專利名稱：治療、預(yù)防、抑制或降低心臟組織損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域涉及治療、預(yù)防、抑制或降低心臟組織損傷。
背景技術(shù)：
心臟疾病是新生兒和成人死亡的主要原因。
冠狀動(dòng)脈疾病引起心臟血管急性阻塞，導(dǎo)致依賴性心肌的損失。在西方國(guó)家這些事件是死亡的主要原因之一。因?yàn)樾呐K不具備充分的肌再生能力，心肌梗塞的存活者一般發(fā)展為慢性心力衰竭，僅美國(guó)就有超過(guò)一千萬(wàn)的該類病例。雖然一般成人患病更多，但在兒童生命的第一年中，心臟疾病是非感染性死亡的主要原因，其通常涉及心臟細(xì)胞分化、遷移或存活的異常。
有多種引起心肌和冠狀血管及組織損傷的情況，包括但不限于心肌缺血、凝血、血管阻塞、感染、發(fā)育缺陷或異常及其它該類心肌事件。心肌梗塞因心臟血管疾病引起。心肌梗塞發(fā)生于心臟某部分的血液供給減少或停止時(shí)(例如由冠狀動(dòng)脈阻塞引起)。血液供應(yīng)減少引起心肌細(xì)胞的損傷，甚至可以殺死心肌細(xì)胞。心臟血液供應(yīng)的減少通常由動(dòng)脈粥樣斑導(dǎo)致心外膜血管狹窄引起。這些動(dòng)脈粥樣斑破裂后將引起出血、血栓形成、纖維蛋白和血小板積累及血管狹窄。
最近有證據(jù)顯示，心外或心內(nèi)干細(xì)胞群可能有助于在正常環(huán)境下維持心肌數(shù)量。通過(guò)引入或補(bǔ)充外源性干細(xì)胞以促進(jìn)心臟修復(fù)的作用認(rèn)為是有希望的，但是，一般包括分離和導(dǎo)入自體同源或供體祖細(xì)胞。盡管干細(xì)胞群可保持細(xì)胞死亡和細(xì)胞更新之間的微妙平衡，但尚不足以完成急性冠狀動(dòng)脈閉塞之后的心肌修復(fù)。導(dǎo)入分離的干細(xì)胞可提高心肌功能，但該方法存在爭(zhēng)議，并且需要分離自體同源干細(xì)胞或使用供體干細(xì)胞以及免疫抑制反應(yīng)。將多能胚胎干細(xì)胞處理為心肌細(xì)胞譜系的努力尚未成功。干細(xì)胞遞送和分化的技術(shù)障礙迄今已經(jīng)阻礙了心臟再生療法的廣泛臨床應(yīng)用。
本領(lǐng)域仍需要改進(jìn)治療、預(yù)防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法和組合物。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種治療、預(yù)防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法，包括誘導(dǎo)至少一種生理功能，選自在所述冠狀組織中上調(diào)或增加ILK活性，在所述冠狀組織中上調(diào)或增加Akt活性，在所述冠狀組織中上調(diào)或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，下調(diào)或減少心肌細(xì)胞死亡，以及在所述冠狀組織中休眠心肌細(xì)胞。該方面包括向需進(jìn)行該治療的受試體使用一種誘導(dǎo)藥劑，其能夠在受試體體內(nèi)誘導(dǎo)至少一種所述生理功能。
發(fā)明詳述不受任何特定理論的約束，本發(fā)明提供了通過(guò)誘導(dǎo)一種或多種生理功能來(lái)預(yù)防、治療、抑制或降低冠狀組織的損傷的方法，其可以包括涉及有關(guān)心臟功能或發(fā)育中的調(diào)節(jié)路徑。
為了治療、預(yù)防、抑制或降低冠狀組織的損傷，根據(jù)本發(fā)明可引入的生理機(jī)能包括上調(diào)或增加整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)，上調(diào)或增加蛋白激酶B(Akt)，上調(diào)或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，下調(diào)或減少心肌細(xì)胞死亡，以及休眠心肌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)給需要治療的受試體使用能夠誘導(dǎo)一種或多種以上所述生理功能的藥劑，可以在患者體內(nèi)誘導(dǎo)至少一種所述生理功能。該患者可以是動(dòng)物，優(yōu)選為人類。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)加入誘導(dǎo)劑，可將ILK的活性上調(diào)或增加到大于10％、25％、50％或100％。根據(jù)本發(fā)明，Akt的活性可上調(diào)或增加到大于10％、25％、50％或100％。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)利用誘導(dǎo)劑，心肌細(xì)胞死亡可下調(diào)或減少大于10％、25％、50％或達(dá)到100％。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)誘導(dǎo)作用，心肌細(xì)胞的休眠可增加到大于10％、25％、50％或達(dá)到100％。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)加入誘導(dǎo)劑，可將PI3K的活性上調(diào)或增加到大于10％、25％、50％或100％。
在一個(gè)實(shí)施例中，該誘導(dǎo)劑為胸腺素β4(Tβ4或TB4)。胸腺素β4最初鑒定為體外內(nèi)皮細(xì)胞遷移和分化期間上調(diào)的蛋白質(zhì)。胸腺素β4由胸腺分離，是一種包含43個(gè)氨基酸殘基、4.9kDa的普遍存在的多肽，可在多種組織中鑒定。多種作用與該蛋白質(zhì)有關(guān)，包括在內(nèi)皮細(xì)胞分化和遷移、T細(xì)胞分化、肌動(dòng)蛋白隔離和血管生成中的作用。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明利用胸腺素β4以外的誘導(dǎo)劑，治療、預(yù)防、抑制或降低冠狀組織的損傷。該誘導(dǎo)劑可包括，Tβ4異構(gòu)體、類似物或衍生物，包括氧化Tβ4、Tβ4亞砜、Tβ4N-端變異體、Tβ4C-端變異體和Tβ4拮抗劑。
已經(jīng)確定了很多Tβ4異構(gòu)體，并且與已知Tβ4氨基酸序列相比具有約70％、或約75％、或約80％或更多的同源性。該異構(gòu)體包括，例如，Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。這些異構(gòu)體與Tβ4共同擁有氨基酸序列LKKTET，其涉及預(yù)防、治療、抑制或降低冠狀組織的損傷。
此處引用國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/US99/17282作為參考，其中公開(kāi)了Tβ4異構(gòu)體，與本發(fā)明的用途一致，同樣具有氨基酸序列LKKTET，及其可用于本發(fā)明的保守變體。此處引用國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/GB99/00833(WO99/49883)作為參考，其中公開(kāi)了可具有本發(fā)明用途的氧化胸腺素β4。
因此，特別注意誘導(dǎo)劑如已知的Tβ4異構(gòu)體、如上文所列、尚未確定的Tβ4異構(gòu)體，將用于本發(fā)明的方法中。
此外，可用于治療、預(yù)防、抑制或降低心臟組織損傷的其它誘導(dǎo)劑分子，同樣可在本發(fā)明的方法中使用。這樣的分子包括凝溶膠蛋白、維生素D結(jié)合蛋白質(zhì)(DBP)、肌動(dòng)蛋白抑制蛋白、肌動(dòng)蛋白素、adsevertin、propomyosin、fincilin、蠶食蛋白、DNA聚合酶I、vilin、片段化蛋白、割切蛋白、加帽蛋白、β-輔肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)調(diào)解蛋白。因?yàn)樗龇椒ò瑧?yīng)用于受試體的這些物質(zhì)，本發(fā)明因而進(jìn)一步提供藥物組合物，包括此處所提出的凝溶膠蛋白、維生素D結(jié)合蛋白質(zhì)(DBP)、肌動(dòng)蛋白抑制蛋白、肌動(dòng)蛋白素、蠶食蛋白，DNA聚合酶I、vilin、片段化蛋白、割切蛋白、加帽蛋白、β-輔肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)調(diào)解蛋白。
因此，本發(fā)明的一個(gè)內(nèi)容是使用誘導(dǎo)劑，例如包含或基本上由氨基酸序列LKKTET及其保守變體組成的肽或肽片段，包括，氨基酸側(cè)序列KLKKTET和/或LKKTETQ(有時(shí)稱其為L(zhǎng)KKTET多肽)。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“保守變體)”及其語(yǔ)法變化，表示氨基酸殘基由其它生物學(xué)上相似的殘基置換。保守變異的實(shí)例包括異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸疏水性殘基的置換，極性殘基的置換，例如精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬氨酸等等。
本發(fā)明還利用誘導(dǎo)劑刺激心臟組織中一種或多種在此所述的誘導(dǎo)劑的產(chǎn)生。該藥劑還稱為“誘導(dǎo)起始劑”。因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使用可刺激受試體體內(nèi)產(chǎn)生此處所述誘導(dǎo)劑的藥劑治療受試體。因而本發(fā)明所使用的誘導(dǎo)劑可直接或間接地誘導(dǎo)至少一種上述的生理功能，以治療、預(yù)防、抑制或減輕降低冠狀組織損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，間接誘導(dǎo)出至少一種上述的生理功能，以治療、預(yù)防、抑制或減輕冠狀組織損傷的誘導(dǎo)劑，可刺激心臟組織中LKKTET肽例如Tβ4的產(chǎn)生，以預(yù)防冠狀組織的損傷。
不受任何特定理論的約束，其它磷酸腺肌醇3-激酶(PI3K)和整合蛋白連接激酶(ILK)和可用胸腺肽β4(Tβ4)或用其它LKKTET肽上調(diào)的AkT信號(hào)通路，可以傳遞生存信號(hào)，并因此在肌缺血損傷后對(duì)預(yù)防心臟組織損傷起重要作用。AkT是絲氨酸-蘇氨酸激酶，通過(guò)影響許多可抑制細(xì)胞凋亡的下游通路，對(duì)細(xì)胞和組織存活起一定作用。在多種膜受體、激素、細(xì)胞因子、趨化因子和其它細(xì)胞分子的刺激作用之后，PI3K和ILK激酶也可激活A(yù)kT。因此，用于本發(fā)明的誘導(dǎo)劑可以是除Tβ4之外的或其它另一種LKKTET肽。該誘導(dǎo)劑的實(shí)施例可選自但不局限于膜受體，包括生長(zhǎng)因子受體的HER(或Erb B)族和雌激素(ER)受體；胰島素或與胰島素聯(lián)合的結(jié)合白蛋白的棕櫚酸鹽；纖連蛋白；谷胱甘肽；甘露醇；P38-MAPK抑制劑，例如SB-203580；紅細(xì)胞生成素；和Rho族蛋白質(zhì)例如Ras、Cdc42和Rac1。其中，Akt的幾個(gè)下游靶點(diǎn)包括轉(zhuǎn)錄因子BAD和Forkhead。作為實(shí)例，Tβ4誘導(dǎo)的Akt活性通過(guò)磷?；疊AD抑制細(xì)胞凋亡，然后BAD抑制線粒體的細(xì)胞色素C釋放和caspase-9的活性。AkT也可激活I(lǐng)KK，而IKK通過(guò)抑制劑NFKB降解，可激活核因子-κB(NF-κ3)。這時(shí)NFκB可易位到核并誘導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。上述分子和其它藥物和小分子也可和在此所述的誘導(dǎo)劑起協(xié)同作用，抑制心臟組織的損傷。該化合物的實(shí)例可選自但不局限于醛糖還原酶抑制劑(ARI)，例如唑泊司他等；ACE抑制劑，例如雷米普利等；山梨醇脫氫酶抑制劑，例如CP-470，711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)；酪氨酸磷酸酶抑制劑，例如原釩酸鈉；維生素衍生物(RXR激動(dòng)劑的胰島素致敏活性)，也就是具有胰島素致敏活性的核受體配體類，例如LG268；水楊酸鹽/酯和c-Jun N末端激酶(JNK)等的藥理抑制劑；氯氮平和奧氮平，(非典型antipsychiotics)；ROS抑制劑；和BAX抑制劑。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用在此所述的有效量的誘導(dǎo)劑接觸受試體損傷部位，而治療、預(yù)防、抑制或降低受試體冠狀組織損傷的方法。該接觸可以是直接的或全身性的。接觸損傷部位的實(shí)施例包括用在此所述的含有誘導(dǎo)劑的組合物接觸損傷部位或在此所述的與增強(qiáng)誘導(dǎo)劑穿透性的至少一種在此所述的藥劑結(jié)合，或延遲或延緩在此所述的誘導(dǎo)劑釋放至治療部位。
給藥可包括，例如，將在此所述的含有誘導(dǎo)劑的組合物直接注射至心臟組織例如心肌組織，靜脈給藥，腹膜內(nèi)給藥，肌內(nèi)或皮下注射，或吸入，透皮或口服。
在此所述的誘導(dǎo)劑，可用任意適于治療、預(yù)防、抑制或降低冠狀組織損傷的劑量給藥。例如，在此所述的誘導(dǎo)劑，給藥劑量在約0.001-1,000,000微克，更優(yōu)選在約0.1-5,000微克，最優(yōu)選在1-30微克范圍內(nèi)。
本發(fā)明的誘導(dǎo)劑可每天、每隔一天等單劑量給藥，對(duì)于數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月等可單劑量給藥或每天多劑量給藥，例如每天用藥2、3、4次或更多次。
Tβ4位于許多類型的組織和細(xì)胞中，因此在心臟組織和/或心臟細(xì)胞中，在此所述的刺激產(chǎn)生Tβ4、LKKTET肽和/或另外的在此所述的誘導(dǎo)劑的藥劑，可加至或含有一種組合物，以產(chǎn)生Tβ4、LKKTET肽和/或另外的誘導(dǎo)劑。該藥劑可包括多種生長(zhǎng)因子族成員，例如胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胸腺肽α1(Tα1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。
另外，可向組合物中加入在此所述的誘導(dǎo)劑和其它輔助治療、預(yù)防、抑制或降低心臟組織損傷的藥劑。該藥劑包括血管生成素、生長(zhǎng)因子、直接分化細(xì)胞的藥劑。例如但不限于，此處描述的誘導(dǎo)劑能與以下一種或多種藥劑組合有效量的VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、胸腺素原α和胸腺素α1。
本發(fā)明同樣包括一種藥物組合物，其在藥學(xué)可接受的載體中，例如注射用水，含有在此所述的治療有效量的誘導(dǎo)劑。
治療或預(yù)防心臟組織損傷的實(shí)際劑量、制劑或組合物依賴于多種因素，包括受試體的體型大小和健康狀況。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用如在申請(qǐng)日之前公開(kāi)的PCT/US99/17282和引用的參考文獻(xiàn)所描述的確定臨床劑量的方法和技術(shù)，來(lái)確定適當(dāng)?shù)氖褂脛┝俊?br> 含有此處所述誘導(dǎo)劑的適當(dāng)制劑的濃度范圍是在約0.001-10％重量，更優(yōu)選約0.01-0.1％重量，最優(yōu)選約0.05％重量的范圍內(nèi)。
在此所述的治療方法涉及多種含有此處所述誘導(dǎo)劑的試劑或組合物的給藥或遞送途徑，包括任何向受試體的常規(guī)給藥技術(shù)。使用或含有此處所述誘導(dǎo)劑的方法和組合物和/或用于本發(fā)明的其它組合物，可通過(guò)與藥學(xué)可接受的無(wú)毒賦形劑或載體混合，制成藥物組合物。
本發(fā)明可包括抗體的使用，該抗體與在此所述的誘導(dǎo)劑相互作用，例如LKKTET肽或其功能性片段?？梢蕴峁┖谢蚧居珊胁煌砦惶匦缘目倖慰寺】贵w的抗體，以及特異的單克隆抗體制劑。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，如申請(qǐng)日之前公開(kāi)的PCT/US99/17282中所述，單克隆抗體由含有蛋白質(zhì)片段的抗原制備。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”的含義包括單克隆抗體和多克隆抗體。
在又一項(xiàng)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種通過(guò)使用有效量的誘導(dǎo)起始劑治療受試體的方法，其中誘導(dǎo)起始劑誘發(fā)此處所述誘導(dǎo)劑的基因表達(dá)，例如Tβ4、Tβ4異構(gòu)體或LKKTET肽。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指有效的誘發(fā)此處所述誘導(dǎo)劑的基因表達(dá)，從而進(jìn)行有效治療的藥劑量。誘發(fā)此處所述誘導(dǎo)劑的基因表達(dá)的藥劑可以是多核苷酸。多核苷酸可以是反義鏈、三聯(lián)劑或核酶。例如可使用指向結(jié)構(gòu)基因區(qū)域或Tβ4的啟動(dòng)子區(qū)域、Tβ4異構(gòu)體或LKKTET肽的反義鏈。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種使用組合物的方法，該組合物可誘發(fā)此處所述誘導(dǎo)劑的肽活性。影響此處所述誘導(dǎo)劑活性的組合物(例如，拮抗劑和激動(dòng)劑)，包括肽、擬肽、多肽、化合物、礦物質(zhì)例如鋅以及生物制劑。
本發(fā)明還涉及一種篩選能夠預(yù)防冠狀組織損傷的如上所述的化合物的方法，包括用候選化合物與冠狀組織接觸；在所述冠狀組織中測(cè)量至少一種所述生理功能的水平，其中與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中至少一種所述生理功能的水平相比，所述至少一種生理功能的水平增加，表明所述組合物能夠治療、預(yù)防、抑制或降低所述冠狀組織的損傷。
本發(fā)明還涉及一種篩選能夠誘導(dǎo)至少一種上述生理功能的化合物的方法，包括用候選化合物接觸心臟組織；測(cè)量所述組織中的Tβ4活性，其中，與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中Tβ4活性水平相比，Tβ4活性在所述心臟組織中增加表明所述化合物能夠誘導(dǎo)至少一種生理功能。
本申請(qǐng)通過(guò)以下非限定性實(shí)施例進(jìn)一步解釋。
實(shí)例1合成Tβ4和Tβ4抗體獲自RegeneRx Biopharmaceuticals，Inc.(3 BethesdaMetro Center，Suite 700，Bethesda，MD 20814)，并在膠原凝膠測(cè)試中檢測(cè)，以確定其將心臟內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的效力。已經(jīng)確定，心臟瓣膜及其它心臟組織的發(fā)育是通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成的，該過(guò)程的缺陷會(huì)引起個(gè)體發(fā)育及整個(gè)生命期間嚴(yán)重的心血管畸形和損傷。在膠原凝膠測(cè)試中，生理濃度的Tβ4明顯增強(qiáng)心內(nèi)膜細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。而且，抗Tβ4的抗體抑制并阻斷該轉(zhuǎn)化。房室心內(nèi)膜向侵入性間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，是形成和維持正常心臟組織及形成心臟瓣膜的一個(gè)方面。
實(shí)例2參與心臟發(fā)育的調(diào)節(jié)途徑，可用于輔助心臟修復(fù)中的心臟細(xì)胞重新調(diào)整。在心臟形態(tài)發(fā)生期間的基因表達(dá)研究中，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育中的心臟中，有43個(gè)氨基酸肽胸腺素β4被表達(dá)。胸腺素β4具有多種功能，其最突出的包括，分離G-肌動(dòng)蛋白單體和之后的對(duì)肌動(dòng)蛋白—細(xì)胞骨架組織的作用，這是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、器官形成和其它細(xì)胞生物學(xué)事件所必需的。最近的結(jié)構(gòu)域分析顯示，基于其對(duì)肌動(dòng)蛋白碳端的親合力，β4-胸腺素能夠影響肌動(dòng)蛋白裝配。除細(xì)胞運(yùn)動(dòng)之外，胸腺素β4可通過(guò)影響Rho-依賴性基因表達(dá)或核肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)的染色質(zhì)重建而影響轉(zhuǎn)錄，。
在此表明，胸腺素β4能夠刺激心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。LIM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)PINCH和整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)，兩者均是細(xì)胞位移和存或所必需的，與胸腺素β4形成復(fù)合物，導(dǎo)致存活激酶Akt/PKB的磷酸化作用。Akt磷酸化作用的抑制與胸腺素β4在心臟細(xì)胞上的作用是相反的。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后，用胸腺素β4處理成年小鼠，導(dǎo)致心臟中Akt磷酸化作用增加，增強(qiáng)了在24小時(shí)內(nèi)早期肌細(xì)胞的存活率，提高了心臟功能。這些結(jié)果表明，在心臟形成期表達(dá)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，在急性冠心病的情況下，可重新調(diào)配于保護(hù)心肌。
結(jié)果胸腺素β4發(fā)育表達(dá)雖然已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在發(fā)育期的大腦中胸腺素β4的表達(dá)，就像心血管系統(tǒng)中的表達(dá)一樣，但是沒(méi)有重要的細(xì)節(jié)。胚胎期(E)10.5天的小鼠全胚胎RNA原位雜交，顯示胸腺素β4在左心室、右心室的外部彎曲和心臟流出道表達(dá)。放射性原位雜交顯示，胸腺素β4轉(zhuǎn)錄子富集于心臟瓣膜前體區(qū)域，通稱為心內(nèi)膜墊。這一區(qū)域的細(xì)胞源自于內(nèi)皮細(xì)胞，其經(jīng)過(guò)間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從心內(nèi)膜遷移出并侵入將心肌和心內(nèi)膜分開(kāi)的細(xì)胞外基質(zhì)的隆起。除心內(nèi)膜細(xì)胞以外，一種心肌細(xì)胞移至并聚集于墊區(qū)域，這是心腔分隔和重構(gòu)所必需的過(guò)程。使用免疫組織化學(xué)，發(fā)現(xiàn)墊中表達(dá)胸腺素β4的細(xì)胞同樣表達(dá)心肌肌動(dòng)蛋白，說(shuō)明在胸腺素β4存在于侵入心內(nèi)膜墊的遷移心肌細(xì)胞中。最后，胸腺素β4轉(zhuǎn)錄子和蛋白質(zhì)在E9.5-E11.5同樣在室間隔和較少分化、較多增生的心肌區(qū)域表達(dá)，通常稱為致密層，該致密層在細(xì)胞成熟時(shí)移行至小梁區(qū)域。由前側(cè)心臟區(qū)域移行的流出道心肌，也表達(dá)高水平的胸腺素β4蛋白質(zhì)。
分泌的胸腺素β4刺激心臟細(xì)胞遷移和存活盡管胸腺素β4是在細(xì)胞液和細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)以及在細(xì)胞內(nèi)起作用，功但是發(fā)現(xiàn)用真菌標(biāo)記的胸腺素β4轉(zhuǎn)染的Cos1細(xì)胞條件培養(yǎng)液，含有可用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的胸腺素β4，與之前報(bào)導(dǎo)的傷口液體分泌和存在于其中的胸腺素β4一致。在噬菌體顆粒表面表達(dá)胸腺素β4之后，該噬菌體是經(jīng)胞外加入到胚胎心臟外植體，發(fā)現(xiàn)抗噬菌體抗體包裹了細(xì)胞表面，并且最終可在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞液和細(xì)胞核中檢測(cè)，而對(duì)照噬菌體檢測(cè)不到。用生物素標(biāo)記胸腺素β4進(jìn)行了類似的觀察。這些數(shù)據(jù)表明，分泌的胸腺素β4可以內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞，盡管細(xì)胞的進(jìn)入機(jī)制仍需測(cè)定。
為了檢測(cè)心臟細(xì)胞遷移中分泌的胸腺素β4的作用，設(shè)計(jì)了一種胚胎心臟外植體系統(tǒng)，用于在三維膠原凝膠中分析細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)化。在該分析中，來(lái)自瓣膜形成區(qū)域的鄰近胚胎心肌和心內(nèi)膜的外植體，與鄰近膠原的心內(nèi)膜一起放置于膠原凝膠上。心肌細(xì)胞的信號(hào)誘導(dǎo)心內(nèi)膜細(xì)胞遷移，但是心肌細(xì)胞并不能正常和大量地移行至膠原。但是，一旦將胸腺素β4加入到原始外植體，就可以觀察到大量自然的搏動(dòng)，心臟肌肉肌動(dòng)蛋白—陽(yáng)性細(xì)胞從外植體中移行出去?；赥UNEL分析法或磷—組織蛋白酶H3免疫染色，與對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞死亡或增生在這些細(xì)胞中沒(méi)有明顯不同。
為測(cè)試出生后心肌細(xì)胞的應(yīng)答，將原始小鼠新生期心肌細(xì)胞培養(yǎng)在涂覆層粘連蛋白的玻璃上，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或胸腺素β4處理細(xì)胞。與胚胎心肌細(xì)胞相似，與對(duì)照(p＜.05)相比，發(fā)現(xiàn)胸腺素β4處理的新生期心肌細(xì)胞的移動(dòng)距離明顯增加。除胸腺素β4在心肌細(xì)胞遷移中的作用之外，在胚胎心臟外植體分析中的內(nèi)皮位移發(fā)現(xiàn)了類似的作用。將E11.5的外植體暴露于胸腺素β4中，與PBS(p＜.01)相比，導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞移行數(shù)量的增加。
在我們實(shí)驗(yàn)室中，新生期心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)物生長(zhǎng)于涂覆層粘連蛋白載玻片上，一般存活大約1至2周，并且某些細(xì)胞搏動(dòng)達(dá)到2周。令人驚訝的是，暴露于胸腺素β4的新生期心肌細(xì)胞存活時(shí)間明顯地比較長(zhǎng)，肌細(xì)胞明顯的節(jié)律性收縮可達(dá)28天。此外，在胸腺素β4處理的新生期心肌細(xì)胞中，搏動(dòng)速率一直比較快(95對(duì)50搏動(dòng)每分鐘，p＜.02)，表明細(xì)胞間傳達(dá)的變化以及心肌細(xì)胞更有活力胸腺素β4激活I(lǐng)LK和Akt/蛋白質(zhì)激酶B為研究通過(guò)胸腺素β4影響細(xì)胞遷移和存活的電位機(jī)制，搜索到與蛋白質(zhì)交互作用的胸腺素β4。胸腺素β4的氨基端與affi-凝膠珠融合，導(dǎo)致碳端暴露以鑒定上述未知交互作用蛋白質(zhì)，但阻止與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合。合成E9.5-12.5小鼠心臟T7噬菌體互補(bǔ)DNA文庫(kù)并用噬菌體顯示篩選，富集胸腺素β4交互作用克隆，并由ELISA確認(rèn)。PINCH是一種LIM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì).，是該篩選中最為一貫的隔離的，并在不存在肌動(dòng)蛋白(ELISA)的情況下與胸腺素β4交互作用。PINCH和整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)作為參與胞外基質(zhì)交互作用的比較大的復(fù)合物的一部分，彼此直接交互作用，并間接地與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架反應(yīng)，所述復(fù)合物通常稱為局部粘連復(fù)合物中。由于PINCH和ILK促進(jìn)絲氨酸—蘇氨酸激酶Akt/蛋白質(zhì)激酶B磷酸化作用，因而是細(xì)胞位移和細(xì)胞存活所必需的，所述蛋白質(zhì)激酶B，為一種存活和生長(zhǎng)信號(hào)通路中的中樞激酶。編碼胸腺素β4的質(zhì)粒用或不用培養(yǎng)的細(xì)胞中的PINCH或ILK轉(zhuǎn)染，并發(fā)現(xiàn)胸腺素β4與PINCH或ILK分別共沉淀。更進(jìn)一步說(shuō)，盡管和PINCH相比，ILK和胸腺素β4之間的交互作用較弱，但PINCH、ILK和胸腺素β4一直在共有的復(fù)合物中進(jìn)行免疫沉淀。PINCH與胸腺素β4的交互作用對(duì)應(yīng)于圖上的PINCH的第四或第五LIM結(jié)構(gòu)域，而ILK氨基末端ankryin結(jié)構(gòu)域足夠進(jìn)行胸腺素β4的交互作用。
由于向局部粘連復(fù)合物中補(bǔ)充ILK對(duì)其激活很重要，因此分析了胸腺素β4對(duì)ILK定位和表達(dá)的作用。在將胚胎心臟外植體或C2C12成肌細(xì)胞用合成胸腺素β4蛋白質(zhì)(10ng/100ul)或表達(dá)胸腺素β4的質(zhì)粒處理后，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，ILK在細(xì)胞周圍顯著增強(qiáng)。Western分析顯示在C2C12細(xì)胞中ILK蛋白質(zhì)水平適度增長(zhǎng)，說(shuō)明增強(qiáng)的免疫熒光可能與胸腺素β4定位改變有關(guān)。并發(fā)現(xiàn)，在胸腺素β4處理C2C12細(xì)胞后，ILK的機(jī)能被激活，該結(jié)果通過(guò)使用Akt的絲氨酸473的磷—特異性抗體使其已知底物的Akt磷酸化作用增加可以證明，同時(shí)不改變總Akt蛋白質(zhì)。細(xì)胞外胸腺素β4和轉(zhuǎn)染胸腺素β4給藥的相似作用與以前觀察到的肽內(nèi)在化一致，說(shuō)明對(duì)胸腺素β4發(fā)信號(hào)是細(xì)胞內(nèi)而不是細(xì)胞外作用。由于胸腺素β4隔離了G-肌動(dòng)蛋白單體庫(kù)，對(duì)ILK激活作用的影響有賴于胸腺素β4在調(diào)節(jié)聚合F-肌動(dòng)蛋白和單體球形肌動(dòng)蛋白之間的平衡所起的作用。F-肌動(dòng)蛋白的聚合作用被C3轉(zhuǎn)移酶抑制，并且F-肌動(dòng)蛋白的形成被活化的Rho所促進(jìn)，但是兩種干預(yù)都沒(méi)有影響胸腺素β4處理后的COS1或C2C12細(xì)胞的ILK活化作用。
為了確定ILK的激活作用對(duì)所觀察到的胸腺素β4的影響是否必需，使用已經(jīng)充分公開(kāi)的ILK抑制劑渥曼青霉素，其抑制ILK上游的激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)。使用心肌細(xì)胞遷移和搏動(dòng)頻率來(lái)分析胸腺素β4活性，如上文所述，在胸腺素β4存在下以及有或無(wú)渥曼青霉素的情況下，培養(yǎng)胚胎心臟外植體。與ILK介導(dǎo)胸腺素β4的作用一致，在ILK的抑制作用下，心肌細(xì)胞遷移和搏動(dòng)頻率明顯降低(p＜.05)。同時(shí)，這些結(jié)果支持生理學(xué)上明顯的細(xì)胞內(nèi)胸腺素β4-PINCH-ILK的交互作用，說(shuō)明該復(fù)合物可介導(dǎo)某些觀察到的相對(duì)獨(dú)立于于肌動(dòng)蛋白聚合作用的胸腺素β4的作用。
胸腺素β4在心肌梗塞后促進(jìn)細(xì)胞存活和提高心臟功能由于胸腺素β4對(duì)心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的存活和遷移的作用以及AKT的磷酸化作用，測(cè)試了在心肌損傷之后胸腺素β4是否有助于體內(nèi)心臟修復(fù)。通過(guò)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成58只成年小鼠心肌梗塞，結(jié)扎后，將其中的一半立即在全身、心臟內(nèi)或全身加心臟內(nèi)使用胸腺素β4，另一半用PBS處理。用膠原(對(duì)照)或膠原與胸腺素β4的混合物進(jìn)行心臟內(nèi)注射。存活兩周的所有45只小鼠，在梗塞后的第2和第4周用隨機(jī)盲超聲通過(guò)心臟收縮多重測(cè)量進(jìn)行心臟功能診斷。梗塞4周后，對(duì)照小鼠的左心室平均縮短分?jǐn)?shù)23.2+/-1.2％(n＝22，95％置信區(qū)間)；與之對(duì)比，用胸腺素β4處理的小鼠平均縮短分?jǐn)?shù)37.2+/-1.8％(n＝23，95％置信區(qū)間，p＜.0001)。作為第二種測(cè)量心室功能的方法，二維超聲心臟圖像測(cè)量顯示，胸腺素β4處理的小鼠左心室輸出血液的平均分?jǐn)?shù)(射血分?jǐn)?shù))為57.7+/-3.2％(n＝23，95％置信區(qū)間，p＜.0001)，而冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后的對(duì)照小鼠的平均值為28.2+/-2.5％(n＝22，95％置信區(qū)間)。心臟縮短分?jǐn)?shù)或射血分?jǐn)?shù)分別大于60％或100％的提高，說(shuō)明暴露至胸腺素β4的顯著提高，盡管與假手術(shù)的動(dòng)物相比，心臟功能仍有所抑制(～60％縮短分?jǐn)?shù)；-75％射血分?jǐn)?shù))。最后，對(duì)照組的末期舒張度(EDD)和末期收縮度(ESD)明顯較高，表明梗塞后胸腺素β4處理導(dǎo)致心臟擴(kuò)張降低，與改善功能一致。顯著的是，當(dāng)胸腺素β4被腹膜內(nèi)注射全身給藥或僅在心臟梗塞局部給藥時(shí)，改進(jìn)的程度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異，表明胸腺素β4的有益作用可能通過(guò)直接作用于心臟細(xì)胞而不是通過(guò)心臟外源產(chǎn)生的。用相同的膠原賦形劑進(jìn)行對(duì)照心臟注射，使針對(duì)心臟修復(fù)的注射不產(chǎn)生內(nèi)在反應(yīng)。
為確定胸腺素β4提高心臟功能的方式，檢查用胸腺素β4處理或未用其處理的心臟的多個(gè)連續(xù)組織切片。三個(gè)水平的三色染色切片顯示，用胸腺素β4處理的所有小鼠中的疤痕的大小減小，但沒(méi)有顯示全身或局部胸腺素β4給藥的不同，這與上述超聲心臟圖像數(shù)據(jù)一致。通過(guò)對(duì)一組小鼠左心室六個(gè)水平的切片進(jìn)行的疤痕體積的定量分析，證明用胸腺素β4處理的小鼠傷疤體積明顯減小(p＜.05)。用PBS或胸腺素β4處理的心臟中，在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后第3、6、11或14天，未發(fā)現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞增殖或死亡。然而通過(guò)TUNEL測(cè)定(綠色)，在結(jié)扎24小時(shí)后，經(jīng)過(guò)胸腺素β4處理的心肌細(xì)胞，其細(xì)胞死亡顯著減少，并被肌肉—肌動(dòng)蛋白抗體(紅色)雙重標(biāo)記證實(shí)。同樣是肌細(xì)胞的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在胸腺素β4組中非常稀少，但在對(duì)照心臟中大量存在。與該發(fā)現(xiàn)一致，發(fā)現(xiàn)梗塞三天后，心臟內(nèi)胸腺素β4處理的左心室縮短分?jǐn)?shù)為39.2+/-2.34％(n＝4,95％置信區(qū)間)，對(duì)照為28.8+/-2.26％(n＝4,95％置信區(qū)間)(p＜.02)；射血分?jǐn)?shù)分別為64.2+/-6.69％或44.7+/-8.4％(p＜.02)，表明獲得了胸腺素β4了早期保護(hù)。最后，c-kit、Sca-1或Abcg2陽(yáng)性心肌細(xì)胞在處理或未接受處理的心臟中的數(shù)量相似，并且胸腺素β4處理動(dòng)物的心肌細(xì)胞體積與成熟的肌細(xì)胞相比沒(méi)有檢測(cè)到任何不同，表明胸腺素β4誘導(dǎo)的改進(jìn)不受所稱干細(xì)胞向心臟細(xì)胞系補(bǔ)充的影響。因此，由于胸腺素β4對(duì)心肌細(xì)胞存活所起的作用以及梗塞后對(duì)心肌細(xì)胞的早期保護(hù)，使用胸腺素β4處理減小鼠少傷疤體積和保存心肌功能是可能的。
由于在培養(yǎng)的細(xì)胞中胸腺素β4上調(diào)ILK活性和Akt磷酸化作用，所以測(cè)試了這些激酶在體內(nèi)的活性。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈梗塞后，與PBS處理的小鼠相比，胸腺素β4處理小鼠的心臟溶溶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)ILK水平增加。相應(yīng)地，與上述胸腺素β4對(duì)ILK的作用一致，Akt-5473磷—特異性抗體顯示出在胸腺素β4處理的小鼠中磷酸化Akt-5473的量上升，這與之前所描述的胸腺素β4對(duì)ILK的作用是一致的。Akt蛋白質(zhì)總數(shù)沒(méi)有增加。這些體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與體外所示的胸腺素β4對(duì)細(xì)胞遷移和存活所起的作用是一致的，這表明ILK激活作用和之后的Akt刺激作用可部分地解釋胸腺素β4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞存活增強(qiáng)，盡管用這個(gè)單一機(jī)制解釋胸腺素β4對(duì)細(xì)胞所起作用的全部原因是不可能的。
討論此處提供的證據(jù)表明，胸腺素β4，一種在心臟形態(tài)發(fā)生期間參與細(xì)胞遷移和存活的蛋白質(zhì)，可重新調(diào)配從而減少心臟梗塞后的心肌細(xì)胞損失。根據(jù)PINCH、ILK和Akt的作用，該數(shù)據(jù)與該復(fù)合物所起的作用是一致的，即在胸腺素β4對(duì)細(xì)胞遷移、存活和心臟修復(fù)的影響中起重要作用。在小鼠中觀察到，胸腺素β4在冠狀結(jié)扎后24小時(shí)內(nèi)防止細(xì)胞死亡的能力，可能導(dǎo)致疤痕體積的減少和改進(jìn)心室功能。盡管ILK的胸腺素β4激活作用可能有許多細(xì)胞效應(yīng)，但Akt的激活作用為主要機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，胸腺素β4促進(jìn)細(xì)胞的存活。當(dāng)心臟損傷后，施用在小鼠中過(guò)表達(dá)的骨髓干細(xì)胞，與預(yù)計(jì)的Akt心臟修復(fù)效果是一致的，盡管這可能發(fā)生在非細(xì)胞自主模式中。
胸腺素β4預(yù)防心臟細(xì)胞死亡的早期作用聯(lián)想到能通過(guò)“休眠”經(jīng)受住組織缺氧損傷的肌細(xì)胞。雖然對(duì)心肌休眠的基本機(jī)制不了解，然而在新陳代謝和能量使用中的改變顯示促進(jìn)細(xì)胞的存活。誘導(dǎo)劑，例如胸腺素β4可用類似休眠心肌方法來(lái)改變細(xì)胞特性，并給出內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新血管生成的時(shí)間。
在此，胚胎心臟中G-肌動(dòng)蛋白分離肽胸腺素β4促進(jìn)心肌和內(nèi)皮細(xì)胞遷移并在出生后的心肌細(xì)胞中保留這種特性。培養(yǎng)的胚胎和出生后心肌細(xì)胞存活也因?yàn)樾叵偎卅?而增強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)胸腺素β4與PINCH和整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)形成一種功能性復(fù)合物，引起殘存細(xì)胞中的激酶Akt/PKB的激活，其對(duì)胸腺素β4對(duì)心肌細(xì)胞施加影響是必需的。小鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后，用胸腺素β4處理導(dǎo)致心臟ILK的上調(diào)和Akt的激活，增強(qiáng)早熟肌細(xì)胞的存活并提高心臟功能。這些結(jié)果指示，胸腺素β4促進(jìn)心肌細(xì)胞遷移、存活和修復(fù)并在急性心肌損傷的情況下是一種新的治療靶點(diǎn)。
方法RNA原位雜交用洋地黃毒甙配基標(biāo)記或S-標(biāo)記的由小鼠胸腺素β4cDNA的3′UTR區(qū)合成的反義鏈核糖核酸探針，進(jìn)行E 9.5-12.5小鼠胚胎的全胚胎或部分胚胎RNA原位雜交，與緊密關(guān)聯(lián)的胸腺素β10的轉(zhuǎn)錄不享有同源性。
免疫組織化學(xué)胚胎或成年心臟組織植入用于免疫組織化學(xué)的石蠟和切片。胚胎心臟切片用不識(shí)別胸腺素β10的抗胸腺素β4孵育。成年心臟從底部到頂部切成十等分。使用連續(xù)切片用于三色染色切片并與肉瘤霉素a-輔肌動(dòng)蛋白、c-kit、Sca-1、Abcg2和BrdU抗體反應(yīng)，用于TUNEL測(cè)定法(Intergen Company#S7111)。
膠原蛋白凝膠遷移測(cè)定法如先前所述，從E11.5野生型小鼠胚胎分割流出道并放置于膠原蛋白基質(zhì)上。經(jīng)過(guò)10小時(shí)附著，外植體在含30ng/300ul胸腺素β4的PBS、單一的PBS或胸腺素β4和100nM渥曼青霉素中孵育。在37℃5％CO2培養(yǎng)3-9天，并在室溫下固定于含4％聚甲醛的PBS中10分鐘。計(jì)數(shù)細(xì)胞對(duì)遷移和距離進(jìn)行定量分析，在內(nèi)皮遷移的各個(gè)條件下使用至少三個(gè)單獨(dú)的外植體和心肌遷移使用八個(gè)單獨(dú)的外植體。
膠原蛋白凝膠外植體的免疫細(xì)胞化學(xué)聚甲醛固定的外植體在室溫下用滲透溶液(10mM PIPES pH6.8；50mMNaCl；0.5％屈立通X-100；300mM蔗糖；3mM MgCl2)滲透10分鐘，并在室溫下用PBS漂洗2×5分鐘。通過(guò)一連串的阻滯和漂洗步驟，使用檢測(cè)抗體且外植體在室溫下用平衡緩沖液(Anti-Fade kit)漂洗和孵育10分鐘。外植體用勺取于玻璃顯微鏡載玻片，蓋上蓋玻片，并用熒光顯微鏡觀察。作為推薦，用ApopTag和熒光素原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Intergen Company # S7111)進(jìn)行TUNEL測(cè)定。
胚胎T7噬菌體展示cDNA文庫(kù)使用Straight A′s mRNA Isolation System(Novagen，Madison WI)，從E9.5-12.5小鼠胚胎心臟中分離和純化等量mRNA。使用T7Selectlo-3定向表達(dá)cDNA隨機(jī)引物克隆系統(tǒng)(Novagen，Madison WI)合成cDNA。媒介物T7Selectlo-3用于展示隨機(jī)準(zhǔn)備的cDNA，其位于5-15噬菌體10B外殼蛋白分子的C端。誘導(dǎo)第二外殼蛋白10A的表達(dá)。經(jīng)EcoRl和Hind III消化后，將插入片段結(jié)合到T7 selectlo-3媒介物(T7選擇系統(tǒng)手冊(cè)，Novagen)。組裝媒介物，并且文庫(kù)的復(fù)雜性為107。組裝的噬菌體在0.5L對(duì)數(shù)期的BLT5615E.coli菌株培養(yǎng)基37℃下擴(kuò)增4小時(shí)。離心除去細(xì)胞碎片，用8％聚乙二醇沉淀噬菌體。用1M NaCl/pH8.0的10mMTris-HCl/1mM EDTA從顆粒狀沉淀物中提取噬菌體，由CsCI梯度超速離心進(jìn)行純化。純化后的噬菌體在PBS中透析，-80℃存儲(chǔ)于10％甘油中。
T7噬菌體的生物淘選參照說(shuō)明書，將300μl的Affi-凝膠15(Bio-RadLaboratories)經(jīng)氨基末端賴氨酸殘基與12μg合成胸腺素β4蛋白質(zhì)(RegeneRx)結(jié)合。在PBS中用3％BSA阻滯1小時(shí)后，將凝膠轉(zhuǎn)移至柱中，用10ml PBS、2ml的1％SDS/PBS和1ml的PBS/0.05％Tween-20(PBST)x4沖洗。在500μl的PBST中，109pfu的T7噬菌體胚胎心臟文庫(kù)(復(fù)合物的100x)用于柱中孵育5分鐘以達(dá)到低標(biāo)準(zhǔn)生物淘選。用50ml的PBS洗去未結(jié)合噬菌體。用2.0ml的1％SDS洗脫結(jié)合噬菌體。測(cè)定10μl洗脫噬菌體的效價(jià)，其余噬菌體立即在0.5L對(duì)數(shù)期的BLT5651E.coli培養(yǎng)基中擴(kuò)增直至溶解。離心去除細(xì)胞碎片，測(cè)定溶解產(chǎn)物的效價(jià)，109pfu的噬菌體用于下一輪生物淘選。進(jìn)行4輪生物淘選，經(jīng)過(guò)第2、3和4輪后，在擴(kuò)增前挑選出30份單一菌落，分別用于序列分析。對(duì)含有多于10個(gè)氨基酸的單一菌落進(jìn)行擴(kuò)增，用于ELISA證實(shí)測(cè)定。
ELISA證實(shí)測(cè)定將Maxi Sorp Nunc-Immuno Plates(Nalgene Nunc International)用1μg/100μl的合成胸腺素β4肽包衣，過(guò)夜，然后用PBS沖洗，用3％BSA阻滯。將109pfu擴(kuò)增的單一噬菌體群落分別加入PBST至每一孔盤，在室溫下孵育1.5小時(shí)。將T7野生型噬菌體作為陰性對(duì)照。用PBS(X4)沖洗以除去未結(jié)合的噬菌體，在室溫下，加入200μl的1％SDS/PBS到孔盤中洗脫結(jié)合噬菌體1小時(shí)。
共免疫沉淀反應(yīng)將COS和10T1/2細(xì)胞用胸腺素β4、PINCH和/或ILK轉(zhuǎn)染，按照前述用抗體沉淀溶解產(chǎn)物。用抗靶向各種PINCH的物質(zhì)包括抗ILK多克隆抗體(Santa Cruz)、抗胸腺素β4多克隆抗體和抗真菌或抗FLAG抗體拮抗劑，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
動(dòng)物和手術(shù)操作按照上文所述，通過(guò)結(jié)扎左前下行冠狀動(dòng)脈，在16周齡(25-30g)的58只雄性C57BL/6J小鼠中形成心肌梗塞。29只結(jié)扎小鼠中在結(jié)扎后立即使用胸腺素β4處理，剩余的29只用PBS注射劑處理。處理方法為，心臟內(nèi)使用胸腺素β4(200μg于10μl膠原)或10μl的膠原；腹腔內(nèi)使用胸腺素β4(150μg于300μl的PBS)或3000的PBS；或同時(shí)通過(guò)心臟內(nèi)和腹膜內(nèi)注射。每三天進(jìn)行一次腹膜內(nèi)注射，直至小鼠死亡。劑量基于在先的胸腺素β4生物分布研究。將心臟移出、稱重并固定以用于組織切片。其余的小鼠以同樣的方式操作，以用于梗塞后0.5、1、3、6和11天的研究。
通過(guò)超聲心臟圖像分析心臟功能使用M-模式和上文所述的2維測(cè)量法，進(jìn)行用于分析心臟收縮功能的超聲波心動(dòng)描記法。測(cè)量顯示了隨機(jī)選自六個(gè)選定心臟周期中的平均值，選自至少兩個(gè)單獨(dú)的掃描，以隨機(jī)盲的方式在掃瞄水平中作為一致性參照的乳頭肌中進(jìn)行。末期舒張定義為最大左心室(LV)舒張尺度，并且末期收縮定義為后壁運(yùn)動(dòng)的峰值。在統(tǒng)計(jì)分析中忽略每組中的單一端值。代表收縮功能的縮短分?jǐn)?shù)(FS)以LV尺度計(jì)算如下FS＝EDD-ESD/EDD×100％。射血分?jǐn)?shù)(EF)由二維圖計(jì)算。EDD，末期舒張度；ESD，末期收縮度。
疤痕體積計(jì)算與上文類似，使用通過(guò)每只小鼠心臟的六個(gè)切片，由Openlab 3.03 software(Improvision)計(jì)算疤痕體積。膠原沉積面積的百分比由隨機(jī)選擇的六個(gè)切片計(jì)算，并算出每只小鼠的平均數(shù)。
統(tǒng)計(jì)分析用95％置信區(qū)間的變量的標(biāo)準(zhǔn)t-test測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。
胸腺素β4增強(qiáng)胚胎心臟中的心肌和內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并在出生后心肌細(xì)胞中保持該特性。胸腺素β4同樣可以增進(jìn)培養(yǎng)基中的胚胎和出生后心肌細(xì)胞的存活。胸腺素β4與PINCH和整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)一起形成功能性復(fù)合物，導(dǎo)致存活激酶Akt的激活(同樣稱之為蛋白激酶B)。小鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎之后，胸腺素β4的處理可以導(dǎo)致心臟中的ILK上調(diào)和Akt激活，增強(qiáng)早期肌細(xì)胞存活并提高心臟功能。這些發(fā)現(xiàn)表明胸腺素β4增強(qiáng)心肌細(xì)胞遷移、存活和修復(fù)，其調(diào)節(jié)路徑是一種新的急性心肌損傷的治療靶點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種治療、預(yù)防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法，其包括誘導(dǎo)至少一種生理功能，所述生理功能選自在所述冠狀組織中上調(diào)或增加ILK活性，在所述冠狀組織中上調(diào)或增加Akt活性，在所述冠狀組織中上調(diào)或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，在所述冠狀組織中下調(diào)或減少心肌細(xì)胞死亡，以及在所述冠狀組織中休眠心肌細(xì)胞，通過(guò)對(duì)需要進(jìn)行該處理的受試體使用一種誘導(dǎo)劑，其能夠在所述受試體體內(nèi)誘導(dǎo)所述生理功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)劑是胸腺素β4(Tβ4)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)劑是LKKTET肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述誘導(dǎo)劑是除Tβ4之外的其它誘導(dǎo)劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)劑是除Tβ4之外的其它誘導(dǎo)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5，其中所述多肽包含氨基酸序列LKKTET、氨基酸序列KLKKTET、氨基酸序列LKKTETQ，和Tβ4的N-端變異體、Tβ4的C-端變異體、Tβ4異構(gòu)體、氧化的Tβ4或Tβ4亞砜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)劑直接或間接誘導(dǎo)所述生理功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述誘導(dǎo)劑間接誘導(dǎo)所述生理功能，且所述誘導(dǎo)劑刺激所述冠狀組織中LKKTET肽的產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述誘導(dǎo)劑是除LKKTET肽之外的其它誘導(dǎo)劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述誘導(dǎo)劑選自膜受體、HER生長(zhǎng)因子受體、Erb B生長(zhǎng)因子受體、雌激素(ER)受體、胰島素、與胰島素聯(lián)合的結(jié)合白蛋白的棕櫚酸鹽、纖連蛋白、谷胱甘肽、甘露醇、P38-MAPK的抑制劑、SB-203580、紅細(xì)胞生成素、Rho族蛋白質(zhì)、Ras、Cdc42或Rac1的至少一種。
11.權(quán)利要求10的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述受試體給予有效量的至少一種分子，所述分子選自醛糖還原酶抑制劑(ARI)、唑泊司他、ACE抑制劑、雷米普利、山梨醇脫氫酶抑制劑、CP-470、CP-711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)、酪氨酸磷酸酶抑制劑，例如原釩酸鈉、具有胰島素致敏活性的rexinoid核受體配體、水楊酸鹽/酯、c-Jun N末端激酶(JNK)的藥理抑制劑、氯氮平、奧氮平、ROS抑制劑或BAX抑制劑。
12.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述受試體給予有效量的一種分子，所述分子選自醛糖還原酶抑制劑(ARI)、唑泊司他、ACE抑制劑、雷米普利、山梨醇脫氫酶抑制劑、CP-470、CP-711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)、酪氨酸磷酸酶抑制劑，例如原釩酸鈉、具有胰島素致敏活性的rexinoid核受體配體、水楊酸鹽/酯、c-Jun N末端激酶(JNK)的藥理抑制劑、氯氮平、奧氮平、ROS抑制劑或BAX抑制劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中上調(diào)或增加ILK的活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中上調(diào)或增加Akt的活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中上調(diào)或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中下調(diào)或減少心肌細(xì)胞的死亡。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠狀組織中心肌細(xì)胞的休眠。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中給予受試體的所述誘導(dǎo)劑的給藥劑量在約0.001-1,000,000微克范圍內(nèi)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)劑的給予是通過(guò)直接注射至所述冠狀組織、靜脈給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下注射、吸入、透皮或口服給藥。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)劑給予受試體的給藥劑量在約0.1-5,000微克范圍內(nèi)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)劑給予受試體的給藥劑量在約1-30微克范圍內(nèi)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述誘導(dǎo)劑是Tβ4。
23.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述LKKTET肽是Tβ4。
24.一種篩選能夠按照權(quán)利要求1的方法預(yù)防冠狀組織損傷的化合物的方法，其包括用候選化合物與冠狀組織接觸；測(cè)量所述冠狀組織中至少一種所述生理功能的水平，其中與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中至少一種所述生理功能的水平相比，所述至少一種生理功能的水平增加，表明所述化合物能夠治療、預(yù)防、抑制或降低所述冠狀組織的損傷。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述化合物是LKKTET肽而不是Tβ4。
26.一種篩選能夠按照權(quán)利要求1的方法誘導(dǎo)至少一種上述生理功能的化合物的方法，其包括用候選化合物接觸冠狀組織；測(cè)量所述組織中的Tβ4活性，其中，與缺乏所述候選化合物的冠狀組織中Tβ4活性水平相比，Tβ4活性在所述冠狀組織中增加，表明所述化合物能夠誘導(dǎo)至少一種生理功能。
全文摘要
一種治療、預(yù)防、抑制或降低冠狀組織損傷的方法，包括誘導(dǎo)至少一種生理功能，選自上調(diào)或增加所述冠狀組織中ILK的活性，上調(diào)或增加所述冠狀組織中Akt的活性，下調(diào)或減少所述冠狀組織中心肌細(xì)胞的死亡，以及心肌細(xì)胞在所述冠狀組織中的休眠。對(duì)需要進(jìn)行該處理的受試體使用一種誘導(dǎo)藥劑，其能夠在受試體體內(nèi)誘導(dǎo)至少一種所述生理功能。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101068562SQ200580028090
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者迪帕克·斯里瓦斯塔瓦, 依爾迪科·勃克馬凱特, 安科·薩克塞納, 阿蘭·L·戈?duì)柎奶?申請(qǐng)人:德克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評(píng)議委員會(huì), 雷金納克斯生物制藥公司