專利名稱：通過親和色譜法進行的連續(xù)蛋白質(zhì)分離和提純方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物樣品中分離蛋白質(zhì)的方法。特別地，本發(fā)明涉及連續(xù)從生物樣品中回收高純蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)加工和發(fā)育要求以最少步驟數(shù)和最大輸出量進行高效加工以實現(xiàn)所需純度。由于蛋白質(zhì)的多樣性、與每種蛋白質(zhì)制品有關(guān)的可能的污染物和/或雜質(zhì)的不同性質(zhì)、和制造生物藥品通常所需的大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分離和提純法面臨著特有的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的提純技術(shù)通常包括以分離單種蛋白質(zhì)目標為目的的一系列提純步驟。隨著每一步驟，收率降低且制造成本提高。蛋白質(zhì)分離和提純成本通常構(gòu)成所有治療用蛋白質(zhì)總制造成本的50％以上。
親和色譜法是藥物發(fā)現(xiàn)和工藝開發(fā)中最重要的分離技術(shù)之一。親和步驟的選擇性越高，整個企業(yè)的效率就越高，這是蛋白質(zhì)分級實驗中的關(guān)鍵要求。親和色譜法在從多組分流中提純、檢測和去除目標分子時找到許多實際用途。親和色譜法基于目標分子和與其結(jié)合的實體(即配體)之間特異性的三維相互作用?？梢苑蛛x或生成以特異性和可逆方式結(jié)合到幾乎任何目標分子上的配體。潛在配體包括生物分子，例如蛋白質(zhì)、抗體、肽和類似物，和專門設(shè)計或選擇的合成配體?？梢允褂媒M合合成技術(shù)生成數(shù)百萬種潛在配體的庫，其中許多是本領(lǐng)域中公知的(參看，例如Lam等人，Nature354，82-84(1991))。為了有助于從樣品中分離目標分子，配體可以固定到固體載體基質(zhì)，例如單獨的粒子(例如色譜法樹脂珠)或鄰接載體(contiguoussupports)(例如陣列)上。然后使用固定在固體載體基質(zhì)上的配體從復(fù)合溶液中提純目標物。
在生物制藥單克隆抗體提純領(lǐng)域中可能已經(jīng)實現(xiàn)了規(guī)模化親和色譜法的最大成功。對蛋白質(zhì)A樹脂的年需求超過10,000升并以每年50％的速度增長，這代表蛋白質(zhì)A吸附劑市場在2002年超過5千萬美元。免疫親和色譜法的使用能夠生產(chǎn)血漿衍生的和重組的凝血因子VIII和IX以及來自天然和重組來源的其它血漿蛋白質(zhì)和生物藥品。
然而，用在下游加工中的現(xiàn)代親和色譜法的最有效形式之一不依靠來自天然來源(例如抗體)的配體，而是依靠高穩(wěn)定性合成親和配體的使用。參看，例如，Sproule等人，New Strategy for the Design ofLigands for the Purification of pharmaceutical proteins by affinitychromatography；J.Chromatography B，740，17-33(2000)。這種方法使用定制或設(shè)計成的(designer)配體代替使用現(xiàn)成化合物。
在本領(lǐng)域中分離的血漿蛋白質(zhì)中，對于醫(yī)療用途，特別以白蛋白和丙種球蛋白為靶。常用于從血漿中分離這些蛋白質(zhì)的程序是基于E.J.Cohn和同事在二十世紀四十年代開發(fā)出的冷乙醇沉淀法。參看Cohn et.al.，Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins.IV.A System for the Separation into Fractions of the Protein and LipoproteinComponents of Biological Tissues and Fluids；J.Am.Chem.Soc.，68，459-475(1946)。最初開發(fā)出該方法用于高收率制造白蛋白，而不是用于分離和提純現(xiàn)在由血漿制成的各種蛋白質(zhì)。特別地，通過這些技術(shù)產(chǎn)生的次要血漿蛋白質(zhì)組分的收率總是如此低以致這些技術(shù)在總分級收率方面不可避免地低效。參看，例如，授予Uemura等人的美國專利5,138,034。
親和色譜法用于血清白蛋白是本領(lǐng)域中已知的，參看Harvey MJ.InCurling JM(ed)Methods of Plasma Protein Fractionation.AcademicPress London.pp 189-200。第一次報導(dǎo)的從血漿中分離蛋白質(zhì)追溯到大約30年前并涉及通過色譜法從血漿中消耗人類血清白蛋白(HSA)以便識別并提純低濃度蛋白質(zhì)。Travis，J.和Pannell，R.Behring Inst.Mitt.5430-32(1974)。使用Procion Blue dextran-Sepharose共軛物進行該操作并確定染料-親和色譜法的首要問題，即染料滲入洗出液。作者關(guān)心從血漿中分離α1-抗胰蛋白酶并描述了在高離子強度下從白蛋白中困難地分離這種蛋白質(zhì)，其中任何非特異性離子交換結(jié)合處于最小程度。
還論述了從血漿中分離各種其它蛋白質(zhì)。例如，現(xiàn)有技術(shù)的方法描述了分離和提純血漿蛋白因子VIII和粘連蛋白餾分，參看，例如，美國專利4,822,872、4,093,608和4,565,651。在例如美國專利3,842,061中公開了抗凝血酶-III的分離和提純方法。在例如Science170，1095(1970)、美國專利4,361,652和4,361,653中公開了血纖維蛋白溶酶原的分離和提純方法。在美國專利4,371,520和4,093,606中描述了免疫球蛋白的分離和提純方法。在例如美國專利4,061,735和4,137,307中描述了hepataglobulin的分離和提純方法。但這些方法缺乏從相同原材料(例如人類血漿)中分離用于制造多種生物藥劑的蛋白質(zhì)所需的特異性和選擇性。
盡管從生物樣品中分離蛋白質(zhì)的方法已經(jīng)在提高的比活度和純度以及在收率或回收率方面對產(chǎn)品質(zhì)量提供了一定的改進，但仍然需要進一步的工藝改進，從而以高收率和高純度獲得蛋白質(zhì)濃縮物，同時最大限度地減少通常與現(xiàn)有技術(shù)的方法有關(guān)的分離的蛋白質(zhì)的比活度降低。在從共同的來源同時分離多個蛋白質(zhì)目標的情況下，尤為如此。本發(fā)明通過提供使用親和色譜技術(shù)(其以預(yù)定和指定次序與吸附法結(jié)合)從生物材料，特別是從血漿中有效分離和提純各種蛋白質(zhì)的方法，解決了這些和其它長期以來的需要。
發(fā)明內(nèi)容
本文所公開和描述的本發(fā)明提供了從生物樣品中連續(xù)分離和提純蛋白質(zhì)的方法。這些方法包括(i)提供生物樣品，(ii)提供兩種或多種配體，它們各自選擇性并特異性地結(jié)合到來自生物樣品的目標蛋白質(zhì)上，其中各個配體任選連接到載體上以形成兩種或多種配體-載體絡(luò)合物，(iii)使兩種或多種配體或配體載體絡(luò)合物以預(yù)定順序與生物樣品連續(xù)接觸以使各個配體或配體載體絡(luò)合物從生物樣品中連續(xù)結(jié)合目標蛋白質(zhì)，其中生物樣品在接觸之前不通過預(yù)調(diào)節(jié)步驟進行處理，(iv)洗脫結(jié)合到兩種或多種配體或配體載體絡(luò)合物的每一個上的目標蛋白質(zhì)，和(v)連續(xù)從生物樣品中分離目標蛋白質(zhì)。預(yù)調(diào)節(jié)步驟包括如下各種過程——例如，醇沉淀、冷沉淀、脂質(zhì)和/或脂蛋白的去除、優(yōu)球蛋白沉淀、或它們的組合。
在一個實施方案中，生物樣品是血漿，目標蛋白質(zhì)包括血纖維蛋白原(Fg)、α-1蛋白酶抑制劑(A1PI)、載脂蛋白A1(ApoA1)、免疫球蛋白(IgG)、對氧磷酶(PON)、凝血因子、血管性血友病因子(vWF)、因子VIII(FVIII)、人血清白蛋白(HSA)、血纖維蛋白溶酶原(Pg)或它們的任意組合。
在另一實施方案中，生物樣品包括體外發(fā)酵或細胞培養(yǎng)物或從轉(zhuǎn)基因動物或植物中提取的組織或流體，蛋白質(zhì)是重組蛋白質(zhì)。
在再一實施方案中，在蛋白質(zhì)分離過程中，在生物樣品中基本保持對氧磷酶的活性。
在一個實施方案中，vWF/FVIII在其它蛋白質(zhì)之前或在其它蛋白質(zhì)之后從血漿中分離。
在另一實施方案中，載脂蛋白A1在其它蛋白質(zhì)之后從血漿中分離。
在再一實施方案中，白蛋白在IgG之前或在IgG之后從血漿中分離。
在另一實施方案中，血纖維蛋白溶酶原在血纖維蛋白原之前從血漿中分離。
在再一實施方案中，兩種或多種配體與生物樣品接觸的預(yù)定順序?qū)е聉WF/FVIII、Pg、Fg、ApoA1/PON、IgG、HSA和A1PI以所述順序連續(xù)結(jié)合。
在另一實施方案中，兩種或多種配體與生物樣品接觸的預(yù)定順序?qū)е聉WF/FVIII、ApoA1/PON、Pg、Fg、IgG、HSA和A1PI以所述順序連續(xù)結(jié)合。
在再一實施方案中，兩種或多種配體與生物樣品接觸的預(yù)定順序?qū)е聉WF/FVIII、IgG、HSA和A1PI以所述順序連續(xù)結(jié)合。
本發(fā)明的配體包括多肽或核酸基分子、抗體或抗原結(jié)合片段、非多肽或核苷酸基分子、碳水化合物模擬物、肽模擬物、小分子、無機材料、染料、碳水化合物、脂質(zhì)、或它們的任意組合。
在一個實施方案中，配體是含有大約1至大約15個氨基酸的肽。
在另一實施方案中，配體和/或配體載體絡(luò)合物包括合成的親和配體，例如Mimetic Blue配體、Mabsorbent配體、ProMetic PBL112-80、ProMetic PBL 112-81、ProMetic PBL 112-82和ProMetic PBL112-83。
載體包括合成材料和/或天然材料。載體的例子包括瓊脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、纖維素、多糖、硝基纖維素、二氧化硅、礬土、氧化鋁、titania、titanium oxide、氧化鋯、苯乙烯、聚二氟乙烯尼龍、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚甲基丙烯酸酯、羥乙基甲基丙烯酸酯、丙烯酸類、聚乙烯醇、聚乙二醇、衍生的二氫唑酮聚合物或共聚物、玻璃、纖維素、瓊脂糖、任何前述物質(zhì)的衍生物、和任何前述物質(zhì)的組合。
在優(yōu)選實施方案中，載體是多糖或樹脂珠。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含通過本發(fā)明的連續(xù)蛋白質(zhì)分離法制成的基本純凈的血漿蛋白質(zhì)的制品。
在一個實施方案中，血漿以至少70％的純度基本純化。
在另一實施方案中，制品基本純化，不含任何免疫吸附劑引起的雜質(zhì)，并已經(jīng)經(jīng)過至少一個病原體滅活步驟。
在再一實施方案中，在接觸步驟之前用緩沖劑處理生物樣品以進一步保持生物樣品中的一種或多種目標試劑的濃度和活性。
在另一方面，將該制品配制成藥用組合物。
本文中詳細公開了本發(fā)明的這些和其它方面和實施方案。
具體實施例方式
本文公開了從生物樣品中有效分離和提純蛋白質(zhì)的方法。特別地，本發(fā)明公開了使用親和色譜法從血漿中連續(xù)提純蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的連續(xù)蛋白質(zhì)提純法使用兩種或多種配體，各個配體任選連接到載體上以形成配體-載體絡(luò)合物。各個配體或配體載體絡(luò)合物以預(yù)定順序選擇性并特異性結(jié)合到目標血漿蛋白質(zhì)上以使各個配體或配體載體絡(luò)合物從血漿中連續(xù)結(jié)合目標蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的連續(xù)蛋白質(zhì)分離和提純法高度特異性，并且在與配體接觸之前不需要現(xiàn)有技術(shù)中慣用的血漿的特異性預(yù)調(diào)節(jié)。這種預(yù)調(diào)節(jié)步驟不包括緩沖或一般過濾。在本發(fā)明范圍內(nèi)的預(yù)調(diào)節(jié)步驟尤其包括如下方法和過程——例如醇沉淀、冷沉淀、脂質(zhì)和/或脂蛋白的去除、優(yōu)球蛋白沉淀或它們的組合。本文中還預(yù)計到，將上述預(yù)調(diào)節(jié)步驟專門排除在所要求的本發(fā)明外。本發(fā)明的血漿蛋白質(zhì)提純法由于它們有效且迅速地制造基本純凈且高度活性的血漿蛋白質(zhì)的能力，在生物藥品制造中非常有價值。本發(fā)明的方法還可用于多種其它用途，包括異常狀態(tài)的預(yù)測、診斷和/或檢測。
I.定義本申請中所用的定義用于解釋說明，其不限制本發(fā)明的范圍。
本文所用的“樣品”包括含有可通過本發(fā)明的方法分離和提純的目標蛋白質(zhì)的任何樣品。樣品可以獲自可能含有目標蛋白質(zhì)的任何來源。這些來源尤其包括動物、植物、土壤、空氣、水、真菌、細菌和病毒。動物樣品，例如，獲自活組織檢查、血液、毛發(fā)、口腔刮物(buccalscrapes)、血漿、血清、皮膚、腹水、plural effusion、胸腔穿刺液、脊髓液、淋巴液、骨髓、呼吸液(respiratory fluid)、腸液、外陰液、糞便、尿、唾液、淚液、痰液、腫瘤、器官、組織、體外細胞培養(yǎng)物成分的樣品、胎兒細胞、胎盤細胞或羊膜細胞和/或羊水。
本文所用的“細胞培養(yǎng)物”包括任何原核或真核培養(yǎng)物，例如細菌、酵母或其它微生物細胞培養(yǎng)物、哺乳動物細胞培養(yǎng)物、植物細胞培養(yǎng)物、和昆蟲培養(yǎng)物、發(fā)酵液和用于制造和傳送生物藥品和制備治療劑的其它細胞培養(yǎng)物。
本文所用的“血漿”是指液態(tài)血液成分并包括血漿衍生物，和含血漿的組合物。
本文所用的“連接”在本發(fā)明的范圍內(nèi)具有廣泛定義，并包括兩種實體之間的任何類型的物理、化學(xué)或生物結(jié)合法，包括，例如但不限于，吸收、吸附、共價鍵合、離子交換、疏水、氫鍵合、偶極子、四極子或親和相互作用、帶電物的形成、親和配體(例如，包括，肽、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、間隔臂、疏水部分和氟化材料)的連接。
本文所用的“配體”在本發(fā)明的范圍內(nèi)具有廣泛定義，并包括結(jié)合到目標蛋白質(zhì)上的化學(xué)或生物實體。配體是結(jié)合到目標蛋白質(zhì)上并可以從天然或合成材料中分離的化合物、分子、細胞和細胞成分。配體可以是原核生物或真核生物內(nèi)源或外源的。配體包括肽、多肽、肽模擬物、小分子、染料、含三嗪的化合物、抗體或抗原結(jié)合片段、核酸基分子、非多肽或核苷酸基分子、碳水化合物、碳水化合物模擬物、脂質(zhì)、無機材料、抑制劑、底物或它們的任意組合。
本文所用的“基本純化”或“基本不含”是指從其天然環(huán)境中提取并分離并至少大約70％不含，優(yōu)選大約85％不含，更優(yōu)選大約95％不含，最優(yōu)選大約99％不含與其天然相聯(lián)的其它成分的蛋白質(zhì)。
本文所用的“多肽基分子”包括任何蛋白質(zhì)、多肽或肽片段、天然肽、重組肽、合成肽、生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚體、雜二聚體、多肽的變體、改性多肽、衍生物、類似物、融合蛋白、激動劑、拮抗劑、和抗體。
本文所用的“小分子”包括，但不限于，碳水化合物、碳水化合物-模擬物、肽模擬物、分子量小于大約10,000克/摩爾的有機或無機化合物(即包括heteroorganic和有機金屬化合物)、分子量小于大約5,000克/摩爾的有機或無機化合物、分子量小于大約1,000克/摩爾的有機或無機化合物、分子量小于大約500克/摩爾的有機或無機化合物、和鹽、酯和這些化合物的其它化學(xué)可接受形式。
本文所用的術(shù)語“病原體”是指可以在血液樣品之類的生物樣品中找到或感染生物體的任何可復(fù)制介質(zhì)。這些病原體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知通常在全血或血液成分中找到的或感染全血或血液成分的各種病毒、細菌、原生動物和寄生物，和未知的其它致病污染物。這些病原體的示例性例子包括，但不限于，細菌，例如鏈球菌屬、埃希氏菌屬和桿菌屬；病毒，例如人類免疫缺陷病毒和其它逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、副粘病毒、巨細胞病毒、肝炎病毒(包括甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎)、痘病毒和toga病毒；和寄生物，例如瘧原蟲，包括瘧原蟲屬和錐體蟲寄生物。
可用領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常會理解本文所用的在蛋白質(zhì)提純領(lǐng)域中使用的其它術(shù)語。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了從血漿中提取特定血漿蛋白質(zhì)的方法。這些方法采用其上連有對兩種或多種血漿蛋白質(zhì)呈選擇性和特異性的配體的色譜法樹脂。使樹脂與血漿接觸，這種接觸導(dǎo)致目標蛋白質(zhì)與配體的選擇性結(jié)合。然后以高回收率和純度洗脫目標蛋白質(zhì)。由此，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以有效地將血漿分級成各種血漿蛋白質(zhì)成分。本文中公開了特定血漿蛋白質(zhì)的提取和隨后分離的優(yōu)選順序。
本發(fā)明范圍內(nèi)的血漿蛋白質(zhì)包括血漿中存在的超過10,000種不同蛋白質(zhì)中的任一種，例如但不限于，丁酰膽堿酯酶(BChE)、凝血因子(例如血纖維蛋白原、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII)、纖連蛋白、凝血酶原、蛋白質(zhì)C、血纖維蛋白溶酶原、抗凝血酶-III、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、α1蛋白酶抑制劑、載脂蛋白A1(也稱作ApoA1脂蛋白)、免疫球蛋白、對氧磷酶、血管性血友病因子(vWF)，所有這些均天然出現(xiàn)在未患病狀態(tài)的生物體的血漿中。
或者，在與患病狀態(tài)相關(guān)的血漿中存在本發(fā)明范圍內(nèi)的血漿蛋白質(zhì)，它們在健康對象的血漿中可以或不可以找到。由于試劑，例如藥物的施用而存在于血漿中的血漿蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這點上，血漿蛋白質(zhì)可以是傳染性PrPsc朊病毒蛋白。
1.配體本發(fā)明的蛋白質(zhì)提純方法利用連接到載體體系上的兩種或多種配體。配體可以包含一個或多個官能團以提供與待分離的生物分子上的相應(yīng)基團的離子型、疏水、氫鍵合或范德瓦爾斯相互作用。適合本發(fā)明的方法的配體包括例如通過直接合成法或化學(xué)物庫(diversitylibraries)，例如隨機或組合的肽或非肽庫制成的合成化學(xué)化合物。本領(lǐng)域已知的其它庫包括化學(xué)合成庫、重組庫(例如噬菌體展示庫)、和體外轉(zhuǎn)譯庫?？梢葬槍μ禺愋越Y(jié)合到本發(fā)明的目標蛋白質(zhì)上的分子篩選這些庫。
例如在Fodor等人，Science 251767-773(1991)；Houghten等人，Nature 35484-86(1991)；Brenner and Lemer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895381-5383(1992)和美國專利6,117,996中描述了化學(xué)合成庫的例子。例如在Scott和Smith，Science 249386-390(1990)；Devlin等人，Science 249404-406(1990)和Christian等人，J.Mol.Biol.227711-718(1992)中描述了噬菌體展示庫的例子。在Mattheakis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919022-9026(1994)中描述了體外轉(zhuǎn)譯庫。
在一個實施方案中，本發(fā)明的配體是主要由大約3至大約5、8、10、15或30個氨基酸或更多氨基酸構(gòu)成的肽。氨基酸是D和/或L氨基酸。肽可以方便地選自任何肽庫，包括隨機肽庫、組合肽庫、或偏移肽庫。術(shù)語“偏移”在本文中用于指控制生成該庫的方法以限定控制所得分子集合的多樣性的一種或多種參數(shù)。
在肽庫中，隨著所進行偶聯(lián)反應(yīng)的數(shù)量、肽的尺寸和所用的不同氨基酸的數(shù)量，不同次序的離散肽的數(shù)量急劇提高。例如，19個氨基酸隨機并入五肽中產(chǎn)生了具有不同次序的多達2,476,099(195)個獨立的肽(Lam等人，見上)。組合法能夠在載體上直接生成配體庫。通常，在載體粒子上合成配體，從而在各個粒子(例如珠粒)上合成單種配體的多個復(fù)制品，盡管這不是本發(fā)明所要求的。
Ostresh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111138-11142(1994)描述了可用的庫的另一例子，其中肽中的酰胺官能已經(jīng)被permethylated以產(chǎn)生化學(xué)轉(zhuǎn)化的組合庫。
非肽庫可以粗略分成兩類decorated單體和低聚物。Decorated單體庫采用相對簡單的骨架(scaffold)結(jié)構(gòu)，在其上添加各種官能團。通常，骨架是具有已知有效的藥理活性的分子。例如，骨架可以是苯并二氮雜卓(benzodiazepine)結(jié)構(gòu)。
非肽低聚物庫采用大量單體，它們以產(chǎn)生新形狀的方式組合在一起的，這種新形狀取決于單體的順序。已用的單體單元包括氨基甲酸酯、pyrrolinones、和morpholinos。類肽，和肽類低聚物(其中側(cè)鏈連接到α氨基而非α碳上)構(gòu)成另一版本的非肽低聚物庫的基礎(chǔ)。第一非肽低聚物庫采用單種單體并由此含有重復(fù)骨架。最近的庫已經(jīng)采用一種以上的單體，這增加了庫的靈活性。
Ecker和Crooke，Bio/Technology 13351-360(1995)描述了本發(fā)明中可用的其它非肽庫。這些庫使用苯并二氮雜卓(benzodiazepine)之類的化合物(參看，例如，Bunin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA914708-4712(1994))。此外，還可以使用類肽庫(例如，Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899367-9371(1992))。肽庫中所用的其它化合物包括乙內(nèi)酰脲、哌嗪二酮、聯(lián)苯、糖類似物、β-巰基酮、芳基乙酸、?；哙ぁ⒈讲⑦拎?、立方烷、黃嘌呤、胺化酰亞胺和噁唑酮。
可以通過多種公知的方法實現(xiàn)庫的篩選。參看，例如，下列參考文獻，它們公開了肽庫的篩選Parmley和Smith，Adv.Exp.Med.Biol.251215-218(1989)；Scott和Smith，id.；Fowlkes等人，Bio Techniques13422-427(1992)；Oldenburg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895393-5397(1992)；和Yu等人，Cell 76933-945(1994)。也可以通過使庫成員與固定在固相上的目標蛋白質(zhì)接觸并收取結(jié)合到相關(guān)蛋白質(zhì)上的庫成員來進行篩選以確定與目標蛋白質(zhì)結(jié)合的分子。例如在Fowlkes等人(同上)中描述了這種篩選方法的例子，名為“panning”技術(shù)。
優(yōu)選地，通過建模和組合化學(xué)來設(shè)計本發(fā)明的配體，并包括可以是對稱或不對稱、單一或分支分子的合成/仿生配體。配體優(yōu)選是耐堿的并承受正常的堿再生和消毒程序。本發(fā)明的配體具有非常低的滲漏性，是安全的，并具有與目標蛋白質(zhì)的高結(jié)合能力和高特異性。
本發(fā)明范圍內(nèi)所用的優(yōu)選配體或配體和載體體系包括，例如但不限于，Mimetic Blue配體(用于HSA柱)，樹脂是選定的MimeticBlueSAHL P6XL；MAbsorbent配體(用于結(jié)合IgG)，吸附劑是選定的MAbsorbentA2P；用于A1PI的ProMetic PBL 112-80吸附劑；用于血纖維蛋白原的ProMetic PBL 112-81吸附劑；用于血纖維蛋白溶酶原的ProMetic PBL 112-82吸附劑；用于vWF/FactorVIII的ProMetic PBL 112-83吸附劑；ECH-Lys-瓊脂糖凝膠(Sepharose)FF.Lot#243526；SAHL P6XL-樹脂；和包括ARQFDF的肽配體樹脂(SEQID NO1)。前述吸附劑使用Purabead 6XL(交聯(lián)瓊脂糖)作為載體基質(zhì)。Purabead 6或6XL載體基質(zhì)本身不會吸附這些蛋白質(zhì)。
2.載體在本發(fā)明的方法的一個實施方案中，將配體連接到載體上。本文所用的術(shù)語“載體”是指用于固定配體的任何載體基質(zhì)，例如本領(lǐng)域已知的那些固體載體。載體或載體基質(zhì)是可以在其上連接配體并提供在接觸溶液中將配體與溶質(zhì)分離的方便手段的任何固體或液體物質(zhì)，其是多孔或無孔的二維或三維物質(zhì)。優(yōu)選地，載體在配體連接之后是惰性的，從而使與目標物的共價反應(yīng)最小化。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括使用間隔臂將配體偶聯(lián)到載體上。間隔臂可以具有多種不同形式，包括但不限于，羥基化材料，例如聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、直鏈或支鏈烷、二胺、甘醇、芳環(huán)、和碳水化合物或它們的任意組合。
在一個實施方案中，載體基質(zhì)包括能夠吸附或吸收目標試劑的多孔粒子。粒子任選被一種或多種材料涂布以改變載體基質(zhì)的表面性質(zhì)，這種材料在有機流體或水流中是不可溶脹或可溶脹的并基本不溶于水或流體。
本發(fā)明的連續(xù)蛋白質(zhì)提純方案所用的優(yōu)選載體基質(zhì)是多孔粒子。吸附分離用的多孔粒子可以以多種不同的材料(包括二氧化硅、玻璃、纖維素、瓊脂糖)和多種不同的聚合物(包括聚苯乙烯聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、水凝膠、丙烯酸樹脂和用于電泳的其它類型的凝膠)提供。許多多孔吸附粒子(例如二氧化硅、玻璃和聚合物)可以干燥并具有表面積為大約1-2平米/克干燥粒子至超過300平米/克干燥粒子的互連孔。粒子的其它類型為交聯(lián)水凝膠。
特別優(yōu)選的載體基質(zhì)是瓊脂糖和聚羥基化甲基丙烯酸酯樹脂。多種珠狀瓊脂糖凝膠和聚合物樹脂可購得。這些載體可以在與配體預(yù)連接的情況下購買，或者，配體可以使用標準方法間接連接或直接固定在載體上(參看，例如，Harlow和Lane，Antibodies，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；Biancala等人，Letters inPeptide Science，7(291)，297(2000)；MacBeath等人，Science，289，1760-1763(2000)；Cass等人，ed.，Proceedings of the ThirteenthAmerican Peptide Symposium.Leiden，Escom，975-979(1994)；美國專利5,576,220；Cook等人，Tetrahedron Letters；35，6777-6780(1994)和Fodor等人，見上)。在一個實施方案中，在載體表面上合成配體，這在生成肽庫時是有利的。配體可以化學(xué)配合到載體上或可以經(jīng)由連接劑(例如抗生蛋白鏈菌素、β-丙氨酸、甘氨酸、含甘氨酸-絲氨酸的聚合物、式--(CH2)的短鏈烴、聚乙二醇、ε氨基己酸、和含--O(CH2)n的連接劑，其中n是1-30)連接。
3.目標蛋白質(zhì)的結(jié)合和洗脫通常通過使配體或配體-載體絡(luò)合物與含目標物的水溶液接觸來使目標蛋白質(zhì)或目標生物分子結(jié)合到配體或配體-載體絡(luò)合物上。這可以通過多種方法實現(xiàn)，包括但不限于，使含有目標物的溶液通過配體-載體絡(luò)合物的填充床或柱，或在攪拌釜或淤漿中分批吸附。優(yōu)選地，使用泵使水溶液通過色譜柱以控制流速，由此捕獲目標蛋白質(zhì)。理想地，蛋白質(zhì)目標的結(jié)合應(yīng)該以下述方式進行不需要溶液的預(yù)先調(diào)節(jié)且含目標物的溶液直接施加到配體-載體絡(luò)合物上。然而，當結(jié)合需要時，可以通過例如稀釋、pH、離子強度或極性的改變、溫度改變、和添加可溶試劑(包括但不限于緩沖鹽、無機鹽、有機鹽、螯合化合物、硫醇、洗滌劑、表面活性劑、有機溶劑、醇、甘醇、離液劑、金屬離子或它們的任意組合)來調(diào)節(jié)含目標物的溶液的性質(zhì)。
為了從配體或配體-載體絡(luò)合物中回收目標蛋白質(zhì)，可以使配體或配體載體絡(luò)合物與促進目標蛋白質(zhì)從配體或配體-載體絡(luò)合物中離解的溶液(例如，“轉(zhuǎn)移溶液”或“洗脫緩沖劑”)接觸。轉(zhuǎn)移溶液可以選自具有各種鹽濃度、pH值或變性能力的緩沖劑、有機溶劑、極性改性劑，例如醇和去離子水?；蛘撸虼送?，電梯度或溫度變化可以從蛋白質(zhì)-配體-載體絡(luò)合物中離解出目標蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)移溶液還可以包含配體(與蛋白質(zhì)-配體-載體絡(luò)合物的配體不同)、目標蛋白質(zhì)的輔因子、對映體特異性分子、和類似物。不同轉(zhuǎn)移溶液的使用能夠探測洗脫條件或使特定目標蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。選擇本發(fā)明的方法中使用的離解和轉(zhuǎn)移條件以使配體和目標蛋白質(zhì)的破壞最小化。換言之，洗脫和轉(zhuǎn)移條件不應(yīng)該使配體從載體中釋放出來或改變目標蛋白質(zhì)的性質(zhì)，除非這是需要的。
在一個實施方案中，在洗脫之前，在蛋白質(zhì)-配體載體上檢測并識別目標蛋白質(zhì)。目標蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)-配體載體上的檢測和識別包括進行結(jié)合分析。結(jié)合分析通常包括使蛋白質(zhì)-配體載體與已知結(jié)合到底物上的部分接觸。用在結(jié)合分析中的結(jié)合部分包括，例如，抗體或其抗原結(jié)合片段、蛋白質(zhì)或寡核苷酸。優(yōu)選地，使蛋白質(zhì)-配體載體與結(jié)合目標蛋白質(zhì)(或目標蛋白質(zhì)的化學(xué)或生物副產(chǎn)物或其片段)的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。結(jié)合部分優(yōu)選用可檢測標簽(例如放射性同位素、發(fā)色團或熒光標簽)標注。在這種結(jié)合分析中，檢測可檢測標簽發(fā)出的信號，由此發(fā)出目標蛋白質(zhì)存在的信號。一旦證明在蛋白質(zhì)-配體載體上存在目標蛋白質(zhì)，就可以分離蛋白質(zhì)。
在例如，Harlow和Lane，見上；Sambreok等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；和Haugland，Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals(第九版)，Molecular Probes，Eugene，OR(2002)中進一步描述了用于檢測目標物的結(jié)合分析。任選地，本發(fā)明的方法可以在檢測之前進一步包含洗滌步驟以去除過量的未結(jié)合的部分或標記物。
或者，本發(fā)明的方法可以包括進行酶活性分析以根據(jù)生物活性表征目標蛋白質(zhì)。將酶底物施加到蛋白質(zhì)-配體載體上，其能夠使底物被目標蛋白質(zhì)酶促改性以形成產(chǎn)物。然后檢測產(chǎn)物，由此確定在樣品中存在目標蛋白質(zhì)。
可以通過任何合適的方法測量目標蛋白質(zhì)的結(jié)合和洗脫，這些方法多數(shù)是現(xiàn)存的且其性能和對于特定用途的適用性是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
4.使用方法本文所述的本發(fā)明提供了從生物樣品中連續(xù)分離蛋白質(zhì)的方法，這些方法產(chǎn)生了高度活性和基本純化的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法高度靈敏并能夠從樣品中分離微小量的目標蛋白質(zhì)。本發(fā)明的連續(xù)蛋白質(zhì)分離法可用于多種用途，包括體外表達的基因產(chǎn)物的預(yù)測、診斷、檢測、提純、分離、加工和生物藥品的制造。本發(fā)明的提純和提取技術(shù)通過減少提純步驟的數(shù)量、改進收率、提高純度和克服與傳統(tǒng)方法有關(guān)的限制，提供了優(yōu)于傳統(tǒng)提純技術(shù)的優(yōu)點。
特別地，本發(fā)明的方法優(yōu)化蛋白質(zhì)提純工藝并通過提高效力和純度來改進生物藥品的制造工藝。生物藥品是包含蛋白質(zhì)、肽或其它復(fù)合多核苷酸或蛋白質(zhì)基大分子的藥品(統(tǒng)稱為“基因產(chǎn)品”)。它們的制造方法包括從其宿主生物質(zhì)，例如血漿或非人類生物源(例如重組或非重組細胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因動物的乳汁或其它重組或非重組來源)中回收所需基因產(chǎn)品。從生物質(zhì)中回收商業(yè)可行產(chǎn)量的所需蛋白質(zhì)是具有挑戰(zhàn)性的，因為生物質(zhì)含有不需要的宿主蛋白質(zhì)、核酸分子和其它天然產(chǎn)生的化學(xué)實體。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于從全血、紅血球濃縮物、血小板濃縮物、血漿、血漿衍生物、白細胞、去白細胞血、哺乳動物細胞培養(yǎng)物、發(fā)酵液和用于制造和傳送生物藥品和制備治療劑的其它介質(zhì)中分離蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法連續(xù)從血漿樣品中分離高活性血漿蛋白質(zhì)。通過本發(fā)明的方法，可以從旨在制造治療品和/或藥品的血漿加工工業(yè)中的任何流體中同時并迅速地從樣品中分離多種蛋白質(zhì)。下表1中公開了血漿蛋白質(zhì)的分離順序的一個例子。
表1血漿蛋白質(zhì)提純方案
分離的血漿蛋白質(zhì)是“基本純化的”，其具有大約70％，優(yōu)選大約85％，更優(yōu)選大約95％，最優(yōu)選大約99％或更高的純度。在此，通過列舉這些特定的純度值，所列的值還包括在所列值之間的所有特定整數(shù)量。例如，大約85％意在還包括80％，81％，82％，83％和84％，而不用實際列出每一特定的基本純化程度。
相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解的是，考慮到普通技術(shù)人員已知的信息，根據(jù)本文所含的本發(fā)明的描述，容易看出對本文所述的方法和應(yīng)用的其它合適的修改和調(diào)適，它們可以在不脫離本發(fā)明的范圍或其任何實施方案的情況下進行。盡管已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明，但參照下列實施例可以更清楚地理解本發(fā)明，，這些實施例僅用于舉例說明而非限制本發(fā)明。
實施例實施例1直線級聯(lián)順序方案1-7的定義直線級聯(lián)(linear cascade)是由五個親和色譜柱構(gòu)成的白蛋白(HSA)、血纖維蛋白原(Fg)、IgG、血纖維蛋白溶酶原(Pg)和PON1/ApoA1。首先，使這些柱以四種不同的順序相繼運行以確定最適合直線級聯(lián)的順序。為了簡化進行中的樣品分析，僅收集未稀釋的流過物(flow-through)作為該序列中下一柱的裝載物。具體而言，這有助于使背景蛋白質(zhì)的濃度在整個實驗過程中保持恒定。其還簡化了每個柱上輸出量與輸入量的對比。分析裝載物和每一流過物的樣品以監(jiān)測流過物中目標和非目標蛋白質(zhì)的回收率。使用這些值檢測每個柱以測定其以最小的下游目標蛋白質(zhì)截留量捕獲目標蛋白質(zhì)的能力。使用最適合這一標準的順序作為直線級聯(lián)順序(LCS)。一旦獲得來自首次操作的分析數(shù)據(jù)，就測試另外三個順序，對于方案6和7，增加A1PI柱。
材料和設(shè)備在裝在Pharmacia XK 50柱(20或30米長)中的級聯(lián)柱(cascades)中使用下列樹脂；血纖維蛋白溶酶原柱Pharmacia ECH-Lys-Sepharose FF.Lot#243526血纖維蛋白原柱ProMetic Purabead，(串聯(lián)的兩個柱)Lot#CG1251和Lot#CG1252IgG柱ProMetic MAbsorbent A2P，Lot#FA0582-ZHSA柱ProMetic Mimetic Blue SAHL P6XL Batch#FA0500ZPON1/ApoA1柱Peptide International，Toyopearl WWLHANLot#217772A1PI柱ProMetic 12/330 P6XL Resin Batch#CG 1255使用帶有950個餾分收集器的AKTA Explorer 100色譜系統(tǒng)(Amersham Biosciences)進行所有色譜法。用使用兩個200平方厘米Hydrosart乙酸纖維素膜(10kD截留分子量)的Sartorius Sartocon Slice200超濾系統(tǒng)進行超濾(UF)/透濾(DF)。
方法對于每一操作，第一柱的裝載物是匯集的人血漿+50mM Tris，pH 7.5，過濾至0.2微米。分多份收集每個柱的流過物，并根據(jù)色譜圖的UV吸光度(A280)分布圖將其匯集。使用這種匯集物作為該序列中下一柱的裝載材料。如果下一柱要在第二天開始工作，將流過物消毒過濾(0.2微米真空濾器)并儲存在室溫。在方案6和7中，使用UF/DF減少體積并如下表2中所示在匯集的流過物上進行緩沖液交換。要求這一操作將A1PI裝載材料帶入A1PI柱流動緩沖劑(15mM磷酸鈉，pH 6.1)中。
表2柱順序
結(jié)果下面顯示每個方案的步驟收率表和圖。N/A是指數(shù)據(jù)不可得。＜LOD是指蛋白質(zhì)的量低于該特定分析法的檢出限。
表3方案#1的％步驟收率
表3概括了方案#1的結(jié)果。
表4方案#2的％步驟收率
表4概括了方案#2的結(jié)果。
表5方案#3的％步驟收率
表5概括了方案#3的結(jié)果。
表6方案#4的％步驟收率
表6概括了方案#4的結(jié)果。
表7方案#5的％步驟收率
*基于活性分析，濁度法結(jié)果不可得表7概括了方案#5的結(jié)果。
表8方案#6的％步驟收率
表8概括了方案#6的結(jié)果。
表9方案#7的％步驟收率 表9概括了方案#7的結(jié)果。
結(jié)論在方案#1之前的操作(與方案#1的順序相同)中，原材料是不含任何添加的緩沖體系的過濾血漿。在將血漿裝載在柱上時，流過物的pH值大致達到峰值。由于這種觀察結(jié)果，在裝載到第一柱中之前，將1M Tris緩沖劑，pH 7.5添加到血漿中至50mM Tris的最終濃度。關(guān)于緩沖劑選擇法的概述，參看下文的實施例3。第七方案證實了直線級聯(lián)的親和柱作為有效血漿蛋白質(zhì)提純法運行的可行性。分析數(shù)據(jù)并根據(jù)下列觀察結(jié)果選擇順序。在方案1中，在整個操作過程中，下游目標蛋白質(zhì)的回收率保持較高。在方案2中，IgG柱幾乎完全耗盡血纖維蛋白溶酶原、血纖維蛋白原和ApoA1的進料流。再在方案3中，IgG柱捕獲ApoA1。根據(jù)這種觀察結(jié)果，確定PON1、Pg和Fg柱必須在該序列中位于IgG柱之前。
在根據(jù)該實驗決定色譜步驟在直線級聯(lián)中的順序時，考慮下列要點■PON1、Pg和Fg的捕獲步驟應(yīng)該位于IgG之前。
■由于白蛋白和檸檬酸鹽會干擾A1PI色譜法，A1PI色譜柱應(yīng)該位于白蛋白柱之后。流過物需要在A1PI柱之前進行UF/DF步驟以交換緩沖液。
■IgG應(yīng)該位于白蛋白之前以避免IgG損失。
因此，該實驗中的直線級聯(lián)順序應(yīng)該選擇為PON1/ApoA1→血纖維蛋白溶酶原→血纖維蛋白原→IgG→HSA→UF/DF→A1PI。
應(yīng)該指出的是，在另一實驗中，從目前的級聯(lián)順序中去除PON1/ApoA1柱，并在樹脂變得可用時在血纖維蛋白溶酶原之前插入vWF/FVIII。
實施例2血漿蛋白質(zhì)的親和捕獲該實驗中使用下列柱順序vWF/FVIII→血纖維蛋白溶酶原→血纖維蛋白原→IgG→UF/DF→HSA→UF/DF.
血漿制品四升冷凍匯集血漿獲自-20℃儲藏。
將血漿匯集物在水浴中在37.0℃±2℃解凍。一旦血漿解凍，迅速將其從水浴中取出。使用1M Tris的50x稀釋液，pH 7.5和2M NaCl的40x稀釋液將血漿調(diào)節(jié)至20mM Tris，50mM NaCl。將血漿充分混合并使用SartoPure 300 PP2(8微米)消毒濾器過濾。
a.血管性血友病因子/因子VIII(vWF/FVIII)親和捕獲制備含有410毫升為vWF/FVIII親和捕獲的捕獲開發(fā)的親和吸附劑的7厘米×10.6厘米填充床柱。該柱在長期不用時通常保存在含有0.1N NaOH的儲存溶液中。將預(yù)存柱用3CVs的Milli Q水以80厘米/小時的流速洗滌直至傳導(dǎo)率降至1mS/cm以下。將該柱用4CVs的平衡(EQ)緩沖劑平衡，該緩沖劑由20mM Tris、20mM檸檬酸鹽、140mM NaCl構(gòu)成，pH 7.5。將過濾血漿施加到柱上。當280納米的吸光度達到滿刻度的吸光度單位(AUFS＝2)的5％時，收集流過的流出物。
用4CV的EQ緩沖劑洗滌該柱，同時繼續(xù)收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。將溶液充分但輕輕混合，然后經(jīng)由3/0.8umSartoClean CA(H8)，然后經(jīng)由0.45/0.22um Sartobran P(H8)濾器過濾。將濾器用500毫升的EQ緩沖劑后漂洗。將合并的濾液輕輕地混合。這種濾過的溶液構(gòu)成vWF/FVIII捕獲步驟的流過餾分(vWF/FVIII-FT(流過物))。將vWF/FVIII用4CV的洗脫緩沖劑洗脫，該緩沖劑由20mM Tris、500mM NaCl、3mM CaCl2、0.01％Polysorbate 80、30％乙二醇構(gòu)成，pH 6.5。該柱的流速設(shè)為30厘米/小時。一旦％UV升至2％AUFS，就開始收集洗出液。持續(xù)收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。將柱洗出液輕輕混合并儲存在-80℃直至準備用于進一步加工。用由0.5N NaOH/1％Triton X100構(gòu)成的CIP-1溶液使樹脂再生。以“上升流”方向以5毫升/分鐘的降低的流速向柱施加CIP-1溶液達大約3CV。然后用2CV的由在0.5N NaOH中的30％異丙醇構(gòu)成的CIP-2溶液以5毫升/分鐘洗滌樹脂。將樹脂用3CV的儲存溶液平衡直至下次使用。
b.血纖維蛋白溶酶原親和捕獲制備含有255毫升為血纖維蛋白溶酶原捕獲開發(fā)的親和吸附劑的5厘米×13厘米填充床柱。該柱在短期不用時通常保存在含有0.1NNaOH的儲存溶液中。將預(yù)存柱用1-2CVs的Milli Q水以160厘米/小時的流速洗滌直至傳導(dǎo)率降至1mS/cm以下。將該柱用3-4CVs的平衡(EQ)緩沖劑平衡，該緩沖劑由20mM Tris、20mM檸檬酸鹽、140mM NaCl構(gòu)成，pH 7.5。將來自上一捕獲步驟的vWF/FVIII-FT施加到柱上。當280納米的吸光度達到AUFS的5％時，收集流過的流出物。
用2-3 CV的EQ緩沖劑洗滌該柱，同時繼續(xù)收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。將溶液輕輕混合，然后經(jīng)由0.22um Sartobran濾器過濾。將濾器用500毫升的EQ緩沖劑后漂洗。將合并的濾液輕輕地混合。這種濾過的溶液構(gòu)成血纖維蛋白溶酶原捕獲步驟的流過餾分(Pg-FT)。將該柱用2CV的由在EQ中的30mM辛酸鹽構(gòu)成的洗滌緩沖劑，pH 7.5洗滌，然后用2CV的EQ緩沖劑洗滌。將血纖維蛋白溶酶原用2-3CV的洗脫緩沖劑洗脫，該緩沖劑由50mM磷酸鈉、0.5M EACA構(gòu)成，pH 7.0。一旦％UV升至2％AUFS，就開始收集洗出液。持續(xù)收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。將柱洗出液輕輕混合并儲存在-80℃直至準備用于進一步加工。用由0.5N NaOH構(gòu)成的CIP-1溶液使樹脂再生。以“上升流”方向以40毫升/分鐘的降低的流速向柱施加CIP-1溶液達大約4CV。然后將樹脂用3CV的儲存溶液平衡直至下次使用。
c.血纖維蛋白原(Fg)親和捕獲制備含有790毫升為血纖維蛋白原捕獲開發(fā)的親和吸附劑的10厘米×10.1厘米填充床柱。該柱在短期不用時通常保存在含有0.1NNaOH的儲存溶液中。將預(yù)存柱用1-2CVs的Milli Q水以60厘米/小時的流速洗滌直至傳導(dǎo)率降至1mS/cm以下。
將該柱用3-4CVs的平衡(EQ)緩沖劑平衡，該緩沖劑由20mMTris、20mM檸檬酸鹽、140mM NaCl構(gòu)成，pH 7.5。將來自上一捕獲步驟的Pg-FT施加到柱上。當280納米的吸光度達到AUFS(吸光度單位滿刻度)的5％時，收集流過的流出物。用4-5CV的EQ緩沖劑洗滌該柱，并連續(xù)收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。將溶液輕輕混合，并經(jīng)由0.22um Sartobran濾器過濾。將濾器用500毫升的EQ緩沖劑后漂洗。將合并的濾液輕輕地混合。這種濾過的溶液構(gòu)成血纖維蛋白原捕獲步驟的流過餾分(Fg-FT)。將血纖維蛋白原用4-5CV的洗脫緩沖劑洗脫，該緩沖劑由20mM Tris、20mM檸檬酸鹽、140mM NaCl、1％膽酸鹽、10％丙二醇構(gòu)成，pH 7.5。一旦％UV升至2％AUFS，就開始收集洗出液。持續(xù)收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。將柱洗出液輕輕混合并儲存在-80℃直至準備用于進一步加工。用由1.0N NaOH構(gòu)成的CIP-1溶液使樹脂再生。以“上升流”方向以80毫升/分鐘的降低的流速向柱施加CIP-1溶液達大約4CV。將樹脂用3CV的儲存溶液平衡直至下次使用。
d.免疫球蛋白G(IgG)親和捕獲通過在Fg-FT中添加1/10體積的載量調(diào)節(jié)緩沖劑(在EQ中的300mM辛酸鹽)并充分混合，制備裝載物。制備含有1880毫升為IgG捕獲開發(fā)的親和吸附劑的14厘米×12.2厘米填充床柱。該柱在短期不用時通常保存在含有0.1N NaOH的儲存溶液中。將預(yù)存柱用2 CVs的Milli Q水以73厘米/小時的流速洗滌直至傳導(dǎo)率降至1mS/cm以下。將該柱用2CVs的由20mM Tris，20mM檸檬酸鹽、1M NaCl構(gòu)成的洗滌緩沖劑(pH 7.5)平衡，然后用3-5CV的由30mM辛酸鹽、20mM Tris、20mM檸檬酸鹽、140mM NaCl構(gòu)成的IgG平衡緩沖劑(pH 7.5)平衡。將來自上一捕獲步驟的Fg-FT施加到柱上。當280納米的吸光度達到AUFS(吸光度單位滿刻度)的5％時，收集流過的流出物。
用4-5CV的洗滌緩沖劑洗滌該柱，繼續(xù)收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。將溶液輕輕混合，然后經(jīng)由0.22um Sartobran濾器過濾。將濾器用500毫升的EQ緩沖劑后漂洗，并將合并的濾液輕輕地混合。這種濾過的溶液構(gòu)成IgG捕獲步驟的流過餾分(IgG-FT)。在IgG洗脫之前，將該柱用1CV的預(yù)洗脫緩沖劑調(diào)節(jié)，該緩沖劑由50mM檸檬酸鹽構(gòu)成，pH 6.0。用4CV由50mM檸檬酸鹽構(gòu)成的洗脫緩沖劑，pH 3.0洗脫IgG。一旦％UV升至2％AUFS，就開始收集洗出液。持續(xù)收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。將柱洗出液輕輕混合并儲存在-80℃直至準備用于進一步加工。用由1.0N NaOH構(gòu)成的CIP-1溶液使樹脂再生。以“上升流”方向以170毫升/分鐘的降低的流速向柱施加CIP-1溶液達大約4CV，然后以下降流方向施加3CV的Milli-Q水。然后將樹脂用3CV的儲存溶液平衡直至下次使用。
e.超濾/透濾進行過濾以濃縮IgG-FT產(chǎn)物直至達到大約1.5-2升的目標體積。對著6倍體積的EQ緩沖劑以18±1psi的濾器入口壓力(P1)和15±1psi的TMP進行透濾。在透濾開始時以及在透濾的大約每一滲余物體積下，將滲透物取樣以進行pH和傳導(dǎo)率測量，從而監(jiān)測透濾何時完成。
f.白蛋白(HSA)親和捕獲制備含有5600毫升為白蛋白捕獲開發(fā)的親和吸附劑的20厘米×17.8厘米填充床柱。該柱在短期不用時通常保存在含有0.1N NaOH的儲存溶液中。將預(yù)存柱用2CVs的Milli Q水以86厘米/小時的流速洗滌直至傳導(dǎo)率降至1mS/cm以下。將該柱用3-4CVs的EQ緩沖劑平衡。將來自上一步驟的UF/DF滲余物施加到柱上。當280納米的吸光度達到AUFS(吸光度單位滿刻度)的5％時，收集流過的流出物。
用2-3CV的EQ緩沖劑洗滌該柱，繼續(xù)收集柱流出物直至吸光度降至AUFS的5％。將溶液輕輕混合。這種濾過的溶液構(gòu)成白蛋白捕獲步驟的流過餾分(HSA-FT)。在白蛋白洗脫之前，將該柱用2CV的預(yù)洗脫緩沖劑調(diào)節(jié)，該緩沖劑由50mM檸檬酸鹽，300mM NaCl構(gòu)成，pH 7.5。將白蛋白用2-3CV的洗脫緩沖劑洗脫，該緩沖劑由50mM檸檬酸鈉、50mM辛酸鈉構(gòu)成，pH 6.2。一旦％UV升至2％AUFS，就開始收集洗出液。持續(xù)收集洗出液直至吸光度降回AUFS的2％。將柱洗出液輕輕混合，然后儲存在-80℃直至準備用于進一步加工。用由1.0N NaOH構(gòu)成的CIP-1溶液使樹脂再生。以“上升流”方向以400毫升/分鐘的降低的流速向柱施加CIP-1溶液達大約4CV，然后以下降流方向施加3CV的Milli-Q水。將樹脂用3CV的儲存溶液平衡直至下次使用。
g.濃縮HSA流過物將含有樣品剩余物的HSA-FT袋連接到產(chǎn)物儲器上的管道入口。在Slice 200系統(tǒng)上以1300毫升/分鐘的“恒定流速”啟動泵。將濾器出口(P2)的壓力設(shè)為13±1psi。這導(dǎo)致18±1psi的濾器入口壓力(P1)和15±1psi的TMP。在濃縮產(chǎn)物的同時，在該系統(tǒng)儲器中連續(xù)加入追加的HSA-FT。持續(xù)濃縮HSA-FT直至達到大約1.5-2升的目標體積。在從濾器系統(tǒng)收取UF產(chǎn)物之前，在沒有壓力或沒有過濾透過膜的情況下，繼續(xù)再循環(huán)大約1分鐘。在儲器中添加大約500-1000毫升平衡緩沖劑以漂洗濾器系統(tǒng)。再循環(huán)在沒有過濾或壓力的情況下緩慢開始以避免使系統(tǒng)漂洗液“發(fā)泡”，其持續(xù)大約3至5分鐘。將UF產(chǎn)物合并、漂洗并儲存在-80℃。HAS-FT濃縮物被視為A1PI提純的合適的原材料。
結(jié)果表10vWF/FVIII捕獲的關(guān)鍵屬性
表11血纖維蛋白溶酶原捕獲的關(guān)鍵屬性
表12血纖維蛋白原捕獲的關(guān)鍵屬性
表13IgG捕獲的關(guān)鍵屬性
表14HSA捕獲的關(guān)鍵屬性
表15目標蛋白質(zhì)的過程收率
實施例3用在直線級聯(lián)法中的血漿緩沖體系的評測和選擇進行該實驗以測定最適合直線級聯(lián)連續(xù)血漿蛋白質(zhì)提純方案的緩沖體系。據(jù)觀察，在IgG柱裝載過程中，pH值攀升至比血漿pH值(pH～7.5)高兩個單位。在IgG裝載過程中觀察到數(shù)次pH值變化，其似乎取決于裝載物的蛋白質(zhì)耗減程度。這意味著，某些血漿蛋白質(zhì)具有緩沖能力，且從裝載溶液中去除這些蛋白質(zhì)可能提高pH值轉(zhuǎn)變的可能性。用于血漿的緩沖體系必須保持血漿中的蛋白質(zhì)濃度和活性。緩沖體系必須使pH值在整個過程中保持在大約7.5±0.4的可接受范圍內(nèi)。
為了確保在隨后的操作中不發(fā)生pH值變化，用于隨后操作的血漿裝載物必須使用pH 7.5的1M Tris的儲液緩沖。使用兩種單獨的原料，1M Tris Base和1M Tris HCl制造這種儲備的緩沖劑。將這些緩沖劑彼此滴定至pH 7.5。然后將儲液在過濾之前在血漿中1∶20稀釋。最終制成的裝載物含有50mM Tris調(diào)節(jié)的血漿，用0.45/0.2微米濾器過濾。使用這種緩沖體系監(jiān)測直線級聯(lián)順序(LCS)實驗1-7。在整個過程中，在血漿和流動的緩沖劑中使用50mM Tris緩沖劑。在使用50mM Tris，pH 7.5時，在柱裝載過程中沒有觀察到任何pH問題。表15概括了使用50mM Tris，pH 7.5作為血漿緩沖劑進行的LCS提純的步驟收率。
表15在用50mM Tris，pH 7.5緩沖的LCS中，目標蛋白質(zhì)的％步驟收率
由于在生產(chǎn)規(guī)模下50mM Tris緩沖劑的相對較高的投入成本，尋求另一緩沖體系。在用pH 7.5的碳酸氫鹽、磷酸鹽和Tris緩沖的血漿的小等分試樣上進行了一些實驗。這些實驗持續(xù)數(shù)天以模擬多天LCS。將相同血漿匯集物的等分試樣緩沖并留在室溫(RT)下培養(yǎng)數(shù)天。分析每一樣品的活性和蛋白質(zhì)濃度。表16中列出了用每一體系緩沖血漿時每一培養(yǎng)步驟的收率。用50mM Tris緩沖的血漿作為比較的基準點操作數(shù)次。
表16預(yù)備性血漿緩沖研究的概要在室溫培養(yǎng)后的收率
結(jié)果表明，當與對照物水比較時，使用各種受試的緩沖劑沒有更大的蛋白質(zhì)或活性損失。在血漿中添加緩沖劑沒有對任何目標蛋白質(zhì)造成不利影響。然后在級聯(lián)研究中測試各個緩沖方案以確定最佳緩沖條件。
在LCS實驗過程中評測10mM磷酸鈉的緩沖體系。在血漿裝載物制備過程中，用血漿將儲備緩沖劑稀釋20倍，用其將0.2M磷酸鈉的儲液稀釋至10mM磷酸鈉。在用于直線級聯(lián)研究之前，將10mM磷酸鹽緩沖的血漿過濾至0.2微米。在這種緩沖方案的測試中，目標蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)活性和指示蛋白質(zhì)活性的其它要素顯著降低。下表17概括了使用10mM磷酸鹽緩沖劑的數(shù)個LCS實驗的步驟收率。
表17在用50mM磷酸鈉，pH 7.5緩沖的LCS中，目標蛋白質(zhì)的％步驟收率
盡管在50mM的Tris緩沖血漿已經(jīng)成功地避免了pH值波動，但仍需要更加成本有效的緩沖血漿的方法。因此，將20mM Tris，pH 7.5用于LCS。通過1M Tris，pH 7.5的50倍稀釋液，將血漿調(diào)節(jié)至20mMTris，pH 7.5。這種儲備緩沖劑如上制成，用Tris HCl滴定tris堿。表18顯示了使用滴定至20mM Tris的血漿進行的LCS操作的性能在目標蛋白質(zhì)回收率、緩沖能力和裝載穩(wěn)定性方面比得上如上所述的50mM Tris緩沖劑。
表18在用20mM Tris，pH 7.5緩沖的LCS中，目標蛋白質(zhì)的％步驟收率
表19使用不同緩沖劑體系的LCS中的HSA步驟收率
表19代表了評測的緩沖體系之間在LCS中的HSA步驟收率方面的比較結(jié)果?？傮w而言，在三個受試緩沖劑中，HSA捕獲的步驟回收率彼此相當，但是用10mM磷酸鹽時，對于IgG捕獲步驟表現(xiàn)出較低的HSA收率。此外，當使用10mM磷酸鹽緩沖劑時，IgG，較高值目標蛋白質(zhì)，在血纖維蛋白原捕獲步驟中具有較低的回收率。所有的值均是各個捕獲步驟顯示出的％收率。從0.5升操作中收集數(shù)據(jù)，僅根據(jù)裝載物和流過物中存在的白蛋白量計算步驟回收率。
結(jié)論是，含有50mM Tris的緩沖劑是有效的血漿緩沖劑，但在該工藝的規(guī)模擴大至生長規(guī)模時，其可能太昂貴。評測了Tris的一些替代物并進行完整的LCS操作。根據(jù)緩沖能力、使用簡易性、成本和蛋白質(zhì)濃度和活性的保持性評判這些替代物。據(jù)發(fā)現(xiàn)，pH 7.5的降低摩爾濃度的Tris(20mM)是有效的血漿緩沖劑。
本發(fā)明可以在不脫離其精神或基本屬性的情況下表現(xiàn)為其它具體形式，因此，應(yīng)該參照所附權(quán)利要求而非前述說明書以指出本發(fā)明的范圍。
序列表SEQ ID NO1氨基酸ARQFDF
權(quán)利要求
1.連續(xù)的蛋白質(zhì)分離和提純方法，包括(i)提供生物樣品，(ii)提供兩種或多種配體，它們各自特異性地結(jié)合到生物樣品中的目標蛋白質(zhì)上，其中這兩種或多種配體各自任選連接到載體上以形成兩種或多種配體-載體絡(luò)合物，(iii)使兩種或多種配體或配體載體絡(luò)合物以預(yù)定順序與生物樣品連續(xù)接觸以使各個配體或配體載體絡(luò)合物從生物樣品中連續(xù)結(jié)合目標蛋白質(zhì)，其中生物樣品在接觸之前不通過預(yù)調(diào)節(jié)步驟進行處理，(iv)洗脫結(jié)合到兩種或多種配體或配體載體絡(luò)合物的每一個上的目標蛋白質(zhì)，和(v)連續(xù)從生物樣品中分離目標蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品是血漿，目標蛋白質(zhì)包括血纖維蛋白原、α-1蛋白酶抑制劑、載脂蛋白A1、免疫球蛋白、對氧磷酶、凝血因子、vWF/FVIII、白蛋白、血纖維蛋白溶酶原或它們的組合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品包含體外細胞培養(yǎng)物，且蛋白質(zhì)是重組蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中在蛋白質(zhì)分離過程中在生物樣品中保持對氧磷酶的活性。
5.權(quán)利要求2的方法，其中vWF/FVIII在其它蛋白質(zhì)之前從血漿中分離。
6.權(quán)利要求2的方法，其中載脂蛋白A1在其它蛋白質(zhì)之后從血漿中分離。
7.權(quán)利要求2的方法，其中白蛋白在IgG之前從血漿中分離。
8.權(quán)利要求2的方法，其中白蛋白在IgG之后從血漿中分離。
9.權(quán)利要求2的方法，其中血纖維蛋白溶酶原在血纖維蛋白原之前從血漿中分離。
10.權(quán)利要求1的方法，其中兩種或多種配體與生物樣品接觸的預(yù)定順序?qū)е聉WF/FVIII、血纖維蛋白溶酶原、血纖維蛋白原、載脂蛋白A1、對氧磷酶、IgG、白蛋白和α-1蛋白酶抑制劑以所述順序連續(xù)結(jié)合。
11.權(quán)利要求1的方法，其中兩種或多種配體與生物樣品接觸的預(yù)定順序?qū)е聉WF/FVIII、載脂蛋白A1、對氧磷酶、血纖維蛋白溶酶原、血纖維蛋白原、、IgG、白蛋白和α-1蛋白酶抑制劑以所述順序連續(xù)結(jié)合。
12.權(quán)利要求1的方法，其中兩種或多種配體與生物樣品接觸的預(yù)定順序?qū)е聉WF/FVIII、IgG、白蛋白和α-1蛋白酶抑制劑以所述順序連續(xù)結(jié)合。
13.權(quán)利要求1的方法，其中配體包括太、多肽、肽模擬物、小分子、染料、含三嗪的化合物、抗體或抗原結(jié)合片段、核酸基分子、非多肽或核苷酸基分子、碳水化合物、碳水化合物模擬物、脂質(zhì)、無機材料、抑制劑、底物或它們的任意組合。
14.權(quán)利要求13的方法，其中配體包括基本含有大約1至大約15個氨基酸的肽。
15.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品獲自活組織檢查、血液、毛發(fā)、口腔刮物(buccal scrapes)、血漿、血清、皮膚、腹水、pluraleffusion、胸腔穿刺液、脊髓液、淋巴液、骨髓、呼吸液(respiratoryfluid)、腸液、外陰液、糞便、尿、唾液、淚液、痰液、腫瘤、器官、組織、體外細胞培養(yǎng)物成分的樣品、胎兒細胞、胎盤細胞或羊膜細胞和/或羊水、調(diào)節(jié)介質(zhì)、發(fā)酵液、腦脊髓液、乳汁、ductal fluid、汗液和精液。
16.權(quán)利要求1的方法，其中載體包括合成材料和/或天然材料。
17.權(quán)利要求1的方法，其中載體包括瓊脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖、纖維素、多糖、硝基纖維素、二氧化硅、礬土、氧化鋁、titania、titanium oxide、氧化鋯、苯乙烯、聚二氟乙烯尼龍、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚甲基丙烯酸酯、衍生的二氫唑酮聚合物或共聚物、玻璃、纖維素、瓊脂糖、任何前述物質(zhì)的衍生物、和任何前述物質(zhì)的組合。
18.權(quán)利要求1的方法，其中載體是樹脂珠。
19.權(quán)利要求1的方法，其中預(yù)調(diào)節(jié)包括醇沉淀、冷沉淀、脂質(zhì)和/或脂蛋白的去除、優(yōu)球蛋白沉淀、或它們的組合。
20.包含通過權(quán)利要求1的方法制成的基本純凈的血漿蛋白質(zhì)的制品。
21.權(quán)利要求20的制品，其中血漿蛋白質(zhì)包括血纖維蛋白原、α-1蛋白酶抑制劑、載脂蛋白A1、免疫球蛋白、對氧磷酶、凝血因子、vWF/FVIII、白蛋白、血纖維蛋白溶酶原或它們的組合。
22.權(quán)利要求20的制品，其中血漿蛋白質(zhì)以至少70％的純度基本純化。
23.權(quán)利要求20的制品，其中制品基本純化，不含任何免疫吸附劑引起的雜質(zhì)，并已經(jīng)經(jīng)過至少一個病原體滅活步驟。
24.作為藥用組合物配制的權(quán)利要求20的制品。
25.權(quán)利要求1的方法，其中在接觸步驟之前用緩沖劑處理生物樣品以進一步保持生物樣品中的一種或多種目標試劑的濃度和活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過親和色譜法從生物樣品中連續(xù)分離和提純蛋白質(zhì)的方法。使用選擇性和特異性結(jié)合到生物樣品中的蛋白質(zhì)上的配體或配體載體絡(luò)合物進行親和色譜法。配體或配體載體絡(luò)合物以預(yù)定順序連續(xù)與生物樣品接觸以使各個配體或配體－載體絡(luò)合物從生物樣品中連續(xù)結(jié)合蛋白質(zhì)。
文檔編號A61K35/16GK101035439SQ200580027498
公開日2007年9月12日 申請日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者史蒂文·詹姆斯·伯頓, 巴爾德夫·貝恩斯, 約翰·柯林, 蒂莫西·基思·海斯, 德文胡·陳, 克里斯托弗·布萊恩特, 大衛(wèi)·約翰·哈蒙德 申請人:普洛麥提生命科學(xué)有限公司, 美國紅十字會