基醇、磷酸酯或烷基化基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合或交聯(lián)。
交聯(lián)劑的兩個反應(yīng)基之間的間隔臂可以具有不同的長度和化學(xué)組成。較長的間隔臂使偶聯(lián)成分具有較好的柔性，而同時該橋中的一些特定成分(例如苯基)可以使反應(yīng)基具有額外的穩(wěn)定性或者提高化學(xué)連接對各方面作用的抗性(例如二硫鍵對還原劑的抗性)。也考慮到使用肽間隔區(qū)如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala。
優(yōu)選地使用在血液或其他體液中具有適當(dāng)穩(wěn)定性的交聯(lián)劑。已知可以成功使用許多類型的含二硫鍵的交聯(lián)劑。典型的異雙功能交聯(lián)劑有SMPT、SPDP、LC-SPDP、Sulfo-LC-SPDP、SMCC、Sulfo-SMCC、MBS、Sulfo-MBS、SIAB、Sulfo-SIAB、SMPB、Sulfo-SMPB、EDC/Sulfo-NHS或ABH。含有空間阻礙的二硫鍵的交聯(lián)劑證明獲得更好的體內(nèi)穩(wěn)定性，防止在結(jié)合于作用部位之前釋放藥物。這些交聯(lián)劑因此是優(yōu)選的一類連接劑。
使用的另外一種優(yōu)選交聯(lián)劑是SMPT，它是一種雙功能交聯(lián)劑，含有被相鄰的苯環(huán)和甲基“空間阻礙”的二硫鍵。人們認(rèn)為二硫鍵的空間阻礙具有保護(hù)該鍵免遭硫醇陰離子如可存在于組織和血液中的谷胱甘肽攻擊的作用，從而有助于在所連接的藥劑被輸送到靶部位例如腫瘤之前防止偶聯(lián)物解偶聯(lián)。
SMPT交聯(lián)劑，以及許多其他的已知交聯(lián)劑，提供交聯(lián)官能團(tuán)如半胱氨酸的SH或伯胺(例如賴氨酸的ε-氨基)的能力。另外一種可能的交聯(lián)劑類型包括含有可切割二硫鍵的異雙功能光反應(yīng)性疊氮苯，如磺基琥珀酰亞氨基-2-(對-疊氮基水楊酰氨基)乙基-1，3’-二硫代丙酸。N-羥基琥珀酰亞氨基與伯氨基反應(yīng)，疊氮苯(在光解后)與任意氨基酸殘基非選擇性地反應(yīng)。
除了阻礙的交聯(lián)劑以外，在此也可以使用非阻礙的交聯(lián)劑。其他有用的交聯(lián)劑，不考慮含有或產(chǎn)生被保護(hù)的二硫化物，包括SATA、SPDP和2-iminothiolane(亞氨硫醇)。這些交聯(lián)劑的應(yīng)用在本領(lǐng)域中眾所周知。
一旦偶聯(lián)后，偶聯(lián)物即與未偶聯(lián)的成分及其他雜質(zhì)分離。有大量純化技術(shù)可用于提供純度足以使它們用于臨床的偶聯(lián)物?；诖笮》蛛x如凝膠過濾、凝膠滲透或高效液相層析的純化方法通常應(yīng)用最廣。也可以使用其他層析技術(shù)，如Blue-Sepharose分離。
本發(fā)明的“藥物組合物”除治療有效量的表達(dá)載體外還可包含核酸序列、病毒顆粒、真核包裝細(xì)胞、生產(chǎn)細(xì)胞、噬菌體來源的蛋白質(zhì)，例如穴蛋白和/或融合蛋白，通常，一種或多種藥學(xué)可接受的和/或藥理學(xué)可接受的載體、添加劑、抗生素、防腐劑、佐劑、稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。
短語“ 藥學(xué)或藥理學(xué)可接受的”是指當(dāng)適當(dāng)?shù)厥┯糜趧游锘蛉藭r不產(chǎn)生不良反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)或其他不利反應(yīng)的分子和組合物。
在此使用時，“藥學(xué)可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。另外，這些輔助物質(zhì)可以是水、鹽水、甘油、乙醇、濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。合適的載體一般是大的、代謝緩慢的分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集物等。這些介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的應(yīng)用在本領(lǐng)域中眾所周知。對于人類給藥，制劑應(yīng)當(dāng)滿足FDA生物制品局的標(biāo)準(zhǔn)所要求的或根據(jù)管理歐洲聯(lián)盟醫(yī)藥產(chǎn)品的EudraLex法規(guī)所要求的無菌、熱原質(zhì)性、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
在另一個實(shí)施方案中，治療有效量的表達(dá)載體、核酸序列、病毒顆粒、真核生產(chǎn)細(xì)胞或包裝細(xì)胞和/或噬菌體來源的蛋白質(zhì)或融合蛋白可以封裝于通透膜或半通透膜內(nèi)。
術(shù)語“封裝”是指生物材料包含在生物相容的裝置或“膠囊”中，這些裝置或“膠囊”將內(nèi)容物與周圍環(huán)境免疫分離，并且允許向膠囊外釋放表達(dá)載體、核酸序列、病毒顆粒和/或噬菌體來源的蛋白質(zhì)例如穴蛋白。因此用于封裝的生物相容材料的主要特征應(yīng)當(dāng)如下(i)不會顯著激活補(bǔ)體系統(tǒng)；(ii)允許較小分子如氧、營養(yǎng)物和廢物進(jìn)入和/或排出膠囊；(iii)允許向膠囊外釋放產(chǎn)物(表達(dá)載體、核酸序列、病毒顆粒和/或噬菌體來源的蛋白質(zhì)如穴蛋白；和(iv)顯著阻止宿主免疫系統(tǒng)的成分進(jìn)入膠囊。
各種生物相容的人工聚合物(或共聚物)可以用于封裝，例如其來源于纖維素、葡聚糖、聚酰胺、聚氨酯、丙烯腈、尼龍、藻酸-聚-L-賴氨酸、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、AN69(聚丙烯腈-甲代烯丙基磺酸酯)、甲基丙烯酸羥乙酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)、聚酰胺、聚醚砜(PES)、硫酸殼聚糖、PAN/PVC或瓊脂糖-聚苯乙烯藻酸酯。優(yōu)選地，半透膜由電解質(zhì)復(fù)合物形成，最優(yōu)選由硫酸纖維素和聚二甲基二烯丙基氯化銨形成。
生物相容的裝置可以表現(xiàn)為不同的形式，例如中空纖維、片或墊。在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施方案中，膠囊為球形，直徑在0.01至5mm不等，優(yōu)選0.1至2mm。作為例子，可以使用EP0835137或EP0892852所述的微膠囊，在此引用作為參考。
為了封裝，表達(dá)載體、核酸序列、病毒顆粒、生產(chǎn)細(xì)胞、包裝細(xì)胞和/或噬菌體來源的蛋白質(zhì)如穴蛋白與聚陰離子成分(例如硫酸纖維素)在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中混合。然后將該混合物滴入含有聚陽離子成分(例如聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯芐基三甲基氯化銨)的聚合浴中，產(chǎn)生膠囊，該膠囊具有由電解質(zhì)復(fù)合物形成的穩(wěn)定膜，并且包圍著未聚合的聚陰離子的液體核心。
已知有幾種制備方法可制備這樣的微膠囊(例如空氣噴射法、振動法、噴射切割法)。
在形成膠囊后，生物材料被包裹于膠囊核心內(nèi)。為了制備藥物組合物，必須利用另外的洗滌和/或過濾步驟將膠囊與聚合介質(zhì)分開。
優(yōu)選地配制含有膠囊的組合物用于非腸胃給藥，例如靜脈注射、動脈內(nèi)注射、肌肉注射或其他這樣的途徑，包括直接注入有此需要的動物或人的腫瘤內(nèi)或病變部位(腔內(nèi)給藥)。
適合注射應(yīng)用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液；含有芝麻油、花生油或含水丙二醇的制劑；用于即時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。滿足人體內(nèi)應(yīng)用的要求的介質(zhì)例如有NaCl溶液或林格乳酸鹽溶液。在所有情況下，其形式應(yīng)當(dāng)是無菌的并且是具有可注射性的液體。在生產(chǎn)和儲存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，并且應(yīng)當(dāng)防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。膠囊可以在合適的容器如玻璃瓶或注射器內(nèi)配制。含有被封裝的細(xì)胞的制劑可以進(jìn)一步含有冷凍保護(hù)劑(例如DMSO、甘油)和/或其他添加劑。在應(yīng)用于患者之前，冷凍保護(hù)劑的濃度可以通過稀釋或另外的洗滌步驟來降低。
此外，根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，噬菌體來源的蛋白質(zhì)，穴蛋白或融合蛋白，可以與其他藥學(xué)可接受的制劑一起組合在一個藥盒中。這些其他的制劑可以是用于診斷/成像或聯(lián)合治療的制劑。例如，這些藥盒可以含有任何一種或多種化療藥或放療藥；抗血管生成劑；抗腫瘤細(xì)胞抗體；和/或抗腫瘤脈管系統(tǒng)或細(xì)胞毒素。
本發(fā)明的噬菌體來源的蛋白質(zhì)或融合蛋白最可能配制用于非腸胃給藥，例如配制用于靜脈注射、肌肉內(nèi)、皮下、透皮或其他途徑，包括蠕動給藥和直接注入腫瘤內(nèi)或病變部位(腔內(nèi)給藥)。
適合注射應(yīng)用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液；含有芝麻油、花生油或含水丙二醇的制劑；用于即時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。滿足人體內(nèi)應(yīng)用的要求的介質(zhì)例如有NaCl溶液或林格乳酸鹽溶液。在所有情況下，其形式應(yīng)當(dāng)是無菌的并且是具有可注射性的液體。在生產(chǎn)和儲存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，并且應(yīng)當(dāng)防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。
藥物組合物可以配制為中性或鹽形式的無菌含水組合物。治療劑靶向劑作為游離堿或藥學(xué)可接受的鹽的溶液可以在與表面活性劑如羥丙基纖維素適當(dāng)混合的水中制備。藥學(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)以及與無機(jī)酸如鹽酸或磷酸或有機(jī)酸如乙酸、三氟乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以來源于無機(jī)堿，如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物，和有機(jī)堿，如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。
合適的載體包括溶劑和分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，其合適的混合物，和植物油。在許多情況中，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。例如，通過使用包衣，如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，和/或使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 在另外的實(shí)施方案中，噬菌體來源的蛋白質(zhì)例如穴蛋白或融合蛋白可以包埋于脂質(zhì)體和/或納米顆粒和/或其他包層體(cladding body)內(nèi)。脂質(zhì)體的形成和應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，脂質(zhì)體由分散在水性介質(zhì)中的磷脂形成，并且自發(fā)形成多層同心雙層囊泡(也被稱為多層袁泡(MLV))。MLV的直徑通常為25nm至4μm。MLV的超聲處理導(dǎo)致形成核心中含有水溶液、直徑為200-500埃的小的單層囊泡(SUV)。脂質(zhì)體通過不同的機(jī)制與細(xì)胞相互作用，例如通過吞噬作用的胞吞作用或通過脂質(zhì)體的脂雙層插入質(zhì)膜內(nèi)與漿細(xì)胞膜融合，同時將脂質(zhì)體內(nèi)容物釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
本發(fā)明該部分的納米顆?；蚱渌鼘芋w通常能夠以穩(wěn)定和可重復(fù)的方式捕獲化合物。為了避免胞內(nèi)多聚體過量引起的副作用，這些膠囊應(yīng)當(dāng)用優(yōu)選能夠在體內(nèi)降解的聚合物設(shè)計，例如使用可生物降解的聚烷基氰基丙烯酸酯。
噬菌體來源的蛋白質(zhì)或融合蛋白的治療有效量可以是每劑量約5-100mg，約10-80mg，約20-70mg，優(yōu)選約25-60mg，或進(jìn)一步優(yōu)選約30-50mg。應(yīng)當(dāng)理解，在與其他藥物聯(lián)用時更低的劑量可能更適合，高于100mg的劑量仍然能夠耐受。
在本發(fā)明的一個方案中，提供了制備含有和保持傳染性病毒顆?；蛑亟M病毒的組合物的方法。簡而言之，通過首先將足量的配制緩沖液添加到含有重組病毒的介質(zhì)中，以形成水懸浮液，可以保存已經(jīng)純化或濃縮的傳染性病毒顆?；蛑亟M病毒。配制緩沖液是在水中含有多糖、高分子量結(jié)構(gòu)添加劑和緩沖成分的水溶液。如本發(fā)明上下文中所使用的“緩沖化合物”或“緩沖成分”應(yīng)當(dāng)理解為是指用來將水懸浮液保持在所需pH的物質(zhì)。水溶液也可含有一種或多種氨基酸和/或任選的細(xì)胞生長因子。
傳染性病毒顆?；蛑亟M病毒也可以以純化的形式保存。更特別地，在添加配制緩沖液之前，可以使粗原液通過濾器而澄清，然后濃縮，例如通過交叉流濃縮系統(tǒng)(Filtron Technology Corp.，Nortborough，MA)。在一個實(shí)施方案中，向濃縮液中加入DNase以消化外源DNA。然后將消化物滲濾，以除去過量的介質(zhì)成分，并在更希望的緩沖溶液中建立傳染性病毒顆?；蛑亟M病毒。然后使?jié)B濾物通過SephadexS-500凝膠柱，洗脫純化的顆?；虿《?。向該洗脫液中加入足量的配制緩沖液以達(dá)到所需的組分終濃度，并最低限度地稀釋重組病毒，然后將水懸浮液貯存，優(yōu)選貯存在-70℃，或者立即干燥。如上所述，配制緩沖液是在水中含有糖、高分子量結(jié)構(gòu)添加物和緩沖成分的水溶液。水溶液也可以含有一種或多種氨基酸和/或任選的細(xì)胞生長因子。
傳染性病毒顆?；蛑亟M病毒的粗原液也可以通過利用蔗糖密度梯度的超速離心步驟來純化。該方法為標(biāo)準(zhǔn)病毒純化方法。通常，粗原液可以利用以下事實(shí)來純化在不同密度的溶液(例如溶于0.1MTris-EDTA pH 9.5中的20％-60％w/v蔗糖)中離心的特定密度的分子將傾向于集中在分子密度和溶液密度嚴(yán)格相等的區(qū)域的帶中。離心后，通過離心管底部的孔收集不同部分。通過在緩沖液中離心洗去多余的蔗糖，并將傳染性病毒顆?；蛑亟M病毒重懸浮于所需緩沖溶液中。然后如上所述向純化的重組病毒中加入足量的配制緩沖液，并將水懸浮液或者立即干燥或者貯存，優(yōu)選貯存于-70℃。
粗制形式或純化形式的水懸浮液可以通過凍干或室溫蒸發(fā)來干燥。具體地，凍干包括以下步驟將水懸浮液冷卻到玻璃轉(zhuǎn)化溫度以下，或者水懸浮液的低共熔點(diǎn)溫度以下，通過升華從冷卻的懸浮液中除去水，從而形成凍干的病毒。簡而言之，將配制的重組病毒的等份置于與冰凍干燥器(Supermodulyo 12K)相連的Edwards冷藏室(3 shelfRC3S單元)中。采用Phillips等人(Cryobiology 18414，1981)所述的多步冷凍干燥方法將配制的重組病毒凍干，優(yōu)選地在-40℃至-45℃的溫度下。獲得的組合物含有低于凍干病毒的10％重量的水。一旦凍干，重組病毒即穩(wěn)定，可以貯存于-20℃至25℃，如以下詳述。
如前所述用于配制的水溶液是由糖、高分子量結(jié)構(gòu)添加物、緩沖成分和水組成的。該溶液也可以含有一種或多種氨基酸。這些成分的組合的作用在于在冷凍和凍干或者蒸發(fā)干燥時保持傳染性病毒顆粒或重組病毒的活性。盡管優(yōu)選的糖是乳糖，但是也可以使用其他的糖，如蔗糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、肌醇、果糖、麥芽糖或半乳糖。另外，也可以使用糖類的組合，例如，乳糖和甘露醇，或蔗糖和甘露醇。特別優(yōu)選的乳糖濃度是3％至4％重量。優(yōu)選地，糖的濃度為1％至12％重量。
氨基酸，如果存在的話，用來進(jìn)一步在水懸浮液冷卻和融化時保持病毒傳染性。另外，氨基酸也用來在冷卻的水懸浮液升華過程中和凍干狀態(tài)時進(jìn)一步保持病毒傳染性。一種優(yōu)選的氨基酸是精氨酸，但是也可以使用其他氨基酸如賴氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸。特別優(yōu)選的精氨酸濃度為0.1％重量。優(yōu)選地，氨基酸的濃度為0.1％至10％重量。
另外，可以有利地使用含有已知能夠提高被感染細(xì)胞活性的成分的水溶液。生長因子或生長因子的組合，如果存在于藥物組合物中，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程，從而在本發(fā)明的范圍內(nèi)有利于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的攝取和進(jìn)一步的整合。代表性的例子包括表皮生長因子(EGF)、促黑素細(xì)胞激素(MSH)、胰島素樣生長因子(IGF)和各種細(xì)胞因子，如白介素-2、-4或-10、干擾素α或γ。
緩沖成分用來通過保持相對恒定的pH來緩沖溶液。可以使用多種緩沖液，這取決于需要的pH范圍，優(yōu)選7.0至7.8。合適的緩沖液包括磷酸緩沖液和檸檬酸緩沖液。重組病毒制劑的特別優(yōu)選的pH是7.4，一種優(yōu)選的緩沖液是氨基丁三醇(tromethamine)。
另外，優(yōu)選地水溶液含有中性鹽，用來將最終配制的病毒調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)牡葷B鹽濃度。合適的中性鹽包括氯化鈉、氯化鉀或氯化鎂。一種優(yōu)選的鹽是氯化鈉。
含有所需濃度的上述成分的水溶液可以制備為濃縮的貯存液。
將重組病毒保持在凍干狀態(tài)以備以后重建的一種特別優(yōu)選的方法包括以下步驟(a)將傳染性重組病毒與水溶液組合，以形成水懸浮液，該水懸浮液含有4％重量的乳糖、0.1％重量的人血清白蛋白、0.03％重量或更低的NaCl、0.1％重量的精氨酸，和一定量的氨基丁三醇緩沖液，其量有效提供約7.4的水懸浮液pH，從而穩(wěn)定該傳染性重組病毒；(b)將該懸浮液冷卻至-40℃至-45℃的溫度，形成冷凍的懸浮液；和(c)通過升華從該冷凍的懸浮液中除去水，以形成凍干的組合物，其含有低于凍干組合物的2％重量的水，該組合物在重建后能夠感染哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選地該重組病毒能夠復(fù)制，進(jìn)一步優(yōu)選地，該重組是復(fù)制缺陷的，并且在重建后適合施用于人體內(nèi)。
基于本文的公開內(nèi)容，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，當(dāng)凍干的病毒打算室溫貯存時，優(yōu)選地可以在水溶液中使用某些糖類。更具體地，優(yōu)選使用二糖，如乳糖或海藻糖，特別用于在室溫下貯存。
本發(fā)明的凍干或脫水的病毒可以用多種物質(zhì)重建，但是優(yōu)選用水重建。在某些情況下，也可以使用稀釋鹽溶液，它使最終制劑等滲。另外，有利地可以使用含有已知能夠提高重建病毒活性的成分的水溶液。這些成分包括細(xì)胞因子，如IL-2，聚陽離子，如硫酸魚精蛋白，或者能夠增強(qiáng)重建病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的其他成分。凍干或脫水的重組病毒可以用允許基本地和優(yōu)選地全部溶解凍干或脫水樣品的任何適當(dāng)體積的水或上述重建劑來重建。
根據(jù)本發(fā)明，如上所述的組合物特別可用于治療需要治療的患者中的癌癥。為此，本發(fā)明的組合物可以直接施用于腫瘤或者多個部位，包括例如，如下部位腦脊液、骨髓、關(guān)節(jié)、動脈內(nèi)皮細(xì)胞、直腸、口腔/舌下、陰道、淋巴系統(tǒng)、選自下組的器官肺、肝、胰、脾、皮膚、血液和腦，或選自腫瘤和間質(zhì)間隙的部位。在其他實(shí)施方案中，組合物可以眼內(nèi)、鼻內(nèi)、舌下、經(jīng)口、局部、膀胱內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)例如肝動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)或皮下給藥。其他代表性給藥途徑包括胃鏡法、ECRP和結(jié)腸鏡法，這不需要全部手術(shù)步驟和住院，但是可能需要醫(yī)務(wù)人員的幫助。
施用本發(fā)明的組合物的考慮因素包括以下口服是易用且方便、經(jīng)濟(jì)(不需消毒)、安全(多數(shù)情況下可以處理過量的劑量)的，并且允許控制釋放組合物的活性成分(重組病毒)。相反的，可能產(chǎn)生局部刺激，如惡心、嘔吐或腹瀉、溶解性較差藥物的不穩(wěn)定吸收，而且重組病毒將經(jīng)受肝代謝的“首過效應(yīng)”和胃酸及酶降解。另外，可能起效緩慢，可能無法達(dá)到有效的血漿水平，需要患者的配合，食物可能影響吸收。
口腔/舌下給藥是一種方便的給藥方法，它導(dǎo)致組合物活性成分快速起效，并且避免首過代謝。因此，沒有胃酸或酶降解，并且重組病毒的吸收是可行的。具有高生物利用性，實(shí)際上立即停止治療是可能的。相反，這種給藥只限于相對較低的劑量(一般約10-15mg)，可能無法同時進(jìn)食、飲水或吞咽。
直腸給藥提供可以忽略的首過代謝效應(yīng)(具有良好的血液/淋巴管供應(yīng)，吸收的材料直接進(jìn)入下腔靜脈內(nèi))，該方法適合兒童、嘔吐和意識喪失的患者。該方法避免了胃酸和酶降解，組合物的離子化將不會改變，因?yàn)橹蹦c液沒有緩沖能力(pH 6.8；荷電組合物吸收最佳)。相反，可能具有緩慢、較差或不穩(wěn)定的吸收、刺激、細(xì)菌群落降解，并且吸收表面小(約0.05m2)。另外，直腸粘膜吸收優(yōu)選親脂性和水溶性化合物，并且吸收增強(qiáng)劑(例如鹽、EDTA、NSAID)可能是必需的。
此處描述的許多給藥途徑(例如進(jìn)入腦脊液(CSF)、進(jìn)入骷髏、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、進(jìn)入各種器官、腫瘤內(nèi)、進(jìn)入間質(zhì)間隙、腹膜內(nèi)、淋巴內(nèi)或進(jìn)入毛細(xì)血管床)可以通過簡單地使用針、導(dǎo)管或有關(guān)裝置直接給藥來實(shí)現(xiàn)。特別是，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以以所述方式直接施用一種或多種劑量向腦脊液內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；向骨髓內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；關(guān)節(jié)內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；靜脈內(nèi)，劑量大于或等于108、109、1010或1011cfu；動脈內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；顱內(nèi)，劑量大于或等于109、1010或1011cfu；肌肉內(nèi)，劑量大于或等于1010或1011cfu；眼內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；經(jīng)肺，劑量大于或等于105、106107、108、109、1010或1011cfu；經(jīng)鼻，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；舌下，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；經(jīng)直腸，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；經(jīng)口，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；局部，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；經(jīng)陰道，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；皮下，劑量大于或等于109、1010或1011cfu；膀胱，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010、或1011cfu；向器官如肺、肝、脾、皮膚、血液或腦內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；腫瘤內(nèi)，劑量大于或等于108、109、1010或1011cfu；腹膜內(nèi)，劑量大于或等于108、109、1010或1011cfu；間質(zhì)間隙，劑量大于或等于1010或1011cfu；淋巴內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；向毛細(xì)血管床內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu；或者鞘內(nèi)，劑量大于或等于105、106、107、108、109、1010或1011cfu。
重組病毒可以從體外輸送到目標(biāo)部位(為門診操作)，或者通過一種手術(shù)操作，其中施用載體是具有其他目的的操作的一部分，或者通過為施用載體而特別設(shè)計的操作。其他給藥途徑和方法包括非腸胃外途徑以及經(jīng)多部位給藥。
此外，病毒、病毒載體顆?；虬b細(xì)胞可以封裝于生物相容的裝置例如上述膠囊內(nèi)。這些生物相容的裝置可以以組合物的形式使用，該組合物含有所述生物相容的裝置，并且配制為優(yōu)選用于對需要的動物包括人類非腸胃給藥。


圖1表示表達(dá)載體pMMTV-holin和pMMTVb.LTR的圖譜bla，β-內(nèi)酰胺酶基因；MMTV LTR，小鼠乳腺瘤病毒的3’LTR；λ-S105，編碼λ-穴蛋白的噬菌體λ基因S(密碼子3至107)；SV40 ori，SV40復(fù)制起點(diǎn)；pSV40，SV40啟動子；neo，新霉素抗性基因；pUC19 ori，來自質(zhì)粒pUC19的復(fù)制起點(diǎn)。
圖2表示用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞在地塞米松刺激24、48、72、96、120小時后，通過Western blotting測定的λ-S105的表達(dá)。被染色的λ-S105編碼穴蛋白用箭頭表示。分子量標(biāo)準(zhǔn)的大小在左側(cè)給出(kDa)；-dex，無地塞米松處理；細(xì)菌裂解物，誘導(dǎo)型表達(dá)λ-S105的大腸桿菌細(xì)胞的裂解物。
圖3表示用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞在地塞米松誘導(dǎo)λ-S105表達(dá)后的形態(tài)學(xué)變化。(A)用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并與地塞米松溫育指定時間的HeLa細(xì)胞。(B)用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并與地塞米松(+dex)溫育指定時間的HeLa細(xì)胞。-dex，無地塞米松處理。箭頭指出多核細(xì)胞的核。
圖4表示地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對HeLa細(xì)胞存活率的影響，其是通過以下試驗(yàn)測定以下細(xì)胞中的代謝活性，MTT試驗(yàn)(●)用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，和(○)用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞作為對照，或者臺盼藍(lán)排除試驗(yàn)(▲)用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，和(△)用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞作為對照，或者膜聯(lián)蛋白V/7AAD染色(■)用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，和(□)用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞作為對照。
圖5表示Tet-調(diào)節(jié)的表達(dá)載體pUHD10.3-holin-Hygr和pUHD10.3-Hygr的圖譜。SV40 poly(A)，猿病毒40的聚腺苷酸化信號；SV40啟動子，猿病毒40啟動子；ColE1 ori，復(fù)制起點(diǎn)；ampr，氨芐青霉素抗性基因；hygror，潮霉素抗性基因；MCS，多克隆位點(diǎn)；7tetO+mCMV.與人巨細(xì)胞病毒的最小啟動子偶聯(lián)的四環(huán)素操縱元件的7個重復(fù)；λ-S105，噬菌體λ-穴蛋白編碼基因；PvuII，SacII，XbaI，限制性內(nèi)切酶結(jié)合位點(diǎn)。
圖6表示(A)HeLa細(xì)胞克隆C124(泳道5-9)、克隆C135(泳道10-14)、克隆C136(泳道15-19)和(B)用pTet-On(BD BiosciencesClontech)和表達(dá)載體pUHD0.3-holin-Hygr穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞克隆Cl1(泳道24-26)、克隆Cl6(泳道27-29)、克隆Cl3(泳道30-32)在多西環(huán)素刺激后通過Western blotting測定的λ-S105的表達(dá)。染色的λ-S105編碼的穴蛋白用箭頭表示。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的大小(kDa)在左側(cè)給出。泳道的編號為(1，20)誘導(dǎo)型表達(dá)λ-S105蛋白的大腸桿菌的裂解物；(2，22)用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并用地塞米松處理的HeLa細(xì)胞的提取物作為對照；(3，21)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；(4，23)未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的提取物；(5，10，15，25，27，30)未與多西環(huán)素溫育的pTet-On/pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；(6，11，16，26，28，31)與多西環(huán)素溫育24小時、(7，12，17，24，29，32)48小時、(8，13，18)72小時、(9，14，19)96小時的雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
圖7顯示用pTet-On和表達(dá)載體pUHD10.3-holin-Hygr穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的(A)HeLa和(B)293細(xì)胞克隆中，多西環(huán)素誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞存活率的影響，根據(jù)使用MTT試驗(yàn)的代謝活性測定而得。(A)◆未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞；■HeLa細(xì)胞克隆24；s HeLa細(xì)胞克隆35；6 HeLa細(xì)胞克隆36。(B)◆未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞；■293細(xì)胞克隆3；s 293細(xì)胞克隆6；6 293細(xì)胞克隆1。
圖8表示用pTet-On和pUHD10.3-holin-Hygr穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的(A)HeLa和(B)293細(xì)胞克隆中，多西環(huán)素誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞存活率的影響，根據(jù)臺盼藍(lán)排除試驗(yàn)測得。(A)◆未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞；■HeLa細(xì)胞克隆24；s HeLa細(xì)胞克隆35；6 HeLa細(xì)胞克隆36。(B)◆未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞；■293細(xì)胞克隆3；s 293細(xì)胞克隆6；6 293細(xì)胞克隆1。
圖9表示編碼組合Tet on/Tet off調(diào)節(jié)系統(tǒng)的成分的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[68]。載體pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror基于鼠白血病病毒(MLV)。LTR，MLV長末端重復(fù)；IRES，內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；Puror，嘌呤霉素抗性基因；ψ+，MLV包裝信號；rtTA-M2，反向Tet-調(diào)節(jié)的反式激活物(rtTA)的高親和力變體；TRSID，組蛋白-脫乙?；改技腡et-阻抑蛋白。
圖10表示在用pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror穩(wěn)定感染的和用pUHD10.3-holin-Hygr穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa、293和MCF-7細(xì)胞中，多西環(huán)素誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)的影響，根據(jù)使用MTT和臺盼藍(lán)排除試驗(yàn)測定細(xì)胞存活率而測得。○未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞；m未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞；◇未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞；s表達(dá)λ-S105的轉(zhuǎn)染的/感染的MCF-7細(xì)胞；6表達(dá)λ-S105的轉(zhuǎn)染的/感染的HeLa細(xì)胞；+表達(dá)λ-S105的轉(zhuǎn)染的/感染的293細(xì)胞。
圖11表示λ-S105穴蛋白表達(dá)對無免疫能力SCID/米色小鼠中的人乳腺瘤細(xì)胞來源的異種移植物的影響。將具有四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)的以及用pUHD10.3-holin-Hygr或pUHD10.3-Hygr轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞皮下注射到SCID/米色小鼠中。當(dāng)腫瘤生長到可觸及的大小時，給予小鼠濃度為2mg/ml的多西環(huán)素(處理組)或飲用凈水(非處理組)。比較多西環(huán)素處理動物和非處理動物的腫瘤生長速度。當(dāng)p＜0.05時認(rèn)為其差異是顯著的。(A)用pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞獲得的腫瘤生長速度的分析。統(tǒng)計學(xué)評價表明處理(+dox)和非處理(-dox)小鼠之間腫瘤生長速度有顯著性差異(p＝0.0424)。(B)用pUHD10.3-Hygr轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞獲得的腫瘤生長速度的比較。處理(+dox)和非處理(-dox)的動物之間未觀察到顯著性差異(p＝0.9014)。
圖12表示在同系免疫活性小鼠模型中λ-S105表達(dá)對鼠乳腺癌細(xì)胞來源的異種移植物生長的影響。鼠乳腺腺癌細(xì)胞(TS/A)用pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror感染，然后用pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染。用選擇的克隆的混合物在同系Balb/c小鼠中建立皮下異種移植腫瘤。也注射用pUHD10.3-Hygr轉(zhuǎn)染的被感染細(xì)胞。分為每組20只小鼠，然后用多西環(huán)素處理(50mg/kg，腹膜內(nèi))或不予處理。監(jiān)測腫瘤生長，用統(tǒng)計學(xué)方法評價生長速度。(A)來源于pUHD10.3-Hygr轉(zhuǎn)染的TSA細(xì)胞的異種移植物在非多西環(huán)素處理的(□)和多西環(huán)素處理的(△)小鼠中的腫瘤生長，以及來源于pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染的TSA細(xì)胞在非多西環(huán)素處理的(●)和多西環(huán)素處理的()小鼠中的腫瘤生長。(B)來源于pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染的(o)或pUHD10.3-Hygr轉(zhuǎn)染的(v)TSA細(xì)胞的異種移植物在多西環(huán)素處理的小鼠中的平均腫瘤生長速度的比較和統(tǒng)計學(xué)評價(非配對student t-檢驗(yàn))。發(fā)現(xiàn)差異非常顯著(p＝0.0012)。
圖13表示從pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror感染的和pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞制備的細(xì)胞提取物的亞細(xì)胞部分的Western blot分析。細(xì)胞與多西環(huán)素溫育48小時，誘導(dǎo)λ-S105基因表達(dá)。制備總細(xì)胞裂解物(T)，進(jìn)行差速離心，將細(xì)胞質(zhì)(C)、核(N)和線粒體(M)分離。分離的蛋白質(zhì)通過Western blotting分析細(xì)胞器特異性標(biāo)記蛋白如細(xì)胞色素c氧化酶(B)、鈣聯(lián)接蛋白(C)、核孔蛋白(D)和整聯(lián)蛋白(E)的存在。細(xì)胞色素c氧化酶和鈣聯(lián)接蛋白的共定位表明，在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中檢測到λ-S105蛋白(A)的存在。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的大小示于左側(cè)(kDa)。
以下實(shí)施例用來說明本發(fā)明的某些方案。
實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)噬菌體λS105蛋白的載體的功能性在該實(shí)施例中，檢查了用來在HeLa細(xì)胞中表達(dá)λ-S105的載體的功能性。編碼λ-S105等位基因的Sλ-開放閱讀框(ORF)的部分(密碼子3至107；噬菌體λ基因組的核苷酸45192至45509[GenBank登記號NC001416])使用引物V13和W13(表1)從質(zhì)粒pVIIIS105[53]中PCR擴(kuò)增，用XbaI和SacII限制性酶切，與也用XbaI和SacII限制性酶切的載體pMMTVGFP(表1)連接，產(chǎn)生載體pMMTV-holin(圖1)。
pMMTVGFP，即pMMTV-holin的親本載體，如下構(gòu)建將pcDNA3的含有CMV啟動子的NruI-BamHI片段(表1)替換為載體pLTR.stp(表1)的含有小鼠乳腺瘤病毒長末端重復(fù)(MMTV LTR)的NruI-BamHI片段，產(chǎn)生載體pMMTVb.LTR(表1)。從pEGFP-1(表1)上作為EcoRI-NotI片段切下eGFP基因，與已用EcoRI和NotI限制性酶切的pMMTVb.LTR連接，產(chǎn)生pMMTVGFP。
用pMMTV-holin轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B細(xì)胞(Invitrogen)，分離氨芐青霉素抗性克隆。通過對制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析證實(shí)載體pMMTV-holin的正確構(gòu)建，使用引物Seq-RC-MMTV-1-R(表1)通過DNA測序證明λ-S105基因的完整性。
按照廠商說明(Invitrogen)使用磷酸鈣共沉淀法用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，使用針對位于λ-S105編碼的穴蛋白C末端部分的肽的抗血清，通過Western blotting分析遺傳霉素G418(Invitrogen)抗性克隆的λ-S105表達(dá)。pMMTV-holin允許從位于MMTV LTR的U3區(qū)的MMTV啟動子經(jīng)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)表達(dá)λ-S105。為了篩選pMMTV-holin轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入1μM地塞米松(Sigma-Aldrich，Vienna，Austria)誘導(dǎo)表達(dá)，48小時后收獲細(xì)胞。進(jìn)一步研究在地塞米松處理后表現(xiàn)出誘導(dǎo)型λ-S105蛋白合成的細(xì)胞克隆(克隆12)。
因此，將克隆12或者作為對照的pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的1×105個細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)120小時。在不同時間點(diǎn)向培養(yǎng)基中加入1μM地塞米松，細(xì)胞在激素存在下進(jìn)一步培養(yǎng)24、48、72、96、120小時。對于地塞米松處理48小時以上的細(xì)胞，每到第二天向培養(yǎng)基中加入新的地塞米松。在120小時的時間點(diǎn)，同時收集所有細(xì)胞，重懸浮于SDS-Laemmli樣品緩沖液(Sigma-Aldrich，Deisenhofen，Germany)中，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過Western blotting分析等量的蛋白質(zhì)。最初在與地塞米松溫育24小時后檢測到λ-S105編碼的穴蛋白的合成(圖2)。之后表達(dá)水平大致保持恒定96小時。使用誘導(dǎo)型表達(dá)λ-S105的大腸桿菌細(xì)胞的裂解物作為對照(圖2，細(xì)菌裂解物)。
整合到被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的染色體DNA內(nèi)的λ-S105基因的完整性通過使用寡核苷酸引物Holin-F2和Holin-R1(表1)PCR擴(kuò)增編碼序列加以證實(shí)，這兩條引物分別結(jié)合λ-S105 ORF的上游和下游，然后用引物Holin-F2和Holin-R2(表1)對該片段進(jìn)行測序。
實(shí)施例2地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)后HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化在該實(shí)施例中檢查了地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)后HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。簡而言之，將用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的或作為對照用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的1×104個HeLa細(xì)胞接種于8孔腔式載玻片的腔室中，培養(yǎng)120小時。在不同的時間點(diǎn)向培養(yǎng)基中加入1μM地塞米松，細(xì)胞在激素的存在下進(jìn)一步培養(yǎng)24、48、72、96和120小時。對于用地塞米松處理48小時以上的細(xì)胞，每到第二天向培養(yǎng)基中加入新的地塞米松。細(xì)胞在緩沖的福爾馬林中固定，在蘇木精明礬溶液(Fluka，Seelze，Germany)中復(fù)染2分鐘。通過標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡檢查法(Zeiss Axiovert 200M，Carl Zeiss GmbH，Vienna，Austria)分析載玻片，并照相。pMMTVb.LTR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在地塞米松處理后不顯示任何明顯的形態(tài)學(xué)變化(圖3A)，而pMMTV-holin-轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)隨時間引起一種“膨脹”，最終導(dǎo)致巨大的，通常多核的細(xì)胞(圖3B，箭頭)。另外，與pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的相應(yīng)的對照(圖3A)相比，pMMTV-holin-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)在誘導(dǎo)λ-S105表達(dá)48小時后開始連續(xù)下降(圖3B，48h+dex，72h+dex，96h+dex，120h+dex)。
實(shí)施例3地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞代謝的影響在該實(shí)施例中，描述了用MTT試驗(yàn)(Sigma-Aldrich，Vienna，Austria)測定相對NADH和NADPH水平而確定的地塞米松誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞代謝的影響。
簡而言之，將pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的或者作為陰性對照的pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的1×105個HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)120小時。在不同時間點(diǎn)向培養(yǎng)基中加入1μM地塞米松，細(xì)胞在激素存在下進(jìn)一步培養(yǎng)24、48、72、96、120小時。對于地塞米松處理48小時以上的細(xì)胞，每到第二天向培養(yǎng)基中加入新的地塞米松。在120小時的時間點(diǎn)，同時收集所有細(xì)胞，并進(jìn)行MTT測定，以測定NADH和NADPH的相對量作為細(xì)胞代謝的指示，又是細(xì)胞存活率的指示。對于pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，與地塞米松溫育120小時導(dǎo)致存活的細(xì)胞比非地塞米松處理組明顯減少74％(圖4，實(shí)心圓形)。為了排除地塞米松本身對細(xì)胞生長和存活率的負(fù)作用，用缺乏λ-S105編碼區(qū)的pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞也與地塞米松溫育120小時(圖4，空心圓形)。用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并生長120小時但未與地塞米松溫育的HeLa細(xì)胞(圖4中時間點(diǎn)0h時的實(shí)心圓形)的活細(xì)胞數(shù)被設(shè)定為100％，并且與除用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外用相同方式處理的HeLa細(xì)胞(圖4中時間點(diǎn)120h處的空心圓形)比較，顯然地塞米松對細(xì)胞生長沒有負(fù)作用。相反，與帶有該基因的細(xì)胞(100％)相比，缺乏λ-S105基因的HeLa細(xì)胞表現(xiàn)數(shù)量較多的活細(xì)胞(110％)。這種效應(yīng)可以解釋為是由于MMTV啟動子系統(tǒng)的滲漏，以及甚至不含地塞米松時λ-S105在pMMTV-holin轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的組成型低水平表達(dá)，或者是由于細(xì)胞培養(yǎng)基中存在低水平的糖皮質(zhì)激素。總之，這些結(jié)果證明，如細(xì)胞代謝降低所表明的，λ-S105表達(dá)對細(xì)胞生存力具有顯著的負(fù)作用。
實(shí)施例4地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對膜完整性的影響在該實(shí)施例中，描述了通過應(yīng)用臺盼藍(lán)排除法測定的地塞米松誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中λ-S105表達(dá)對膜完整性的影響。細(xì)胞質(zhì)膜的滲漏是凋亡或壞死引起的細(xì)胞死亡的眾所周知的指示。將pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的或作為參照的pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的1×105HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)120小時。在不同的時間點(diǎn)，向培養(yǎng)基中加入1μM地塞米松，在激素存在下細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)24、48、72、96和120小時。對于用地塞米松處理48小時以上的細(xì)胞，每到第二天向培養(yǎng)基中加入新的地塞米松。在120小時的時間點(diǎn)，同時收獲所有細(xì)胞，進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，以測定具有完整膜的活細(xì)胞的數(shù)目。臺盼藍(lán)排除試驗(yàn)按照廠商說明書進(jìn)行(Sigma-Aldrich，Vienna，Austria)。對于pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞，與地塞米松溫育120小時導(dǎo)致具有完整(臺盼藍(lán)排除的)膜的細(xì)胞數(shù)目(30％)顯著低于被設(shè)定為100％的未用地塞米松處理的細(xì)胞(圖4，實(shí)心三角形)。為了排除地塞米松本身對膜完整性的負(fù)面作用，用缺乏λ-S105基因的pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞也與地塞米松溫育120小時。用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并生長120小時但未與地塞米松溫育的非缺陷HeLa細(xì)胞的數(shù)目(100％；圖4中時間點(diǎn)0h時的實(shí)心三角形)與除用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外用相同方式處理的HeLa細(xì)胞(圖4中時間點(diǎn)120h處的空心三角形)比較，顯然地塞米松本身不引起膜損傷。相反，缺乏λ-S105基因的HeLa細(xì)胞，與帶有該基因的細(xì)胞(100％)相比，顯示數(shù)目較多的具有完整細(xì)胞質(zhì)膜的活細(xì)胞(106％)。實(shí)施例3中也提到，這種作用最可能是由于MMTV啟動子系統(tǒng)的滲漏。總之，該實(shí)施例中描述的結(jié)果再次證明，如細(xì)胞質(zhì)膜完整性喪失所顯示的，λ-S105編碼的穴蛋白對細(xì)胞生存力具有有害的作用。
實(shí)施例5地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞質(zhì)膜的影響在該實(shí)施例中，描述了通過膜聯(lián)蛋白V-PE/7AAD染色測定的地塞米松誘導(dǎo)的λ-S105蛋白表達(dá)對細(xì)胞質(zhì)膜的影響。膜聯(lián)蛋白V是位于面向胞質(zhì)的內(nèi)膜小葉中的磷脂酰絲氨酸(PS)的天然結(jié)合配體。但是，在細(xì)胞凋亡過程中，PS暴露于細(xì)胞表面，因此能夠被從外部添加的膜聯(lián)蛋白V檢測到。膜聯(lián)蛋白V與細(xì)胞的結(jié)合是凋亡以及壞死的指示，因?yàn)槟な軗p的細(xì)胞使膜聯(lián)蛋白V進(jìn)入并且結(jié)合來自內(nèi)部的PS(55)。7AAD(7-氨基-放線菌素D)嵌入雙鏈核酸內(nèi)。它被具有完整膜的活細(xì)胞排除，但是能夠穿透晚期凋亡和/或壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜。
將pMMTV-holin或pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并且缺乏λ-S105編碼區(qū)的1×105個HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)120小時。在不同時間點(diǎn)向培養(yǎng)基中加入1μM地塞米松，細(xì)胞在激素存在下進(jìn)一步培養(yǎng)24、48、72、96、120小時。對于地塞米松處理48小時以上的細(xì)胞，每到第二天向培養(yǎng)基中加入新的地塞米松。在120小時的時間點(diǎn)，同時收集所有細(xì)胞，根據(jù)廠商說明(BD Biosciences，Heidelberg，Germany)進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V-PE/7AAD染色。未用地塞米松處理并且不顯示膜聯(lián)蛋白V-PE/7AAD染色(因此被視為活細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)目被設(shè)定為100％，并且與地塞米松處理120小時的細(xì)胞庫中膜聯(lián)蛋白V-PE/7AAD-陰性細(xì)胞的數(shù)目比較，顯然活細(xì)胞更少(32％)(圖4)。為了研究地塞米松本身對膜完整性的可能的作用，缺乏λ-S105基因的pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞也與地塞米松溫育120小時。用pMMTV-holin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并且生長120小時但是未與地塞米松溫育的的HeLa細(xì)胞的數(shù)目(100％；圖4中時間點(diǎn)0h處的實(shí)心正方形)與除用pMMTVb.LTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外用相同方式處理的HeLa細(xì)胞(圖4中時間點(diǎn)120h處的空心正方形)比較，顯然地塞米松本身不引起膜損傷。實(shí)施例3和4也指出，缺乏λ-S105基因的HeLa細(xì)胞在地塞米松處理120小時后表現(xiàn)出的活細(xì)胞數(shù)(111％)高于帶有該基因的細(xì)胞(100％)。另外，這種作用最可能是由于MMTV啟動子系統(tǒng)的滲漏(見實(shí)施例3)?？傊搶?shí)施例證明當(dāng)λ-S105在HeLa細(xì)胞中表達(dá)時具有強(qiáng)有力的細(xì)胞殺傷作用。
實(shí)施例6多西環(huán)素誘導(dǎo)的載體系統(tǒng)的評價在該實(shí)施例中，描述了使用多西環(huán)素誘導(dǎo)的Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)(BD Biosciences，Heidelberg，Germany)在HeLa和293細(xì)胞中表達(dá)λ-S105的作用。為此目的，將細(xì)胞用pTet-On穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，然后用相應(yīng)的編碼λ-S105的Tet-響應(yīng)載體pUHD10.3-holin-Hygr或親本載體pUHD10.3-Hygr(圖5)轉(zhuǎn)染。四環(huán)素響應(yīng)質(zhì)粒pUHD10.3-holin如下構(gòu)建將擴(kuò)增的含有λ-S105編碼區(qū)、長度為318bp的DNA片段(NCBI-Gene bank登記號J02459；核苷酸45192-45509)插入質(zhì)粒pUHD-10.3[http://www2.cbm.uam.es/bc-015/seguences/pUHD10-3.html]中。用于擴(kuò)增的引物(V13和W13[表1])包含SacII和XbaI位點(diǎn)，用于酶切消化，以及將獲得的片段與pUHD-10.3的3.15kb載體片段的XbaI和SacII位點(diǎn)連接。潮霉素抗性基因表達(dá)盒(2.3kb)通過用PvuII限制性內(nèi)切酶消化pcDNA3-Hygr(Invitrogen LT，Lofer，Austria)獲得。該2.3kb片段分別與PvuII線性化的載體pUHD-10.3-holin和pUHD-10.3連接，獲得載體pUHD-10.3-holin-Hygr和pUHD10.3-Hygr(圖5)。
使用針對位于λ-S105編碼的穴蛋白C末端部分的肽的抗血清，通過Western blotting分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆的多西環(huán)素誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)。在表達(dá)λ-S105的克隆中，進(jìn)一步分析顯示最高表達(dá)水平的三個克隆。HeLa細(xì)胞在5μg/ml多西環(huán)素的存在下培養(yǎng)24、48、72、96小時。293細(xì)胞只培養(yǎng)24和48小時，因?yàn)樗屑?xì)胞在此培養(yǎng)期之后死亡。HeLa細(xì)胞克隆24、35、36和293細(xì)胞克隆1、3、6中的λ-S105表達(dá)分別顯示在圖6A和B中。在未與多西環(huán)素一起培養(yǎng)的HeLa和293對照細(xì)胞中沒有觀察到(圖6，泳道5、15、27、30)或只有低的(圖6，泳道10、25)背景表達(dá)，而在向培養(yǎng)基中加入多西環(huán)素24小時后觀察到極高的表達(dá)(圖6，泳道6、11、16、26、28、31)。作為對照，使用實(shí)施例1描述的表達(dá)λ-S105的大腸桿菌細(xì)胞的相同細(xì)胞裂解物(圖6，泳道1和20)以及從載體pMMTV-holin穩(wěn)定表達(dá)λ-S105的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞提取物(圖6，泳道2和22；見實(shí)施例1)。與地塞米松誘導(dǎo)的從pMMTV-holin表達(dá)λ-S105的HeLa細(xì)胞(圖6B，泳道22)相比，用Tet-On載體系統(tǒng)表達(dá)λ-S105顯著提高了表達(dá)水平。通過Western blotting，在與多西環(huán)素溫育48小時后的293細(xì)胞克隆3的提取物中檢測到少量λ-S105穴蛋白(圖6B，泳道32)，這是由于大多數(shù)細(xì)胞在此時間點(diǎn)已經(jīng)死亡這一事實(shí)。在含有細(xì)菌裂解物的泳道20中染色的較大蛋白帶(圖6B)最可能代表λ-S105的寡聚形式，而在染色的λ-穴蛋白(用箭頭標(biāo)出)之外檢測到的較小的蛋白質(zhì)(圖6B，泳道24、25、26、28)可能表示293細(xì)胞中λ-S105穴蛋白部分降解。
實(shí)施例7多西環(huán)素誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞代謝的影響該實(shí)施例描述了通過使用MTT試驗(yàn)測定相對NADH和NADPH水平作為細(xì)胞生存力的指示，HeLa和293細(xì)胞中多西環(huán)素誘導(dǎo)的、Tet-調(diào)節(jié)的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞代謝的影響。帶有含λ-S105的Tet-調(diào)節(jié)表達(dá)載體pUHD10.3-holin-Hygr的被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞克隆24、35、36和293細(xì)胞克隆1、3、6在5μg/ml多西環(huán)素存在下培養(yǎng)24、48、72、96小時(HeLa細(xì)胞克隆)或24、48小時(293細(xì)胞克隆)，以誘導(dǎo)λ-S105表達(dá)。λ-S105編碼的穴蛋白的合成通過Western blotting證實(shí)(見實(shí)施例6)。對細(xì)胞進(jìn)行MTT測定(見實(shí)施例3)，以測定細(xì)胞生存力(圖7)。缺少該載體的未轉(zhuǎn)染的HeLa(圖7A)和293(圖7B)細(xì)胞的生存力(圖7，黑色菱形)未受損害，證明多西環(huán)素本身對細(xì)胞沒有負(fù)作用。但是，pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染的293和HeLa和細(xì)胞克隆中λ-S105的表達(dá)(圖7，實(shí)心正方形、三角形、十字形)在與多西環(huán)素溫育48小時至96小時后導(dǎo)致94％至98％的實(shí)際細(xì)胞殺傷。
實(shí)施例8多西環(huán)素誘導(dǎo)的λ-S105表達(dá)對細(xì)胞質(zhì)膜完整性的影響在該實(shí)施例中，描述了通過臺盼藍(lán)染色測定的多西環(huán)素誘導(dǎo)的HeLa和293細(xì)胞中的λ-S105表達(dá)對作為細(xì)胞生存力指示的細(xì)胞質(zhì)膜完整性的影響。λ-S105蛋白使用多西環(huán)素誘導(dǎo)的Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)(見實(shí)施例7)。檢查了帶有Tet-調(diào)節(jié)的表達(dá)載體pUHD10.3-holin-Hygr的HeLa細(xì)胞克隆24、35、36和293細(xì)胞克隆1、3、6。加入5μM多西環(huán)素誘導(dǎo)λ-S105表達(dá)，細(xì)胞在多西環(huán)素存在下培養(yǎng)24、48、72、96小時(HeLa細(xì)胞克隆)或24、48小時(293細(xì)胞克隆)。λ-S105蛋白表達(dá)通過Western blotting證實(shí)(見實(shí)施例6)。按照廠商說明(Sigma-Aldrich，Vienna，Austria)進(jìn)行臺盼藍(lán)染色(見實(shí)施例4)。對于pUHD10.3-holin-Hygr穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa(圖8A)和293細(xì)胞(圖8B)，與多西環(huán)素溫育96小時導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)減少97％至100％(圖8，實(shí)心正方形、三角形、十字形)，而缺少該載體的HeLa和293細(xì)胞(圖8，實(shí)心菱形)顯示在多西環(huán)素處理后沒有生存力損失。臺盼藍(lán)排除失敗表明的這種明顯的細(xì)胞質(zhì)膜損傷可能是由于λ-S105表達(dá)介導(dǎo)的凋亡或壞死性的細(xì)胞死亡。
實(shí)施例9Tet on/off調(diào)節(jié)的λ-S105表達(dá)對真核癌細(xì)胞系的細(xì)胞生存力的影響的評價為了獲得絕對嚴(yán)格調(diào)節(jié)的表達(dá)系統(tǒng)以在真核癌細(xì)胞中合成λ-S105穴蛋白，建立了Tet on/off載體系統(tǒng)。為此目的，如[68]所述構(gòu)建了基于鼠白血病病毒(MLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror(圖9)。簡而言之，將反向Tet-調(diào)節(jié)的反式激活物(rtTA)的高親和力變體rtTA2-M2克隆到另外還編碼組蛋白-脫乙?；?募集的Tet-阻抑蛋白(TRSID)和嘌呤霉素抗性基因(Puror)的改良pLIB逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(BD Biosciences，Heidelberg)中。每個編碼區(qū)由內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)隔開，這允許由位于5’長末端重復(fù)(LTR)的逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子驅(qū)動，由一個mRNA同時翻譯全部3種蛋白質(zhì)。將高親和力rtTA變體(rtTA2-M2)與TRSID蛋白組合在一起的載體表現(xiàn)出大大減少的滲漏，這使它們特別可用于細(xì)胞毒性基因的嚴(yán)格控制的表達(dá)。用293來源的兼嗜性包裝細(xì)胞系[71]產(chǎn)生的重組載體病毒感染人宮頸癌(HeLa)和乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞系以及胚腎細(xì)胞(293)。進(jìn)一步用pUHD10.3-holin-Hygr(圖5)轉(zhuǎn)染選擇的細(xì)胞群體，進(jìn)一步研究在多西環(huán)素刺激時表達(dá)λ-S105的單克隆。
因此，將3×105MCF-7或1×105HeLa或2×105293細(xì)胞/孔接種到6孔板內(nèi)。第二天，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5μg/ml多西環(huán)素。對于多西環(huán)素處理24小時以上的細(xì)胞，每天向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入新的多西環(huán)素，細(xì)胞再培養(yǎng)24、48、72、96、120小時。在時間點(diǎn)144h，同時收集所有細(xì)胞。合并來自每個樣品的漂浮的和附著的細(xì)胞，收集到一起。用CasyTT細(xì)胞計數(shù)器(Schrfe System GmbH，Reutlingen，Germany)測量總細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞/孔)。為了評價誘導(dǎo)的λ-穴蛋白合成對細(xì)胞生存力的影響，進(jìn)行MTT(圖10，上圖)和臺盼藍(lán)排除試驗(yàn)(圖10，下圖)(見實(shí)施例7和8)。細(xì)胞殺傷比例(％存活率)定義為多西環(huán)素誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的細(xì)胞之間的比例。這兩個試驗(yàn)都顯示在三種細(xì)胞系中多西環(huán)素刺激λ-S105基因表達(dá)后細(xì)胞存活率嚴(yán)重下降(圖10)。當(dāng)用多西環(huán)素處理未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時，未注意到細(xì)胞毒性作用(圖10，空心符號)。根據(jù)細(xì)胞系，在多西環(huán)素誘導(dǎo)λ-S105表達(dá)48小時至96小時之間觀察到90％的細(xì)胞死亡。
實(shí)施例10λ-S105基因表達(dá)對無免疫活性SCID/米色小鼠中人乳腺瘤細(xì)胞異種移植物生長的影響的評價為了評價λ-S105編碼的穴蛋白在體內(nèi)的細(xì)胞毒性，向雌性SCID/米色小鼠(C.B-17/lcrHsd-PrkcdscidLystbg；Harlan-Winkelmann，Bochen，Germany)的乳房脂肪墊皮下注射5×106個穩(wěn)定具有Tet調(diào)節(jié)的λ-穴蛋白編碼質(zhì)粒pUHD10.3-holin-Hygr或相應(yīng)基本質(zhì)粒pUHD10.3-Hygr的MCF-7細(xì)胞。腫瘤大小每周用卡尺在兩個方向測量兩次，按照公式[l×w×w/2]計算腫瘤體積。植入37天后，當(dāng)腫瘤生長到大約50mm3時，向每只小鼠中植入1.7mg 17β-雌二醇(E2)90天緩釋丸(InnovativeResearch，F(xiàn)L，USA)，以進(jìn)一步加強(qiáng)腫瘤生長。在腫瘤生長到可觸及的大小(～200mm3)后，將動物分為兩組。一組口服溶解在含5％蔗糖的飲用水中的終濃度為2mg/ml的多西環(huán)素，另一組給予缺少多西環(huán)素的富含蔗糖的飲用水。動物用多西環(huán)素處理32天。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，或當(dāng)腫瘤大小超過1800mm3時，殺死小鼠，并解剖。以每只動物的腫瘤生長曲線的平均斜率計算腫瘤生長速度(圖11)。當(dāng)多西環(huán)素處理的帶有pUHD10.3-holin-Hygr轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的小鼠與未給予多西環(huán)素的動物比較時，觀察到腫瘤生長顯著減慢(圖11A，p＝0.0424)。相反，帶有親本載體pUHD10.3-Hygr轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的動物對于多西環(huán)素處理未獲得腫瘤生長的差異(圖11B)。
實(shí)施例11
多西環(huán)素誘導(dǎo)的λ-S105基因表達(dá)對同系乳腺腺癌小鼠模型的腫瘤生長的影響為了評價λ-S105編碼的穴蛋白在免疫活性模型中的抗腫瘤發(fā)生能力，建立含有Tet on/off調(diào)節(jié)的pUHD10.3-holin-Hygr表達(dá)系統(tǒng)或親本載體pUHD10.3-Hygr的鼠乳腺腺癌細(xì)胞(TSA)。向同系Balb/c小鼠的乳房脂肪墊內(nèi)皮下注射1×106個細(xì)胞。7天后每天對小鼠接種多西環(huán)素(50mg/kg體重，腹膜內(nèi))。對照組由隨機(jī)選擇的小鼠組成，不接受多西環(huán)素。每周兩次檢測所有動物的腫瘤生長，按照公式[l×w×w/2]計算腫瘤體積(圖12A)。如圖12B所示，當(dāng)多西環(huán)素處理的帶有表達(dá)λ-S105的TSA細(xì)胞的動物(白色條)與含有pUHD10.3-Hygr轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的動物(黑色條)比較時，觀察到腫瘤生長非常顯著地降低(p＝0.0012)。
實(shí)施例12通過亞細(xì)胞分級分離確定λ-S105編碼的穴蛋白在真核細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)定位為了研究λ-穴蛋白的亞細(xì)胞定位，將穩(wěn)定地帶有Tet on/off調(diào)節(jié)的表達(dá)載體pUHD10.3-holin-Hygr的1×107個HeLa細(xì)胞與5μg/ml多西環(huán)素溫育24小時。處理后，從培養(yǎng)瓶中輕輕刮下細(xì)胞，以250×g離心5分鐘收集。亞細(xì)胞分級分離如[70]所述進(jìn)行，只有較小的改變。簡而言之，將細(xì)胞重懸浮于5倍體積的冰冷的緩沖液A中，緩沖液A含有20mM Hepes-KOH，pH 7.5，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mMEDTA，1mM EGTA，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich，Deisenhofen，Germany)和250mM蔗糖。使細(xì)胞膨脹10分鐘后，使其通過25號針頭15-20次將其裂解，于4℃以1000×g離心10分鐘用冰冷的緩沖液A洗滌勻漿5次，分離核(部分N)。上清液于4℃以10000×g離心15分鐘。將得到的富含線粒體的沉淀物(部分M)用冰冷的緩沖液A洗滌五次。獲得的上清液用作胞質(zhì)部分(C)。溶于含有10％β-巰基乙醇(Sigma-Aldrich，Deisenhofen，Germany)的Laemmli-樣品緩沖液中的15-30μg蛋白質(zhì)-總細(xì)胞提取物(T)和亞細(xì)胞級分-通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并通過Western blotting分析(圖13)。用多克隆兔抗穴蛋白抗血清或檢測細(xì)胞器特異性標(biāo)記蛋白如細(xì)胞色素C氧化酶(Cox IV)(1∶50)(Eubio，Vienna，Austria)、鈣聯(lián)接蛋白(1∶50)(Becton Dickinson，Vienna，Austria)、核孔蛋白(1∶50)(Becton Dickinson，Vienna，Austria)和整聯(lián)蛋白α2(1∶25)(BectonDickinson，Vienna，Austria)的抗體與膜雜交。最后，根據(jù)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(Amersham Biosciences)檢測蛋白質(zhì)。顯示λ-穴蛋白(圖13A)共定位于含有Cox IV(圖13B)和鈣聯(lián)接蛋白(圖13C)的亞細(xì)胞部分，表明其分別存在于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。分別根據(jù)核孔蛋白(圖13D)和整聯(lián)蛋白α2(圖13E)的存在，確定在含有核或細(xì)胞質(zhì)膜的部分中沒有檢測到穴蛋白。
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表1細(xì)菌菌株、人細(xì)胞系、質(zhì)粒和引物細(xì)菌菌株/人細(xì)胞系 來源/參考文獻(xiàn)大腸桿菌DH10B InvitrogenHeLaATCC(No.CCL-2)HEK 293 ATCC(No.CRL-1573)MCF-7 ATCC(No.HTB-22)www.biotech.ist.unige.it/cldb/clTS/A4545.html[72]
質(zhì)粒來源/參考文獻(xiàn)
pTet-On BD Biosciences-ClontechpLTR-stp[64]pVIII-S105 [53]pLS105 [54]pLib-rtTA-M2-IRES-TRSID-IRES-Puror[68]pcDNA3-hygrInvitrogenpEGFP-1 BD Bioscienceshttp://www2.cbm.uam.es/bc-01pUHD-10.3 5/sequences/pUHD10-3.htmlpUHD-10.3-holin 本發(fā)明pUHD-10.3-hygr本發(fā)明pUHD-10.3-holin-hygr本發(fā)明pMMTV-holin 本發(fā)明pMMTVb.LTR 本發(fā)明pMMTVGFP本發(fā)明引物 核苷酸序列SEQ ID號V13 5’AAAAAACCGCGGATGCCAGAAAAACATGACCTGTTGGCC 3’
(SEQ ID No.1)
W13 5’AAAAAATCTAGATTATTATTGATTTCTACCATCTTCTACTCC 3’(SEQ ID No.2)holin-F2 5’CGCCAGTGTGCTGGAATTCT 3’(SEQ ID No.3)holin-R1 5’CTGGCAACTAGAAGGCACAG 3’(SEQ ID No.4)holin-R2 5’AAGGCACAGTCGAGGCTGAT 3’(SEQ ID No.5)Seq-RC-MMTV-1-R 5’ACGAGGATGTGAGACAAGTG 3’ (SEQ ID No.6)
序列表<110>Fonds zur Foerderung der Forschung auf dem Gebiet dermolekularen Virologie und Gentherapie<120>癌癥基因治療中的噬菌體和原噬菌體蛋白<130>P-FON-06-PCT<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1aaaaaaccgc ggatgccaga aaaacatgac ctgttggcc 39<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2aaaaaatcta gattattatt gatttctacc atcttctact cc42<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3cgccagtgtg ctggaattct20
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ctggcaacta gaaggcacag 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5aaggcacagt cgaggctgat20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6acgaggatgt gagacaagtg 20<210>7<211>105<212>pRT<213>噬菌體λ<300>
<308>P03705<309>1989-07-01<313>(3)..(107)<300>
<308>P03705<309>1986-07-21<313>(3)..(107)<400>7Met Pro Glu Lys Asn Asp Leu Leu Ala Ala Ile Leu Ala Ala Lys Glu1 5 10 15
Gln Gly Ile Gly Ala Ile Leu Ala Phe Ala Met Ala Tyr Leu Arg Gly20 25 30Arg Tyr Asn Gly Gly Ala Phe Thr Lys Thr Val Ile Asp Ala Thr Met35 40 45Cys Ala Ile Ile Ala Trp Phe Ile Arg Asp Leu Leu Asp Phe Ala Gly50 55 60Leu Ser Ser Asn Leu Ala Tyr Ile Thr Ser Val Phe Ile Gly Tyr Ile65 70 75 80Gly Thr Asp Ser Ile Gly Ser Leu Ile Lys Arg Phe Ala Ala Lys Lys85 90 95Ala Gly Val Glu Asp Gly Arg Asn Gln100 105<210>8<211>107<212>PRT<213>噬菌體λ<300>
<308>p03705<309>1986-07-21<313>(1)..(107)<400>8Met Lys Met Pro Glu Lys Asn Asp Leu Leu Ala Ala Ile Leu Ala Ala1 5 10 15Lys Glu Gln Gly Ile Gly Ala Ile Leu Ala Phe Ala Met Ala Tyr Leu20 25 30Arg Gly Arg Tyr Asn Gly Gly Ala Phe Thr Lys Thr Val Ile Asp Ala35 40 45Thr Met Cys Ala Ile Ile Ala Trp Phe Ile Arg Asp Leu Leu Asp Phe50 55 60Ala Gly Leu Ser Ser Asn Leu Ala Tyr Ile Thr Ser Val Phe Ile Gly65 70 75 80Tyr Ile Gly Thr Asp Ser Ile Gly Ser Leu Ile Lys Arg Phe Ala Ala85 90 95Lys Lys Ala Gly Val Glu Asp Gly Arg Asn Gln100 105<210>9<211>131<212>PRT<213>噬菌體phi-29
<300>
<308>P11188<309>1989-07-01<313>(1)..(131)<400>9Met Lys Met Ile Ala Trp Met Gln His Phe Leu Glu Thr Asp Glu Thr1 5 10 15Lys Leu Ile Tyr Trp Leu Thr Phe Leu Met Val Cys Met Val Val Asp20 25 30Thr Val Leu Gly Val Leu Phe Ala Lys Leu Asn Pro Asn Ile Lys Phe35 40 45Ser Ser Phe Lys Ile Lys Thr Gly Val Leu Ile Lys Val Ser Glu Met50 55 60Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Pro Phe Ala Val Pro Phe Pro Ala Gly65 70 75 80Leu Pro Leu Leu Tyr Thr Val Tyr Thr Ala Leu Cys Val Ser Glu Ile85 90 95Tyr Ser Ile Phe Gly His Leu Arg Leu Val Asp Asp Lys Ser Asp Phe100 105 110Leu Glu Ile Leu Glu Asn Phe Phe Lys Arg Thr Ser Gly Lys Asn Lys115 120 125Glu Glu Lys130
權(quán)利要求
1.一種分離的噬菌體來源的蛋白質(zhì)作為治療增生性疾病或病癥的藥物的用途，其中所述噬菌體來源的蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制活性或細(xì)胞殺傷效應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述噬菌體來源的蛋白質(zhì)是α-螺旋型通道形成蛋白或至少是其功能部分或類似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述噬菌體來源的蛋白質(zhì)是穴蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的用途，其中所述噬菌體來源的蛋白質(zhì)選自λS105和λS107蛋白(Swiss-Prot登記號P03705)、Phi29 GP14蛋白(Swiss-Prot登記號P11188)、噬菌體T4免疫蛋白(Swiss-Prot登記號P08986)、噬菌體P22蛋白13(Swiss-Prot登記號P09962)、噬菌體P2TM蛋白Y(Swiss-Prot登記號P51773)、噬菌體PRD1的M蛋白(Swiss-Prot登記號P27389)、噬菌體A118的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q37975)、噬菌體A500的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q37977)、噬菌體Dp-1的DPH穴蛋白(Swiss-Prot登記號O03978)、噬菌體HP1的穴蛋白(Swiss-Prot登記號P51727)、噬菌體rlt的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q38134)、噬菌體T7(Swiss-Prot登記號P03802)和T3(Swiss-Prot登記號P10307)的裂解蛋白17.5、噬菌體P2Ogr的NucE穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q54418)、從睡眠嗜血菌中分離的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q48281)、噬菌體Phi-6的P10蛋白(Swiss-Prot登記號P11127)、噬菌體T4的蛋白rV(Swiss-Prot登記號P06808)、葡萄球菌噬菌體Phi-11的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q38020)和乳球菌噬菌體Tuc2009的穴蛋白(Swiss-Prot登記號Q38613)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的用途，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動物和/或人細(xì)胞包。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的用途，其中通過真核表達(dá)載體將所述噬菌體來源的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入所述真核細(xì)胞內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述真核表達(dá)載體是病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更特別是復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，ProCon或ReCon載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7有用的真核表達(dá)載體，其包含以及從可操作連接的調(diào)節(jié)元件表達(dá)編碼噬菌體來源的蛋白質(zhì)的核酸序列，該噬菌體來源的蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制活性或細(xì)胞殺傷效應(yīng)。
9.一種真核表達(dá)載體，其含有或者從可操作連接的調(diào)節(jié)元件表達(dá)含噬菌體來源的蛋白質(zhì)的融合蛋白，該噬菌體來源的蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制活性或細(xì)胞殺傷效應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的真核表達(dá)載體，其中所述載體是病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，更特別是復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，ProCon或ReCon載體。
11.含有編碼根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的真核表達(dá)載體的序列的核酸序列。
12.一種病毒顆粒，其含有根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的真核表達(dá)載體。
13.含有根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列的真核細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的真核細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求12的病毒顆粒。
15.一種將根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)的方法，所述方法包括用根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞；或者用根據(jù)權(quán)利要求12的病毒顆粒感染真核細(xì)胞的步驟。
16.一種組合物，其含有治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列、根據(jù)權(quán)利要求12的病毒顆粒、根據(jù)權(quán)利要求14的真核細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制活性或細(xì)胞殺傷效應(yīng)的分離的噬菌體來源的蛋白質(zhì)和/或含噬菌體來源的蛋白質(zhì)的融合蛋白，和藥學(xué)可接受的載體。
17.一種組合物，其含有封裝于多孔膜內(nèi)的根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列、根據(jù)權(quán)利要求12的病毒顆粒、根據(jù)權(quán)利要求14的真核細(xì)胞、分離的噬菌體來源的蛋白質(zhì)和/或含噬菌體來源的蛋白質(zhì)的融合蛋白，和藥學(xué)可接受的載體，該組合物在施用于患者后允許從膠囊中釋放治療有效量的所述表達(dá)載體、所述核酸序列、所述病毒顆粒、所述真核細(xì)胞、所述噬菌體來源的蛋白質(zhì)和/或所述含噬菌體來源的蛋白質(zhì)的融合蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求11的核酸序列、根據(jù)權(quán)利要求12的病毒顆粒、根據(jù)權(quán)利要求14的真核細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制活性或細(xì)胞殺傷效應(yīng)的分離的噬菌體來源的蛋白質(zhì)、含噬菌體來源的蛋白質(zhì)的融合蛋白，和/或根據(jù)權(quán)利要求16或17的組合物，作為藥物或用于制備治療癌癥的藥物的用途。
19.一種治療癌癥的方法，包括對受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求16或17的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對動物細(xì)胞具有增殖抑制活性或細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性的多肽的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供使用所述多肽的手段和方法和含有所述多肽的編碼區(qū)的相應(yīng)核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)所述多肽的載體，用于治療增生性病癥或疾病如癌癥的藥物組合物和治療方法。最后但并非最不重要的，本發(fā)明提供一種使用所述對動物細(xì)胞具有增殖抑制活性或細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性的多肽的基因治療方法。
文檔編號A61K38/02GK1988913SQ200580024330
公開日2007年6月27日 申請日期2005年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者烏多·布拉西, 克里斯蒂娜·霍埃納德爾 申請人:奧斯徹諾伐生物技術(shù)公司