專利名稱：放射性氟化肽的制作方法
專利說明放射性氟化肽 本發(fā)明涉及新的肽基化合物和它們?cè)谑褂谜娮影l(fā)射斷層顯像(PET)用于診斷成像中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及這樣的肽基化合物作為與和血管生成相關(guān)的受體結(jié)合的靶向載體的用途，特別是整聯(lián)蛋白受體，例如αvβ3整聯(lián)蛋白受體。因此這樣的化合物可以用于診斷或治療例如惡性疾病、心臟病、子宮內(nèi)膜異位癥、與炎癥相關(guān)的疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和卡波濟(jì)氏肉瘤(kaposi’s sarcoma)。此外，它還涉及制備該肽基化合物的方法和試劑。
本申請(qǐng)用于診斷成像的放射性標(biāo)記生物活性肽在核醫(yī)學(xué)上獲得重要地位。與特定細(xì)胞類型選擇性相互使用的生物學(xué)活性分子可以用于對(duì)目標(biāo)組織釋放放射活性。例如放射性標(biāo)記的肽對(duì)向腫瘤、梗塞和感染組織釋放放射性核素以用于診斷成像和放射治療具有重要的潛力。18F具有半衰期大約為110分鐘，是許多受體成像研究的正電子-放射核素的選擇。因此，因?yàn)樵赑ET定量測(cè)定和表征多種疾病中的應(yīng)用，18F-標(biāo)記生物活性肽具有很大的臨床潛力。
新血管可以通過兩種不同的機(jī)理形成血管發(fā)生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)。血管生成是從存在的血管分支形成新血管。這種過程的主要刺激可能是對(duì)組織中的細(xì)胞的不充分的營(yíng)養(yǎng)和氧(氧不足)的供應(yīng)。細(xì)胞可以通過分泌多種的血管發(fā)生因子響應(yīng)；常常提到的一個(gè)例子是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)。這些因子引起蛋白水解酶的分泌，蛋白水解酶裂解基膜蛋白質(zhì)，以及限制這些可能有害酶的作用的抑制劑。血管發(fā)生因子的其他突出的作用是引起內(nèi)皮細(xì)胞位移和分裂。與基膜附著的內(nèi)皮細(xì)胞，圍繞血管在contralumenal側(cè)上形成連續(xù)片狀，該內(nèi)皮細(xì)胞沒有經(jīng)歷有絲分裂。附著損失和來自血管生成因子受體的信號(hào)的聯(lián)合作用引起內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、繁殖和自身重排，最終在新血管周圍合成基膜。
血管生成在組織生長(zhǎng)和重塑中是突出的，包括傷口愈合和炎癥過程。當(dāng)腫瘤達(dá)到毫米大小時(shí)為了保持它們的生長(zhǎng)速度，必須開始血管生成。血管生成伴隨內(nèi)皮細(xì)胞和它們的環(huán)境的特征性變化。除了在影響和控制蛋白質(zhì)水解中涉及的各種蛋白質(zhì)之外，在準(zhǔn)備移動(dòng)中這些細(xì)胞的表面被重塑，基膜被降解的地方隱蔽結(jié)構(gòu)被暴露。在腫瘤的情況下，得到的血管網(wǎng)通常被打亂，形成明顯的紐結(jié)還有動(dòng)靜脈的分路。對(duì)血管生成的抑制作用也被認(rèn)為是抗腫瘤治療有希望的策略。伴隨血管生成的轉(zhuǎn)化作用對(duì)于診斷也是非常有希望的，一個(gè)明顯的例子是惡性疾病，但是這個(gè)概念還指出對(duì)炎癥和各種炎癥相關(guān)的疾病非常有前途，包括動(dòng)脈粥樣硬化、早期動(dòng)脈粥樣硬化損傷的巨噬細(xì)胞可能是血管生成因子的潛在根源。
細(xì)胞粘著中涉及的很多配體包含三肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。該RGD序列表現(xiàn)出作為代表該序列的配體與細(xì)胞表面上的受體之間的主要識(shí)別位點(diǎn)而起作用。普遍認(rèn)為配體和受體之間的二級(jí)相互作用提高相互作用的特異性。這些二級(jí)作用可能發(fā)生在配體和緊鄰RGD序列的受體之間的部分或者發(fā)生在遠(yuǎn)離RGD序列的位點(diǎn)。
因此與體內(nèi)血管發(fā)生相關(guān)的整聯(lián)蛋白受體的有效靶向和成像要求化學(xué)穩(wěn)健和穩(wěn)定的選擇性、高親和性RGD為基礎(chǔ)的載體。此外，當(dāng)為了減少與背景有關(guān)的問題而設(shè)計(jì)顯像劑時(shí)，排泄途徑是重要的因素。
WO 03/006491描述了目標(biāo)為與血管生成相關(guān)的整聯(lián)蛋白受體的肽基化合物。然而，存在對(duì)另外的可用于診斷成像技術(shù)如PET的肽基化合物的需要。共同待決的國(guó)際申請(qǐng)PCT/GB2004/001052描述了適用于標(biāo)記具有18F的生物學(xué)活性載體的方法。但這里還需要肽基化合物，其可以迅速地和有效地制備，并且還具有理想的生物活性。
在第一方面，本發(fā)明提供了一種放射性氟化方法，其包含式(I)化合物的反應(yīng)
其中載體包含片段
和式(II)的化合物
其中 n是0-20的整數(shù)； m是0-10的整數(shù)； Y是H、C1-6烷基(如甲基)，或苯基 得到式(III)化合物
其中m、n和Y如式(II)化合物中所定義，載體如對(duì)式(I)化合物中所定義。
這個(gè)反應(yīng)可以在合適溶劑，例如在pH范圍為1-11，合適的為2-11，更合適的為2-6的含水緩沖液中，并在非端點(diǎn)溫度5-100℃，合適的為20-70℃，優(yōu)選環(huán)境溫度下進(jìn)行。
在一個(gè)具體方面，式(I)或(III)中的載體為式(A)
其中X7為-NH2或
其中a是1-10的整數(shù)，優(yōu)選a是1。
選擇式(I)化合物中形成載體部分的連接物用于提供良好的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)，如式(III)的最終共軛物有利的排泄特性。使用具有不同的親脂性和或電荷的連接基團(tuán)可以顯著地改變體內(nèi)肽的藥物動(dòng)力學(xué)，以適合診斷的需要。例如，當(dāng)希望通過腎排泄從身體清除式(III)共軛物時(shí)，使用親水連接物，當(dāng)希望通過肝膽管排泄清除時(shí)，使用疏水連接物。連接物包括聚乙二醇部分，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些情況下有希望用來減緩血液清除率。
式(I)化合物中載體的連接物形成部分為C1-60烴基基團(tuán)，合適的為C1-30烴基基團(tuán)，任選包括1-30個(gè)雜原子，合適地為1-10個(gè)雜原子如氧或氮。合適的連接基基團(tuán)包括烷基、烯基、炔基鏈、芳香、多芳香和雜芳香環(huán)，聚合物包含乙二醇、氨基酸或碳水化合物亞單元。優(yōu)選式(I)化合物中載體的連接物形成部分包含聚乙二醇亞單元，最優(yōu)選的連接物是式B
其中b是2-20的整數(shù)，優(yōu)選是3-10，最優(yōu)選5。
術(shù)語(yǔ)“羥基基團(tuán)”意指由碳和氫組成的有機(jī)取代基，這些基團(tuán)可以包括飽和、不飽和或芳香部分。
因此，優(yōu)選的式(I)化合物為式(Ia)化合物
其中X7為-NH2或
其中a為1-10的整數(shù)，優(yōu)選a為1，b為2-20的整數(shù)，優(yōu)選3-10，最優(yōu)選5。
優(yōu)選的式(II)化合物為其中m是0，n是0，以及Y是氫的化合物。
通過肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方法可以制備式(I)和(III)的化合物，例如固相肽合成，例如如Atherton，E.和Sheppard，R.C.；″Solid Phase Synthesis″；IRL PressOxford，1989中所述。通過由肽胺官能團(tuán)與活性酸反應(yīng)制備生成穩(wěn)定的酰胺鍵，并在肽合成中或之后引入，可以實(shí)現(xiàn)在式(I)化合物中引入胺氧基。
另一方面，本發(fā)明提供了如上定義的式(I)和(Ia)化合物，其具有作為可用于產(chǎn)生放射性標(biāo)記的肽基化合物的試劑的用途。
另一方面，本發(fā)明提供了如上定義的式(III)化合物或其鹽作為放射標(biāo)記的共軛物。優(yōu)選的式(III)化合物是式(IIIa)化合物
或其鹽，其中X7是-NH2或
其中a為1-10的整數(shù)，優(yōu)選a為1，b為2-20的整數(shù)，優(yōu)選3-10，最優(yōu)選5。
一個(gè)特別優(yōu)選的式(III)化合物是
式(III)和(IIIa)化合物合適的鹽包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽如由鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、醋酸、三氟醋酸、琥珀酸、草(oxaxlic)酸、反丁烯二酸、馬來酸、草醋酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸和異乙二酸(isoethionic acids)所成的鹽。
式(II)化合物可以從相應(yīng)的式(IV)前體或其被保護(hù)的衍生物制備得到
其中L是離去基團(tuán)，優(yōu)選當(dāng)m≥1時(shí)，L是對(duì)甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽或甲磺酸鹽，或鹵化物和當(dāng)m是0時(shí)，L是對(duì)三烷基銨鹽或?qū)ο趸约癥、m和n如式(II)化合物所描述；通過用回旋加速器反應(yīng)制備水性[18F]-氟化物，在合適溶劑如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中，通常在環(huán)境或升高的溫度例如達(dá)到14O℃下通過從堿(例如從四丁銨或K2CO3/Kryptofix-222)進(jìn)行適當(dāng)?shù)仡A(yù)活化而制備。氟化作用之后通過簡(jiǎn)單的酸處理也可以從它們的保護(hù)前體如縮醛或縮酮快速產(chǎn)生式(II)化合物的醛或酮官能團(tuán)。
如下面的體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)所示，式(I)和(Ia)化合物與血管生成相關(guān)的受體結(jié)合。這些化合物因此可能用于與血管生成相關(guān)的治療、疾病和病癥的體內(nèi)診斷和成像。
術(shù)語(yǔ)“與血管生成相關(guān)的疾病和病癥”包括那些參照以下的疾病和病癥。關(guān)于這方面也可參見WO 98/47541。
與血管生成相關(guān)的疾病或病癥包括各種癌和轉(zhuǎn)移，例如乳腺、皮膚、結(jié)腸直腸、胰腺、前列腺、肺或卵巢癌。
其它與血管生成相關(guān)的疾病或病癥是炎癥(例如慢性炎癥)、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙齦炎。
此外，與血管生成相關(guān)的疾病或病癥是動(dòng)靜脈alformations、星形細(xì)胞瘤、絨毛膜癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、血管瘤(幼年期，毛細(xì)血管)、肝癌、子宮內(nèi)膜增生、缺血性心肌、子宮內(nèi)膜異位癥、卡波西肉瘤、黃斑變性、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、外周動(dòng)脈閉塞疾病、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、視網(wǎng)膜病(糖尿病性，增生性)、硬皮病、精原細(xì)胞瘤(seminomas)和潰瘍性結(jié)腸炎。
本發(fā)明也提供一種包含有效量(例如用于體內(nèi)PET成像的有效數(shù)量)如上所定義的通式(III)或(IIIa)化合物或其鹽的放射性藥物組合物；以及一種或多種藥學(xué)上可接受的助劑、賦形劑或稀釋劑。
本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案涉及如上定義的通式(III)或(IIIa)化合物或其鹽用于醫(yī)藥的用途，特別是通過例如PET對(duì)與血管生成相關(guān)的疾病或病癥進(jìn)行體內(nèi)診斷或成像。
式(III)或(IIIa)的放射性標(biāo)記的共軛物可以以足以產(chǎn)生希望的信號(hào)的量給藥于患者用于PET成像，一般的放射性核素劑量為0.01-100mCi，優(yōu)選0.1-50mCi，最優(yōu)選1-20mCi，一般對(duì)每70kg體重將是足夠的。
因此，可以使用在某種意義上本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的生理學(xué)可接受的載體或賦形劑來配制式(III)或(IIIa)的放射性標(biāo)記的共軛物用于給藥。例如，化合物任選加入藥學(xué)上可接受的賦形劑，可以懸浮或溶于含水介質(zhì)，然后將得到的溶液或懸浮液滅菌。
從進(jìn)一步的方面來看，本發(fā)明提供了使用如上定義的式(III)或(IIIa)或其鹽放射性標(biāo)記的共軛物，用于制備放射性藥物的用途，其在體內(nèi)成像方法中使用，適合于PET，優(yōu)選用于與血管生成相關(guān)的疾病或病癥的成像；包括將所述放射性藥物對(duì)人或動(dòng)物體給藥和產(chǎn)生至少部分所述身體的成像。
從更進(jìn)一步的方面來看，本發(fā)明提供了用于與血管生成相關(guān)的疾病或病癥的體內(nèi)診斷或成像，包括將放射性藥物對(duì)所述身體給藥，例如血管系統(tǒng)，并產(chǎn)生至少一部分所述身體的成像，所述放射性藥物使用PET分布在體內(nèi)，其中所述放射性藥物包含式(III)或(IIIa)或其鹽的放射性標(biāo)記的共軛物。
從進(jìn)一步的方面來看，本發(fā)明提供了一種監(jiān)控使用藥物例如細(xì)胞毒藥物對(duì)人或動(dòng)物體治療的效果的方法，其用于與癌相關(guān)的病癥，優(yōu)選血管生成的癌癥。所述方法包含將式(III)或(IIIa)或其鹽的放射性標(biāo)記的共軛物對(duì)所述身體給藥，并且測(cè)定由細(xì)胞受體優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞受體和尤其是αvβ3受體對(duì)所述共軛物的吸收量，任意選擇所述給藥和測(cè)定，但優(yōu)選重復(fù)起作用，例如使用所述藥物處理之前、之間和之后。
在本發(fā)明又一個(gè)的實(shí)施方案中提供了一種用于制備包含式(II)輔基和式(I)化合物的放射性氟示蹤劑(radiofluorinated tracer)的試劑盒。
在使用該試劑盒時(shí)，分別將式(II)化合物加入到式(I)化合物中，其可以適當(dāng)?shù)厝苡诤彌_液(pH1-11)。在非端點(diǎn)溫度下反應(yīng)1-70分鐘后，可以例如使用固相萃取(SPE)或高效液相色譜(HPLC)來純化和收集標(biāo)記肽。
實(shí)施例 本發(fā)明通過實(shí)施例進(jìn)行說明，其中使用了下列縮寫詞 HPLC高效液相色譜 NMR核磁共振 TFA三氟乙酸 hr(s)小時(shí) min(s)分鐘 DMAP4-(二甲基氨基)吡啶 THF四氫呋喃 DCM二氯甲烷 DMFN，N-二甲基甲酰胺 TBAF四丁基氟化銨 MeOH甲醇 TLC薄層色譜法 TIS三異丙基硅烷 DMSO二甲亞砜 PBS磷酸鹽緩沖鹽水 PyAOP[7-氮雜苯并三唑-1-基氧三(吡咯烷基) 六氟磷酸鹽] Boc叔丁氧羰基 RT室溫 實(shí)施例1 4-三甲基銨苯甲醛三氟甲磺酸鹽(化合物1)的制備
根據(jù)Haka等人(J.Labelled Cpds.& Radiopharms 1989 27(7)823)描述的方法合成該化合物。
實(shí)施例2-肽前體(化合物2)的制備 使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成方法合成肽(化合物2)。

(a)1，17-二疊氮-3，6，9，12，15-五氧雜十七烷 在氬氣保護(hù)下，將干燥六聚乙二醇(25g，88mmol)和甲磺酰氯(22.3g，195mmol)的干燥THF(125mL)溶液在冰/水浴中冷卻至0℃。在45分鐘內(nèi)滴加三乙胺(19.7g，195mmol)在干燥THF(25mL)的溶液。1小時(shí)后移去冷卻浴并再攪拌反應(yīng)4小時(shí)。然后將水(55mL)加入到混合物，之后加入碳酸氫鈉(5.3g，至pH 8)和疊氮化鈉(12.7g，195mmol)。通過蒸餾除去THF，并將含水溶液回流24小時(shí)(形成兩層)。冷卻混合物，加入醚(100mL)，含水相加入氯化鈉至飽和。分離有機(jī)相，用乙醚(4×50mL)萃取含水相。合并有機(jī)相，用鹽水(2×50mL)洗滌并干燥(MgSO4)。過濾和蒸發(fā)溶劑得到26g(89％)的黃色油狀物。該產(chǎn)物用于下一步而無(wú)需進(jìn)一步純化。
(b)17-疊氮基-3，6，9，12，15-五氧雜十七烷胺 在室溫下在3小時(shí)內(nèi)向劇烈攪拌的1，17-二疊氮-3，6，9，12，15-五氧雜十七烷(25g，75mmol)在5％HCl(200mL)中的溶液中加入三苯膦(19.2g，73mmol)在乙醚(150mL)中的溶液。額外攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)。分離各相，用二氯甲烷(3×40mL)萃取含水相。含水相在冰/水浴中冷卻，加入固體氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至12。濃縮含水相，將產(chǎn)物吸收入二氯甲烷(150mL)。干燥有機(jī)相(Na2SO4)并濃縮得到22g(95％)的黃色油狀物。該產(chǎn)物用電噴霧質(zhì)譜確定。(ESI-MS)(MH+計(jì)算值307.19；實(shí)測(cè)值307.4)。粗油狀物用于下一步而無(wú)需進(jìn)一步純化。
(c)23-疊氮基-5-氧雜-6-氮雜-3，9，12，15，18，21-六氧雜二十三酸 向17-疊氮基-3，6，9，12，15-五氧雜十七烷胺(15g，50mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入二乙醇酸酐(Acros，6.4g，55mmol)。攪拌反應(yīng)混合物過夜。通過ESI-MS分析監(jiān)控反應(yīng)，加入更多試劑以推動(dòng)反應(yīng)完成。濃縮溶液得到黃色殘余物，將其溶于水(250mL)。通過二氯甲烷連續(xù)萃取從含水相分離產(chǎn)物過夜。干燥并蒸發(fā)溶劑得到18g(85％)的收率。該產(chǎn)物用ESI-MS分析表征。(MH+計(jì)算值423.20；實(shí)測(cè)值423.4)。該產(chǎn)物用于下一步而無(wú)需進(jìn)一步純化。
(d)23-氨基-5-氧雜-6-氮雜-3，9，12，15，18，21-六氧雜二十三酸 將23-疊氮基-5-氧-6-氮雜-3，9，12，15，18，21-六氧雜二十三酸(9.0g，21mmol)溶于水(50mL)，用H2(g)-Pd/C(10％)還原。進(jìn)行反應(yīng)直到ESI-MS分析顯示完全轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)品(MH+計(jì)算值397.2；實(shí)測(cè)值397.6)。該粗品用于下一步而無(wú)需進(jìn)一步純化。
(e)(Boc-氨氧基)乙酰基-PEG(6)-二羥乙酸 將二環(huán)己基碳二亞胺(515mg，2.50mmol)在二烷(2.5mL)中的溶液滴加到(Boc-氨氧基)乙酸(477mg，2.50mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(287mg，2.50mmol)在二烷(2.5mL)溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)并過濾。將濾液轉(zhuǎn)入包含23-氨基-5-氧-6-氮雜-3，9，12，15，18，21-六氧雜二十三酸(1.0g，2.5mmol)和N-甲基嗎啉(278μl，2.50mmol)在水(5mL)中的溶液的反應(yīng)器中。室溫下攪拌混合物30分鐘。ESI-MS分析顯示完全轉(zhuǎn)化到想要的產(chǎn)品(MH+計(jì)算值570.28；實(shí)測(cè)值570.6)。
粗品用制備HPLC(柱Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm，檢測(cè)214nm，梯度60分鐘內(nèi)0-5％B，其中A＝H2O/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA，流速10mL/分鐘)純化得到500mg(38％)的純產(chǎn)物。
通過HPLC(柱Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2.00mm，檢測(cè)214nm，梯度10分鐘內(nèi)0-50％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，和B＝乙腈/0.1％TFA，流速0.75mL/分鐘，Rt＝5.52分鐘)分析產(chǎn)品。通過NMR分析進(jìn)一步證實(shí)。
(f)(Boc-氨氧基)乙?；?PEG(6)-二羥乙酸和化合物2的共軛 將(Boc-氨氧基)乙?；?PEG(6)-二羥乙酸(0.15mmol，85mg)和PyAOP(0.13mmol，68mg)溶于DMF(2mL)。加入N-甲基嗎啉(0.20mmol，20μL)，攪拌混合物10分鐘。加入化合物2(0.100mmol，126mg)和N-甲基嗎啉(0.20mmol，20μL)在DMF(4mL)的溶液，攪拌反應(yīng)混合物25分鐘。加入另外的N-甲基嗎啉(0.20mmol，20μL)，再攪拌反應(yīng)混合物15分鐘。真空下蒸發(fā)DMF，產(chǎn)物吸收入10％乙腈-水，用制備HPLC(柱Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm，檢測(cè)UV214nm，梯度40分鐘內(nèi)5-50％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，和B＝乙腈/0.1％TFA，流速10mL/分鐘)純化得到100mg(38％)的半純產(chǎn)物。第二個(gè)純化步驟，其中TFA被HCOOH替代(梯度0-30％B，其他方面與上述條件相同)得到89mg(50％)。用HPLC(柱Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm，檢測(cè)UV 214nm，梯度10分鐘內(nèi)0-30％B，其中A＝H2O/0.1％HCOOH，和B＝乙腈/0.1％HCOOH，流速0.3mL/分鐘，室溫10.21分鐘)分析產(chǎn)物。進(jìn)一步產(chǎn)物用ESI-MS進(jìn)行表征(MH+calculated905.4；found 906.0)。
實(shí)施例3-18F-氟苯甲醛與化合物3的化學(xué)選擇性的結(jié)合得到化合物4
通過加入包含5％水的TFA至10mg的肽中進(jìn)行肽3的去保護(hù)。將溶于1mL水的Boc-去保護(hù)肽(5.9mg，0.0044mmol)加入到溶于1mL乙腈的4-氟苯甲醛(化合物1)(1.1mg，0.94μl，0.0089mmol)中。混合物的pH是3.5。在70℃(degrees)45分鐘后，混合物用反相制備色譜法(PhenomenexLuna C18柱，00G-4253-NO；溶劑A＝水+0.1％TFA/B＝CH3CN+0.1％TFA，梯度30分鐘內(nèi)10-40％B，流速5.0mL/分鐘；在214nm處檢測(cè))提純兩次得到2.0mg(32％)的純化合物(分析HPLCPhenomenex Luna C18柱，00G-4252-EO；溶劑A＝水+0.1％TFA/B＝CH3CN+0.1％TFA，梯度20分鐘內(nèi)10-50％B，流速1.0mL/分鐘；保留時(shí)間16.3分鐘，在214nm和254nm處檢測(cè))。進(jìn)一步使用質(zhì)譜法進(jìn)行表征，得到m/z值1437.2。[M-H+]。
實(shí)施例418F-化合物4的放射合成 方法1 18F-氟化物(達(dá)到370MBq)在Kryptofix 222(5mg在0.5mL乙腈中)和碳酸鉀(50μl、0.1M在水中)存在下，在N2保護(hù)下加熱至110℃恒沸干燥20分鐘。此時(shí)加入3×0.5mL乙腈并蒸干。冷卻至＜40℃后，加入三甲基銨苯甲醛三氟甲磺酸鹽溶液(1mg在0.4mL DMSO中)。密封反應(yīng)器并加熱至90℃15分鐘實(shí)施標(biāo)記。同時(shí)，室溫下用5％在TFA(200μl)中的水處理化合物3(6mg)5分鐘。然后在真空中除去溶劑。去保護(hù)的肽再溶解于0.1M NH4OAc緩沖液、pH4(0.4mL)中，與4-18F-氟苯甲醛在反應(yīng)器中混合。密封反應(yīng)器并加熱至70℃15分鐘實(shí)施偶合。冷卻至室溫后，用制備放射HPLC(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm 10×100mm，溶劑A＝水/01％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度5分鐘內(nèi)15-25％B；25％B12分鐘；10分鐘內(nèi)25-50％B；流速4.0mL/分鐘；UV在210nm和254nm處檢測(cè))得到產(chǎn)物。產(chǎn)物部分用水稀釋(10mL)并裝載在SepPakC18-plus cartridge(用10mL EtOH和20mL H2O調(diào)節(jié))。在乙醇(1mL)中洗脫化合物4。在真空中除去乙醇，在PBS中配制化合物4。
方法2 a)18F-氟苯甲醛的放射合成 18F-氟化物(達(dá)到370MBq)在Kryptofix 222(5mg在0.5mL乙腈中)和碳酸鉀(50μl、0.1M的水溶液)存在下，在N2保護(hù)下加熱至110℃恒沸干燥20分鐘。此時(shí)加入3×0.5mL乙腈并蒸干。冷卻至＜40℃后，加入三甲基銨苯甲醛三氟甲磺酸鹽溶液(1mg在0.4mL DMSO中)。密封反應(yīng)器并加熱至90℃15分鐘實(shí)施標(biāo)記。冷卻粗的反應(yīng)混合物至室溫，加水稀釋?；旌衔镞B續(xù)通過離子交換柱(用乙醇(或乙腈)和水預(yù)處理)，在乙腈/水混合物中洗脫。洗脫物使用C18 Seppak濃縮，氟苯甲醛在乙腈中洗脫。
b)化合物3和4-18F-氟苯甲醛的共軛 在室溫下化合物3用5％三氟乙酸的水溶液處理5分鐘。然后真空下蒸發(fā)除去溶劑。肽再溶解于0.1M NH4OAc緩沖液、pH4(0.5mL)中，與4-18F-氟苯甲醛在反應(yīng)器中合并。密封反應(yīng)器并加熱至70℃15分鐘實(shí)施共軛。冷卻至室溫后，用制備放射HPLC(如方法1所描述)或用SPE得到產(chǎn)物。
生物數(shù)據(jù) 結(jié)合研究 使用已知表達(dá)αvβ3整聯(lián)蛋白受體的細(xì)胞膜制備法，并使用125I-echistatin和F-19標(biāo)記肽作為競(jìng)爭(zhēng)性配體來進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合研究。使用PrismTM軟件獲得結(jié)合曲線和計(jì)算Kj值。
化合物4具有10nM的Kj值。
Lewis肺腫瘤的生物分布 將Lewis肺腫瘤(LLC)細(xì)胞(0.1mL，1×107細(xì)胞/mL，在培養(yǎng)基中)皮下注射到小鼠(雄性C57BL/6，大約25g)的右大腿內(nèi)。控制動(dòng)物用于腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到15天，在腫瘤模型發(fā)展中選擇使用這個(gè)時(shí)間是因?yàn)檫@時(shí)它顯示血管生成的最高的濃度。
為了測(cè)定18F-化合物的生物分布，借助于尾部血管將測(cè)試藥品(0.1mL，5-10MBq/mL)作為一種靜脈內(nèi)丸劑注射到患腫瘤動(dòng)物。用安樂死處理不同倍數(shù)二次注射的動(dòng)物。剖析肌肉、腎、尿、肺、肝臟、胃、小腸、大腸、甲狀腺、腫瘤，并提取血樣。稱重和計(jì)算剖析過的組織和血樣(Wallac自動(dòng)γ粒子計(jì)數(shù)系統(tǒng))。研究至少三個(gè)動(dòng)物的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果用％id和％id每克組織來表示。
表1 顯示化合物4在小鼠Lewis肺腫瘤模型中的生物分布。隨時(shí)間的概括數(shù)據(jù)。5個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均數(shù)據(jù)以平均值(SD)存在。
表1 作為對(duì)照，表2顯示了化合物5在小鼠Lewis肺腫瘤模型中的生物分布。隨時(shí)間的概括數(shù)據(jù)。5個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均數(shù)據(jù)以平均值(SD)存在。

表2 化合物4額外的PEG部分給予顯著更有利的體內(nèi)特性。具體地說，存在于背景組織如血液、肌肉、肺和肝臟中化合物4的剩余活性，120分鐘后大體上小于化合物5的活性。隨后的腫瘤顯著地改善背景比率，因此能夠成像。
權(quán)利要求
1.一種放射性氟化方法，其包含式(I)化合物
其中載體包含片段
與式(II)的化合物的反應(yīng)
其中
n是0-20的整數(shù)；
m是0-10的整數(shù)；
Y是氫、C1-6烷基(如甲基)，或苯基
得到式(III)化合物
其中m、n和Y如式(II)化合物中所定義，載體如式(I)化合物中所定義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中式(I)或(III)中的載體為式(A)
其中X7為-NH2或
其中a是1-10的整數(shù)，優(yōu)選a是1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中式(I)化合物為式(Ia)化合物
其中X7為-NH2或
其中a為1-10的整數(shù)，優(yōu)選a為1，b為2-20的整數(shù)，優(yōu)選3-10，最優(yōu)選5。
4.如權(quán)利要求1或2所定義的式(I)化合物。
5.如權(quán)利要求3所定義的式(Ia)化合物。
6.如權(quán)利要求1或2所定義的式(III)化合物或其鹽。
7.式(IIIa)化合物
或其鹽，其中X7是-NH2或
其中a為1-10的整數(shù)，優(yōu)選a為1，b為2-20的整數(shù)，優(yōu)選3-10，最優(yōu)選5。
8.式(III)化合物，其為
9.一種包含有效量的如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所定義的式(III)或(IIIa)化合物或其鹽的放射性藥物組合物；以及一種或多種藥學(xué)上可接受的助劑、賦形劑或稀釋劑。
10.如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所定義的式(III)或(IIIa)化合物或其鹽用于醫(yī)藥的用途，特別是與血管生成相關(guān)的疾病或病癥的體內(nèi)診斷或成像，例如用PET。
11.如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所定義的式(III)或(IIIa)化合物或其鹽的放射性標(biāo)記的共軛物的用途，用于制備放射性藥物，其在體內(nèi)成像方法中使用，適合于PET，優(yōu)選用于與血管生成相關(guān)的疾病或病癥的成像；包括將所述放射性藥物對(duì)人或動(dòng)物體給藥和產(chǎn)生至少部分所述身體成像。
12.一種用于與血管生成相關(guān)的疾病或病癥的體內(nèi)診斷或成像的方法，包括將放射性藥物對(duì)所述身體給藥，例如進(jìn)入血管系統(tǒng)，并產(chǎn)生至少部分所述身體的成像，在其中所述放射性藥物使用PET分配，其中所述放射性藥物包含權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所定義的式(III)或(IIIa)化合物或其鹽。
13.一種監(jiān)控使用藥物對(duì)人或動(dòng)物體治療的效果的方法，所述藥物用于與癌相關(guān)的癥狀斗爭(zhēng)，優(yōu)選血管生成，所述方法包含將權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所定義的式(III)或(IIIa)化合物或其鹽對(duì)所述身體給藥，并且測(cè)定由細(xì)胞受體對(duì)所述化合物的吸收，所述給藥和檢測(cè)任選但優(yōu)選重復(fù)進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(III)或(IIIa)化合物或其鹽的共軛物，它們作為放射性藥物，它們的制備方法，以及用于該方法的合成中間體。
文檔編號(hào)A61K51/08GK101151054SQ200580030720
公開日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2005年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者M·索爾巴肯, B·阿波, A·卡思伯森, A·吉布森 申請(qǐng)人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)股份有限公司, 通用電氣健康護(hù)理有限公司