專利名稱：介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的肽抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由單克隆抗DNA抗體識別的肽，所述肽能夠抑制真核細(xì)胞中的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)，從而可用于治療人變性性疾病和炎癥。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡，或程序性細(xì)胞死亡，對于正常生物過程包括組織胚胎發(fā)生、組織穩(wěn)態(tài)的維持、多細(xì)胞生物體的細(xì)胞發(fā)育、病毒感染細(xì)胞的消除及免疫系統(tǒng)的發(fā)育(Ellis等，1991)具有根本的重要性。這是與變性性死亡或壞死根本不同的細(xì)胞死亡類型，因為此細(xì)胞死亡類型是基因介導(dǎo)的細(xì)胞自毀的主動過程，在某些情況下，具有生物意義的穩(wěn)態(tài)功能。
p53p53蛋白最初被鑒定為腫瘤相關(guān)抗原，是腫瘤抑制基因的產(chǎn)物，其可以抑制突變或異常細(xì)胞的生長(Baker等，1990)。認(rèn)為功能性p53可以檢測出DNA損傷(Lee等，1995)及隨后誘導(dǎo)異常細(xì)胞的DNA修復(fù)(Kastan等，1991)、生長停滯(Kuerbitz等，1992)或細(xì)胞凋亡(Yonish-Rouach等，1991)。具體地，p53通過消除細(xì)胞群的遺傳損傷細(xì)胞而調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性，且其主要功能之一為預(yù)防腫瘤形成。
p53蛋白具有至少兩個DNA結(jié)合位點(1)p53蛋白的核心，其與p53反應(yīng)基因的啟動子區(qū)中的DNA序列特異性相互作用(el-Deiry等，1992)；及(2)p53蛋白的C末端，其通?？勺R別損傷DNA的常見特征(Lee等，1995；Foord等，1991)。
p53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，其可特異性結(jié)合p53依賴性基因調(diào)節(jié)序列的共有位點(el-Deiry等，1992)。在與結(jié)合特定DNA調(diào)節(jié)位點有關(guān)的主要序列編碼區(qū)中p53基因的突變導(dǎo)致腫瘤抑制減少。因此，不足為奇，大部分天然的人腫瘤帶有突變的p53(Hollstein等，1991)。
p53具有短的半衰期，并因此，在細(xì)胞中持續(xù)合成和降解。然而，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受應(yīng)激時，p53被穩(wěn)定。誘導(dǎo)p53穩(wěn)定的細(xì)胞應(yīng)激的例子如下a)DNA損傷，例如由UV(紫外線)輻射、細(xì)胞突變、化療、及放療引起的損傷；b)體溫過高；c)缺氧；及d)某些化療藥物引起的微管脫調(diào)節(jié)，如使用紫杉醇或長春花堿類的治療。
應(yīng)激活化的p53誘導(dǎo)級聯(lián)事件，導(dǎo)致應(yīng)激細(xì)胞的生長停滯或細(xì)胞凋亡，從而防止異常細(xì)胞的過度生長和腫瘤形成(Ko，1996)。然而，嚴(yán)重應(yīng)激之后p53的過度活化對生物體有害，這是因為組織功能可被過度的細(xì)胞凋亡損害(Komarova，2001)。
具體地，放療和化療顯示有嚴(yán)重的副作用，例如對淋巴和造血系統(tǒng)及腸上皮的嚴(yán)重?fù)p傷，限制了這些治療的效果。其他副作用，如脫發(fā)，也是由p53介導(dǎo)并進一步減弱癌癥治療的效果。因此，為消除或減輕在正常組織中與癌癥治療相關(guān)的不良副作用，在p53缺陷的腫瘤的治療過程中抑制正常組織中p53的活性并由此保護正常組織是有益的。
已認(rèn)為p53的失活是非期望和不需要的事件，且已付出可觀的努力通過恢復(fù)p53功能而促進癌癥治療。然而，p53恢復(fù)或模擬會引起上述在化療或放療過程中損傷正常組織細(xì)胞有關(guān)的問題。在癌癥治療過程中，這些正常細(xì)胞經(jīng)受應(yīng)激，使細(xì)胞中的p53引起程序性死亡。癌癥治療然后殺死腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。
美國專利No.6,593,353揭露了p53抑制劑用于p53介導(dǎo)的疾病、病癥及損傷的治療。
美國專利No.6,420,136揭露了通過添加一種增強或抑制p53的生物化學(xué)活性的蛋白質(zhì)而調(diào)節(jié)細(xì)胞中p53蛋白的活性的方法。
美國專利No.6,630,584揭露了一種可識別暴露于突變體而非野生型p53上的抗原表位的單鏈抗體，和編碼所述單鏈Fv的DNA分子，含有所述抗體的藥物組合物，以及使用所述藥物組合物的治療方法。
p53和應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)p53活性對生物體的不利作用不限制于癌癥治療。p53可被損傷(如燒傷)、自然發(fā)生的疾病(如發(fā)燒有關(guān)的體溫過高，及受阻斷的血液供應(yīng)有關(guān)的局部缺氧，中風(fēng)，及局部缺血)和細(xì)胞老化(如成纖維細(xì)胞老化)及癌癥治療相關(guān)的多種應(yīng)激活化。因此，臨時的p53抑制還可在例如下述情況中是治療上有效的(a)減輕或消除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的p53依賴性神經(jīng)元死亡，即腦和脊髓損傷；(b)在移植前保護組織和器官；(c)骨髓移植宿主的準(zhǔn)備；及(d)減輕或消除如癲癇發(fā)作過程中的神經(jīng)元損傷。
另外，各種變性性疾病，包括阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、缺血性中風(fēng)(ischemic stroke)(Mattson2001；Martin，2001)、青光眼(Nickells，1999)、創(chuàng)傷后的繼發(fā)性變性(Raghupathi，2000)、心肌梗塞(Haunstetter，1998)，與應(yīng)激反應(yīng)中敏感組織的過度細(xì)胞死亡有關(guān)。因此，應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞死亡的臨時抑制可預(yù)防和治療變性性疾病(Komarova，2001)。
p53的DNA結(jié)合區(qū)的單克隆抗體DNA抗體為許多自身免疫性疾病，特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)且尤其是狼瘡性腎炎所特有。然而，對于自身免疫性疾病中抗DNA抗體的流行，目前還沒有普遍接受的解釋。對于DNA的免疫看上去是由一種抗原(Radic等，1994)驅(qū)動，但因為哺乳動物的DNA通常不會誘導(dǎo)抗DNA免疫反應(yīng)，所以自身DNA不太可能是驅(qū)動的抗原(Pisetsky，1996)。
據(jù)報導(dǎo)，使用單克隆抗體的免疫，可能通過基于免疫單克隆抗體的可變區(qū)中獨特型決定簇的抗獨特型連接性，可誘導(dǎo)延伸超越抗體的特異性的免疫反應(yīng)。
根據(jù)獨特型抗體網(wǎng)絡(luò)術(shù)語，Ab1是第一抗體，該抗體結(jié)合抗原，Ab2是Ab1的抗獨特型抗體。因為抗原和Ab2均可與Ab1結(jié)合，Ab2的可變區(qū)可模擬抗原的構(gòu)象。Ab3是Ab2的抗獨特型抗體。由于結(jié)構(gòu)互補性鏈，Ab1和Ab3可具有對于原始抗原的相似特異性。
PAb-421抗體是與p53的C末端DNA結(jié)合區(qū)反應(yīng)的原型單克隆抗體?？筽53 PAb-421抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)已有資料描述(見WO 98/56416)。由于PAb-421抗體在體外可活化p53的DNA結(jié)合，建議其用于癌癥治療(見WO 94/12202)。
發(fā)明人先前曾報道，使用PAb-421免疫小鼠可誘導(dǎo)也結(jié)合DNA的抗獨特型抗體的形成(Herkel等，2000；和WO 00/23082)。這些單克隆抗獨特型抗體中的兩種，Idi-1和Idi-2，模擬p53調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)合特性并與PAb-421和雙鏈和單鏈DNA特異性反應(yīng)。
本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為(在本發(fā)明優(yōu)先權(quán)日之后)損傷DNA具有由p53和Idi-1和Idi-2抗體識別的化學(xué)上定義的結(jié)構(gòu)(Herkel等，2004)?，F(xiàn)有技術(shù)中尚未有教導(dǎo)或表明可能使用這些抗獨特型抗體鑒定具有抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥特性的新型肽。
尚需要新型組合物，所述新型組合物應(yīng)可特異、安全及有效減輕正常組織中的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕應(yīng)激相關(guān)的變性性疾病和應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥的嚴(yán)重性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了組合物和方法，其包括用于抑制對于多種應(yīng)激相關(guān)疾患的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)的肽。本發(fā)明的肽顯示有抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥活性，由此增加暴露于應(yīng)激的細(xì)胞或組織的細(xì)胞存活率。
盡管p53的抗體用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的用途已有描述，本發(fā)明證明了與抗p53抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗獨特型抗體也可用于定義用于預(yù)防或減少細(xì)胞死亡的治療。
意想不到地，本發(fā)明揭露了，由獨特型免疫產(chǎn)生的抗p53單克隆抗體的單克隆抗體識別的肽對于治療人變性性疾病及改變炎癥反應(yīng)具有潛在用途。換言之，抗p53抗體(Abs)可產(chǎn)生抗獨特型抗體，其中這些后提到的抗體可識別預(yù)防細(xì)胞死亡或炎癥有用的抗原表位。
本發(fā)明部分基于證明本發(fā)明的肽在緩解應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和p53介導(dǎo)的反應(yīng)中的功效的實驗，其中所述細(xì)胞死亡和p53介導(dǎo)的反應(yīng)由例如DNA損傷劑、體溫過高、中毒性應(yīng)激及γ輻射等刺激誘導(dǎo)。
令人吃驚的是，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的肽無論在體外還是在體內(nèi)都顯示有抗炎癥活性。因此，本發(fā)明證明了本發(fā)明的肽對于治療炎癥和自身免疫性疾病是有用的。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及含有可與針對抗p53抗體的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的表位的肽，其中所述抗p53抗體可與p53C末端的至少部分調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明的肽顯示有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
在一個具體實施方案中，所述肽可與針對抗p53抗體PAb-421的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)(Herkel等，2000，由此通過參考完整并入本文)。在其他具體實施方案中，所述肽具有p53調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)構(gòu)模擬特性，可與單克隆抗體Idi-1和Idi-2發(fā)生免疫反應(yīng)(Herkel等，2004，由此通過參考完整并入本文)。
在一個實施方案中，所述抗獨特型抗體是一種含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的分子。在另一個實施方案中，抗獨特型抗體是一種含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物和衍生物的VL和VH區(qū)的分子。
所述肽可通過本領(lǐng)域已知方法表征和合成。在一個實施方案中，所述肽通過質(zhì)譜分析法表征及通過化學(xué)合成方法合成。
根據(jù)另一個實施方案，所述肽與p53的DNA結(jié)合區(qū)具有結(jié)構(gòu)互補性。不希望受限于任何具體理論或作用機理，假定所述肽能夠結(jié)合p53，由此而防止p53結(jié)合損傷DNA。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽顯示有結(jié)合與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)的活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽顯示有防止所述蛋白質(zhì)結(jié)合損傷DNA的活性。
根據(jù)某些實施方案，所述肽含有總共約5至25個氨基酸，優(yōu)選地，所述肽含有約5至25個氨基酸，優(yōu)選約7至12個氨基酸。
在某些具體實施方案中，本發(fā)明提供了具有抗細(xì)胞凋亡活性和/或抗炎癥活性的新型肽，所述新型肽具有選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO4、其類似物、衍生物或活性片段的氨基酸序列。本發(fā)明的肽如下SEQ ID NO1-LPPLPYP，被命名為應(yīng)激素-1；SEQ ID NO2-DLSTDALHYRTA，被命名為應(yīng)激素-2；
SEQ ID NO3-HPTNQQSLWRWP，被命名為應(yīng)激素-3；SEQ ID NO4-SSLSVDYPTRYP，被命名為應(yīng)激素-4。
在其他具體實施方案中，所述衍生物是反向肽，其具有SEQ ID NO5-8中任一所述的氨基酸序列SEQ ID NO5-PYPLPPL(“D”同分異構(gòu)形式的所有殘基)；SEQ ID NO6-ATRYHLADTSLD(“D”同分異構(gòu)形式的所有殘基)；SEQ ID NO7-PWRWLSQQNTPH(“D”同分異構(gòu)形式的所有殘基)；SEQ ID NO8-PYRTPYDVSLSS(“D”同分異構(gòu)形式的所有殘基)。
在一個具體實施方案中，所述肽具有SEQ ID NO1、2及5中任一所述的氨基酸序列。
根據(jù)其他實施方案，本發(fā)明的肽對于選擇性預(yù)防正常組織的細(xì)胞死亡有用。在一個實施方案中，所述肽抑制哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞凋亡活性。在另一個實施方案中，所述肽抑制人細(xì)胞的細(xì)胞凋亡活性。
根據(jù)某些優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的肽能夠抑制細(xì)胞凋亡活性至少25％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少95％。
本發(fā)明提供的肽具有有效抑制正常組織中細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)的能力，并對于治療細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性的抑制而導(dǎo)致的疾病或病癥有用。
根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明的肽對于治療應(yīng)激相關(guān)的人變性性疾病有用。根據(jù)其他實施方案，所述肽能夠下調(diào)免疫介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)。
在其他方面，本發(fā)明涉及一種含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ IDNO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的抗體分子，及其用于分離本發(fā)明的肽的用途。在一個實施方案中，所述抗體分子含有選自SEQ IDNO9和10及SEQ ID NO11和12的VL和VH。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了含有作為活性成分的本發(fā)明的肽或其鹽類及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)生物體細(xì)胞中細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)及免疫應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)的方法，其包括將細(xì)胞暴露于有效量的本發(fā)明的肽、其類似物、衍生物或鹽類。
本發(fā)明的肽可治療的疾病和炎癥病癥包括，但不限制于，阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、創(chuàng)傷后的繼發(fā)性變性、中風(fēng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒、青光眼、黃斑變性、I型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性眼葡萄膜炎、移植物抗宿主病、移植物排斥、關(guān)節(jié)炎、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、炎性腸病(IBD)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、銀屑病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、輻射病、體溫過高、缺氧、暴發(fā)性中毒肝(fulminant toxic liver)、腎衰竭、不育癥及多種其他疾病。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療需要的受治療者的變性性疾病或病癥的方法，其包括施用于所述受治療者治療有效量的本發(fā)明的肽、其類似物、衍生物或鹽類。
在一個實施方案中，所述疾病或病癥是應(yīng)激相關(guān)的變性性疾病。
在另一個實施方案中，所述受治療者患有腫瘤性疾病并經(jīng)歷用于治療癌癥的化療和/或放療。
在另一個實施方案中，所述疾病或病癥選自阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、創(chuàng)傷后的繼發(fā)性變性、中風(fēng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒、青光眼、黃斑變性、心肌梗塞、輻射病、體溫過高、缺氧、暴發(fā)性中毒肝、腎衰竭及不育癥。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療需要的受治療者的炎癥性疾病或病癥的方法，其包括施用于所述受治療者治療有效量的本發(fā)明的肽、其類似物、衍生物或鹽類。
在一個實施方案中，所述疾病或病癥具有與選自IL-6和TNF-α的至少一種前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)的病因。
在另一個實施方案中，所述疾病是自身免疫性疾病。
在其他實施方案中，所述疾病或病癥選自I型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性眼葡萄膜炎、關(guān)節(jié)炎、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、炎性腸病(IBD)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、銀屑病、動脈粥樣硬化、移植物排斥以及移植物抗宿主病。
在一個具體實施方案中，所述疾病是多發(fā)性硬化癥。
在一個實施方案中，在對正常組織或細(xì)胞中的細(xì)胞應(yīng)激紊亂和免疫應(yīng)激紊亂的反應(yīng)中，所述肽抑制細(xì)胞凋亡活性。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的肽在體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)蛋白活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)蛋白活性。
根據(jù)某些實施方案，可通過任何合適給藥途徑將所述肽施用于需要的受治療者，所述合適給藥途徑包括，但不限制于口服、局部、經(jīng)皮膚、胃腸外。
結(jié)合下述附圖、說明書及權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其他實施方案將變得明顯。


圖1使用DNA損傷劑順鉑處理的L12細(xì)胞的DNA含量，用以檢測p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
圖2順鉑(80μM)誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
圖3當(dāng)BALB/c小鼠經(jīng)受6.5Gy劑量的身體輻射時，應(yīng)激素肽對BALB/c小鼠的作用。
圖4應(yīng)激素-1抑制在對脂多糖(LPS)或CpG-寡核苷酸的反應(yīng)中的RAW 264.7巨噬細(xì)胞的TNF-α分泌。
圖5應(yīng)激素-1抑制在對脂多糖(LPS)或CpG-寡核苷酸的反應(yīng)中的RAW 264.7巨噬細(xì)胞的白介素-6分泌。
圖6應(yīng)激素-1在小鼠實驗性自身免疫性疾病(EAE)的發(fā)展中的抑制作用。
圖7PAb-421、Idi-1及Idi-2可變區(qū)的氨基酸序列。對輕鏈或重鏈的互補決定區(qū)(CDR)進行比對。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了組合物和方法，其包括用于抑制對于多種應(yīng)激相關(guān)疾患的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)的肽。本發(fā)明提供了利用單克隆抗DNA抗體識別的肽治療人變性性疾病和炎癥的組合物和方法，所述肽具有抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥活性。
定義如本發(fā)明所使用，術(shù)語“線性肽”是指一種肽或多肽，其中的氨基酸通過在一個氨基酸的α氨基和另一個氨基酸的α羧基之間形成的酰胺鍵互相連接。
如本發(fā)明所使用，“細(xì)胞”是指真核細(xì)胞。典型地，所述細(xì)胞為動物來源，且可為干細(xì)胞或體細(xì)胞。合適的動物細(xì)胞可來源于，例如，哺乳動物和鳥類。哺乳動物細(xì)胞的例子包括人細(xì)胞、牛細(xì)胞、羊細(xì)胞、豬細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、家兔細(xì)胞。所述細(xì)胞可為胚胎細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞或其他祖細(xì)胞。當(dāng)所述細(xì)胞為體細(xì)胞時，其可為，例如，上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血細(xì)胞(包括造血細(xì)胞、紅細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞，等)、心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞(如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞)。
在本發(fā)明上下文中，“調(diào)節(jié)”是指抑制，即減少表達(dá)。這種調(diào)節(jié)可使用本領(lǐng)域常規(guī)方法進行檢測，如通過蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，或通過蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫沉淀測定來進行檢測。
本發(fā)明使用的術(shù)語“治療”包括預(yù)防疾病和治療用途，是指緩解患者特定疾病的癥狀，改進特定疾病相關(guān)的可確定的檢測結(jié)果，或預(yù)防特定免疫反應(yīng)(例如移植排斥)。
抗體，或免疫球蛋白，包括由二硫鍵連接在一起的兩條重鏈及兩條輕鏈，在“Y”形構(gòu)象中，每條輕鏈通過二硫鍵與各重鏈連接?？贵w的蛋白水解消化產(chǎn)生Fv(片段可變)及Fc(片段晶體)區(qū)?？乖Y(jié)合區(qū)，F(xiàn)ab′，包括多肽序列變化的區(qū)域。術(shù)語“F(ab′)2”表示由二硫鍵連接在一起的兩條Fab′臂?？贵w的中心軸被稱為Fc片段。每一條重鏈一端具有可變區(qū)(VH)，其后是多個恒定區(qū)(CH)。每條輕鏈一端具有可變區(qū)(VL)，另一端具有恒定區(qū)(CL)，輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)對齊，輕鏈恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)對齊。
每對輕鏈和重鏈的可變區(qū)形成抗原結(jié)合位點。輕鏈和重鏈上的區(qū)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，每一區(qū)域包括四個框架區(qū)，其序列相對保守，并由三個稱為互補決定區(qū)(CDR1-3)的高變區(qū)連接。這些區(qū)域促成了抗原結(jié)合位點的特異性和親和力。
本發(fā)明使用的術(shù)語“抗體”是指實質(zhì)上由一種免疫球蛋白基因或多種免疫球蛋白基因編碼的多肽配體，或其片段，所述多肽配體或其片段可特異性結(jié)合和識別抗原表位(如抗原)。如本發(fā)明所使用，此術(shù)語是指能夠結(jié)合抗原表位決定簇的完整分子，如多克隆抗體或單克隆抗體(mAb)，重組和工程抗體，以及其片段，例如Fab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)ab微型抗體(見，例如，美國專利5,910,573，美國專利6294353，WO 96/37621，美國專利申請08/999,554)，F(xiàn)v，scFv(如美國專利No.4,946,778、5,091,513和5,096,815)，等等。本發(fā)明使用的抗體可使用完整多肽或含有目的小肽的片段作為免疫抗原而進行制備。用于免疫動物的多肽或寡肽可從RNA翻譯獲得或化學(xué)合成，并且如果需要，可與載體蛋白軛合。與肽化學(xué)偶合的常用載體例如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白及鑰孔蟲戚血蘭素。被偶合的肽然后用于免疫動物(如小鼠、大鼠或家兔)。產(chǎn)生抗體的非限制性方法于下文的實施例中描述；然而，本領(lǐng)域熟知的其他方法可被容易使用。
術(shù)語“抗獨特型抗體”意指針對(換言之，是指“與......發(fā)生免疫反應(yīng)”)另一種抗體的獨特型決定簇的抗體。如本發(fā)明所使用，術(shù)語“獨特型決定簇”是指單克隆的細(xì)胞的免疫球蛋白產(chǎn)物特異的抗原決定簇或抗原表位。獨特型可見于抗體的可變區(qū)。術(shù)語“抗原表位”是指抗體識別的分子上的抗原決定簇。
如本發(fā)明所使用，術(shù)語“可與.....發(fā)生免疫反應(yīng)”是指抗體能夠以提示與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的結(jié)合親和力結(jié)合抗原。所述親和力為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，包括105至1014M-1的親和力。確定抗體組合物的親和力的方法描述于Day，Advanced Immunochemistry，(第二版)Wiley-Liss，New York，N.Y.(1990)。
應(yīng)激素肽根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及含有可與針對抗p53抗體的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原表位的肽，其中所述抗p53抗體可與p53的C末端的至少部分調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明的肽顯示有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性，下文將詳細(xì)描述。
在一個實施方案中，通過具有p53調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)構(gòu)模擬特性的抗獨特型單克隆抗體篩選所述肽。根據(jù)某些實施方案，所述肽可與針對抗p53抗體的單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。在一個具體實施方案中，所述抗p53抗體是PAb-421(Herkel等，2000)。在其他具體實施方案中，所述肽具有p53調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)構(gòu)模擬特性，可與單克隆抗體Idi-1和Idi-2發(fā)生免疫反應(yīng)(Herkel等，2004)。
在其他實施方案中，所述肽可與含有選自SEQ ID NO15和18及SEQID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的抗獨特型抗體分子發(fā)生免疫反應(yīng)。在另一個實施方案中，所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ IDNO13-18和10及SEQ ID NO19-24的CDR序列的分子。在另一個實施方案中，所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL和VH區(qū)的分子。
所述肽可通過本領(lǐng)域已知方法表征和合成。在一個實施方案中，所述肽通過質(zhì)譜分析法表征及通過化學(xué)合成方法合成，如下文所述。
本發(fā)明的肽優(yōu)選具有5至25個氨基酸，更優(yōu)選5至15個氨基酸，最優(yōu)選7至12個氨基酸。
根據(jù)某些具體實施方案，本發(fā)明提供四種所選肽，為應(yīng)激素-1至4(應(yīng)激反應(yīng)特異性肽抑制劑)。本發(fā)明某些肽的氨基酸序列列于表1，為SEQID NO1至SEQ ID NO4。
除非另有說明，本發(fā)明所述氨基酸殘基優(yōu)選為“L”同分異構(gòu)形式。然而，“D”同分異構(gòu)形式的殘基可被任何L氨基酸殘基取代，只要所述肽保留所需功能特性。
在其他具體實施方案中，本發(fā)明提供了SEQ ID NO1至SEQ ID NO4的肽的類似物、片段及功能衍生物，下文將詳細(xì)描述。根據(jù)某些具體實施方案，所述衍生物為具有SEQ ID NO5-8任一所述的氨基酸序列的反向肽。在一個具體實施方案中，所述肽具有SEQ ID NO1、2及5任一所述的氨基酸序列。
先前，證明了單克隆抗體Idi-1和Idi-2可特異性結(jié)合PAb-421和單鏈或雙鏈DNA(本發(fā)明某些發(fā)明人的Herkel等，2000)。本發(fā)明提供了針對含有選自SEQ ID NO9和10及SEQ ID NO11和12的可變區(qū)的PAb-421的抗體分子，及含有選自SEQ ID NO13-18和SEQ ID NO19-24的氨基酸序列的CDR的抗體分子。這些抗體排除已知的名稱為Idi-1和Idi-2的單克隆抗體。
在一個實施方案中，所述抗體分子含有選自SEQ ID NO15和18的VL-CDR3和VH-CDR3序列(分別對應(yīng)于Idi-1的輕鏈互補決定區(qū)3和Idi-1的重鏈互補決定區(qū)3)及SEQ ID NO21和24(Idi-2)的VL-CDR3和VH-CDR3序列。在另一個實施方案中，所述抗體分子含有下文表4所述的CDR序列，其具有選自SEQ ID NO13-18(Idi-1)和SEQ ID NO19-24(Idi-2)的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述抗體分子含有選自SEQID NO9和10(Idi-1)及SEQ ID NO11和12(Idi-2)的VL和VH區(qū)(免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區(qū))。本發(fā)明的抗體分子還包括含有所述VL和VH的類似物和衍生物的分子，只要所述類似物或衍生物可與PAb-421的抗原結(jié)合部分發(fā)生免疫反應(yīng)。
在另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的抗體分子用于分離顯示有選自抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥活性中至少一種活性的肽的用途。利用這些抗體鑒定和分離本發(fā)明的肽的合適方法于下文描述。
噬菌體展示文庫噬菌體展示肽文庫為鑒定所述肽激動劑和拮抗劑的強有力方法。見，例如Scott等，(1990)；Devlin等，(1990)；美國專利No.5,223,409；美國專利No.5,733,731；美國專利No.5,498,530；美國專利No.5,432,018；美國專利No.5,338,665；美國專利No.5,922,545；WO 96/40987；及WO 98/15833。在這些文庫中，通過與絲狀噬菌體的衣殼蛋白融合展示了隨機肽序列。典型地，所展示的肽可針對受體的抗體固定的細(xì)胞外區(qū)而被親和洗脫。所保留的噬菌體可通過親和純化和再生的連續(xù)循環(huán)而富集。最佳的結(jié)合肽可被測序用于鑒定肽的一個或多個結(jié)構(gòu)相關(guān)家族內(nèi)的關(guān)鍵殘基。見，例如Cwirla等，(1997)，其中鑒定了兩個不同的家族。所述肽序列還表明哪些殘基可通過丙氨酸掃描或通過DNA水平的誘變而被安全取代?？蓜?chuàng)建和篩選突變文庫以進一步優(yōu)化最佳連接子的序列(Lowman，1997)。
使用p53調(diào)節(jié)區(qū)的代用抗體從噬菌體展示文庫(來自New EnglandBiolabs，F(xiàn)rankfurt，Germany的Ph.D.-7或Ph.D.-12)篩選和分離本發(fā)明的肽。所述p53代用抗體通過對結(jié)合p53調(diào)節(jié)區(qū)的PAb-421單克隆抗體(Herkel等，2000)進行獨特型免疫而產(chǎn)生；兩種單克隆抗體Idi-1和Idi-2，模擬p53調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)合特性。
對于所選的候選肽通過檢測其抑制L12細(xì)胞系(Wolf，1984)對體溫過高的響應(yīng)而檢測其干擾p53介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的能力，所述L12細(xì)胞系缺乏內(nèi)源性p53活性且被p53基因或?qū)φ蛰d體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在這些細(xì)胞中，在對于體溫過高的響應(yīng)中，p53活性誘導(dǎo)生長停滯和細(xì)胞存活而非細(xì)胞凋亡(Nitta，1997)。
鑒定了四種肽，應(yīng)激素-1至應(yīng)激素-4(應(yīng)激反應(yīng)特異性肽抑制劑)，在體溫過高之后以100μg/ml的濃度抑制了p53介導(dǎo)的生長停滯并誘導(dǎo)幾乎所有具有活性p53的細(xì)胞死亡，此為缺乏p53活性的L12細(xì)胞的反應(yīng)(表1)；所述肽序列示于表2。
鑒定和分離肽的可選方法蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)分析也可用于提出模擬大蛋白配體的結(jié)合活性的肽。在這樣的分析中，晶體結(jié)構(gòu)可提示大蛋白配體的關(guān)鍵殘基的同一性和相對方位，由此而設(shè)計肽(見，例如Takasaki等，1997)。這些分析方法也可用于研究受體蛋白和噬菌體展示所篩選的肽之間的相互作用，此可提出進一步修飾所述肽以增加結(jié)合親和力。
在肽研究中，其他方法與噬菌體展示競爭。肽文庫可與乳糖抑制子的羧基端融合，并在大腸桿菌中表達(dá)。另一種基于大腸桿菌的方法允許通過與肽聚糖相關(guān)的脂蛋白(PAL)融合而展示于細(xì)胞外膜上。在下文中，這些及相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“大腸桿菌展示”。在另一種方法中，隨機RNA的翻譯在核糖體釋放之前終止，導(dǎo)致多肽文庫與其相關(guān)的RNA仍然連接。在下文中，此方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“核糖體展示”。其他方法使用了肽與RNA的化學(xué)鍵，見，例如，Roberts和Szostak(1997)。在下文中，此方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“RNA-肽篩選”。已開發(fā)了化學(xué)衍生的肽文庫，其中所述肽固定于穩(wěn)定、非生物材料上，例如聚乙烯柱或溶劑可滲透的樹脂。另一種化學(xué)衍生的肽文庫使用照相平板印刷術(shù)掃描固定于載玻片上的肽。在下文中，這些方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“化學(xué)-肽掃描”?；瘜W(xué)-肽掃描是有利的，這是因為其允許使用D氨基酸和其他非天然類似物及非肽組分。生物方法和化學(xué)方法在Wells和Lowman(1992)中均有描述。
噬菌體展示在產(chǎn)生用于本發(fā)明的肽中特別有用。已有說明，從隨機肽文庫的親和篩選可用于鑒定任何基因產(chǎn)物的任何位點的肽配體(Dedman等，1993)。噬菌體展示尤其非常適于鑒定可結(jié)合作為細(xì)胞表面受體的所述目的蛋白質(zhì)或具有線性抗原表位的任何蛋白質(zhì)的肽(Wilson等，1998；Kay等，1998)。
本發(fā)明的肽的合成本發(fā)明的肽可通過產(chǎn)生氨基酸序列的任何已知的化學(xué)和重組方法產(chǎn)生，包括肽模擬方法(Allen G.，1989；Young，1963；Meienhofer，1973；Schroder和Lupke，1965)?；瘜W(xué)合成通常通過在液相中以正確順序使氨基酸殘基或肽片段相互偶合而產(chǎn)生所需肽而進行。另一種常用策略是從固相(樹脂)開始使氨基酸相互偶合，序列的最后一個氨基酸C-末端與固相偶合，由此，次末端氨基酸的C-末端與最后一個氨基酸的N-末端偶合，等等，最終從所述固相釋放結(jié)合在一起的肽(被稱為固相技術(shù))。
術(shù)語“肽”是指具有2至25個氨基酸的分子，優(yōu)選具有5至20個氨基酸的分子，最優(yōu)選具有7至12個氨基酸的分子。典型的肽可通過上述的任何方法隨機產(chǎn)生，被肽文庫(如噬菌體展示文庫)攜帶，或通過蛋白的消化獲得。
本發(fā)明包括含有本發(fā)明的肽的任何類似物、衍生物及軛合物，其氨基酸序列示于本發(fā)明，只要所述肽能抑制細(xì)胞凋亡和/或炎癥。因此，本發(fā)明包括含有非天然氨基酸衍生物或非蛋白側(cè)鏈的肽。
術(shù)語“類似物”包括具有與特別示于本發(fā)明的序列中的一種基本相同的氨基酸序列的任何肽或多肽，其中一個或多個殘基被功能上相似的殘基保守地取代，且所述序列展示了如本發(fā)明所述的能力。保守性取代的例子包括一個非極性(疏水)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個非極性(疏水)殘基，一個極性(親水)殘基取代另一個極性(親水)殘基，例如精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酰胺和天門冬酰胺之間，甘氨酸和絲氨酸之間，一個堿性殘基如賴氨酸、精氨酸或組氨酸取代另一個堿性殘基，或一個酸性殘基如天門冬氨酸或谷氨酸取代另一個酸性殘基。
肽衍生物是指含有本發(fā)明主題肽的各種變化的氨基酸序列的分子，所述變化包括，但不限于，化學(xué)修飾、取代、插入、延伸及缺失，其中這些變化不會破壞所述肽的抗炎癥或抗細(xì)胞凋亡活性，并且這樣的衍生物不是已知的肽或蛋白質(zhì)?！半难苌铩币庠诎哪M物，如下文所述。在這方面，本發(fā)明的肽對應(yīng)于表1中所列的一種肽，且優(yōu)選與表1中所列的一種肽相同，其中進行了一種或多種變化，只要在一種或多種如本發(fā)明定義的測定方法中，所述多肽能夠保留本發(fā)明的肽的抑制功能。至于本發(fā)明的抗體分子，可變區(qū)衍生物保留特異性結(jié)合(即可與.....發(fā)生免疫反應(yīng))PAb-421的獨特型決定簇的能力。
具有化學(xué)修飾的肽衍生物包括，例如，具有通過側(cè)鏈或功能基團的反應(yīng)化學(xué)衍生的一個或多個殘基的肽。這些衍生的分子包括，例如，其中自由氨基被衍生形成氫氯化胺、對甲苯磺酰基、芐酯基、叔丁氧羰基、氯乙?；蚣柞；?。自由羧基可被衍生形成鹽類、甲基酯或乙基酯或其他類型酯類或酰肼。自由羥基可被衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-亞氨基苯甲基組氨酸。還包括作為化學(xué)衍生物的那些含有20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸殘基的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羥脯氨酸可取代脯氨酸；5-羥賴氨酸可取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸；鳥氨酸可取代賴氨酸。
另外，通過化學(xué)修飾，肽衍生物可不同于本發(fā)明的肽的天然序列，所述化學(xué)修飾包括，但不限于，末端NH2酰化，乙?；驇€乙酸酰胺化，及如使用銨、甲胺的末端羧基酰胺化，等。
本發(fā)明的肽還包括具有與本發(fā)明的肽序列相關(guān)的殘基的一種或多種添加和/缺失的任何肽，其序列示于本發(fā)明，只要對細(xì)胞凋亡和/或炎癥的必需抑制活性被保留。術(shù)語“活性片段”因此是指本發(fā)明全長的應(yīng)激素肽的肽部分，其具有相應(yīng)的全長肽特征性活性的至少一種。檢測細(xì)胞凋亡和炎癥的抑制的合適方法的非限制性例子示于本發(fā)明。
氨基酸殘基的添加可在本發(fā)明的肽的任何末端進行，以提供一種“連接子”，通過該“連接子”，本發(fā)明的肽可方便與載體結(jié)合。所述連接子通常具有一個氨基酸殘基，并可為40個或更多殘基，更常見為1至10個殘基。用于連接的典型氨基酸殘基為酪氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸及天門冬氨酸等。
本發(fā)明的肽也可自身共軛或聚集，以產(chǎn)生含有所述肽的巨大復(fù)合體。所述巨大復(fù)合體是有利的，這是因為其具有新的生物特性，如較長的循環(huán)半衰期或更大的活性。
肽模擬物肽模擬物為可通過模擬肽和蛋白質(zhì)的某些結(jié)構(gòu)方面而結(jié)合蛋白質(zhì)的小分子。它們作為細(xì)胞的受體和其他受體的蛋白質(zhì)和肽配體的激動劑和拮抗劑及作為酶的底物和底物類似物廣泛用于科學(xué)和醫(yī)學(xué)。
肽模擬物設(shè)計中的基本目標(biāo)是減小模擬物對于肽酶導(dǎo)致的裂解和失活的敏感性。在一種方法中，以基本同型空間配位的方式由多種化學(xué)功能基團取代一個或多個酰胺鍵，所述多種化學(xué)功能基團包括，但不限于脲鍵、氨基甲酸酯鍵、磺胺鍵、聯(lián)氨鍵或任何其他共價鍵。在另一種方法中，多種非編碼或修飾的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸用于修飾哺乳動物肽。
通過使BALB/c小鼠經(jīng)受全身γ輻射(6.5Gy)，來檢測應(yīng)激素肽是否可以保護生物體免于過度的p53活化和組織衰竭而導(dǎo)致的死亡。反向肽用于測定延長的體內(nèi)半衰期是否會有利(見實施例6)；反向肽對蛋白酶具有抵抗力，且由反序D氨基酸組成，導(dǎo)致肽骨架改變，但側(cè)鏈方向不變(VanRegenmortel，1998)。
如本發(fā)明所使用，例如，術(shù)語應(yīng)激素-1肽的“反向肽”，如在本發(fā)明中變化使用，意在包括其中氨基酸序列與應(yīng)激素-1的序列相比為反向且由反序D氨基酸組成的肽。
本發(fā)明因此提供具有SEQ ID NO5-8中任一所述的氨基酸序列的反向應(yīng)激素肽。
骨架可包括多種原子類型，包括碳、氮、氧、硫及磷，大多數(shù)骨架原子通常由碳組成。包括末端胍基或脒基的多個側(cè)鏈部分與骨架連接。盡管鄰近的側(cè)鏈部分之間的間距通常恒定，本發(fā)明所使用的增強遞送的運輸體也可包括沿骨架的側(cè)鏈部分之間的可變間距。
細(xì)胞死亡和p53抑制細(xì)胞凋亡，或“程序性細(xì)胞死亡”，是一種借此細(xì)胞執(zhí)行“細(xì)胞自殺”程序的過程。目前，認(rèn)為細(xì)胞凋亡程序在幾乎所有多細(xì)胞生物體中及在特定生物體的幾乎所有細(xì)胞中為進化性保守。另外，認(rèn)為在許多情況下，細(xì)胞凋亡可為必須在健康存活細(xì)胞中被主動抑制的“缺省”程序。
使細(xì)胞經(jīng)受細(xì)胞凋亡的判斷受多種調(diào)節(jié)刺激和環(huán)境因素影響(Thompson，1995)。細(xì)胞凋亡的生理活化因素包括腫瘤壞死因子(TNF)、Fas配體、轉(zhuǎn)化生長因子-β、神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、多巴胺、N-甲基-D-天門冬氨酸，生長因子的撤退、基質(zhì)連接的喪失、鈣和糖皮質(zhì)激素。細(xì)胞凋亡的與損傷相關(guān)的誘導(dǎo)因素包括熱激、病毒感染、細(xì)菌毒素、致癌基因myc、rel和E1A、腫瘤抑制基因p53、溶細(xì)胞的T細(xì)胞、氧化劑、自由基和營養(yǎng)缺乏(抗代謝物)。治療相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因素包括γ輻射、紫外線輻射和多種化療藥物，包括順鉑、阿霉素、博萊霉素、阿糖胞苷、氮芥、甲氨喋呤和長春新堿。與毒素相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因素包括乙醇和右旋淀粉狀肽。細(xì)胞凋亡當(dāng)在正常情況下不再生的細(xì)胞如神經(jīng)元中病理性發(fā)生時，可特別具有破壞性后果。因為當(dāng)這些細(xì)胞死亡時不能夠被取代，其喪失可導(dǎo)致受影響的器官虛弱并且有時導(dǎo)致其致命性的機能障礙。這種機能障礙在多種與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)的神經(jīng)變性性疾病中得到證明，所述神經(jīng)變性性疾病包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎及小腦變性。
在一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或抑制真核細(xì)胞細(xì)胞凋亡的組合物和方法。不考慮本發(fā)明的肽介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的機制，且不希望受限于任何理論或作用機理，假定所述肽能夠結(jié)合p53，由此防止p53與損傷的DNA結(jié)合。
p53的潛在治療抑制劑是一種在p53信號傳導(dǎo)途徑的任何階段起作用并導(dǎo)致p53介導(dǎo)的反應(yīng)功能失活(即，阻斷p53依賴性成長停滯、細(xì)胞凋亡，或兩者均有)的化合物。先前的研究人員未考慮到治療性p53抑制劑，因為他們認(rèn)為治療性p53抑制是導(dǎo)致癌性腫瘤發(fā)病和增殖的不利因素。因此，本發(fā)明涉及p53活性的治療抑制和可逆性抑制，并涉及能夠進行這種抑制的肽。
然而，在實施與在細(xì)胞凋亡或炎癥相關(guān)疾病中起作用的p53或任何其他蛋白質(zhì)的抑制有關(guān)的治療之前，應(yīng)該提到幾個目標(biāo)，例如a)提供在體內(nèi)作為治療性藥物用于實踐性給藥充分有效的抑制劑；
b)提供一種具有充分低毒性用于治療且在足夠抑制p53活性的濃度不會引起不希望的副作用的抑制劑；c)表現(xiàn)可逆的抑制作用。例如，長期p53失活可顯著增加癌癥風(fēng)險；d)在臨時的p53失活期間，細(xì)胞應(yīng)從施加的應(yīng)激恢復(fù)，并且p53活化的信號應(yīng)被消除或減輕，否則當(dāng)p53活化的信號有活性時，p53活性的恢復(fù)可導(dǎo)致細(xì)胞損傷；e)p53抑制治療與癌癥發(fā)展頻率的顯著增加無關(guān)。
在癌癥治療過程中，本發(fā)明的肽可單獨使用，或，例如，與化療或放療一起使用，以保護正常細(xì)胞免受由于癌癥治療或疾病或創(chuàng)傷施予的應(yīng)激而引起的p53程序性死亡。另外，在化療過程中，腫瘤和正常細(xì)胞均被破壞。腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞優(yōu)先被殺死，這是成功化療的基礎(chǔ)。例如，通過給予治療性p53抑制劑，正常細(xì)胞受到保護，并且化學(xué)治療劑的劑量因此可被增加以更有效治療癌癥。
應(yīng)該理解，因為在p53缺陷細(xì)胞系及p53活性測定中，這些肽中的有些表現(xiàn)有抗細(xì)胞凋亡活性，本發(fā)明的肽不一定通過調(diào)節(jié)p53活性起作用。
檢測細(xì)胞凋亡的方法細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種主動、基因介導(dǎo)的自毀過程，且與特征性形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化相關(guān)。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)濃縮和瀕死細(xì)胞碎裂成膜結(jié)合的細(xì)胞凋亡小體是細(xì)胞凋亡的典型特征。凋亡細(xì)胞死亡的其他特點是在特異性核酸酶活化之后染色體DNA降解為寡核苷酸片段。
“抑制細(xì)胞凋亡”或“抑制細(xì)胞凋亡活性”是指與未處理的對照(即未暴露于本發(fā)明的肽的細(xì)胞)相比經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)量的任何減少。優(yōu)選減少至少25％，更優(yōu)選減少至少50％，最優(yōu)選減少至少一倍。
流式細(xì)胞計量術(shù)提供了檢測細(xì)胞凋亡的多種可能性。已建立和實施不同方法，其中某些在細(xì)胞表面染色，某些在細(xì)胞內(nèi)染色。
第一種方法其中之一除了觀察到凋亡細(xì)胞萎縮和具有較高的細(xì)胞內(nèi)粒度，使用DNA特異的熒光色素染色(如碘化丙錠[PI]、溴化乙錠[EtBr])。一旦致死性攻擊被誘導(dǎo)，DNA就開始改變其圖譜。細(xì)胞凋亡的DNA不僅包括斷裂的DNA(在瓊脂糖凝膠中觀察到較短的條帶，被稱為DNA梯型)，且還部分被消化成單核苷酸，以致熒光色素，如PI或EtBr著染較少的DNA(Nicoletti等，1991)。這通常通過FACScanTM(來自Becton Dickinson，USA)的特異性熒光色素檢測通道的左移(被稱為亞-G1峰)而觀察到。
另一種方法是末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的DNA鏈斷裂(TUNEL)的末端標(biāo)記。TUNEL方法檢測經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞中的DNA鏈斷裂。TdT是一種催化脫氧核糖核酸三磷酸添加至雙鏈或單鏈DNA的3′-OH末端的酶。不同于正常細(xì)胞，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核在TdT存在下?lián)饺胪庠葱院塑账?dUTP)-DIG。帶有軛合的熒光色素的抗DIG抗體片段使得能夠觀察到凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞增加產(chǎn)生較高數(shù)量的DNA片段，并因此具有較明亮的熒光。這個方法的優(yōu)點是具有非常高的特異性(Gavrieli等，1992)。這個方法的缺點是，費用昂貴，且因為時間密集，僅可用于小組樣品。因此，它不適用于大的篩選程序。
在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜極性的喪失和增加量的磷脂酰絲氨酸(PS)于細(xì)胞膜外的呈遞導(dǎo)致產(chǎn)生一種新方法。膜聯(lián)蛋白V是一種對于PS具有高親和力的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白。在細(xì)胞凋亡的早期和間期，維持了細(xì)胞膜完整性。早期和間期的凋亡細(xì)胞顯示膜聯(lián)蛋白-FITC的結(jié)合增加，并對于PI染色主要為陰性。因為PS呈遞于表面及由于膜的分解細(xì)胞內(nèi)核酸的PI染色，細(xì)胞凋亡晚期和壞死的細(xì)胞成為雙陽性。這種方法也是費用昂貴和勞動密集。
檢測體內(nèi)和體外細(xì)胞凋亡的其他方法在美國專利No.6,726,895和6,723,567中揭露。
炎癥應(yīng)激反應(yīng)和TNF-α和IL-6介導(dǎo)的炎癥哺乳動物的應(yīng)激反應(yīng)不僅包括應(yīng)激細(xì)胞的反應(yīng)，而且包括已知為炎癥的免疫系統(tǒng)的復(fù)雜活動(Nathan等，2002)，其包括大量用于組織維護和愈合的免疫活動(Cohen，2000)。
腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-6(IL-6)是重要生物實體，被統(tǒng)稱為炎癥前細(xì)胞因子。這些分子與幾種其他相關(guān)分子一起介導(dǎo)與感染原的免疫識別相關(guān)的炎癥反應(yīng)。所述炎癥反應(yīng)在限制和控制病原性感染中起到重要作用。
炎癥前細(xì)胞因子的水平提高還與許多自身免疫性疾病有關(guān)，如中毒性休克綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病和炎性腸病(Dinarello等，1984)。在這些疾病中，炎癥的慢性加重加劇或?qū)е略S多可觀察到的病理生理。
在這些疾病中，一種用于潛在藥物干涉的重要和可接受的治療方法為減少炎癥前細(xì)胞因子如TNF(其分泌的無細(xì)胞形式也被稱為TNF-α)和IL-6。目前，在臨床試驗中使用許多抗細(xì)胞因子治療。已證明，在許多自身免疫性疾病中，使用針對TNF-α的單克隆抗體具有功效(Heath，1997)。這些治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病(Crohn′s disease)和潰瘍性結(jié)腸炎(Rankin，1997，和Stack等，1997)的治療。認(rèn)為所述單克隆抗體通過與可溶的TNF-α和膜結(jié)合TNF結(jié)合起作用。
創(chuàng)傷性腦損傷觸發(fā)級聯(lián)事件，導(dǎo)致延遲性水腫、壞死及功能受損。損傷后有害介體在腦中積累，最近，認(rèn)為細(xì)胞因子在腦損傷的病理生理起作用。先前有報道，在閉合性顱腦損傷之后大鼠腦中TNF-α和IL-6活性的空間性和短暫誘導(dǎo)。TNF-α的抑制劑，HU-211，顯示改善實驗?zāi)Ｐ偷拈]合性顱腦損傷的結(jié)果(Shohami等，1997)。已知動脈粥樣硬化具有炎性組分起作用，并認(rèn)為細(xì)胞因子例如IL-1和TNF可促進該疾病。
炎癥前細(xì)胞因子IL-6與急性期反應(yīng)有關(guān)。IL-6是多種腫瘤疾病包括多發(fā)性骨髓瘤和相關(guān)的漿細(xì)胞不調(diào)癥的生長因子(Treon等，1998年)。IL-6還顯示是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的重要的炎癥介體。發(fā)現(xiàn)IL-6在一些神經(jīng)疾病中水平提高，所述神經(jīng)疾病包括愛滋病癡呆綜合癥、阿耳茨海默氏病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、CNS損傷及病毒性和細(xì)菌性腦膜炎(Gruol等，1997)。IL-6還在骨質(zhì)疏松癥中起重要作用。在鼠模型中，IL-6顯示可影響骨吸收并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活性(Ershler等，1997)。
WO 01/01986揭露了具有抑制TNF-α能力的特殊化合物。WO98/52558揭露了在治療細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病中有用的異芳基脲化合物。WO 99/23091揭露了作為抗炎劑有用的另一種脲化合物。WO 99/32463涉及芳基脲及其在治療細(xì)胞因子疾病和蛋白水解酶介導(dǎo)的疾病的用途。
本發(fā)明表明，對先天性活化劑如脂多糖(LPS)和CpG寡核苷酸(見實施例7)的反應(yīng)中，應(yīng)激素肽可用于干涉和阻斷巨噬細(xì)胞的TNF-α和IL-6分泌。因此，這些肽能改變免疫細(xì)胞的炎癥前信號傳導(dǎo)通道。如下文對于應(yīng)激素-1所述，本發(fā)明的肽在下調(diào)對應(yīng)激的炎癥免疫反應(yīng)中起作用。
本發(fā)明還證明了應(yīng)激素肽對自身免疫性疾病的抗炎特性，所述自身免疫性疾病如實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、人多發(fā)性硬化癥動物模型(見實施例8)。
藥物組合物及其治療用途在另一方面，本發(fā)明涉及含有治療有效量的本發(fā)明的肽和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
如本發(fā)明使用的“藥物組合物”是指本發(fā)明所述一種或多種藥劑或其生理學(xué)上可接受的鹽類或溶劑與其他化學(xué)組分如生理學(xué)上可接受的載體和賦形劑的一種制劑。藥物組合物的目的是便于將化合物給予生物體。
含有肽或多肽作為活性成分的藥物組合物制劑為本領(lǐng)域熟知。典型地，所述組合物可制備成液體溶液或懸浮液，然而，也可制備成固體形式，所述固體形式可于注射前懸浮或溶解。所述制劑也可被乳化?；钚运幬锍煞挚膳c藥學(xué)上可接受的及與所述活性成分相容的無機和/或有機載體混合。載體為含有或多或少惰性物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的賦形劑(運輸體)，所述載體當(dāng)被添加至藥物組合物時，可提供合適的一致性或形成所述組合物。合適的載體例如水、鹽、右旋糖、丙三醇、乙醇等及其組合形式。另外，如果需要，所述組合物可含有提高所述活性成分效果的較小量的輔助物質(zhì)例如增濕劑或乳化劑和pH緩沖劑。
本發(fā)明所述肽的毒性和治療功效可通過于細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游锏臉?biāo)準(zhǔn)藥物操作方法測定，如通過測定主題化合物的IC50(提供50％抑制的濃度)和LD50(引起實驗動物50％死亡的致死劑量)。從這些細(xì)胞培養(yǎng)物分析和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于形成用于人類的劑量范圍。所述劑量根據(jù)所使用的劑型和給藥途徑而不同。準(zhǔn)確的制劑、給藥途徑及劑量可由醫(yī)師根據(jù)患者的病情而選擇(見，例如，F(xiàn)ingl等，1975)。
用于本發(fā)明的組合物給藥的活性劑的量為可有效實現(xiàn)特定活性劑用于目標(biāo)適應(yīng)癥的目的的量。所述組合物中活性劑的量通常為藥學(xué)、生物學(xué)、治療學(xué)或化學(xué)上有效的量。然而，所述量少于所述組合物以劑量單位形式使用時的量，因為劑量單位形式在單組合物中可含有大量化合物或活性劑，或可分別含有藥學(xué)、生物學(xué)、治療學(xué)或化學(xué)上有效的量?？傆行Я靠扇缓笠院锌傮w上有效量的活性劑的累積單位給藥。
本發(fā)明的肽的治療有效量是當(dāng)施用于患者時能夠發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡活性和/或抗炎癥活性的量。檢測本發(fā)明的肽的抗細(xì)胞凋亡活性的測定方法包括，但不限于使用特異性熒光色素如碘化丙錠及溴化乙錠進行DNA染色，膜聯(lián)蛋白V測定、TUNEL測定等等；這些測定方法的某些非限制性例子在下述實施例中提供。檢測本發(fā)明的肽的抗炎癥活性的測定方法也為本領(lǐng)域熟知；這些方法的非限制性例子在下述實施例中提供。
盡管根據(jù)給藥途徑、患者的年齡、體重、性別或病情，本發(fā)明的肽的合適劑量可不同，并且最終應(yīng)由醫(yī)師確定，適于成人的劑量通常為約0.2-2000mg/kg體重，優(yōu)選約2-200mg/kg。
本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的一種或多種化合物，及一種或多種賦形劑或稀釋劑。在一個實施方案中，為一種或多種所述化合物，或這些化合物的溶劑化物或鹽。
本發(fā)明使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指對活生物體基本無毒性的鹽。典型的藥學(xué)上可接受的鹽包括那些由本發(fā)明的化合物與藥學(xué)上可接受的無機酸或有機酸反應(yīng)而制備的鹽。所述鹽類也稱為酸加成鹽。
含有所述化合物和活性劑的組合物可用于將所述活性劑遞送至所選生物系統(tǒng)及與不使用遞送劑(delivery agent)情況下活性劑的給藥相比可增加或改進所述活性劑的生物利用度?？赏ㄟ^在一定時間段遞送較多活性劑或在特定時間段(如產(chǎn)生較快或延遲遞送)或一定時間段(如持續(xù))遞送活性劑而改進遞送。
根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物因此可以傳統(tǒng)方法配制，所述傳統(tǒng)方法使用一種或多種含有賦形劑和輔料的生理學(xué)上可接受的載體，所述載體可促進所述活性化合物加工至可藥用的制劑中。合適的制劑取決于所選的給藥途徑。
所述藥物組合物可通過任何傳統(tǒng)和合適的途徑局部或全身給藥，包括，但不限于口服、腹膜內(nèi)、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下，經(jīng)皮膚、鞘內(nèi)、局部、直腸、口腔、吸入或鼻內(nèi)。
對于注射，本發(fā)明的化合物可使用水溶液配制，優(yōu)選使用生理相容緩沖液如漢克氏溶液(Hank′s solution)、林格氏溶液(Ringer′s solution)或生理鹽水緩沖液配制。對于跨膜給藥，可穿過屏障的合適滲透劑可用于所述制劑。所述滲透劑例如DMSO或聚乙二醇為本領(lǐng)域公知。
可口服使用的藥物組合物，包括明膠制成的推合式膠囊及由明膠和增塑劑如丙三醇或山梨糖醇制成的軟密封膠囊。推合式膠囊可在與充填劑如乳糖、粘合劑如淀粉、潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂以及任選穩(wěn)定劑的混合物中包含活性劑。
在軟膠囊中，所述活性化合物可溶于或懸浮于合適溶液中，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，還可添加穩(wěn)定劑。所有用于口服給藥的制劑應(yīng)使用適于所選給藥途徑的劑量。
可選地，本發(fā)明的化合物可摻入口服液體制劑如含水或含油懸浮液、溶液、乳狀液、糖漿或酏劑。另外，含有這些化合物的制劑可作為干制品提供，在使用前與水或其他合適載體混合。這些液體制劑可含有類似懸浮劑的傳統(tǒng)添加劑，如山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁膠及被氫化的食用脂；乳化劑，例如卵磷脂、山梨糖醇單油酸酯、或阿拉伯膠；非水載體(可包括食用油)，如杏仁油、分餾椰子油、油酯類、丙二醇及乙醇；以及防腐劑，例如甲基或丙基對羥苯甲酸酯和山梨酸。
對于吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明所使用的肽使用合適的噴射劑以從加壓的包裝或噴霧器的噴霧劑形式提供，所述噴射劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。至于加壓噴霧劑，劑量單位可通過提供閥以遞送計量量而確定。用于吸入器或吹入器的如明膠的膠囊和藥筒可被配制成含有所述肽和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本發(fā)明的藥物組合物還可用于局部及內(nèi)部損害的應(yīng)用。如本發(fā)明所使用，術(shù)語“局部”是指“屬于特定的表面”，如皮膚和粘膜，用于所述表面的某些區(qū)域的局部藥劑只會影響應(yīng)用的區(qū)域。所述肽/肽類似物的制劑可作為凝膠、軟膏、乳膏、乳劑、包括透皮貼的持續(xù)釋放制劑，且可含有脂質(zhì)體和適于藥物局部給藥的任何其他藥學(xué)上可接受的載體。所述藥物組合物還可含有合適的固體膠相載體或賦形劑。所述載體或賦形劑的例子包括，但不限于，碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)生物體細(xì)胞中細(xì)胞和免疫應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)的方法，其包括將細(xì)胞暴露于有效量的本發(fā)明的肽。
在其他方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防炎性疾病和/或變性性疾病和病癥的方法，包括施用于患有所述疾病的患者治療有效量的本發(fā)明的肽。本發(fā)明的又一方面提供一種減輕或消除因創(chuàng)傷或疾病導(dǎo)致的正常細(xì)胞死亡的方法，其包括施用于生物體治療有效量的本發(fā)明的肽以抑制應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)活性。
在某些實施方案中，所述肽是含有有效量的所述肽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物形式。
應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)與下述疾病和病癥有關(guān)，包括，例如，病理性疾病例如神經(jīng)變性性疾病(如中風(fēng)、帕金森氏病及阿耳茨海默氏病)、心肌梗塞、暴露于輻射或化療劑、炎癥、損傷(如燒傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷)、細(xì)胞老化、體溫過高、癲癇發(fā)作、缺氧(如局部缺血和中風(fēng))，以及在移植前見于移植組織和器官中。
這些病癥還包括自身免疫性疾病，其特征為針對至少一種機體正常成分的個體的免疫狀態(tài)。這些現(xiàn)象特別見于下述病理狀態(tài)，包括，但不限于與系統(tǒng)性紅斑狼瘡病(SLE)、古-斯二氏綜合征(或斯耶格倫氏綜合征)及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的感染，及下述病理狀態(tài)，如肉狀瘤病和骨量減少、脊椎關(guān)節(jié)炎、硬皮病、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、甲狀腺機能亢進、阿狄森氏病(Addison′s disease)、自身免疫性溶血性貧血、克隆氏病、Goddpasture氏綜合征、格雷夫斯氏病(Graves′disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroIditis)、原發(fā)性紫癜(purpura)出血、胰島素依賴性糖尿病、肌無力、尋常天皰瘡、惡性貧血、有害貧血癥、鏈球菌感染后腎小球腎炎、銀屑病和自發(fā)性不育癥，以及在移植物排斥和移植物抗宿主病中可見的立即或延遲的現(xiàn)象。在一具體實施方案中，本發(fā)明的肽可用于治療多發(fā)性硬化癥，如本發(fā)明實施例8中所述。
移植物排斥是一種個體針對有意植入患者的外源成分(體液例如血液、腦脊髓液等，細(xì)胞、組織、器官、抗體等)的免疫狀態(tài)。
如本發(fā)明所使用，術(shù)語“變性性疾患”、“變性性疾病”、“變性性病癥”是指具有下述特征的任何疾患、疾病或病癥即不適當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖或不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡或在某些情況下兩者均有，或異?；蚴д{(diào)的細(xì)胞凋亡。這些病癥還包括下述病癥即其中過度的細(xì)胞凋亡盡管在單細(xì)胞水平適當(dāng)或受調(diào)，其與器官機能障礙或衰竭有關(guān)。
在一個實施方案中，所述肽可用于預(yù)防患有腫瘤性疾病并經(jīng)受用于治療癌癥的化療和/或放療的患者的非惡性組織或細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
如本發(fā)明所使用，術(shù)語“炎性疾病”和“炎性病癥”是指過度或失調(diào)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致過度的炎癥癥狀、宿主組織損傷或組織功能喪失的任何疾病或病癥。
在一個實施方案中，所述炎性疾病或炎性病癥是自身免疫性疾病。在一具體實施方案中，自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
在另一個實施方案中，炎性疾病或炎性病癥具有與本發(fā)明所述的選自IL-6和TNF-α的至少一種炎癥前細(xì)胞因子有關(guān)的病因。
下述實施例被認(rèn)為僅作為說明性而實質(zhì)上非限制性。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不背離本發(fā)明范圍的情況下，可對本發(fā)明進行許多修改、變換及變化。
實施例實施例1自噬菌體展示文庫的肽篩選單克隆抗PAb-421抗體Idi-1和Idi-2如資料所述而產(chǎn)生和表征(Herkel等，2004)。簡言之，使用PAb-421免疫BALB/c小鼠三次，并將產(chǎn)生最高的抗PAb-421滴度的小鼠的脾臟細(xì)胞與NSO骨髓瘤細(xì)胞融合。通過ELISA篩選生長細(xì)胞的上清液用于與PAb-421和DNA的結(jié)合。通過有限稀釋分離和克隆雜交瘤Idi-1和Idi-2。
根據(jù)制造廠家的說明書篩選來自New England Biolabs，F(xiàn)rankfurt，Germany的Ph.D.-7或Ph.D.-12文庫。簡言之，通過Idi-1或Idi-2單克隆抗體進行三輪篩選，并通過噬菌體DNA測序鑒定共有肽序列。然后通過Sigma-Genosis(Pampisford，UK)合成候選肽，并進一步使用功能分析進行研究，如下文所述。
實施例2候選肽對p53介導(dǎo)的生長停滯的作用的檢測對于所選的候選肽通過檢測其抑制L12細(xì)胞系對體溫過高的反應(yīng)的能力檢測其干涉p53介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的能力(Wolf，1984)，所述L12細(xì)胞系缺乏內(nèi)源性p53活性并已使用p53基因或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染。在這些細(xì)胞中，在對于體溫過高的反應(yīng)中，p53活性誘導(dǎo)生長停滯和細(xì)胞存活而非細(xì)胞凋亡(Nitta，1997)。
通過使用活體染料臺盼藍(lán)(Sigma)對細(xì)胞進行染色并使用光學(xué)顯微鏡計數(shù)每視野的死亡/存活細(xì)胞比例。
結(jié)果在42℃培育2個小時誘導(dǎo)所有缺乏p53的細(xì)胞死亡，相比之下，具有活性p53的細(xì)胞瞬時生長停滯及約80％的細(xì)胞存活。對四種肽，應(yīng)激素-1到應(yīng)激素-4(為應(yīng)激反應(yīng)特異性肽抑制劑)進行了鑒定，在100μg/ml的濃度抑制體溫過高之后的p53介導(dǎo)的成長停滯，并誘導(dǎo)幾乎所有具有活性p53的細(xì)胞死亡，此為缺乏p53活性的L12細(xì)胞的反應(yīng)(表1)；肽序列示于表2。
表1有或無活性p53的L12細(xì)胞體溫過高誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的發(fā)生率，及應(yīng)激素肽對p53依賴性應(yīng)激反應(yīng)的抑制

表2改變細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的應(yīng)激素肽的氨基酸序列

實施例3應(yīng)激素肽對于由DNA損傷誘導(dǎo)的p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的作用使用50μM DNA損傷劑順鉑處理L12細(xì)胞48小時，通過使用碘化丙錠染色檢測細(xì)胞的DNA含量來測定p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖1)。在不存在肽的情況下培育的細(xì)胞對順鉑處理的反應(yīng)為p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
結(jié)果FACS(熒光激活細(xì)胞分類術(shù))分析表明，使用應(yīng)激素-1或應(yīng)激素-2處理分別解救了35％或25％的細(xì)胞免于p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
實施例4在非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中應(yīng)激素肽對p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的作用如實施例3所述，在存在或不存在應(yīng)激素-1肽的情況下，使用80μM順鉑處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，通過摻入活體染料中性紅(Sigma，Taufkirchen，Germany)評估細(xì)胞死亡，在ELISA讀板機中讀取在540nm的光密度。
存活細(xì)胞的百分率在圖2A中提供；通過下述方程式計算存活率細(xì)胞存活率＝樣品OD540×100/未處理細(xì)胞的OD540。
處理的細(xì)胞的顯微攝影提供于圖2B。
圖2顯示了應(yīng)激素-1抑制使用在50μM濃度具有最大功效的劑量依賴性方法由80μM順鉑誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞死亡。
實施例5應(yīng)激素肽對中毒性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的作用為了解應(yīng)激素肽是否可保護免受中毒性應(yīng)激，使用或不使用0.6％濃度的乙醇，及使用或不使用50μM應(yīng)激素-1培育原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物。48小時之后，通過臺盼藍(lán)排除法來確定死細(xì)胞和活細(xì)胞的數(shù)量(表3)。
結(jié)果在無應(yīng)激素-1存在下，所有暴露于乙醇的肝細(xì)胞死亡；相比之下，應(yīng)激素-1解救了20％的肝細(xì)胞免于乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
表3應(yīng)激素-1肽促進暴露于致死劑量乙醇的肝細(xì)胞的存活

實施6應(yīng)激素肽對經(jīng)受γ-輻射的小鼠的作用使BALB/c小鼠經(jīng)受全身γ-輻射(6.5Gy)。在輻射1小時之后，小鼠腹膜內(nèi)接受應(yīng)激素-1(n＝7；SEQ ID NO1)或修飾的反向應(yīng)激素-1肽(n＝7；SEQ ID NO5)(兩種處理均使用500μg/小鼠的濃度)，或使用鹽水假注射(n＝6)。反向肽用于確定是否延長的體內(nèi)半衰期具有優(yōu)點。
結(jié)果在17天之后，假處理組中66％死亡；相比之下，使用應(yīng)激素-1肽處理的小鼠無死亡，使用修飾的應(yīng)激素-1肽處理的小鼠僅29％死亡。40天之后，假處理組中僅33％從輻射疾病恢復(fù)；相比之下，使用修飾的或未修飾的應(yīng)激素-1肽處理的小鼠中有57％和86％從輻射疾病恢復(fù)(圖3)。
實施例7應(yīng)激素肽對LPS和CpG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌的作用為了解應(yīng)激素肽是否改變對于應(yīng)激信號的炎癥反應(yīng)，研究了RAW264.7巨噬細(xì)胞系細(xì)胞對炎癥前微生物信號——脂多糖(LPS)及CpG寡聚核苷酸的反應(yīng)。在存在或不存在應(yīng)激素-1(50μM)的情況下，使用LPS或CpG寡聚核苷酸培育細(xì)胞。6小時之后，通過特異性ELISA試劑和抗TNF-α及抗IL-6抗體(R&D Systems，Wiesbaden，Germany)測定培養(yǎng)上清液中的分泌的TNF-α(圖4)或IL-6(圖5)的量，以測量巨噬細(xì)胞活化。
結(jié)果應(yīng)激素-1抑制巨噬細(xì)胞活化和LPS和CpG寡聚核苷酸誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的分泌。
實施例8應(yīng)激素-1保護小鼠免于遭受實驗性自身免疫性疾病(EAE)使用溶于完全福氏佐劑的200μg修飾的(Y在位置4)Acl-9肽皮下免疫MBP Acl-9特異性T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因Tg4小鼠(Liu等，1995)，然后在第二天腹膜下給予200ng百日咳毒素。在MBP免疫之后1小時，一組小鼠(n＝4)腹膜內(nèi)接受100μl PBS，另一組小鼠(n＝6)腹膜內(nèi)接受溶于100μl PBS的500μg應(yīng)激素-1肽。然后，通過評估臨床的實驗性自身免疫性疾病(EAE)分?jǐn)?shù)來檢測EAE的發(fā)展。如于圖6可見，應(yīng)激素-1保護小鼠免于EAE。
實施例9Idi-1和Idi-2可變區(qū)的測序使用TriReagent(Molecular Research Center，INC.)從Idi-1和Idi-2雜交瘤提取總RNA，所述RNA用作使用Superscript Reverse Transcriptase(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)的cDNA合成的模板。使用各自側(cè)翼恒定區(qū)的特異性引物進行重鏈和輕鏈可變區(qū)的PCR擴增5′CGGGAATTCCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGG SEQ ID NO25和3′GCGGGCCCTCGAGTCTATGTACATATGCAAGGCTTACAACC SEQ IDNO26用于重鏈；5′CGCGCAAGCTTGATATTGTGATAACCCAGGATGASEQ ID NO27和3′GATGGTGGGAAGATG SEQ ID NO28用于輕鏈。純化PCR產(chǎn)物并使用相同引物進行測序。
Idi-1(Idi-1 VL-SEQ ID NO9；Idi-1 VH-SEQ ID NO10)，Idi-2(Idi-2VL-SEQ ID NO11；Idi-2 VH-SEQ ID NO12)及PAb-421的可變區(qū)在圖7中提供。Idi-1和Idi-2的CDR序列示于圖7，并與其相應(yīng)的SEQ ID NO列于下述表4。
表4Idi-1和Idi-2的CDR序列

盡管已特別描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解可進行許多改變和改進。因此，本發(fā)明不受限于特別描述的實施方案，而通過參考下述權(quán)利要求，本發(fā)明的范圍、精神和概念將更容易理解。
參考文獻1.Ellis et al.，Ann.Rev.Cell Biol.7663-698(1991).
2.Baker et al.，Science 249912-915(1990).
3.Lee et al.，Cell 811013-1020(1995).
4.Kastan et al.，Cancer Res.516304-6311(1991).
5.Kuerbitz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897491-7495(1992).
6.Yonish-Rouach et al.，Nature 352345-347(1991).
7.el-Deiry et al.，Nat.Genet.145-49(1992).
8.Lee et al.，Cell 811013-1020(1995).
9.Shohat-Foord et al.，Nucleic Acids Res.195191-5198(1991).
10.Hollstein et al.，Science 25349-53(1991).
11.Ko LJ and Prives C.Genes Dev.101054-72(1996).
12.Komarova EA and Gudkov AV.Biochem Pharmacol.62657-67(2001).
13.Mattson MP et al.，apoptosis 669-81(2001).
14.Martin LJ.Int J MoI Med.7455-78(2001).
15.Nickells RW.Surv Ophthalmol.43 Suppl 1S1 51-61(1999).
16.Raghupathi R et al.，J Neurotrauma 17927-38(2000).
17.Haunstetter A and Izumo S.Circ Res 821111-29(1998).
18.Radic et al.，Annu.Rev.Immunol.12487-520(1994).
19.Pisetsky，J.Immunol.156421-423(1996).
20.Herkel et al.，Eur J Immunol 30977-984(2000).
21.Herkel et al.，Eur J Immunol.Dec；34(12)3623-32(2004).
22.Scott et al.，Science 249386(1990).
23.Devlin et al.，Science 249404(1990).
24.Cwirla et al.，Science 2761696-9(1997).
25.Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-424(1997).
26.Wolf et al.，Cell 38119-26(1984).
27.Nitta et al.，Oncogene 15561-8(1997).
28.Takasaki et al.，Nature Biotech.151266-1270(1997).
29.Roberts and Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412297-303(1997).
30.Wells and Lowman，Curr.Opin.Biotechnol.3355-362(1992).
31.Dedman et al.，J.Biol.Chem.26823025-23030(1993).
32.Wilson et al.，Can.T.Microbiol.44313-329(1998).
33.Kay et al，Drug Disc.Today 3370-378(1998).
34.Allen G.，Sequencing of proteins and peptides(1989)Elsevier SciencePublishers B.V.
35.Van Regenmortel and Muller.Curr Opin Biotechnol 9377-82(1998).
36.Thompson，Science 267(5203)1456-62(1995).
37.Nicoletti et al.，J Immunol Methods.Jun 3；139(2)271-279(1991).
38.Gavrieli et al.，J Cell Biol.Nov；119(3)493-501(1992).
39.Nathan C.Points of control in inflammation.Nature 420846-52(2002).
40.Cohen IR.Semin Immunol 12215-9(2000).
41.Dinarello，C.A.，et al.，Rev.Infect.Disease 651(1984).
42.Heath，P.，IBC Meeting on cytokine Antagonists，Philadelphia，Pa.，Apr.24-25，(1997).
43.Rankin，E.C.C，et al.，British J.Rheum.35334-342(1997).
44.Stack，W.A.，et al.，Lancet 349521-524(1997).
45.Shohami，et al.，J Neuroimmunol.72，169(1997).
46.Treon，et al.，Current Opinion in Hematology 542(1998).
47.Gruol，et al.，Molecular Neurobiology 15307(1997).
48.Ershler et al.，Development and Comparative Immunol.21487(1997).
49.Fingl，et al.，in″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，Ch.1 pp.1(1975).
50.Liu et al.，Immunity 3407-415(1995).
51.Stewart，J.M.and Young，J.D.(1963)，″Solid Phase Peptide Synthesis″，W.H.Freeman Co.(San Francisco).
52.Meienhofer，J(1973).″Hormonal Proteins and Peptides″，vol.2，p.46，Academic Press(New York).
53.Schroder，G.and Lupke，K.(1965).″The Peptides″，vol.1，Academic Press(New York).
序列表<110>耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司<120>介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的肽抑制劑<130>YEDA 042 PCT<160>28<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>7<212>PRT<213>人工<220>
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<223>合成肽<400>14Leu Met Ser Ile Arg Ala Ser1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽<400>15Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Tyr Thr1 5<210>16<211>13<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽<400>16Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn1 5 10<210>17<211>12<212>PRT
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<223>合成肽<400>17Asn Ile Ser Pro Ala Asp Ser Ser Thr Asn Tyr Asn1 5 10<210>18<211>11<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽<400>18Glu Glu Val Arg Arg Arg Arg Asp Met Asp Phe1 5 10<210>19<211>15<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽<400>19Gln Ala Ser Glu Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His1 5 10 15<210>20<211>7<212>PRT<213>人工
<220>
<223>合成肽<400>20Arg Ala Ser Lys Leu Glu Ser1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽<400>21Met Gln Ser Met Glu Asp Pro Tyr Thr1 5<210>22<211>13<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽<400>22Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Ile Asn1 5 10<210>23<211>12<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽
<400>23Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Cys Tyr Asn1 5 10<210>24<211>15<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成肽<400>24Arg Val Trp Leu Arg Arg Asp Gly Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr1 5 10 15<210>25<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成肽<400>25cgggaattcc ccaggtgcag ctgcagcagt ctgg 34<210>26<211>41<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>合成寡核苷酸<400>26gcgggccctc gagtctatgt acatatgcaa ggcttacaac c 41
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<223>合成寡核苷酸<400>27cgcgcaagct tgatattgtg ataacccagg atga 34<210>28<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>28gatggtggga agatg1權(quán)利要求
1.一種肽，其含有可與針對抗p53抗體的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原表位，其中所述抗p53抗體可與p53的C末端的至少部分調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生免疫反應(yīng)，并且其中所述肽表現(xiàn)有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽含有約5至25個氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽含有約7至12個氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述抗p53抗體是PAb-421。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述抗獨特型抗體選自Idi-1和Idi-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽表現(xiàn)有結(jié)合與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)的活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肽，其中所述肽表現(xiàn)有防止所述蛋白質(zhì)結(jié)合損傷的DNA的活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽抑制細(xì)胞凋亡活性至少25％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少75％，以及最優(yōu)選至少95％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽抑制哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞凋亡活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽，其中所述肽抑制人細(xì)胞的細(xì)胞凋亡活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽能夠下調(diào)免疫介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO1-4、其類似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的肽，其中所述衍生物具有SEQ ID NO5-8任一者所列的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO1、2及5任一者所列的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO15和18，及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的分子。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL區(qū)和VH區(qū)的分子。
17.一種藥物組合物，其含有作為活性成分的一種肽及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，所述肽含有可與針對抗p53抗體的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原表位，其中所述抗p53抗體可與p53的C末端的至少部分調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生免疫反應(yīng)，其中所述肽表現(xiàn)有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述肽含有約5至25個氨基酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述肽含有約7至12個氨基酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述抗p53抗體是PAb-421。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述抗獨特型抗體選自Idi-1和Idi-2。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述肽具有SEQ ID NO1-4、其類似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其中所述衍生物具有SEQID NO5-8任一者所列的氨基酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述肽具有SEQ ID NO1、2及5任一者所列的氨基酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL區(qū)和VH區(qū)的分子。
27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中所述活性成分是根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項所述的肽及其藥學(xué)上可接受的鹽。
28.一種抗體分子，其含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列。
29.一種抗體分子，其含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL區(qū)和VH區(qū)。
30.一種用于調(diào)節(jié)生物體細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)和免疫應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)的方法，其包括將所述細(xì)胞暴露于有效量的一種肽，所述肽含有可與針對抗p53抗體的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原表位，其中所述抗p53抗體可與p53的C末端的至少部分調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生免疫反應(yīng)，并且其中所述肽表現(xiàn)有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肽含有約5至25個氨基酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肽含有約7至12個氨基酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述抗p53抗體是PAb-421。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述抗獨特型抗體選自Idi-1和Idi-2。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO1-4、其類似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述衍生物具有SEQ ID NO5-8任一者所列的氨基酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO1、2及5任一者所列的氨基酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)與選自下述的疾病有關(guān)阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、創(chuàng)傷后的繼發(fā)性變性、中風(fēng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒、青光眼、黃斑變性、I型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性眼葡萄膜炎、移植物抗宿主病、移植物排斥、關(guān)節(jié)炎、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、炎性腸病(IBD)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、銀屑病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、輻射病、體溫過高、缺氧、暴發(fā)性中毒肝、腎衰竭及不育癥。
39.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肽可在體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肽可在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性。
41.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中通過選自口服、局部、經(jīng)皮膚及胃腸外的途徑將所述肽施用于需要的受治療者。
42.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述肽抑制在正常組織或細(xì)胞對細(xì)胞應(yīng)激疾病和免疫應(yīng)激疾病反應(yīng)中的細(xì)胞凋亡活性。
43.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的分子。
44.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL區(qū)和VH區(qū)的分子。
45.一種用于治療受治療者變性性疾病或病癥的方法，其包括將治療有效量的一種肽施用于所述受治療者，所述肽含有可與針對抗p53抗體的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原表位，其中所述抗p53抗體可與p53的C末端的至少部分調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生免疫反應(yīng)，并且其中所述肽表現(xiàn)有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述肽含有約5至25個氨基酸。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述肽含有約7至12個氨基酸。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗p53抗體是PAb-421。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗獨特型抗體選自Idi-1和Idi-2。
50.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO1-4、其類似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述衍生物具有SEQ ID NO5-8任一者所列的氨基酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO1、2及5任一者所列的氨基酸序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疾病或病癥為應(yīng)激相關(guān)的變性性疾病。
54.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述受治療者患有腫瘤性疾病并正經(jīng)受用于治療癌癥的化療和/或放療。
55.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述疾病或病癥選自阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、創(chuàng)傷后的繼發(fā)性變性、中風(fēng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒、青光眼、黃斑變性、心肌梗塞、輻射病、體溫過高、缺氧、暴發(fā)性中毒肝、腎衰竭及不育癥。
56.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述肽可在體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性。
57.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述肽可在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性。
58.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中通過選自口服、局部、經(jīng)皮膚及胃腸外的途徑將所述肽施用于需要的受治療者。
59.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的分子。
60.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL區(qū)和VH區(qū)的分子。
61.一種用于治療受治療者炎性疾病或病癥的方法，其包括將治療有效量的一種肽施用于所述受治療者，所述肽含有可與針對抗p53抗體的抗獨特型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原表位，其中所述抗p53抗體可與p53的C末端的至少部分調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生免疫反應(yīng)，并且其中所述肽表現(xiàn)有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述肽含有約5至25個氨基酸。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述肽含有約7至12個氨基酸。
64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述抗p53抗體是PAb-421。
65.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述抗獨特型抗體選自Idi-1和Idi-2。
66.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO1-4、其類似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述衍生物具有SEQ ID NO5-8任一者所列的氨基酸序列。
68.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO1、2及5任一者所列的氨基酸序列。
69.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述疾病或病癥具有與選自IL-6和TNF-α的至少一種炎癥前細(xì)胞因子的產(chǎn)生相關(guān)的病因。
70.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述疾病為自身免疫性疾病。
71.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述疾病或病癥選自I型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性眼葡萄膜炎、關(guān)節(jié)炎、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、炎性腸病(IBD)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、銀屑病、動脈粥樣硬化、移植物排斥以及移植物抗宿主病。
72.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述疾病為多發(fā)性硬化癥。
73.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述肽可在體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性。
74.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述肽可在體外調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性。
75.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中通過選自口服、局部、經(jīng)皮膚及胃腸外的途徑將所述肽施用于需要的受治療者。
76.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述抗獨特型抗體為是含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列的分子。
77.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述抗獨特型抗體是含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL區(qū)和VH區(qū)的分子。
78.一種抗體分子用于分離一種肽的用途，所述抗體分子含有選自SEQ ID NO15和18及SEQ ID NO21和24的VL-CDR3和VH-CDR3序列，所述肽表現(xiàn)有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
79.一種抗體分子用于分離一種肽的用途，所述抗體分子含有選自SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12及其類似物的VL區(qū)和VH區(qū)，所述肽表現(xiàn)有選自抗細(xì)胞凋亡活性和抗炎癥活性的至少一種活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及真核細(xì)胞中能夠抑制細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)的肽。本發(fā)明提供了利用單克隆抗DNA抗體識別的肽治療人變性性疾病和炎癥的組合物和方法，所述肽具有抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥活性。本發(fā)明還提供了抗體分子及其用于分離所述肽的用途。
文檔編號A61K38/10GK101035554SQ200580028458
公開日2007年9月12日 申請日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者約翰尼斯·赫克爾, 艾潤·R·科恩, 瓦達(dá)·羅特, 安斯哥·W·洛思, 納塔·艾瑞茲, 艾維賽伊·米姆蘭, 納阿曼·凱姆 申請人:維茲曼科學(xué)研究所耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司