專利名稱：細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)和用于免疫治療的應(yīng)用的制作方法
細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)和用于免疫治療的應(yīng)用
背景技術(shù)：
人的免疫系統(tǒng)不能控制和清除許多致病的感染和惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)。用 于慢性感染和癌癥的成功治療疫苗和免疫療法依賴于新方法的研發(fā)， 這種新的方法用作誘導(dǎo)有力免疫應(yīng)答的有效方式，該免疫應(yīng)答能夠控 制和清除與病理學(xué)相關(guān)的攻擊性抗原。
T細(xì)胞識(shí)別抗原的能力依賴于抗原與主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) I或MHC II蛋白的結(jié)合。例如，細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答與MHC-I 蛋白結(jié)合呈遞的抗原。因此，如果細(xì)胞不同時(shí)表達(dá)合適的MHC-I蛋白， 殺滅病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞將不會(huì)殺滅該細(xì)胞。輔助T細(xì)胞 識(shí)別MHC-II蛋白。輔助T細(xì)胞活性通常依賴于抗原呈遞細(xì)胞上抗原的 識(shí)別和這些細(xì)胞上"自身"MHC-II蛋白的存在。對(duì)與自身MHC蛋白結(jié) 合的抗原的識(shí)別的需要稱為MHC限制。在幾乎所有有核細(xì)胞的表面上 發(fā)現(xiàn)了 MHC-I蛋白。在特定細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)了 MHC-II蛋白，這些細(xì) 胞包括脾臟的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞以及皮膚的朗格漢斯細(xì)胞。 引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟是激活識(shí)別MHC-II限制性外 源抗原的CD4+輔助T細(xì)胞。在抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞(DC)中的 細(xì)胞內(nèi)體途徑中捕獲和加工這些抗原。在內(nèi)體和溶酶體中，將抗原加 工成小的抗原肽，其在Golgi區(qū)室中復(fù)合到MHC-II上來(lái)形成抗原 -MHC-II復(fù)合體。該復(fù)合體在細(xì)胞表面上表達(dá)，這種表達(dá)誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞的激活。
誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物有效免疫應(yīng)答中的其他關(guān)鍵事件涉及008+ T細(xì)胞和 B細(xì)胞的激活。當(dāng)所需的蛋白通過細(xì)胞發(fā)送，使其作為與MHC-I抗原 復(fù)合的經(jīng)過加工的蛋白在細(xì)胞表面上呈遞時(shí)，CD8+細(xì)胞得到激活。B 細(xì)胞可以通過它們的表面免疫球蛋白(IgM和IgD)與抗原相互作用而不需要MHC蛋白。然而，CD4+T細(xì)胞的激活刺激了免疫系統(tǒng)的所有分 支。激活時(shí)，CD4+T細(xì)胞(輔助T細(xì)胞)產(chǎn)生白細(xì)胞介素。這些白細(xì) 胞介素幫助激活免疫系統(tǒng)的其他分支。例如，輔助T細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞 介素_4 ( IL-4 )和白細(xì)胞介素-5 ( IL-5 )，這些幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體； 白細(xì)胞介素-2 (IL-2)，其激活了 CD4+和CD8+T細(xì)胞；和y干擾素， 其激活了巨噬細(xì)胞。因?yàn)樽R(shí)別MHC-II限制性抗原的輔助T細(xì)胞在細(xì)胞 毒性T-細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞的激活和克隆擴(kuò)充中 起著關(guān)鍵作用，響應(yīng)抗原激活輔助T細(xì)胞的最初事件對(duì)于誘導(dǎo)針對(duì)該 抗原的有效免疫應(yīng)答是關(guān)鍵的。已經(jīng)報(bào)道了使用源自溶酶體跨膜蛋白 的序列來(lái)刺激輔助T細(xì)胞激活的嘗試。然而，這些嘗試沒有獲得對(duì)測(cè) 試哺乳動(dòng)物就CD8+ T細(xì)胞和B細(xì)胞而言的有效免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
除了 T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中起的關(guān)鍵作用，DC同樣重要。DC是在自 身抗原耐受性維持以及先天免疫和獲得性免疫激活中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作 用的專門性抗原呈遞細(xì)胞(Banchereau等，1998, Nature 392:245-52; Stei麵n等，2003， A謹(jǐn).Rev. Immunol. 21: 685-711 )。當(dāng)DC遇 到促炎癥刺激物如微生物產(chǎn)物時(shí)，通過上調(diào)細(xì)胞表面表達(dá)的裝載抗原 肽的MHC分子和共刺激分子來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞的成熟過程。成熟并歸巢至局 部淋巴結(jié)后，DC建立了與T細(xì)胞的接觸，通過形成免疫突觸，其中T 細(xì)胞受體(TCR)和共刺激分子聚集于由粘附分子圍繞的中心區(qū)域中
(Dustin等，2000， Nat. Immunol. 1:23-9)。 一旦得到激活，CD8+ T細(xì)胞可以自主地增殖幾個(gè)世代并獲得細(xì)胞毒性功能而不需要進(jìn)一步 的抗原刺激(Kaech等，2001， Nat. Immunol. 2: 415—22; vanStipdonk 等，2001， Nat. Immunol. 2:423-9 )。因此已經(jīng)提出了由DC提供的 肽-MHC復(fù)合體(信號(hào)1)和共刺激分子(信號(hào)2)的水平和持續(xù)時(shí)間 對(duì)于決定抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的規(guī)模和結(jié)局是必要的
(Lanzavecchia等，2001， Nat. Immunol. 2:487-92; Gett等，2003, Nat. Immunol. 4: 355-60 )。
研發(fā)腫瘤疫苗的主要工作嘗試了促進(jìn)DC成熟和共刺激，作為增強(qiáng) 抗肺瘤免疫性的方式。然而，對(duì)抗自身腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的免疫性的誘導(dǎo)受到內(nèi)在抑制機(jī)制的限制，其中許多機(jī)制尚須明確。 一種已知
的抑制機(jī)制是T-細(xì)胞上的細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞抗原4 (CTLA4)和相 關(guān)分子用于通過與DC或其他細(xì)胞上的B7家族分子的細(xì)胞-細(xì)胞接觸來(lái) 控制效應(yīng)T-細(xì)胞激活的規(guī)模。DC成熟作為從自身耐受性維持至免疫性 誘導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)換。然而，成熟抗原呈遞DC是否具有允許它們?cè)谶^了成 熟點(diǎn)后控制獲得性免疫規(guī)模和持續(xù)時(shí)間的負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制仍然是不清楚 的。
細(xì)胞因子決定性地涉及多種免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)(Curtsinger 等，2003，J. Exp. Med. 197: 1141-51; Valenzuela等，2002， J. Immunol. 169: 6842-9 ) 。 DC使用toll樣受體(TLR),其識(shí)別保守的微生物結(jié) 構(gòu)如脂多糖(LPS)，通過激活核因子-kB (NF-kB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái) 促進(jìn)DC成熟(Akira等，2004, Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511 )。 然后NF-kB家族成員介導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子如IL-2的表達(dá)，導(dǎo)致先天 免疫和獲得性免疫的誘導(dǎo)(Akira等，2004 ， Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511; Beutler等，2003， Nat. Rev. Immunol. 3: 169-76; Ja腳ay 等，2002， Annu. Rev. Immunol. 20:197-216 ) 。 DC成熟后，細(xì)胞因 子產(chǎn)生和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為受到緊密調(diào)節(jié)以促進(jìn)對(duì)抗外源抗原 的有益免疫應(yīng)答同時(shí)限制過度自身免疫激活。然而，這些途徑的特異 性反饋抑制機(jī)制的重要性和所得到的對(duì)自身抗原特異性免疫應(yīng)答的控 制仍然是不太明確的。
SOCS1是通過多種細(xì)胞因子包括干擾素(IFN) - y、白細(xì)胞介素 (IL)-2、 IL-6、 IL-7、 IL-12和IL-15可誘導(dǎo)的負(fù)向信號(hào)反饋調(diào)節(jié) 劑(Kubo等，2003， Nat. Im醒ol. 4:1169-76; Alexander等，2004， Annu. Rev. Immunol. 22:503-29 ) 。 SOCS1作為假底物抑制劑通過結(jié) 合上游Janus激酶(JAK)的活化環(huán)和/或靶向JAK進(jìn)行蛋白酶降解， 抑制了多種轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活物(STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Kubo 等，2003， Nat. I畫no1. 4: 1169-76; Alexander等，2004， Annu. Rev. Immunol. 22:503-29 ) 。 S0CS1還通過其SOCS盒區(qū)域通過耙向p65蛋 白進(jìn)行遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白水解而阻斷了 NF-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ryo等，2003， Mol. Cell. 12:1413-26) 。 SOCSl-缺陷(-/-)小鼠作為患有 嚴(yán)重全身性炎癥以及T和NKT細(xì)胞異常活化的新生兒死亡，主要是由 于不受控制的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Marine等，1999， Cel 1 98: 609-16; Alexander等，1999， Cell 98:597-608; Naka等，2001, Immunity 14:535-45 )。盡管關(guān)于S0CS1在DC中的功能知道得很少，最近的研 究表明S0CS1在控制抗原呈遞細(xì)胞(APC)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用(Kubo 等，2003， Nat. Immunol. 4:1169-76; Hanada等，2003， Immunity 19: 437-50 ),通過LPS或CpG-DNA刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的S0CS1表達(dá)， 且SOCSl-/-小鼠對(duì)LPS誘導(dǎo)的休克比野生型的同窩出生者更敏感 (Crespo等，2000， Biochem. J. 349: 99-104; Dalpke等，2002， J. Immunol 166: 7082-9; Nakagawa等，2002, Immunity 17: 677-87; Kinjyo等，2002， Immunity 17: 583-91 )。此外，其中基于SOCSl-/-背景已經(jīng)在T細(xì)胞和B細(xì)胞中恢復(fù)S0CS1表達(dá)小鼠的S0CS1-/-DC對(duì) IFNy和LPS是高應(yīng)答性的，引發(fā)了異源T細(xì)胞擴(kuò)增并誘導(dǎo)了 B細(xì)胞的 異常擴(kuò)增和自身反應(yīng)性抗體產(chǎn)生(Hanada等，2003, Immunity 19: 437-50 )。
盡管關(guān)于SOCS1在DC中的功能知道得很少，最近的研究已經(jīng)證明 了 SOCS1在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用。例如，已經(jīng)證明了 S0CS1-/-DC呈現(xiàn)更成熟的表型并觀察到對(duì)脂多糖(LPS)是高應(yīng)答性 的，LPS與Toll-樣受體(TLR) 4相互作用來(lái)用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。還觀察 到S0CS1-/-DC誘導(dǎo)了自身反應(yīng)性抗體產(chǎn)生。這些觀察暗示了 SOCS1 可能通過控制JAK/STAT途徑和TLR/NF- k B途徑在DC負(fù)調(diào)節(jié)中的可能 作用。
已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試在免疫治療中使用DC來(lái)刺激哺乳動(dòng)物的免 疫應(yīng)答。在這些努力中，通過裝載抗原并使它們?cè)陔x體的環(huán)境中成熟 來(lái)操縱DC，使得它們刺激癌癥患者的抗腫瘤免疫性。對(duì)于使用免疫療 法來(lái)對(duì)抗人免疫缺陷病毒(HIV)，還沒有出現(xiàn)有效的人免疫缺陷病毒 (HIV)疫苗。因此，本領(lǐng)域中長(zhǎng)期感受到對(duì)引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答以 治療疾病的有效且定向方式的需要。本發(fā)明滿足了這種需要。發(fā)明概述
本發(fā)明包括用于增強(qiáng)免疫細(xì)胞免疫效能的組合物。優(yōu)選，組合物
包括細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressor of cytokine signaling) ( S0CS )、含SH2的磷酸酶(SHP )或活化STAT的蛋白抑 制劑(PIAS)中任何一種或多種的抑制劑。更優(yōu)選地，抑制劑干擾所 述細(xì)胞中的負(fù)向調(diào)節(jié)途徑。
特定實(shí)施方案中，抑制劑選自小干擾RNA (siRNA)、微RNA、反 義核酸、核酶、編;馬轉(zhuǎn)顯性(transdominant)陰性突變體的表達(dá)栽體、 胞內(nèi)抗體、肽和小分子。優(yōu)選，抑制劑是siRNA。
再一方面中，siRNA選自雙鏈寡核苷酸、單鏈寡核苷酸和多核苷酸。
再一方面中，s iRNA是化學(xué)合成的。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制 劑的組合物，其中組合物進(jìn)一步含有生理學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選， 生理學(xué)上可接受的載體是脂質(zhì)體。
另一實(shí)施方案中，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑是由克隆至 表達(dá)載體中的分離的多核苷酸編碼的。表達(dá)載體選自質(zhì)粒DNA、病毒 栽體、細(xì)菌載體和哺乳動(dòng)物載體。另一方面中，表達(dá)栽體進(jìn)一步包括 促進(jìn)分離的多核苷酸整合至宿主細(xì)胞基因組中的整合信號(hào)序列。
本發(fā)明還包括細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)的抑制劑，其 中SOCS選自S0CS1、 S0CS2、 S0CS3、 S0CS4、 S0CS5、 S0CS6、 S0CS7 和細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白(CIS)。
另一方面中，本發(fā)明包括含有SH2的磷酸酶(SHP)的抑制劑，其 中SHP選自SHP-l和SHP-2。
再一方面中，本發(fā)明包括活化STAT蛋白抑制劑(PIAS )的抑制劑， 其中PIAS選自PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy。
本發(fā)明還包括用于增強(qiáng)免疫細(xì)胞免疫效能的組合物，其中組合物 進(jìn)一步包括具有至少一個(gè)表位的抗原。優(yōu)選，表位能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。另一方面中，表位誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。再 一方面中，表位誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。再一方面中，表位 誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞應(yīng)答。
另一實(shí)施方案中，通過表達(dá)載體來(lái)表達(dá)抗原。進(jìn)一步的方面中， 抗原是分離的多肽。
再一實(shí)施方案中，抗原與疾病相關(guān)。優(yōu)選，疾病選自感染性疾病、 癌癥和自身免疫性疾病。
一方面中，感染性疾病是由選自病毒、細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物的 致病微生物引起的。
另一實(shí)施方案中，抗原是由病毒基因編碼的。優(yōu)選，病毒基因源 自選自乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒和皰滲病 毒的病毒。
一方面中，抗原是由選自乙肝病毒e抗原基因、乙肝病毒表面抗 原基因和乙肝病毒核心抗原基因的病毒基因編碼的。
另一方面中，抗原是由選自人免疫缺陷病毒Envgpl60基因、Gag 基因、Pol基因、Rev基因、Tat基因、Vif基因和Nef基因的病毒基 因編碼的。
再一方面中，抗原是由選自乳頭瘤病毒E7基因和乳頭瘤病毒E6 的病毒基因編碼的。
再一方面中，抗原是由源自皰滲病毒的病毒基因編碼的，皰滲病 毒選自l型單純皰滲病毒、2型單純皰滲病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、 人皰滲病毒6、人皰滲病毒7和人皰滲病毒8。
一實(shí)施方案中，抗原與癌癥相關(guān)，其中癌癥選自乳癌、宮頸癌、 黑素瘤、直腸癌和前列腺癌。
進(jìn)一步的方面中，腫瘤相關(guān)抗原選自超表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原、睪 丸腫瘤抗原、突變的腫瘤相關(guān)抗原、分化腫瘤相關(guān)抗原酪氨酸酶、MART、 trp、 MAGE-1、 MAGE-2、 MAGE-3、 gp100、 HER-2、 Ras和PSA。
再一方面中，腫瘤相關(guān)抗原選自BCR-ABL、 CASP、 CDK、 Ras、 p53、 腿-2/扁、CEA、 MUC、 TW1、 PAP、 survivin、端粒酶、EGFR、 PSMA、PSA、 PSCA、酪氨酸酶、MART、 TRP、 gp100、 MART、 MAGE、 BAGE、 GAGE、 LAGE/NY-ESO、 RAGE、 SSX-2、 CD19和CD20。
另一實(shí)施方案中，抗原與選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 多發(fā)性硬化癥、牛皮瓣和節(jié)段性回腸炎的疾病相關(guān)。
本發(fā)明還包括組合物，該組合物包括細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的 抑制劑和具有至少一個(gè)能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的表位的抗原，并進(jìn)一步包 括細(xì)胞因子和Toll-樣受體(TLR)激動(dòng)劑。
一方面中，通過表達(dá)載體來(lái)表達(dá)細(xì)胞因子或TLR激動(dòng)劑。優(yōu)選， 細(xì)胞因子或TLR激動(dòng)劑是分離的多肽。
另一方面中，細(xì)胞因子選自IL-12、 TNFoc、 IFNct、 IFN P 、 IFN Y、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
本發(fā)明還包括含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑的組合物， 其中抑制劑抑制對(duì)Janus激酶(JAK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。
另 一實(shí)施方案中，組合物包括細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑， 該抑制劑抑制對(duì)Toll-樣受體(TLR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。
再一實(shí)施方案中，組合物包括細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑， 該抑制劑抑制對(duì)NK-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。
本發(fā)明包括用于增強(qiáng)細(xì)胞免疫效能的組合物，其中組合物包括載 體，該載體含有編碼抑制劑的第 一 多核苷酸和編碼具有至少 一 個(gè)表位 的抗原的第二多核苷酸，其中抑制劑抑制所述細(xì)胞中的細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，其中至少一個(gè)表位誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還包括用于增強(qiáng)細(xì)胞免疫效能的組合物，其中組合物包括 載體，該載體含有編碼抑制劑的第一多核苷酸和編碼細(xì)胞因子的笫二
多核苷酸，其中抑制劑抑制所述細(xì)胞中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑。 優(yōu)選，第二多核苷酸編碼的細(xì)胞因子選自IL-2、 TNFcc、 IFNot、 IFN 卩、IFNy、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
本發(fā)明還包括含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑的細(xì)胞。優(yōu) 選，細(xì)胞是選自APC、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì) 胞的免疫細(xì)胞。另一方面中，細(xì)胞進(jìn)一步包括具有至少一個(gè)表位的抗原，其中至 少一個(gè)表位能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
再一方面中，細(xì)胞進(jìn)一步包括含有編碼細(xì)胞因子的多核苷^的表 達(dá)載體。
本發(fā)明還包括產(chǎn)生沉默細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞接觸細(xì)胞因子信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括產(chǎn)生經(jīng)沉默并脈沖(pulsed)的細(xì)
胞的方法，包括將細(xì)胞接觸細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑并進(jìn)一
步將細(xì)胞接觸具有至少一個(gè)表位的抗原，其中至少一個(gè)表位能夠引發(fā)
哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還包括引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括將含有細(xì)胞因 子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑的組合物給藥于有此需要的哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括 將含有沉默細(xì)胞的組合物給藥于有此需要的哺乳動(dòng)物，其中沉默細(xì)胞 含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑。優(yōu)選，在將沉默細(xì)胞給藥于 有此需要的哺乳動(dòng)物之前將沉默細(xì)胞在體外接觸抗原。另 一方面中， 還可以在將沉默細(xì)胞給藥于有此需要的哺乳動(dòng)物之后將沉默細(xì)胞在體 內(nèi)接觸抗原。
附圖筒述
出于說(shuō)明本發(fā)明的目的，在附圖中描繪了本發(fā)明的特定實(shí)施方案， 然而，本發(fā)明不限于附圖中所述實(shí)施方案的精確排列和說(shuō)明。


圖1,包括圖1A和1B,是系列圖，證明了通過SOCSl-siRM下調(diào) 了 S0CS1的表達(dá)。圖1A描繪了用小鼠S0CS1 siRNA共轉(zhuǎn)染的293T細(xì) 胞的蛋白質(zhì)印跡測(cè)試。圖1B描繪了用S0CS1 siRNA oligo轉(zhuǎn)染的DC 的定量RT-PCR測(cè)試。
圖2是證明了用S0CS1 siRNA轉(zhuǎn)染的DC對(duì)LPS或IFN-Y比用siTNA 突變體轉(zhuǎn)染的DC應(yīng)答性更高的圖，通過增加的促炎癥細(xì)胞因子如IL-6 和TNF-ot的分泌來(lái)表示。圖3是重組慢病毒栽體的圖示；LV-SOCSl-siRNA和LV-GFP-siRNA。
圖4,包括圖4A和4B，是系列圖，證明了 S0CS1負(fù)向調(diào)節(jié)了 DC 體外刺激抗原特異性CTL的能力。圖4A描繪了在SOCSl-siRM-DC共 培養(yǎng)物中卵清蛋白特異性TCR T細(xì)胞(OT-1)比在siRNA-DC突變體共 培養(yǎng)物中增殖地更多的事實(shí)。和這些數(shù)據(jù)相一致，SOCSl-siRNA-DC共 培養(yǎng)物中分泌的促炎癥細(xì)胞因子的水平更高(圖4B)。
圖5,包括圖5A至5C，是系列圖，證明了 S0CS1負(fù)向調(diào)節(jié)了 DC 體內(nèi)引發(fā)抗原特異性T-細(xì)胞應(yīng)答的能力。圖5八表示總的門控008+ T 細(xì)胞群中H2-K7卵清蛋白-PE四聚體+T細(xì)胞的百分比。圖5B描繪了干 擾素Y UFNy ) ELISPOT測(cè)試。圖5C描繪了 CTL測(cè)試，證明了對(duì)抗 來(lái)自給予不成熟LV-S0CS1-s iRNA-DC小鼠的脾細(xì)胞的卵清蛋白+靶細(xì)胞 更有效的細(xì)胞毒性。
圖6，包括圖6A至6E，是系列圖，證明了體內(nèi)LPS刺激強(qiáng)烈地增 強(qiáng)了由S0CS1-沉默DC誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答。圖6A描繪了門控CD8+T細(xì)胞 中卵清蛋白-PE四聚體-陽(yáng)性T細(xì)胞的百分比。圖6B描繪了小鼠中CD8+ T細(xì)胞的IFN-y ELISPOT數(shù)量，該小鼠用卵清蛋白脈沖的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC 或模擬(mock) DC免疫，沒有離體的LPS誘導(dǎo)成熟，接著體內(nèi)LPS刺 激。圖6C和圖6D各自描繪了小鼠中CD8+T細(xì)胞的卵清蛋白-PE四聚 體+百分比和IFN-y ELISPOT數(shù)量，該小鼠用成熟DC免疫，接著體內(nèi) LPS刺激。圖6E證明了使用多種細(xì)胞因子和TLR激動(dòng)劑的體內(nèi)刺激增 強(qiáng)了由S0CS1-沉默DC引起的CTL應(yīng)答(ELISPOT)。
圖7，包括圖7A至7E，是系列圖，證明了增強(qiáng)的由SOCSl-沉默 DC誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫性。圖7A描繪了使用卵清蛋白脈沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC的免疫阻斷了預(yù)先建立的卵清蛋白+EG7腫瘤生長(zhǎng) 的事實(shí)。圖7B描繪了抗CD8抗體，而不是抗CD々抗體，消除了由卵清 蛋白脈沖的LV-SOCSl-siRNA-DC誘導(dǎo)的抗腫瘤活性的事實(shí)。圖7C至圖 7E描繪了小鼠中通過S0CS1 siRNA oligo雙鏈體轉(zhuǎn)染的DC增強(qiáng)的抗 腫瘤活性。
圖8，包括圖8A至8C，是系列圖，證明了通過SOCSl-沉默的DC
16增強(qiáng)的對(duì)抗自身腫瘤相關(guān)抗原的CTL應(yīng)答。圖8A描繪了成熟 LV-SOCSl-siRNA-DC有效地阻斷了預(yù)先建立的B16胂瘤的生長(zhǎng)，而成 熟LV-GFP-siRNA-DC不具有任何可觀察到的抑制效果的事實(shí)。圖8B 和圖8C各自描繪了 LV-SOCSl-siRM-DC小鼠中有效TRP-2特異性CTL 應(yīng)答的IFN-y ELISPOT和CTL測(cè)試。
圖9，包括圖9A至9C，是系列圖，證明了受S0CS1限制的成熟 DC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制對(duì)抗自身抗原的CTL應(yīng)答和抗腫瘤免疫性。圖9A描 繪了免疫后兩周小鼠中脾細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞中H2-Kb-TRP2-PE四聚體 -陽(yáng)性T細(xì)胞的百分比。圖9B描繪了免疫后三個(gè)月接受一次或三次體 內(nèi)LPS刺激的經(jīng)TRP2a-脈沖的SOCSl-siRM-DC免疫的小鼠中典型的 白癜風(fēng)。圖9C描繪了用TRP2a肽體外再次刺激后從經(jīng)免疫小鼠組匯 集的脾細(xì)胞對(duì)抗TRP2+B16的細(xì)胞毒性(上圖)和用S0CS1 siRM DC 免疫的野生型小鼠脾細(xì)胞對(duì)抗TRP2—EG. 7靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性(下圖)。
圖10，包括圖IOA至10D,是系列圖，證明了通過SOCSl-siRNADC 免疫根除了預(yù)先建立的B16腫瘤。圖IOA和IOB各自描繪了沒有使用 和使用LPS體內(nèi)刺激的野生型小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。圖IOC描繪了監(jiān) 測(cè)六十天小鼠的百分比存活。圖IOD描繪了從共注射LPS并接受TRP2a 肽刺激的經(jīng)免疫小鼠匯集的脾細(xì)胞分離的CD8+ T細(xì)胞的IFN-y ELISPOT測(cè)試。
圖11，包括圖11A至11C,是系列圖，證明了由低或高親和性肽 脈沖的S0CS1-沉默DC誘導(dǎo)的有效CTL應(yīng)答和抗腫瘤活性。圖IIA描 繪了沒有使用(圖1U-1)或使用LPS (圖11A-2)刺激的轉(zhuǎn)導(dǎo)DC上 共刺激/抑制分子的流式細(xì)胞分析。圖11B描繪了通過用低或高親和性 肽脈沖的S0CS1-siRNADC根除了預(yù)先建立的Bl6腫瘤。圖IIC描繪了 通過IFNy ELISPOT測(cè)試測(cè)量的用TRP2a或TRP2b肽刺激的抗原特異 性CTL應(yīng)答的比較。
圖12，包括圖12A至12D,是系列圖，證明了缺乏IL-12K0S0CS1 siMA-DC對(duì)有效抗腫瘤應(yīng)答的誘導(dǎo)。圖12A和圖12B各自描繪了腫瘤 體積和存活。圖12C描繪了用TRP2a肽體外刺激后的IFNy ELISPOT測(cè)試。圖12D描繪了使用TRP2+ B16靶細(xì)胞用TRP2a肽體外刺激后的 CTL測(cè)試。
圖13，包括圖13A至13D,是系列圖，證明了 S0CS1控制DC的 IL-2和IL-12誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生。圖13A描繪了 SOCSl siRNA DC 響應(yīng)LPS和平板包,皮的抗-CD40 mAb連續(xù)刺激而分泌的IL-2水平。圖 13B描繪了最初24小時(shí)刺激后除去這些刺激物后的IL-12水平。圖13C 描繪了 SOCSl siRNA DC響應(yīng)LPS和平板包被的抗CD40 mAb刺激24 小時(shí)接著除去刺激物而分泌的TNFcc和IL-6的水平。圖13D描繪了 p35-Z-或wt SOCSl siRNA DC響應(yīng)LPS和平板包被的抗CD40 mAb連 續(xù)刺激而分泌的TNFct和IL-6的水平。
圖14，包括圖14A和14B，是系列圖，證明了體內(nèi)給予IL-12增 強(qiáng)了 SOCSl沉默DC免疫。圖14A描繪了通過體內(nèi)給予IL-12增強(qiáng)的抗 腫瘤活性。圖14B描繪了通過IL-12增強(qiáng)的TRP2-特異性CTL應(yīng)答。
圖15,包括圖15A至15D,是系列圖，證明了通過沉默DC中的 S0CS1增強(qiáng)了 gpl20-特異性抗體和CTL應(yīng)答。圖15A說(shuō)明了 LV-SOCSl-siRNA-DC引發(fā)了比對(duì)照LV-GFP-siRM-DC顯著更強(qiáng)烈的 gp-120特異性IgM和IgG應(yīng)答。圖15B顯示了與LV-GFP-siRNA-DC小 鼠的相應(yīng)亞類相比較，用LV-S0CS1-siRNA-DC免疫的小鼠中所有IgG 亞類中HIV-Env特異性抗體滴度的劇烈增加。圖15C顯示了 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠體內(nèi)對(duì)抗gpl20-脈沖的耙細(xì)胞的CTL活性比 LV-GFP-siRNA-DC小鼠體內(nèi)的那些顯著更有效。圖15D顯示了 LV-SOCS-siRM-DC小鼠體內(nèi)IFN-y十T細(xì)胞的百分比更高。
圖16，包括圖16A至16D,是系列圖，證明了通過S0CS1沉默DC 增強(qiáng)的Thl-和Th-2極化細(xì)胞因子的產(chǎn)生。圖16A描繪了 LPS刺激后 與GFP-siRNA-DC相比較，LV-SOCSl-siRM-DC產(chǎn)生的IL-12、 IFN-y 和TNFcx的水平。圖16B描繪了 gp-120特異性CD4+ T細(xì)胞的頻率。 圖16C說(shuō)明了 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的CD4+ T細(xì)胞響應(yīng)gpl20脈 沖DC刺激的增殖比LV-GFP-siRNA-DC小鼠更活躍。圖16D顯示了 S0CS1 沉默DC中Thl-極化(IFN- y 、 IL-2和TNF a )和Th2-極化(IL-4和IL-IO)細(xì)胞因子提高的水平。
圖17，包括圖UA至17D，是系列圖，證明了通過S0CS1-沉默DC 增強(qiáng)的gpl20特異性B細(xì)胞激活。圖17A描繪了經(jīng)LPS刺激APRIL和 BAFF mRNA的表達(dá)水平。圖17B描繪了 LV-SOCSl-siRNA-DC和 LV-GFP-siRNA-DC小鼠中產(chǎn)生抗gpl20 IgG的B細(xì)胞的頻率。圖17C 描繪了用抗CD40和IL-4共同刺激時(shí)，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B 細(xì)胞比LV-GFP-siRNA-DC小鼠的B細(xì)胞更強(qiáng)有力地增殖。圖17D描繪 了 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B細(xì)胞響應(yīng)各種刺激物而產(chǎn)生更高含量 的多種細(xì)胞因子，包括IL-6、 IL-12和TNF-a。
圖18，包括圖18A至18B，是系列圖，證明了由S0CS1沉默DC 誘導(dǎo)的長(zhǎng)期gpl20特異性抗體和CTL應(yīng)答。圖18A描繪了 LV-GFP-siRNA-DC免疫小鼠中的 gpl20 特異性抗體，與 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠相比較。圖 18B i兌明了 LV-SOCSl-siRNA-DC 小鼠中 gpl20特異性 CTL應(yīng)答，與 LV-GFP-siRNA-DC小鼠相比較。圖18C說(shuō)明了免疫后六個(gè)月時(shí) LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中CD44hi和IFN y + CD8+ T細(xì)胞的百分比, 與LV-GFP-siRM-DC小鼠相比較。圖18D說(shuō)明了免疫后六個(gè)月時(shí)在 LV-S0CS1-siRNA-DC小鼠中維持并快速誘導(dǎo)了 gpl2Q-特異性C4+ Th 應(yīng)答。
圖19,包括圖19A至19E，是系列圖，證明了 S0CS1沉默DC對(duì) HIV Env介導(dǎo)的免疫抑制的抗性。圖19A說(shuō)明了在gpl20蛋白存在下 LV-SOCSl-siRNA-DC保持了應(yīng)答LPS的能力。預(yù)先暴露于gpl20蛋白 對(duì)LV-S0CS1-s iRM-DC誘導(dǎo)OVA特異性抗體應(yīng)答的能力不具有明顯的 效果(圖19B和19C)，也沒有損害由LV-SOCSl-siRNA-DC誘導(dǎo)的OVA-特異性CD8+ CTL和CD4+ Th應(yīng)答(圖19D和19E )。
圖20，包括圖20A至20D,是系列圖，證明了通過SOCSl siRNA 增強(qiáng)了 HIV DNA疫苗。圖20A描繪了用pSuper-SOCSl-siRNA DNA共 免疫的小鼠中HIVEnv-特異性抗體滴度的提高。圖20B和20C說(shuō)明了 通過pSuper-SOCSl-siRNA DNA的共同注射顯著增強(qiáng)了 HIV Env-特異性CTL應(yīng)答，如分別通過CTL和ELISPOT測(cè)試所證明的。圖20D描繪 了通過共同注射SOCSl-siRNA DNA增強(qiáng)了 HIV Env-特異性CD4+ Th應(yīng) 答的事實(shí)。
圖21，包括圖21A至21C，是系列圖，證明了人單核細(xì)胞來(lái)源的 DC中人S0CS1的沉默。圖2U說(shuō)明了人S0CS1 siRNA有效地下調(diào)了人 S0CS1表達(dá)。圖21B說(shuō)明了合成的siRNA雙鏈體至源自人單核細(xì)胞的 DC中的轉(zhuǎn)染效率。圖21C說(shuō)明了 hSOCSl siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染的總DC群 中hSOCSl mRNA的含量。
圖22，包括圖22A至22C，是表征人S0CS1沉默DC的系列圖。圖 22A描繪了所示人S0CS1的流式細(xì)胞分析。圖22B和22C說(shuō)明了 hSOCSl siRNA轉(zhuǎn)染DC中促炎癥細(xì)胞因子如IL-2、IL-6和TNF-a的分泌水平， 與siRNA突變體轉(zhuǎn)染的人DC相比較。
圖23，包括圖23A至23C，是系列圖，證明了增強(qiáng)的人S0CS1沉 默DC引發(fā)抗原特異性CTL應(yīng)答的免疫刺激功效。從四個(gè)使用不同 HLA-A2+捐獻(xiàn)者的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一顯示了門控CD3+和CD8+T細(xì)胞群中的 MAGE3-PE四聚體+T細(xì)胞百分比(圖23A)，胞內(nèi)IFNy+ T細(xì)胞百分 比(圖23B )，和IFN- y + ELISPOT數(shù)量(圖23C )。
圖24是描繪了人源化HLA-A2. 1轉(zhuǎn)基因小鼠中增強(qiáng)的人MAGE3-特 異性CTL應(yīng)答的圖。
圖25，包括圖25A和25B,是系列圖，證明了通過人 SOCSl-siRNA-DC激活的人CTL的腫瘤裂解活性。從四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一 顯示了在MAGE3-脈沖的hSOCSl-siRNA DC或?qū)φ誅C與自身T細(xì)胞在 抗人11^-12抗體不存在或存在下兩周共培養(yǎng)后，對(duì)抗人1^^￡3+,111^42+ 黑素瘤細(xì)胞(SK-Mel-37)(圖25A)和對(duì)照人MAGE3+, HLA-A2—黑素 瘤細(xì)胞(M-6-Mel)(圖25B)的細(xì)胞裂解活性。
圖26，包括圖26A和26B，是系列圖，證明了經(jīng)免疫的HLA-A2. 1 轉(zhuǎn)基因小鼠激活的CTL的腫瘤裂解活性。用MAGE3肽體外再次刺激5 天后測(cè)定了對(duì)抗人SK-Mel-37細(xì)胞(圖26A )和對(duì)照人HLA-A2—NA-6-Mel 細(xì)胞(圖26B)的細(xì)胞毒性，并從三個(gè)實(shí)驗(yàn)之一來(lái)呈現(xiàn)。圖27,包括圖27A和27B,是系列圖，證明了用S0CS1 s匿Aoligo 雙鏈體的共同免疫增強(qiáng)了體內(nèi)蛋白免疫。
圖28是描繪了表達(dá)人S0CS1 siRNA的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的 圖。圖28還證明了 Ad-人S0CS1 siRNA對(duì)人DC的轉(zhuǎn)染。
圖29是描繪了通過對(duì)T細(xì)胞的S0CS1 siRNAoligo雙鏈體轉(zhuǎn)染增 強(qiáng)的CTL活性的圖。
圖30是描繪了 siRNA候選物的核酸序列的圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑來(lái)增 強(qiáng)免疫細(xì)胞的免疫效能。本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中抗原呈遞 的組合物和方法，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)或活化STAT的蛋 白抑制劑(PIAS)。本發(fā)明提供了疫苗和治療方法，其中通過調(diào)節(jié)細(xì) 胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)了免疫細(xì)胞的免疫效能。此外，本發(fā)明還 提供了破壞腫瘤疫苗接種中自身耐受性的機(jī)制。因此，本發(fā)明提供了 通過增強(qiáng)細(xì)胞的免疫刺激能力干擾免疫細(xì)胞中負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 的治療益處。
定義
如在此所用的，以下每個(gè)術(shù)語(yǔ)具有該部分中伴隨其的意思。 在此所用的冠詞"一種"和"一個(gè)"指的是一個(gè)或多于一個(gè)(即，
至少一個(gè))該冠詞的語(yǔ)法賓語(yǔ)。例如"一個(gè)元件"意思是一個(gè)元件或
多于一個(gè)元件。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解術(shù)語(yǔ)"約"并在其使用的上下文中將有一 定程度的改變。
"同種異體"指的是源自相同物種不同動(dòng)物的移植物。 "同種異體抗原，，是不同于接收者所表達(dá)抗原的抗原。 如在此所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"，指的是免疫球蛋白分子，其能夠特異性結(jié)合抗原上的特異性表位?？贵w可以是源自天然來(lái)源或重組來(lái)源 的完整免疫球蛋白和可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分?？贵w通 常是免疫球蛋白分子的四聚體。本發(fā)明中的抗體可以以各種形式存在，
包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、 Fab和F(abh，以及單鏈抗 體和人源化抗體(Harlow等，1988; Houston等；Bird等，1988 )。 如在此所用的術(shù)語(yǔ)"抗原"或"Ag"定義為引發(fā)免疫應(yīng)答的分子。 這種免疫應(yīng)答可以涉及抗體產(chǎn)生，或特定免疫活性細(xì)胞的激活，或兩 者。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解任何大分子，包括幾乎所有蛋白質(zhì)或肽， 可以作為抗原。此外，抗原可以源自重組或基因組DNA。本領(lǐng)域技術(shù) 人員將理解任何DNA，其包括編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白的核苷酸序列 或部分核苷酸序列，因此編碼如在此所用的術(shù)語(yǔ)"抗原"。此外，本 領(lǐng)域技術(shù)人員將理解抗原不需要只通過基因的全長(zhǎng)核苷酸序列來(lái)編 碼。顯而易見的是本發(fā)明包括但不限于使用多于一個(gè)基因的部分核苷
外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解抗原根本不需要通過"基因"來(lái)編碼。顯 而易見的是抗原可以合成產(chǎn)生或可以源自生物學(xué)樣品。這樣的生物學(xué) 樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物學(xué)流體。
"抗原呈遞細(xì)胞"(APC)是能夠激活T細(xì)胞的細(xì)胞，并包括但不 限于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)。
術(shù)語(yǔ)"樹突細(xì)胞，，或"DC"指的是在淋巴或非淋巴組織中發(fā)現(xiàn)的 多種形態(tài)上相似細(xì)胞類型的群中的任何成員。這些細(xì)胞的特征在于它 們特征性的形態(tài)，高水平的表面MHC-II類表達(dá)?？梢詮亩喾N組織來(lái)源 分離DC。 DC具有敏化MHC-限制性T細(xì)胞的高能力并在原位向T細(xì)胞 呈遞抗原方面非常有效?？乖梢允窃赥細(xì)胞發(fā)育和耐受過程中表達(dá) 的自身抗原，和在正常免疫應(yīng)答過程中存在的外源抗原。
如在此所用的，"激活的DC"是已經(jīng)用抗原脈沖并能夠激活免疫 細(xì)胞的DC。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"成熟DC"定義為表達(dá)高水平的MHC II類、 CD80 ( B7. 1 )和CD86 ( B7. 2 )分子的樹突細(xì)胞。相反，不成熟樹突細(xì)
22胞表達(dá)低水平的MHC II類、CD8G (B7. 1)和CD86 (B7. 2)分子，但 具有極大的攝取抗原的能力。
"裝載抗原的APC"或"抗原脈沖的APC"包括已經(jīng)暴露于抗原并 通過抗原激活的APC。例如，APC可以在體外變成裝載Ag的，例如在 抗原存在下的培養(yǎng)過程中。還可以通過暴露于抗原在體內(nèi)裝栽APC。
通常以兩條途徑之一來(lái)制備"裝載抗原的APC，， ( 1)將稱為抗 原肽的小肽片段直接"脈沖"至APC的外表面上；或(2)用隨后通過 APC攝入的完整蛋白或蛋白顆粒來(lái)溫育APC。這些蛋白通過APC消化成 小肽片段并最終轉(zhuǎn)運(yùn)至APC表面并在APC表面上呈遞。此外，還可以 通過將編碼抗原的多核苷酸引入細(xì)胞中來(lái)產(chǎn)生裝載抗原的APC。
如在此所用的，術(shù)語(yǔ)"沉默的(silenced) APC"或"沉默的DC" 各自指的是已經(jīng)暴露于本發(fā)明的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑的 APC或DC。抑制劑優(yōu)選是siRNA形式。抑制劑能夠抑制細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑包括但不限于SOCS、 SHP、 PIAS等。與沒有用細(xì)胞因子信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑處理過的其他方面相同的APC相比較時(shí)，沉默APC 具有增強(qiáng)的免疫效能。
"反義"特別指的是編碼多肽的雙鏈DM分子的非編碼鏈的核酸 序列，或指的是與非編碼鏈基本上同源的序列。如在此所定義的，反 義序列與編碼多肽的雙鏈DNA分子的序列互補(bǔ)。不必定反義序列只與 DNA分子編碼鏈的編碼區(qū)域互補(bǔ)。反義序列可以與編碼多肽的DNA分 子編碼鏈上指定的調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)，該調(diào)節(jié)序列控制編碼序列的表達(dá)。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"自身免疫性疾病，，定義為由自身免疫應(yīng)答引 起的病癥。自身免疫性疾病是對(duì)自身抗原不當(dāng)和過度應(yīng)答的結(jié)果。自 身免疫性疾病的實(shí)例包括但不限于，艾迪生氏病、斑禿、強(qiáng)直性脊柱 炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、節(jié)段性回腸炎、糖尿病(I 型)、營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球腎炎、突眼性 曱狀腺腫、Guillain-Barr綜合征、橋本氏病、溶血性貧血、系統(tǒng)性 紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、尋常性天皰瘡、牛皮癬、風(fēng)濕 熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、Sjogren's綜合征、脊推關(guān)節(jié)病、甲狀腺炎、脈管炎、白癜風(fēng)、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性 結(jié)腸炎等。
如在此所用的，術(shù)語(yǔ)"自體的"意思是源自相同個(gè)體的任何材料， 之后將該材料再次引入該個(gè)體中。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"癌癥"定義為特征在于異常細(xì)胞快速和不受 控生長(zhǎng)的疾病。癌細(xì)胞可以局部擴(kuò)散或通過血流和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散至身 體的其他部分。各種癌癥的實(shí)例包括但不限于乳癌、前列腺癌、卵巢 癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋 巴瘤、白血病、肺癌等。
"細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑"或"細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑" 或"細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑"指的是能夠負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞中細(xì)胞因 子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑包括但不限于細(xì)胞
因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(S0CS1-S0CS7、細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的含有SH2 結(jié)構(gòu)域的蛋白(CIS ))、含有SH2的磷酸酶(SHP )和活化STAT的蛋 白抑制劑(PIAS)。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"DNA"定義為脫氧核糖核酸。 "供體抗原"指的是由待移植入受體的供體組織表達(dá)的抗原。 "受體抗原"指的是對(duì)供體抗原的免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。
如在此所用的，"效應(yīng)細(xì)胞"指的是介導(dǎo)對(duì)抗抗原的免疫應(yīng)答的 細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于T細(xì)胞和B細(xì)胞。
"編碼"指的是多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序 列作為生物過程中其他聚合物和大分子合成模板的內(nèi)在性質(zhì)，所述聚 合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、 tRNA和niRNA)或限 定的氨基酸序列和由此引起的生物特性。因此，如果對(duì)應(yīng)于基因的 mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物體系中產(chǎn)生蛋白，該基因就編碼 該蛋白。編碼鏈，其核苷酸序列與mRNA序列相同并通常提供于序列表 中，非編碼鏈，用作基因或cDM轉(zhuǎn)錄的模板，這兩者均可以稱為編碼 該蛋白或者該基因或cDNA的其他產(chǎn)物。
如在此所用的"內(nèi)源"指的是來(lái)自生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)的任何物質(zhì)或在生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的任何物質(zhì)。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"外源"指的是從生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)
引入的任何物質(zhì)或在生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外部產(chǎn)生的任何物質(zhì)。 如在此所用的術(shù)語(yǔ)"表位"定義為抗原上可以引發(fā)免疫應(yīng)答包括
B和/或T細(xì)胞應(yīng)答的小化學(xué)分子?？乖梢跃哂幸粋€(gè)或多個(gè)表位。大 多數(shù)抗原具有多個(gè)表位；即，它們是多價(jià)的。通常，表位一般為五個(gè) 氨基酸和/或糖大小。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解通常分子的整體三維結(jié) 構(gòu)，而不是特定線性序列，是抗原特異性的主要標(biāo)準(zhǔn)，因此將一個(gè)表 位與另一個(gè)區(qū)別開來(lái)。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"定義為特定核苷酸序列通過其啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"指的是含有編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的基 因產(chǎn)物的至少一部分的核酸序列的載體。 一些情況中，然后將RNA分 子翻譯成蛋白質(zhì)、多肽或肽。其他情況中，這些序列沒有得到翻譯， 例如，在反義分子、siRM、核酶等的產(chǎn)生中。表達(dá)載體可以含有各種 控制序列，其指的是對(duì)于可操作連接的編碼序列在特定宿主生物體中 轉(zhuǎn)錄和可能的翻譯所必需的核酸序列。除了支配轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序 列以外，載體和表達(dá)載體還可以含有起其他作用的核酸序列。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"輔助T細(xì)胞"定義為主要功能是促進(jìn)其他B 淋巴細(xì)月包和T淋巴細(xì)胞和或巨噬細(xì)胞的激活和功能的效應(yīng)T細(xì)胞。大 部分輔助T細(xì)胞是CD4 T細(xì)胞。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"異源"定義為源自不同物種的DNA或RM序 列或蛋白。
如在此所用的"同源"指的是兩個(gè)聚合分子之間的亞基序列相似 性，例如兩個(gè)核酸分子之間，例如兩個(gè)DNA分子或兩個(gè)RNA分子，或 兩個(gè)多肽分子之間。當(dāng)兩個(gè)分子中的亞基位置都由相同單體亞基占據(jù) 時(shí)，例如，如果兩個(gè)DNA分子各自中的一個(gè)位置由腺噤呤占據(jù)時(shí)，則 它們?cè)谠撐恢镁褪峭吹?。兩個(gè)序列之間的同源性是相匹配或同源位 置數(shù)目的直接函數(shù)，例如，如果兩個(gè)化合物序列中的一半(例如，十個(gè)亞基長(zhǎng)的聚合物中的五個(gè)位置)位置是同源的，則兩個(gè)序列是50% 同源，如果90%的位置例如IO個(gè)中的9個(gè)是相匹配的或同源的，兩個(gè) 序列具有90°/。的同源性。例如，DM序列3， ATTGCC5，和3， TATGGC 具有50%的同源性。
如在此所用的，"同源性"與"同一性"同義使用。 如在此所用的，"免疫原"指的是能夠刺激或誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中體 液抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"或"Ig"定義為功能作為抗體 的一類蛋白。這類蛋白中包括的五個(gè)成員是IgA、 IgG、 IgM、 IgD和 IgE。 IgA是身體分泌物如唾液、眼淚、乳汁、胃腸道分泌物以及呼吸 道和生殖泌尿道的粘膜分泌物中存在的主要抗體。IgG是最常見的循 環(huán)抗體。IgM是大部分哺乳動(dòng)物初級(jí)免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋 白。它是凝集、補(bǔ)體固定和其他抗體應(yīng)答中最有效的免疫球蛋白，且 在對(duì)抗細(xì)菌和病毒的防御中是重要的。IgD是無(wú)已知抗體功能的免疫 球蛋白，但可以作為抗原受體。IgE是通過在暴露于過敏原時(shí)引起介 質(zhì)從肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的釋放來(lái)介導(dǎo)速發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫球蛋 白。
"分離的核酸，，指的是已經(jīng)從天然存在狀態(tài)中其兩側(cè)序列分離的 核酸部分或片段，即，已經(jīng)從通常鄰接該片段的序列移出的DNA片段，
術(shù)語(yǔ)還適用從天然伴隨核酸的其他成分基本上純化的核酸，所述成分 即在細(xì)胞中天然伴隨的RM或DNA或蛋白質(zhì)。因此該術(shù)語(yǔ)包括，例如， 引入載體、自主復(fù)制質(zhì)?；虿《尽⒒蛟松锘蛘婧松锘蚪MDNA 中的重組DNA，或其作為獨(dú)立于其他序列的分離分子存在(即，作為 通過PCR或限制酶消化產(chǎn)生的cDM或基因組或cDNA片段)。還包括 重組DNA，其是編碼其他多肽序列的雜交基因的一部分。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，使用以下對(duì)于通常出現(xiàn)的核酸堿基的縮寫。 "A"指的是腺苷，"C"指的是胞嘧啶，"G"指的是鳥苷，"T"指 的是胸苷，和"U"指的是尿苷。
26如在此所用的術(shù)語(yǔ)"主要組織相容性復(fù)合體，，或"MHC，，定義為特 定的基因簇，其中許多在進(jìn)化上編碼涉及抗原呈遞的相關(guān)細(xì)胞表面蛋 白，它們是最重要的組織相容性決定簇。I類MHC或MHC-I，主要功能 在于對(duì)CD8T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞。II類MHC或MHC-II，主要功能在 于對(duì)CD4 T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)(modulate)"指的是生物學(xué)狀態(tài)的任 何改變，即增強(qiáng)、降低等。例如，術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"指的是正向或負(fù)向調(diào) 節(jié)S0CS1的表達(dá)或活性的能力，包括但不限于S0CS1 mRNA的轉(zhuǎn)錄、 S0CS1 mRNA的穩(wěn)定性、S0CS1 mRNA的翻譯、S0CS1多肽的穩(wěn)定性、S0CS1 翻譯后的修飾，或其任意組合。此外，術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)可以用來(lái)指活性的增 強(qiáng)、降低、遮掩、改變、超越或恢復(fù)，包括但不限于，與樹突細(xì)胞的 免疫效能相關(guān)的S0CS1活性。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"也適用于S0CS2、 S0CS3、 S0CS4、 S0CS5、 S0CS6、 S0CS7、 CIS、 PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和 PIASy) 、 SHP (SHP-1和SHP2)或任何其他相關(guān)活性。
除非另外指出，"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括為相互簡(jiǎn) 并形式并編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語(yǔ)編碼蛋白質(zhì)或 RNA的核苷酸序列還可包括內(nèi)含子，至編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以 在一些形式中含有內(nèi)含子的程度。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"定義為核苷酸鏈。此外，核酸是 核苷酸的聚合物。因此，如在此所用的核酸和多核苷酸是可互換的。 本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸是可以水解成單體"核苷酸"的多核苷酸的 一般知識(shí)。單體核苷酸可以水解成核苷。如在此所用的多核苷酸包括 但不限于通過本領(lǐng)域可用的任何方式獲得的所有核酸序列，這些方式 包括但不限于重組方式，即使用常用的克隆技術(shù)和PCIT等從重組文庫(kù) 或細(xì)胞基因組克隆核酸序列，和通過合成方式。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"多肽"定義為氨基酸殘基鏈，通常具有限定 的序列。如在此所用的術(shù)語(yǔ)多肽與術(shù)語(yǔ)"肽"和"蛋白質(zhì)"相互包含。
如在此所用的"增殖"指的是實(shí)體相似形式的復(fù)制或繁殖，例如 細(xì)胞的增殖。即，增殖包括更多數(shù)量細(xì)胞的產(chǎn)生，并特別地可以通過簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目、測(cè)量摻入細(xì)胞的力-胸苷等來(lái)測(cè)量。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"定義為被細(xì)胞合成機(jī)制識(shí)別的或引
入合成機(jī)制的啟動(dòng)多核苷酸序列特定轉(zhuǎn)錄所需要的DNA序列。
如在此所用的，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子/調(diào)控序列"意思是可操作連接至啟 動(dòng)子/調(diào)控序列的基因產(chǎn)物的表達(dá)所需的核酸序列。在一些情況中，該 序列可以是核心啟動(dòng)子序列，在其他情況中，這種序列還包括增強(qiáng)子 序列和基因產(chǎn)物表達(dá)需要的其他調(diào)控元件。啟動(dòng)子/調(diào)控序列可以是例 如以組織特異性方式表達(dá)基因產(chǎn)物的序列。
"組成型"啟動(dòng)子是可操作地連接編碼或限定基因產(chǎn)物的多核苷 酸時(shí)，導(dǎo)致在大部分或所有的細(xì)胞生理?xiàng)l件下在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物 的核苷酸序列。
"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子是可操作地連接編碼或限定基因產(chǎn)物的多核苷 酸時(shí)，基本上只在細(xì)胞中存在對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑時(shí)導(dǎo)致在細(xì)胞中 產(chǎn)生基因產(chǎn)物的核苷酸序列。
"組織特異性"啟動(dòng)子是可操作地連接編碼或限定基因產(chǎn)物的多 核苷酸時(shí)，基本上只在細(xì)胞是對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子的組織型細(xì)胞時(shí)導(dǎo)致在細(xì) 胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的核苷酸序列。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"RM"定義為核糖核酸。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"重組DM"定義為通過連接不同來(lái)源的DNA 片段而產(chǎn)生的DM。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"重組多肽"定義為使用重組DNA方法產(chǎn)生的 多肽。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"自身抗原"定義為由宿主細(xì)胞或組織表達(dá)的 抗原。自身抗原可以是腫瘤抗原，但在特定實(shí)施方案中，在正常和胖 瘤細(xì)胞中都表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解自身抗原可在細(xì)胞中超 表達(dá)。
如在此所用的"基本上純化的"細(xì)胞是基本上無(wú)其他細(xì)胞類型的 細(xì)胞?；旧霞兓募?xì)胞還指的是已經(jīng)從天然存在狀態(tài)中通常伴隨其 的其他細(xì)胞類型分離出來(lái)的細(xì)胞。 一些情況中，基本上純化的細(xì)胞群指的是同源的細(xì)胞群。其他情況中，該術(shù)語(yǔ)簡(jiǎn)單地指已經(jīng)從天然存在 狀態(tài)中通常伴隨的細(xì)胞分離出來(lái)的細(xì)胞。 一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是體 外培養(yǎng)物。其他實(shí)施方案中，細(xì)胞不在體外培養(yǎng)。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"T-細(xì)胞"定義為胸腺衍生的參與各種細(xì)胞介
導(dǎo)的免疫反應(yīng)的細(xì)胞。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"B-細(xì)胞"定義為源自骨髓和/或脾臟的細(xì)胞。 B細(xì)胞可以發(fā)展成產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。
如在此所用的，"治療有效量"是足以對(duì)給藥組合物的哺乳動(dòng)物 提供有益效果的治療組合物量。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)的"指的是 通過其將外源核酸轉(zhuǎn)移至或引入宿主細(xì)胞中的過程。"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn) 化的"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)的"細(xì)胞是已經(jīng)用外源核酸轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。 細(xì)胞包括原代主體細(xì)胞及其后代。
如在此所用的短語(yǔ)"在轉(zhuǎn)錄控制下"或"可操作地連接"意思是 啟動(dòng)子相對(duì)于多核苷酸處于正確的位置和方向來(lái)控制通過RNA聚合酶 的轉(zhuǎn)錄和多核苷酸表達(dá)的啟動(dòng)。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"疫苗"定義為將該物質(zhì)給予哺乳動(dòng)物后用于 引發(fā)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
"栽體"是包括分離的核酸并可以用于將分離的核酸傳送至細(xì)胞 內(nèi)部的物質(zhì)組成。各種載體是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，線性多 核苷酸、與離子或兩性化合物結(jié)合的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此， 術(shù)語(yǔ)"栽體"包括自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒。還應(yīng)當(dāng)將該術(shù)語(yǔ)解釋來(lái)包 括促進(jìn)核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的非質(zhì)粒和非病毒化合物，如例如，聚賴氨 酸化合物、脂質(zhì)體等。病毒載體的實(shí)例包括但不限于腺病毒載體、腺 伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)"病毒"定義為由蛋白殼中包封的核酸UNA 或DNA)構(gòu)成的顆粒，具有或不具有外部脂質(zhì)包膜，其能夠在完整細(xì) 胞內(nèi)復(fù)制。
"異種"指的是源自不同物種動(dòng)物的移植物。描述
哺乳動(dòng)物中基于細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不受控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可具有災(zāi)難 性的生物后果。因此，以不同水平緊密控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。存在多種 類型的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑，包括但不限于，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
抑制因子(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)和活化STAT的蛋白抑 制劑(PIAS)。
細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可誘導(dǎo)抑制劑是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子 (SOCS)蛋白，其中存在八個(gè)家族成員S0CS1-S0CS7和細(xì)胞因子可 誘導(dǎo)的含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白(CIS) 。 SOCS蛋白識(shí)別細(xì)胞因子受體 或相關(guān)的JAK并通過直接干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和通過靶向受體復(fù)合體進(jìn)行遍 在蛋白介導(dǎo)的蛋白酶體降解來(lái)削弱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
SHP蛋白，包括但不限于(SHP-1和SHP-2 ),是組成型表達(dá)的并 可以通過將信號(hào)中間產(chǎn)物如Janus激酶(JAK)及其受體去磷酸化來(lái)削 弱細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。活化STAT的蛋白抑制劑(PIAS)的家族成員， 包括但不限于PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy，也是組成型表達(dá)的并 通過抑制STAT活性來(lái)削弱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Sumoylation的過程涉及PIAS 介導(dǎo)的對(duì)STAT活性的抑制。
本發(fā)明涉及對(duì)這些類型細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑中任何一種或多 種的抑制提供了治療性益處的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明包括用于調(diào)節(jié)免疫 細(xì)胞中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑因此增強(qiáng)免疫細(xì)胞免疫效能的組合 物和方法。組合物包括以下至少一種或多種的任意組合細(xì)胞因子信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑、抗原、沉默的免疫細(xì)胞、脈沖的細(xì)胞、用抗 原脈沖的沉默的免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等。組合物可以是用于體內(nèi)免疫 和/或離體治療的疫苗。
本發(fā)明提供了沉默的APC作為一般的工具通過使APC中的關(guān)鍵控 制點(diǎn)失去能力來(lái)增強(qiáng)疫苗功效。用本發(fā)明的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑 抑制劑或沉默的APC接種增強(qiáng)了抗原特異性免疫，因?yàn)榧?xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的沉默允許抗原呈遞免疫原性APC持續(xù)地體內(nèi)刺激抗原特異性T細(xì)胞。本發(fā)明的一實(shí)施方案中，沉默的APC通過增強(qiáng)APC成熟 和抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞抑制的促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生能夠關(guān)閉調(diào)節(jié)T細(xì)胞。 除了產(chǎn)生沉默的APC,本發(fā)明還包括沉默的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL)。本發(fā)明的公開內(nèi)容證明了使用本發(fā)明的方法沉默的CTL呈現(xiàn) 了增強(qiáng)的細(xì)胞裂解活性。具有增強(qiáng)的細(xì)胞裂解活性的CTL在細(xì)胞治療 和/或接種疫苗中提供了治療益處。
調(diào)節(jié)劑的抑制劑
基于在此的公開內(nèi)容，本發(fā)明包括抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑 的一般概念，其中調(diào)節(jié)劑與調(diào)節(jié)涉及免疫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)。
一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于增強(qiáng)免疫細(xì)胞免疫效能的組合物。 該組合物包括以下調(diào)節(jié)劑中任一種或多種的抑制劑S0CS、 SHP或 PIAS。本發(fā)明的另一方面中，組合物干擾細(xì)胞中的負(fù)向調(diào)節(jié)途徑。
含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑的組合物選自小干擾RNA (siRNA)、微RNA、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá) 載體、胞內(nèi)抗體、肽和小分子。
兮貝碼3夂不八貝丞T杜jto僅伏的么、^T円谷pj "t 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的mRM和/或蛋白水平的一種方法是通過降 低或抑制編碼調(diào)節(jié)劑的核酸的表達(dá)。因此，還可以使用抑制或降低基 因表達(dá)的分子或化合物如反義分子或核酶來(lái)降低細(xì)胞中細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的蛋白水平。
優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列是通過質(zhì)粒載體表達(dá)的反義核酸序列。 將反義表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物自身，因此引起細(xì) 胞中所需細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑降低的內(nèi)源表達(dá)。然而，不
號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的表達(dá)。相反，本發(fā)明包括本領(lǐng)域已知的用于抑制細(xì)胞 中蛋白表達(dá)或活性的其他方法，包括但不限于，使用核酶，表達(dá)非功 能性的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(即，轉(zhuǎn)顯性陰性突變體)和使用胞 內(nèi)抗體。反義分子及其用于抑制基因表達(dá)的用途是本領(lǐng)域公知的(參見，
例如，Cohen， 1989, 在Oligodeoxyribonucleotides， Antisense Inhibitors of Gene Expression (寡脫氧核糖核苷酸，基因表達(dá)的 反義抑制劑)，CRC Press)。和該術(shù)語(yǔ)在別處所定義的一樣，反義核 酸是與特定mRNA分子的至少一部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子 (Weintraub, 1990， Scientific American 262:40 )。在細(xì)胞中， 反義核酸與相應(yīng)的fflRNA雜交，形成雙鏈分子，因此抑制基因的翻譯。
使用反義方法來(lái)抑制基因翻譯是本領(lǐng)域已知的，例如描述于 Marcus-Sakura ( 1988， Anal. Biochem. 172: 289 )?？?吏用編石馬反義 分子的DNA通過基因表達(dá)將這樣的反義分子提供給細(xì)胞，如Inoue， 1993， U. S.專利No. 5， 190， 931所教導(dǎo)的。
或者，可以合成制得本發(fā)明的反義分子并提供給細(xì)胞。優(yōu)選約IO 至約30個(gè)核苷酸的反義寡聚物，更優(yōu)選約15個(gè)核苷酸，因?yàn)樗鼈內(nèi)?易合成和引入靶細(xì)胞中。本發(fā)明設(shè)想的合成反義分子包括本領(lǐng)域已知 的與未修飾的寡核苷酸相比較具有改進(jìn)的生物活性的寡核苷酸衍生物 (參見U. S.專利No. 5， 023， 243 )。
核酶及其用于抑制基因表達(dá)的用途是本領(lǐng)域公知的(參見，例如， Cech等,1992， J. Biol. Chem. 267: 17479-17482; Hampel等，1989， Biochemistry 28: 4929-4933; Eckstein等,國(guó)際公開No.謂2/07065; Altman等，U. S.專利No. 5， 168， 05 3 )。核酶是具有以類似于DM限制 性內(nèi)切酶的方式特異性切割其他單鏈RNA能力的RM分子。通過編碼 這些RNA的核苷酸序列的修飾，可以將分子工程化來(lái)識(shí)別RM分子中 的特定核苷酸序列并將其切割(Cech， 1988， J. Amer. Med. Assn. 260: 3030 )。這種方法的主要優(yōu)勢(shì)在于核酶是序列特異性的事實(shí)。
存在兩種基本類型的核酶，即，四膜蟲型(Haddelhoff， 1988， Nature 334: 585 )和錘頭型。四膜蟲型核酶識(shí)別四個(gè)堿基長(zhǎng)的序列， 而錘頭型核酶識(shí)別11-18個(gè)堿基長(zhǎng)的堿基序列。序列越長(zhǎng)，目標(biāo)mRNA 種類中序列唯一出現(xiàn)的可能性越大。因此，對(duì)于滅活特定mRM種類， 錘頭型核酶優(yōu)于四膜蟲型核酶，且18-堿基識(shí)別序列優(yōu)于各種無(wú)關(guān)mRNA分子內(nèi)可隨機(jī)出現(xiàn)的較短識(shí)別序列。
通過將目標(biāo)序列引入基礎(chǔ)核酶結(jié)構(gòu)中來(lái)設(shè)計(jì)用于抑制細(xì)胞因子信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑表達(dá)的核酶，目標(biāo)序列與本發(fā)明所需細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 調(diào)節(jié)劑的mRNA序列互補(bǔ)，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑包括但不限于SOCS (S0CS1-S0CS7， CIS) 、 SHP(SHP-1和SHP2 )和PIAS ( PIAS1 、 PIAS3、 PIASx和PIASy)?？梢源缋粲每少?gòu)^尋的試劑(Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA )來(lái)合成靶向所需細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑的核酶，或 從編碼它們的DNA遺傳表達(dá)來(lái)獲得。
本發(fā)明的另 一個(gè)方面中，通過滅活和/或隔絕細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)
節(jié)劑來(lái)抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑。因此，通過使用轉(zhuǎn)顯性陰性突 變體可以實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的效果?；蛘撸梢允褂?br> 對(duì)所需細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑特異性的胞內(nèi)抗體，另外也稱為細(xì)胞 因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的拮抗劑。 一實(shí)施方案中，拮抗劑是具有與細(xì)胞 因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑結(jié)合伴侶相互作用的理想特性的蛋白質(zhì)和/或化 合物，因此與相應(yīng)的野生型細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑竟?fàn)帯Ａ硪粚?shí)施 方案中，拮抗劑是具有與細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑相互作用的理想特 性的蛋白質(zhì)和/或化合物，并因此隔絕細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑。
小干擾RNA ( siRNA)
小干擾RNA (siRNA)是RNA分子，包括一組靶向目標(biāo)基因或多核 苷酸的核苷酸。如在此所用的，術(shù)語(yǔ)"siRM"包括所有形式的siRNA， 包括但不限于，(i)雙鏈RNA多核苷酸，(ii)單鏈多核香酸，和(iii) (i)或(ii)的多核苷酸，其中這樣的多核普酸具有一個(gè)、兩個(gè)、三 個(gè)、四個(gè)或多個(gè)核苷酸改變或置換。
雙鏈多核苷酸形式的siRNA包括約18個(gè)堿基對(duì)、約19個(gè)堿基對(duì)、 約20個(gè)堿基對(duì)、約21個(gè)堿基對(duì)、約22個(gè)堿基對(duì)、約23個(gè)堿基對(duì)、 約24個(gè)堿基對(duì)、約25個(gè)堿基對(duì)、約26個(gè)堿基對(duì)、約27個(gè)堿基對(duì)、 約28個(gè)堿基對(duì)、約29個(gè)堿基對(duì)或約30個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)。雙鏈siRNA能夠 干擾細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的表達(dá)和/或活性。單鏈siRNA包括靼向目標(biāo)基因或多核苷酸的RM多核苷酸序列的 一部分。單鏈siRNA包括約18個(gè)核苷酸、約19個(gè)核苷酸、約20個(gè)核 苷酸、約21個(gè)核苷酸、約22個(gè)核苷酸、約23個(gè)核苷酸、約24個(gè)核 苷酸、約25個(gè)核苷酸、約26個(gè)核苷酸、約27個(gè)核苷酸、約28個(gè)核 苷酸、約29個(gè)核苷酸或約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的多核苷酸。單鏈siRNA能 夠干擾目標(biāo)多核普酸如SOCS (S0CS1-S0CS7， CIS) ， SHP， PIAS或其 變體的表達(dá)和/或活性。單鏈siRNA還能夠與互補(bǔ)序列退火來(lái)形成能夠 干擾細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑表達(dá)和/或活性的dsRNA。
再一方面中，siRNA包括含有雙鏈或單鏈多核普酸的多核苷酸， 其中siRNA具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或多個(gè)核普酸改變或置換。
siRNA多核苷酸是干擾RNA活性的RNA核酸分子，通常認(rèn)為是通 過轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制產(chǎn)生效應(yīng)的。s iRNA多核苷酸優(yōu)選包括雙鏈RNA (dsRNA)，但不認(rèn)為受限于此，可以包括單鏈MA (參見，例如， Martinez等，2002 Cel 1 110: 563-74 )。本發(fā)明中包括的siRNA多核 苷酸包括其他天然產(chǎn)生的、重組或合成的單鏈或雙鏈核苷酸(核糖核 苷酸或脫氧核糖核苷酸或兩者的組合)聚合物和/或在此提供的核苷酸 類似物(例如，寡核苷酸或多核苷酸等，通常是5，至3，磷酸二酯鍵)。 因此，將認(rèn)識(shí)到在此作為能夠指導(dǎo)siRNA多核苷酸轉(zhuǎn)錄的DNA序列公 開的特定示范性序列還旨在描述相應(yīng)的RNA序列及其互補(bǔ)物(已知充 分建立的互補(bǔ)核苷酸堿基配對(duì)的原理)。
使用含有用于RNA聚合酶啟動(dòng)子的啟動(dòng)子的DNA(基因組的、cDNA 或合成的)作為模板可以轉(zhuǎn)錄siRNA。例如，啟動(dòng)子可以是U6啟動(dòng)子 或HI RNA聚合酶III啟動(dòng)子?；蛘撸瑂iRNA可以是合成產(chǎn)生的RNA分 子。特定實(shí)施方案中，siRNA多核苷酸具有平端。其他特定實(shí)施方案 中，siRNA多核苷酸的至少一條鏈在siRNA多核苷酸任一條鏈的3，端 具有至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)多核苷酸"突出端"(即，在相對(duì)鏈中沒有 與互補(bǔ)堿基形成堿基對(duì))。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，siRM多核苷 酸雙鏈體的每條鏈在3，端具有兩個(gè)核苷酸的突出端。兩個(gè)核苷酸的 突出端優(yōu)選是胸苷二核苷酸(TT)，但也可以包括其他堿基，例如TC
34二核苷酸或TG二核苷酸，或任何其他二核苷酸。突出端二核苷酸還可 以與靶向進(jìn)行干擾的多核苷酸序列5，端的兩個(gè)核苷酸互補(bǔ)。對(duì)于 siRNA多核苷酸3，端的討論，參見例如WO01/75164。
優(yōu)選siRNA多核普酸包括約18-30個(gè)核苷酸堿基對(duì)的雙鏈多核苷 酸，優(yōu)選約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、 約26或約27個(gè)堿基對(duì)，其他優(yōu)選實(shí)施方案中，約19、約20、約21、 約22或約23個(gè)堿基對(duì)，或約27個(gè)堿基對(duì)，其中"約"的使用表示在 特定實(shí)施方案中和在特定條件下，形成能夠干擾選定多肽表達(dá)的功能 性siRNA多核苷酸的持續(xù)裂解步驟可能不是絕對(duì)有效的。因此，作為 siRNA加工過程、生物合成或人工合成中可變性的結(jié)果，siRNA多核苷 酸可以包括一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)度相差(例如，通過核苷酸插入或刪除)一 個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的siRNA多核苷酸分子。本發(fā)明 的siRNA多核苷酸還可以包括通過在一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)核普酸 不同于特定序列(例如，通過核苷酸置換，包括轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)換)呈現(xiàn)可 變性的多核苷酸序列。這些差異可以發(fā)生在特定siRNA多核苷酸序列 的任何核苷酸位置，取決于分子的長(zhǎng)度，不管是位于雙鏈多核苷酸的 有義或反義鏈中?？梢栽陔p鏈多核苷酸的一條鏈上發(fā)現(xiàn)核苷酸差異， 其中替代核苷酸與之通常形成氫鍵堿基配對(duì)的互補(bǔ)核苷酸不必定相應(yīng) 地替代。優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)于特定核苷酸序列，siRNA多核苷酸是 同源的。
特定實(shí)施方案中，包括本發(fā)明siRM多核苷酸的多核苷酸可以源 自包括單鏈寡核苷酸片段(例如，約18-30個(gè)核苷酸)及其反向互補(bǔ) 物的單鏈多核苷酸，其間通常通過間隔序列來(lái)隔開。根據(jù)某些這樣的 實(shí)施方案，間隔物的分裂提供了單鏈寡核苷酸片段及其反向互補(bǔ)物， 使得它們退火形成本發(fā)明的雙鏈sLRM多核苷酸，任選地使用導(dǎo)致從 任一條或兩條鏈的3，端和/或5，端添加或去除一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或 多個(gè)核苷酸的其他加工步驟。特定實(shí)施方案中，間隔物是在間隔物分 離和任選地導(dǎo)致從任一條或兩條鏈的3，端和/或5，端添加或去除一 個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或多個(gè)核苷酸的隨后加工步驟之前，允許片段及其反向互補(bǔ)物退火并形成雙鏈結(jié)構(gòu)(例如，如發(fā)夾多核苷酸)的長(zhǎng) 度。因此，間隔物序列是如在此所提供的位于兩個(gè)互補(bǔ)多核苷酸序列 區(qū)域之間的任何多核苷酸序列，當(dāng)兩個(gè)序列退火成雙鏈核酸時(shí)，形成
siRNA多核苷酸。優(yōu)選，間隔物序列包括至少4個(gè)核苷酸。特定實(shí)施 方案中，間隔物包括5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21-25、 26-30、 31-40、 41-50、 51-70、 71-90、 91-110、 111-150、 151-200或更多個(gè)多核苷酸。已經(jīng)描述了源自單核苷酸鏈的 siRM多核苷酸實(shí)例，該單核苷酸鏈包括兩個(gè)通過間隔物隔開的互補(bǔ) 核脊酸序歹'J (侈寸^口， Brummelkamp等，2002 Science 296: 550; Paddison 等，2002 Genes Develop. 16: 948，' Paul等，2002 Nat. Biotechnol. 20:505-508; Grabarek等,2003 Bio Techniques 34:734-44 )。
多核苷酸變體可以含有一個(gè)或多個(gè)置換、添加、刪除和/或插入， 使得siRM多核苷酸的活性沒有顯著減小。通常如本文別處所述的評(píng) 價(jià)核苷酸內(nèi)容中任何這樣的改變對(duì)siRM多核苷酸活性的影響。變體 優(yōu)選呈現(xiàn)與編碼天然SOCS( S0CS1-S0CS7、 CIS )， SHP( SHP-l和SHP-2 ) 或PIAS (PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)的多核苷酸序列的一部分 至少約75%、 78°/。、 80%、 85%、 87%、 88%或89°/。的同一性，更優(yōu)選至少 約90%、 "％、 "％、 96%或97%的同一性。通過比較多核苷酸與目標(biāo)多 核苷酸相應(yīng)部分的序列可以容易地測(cè)定百分比同一性，使用任何方法， 包括使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的計(jì)算機(jī)算法。這些包括Al ign或 BLAST算法(AUschul, 1991 J. Mol. Biol. 219:555-565; Henikoff 和Henikoff， 1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 )。
特定siRNA多核苷酸變體可與編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的一部分 基本上同源。源自這些多核苷酸變體的單鏈多核苷酸在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件 下能夠與編碼目標(biāo)多肽的天然產(chǎn)生的DM或RNA序列雜交。在中等嚴(yán) 謹(jǐn)條件下與編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸序列可檢測(cè)雜交的siRM多核苷 酸可具有包括至少10個(gè)與特定目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的連續(xù)核普酸的核 苷酸序列，更優(yōu)選ll、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30個(gè)連續(xù)的核苷酸。特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的siRNA序列(或其互補(bǔ)物)對(duì)于編碼想要干擾 其表達(dá)的目標(biāo)多肽的單個(gè)特定多核苷酸是獨(dú)特的。特定的其他實(shí)施方 案中，該序列(或其互補(bǔ)物)可以為編碼想要干擾多肽表達(dá)的目標(biāo)多 肽的兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)多核苷酸所共有。
合適的中等嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在5XSSC， 0. 5%SDS， 1. OmM EDTA (pH8， 0)溶液中預(yù)先洗滌多核苷酸；在50-70。C、 5XSSC將多核苷酸 雜交1-16小時(shí)(例如，過夜)；接著在22-65。C將多核苷酸洗滌一次 或兩次20-40分鐘，使用一次或多次含有0. 05-0. 1%SDS的2X、 0. 5X 和0. 2X SSC中的每一種。對(duì)于附加的嚴(yán)謹(jǐn)性，雜交條件可以包括在 0. 1XSSC和0. 1%SDS中50-60'C另外洗滌15-40分鐘。本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員將理解通過改變用于預(yù)雜交、雜交以及洗滌步驟的時(shí)間、溫度 和/或溶液濃度可以獲得雜交條件嚴(yán)謹(jǐn)性的改變。合適的條件部分也可 取決于所用探針和印跡過的先證核酸樣品的特定核苷酸序列。因此， 將認(rèn)識(shí)到當(dāng)基于與一個(gè)或多個(gè)特定的先證序列雜交同時(shí)不與特定的其 他先證序列雜交的能力鑒定出所需的多核苷酸選擇性時(shí)，可以容易地 選擇合適的嚴(yán)謹(jǐn)條件，而不需要不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。
可以使用若干標(biāo)準(zhǔn)中的 一 個(gè)或多個(gè)來(lái)設(shè)計(jì)本發(fā)明的序列特異性 siRNA多核苷酸。例如，為了設(shè)計(jì)具有與編碼目標(biāo)多肽的序列相同的 約21個(gè)連續(xù)核苷酸的siRNA多核苷酸，可以掃描多核苷酸序列開放閱 讀框中具有一個(gè)或多個(gè)以下特征的約21個(gè)堿基序列長(zhǎng)度(1 )A+T / G+C 比例約為1: 1,但不高于2: l或l: 2; (2)5，端為AA雙核苷酸或 CA雙核苷酸；(3)內(nèi)部發(fā)夾環(huán)的解鏈溫度低于55X:; (4)同型二聚 體的解鏈溫度低于37。C (可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)軟件 來(lái)確定(3)和(4)中所述的解鏈溫度計(jì)算)；(5)至少16個(gè)未鑒 定為存在于任何其他已知多核普酸序列中的連續(xù)核苷酸的序列。或者， 可以使用從各種廠商例如OligoEngine. TM. (Seattle, Wash.); Dharmacon, Inc. ( Lafayette, Colo. ); Ambion Inc. ( Austin, Tex.); 和QIAGEN， Inc. (Valencia, Calif.))可購(gòu)得的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)設(shè)計(jì) 和選擇siRNA多核苷酸序列。還可以參見Elbashir等，2000 Genes &Development 15: 188-200; Elbashir等，2001 Nature 411: 494-98。 然后可以才艮據(jù)本領(lǐng)域已知的和本文別處所述的方法來(lái)測(cè)試siRNA多核 苷酸千擾目標(biāo)多肽表達(dá)的能力。siRNA多核苷酸有效性的測(cè)定不僅包 括干擾目標(biāo)多肽表達(dá)能力的考慮，而且包括siRNA多核苷酸對(duì)于宿主 細(xì)胞是否是毒性的。例如，理想的siRNA將呈現(xiàn)RNA干擾活性，并且 還不呈現(xiàn)不利的生物后果。不利生物后果的實(shí)例是細(xì)胞凋亡，對(duì)于所 述細(xì)胞而言，作為將siRNA引入宿主細(xì)胞的結(jié)果，細(xì)胞死亡不是所期 望的。
基于本發(fā)明的公開內(nèi)容，將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的siRNA可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo) 多肽表達(dá)不同程度的沉默。因此首先必須測(cè)試siRNA的有效性?；?給定siRNA干擾或調(diào)節(jié)目標(biāo)多肽表達(dá)的能力，進(jìn)行siRNA的選擇。因 此，能夠千擾所需目標(biāo)多肽表達(dá)的特異性siRNA多核苷酸序列的鑒定 需要各個(gè)siRNA的產(chǎn)生和測(cè)試。測(cè)試每個(gè)siRNA的方法和用于本發(fā)明 中合適siRNA的選擇在此充分列于實(shí)施例中。因?yàn)椴皇撬懈蓴_蛋白 表達(dá)的siRNA都具有生理學(xué)上重要的效果，本發(fā)明的公開內(nèi)容還列舉 了多種生理學(xué)上相關(guān)的測(cè)試，用于測(cè)定使用本發(fā)明的siRNA干擾目標(biāo) 蛋白表達(dá)的水平是否具有臨床上相關(guān)的顯著性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，許 多不同的核苷酸序列編碼相同的多肽。即，氨基酸可以由幾種不同密 碼子中的一種來(lái)編碼，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定，盡管一個(gè)特 定的核苷酸序列不同于另一個(gè)，但多核苷酸實(shí)際上編碼具有相同氨基 酸序列的多肽。因此，本發(fā)明特別地考慮由于密碼子使用差異而不同 的多核苷酸。
可以使用用于制備特定需要的siRNA多核苷酸的多種技術(shù)中的任 何一種來(lái)制備siRNA的多核苷酸。例如，可以由從合適細(xì)胞或組織類 型制得的cDNA擴(kuò)增多核苷酸?？梢酝ㄟ^聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)擴(kuò) 增這樣的多核苷酸。使用這種方法，基于在此提供的序列來(lái)設(shè)計(jì)序列 特異性引物，并可以購(gòu)買或直接合成。引物的擴(kuò)增部分可以用于使用 公知技術(shù)從合適的DNA文庫(kù)分離全長(zhǎng)基因，或其所需部分。使用一個(gè)優(yōu)選，文庫(kù)是大小選擇的來(lái)包括較大的多核苷酸序列。為了鑒定基因
的5，和其他上游區(qū)域，隨機(jī)引物文庫(kù)也是優(yōu)選的?；蚪M文庫(kù)對(duì)于 獲得內(nèi)含子和延伸5，序列是優(yōu)選的。本發(fā)明考慮的siRNA多核苷酸 還可以選自siRNA多核苷酸序列文庫(kù)。
對(duì)于雜交技術(shù)，可以使用公知技術(shù)將部分多核苷酸序列標(biāo)記(例 如，通過切口平移或用"P末端標(biāo)記)。然后通過使用標(biāo)記的探針與含 有變性細(xì)菌菌落的濾器(或含有噬菌斑的菌苔)雜交來(lái)篩選細(xì)菌或噬 菌體文庫(kù)(參見，例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y. ， 2001 )。選擇雜交菌落或噬斑并擴(kuò)充， 分離DNA用于進(jìn)一步的分析。
或者，眾多擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，用于從部分cDNA序列獲得 全長(zhǎng)編碼序列。這樣的技術(shù)內(nèi)，通常通過PCR來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。 一種這樣 的技術(shù)稱為"cDNA末端的快速擴(kuò)增"或RACE(參見，例如，Sambrook 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y. ， 2001)。
在此包括的實(shí)施例、附圖和序列表中呈現(xiàn)了許多用于干擾目標(biāo)多 肽表達(dá)的特異性siRNA多核苷酸序列。通常可以通過本領(lǐng)域已知的任 何方法來(lái)制備siRNA多核苷酸，包括例如固相化學(xué)合成。還可以使用 標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)如寡核苷酸指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變將修飾引入多核苷酸 序列中。此外，siRNA可以化學(xué)上修飾或綴合其他分子來(lái)增強(qiáng)它們的 穩(wěn)定性和/或傳送特性。作為本發(fā)明的一方面包括的是在此所述的 siRNA，其中已經(jīng)從其除去了一個(gè)或多個(gè)核糖。
或者，通過體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合適的DNA序列(例如，編碼目標(biāo)多 肽的多核苷酸序列，或其所需部分)來(lái)產(chǎn)生siRNA多核苷酸分子，只 要將DM引入具有合適RM聚合酶啟動(dòng)子(如例如，T7、 U6、 HI或SP6, 盡管其他啟動(dòng)子同樣可用)的載體中。此外，可以將siRNA多核苷酸 給藥于哺乳動(dòng)物，如同支持轉(zhuǎn)錄(和任選地合適的加工步驟)的DM序列(例如，在此提供的重組核酸構(gòu)建體)，使得在體內(nèi)產(chǎn)生所需的
siRM。
一實(shí)施方案中，siRNA多核苷酸，其中siRM多核苷酸能夠干擾 目標(biāo)多肽的表達(dá)，可以用于產(chǎn)生沉默細(xì)胞。本發(fā)明包括與生物來(lái)源接 觸一定時(shí)間段時(shí)導(dǎo)致目標(biāo)肽表達(dá)顯著降低的任何siRNA多核苷酸。優(yōu) 選，相對(duì)于siRNA不存在時(shí)檢測(cè)到的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平，降低高于約 10%、更優(yōu)選高于約20%、更優(yōu)選高于約30%、更優(yōu)選高于約40%、約 50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約 98%。優(yōu)選，細(xì)胞中siRNA多核苷酸的存在不導(dǎo)致或引起任何不利的毒 性影響，例如，細(xì)胞的凋亡或死亡，其中凋亡不是RNA干擾的期望效 果。
另一實(shí)施方案中，與生物來(lái)源接觸一定時(shí)間段時(shí)，siRNA多核苷 酸引起目標(biāo)多肽表達(dá)的顯著降低。相對(duì)于siRM不存在時(shí)檢測(cè)到的目 標(biāo)多肽表達(dá)水平，優(yōu)選降低是約10%-20%，更優(yōu)選約20%-30%，更優(yōu)選 約30%-40%，更優(yōu)選約40%-50%，更優(yōu)選約50%-60%，更優(yōu)選約60%-70%， 更優(yōu)選約70%-80%,更優(yōu)選約80%-90%，更優(yōu)選約90%-95%,更優(yōu)選約 95%-98%。優(yōu)選，細(xì)胞中siRNA多核苷酸的存在不導(dǎo)致或引起任何不利 的毒性影響。
再一實(shí)施方案中，與生物來(lái)源接觸一定時(shí)間段時(shí)，siRNA導(dǎo)致目 標(biāo)多肽表達(dá)的顯著降低。相對(duì)于siRNA不存在時(shí)檢測(cè)到的目標(biāo)多肽表 達(dá)水平，優(yōu)選降低約10%或更多，更優(yōu)選約20%或更多，更優(yōu)選約30% 或更多，更優(yōu)選約40%或更多，更優(yōu)選約50%或更多，更優(yōu)選約60%或 更多，更優(yōu)選約70%或更多，更優(yōu)選約80%或更多，更優(yōu)選約90%或更 多，更優(yōu)選約95%或更多，更優(yōu)選約98%或更多。優(yōu)選，細(xì)胞中siRM 多核苷酸的存在不導(dǎo)致或引起任何不利的毒性影響。
因此，本發(fā)明包括siRNA多核苷酸，如siRM,如SEQ ID NO: l-3、 21-23和27-56中所示例的。SEQ 1-3和21-23各自是對(duì)于S0CS1的 鼠和人siRNA候選序列的序列。SEQ ID NO: 27-32、 33-38、 39-44、 45-50和51-56各自是對(duì)于PIAS1、 PIAS3、 PIASx、 PIASy和SHP-1的
40人siRM候選序列的序列。siRNA的序列描繪于圖30中。在本領(lǐng)域普
通技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)庫(kù)中可以找到對(duì)于各種細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的多核苷酸和多肽序列。 一個(gè)這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)是National
Center for Biotechnology Information' s Genbank和GenPept數(shù) 據(jù)庫(kù)(國(guó)家生物技術(shù)信息中心GenBank和GenPept數(shù)據(jù)庫(kù))?？梢詳U(kuò) 增這些已知基因的核酸序列，結(jié)合(例如，連接)在此公開的序列， 和/或表達(dá)，使用在此公開的技術(shù)或通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任 何技術(shù)(例如，Sambrook等，2001 )。盡管可以在體外表達(dá)系統(tǒng)中表 達(dá)核酸，優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸包括用于體內(nèi)復(fù)制和/或表達(dá)的載體。
siRNA的修飾
本發(fā)明的siRM多核苷酸產(chǎn)生后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解siRM 多核苷酸具有可被修飾來(lái)改進(jìn)siRNA作為治療化合物的特定特征。因 此，可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)siRNA多核苷酸來(lái)抵抗降解，通過修飾來(lái)包括硫 代磷酸酯或其他鍵、膦酸甲酯、砜、硫酸酯、羰游離基、二硫代磷酸 酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等(參見，例如，Agrwal等，1987 Tetrahedron Lett.28:3539-3542 ;Stec 等，1985 Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody等，1989 Nucleic Acids Res. 12:4769-4782; Eckstein, 1989 Trends Biol. Sci. 14:97-100 ; Stein ， 在 01igodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression (寡脫氧核糖核苷酸?；虮磉_(dá)的反義抑制劑)，Cohen編輯， Macmillan Press, London, pp.97-117 (1989))。
可以將本發(fā)明的任何多核苷酸進(jìn)一步修飾來(lái)增強(qiáng)體內(nèi)穩(wěn)定性?？?能的修飾包括但不限于在5，和/或3，端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使 用硫代磷酸酯或2' 0-甲基而不是磷酸二酯鍵；和/或包括非傳統(tǒng)堿基 如肌苷、queosine和wybutosine等，以及乙酰基-曱基、硫代-和其 他修飾形式的腺噤呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷。
載體其它相關(guān)方面中，本發(fā)明包括編碼抑制劑的分離核酸，其中抑制
劑優(yōu)選siRNA抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑，可操作地連接至包括啟 動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列的核酸，使得核酸優(yōu)選能夠指導(dǎo)由核酸編碼的蛋白的表 達(dá)。因此，本發(fā)明包括表達(dá)載體和用于將外源DM引入細(xì)胞中的方法， 伴隨外源DNA在細(xì)胞中的表達(dá)，如Sambrook等(2001， Molecular Cloning: A Laboratory Ma纖l(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和 Ausuble 等(1997, Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的通用實(shí)驗(yàn)方案)， John Wiley & Sons, New York)所述的那些。
另一方面中，本發(fā)明包括含有siRNA多核苷酸的載體。優(yōu)選，siRNA 多核苷酸能夠抑制目標(biāo)多肽的表達(dá)，其中目標(biāo)多肽選自S0CS (S0CSl-7、 CIS) 、 SHP或PIAS。將所需多核苷酸引入載體中和載體 的選擇是本領(lǐng)域公知的，如描述于Sambrook等，上文和Ausubel等， 上文。
可以將siRNA多核苷酸克隆至多種類型的載體中。然而，本發(fā)明 不應(yīng)當(dāng)解釋為限于任何特定的載體。實(shí)際上，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)解釋包括多
種容易獲得和/或本領(lǐng)域公知的載體。例如，可以將本發(fā)明的siRNA 多核苷酸克隆至載體中，載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍 生物、動(dòng)物病毒和粘粒。特定目標(biāo)載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探 針產(chǎn)生載體和測(cè)序載體。
特定實(shí)施方案中，表達(dá)載體選自病毒載體、細(xì)菌載體和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞載體。存在多種包括至少部分或全部上述組合物的表達(dá)載體系統(tǒng)。 基于原核生物和/或真核生物載體的系統(tǒng)可以用于本發(fā)明中來(lái)產(chǎn)生多 核苷酸或其同源的多肽。許多這樣的系統(tǒng)是可購(gòu)得的和廣泛獲得的。
此外，可以以病毒載體形式將表達(dá)載體提供給細(xì)胞。病毒載體技 術(shù)是本領(lǐng)域公知的并描述于例如Sambrook等(2001 )和Ausubel等 (1997 )，以及其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊(cè)中。用作載體的病毒， 包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病 毒。通常，合適的載體含有在至少一種生物體中有功能的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記(參見，
例如，WO01/96584; WO01/29058;和U. S.專利No. 6， 326， 193 )。
為了 siRNA的表達(dá)，每個(gè)啟動(dòng)子中的至少一個(gè)模塊起作用來(lái)定位 用于RM合成的起始位點(diǎn)。了解最多的實(shí)例是TATA盒，但在一些缺乏 TATA盒的啟動(dòng)子中，如用于哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟 動(dòng)子和用于SV40基因的啟動(dòng)子中，覆蓋起始位點(diǎn)自身的分立元件有助 于固定啟動(dòng)位置。
另外的啟動(dòng)子元件，即增強(qiáng)子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率。通常，這 些位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域中，盡管最近已經(jīng)表明許多啟動(dòng) 子在起始位點(diǎn)下游也含有功能性元件。啟動(dòng)子元件之間的間隔通常是 靈活的，使得元件相對(duì)于彼此倒置和移動(dòng)時(shí)，啟動(dòng)子功能得以保存。 在胸苷激酶(tk)啟動(dòng)子中，在活性開始下降之前啟動(dòng)子元件之間的 間隔可以增加至50bp間隔。根據(jù)啟動(dòng)子，似乎單個(gè)元件可以合作地或 獨(dú)立地起作用來(lái)激活轉(zhuǎn)錄。
啟動(dòng)子可以是與基因或多核苷酸序列天然相連的，如可以通過分 離位于編碼片段和/或外顯子上游的5，非編碼序列獲得。這樣的啟動(dòng)
子可以稱為"內(nèi)源的"。相似地，增強(qiáng)子可以是與多核苷酸序列天然 相連的，位于該序列的下游或上游?；蛘?，通過將編碼多核苷酸片段 置于重組或異源啟動(dòng)子控制下來(lái)獲得特定的優(yōu)勢(shì)，這指的是通常不與 天然環(huán)境中的多核苷酸序列相連的啟動(dòng)子。重組或異源增強(qiáng)子也指的 是通常不與天然環(huán)境中的多核苷酸序列相連的增強(qiáng)子。這樣的啟動(dòng)子 或增強(qiáng)子可以包括其他基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，以及從任何其他原核、 病毒或真核細(xì)胞分離的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，和不是"天然存在"的啟動(dòng) 子或增強(qiáng)子，即，含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的不同元件，和/或改變表達(dá) 的突變。除了合成產(chǎn)生啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列，可以使用重組克 隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)來(lái)產(chǎn)生序列，包括PGR ,結(jié)合在此公開的組合 物(U.S.專利4， 683， 202， U. S.專利5， 928， 906 )。此外，考慮到還可 以使用指導(dǎo)無(wú)核細(xì)胞器如線粒體、葉綠體等內(nèi)序列轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的控 制序列。自然地，使用有效指導(dǎo)DM片段在選擇用于表達(dá)的細(xì)胞類型、細(xì) 胞器和生物體中表達(dá)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子是重要的。分子生物學(xué)領(lǐng)域 的那些技術(shù)人員通常知道怎樣使用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和細(xì)胞類型組合用 于蛋白表達(dá)，例如，參見Sambrook等(2001 )。所用的啟動(dòng)子可以是 組成型的，組織特異性的，誘導(dǎo)型的，和/或在合適條件下可用于指導(dǎo) 引入的DNA片段的高水平表達(dá)，如在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白和/或肽中是 有利的。啟動(dòng)子可以是異源或內(nèi)源的。
在此呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中示例的啟動(dòng)子序列是立即早期巨細(xì)胞病 毒(CMV)啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列是能夠驅(qū)動(dòng)與其可操作連接的任 何多核苷酸序列高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子序列。然而，也可以使 用其他組成型啟動(dòng)子序列，包括但不限于，猿猴病毒40 (SV40)早期 啟動(dòng)子、鼠乳房腫瘤病毒(腦TV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長(zhǎng)末端重 復(fù)序列(LTR)啟動(dòng)子、莫洛尼氏病毒啟動(dòng)子、鳥類白血病病毒啟動(dòng)子、 EB病毒立即早期啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子以及人基因啟動(dòng)子，如 但不限于，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、肌球蛋白啟動(dòng)子、血紅蛋白啟動(dòng)子和肌 肉肌酸啟動(dòng)子。此外，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)不限于使用組成型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子也考慮為本發(fā)明的一部分。本發(fā)明中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用提供 了需要這樣的表達(dá)時(shí)能夠打開可操作連接的多核苷酸序列的表達(dá)或不 需要表達(dá)時(shí)關(guān)閉表達(dá)的分子開關(guān)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于 金屬硫蛋白啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子、黃體酮啟動(dòng)子和四環(huán)素啟動(dòng) 子。此外，本發(fā)明包括使用組織特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子只在所需的 組織中是活性的。組織特異性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于， HER-2啟動(dòng)子和PSA相關(guān)啟動(dòng)子序列。
為了評(píng)估siRNA的表達(dá)，引入細(xì)胞中的表達(dá)載體還可以含有選擇 標(biāo)記基因或報(bào)告基因或兩者，來(lái)幫助從尋求通過病毒載體轉(zhuǎn)染或感染 的細(xì)胞群中識(shí)別和選擇表達(dá)細(xì)胞。其他實(shí)施方案中，可以在分開的DNA 碎片上攜帶選擇標(biāo)記并用于共轉(zhuǎn)染程序中。選擇標(biāo)記和報(bào)告基因可以 兩側(cè)具有合適的調(diào)節(jié)序列，使得能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。有用的選擇 標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的并可以包括例如抗生素抗性基因，如neo等。報(bào)告基因用于鑒定可能轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和用于評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)序列的功能 性。編碼易于測(cè)定的蛋白的報(bào)告基因是本領(lǐng)域已知的。通常，報(bào)告基 因是不存在于受體生物體或組織中或不由受體生物體或組織表達(dá)并編 碼其表達(dá)通過一些容易檢測(cè)的特性例如酶促活性來(lái)呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)的基
因。在DNA已經(jīng)引入受體細(xì)胞后的合適時(shí)間測(cè)試報(bào)告基因的表達(dá)。
合適的報(bào)告基因可以包括編碼熒光素酶、P-半乳糖苷酶、氯霉素 乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌的堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白基因的基因(參見， 例如，Ui-Tei等，2000 FEBS Lett. 479: 79-82 )。合適的表達(dá)系統(tǒng)是 公知的并可以使用公知技術(shù)制得或商業(yè)獲得?？梢允褂锚?dú)特的內(nèi)部限 制位點(diǎn)或通過對(duì)非獨(dú)特限制位點(diǎn)的部分消化來(lái)產(chǎn)生內(nèi)部刪除構(gòu)建體。 然后可以將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至呈現(xiàn)高水平siRNA多核苷酸和/或多肽表達(dá) 的細(xì)胞中。通常，將具有最小5，側(cè)翼區(qū)域的顯示報(bào)告基因最高水平 表達(dá)的構(gòu)建體鑒定為啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子區(qū)域可以連接報(bào)告基因并 用于評(píng)價(jià)試劑調(diào)節(jié)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力。
沉默免疫細(xì)胞的產(chǎn)生
一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于細(xì)胞的系統(tǒng)，用于向細(xì)胞中表 達(dá)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑?；诩?xì)胞的系統(tǒng)，指"沉默細(xì) 胞"，包括細(xì)胞和用于表達(dá)抑制劑的表達(dá)載體。然而，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)不 受限于包括表達(dá)載體的細(xì)胞，而是本發(fā)明的沉默細(xì)胞應(yīng)當(dāng)解釋為包括 已經(jīng)用本發(fā)明任何類型的抑制劑即化學(xué)合成的siRNA修飾的細(xì)胞。任 何情況中，與沒有用抑制劑沉默的其他方面相同的細(xì)胞相比較，包括 抑制劑的沉默細(xì)胞具有升高的免疫效能。沉默細(xì)胞適于單獨(dú)或結(jié)合其 他治療給予哺乳動(dòng)物受體。
本發(fā)明包括含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑的細(xì)胞。抑制劑 能夠抑制包括但不限于S0CS、SHP或PIAS的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑。 一方面中，可以用含有編碼抑制劑的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。不需 要將多核苷酸整合至細(xì)胞中。另一方面中，根本不需用載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，
45而是將細(xì)胞暴露于不是從載體表達(dá)的抑制劑。這樣抑制劑的實(shí)例是化
學(xué)合成的siRNA。
在表達(dá)載體的范圍內(nèi)，可以通過本領(lǐng)域的任何方法將栽體容易地 引入宿主細(xì)胞中，例如，哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞。例如， 可以通過物理、化學(xué)或生物方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中。容易 理解含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體的引入就細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)
劑而言產(chǎn)生了沉默細(xì)胞。
用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì) 轉(zhuǎn)染、微粒轟擊、微注射、電穿孔等。產(chǎn)生含有栽體和/或外源核酸的 細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Sambrook等(2001， Molecular Clong: A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))， Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork)， 和Ausuble等(1997， Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的通用實(shí) 驗(yàn)方案)，John Wiley & Sons, New York)。
用于將目標(biāo)多核苷酸引入宿主細(xì)胞中的生物方法包括使用DM和 RNA載體。病毒載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為將基因插入 哺乳動(dòng)物例如人細(xì)胞中最廣泛使用的方法。其他病毒載體可以源自慢 病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺伴隨病毒等。參見，例 如，U. S.專利No. 5， 350， 674和5， 585， 362。
用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的化學(xué)方法包括膠體分散系統(tǒng)，如 大分子復(fù)合物、納米膠嚢、微球體、珠子和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包 油型乳濁液、膠粒、混合膠粒和脂質(zhì)體。優(yōu)選的用作體外和體內(nèi)傳送 載體的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即，人造膜嚢泡)。這樣系統(tǒng)的制備和使 用是本領(lǐng)域公知的。
與用于將外源核酸引入宿主細(xì)胞或以其它方式將細(xì)胞暴露于本發(fā) 明抑制劑的方法無(wú)關(guān)，為了證實(shí)宿主細(xì)胞中重組DM序列的存在，可 以進(jìn)行各種測(cè)試。這樣的測(cè)試包括，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的"分 子生物，，測(cè)試，如DNA和RNA印跡、RT-PCR和PCR;"生化"測(cè)試， 如檢測(cè)特定的肽的存在或不存在，例如，通過免疫學(xué)方法(ELISA和蛋白質(zhì)印跡)或通過在此所述鑒定落入本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑的測(cè)試。
為了產(chǎn)生沉默細(xì)胞，可以使用任何DM載體或傳送載體來(lái)將所需 的siRNA多核苷酸在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)移至免疫細(xì)胞中。在使用非病毒傳 送系統(tǒng)的情況中，優(yōu)選的傳送載體是脂質(zhì)體。因此上述傳送系統(tǒng)和實(shí) 驗(yàn)方案可以見Gene Targeting Protocols (基因輩巴向?qū)嶒?yàn)方案)，第 2版，ppl-35 (2002)和Gene Transfer and Expression Protocls (基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)方案)，Vol. 7, Murray編輯，pp81-89 ( 1991 )。
打算使用脂質(zhì)體制劑來(lái)將本發(fā)明的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑 制劑引入宿主細(xì)胞中(體外、離體或體內(nèi))。本發(fā)明的特定實(shí)施方案 中，抑制劑可以結(jié)合脂質(zhì)。與脂質(zhì)結(jié)合的抑制劑可以包裹于脂質(zhì)體的 含水內(nèi)部中，散布于脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層內(nèi)，通過與脂質(zhì)體和寡核苷酸結(jié)
合的連接分子連接脂質(zhì)體，包入脂質(zhì)體中，與脂質(zhì)體復(fù)合，分散在含 脂質(zhì)的溶液中，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)組合，作為脂質(zhì)中的懸浮液包含， 包含在膠粒中或與膠粒復(fù)合，或以其它方式與脂質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明的脂 質(zhì)、脂質(zhì)/siRNA或脂質(zhì)/表達(dá)載體結(jié)合組合物不限于溶液中的任何特 定結(jié)構(gòu)。例如，它們可以以雙層結(jié)構(gòu)存在，作為膠粒，或具有"崩解 的"結(jié)構(gòu)。它們還可以簡(jiǎn)單地散布于溶液中，可能形成大小或形狀不 均一的凝聚物。
脂質(zhì)是天然存在的脂肪物質(zhì)或合成的脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括細(xì)胞 質(zhì)中天然存在的脂肪小滴以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化合物類別，其 含有長(zhǎng)鏈脂族烴及其衍生物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
磷脂可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體并可以帶有凈的正、負(fù)或 中性電荷。雙乙酰磷酸鹽可以用來(lái)將負(fù)電荷賦予脂質(zhì)體，和硬脂酰胺 可以用來(lái)將正電荷賦予脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可以由一種或多種磷脂制得。
帶中性電荷的脂質(zhì)可以包括沒有電荷的脂質(zhì)、基本上不帶電的脂
質(zhì)或具有相同數(shù)量的正和負(fù)電荷的脂質(zhì)混合物。合適的磷脂包括磷脂 酰膽堿和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的磷脂。
可以從商業(yè)來(lái)源獲得根據(jù)本發(fā)明適用的脂質(zhì)。例如，可以從
Sigma, St. Louis, M0 Chemical Co.獲得二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿("DMPC"),從K&K Laboratories (Plainview， NY)獲得雙十六 烷基磷酸酯("DCP，，);從Calbiochem-Behring獲得膽甾醇("Choi"); 從Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)獲得二肉豆蔻酖 基磷脂酰甘油("DMPG")和其他脂質(zhì)?？梢詫⒙确禄蚵确?曱醇中的 脂質(zhì)儲(chǔ)液儲(chǔ)存于約-20'C。優(yōu)選，氯仿用作唯一的溶劑，因?yàn)樗燃状?更容易蒸發(fā)。
因?yàn)樗玫街|(zhì)體的不穩(wěn)定性和易漏性，來(lái)自天然來(lái)源的磷脂， 如蛋或大豆磷脂酰膽堿、腦磷脂酸、腦或植物磷脂酰肌醇、心臟心磷 脂和植物或細(xì)菌磷脂酰乙醇胺優(yōu)選不用作主要的磷脂，即，構(gòu)成總磷 脂組成的50%或更多。
"脂質(zhì)體"是一般術(shù)語(yǔ)，包括多種通過封閉的脂質(zhì)雙層或凝聚物 的產(chǎn)生而形成的單和多層脂質(zhì)載體。脂質(zhì)體可以表征為具有磷脂雙層 膜和內(nèi)部含水介質(zhì)的嚢泡狀結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有多層通過含水介質(zhì) 隔開的脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮于過量水溶液中時(shí)它們自發(fā)形成。在形成 封閉的結(jié)構(gòu)并將水和溶解的溶質(zhì)圏閉在脂質(zhì)雙層之間前脂質(zhì)成分經(jīng)歷 自我重排(Grosh和Bachhawat， 1991)。然而，本發(fā)明還包括在溶液
中具有不同于通常嚢泡狀結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的組合物。例如，脂質(zhì)可以呈現(xiàn) 膠粒結(jié)構(gòu)或僅僅作為脂質(zhì)分子的非均一聚集物存在。還涉及的是 1 ipofectamine-核酸復(fù)合物。
當(dāng)分散于水中時(shí)根據(jù)脂質(zhì)與水的摩爾比，磷脂可以形成除了脂質(zhì) 體以外的各種結(jié)構(gòu)。在低的比例，脂質(zhì)體是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體的物 理特征取決于pH、離子強(qiáng)度和/或二價(jià)陽(yáng)離子的存在。脂質(zhì)體可顯示 出對(duì)離子性和/或極性物質(zhì)的低滲透性，但是在升高的溫度經(jīng)歷相變， 這顯著改變了它們的滲透性。相變涉及從稱為凝膠狀態(tài)的緊密填充的 有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成稱為流態(tài)的松散填充的有序度較低的結(jié)構(gòu)。這發(fā)生在 特征性相變溫度和/或?qū)е聦?duì)離子、糖和/或藥物的滲透性增強(qiáng)。
脂質(zhì)體通過四種不同的機(jī)制與細(xì)胞相互作用通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) 的吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞的胞吞作用；通過非特異性 的弱疏水或靜電力和/或通過與細(xì)胞表面成分的特異性相互作用吸附至細(xì)胞表面；通過將脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層插入質(zhì)膜中與質(zhì)膜融合，同時(shí) 將脂質(zhì)體的內(nèi)含物釋放至細(xì)胞質(zhì)中；和/或通過將脂質(zhì)體的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至 細(xì)胞和/或亞細(xì)胞膜，和/或相反，沒有與脂質(zhì)體內(nèi)含物的任何相關(guān)。 改變脂質(zhì)體制劑可以改變運(yùn)作機(jī)制，盡管同時(shí)可以運(yùn)作多于一種。
脂質(zhì)體介導(dǎo)的寡核苷酸傳送和外源DNA體外表達(dá)已經(jīng)非常成功。 Wong等(1980 )證明了在培養(yǎng)的雞胚胎、HeLa細(xì)胞和肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中 脂質(zhì)體介導(dǎo)的外源DNA傳送和表達(dá)的可行性。Nicolau等(1987 )實(shí) 現(xiàn)了在大鼠中靜脈注射后成功的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，脂質(zhì)可以結(jié)合血凝病毒(HVJ)。已經(jīng) 表明這有助于與細(xì)胞膜的融合和促進(jìn)了脂質(zhì)體包裹的DM的細(xì)胞進(jìn)入 (Kaneda等，1989 )。其他實(shí)施方案中，脂質(zhì)可以與核的非組蛋白染 色體蛋白(HMG-1)復(fù)合或結(jié)合核的非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)使 用(Kato等，1991)。再一實(shí)施方案中，脂質(zhì)可以與HVJ和HMG-1兩 者復(fù)合或結(jié)合HVJ和HMG-1兩者使用。因?yàn)檫@樣的表達(dá)載體已經(jīng)成功 地用于寡核苷酸的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)中，則它們可用于本發(fā)明中。 在DNA構(gòu)建體中使用細(xì)菌啟動(dòng)子的情況中，在脂質(zhì)體內(nèi)包括合適的細(xì) 菌聚合酶也是理想的。
可以通過不同方法形成根據(jù)本發(fā)明所用的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的大小 根據(jù)合成的方法而不同。懸浮于水溶液中的脂質(zhì)體通常是球嚢的形狀， 具有一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)雙層分子的同心層。每層由通式XY表示的分子的 平行陣列構(gòu)成，其中X是親水部分和Y是疏水部分。含水懸浮液中， 同心層排列使得親水部分傾向于保持與水相的接觸而疏水部分趨向自 我結(jié)合。例如，當(dāng)脂質(zhì)體內(nèi)和外都存在水相時(shí)，脂質(zhì)分子形成雙層， 稱為排列XY-YX的薄層。當(dāng)多于一個(gè)脂質(zhì)分子的親水和疏水部分變得 相互連接時(shí)形成脂質(zhì)的凝聚物。這些凝聚物的大小和形狀取決于許多 不同變量，如溶劑的性質(zhì)和溶液中其他化合物的存在。
可以根據(jù)已知的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來(lái)制備本發(fā)明范圍內(nèi)的脂質(zhì)體。 一優(yōu) 選實(shí)施方案中，通過混合容器例如玻璃梨形燒瓶中溶劑中的脂質(zhì)體脂 質(zhì)來(lái)制備脂質(zhì)體。容器應(yīng)當(dāng)具有超過預(yù)期脂質(zhì)體懸浮液體積十倍的體積。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，在負(fù)壓下大約4ox:除去溶劑。通常在約5分鐘
至2小時(shí)內(nèi)除去溶劑，取決于所需脂質(zhì)體的體積?？梢詫⒔M合物在真
空下的干燥器中進(jìn)一步干燥。由于易于隨時(shí)間而變質(zhì)，通常在約l周 后丟棄干燥的脂質(zhì)。
干燥的脂質(zhì)可以在無(wú)菌無(wú)熱原水中以25-50mM磷脂水合，通過震 蕩直至所有脂質(zhì)膜重新懸浮。然后將含水的脂質(zhì)體分成等份，每份置 于小瓶中，在真空下凍干并密封。
在可替換的方案中，根據(jù)其它已知的實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)制備脂質(zhì)體 Bangham等(1965 )的方法，其內(nèi)容在此引入作為參考；Gregoriadis 的方法，如"生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的藥物載體，，中所述的，G. Gregoriadis 編輯(1979 )pp. 287-341，其內(nèi)容在此引入作為參考；Deamer和Uster 的方法，1983，其內(nèi)容在此引入作為參考；和Szoka和 Papahadjopoulos, 1978所述的反相蒸發(fā)方法。上述方法各自捕獲含 水物質(zhì)的能力和各自含水空間對(duì)脂質(zhì)的比例不同。
如上所述制得的干燥脂質(zhì)或凍干脂質(zhì)體可以脫水并在抑制肽的溶 液中重構(gòu)并用合適的溶劑如DPBS稀釋至合適的濃度。然后在渦旋混合 器中將混合物劇烈震蕩。通過在29， OOOx g離心來(lái)除去未包裹的核酸 并洗滌脂質(zhì)體沉淀物。以合適的總磷脂濃度如約50-200mM將洗過的脂 質(zhì)體重懸?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)定包裹的核酸量。測(cè)定脂質(zhì)體制劑 中包裹的核酸量后，可以將脂質(zhì)體稀釋至合適的濃度并存儲(chǔ)于4。C直 至使用。
激活(脈沖)的免疫細(xì)胞的產(chǎn)生
本發(fā)明包括已經(jīng)暴露于抗原或以其它方式用抗原"脈沖"并通過 抗原激活的細(xì)胞。例如，APC可以變成體外裝載Ag的，例如通過抗原 存在下的離體的培養(yǎng)，或通過體內(nèi)暴露于抗原。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還容易理解可以以將APC暴露于抗原足以促進(jìn)抗 原在APC表面上呈遞的時(shí)間的方式來(lái)"脈沖，，APC。例如，可以將APC 暴露于稱為抗原肽的小肽片段形式的抗原，直接"脈沖"至APC外表面上(Mehta-Damani等，I994);或可以用完整蛋白或蛋白微粒來(lái)溫 育APC，這些蛋白或蛋白微粒隨后被APC攝入。這些完整蛋白通過APC 消化成小肽片段，最后運(yùn)載至APC表面并在APC表面上呈遞(Cohen 等，19")。通過在此所迷的標(biāo)準(zhǔn)"脈沖"技術(shù)可以將肽形式的抗原 暴露于細(xì)胞。
不希望受到任何特定理論的束縛，為了保持抗原的免疫原性形式， 通過本發(fā)明的APC來(lái)加工外源形式的抗原或自身抗原?？乖拿庖咴?性形式意思是抗原通過斷裂加工產(chǎn)生可由免疫細(xì)胞例如T細(xì)胞識(shí)別并 刺激免疫細(xì)胞的抗原形式。優(yōu)選，這樣的外源或自身抗原是通過APC 加工成肽的蛋白質(zhì)。可以提取并純化通過APC產(chǎn)生的相關(guān)肽，用作免 疫原性組合物。通過APC加工的肽還可以用于誘導(dǎo)對(duì)APC加工的蛋白 質(zhì)的耐受性。
認(rèn)為自身免疫性疾病是由對(duì)抗"自身蛋白"(另外稱為自身抗原， 即個(gè)體中存在的或內(nèi)源的自身抗原)的免疫應(yīng)答引起的。自身免疫應(yīng)
答中，這些"自身蛋白"對(duì)T細(xì)胞呈遞，這導(dǎo)致T細(xì)胞變成"自身反 應(yīng)性的"。根據(jù)本發(fā)明的方法，用抗原脈沖APC來(lái)產(chǎn)生相關(guān)的"自身 肽"。相關(guān)的自身肽對(duì)于每個(gè)個(gè)體是不同的，因?yàn)镸HC產(chǎn)物是高度多 態(tài)性的且每個(gè)單獨(dú)的MHC分子可能結(jié)合不同的肽片段。然后"自身肽"
需要治療的二體中對(duì)自身蛋白的耐受:: ^
通過將APC在體外或體內(nèi)暴露于抗原來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的抗原激活的 APC，也稱為"脈沖的APC"。在體外脈沖APC的情況中，將APC涂布 于培養(yǎng)皿上并暴露于足量的抗原和足夠的時(shí)間段來(lái)使抗原結(jié)合APC。
可以使用本領(lǐng)域已知的或在此另外公開的方法來(lái)測(cè)定獲得抗原與APC 結(jié)合所需的量和時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法，例如免疫測(cè) 試或結(jié)合測(cè)試，可以用來(lái)檢測(cè)暴露于抗原后APC上抗原的存在。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用允許APC表達(dá)特定蛋白質(zhì)的載體 轉(zhuǎn)染APC。APC表達(dá)的蛋白質(zhì)然后被加工并呈遞在細(xì)胞表面上MHC受體 上。然后將轉(zhuǎn)染的APC用作免疫原性組合物來(lái)產(chǎn)生對(duì)載體編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
如本文別處所討論的，可以制得載體來(lái)包括編碼和表達(dá)蛋白質(zhì)的 特定多核苷酸，對(duì)該蛋白的免疫原性應(yīng)答是所需的。優(yōu)選，將逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體用來(lái)感染細(xì)胞。更優(yōu)選，將腺病毒載體用來(lái)感染細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過修飾病毒載體來(lái)編碼由APC上 的受體識(shí)別的蛋白質(zhì)或其部分，將栽體乾向APC，借此通過載體占據(jù) APC受體將啟動(dòng)對(duì)載體的胞吞作用，使得加工和呈遞由病毒載體的核 酸編碼的抗原。通過病毒傳送的核酸對(duì)病毒可以是天然的，其在APC 上表達(dá)時(shí)編碼病毒蛋白，然后該蛋白被加工和呈遞在APC的MHC受體 上。
如本文別處所討論的，各種方法可用于將多核苷酸轉(zhuǎn)染至宿主細(xì) 胞中。方法包括但不限于磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、微粒轟擊、微注射、 電穿孔、膠體分散系統(tǒng)(即，大分子復(fù)合物、納米膠嚢、微球體、珠
子和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油型乳濁液、膠粒、混合膠粒和脂質(zhì)體)。 另一方面中，可以將編碼抗原的多核苷酸克隆至表達(dá)載體中，并 將栽體引入APC中來(lái)另外產(chǎn)生激活的APC。本文別處討論了將核酸引 入細(xì)胞中的各種載體和方法。例如，可以通過本領(lǐng)域的任何方法將編 碼抗原的載體引入宿主細(xì)胞中。例如，可以通過物理、化學(xué)或生物方 法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中。參見，例如，Sambrook等，(2001， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))， Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和Ausubel等(1997, Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的通用實(shí) 驗(yàn)方案)，John Wiley & Sons, New York )。容易理解引入含有編碼 抗原的多核苷酸的表達(dá)載體產(chǎn)生了脈沖的細(xì)胞。
本發(fā)明包括用于脈沖APC的各種方法，包括但不限于，用蛋白質(zhì)、 cDNA或mRM形式的完整抗原裝載APC。然而，不應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明解釋為 限于用于脈沖APC的特定形式的抗原。相反，本發(fā)明包括本領(lǐng)域已知 的用于產(chǎn)生裝載抗原的APC的其它方法。優(yōu)選，用編碼限定抗原的niRNA 轉(zhuǎn)染APC。使用合適的引物和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)結(jié)合
52轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以在體外快速產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于序列已知基因產(chǎn)物的mRNA。用 mRNA轉(zhuǎn)染APC提供了超越其他用于產(chǎn)生脈沖APC的裝載抗原技術(shù)的優(yōu) 勢(shì)。例如，從微小量的組織即腫瘤組織擴(kuò)增RNA的能力擴(kuò)展了 APC用 于接種大量患者的用途。
抗原可以源自病毒、真菌或細(xì)菌?？乖梢允亲陨砜乖蚺c選自 感染性疾病、癌癥、自身免疫性疾病的疾病相關(guān)的抗原。
對(duì)于用作疫苗的抗原組合物，抗原組合物必須在細(xì)胞、組織或哺 乳動(dòng)物(例如，人)中誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。如在此所使用的，"免 疫學(xué)組合物"可以包括抗原(例如，肽或多肽)、編碼抗原的核酸(例 如，抗原表達(dá)載體)、表達(dá)或呈遞抗原的細(xì)胞或細(xì)胞組成成分。特定 實(shí)施方案中，抗原組合物包括或編碼在此所述任何抗原的全部或部分， 或其免疫學(xué)功能等同物。其他實(shí)施方案中，抗原組合物在混合物中， 該混合物包括其他免疫刺激劑或編碼這樣試劑的核酸。免疫刺激劑包 括但不限于其他抗原、免疫調(diào)節(jié)劑、抗原呈遞細(xì)胞或佐劑。其他實(shí)施 方案中， 一種或多種其他的試劑共價(jià)結(jié)合抗原或免疫調(diào)節(jié)劑，以任意 組合。特定實(shí)施方案中，抗原組合物綴合或包括HLA錨基序氨基酸。
本發(fā)明疫苗的核酸和/或細(xì)胞組成成分的組成可以不同。非限制性 實(shí)例中，編碼抗原的核酸也可以和佐劑一起配制。當(dāng)然，可以理解在 此所述的各種組合物可以進(jìn)一步包括其他成分。例如， 一種或多種疫 苗組成部分可以包括于脂質(zhì)或脂質(zhì)體中。另一非限制性實(shí)施例中，疫 苗可以包括一種或多種佐劑。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，通過在此公開 的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)制得和/或給藥本發(fā)明的疫苗 及其各種成分。
包括但不限于，化學(xué)合成，通過固相合成和通過HPLC從化學(xué)反應(yīng)的其 他產(chǎn)物純化分離，或通過編碼包括本發(fā)明抗原的肽或多肽的核酸序列 (例如，DNA序列)在體外翻譯系統(tǒng)或活細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。此外， 抗原組合物可以包括從生物學(xué)樣品分離的細(xì)胞成分。優(yōu)選，分離并充 分透析抗原組合物來(lái)除去一種或多種不需要的小分子量分子和/或凍干以更易配制到所需的載體中。進(jìn)一步理解在疫苗成分中形成其他的 氨基酸、突變、化學(xué)修飾等，如果有的話，將優(yōu)選基本上不干擾表位 序列的抗體識(shí)別。
對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明抗原決定簇的肽或多肽通常至少是五或
六個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，并可以含有高達(dá)約IO、約15、約20、約25、約 30、約35、約40、約45或約50個(gè)殘基?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域那些普通技 術(shù)人員已知的方法來(lái)合成肽序列，如，例如，使用自動(dòng)化肽合成儀的 肽合成,如從Applied Biosystems， Inc. ， Foster City， CA( Foster City, CA)可獲得的那些。
例如通過重組方法也可以制得較長(zhǎng)的肽或多肽。特定實(shí)施方案中，
產(chǎn)生抗原組合物，用于本發(fā)明的各種組合物和方法。例如，特定實(shí)施 方案中，編碼抗原的核酸包括于例如重組細(xì)胞的載體中?？梢员磉_(dá)核 酸來(lái)產(chǎn)生含有抗原序列的肽或多肽?？梢詮募?xì)胞分泌肽或多肽，或作 為細(xì)胞的一部分包括或包括于細(xì)胞內(nèi)。
特定實(shí)施方案中，通過用編碼抗原的核酸轉(zhuǎn)染或接種哺乳動(dòng)物來(lái) 促進(jìn)免疫應(yīng)答。將核酸給藥于哺乳動(dòng)物后，然后目標(biāo)哺乳動(dòng)物內(nèi)包括 的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)核酸編碼的序列。疫苗還可以是例如編碼抗原 全部或部分肽或多肽序列的核酸(例如，cDNA或RNA形式)的形式。 通過核酸的體內(nèi)表達(dá)可以是例如通過質(zhì)粒型載體、病毒載體或病毒/ 質(zhì)粒構(gòu)建載體。
優(yōu)選方面中，核酸包括編碼區(qū)域，編碼全部或部分編碼合適抗原 或其免疫學(xué)功能等價(jià)物的序列。當(dāng)然，核酸可以包括和/或編碼另外的 序列，包括但不限于含有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑的那些。
腫瘤相關(guān)抗原
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"腫瘤抗原"或"過度增殖性障礙抗原"或 "過度增殖性障礙相關(guān)抗原"指的是特定過度增殖性障礙常見的抗 原。特定方面中，本發(fā)明的過度增殖性障礙抗原源自癌癥，包括但不限于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、 非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、宮頸癌、膀 胱癌、腎癌和腺癌如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
一實(shí)施方案中，本發(fā)明的胂瘤抗原包括一種或多種由源自哺乳動(dòng)
物癌腫瘤的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)免疫上識(shí)別的抗原性癌癥表位。 惡性肺瘤表達(dá)可以作為免疫攻擊的目標(biāo)抗原的多種蛋白。這些分 子包括但不限于組織特異性抗原如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和 GP100和前列腺癌中的前列腺酸磷酸酶(PAP)和前列腺特異性抗原
(PSA )。其他目標(biāo)分子屬于轉(zhuǎn)化相關(guān)分子組如癌基因 HER-2/Neu/ErbB-2。再一組目標(biāo)抗原是腫瘤胚胎性抗原如癌胚抗原
(CEA)。在B細(xì)胞淋巴瘤中，肺瘤特異性獨(dú)特型免疫球蛋白構(gòu)成個(gè)體 腫瘤獨(dú)特的真正腫瘤特異性免疫球蛋白抗原。B細(xì)胞分化抗原如CD19、 CD20和CD37是B細(xì)胞淋巴瘤中目標(biāo)抗原的其他候選者。這些抗原中 的一些(CEA、 HER-2、 CD19、 CD20、獨(dú)特型)已經(jīng)用作使用單克隆抗 體的被動(dòng)免疫治療的目標(biāo)，獲得有限的成功。
可以從天然來(lái)源如原代臨床分離物、細(xì)胞系等純化和分離腫瘤抗 原及其抗原性癌癥表位。也可以通過化學(xué)合成或通過本領(lǐng)域已知的重 組DNA技術(shù)來(lái)獲得癌癥肽及其抗原性表位?；瘜W(xué)合成的技術(shù)描述于 Steward等(1969) ; Bodansky等(1976) ; Meienhofer (1983)和 Schrder等(1965 )。此外，如Renkvist等(2001 )中所述的，本領(lǐng) 域中存在多種已知抗原。下表描述了由腫瘤抗原編碼的T細(xì)胞限定的 表位，且只列出了那些由T細(xì)胞(細(xì)胞毒性CD8+或輔助CD")識(shí)別的 腫瘤抗原。盡管沒有列出類似物或人工改造的表位，本領(lǐng)域技術(shù)人員 將認(rèn)識(shí)到怎樣通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)獲得或產(chǎn)生它們。在Ludwig Institute for Cancer Research (路德維希癌癥研究學(xué)會(huì))的數(shù)據(jù) 庫(kù)中鑒定了通過抗體鑒定和通過Serex技術(shù)檢測(cè)的其他抗原(參見， Sahin等(1997 )和Chen等(2000 ))。
微生物抗原微生物抗原可以是病毒、細(xì)菌或真菌來(lái)源的。感染性病毒的實(shí)例
包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如，人免疫缺陷病毒，如HIV-1 (也稱為 HTLV-III、 LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III;和其他分離抹，如 HIV-IP;細(xì)小病毒科(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲肝病毒；腸道病毒、 人庫(kù)克薩基病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；Calciviridae (例如，引起 腸胃炎的抹)；披膜病毒科(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)瘆病毒)；黃病 毒科(例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(例 如，冠狀病毒)；纟奉狀病毒科(例如，水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)； 線狀病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、 腮腺炎病毒、麻療病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流 感病毒)；布尼亞病毒科(例如，漢坦病毒、布尼亞病毒、白蛉病毒 和納伊羅病毒)；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼吸弧病毒科(例如， 呼吸弧病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科；嗜肝DNA病毒 科(乙肝病毒)；細(xì)小病毒科(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤 病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(單純 皰滲病毒(HSV) 1和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰 滲病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒 科(例如，非洲豬熱病毒)和未分類的病毒(例如，海綿狀腦病的病 原體，5肝炎的病原體(認(rèn)為是乙肝病毒的缺陷型衛(wèi)星)，非曱非乙 肝炎病毒的病原體(1類=內(nèi)部傳播的；2類=腸道外傳播的(即，丙肝)； 諾沃克和相關(guān)病毒，以及星狀病毒)。
感染性細(xì)菌的實(shí)例包括幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)、 布氏疏螺旋體(Borrelia burdorferi )、侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pne畫philia )、分枝桿菌(例如，結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis )、 鳥分枝桿菌(M. avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare )、堪薩 斯分枝桿菌(M. kansasii)、戈登分枝桿菌(M. gordonae)、金黃色 葡萄球菌(Streptococcus aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、 單核細(xì)月包增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酉良腺鏈J求菌(Streptococcus pyogenes ) (A 組鏈球菌)、無(wú)乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae ) ( B組鏈球菌)、草綠色鏈球菌(組)、 糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、 牛鏈球菌(Streptococcus bovis )、鏈球菌(厭氧)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )、 致病性彎曲桿菌(Campylobacter)、腸球菌(Entercoccus)、流感 嗜血菌 (Haemophilus influenzae)、 炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)、 白喉棒桿菌(Cornebacterium dipheriae)、棒桿菌、 豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )、產(chǎn)氣莢膜梭菌
產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes )、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、 多殺巴斯德氏菌(Pasteulla multocida)、擬桿菌
(Bacteroides)、 具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠 狀鏈桿菌 (Streptobacillus moniliformis)、 極細(xì)密螺旋體
(Treponema pertenue)、鉤端螺旋體(Leptospira)和衣氏放線菌
(Actinomyces israelii)。
感染性真菌的實(shí)例包括新型隱球菌(Crytococcus neoformans )、 莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum )、 厭酷球孢子菌
(Coccidiodes immitis )、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis )、 沙目艮衣原體(Chlamydia trachomatis)、白色假絲酵母(Candida albicans)。其他感染性生物體(即，原生生物)包括惡性瘧原蟲
(Plasmodium falciparum)和弓形蟲(Toxoplasma gondii)。
經(jīng)沉默和脈沖的免疫細(xì)胞
另一實(shí)施方案中，可以從培養(yǎng)物、組織、器官或生物體分離細(xì)胞 并作為細(xì)胞疫苗給藥于哺乳動(dòng)物。因此，本發(fā)明涉及"細(xì)胞疫苗"。 當(dāng)然，細(xì)胞還可以表達(dá)一種或多種其他疫苗成分，如免疫調(diào)節(jié)劑或佐 劑。疫苗可以包括細(xì)胞的全部或部分。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì) 胞疫苗包括人APC，更優(yōu)選的實(shí)施方案中，APC是DC。
細(xì)胞疫苗可以包括已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明沉默來(lái)增強(qiáng)其免疫效能的
ingens )、破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)、APC。然后用編碼抗原的核酸來(lái)轉(zhuǎn)染沉默的APC來(lái)產(chǎn)生裝栽抗原的細(xì) 胞。另一方面中，用含有抗原的免疫刺激蛋白來(lái)脈沖沉默的APC來(lái)產(chǎn) 生裝載抗原的細(xì)胞?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，可以通過任何方法使用 任何類型的抗原來(lái)脈沖沉默的APC來(lái)裝載抗原。此外，可以在用本發(fā) 明的抑制劑沉默APC之前、同時(shí)或之后通過任何方法來(lái)脈沖APC。
如本文別處所公開的，可以使用各種方法用抗原來(lái)脈沖細(xì)胞。本 發(fā)明的抗原含有至少一個(gè)表位，其中所述表位能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免 疫應(yīng)答。 一實(shí)施方案中，通過表達(dá)載體來(lái)表達(dá)抗原。另一實(shí)施方案中， 抗原是分離的多肽。優(yōu)選，抗原與選自感染性疾病、癌癥和自身免疫 性疾病的疾病相關(guān)。本文別處公開了用于脈沖本發(fā)明細(xì)胞的多種優(yōu)選 抗原?？乖梢允侵辽僖环N或多種以下的形式腫瘤裂解物、蛋白質(zhì)、 肽、mRNA、 DNA，從載體表達(dá)的，脂質(zhì)體等。
已經(jīng)用細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑沉默的APC具有升高的免 疫效能，因此引發(fā)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，即，增強(qiáng)的呈遞抗原和激活對(duì)其 的免疫應(yīng)答的能力。與沒有沉默的其他方面相同的APC相比較，根據(jù) 本發(fā)明沉默和脈沖的APC能夠刺激效應(yīng)T細(xì)胞并引發(fā)對(duì)抗原增強(qiáng)的免 疫應(yīng)答。
治療應(yīng)用
本發(fā)明包括用于增強(qiáng)免疫細(xì)胞如APC免疫效能的組合物?？梢酝?過使用本領(lǐng)域公知的方法監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答、輔助T細(xì)胞應(yīng)答 和/或?qū)乖目贵w應(yīng)答的誘導(dǎo)來(lái)測(cè)量對(duì)APC呈遞的抗原的應(yīng)答。
本發(fā)明包括增強(qiáng)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括將一種或多種淋 巴細(xì)胞接觸抗原組合物的步驟，其中抗原是通過免疫細(xì)胞如APC來(lái)呈 遞的?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，可以通過暴露于細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào) 節(jié)劑抑制劑來(lái)沉默APC，借此對(duì)抑制劑的暴露增強(qiáng)了 APC的免疫效能。 可以在將APC暴露于抗原組合物以脈沖APC之前、同時(shí)或之后使用在 此公開的方法來(lái)沉默APC。
增強(qiáng)的免疫應(yīng)答可以是主動(dòng)或被動(dòng)免疫應(yīng)答。應(yīng)答可以是繼承性
58免疫治療方法的一部分，其中從哺乳動(dòng)物(例如，患者)獲得APC如 樹突細(xì)胞、B細(xì)胞或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，然后用含有抗原組合物的組 合物脈沖(在將細(xì)胞暴露于細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑來(lái)另外沉 默免疫細(xì)胞之前、同時(shí)或之后)，然后將APC給藥于有此需要的哺乳 動(dòng)物。
組合物包括至少一種或多種以下物質(zhì)的任何組合細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑、抗原、沉默的免疫細(xì)胞、脈沖的細(xì)胞和還用抗 原脈沖的沉默免疫細(xì)胞。組合物可以是用于哺乳動(dòng)物離體免疫和/或體 內(nèi)治療的疫苗。優(yōu)選，哺乳動(dòng)物是人。
對(duì)于離體的免疫，將細(xì)胞給藥于哺乳動(dòng)物之前在體外發(fā)生至少一 種以下情況i)細(xì)胞的沉默，ii )細(xì)胞的脈沖或iii )細(xì)胞的沉默和 脈沖。應(yīng)當(dāng)^人識(shí)到可以^吏用本文別處>^開的方法在用抗原處理APC以 脈沖免疫細(xì)胞之前、同時(shí)或之后來(lái)沉默本發(fā)明的免疫細(xì)胞(即，APC)。
另一實(shí)施方案中，可以將沉默的APC給藥于有此需要的患者，而 之前沒有在體外暴露于抗原。即，本發(fā)明包括將沉默的APC給藥于患 者，其中細(xì)胞的脈沖發(fā)生在患者體內(nèi)。
再一實(shí)施方案中，可以將脈沖的APC給藥于有此需要的患者，之 前沒有在體外將細(xì)胞暴露于細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑。即， 本發(fā)明包括將脈沖的APC給藥于患者，其中細(xì)胞的沉默發(fā)生在患者體內(nèi)。
離體(ex vivo)的方法是本領(lǐng)域公知的并在以下更全面地討論。 簡(jiǎn)而言之，從哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)分離細(xì)胞并用表達(dá)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑的載體或用在此公開的任何其他形式的細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑(即，化學(xué)合成的siRNA)來(lái)沉默(即，體外轉(zhuǎn)導(dǎo) 或轉(zhuǎn)染)?？梢詫⒊聊募?xì)胞給藥于哺乳動(dòng)物受體來(lái)提供治療益處。 哺乳動(dòng)物受體可以是人，由此沉默的細(xì)胞對(duì)于受體可以是自體的?；?者，細(xì)胞對(duì)于受體可以是同種異體的、同基因的或異種的。
U.S.專利No. 5， 199， 942'中描述了用于離體擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖 細(xì)胞的方法，在此引入作為參考，可以應(yīng)用于本發(fā)明的細(xì)胞。其他合適的方法是本領(lǐng)域已知的，因此本發(fā)明不限于任何特定離體擴(kuò)增細(xì)胞
的方法。簡(jiǎn)而言之，DC的離體培養(yǎng)和擴(kuò)充包括(l)從哺乳動(dòng)物的 外周血收集物或骨髓外植體收集CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞；和(2) 離體擴(kuò)充這樣的細(xì)胞。除了 U.S.專利No. 5, 199, 942中所述的細(xì)胞生 長(zhǎng)因子，其他因子如fU3-L、 IL-1、 IL-3和c-kit配體，可以用于培 養(yǎng)和擴(kuò)充細(xì)胞。
用于從細(xì)胞群中鑒定和分離CD34+造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的各種細(xì) 胞選擇技術(shù)是已知的。例如，單克隆抗體(或其他特異性細(xì)胞結(jié)合蛋 白)可以用于結(jié)合干細(xì)胞或祖細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記蛋白或表面抗原蛋白。 用于造血干細(xì)胞的幾種這樣的標(biāo)記或細(xì)胞表面抗原(即flt-3、 CD34、 My-lO和Thy-l)是本領(lǐng)域已知的。
用合適的細(xì)胞因子培養(yǎng)收集的CD34+細(xì)胞。然后使0034+細(xì)胞分
化并定向成樹突世系的細(xì)胞。然后使用樹突細(xì)胞的特征性標(biāo)記，如 CDla、 HLA DR、 CD8Q和/或CD86,通過流式細(xì)胞術(shù)或相似的方法將這 些細(xì)胞進(jìn)一步純化。DC培養(yǎng)分離后，根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)修飾細(xì)胞。 或者在分化成DC樣細(xì)胞之前修飾祖細(xì)胞。
除了在離體免疫中使用基于細(xì)胞的疫苗外，本發(fā)明還提供了用于 體內(nèi)免疫的組合物和方法，來(lái)引發(fā)患者對(duì)抗抗原的免疫應(yīng)答。
對(duì)于體內(nèi)免疫，本發(fā)明提供了細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑作 為 一般方法通過使APC中的關(guān)鍵控制點(diǎn)失去能力來(lái)增強(qiáng)疫苗功效的應(yīng) 用。因此，用于體內(nèi)免疫的疫苗包括至少一種抑制劑成分，其中抑制 劑成分能夠抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑。另一方面中，疫苗包括抑 制劑成分和抗原成分，其中抗原成分能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
關(guān)于體內(nèi)免疫，將從患者獲得的細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)另外產(chǎn) 生沉默的細(xì)胞。用表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑抑制劑的載體來(lái)體內(nèi)沉默細(xì)胞。 或者，使用在此公開的不是通過載體表達(dá)的任何其它形式的細(xì)胞因子 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑(即，化學(xué)合成的siRNA)來(lái)沉默細(xì)胞。本文
別處討論了體內(nèi)產(chǎn)生沉默細(xì)胞的方法。
疫苗的另一方面包括用于體內(nèi)脈沖細(xì)胞的抗原成分。任何抗原可以結(jié)合本發(fā)明的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑來(lái)給藥。在用含有抑 制劑的疫苗沉默細(xì)胞之前、同時(shí)或之后使用本文別處公開的任何方法 來(lái)脈沖細(xì)胞。容易認(rèn)識(shí)到在同時(shí)脈沖和沉默細(xì)胞的情況中，用含有抑 制劑和抗原兩者的單個(gè)疫苗來(lái)免疫哺乳動(dòng)物?；蛘?，用兩種分開的疫 苗來(lái)免疫哺乳動(dòng)物， 一種含有抑制劑而第二種疫苗含有抗原。
本發(fā)明包括用于癌癥和感染性疾病的體內(nèi)免疫。 一實(shí)施方案中，
通過體內(nèi)單獨(dú)給藥siRNA或結(jié)合產(chǎn)生對(duì)抗患者抗原的免疫應(yīng)答的抗原 給藥來(lái)治療失調(diào)或疾病?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 調(diào)節(jié)劑的抑制劑(即，S0CS1 siRNA)結(jié)合抗原制劑的給藥增強(qiáng)了沒有 使用細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑而其它方面相同的疫苗接種方案 的功效。不希望受到任何特定理論的束縛，認(rèn)為對(duì)患者抗原的免疫應(yīng) 答取決于(1)給藥的siRNA組合物，(2)給藥的持續(xù)時(shí)間、劑量和 頻率，(3)患者的一般狀況，和如果合適(4)給藥的抗原組合物。
一實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物具有表達(dá)腫瘤特異性抗原的癌癥類型。 根據(jù)本發(fā)明，可以制得免疫刺激蛋白，其包括腫瘤特異性抗原序列成 分。這種情況中，將細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑結(jié)合免疫刺激 蛋白給藥于有此需要的患者，對(duì)于患者獲得改進(jìn)的治療結(jié)果，例如通 過表達(dá)腫瘤特異性抗原的癌細(xì)胞或?qū)嶓w腫瘤的生長(zhǎng)減緩或消除，或癌 細(xì)胞總數(shù)或總的腫瘤負(fù)荷的降低所證明的。
相關(guān)實(shí)施方案中，患者已經(jīng)診斷為患有病毒性、細(xì)菌性、真菌性 或其他類型的感染，其與特定抗原如病毒抗原的表達(dá)相關(guān)。根據(jù)本發(fā) 明，可以制得免疫刺激蛋白，其包括由抗原例如HIV特異性抗原構(gòu)成 的序列成分。在這樣的情況中，將細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑 結(jié)合免疫蛋白給藥于有此需要的患者，對(duì)于患者獲得改進(jìn)的治療結(jié)果，
可檢測(cè)癥狀的減輕或消除所證明的。
在另 一種情況中，可以通過將細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑 結(jié)合抗原給藥于有此需要的患者來(lái)治療失調(diào)或疾病。本發(fā)明提供了產(chǎn) 生保護(hù)性的DC誘導(dǎo)的對(duì)患者抗原的免疫應(yīng)答的方法?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到促炎癥細(xì)胞因子(即，IL-2、 TNF a、 IFNa、 IFN P 、 IFN y等)可以加入在此^^開的治療方案中來(lái)增強(qiáng) 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑抑制劑疫苗的功效。
劑量和制劑(藥物組合物)
本發(fā)明預(yù)想了通過給藥治療劑例如s iRNA來(lái)治療哺乳動(dòng)物疾病例 如HIV感染、癌癥等。根據(jù)本發(fā)明的治療劑給藥可以是連續(xù)的或間隔 的，取決于例如受體的生理狀況、給藥目的是治療性的或是預(yù)防性的 和有經(jīng)驗(yàn)從業(yè)者已知的其他因素。本發(fā)明藥劑的給藥可以在預(yù)選的時(shí) 間段內(nèi)基本上是連續(xù)的或是一連串間隔的劑量。涉及局部和全身給藥。 給藥量將根據(jù)各種因素而改變，這些因素包括但不限于選定的組合物、 特定的疾病、哺乳動(dòng)物的體重、身體狀況和年齡以及有待獲得預(yù)防或 治療。臨床醫(yī)師使用動(dòng)物模型或本領(lǐng)域公知的其他測(cè)試系統(tǒng)可以容易 地確定這樣的因素。
可以通過給藥編碼siRNA的核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)siRM的給藥(參見， 例如，F(xiàn)eigner等，U. S.專利No. 5， 580， 859, Pardoll等，1995; Stevenson等，1995; Moiling 1997; Donnelly等，1995; Yang等， II; Abdallah等，1995 )。對(duì)于核酸的藥物制劑、劑量和給藥途徑總 地公開于例如Feigner等，上文。
含有本發(fā)明治療劑的 一種或多種合適的單位劑型，如以下所討論 的，可以任選地配制成用于持續(xù)釋放(例如使用微嚢化，參見 WO94/07529,和U. S.專利No. 4， 962， 091,其公開內(nèi)容在此引入作為參 考)，可以通過各種途徑給藥，包括非腸道，包括通過靜脈內(nèi)和肌內(nèi) 途徑，以及通過直接注射至患病組織中。例如，治療劑可以直接注射 至腫瘤中。在合適的情況下，制劑可以方便地存在于分開的單位劑型 中并可以通過制藥學(xué)公知的任何方法來(lái)制備。這樣的方法包括使治療 劑和液體載體、固體基質(zhì)、半固體栽體、細(xì)粉固體載體或其組合結(jié)合 的步驟，然后如果需要，將產(chǎn)物引入或成形入所需的傳送系統(tǒng)。
當(dāng)制備本發(fā)明的治療劑用于給藥時(shí)，優(yōu)選將它們結(jié)合藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑來(lái)形成藥物制劑或單位劑型。這樣制劑
中的全部活性成分占制劑的0. 1至99. 9%重量。"藥物學(xué)上可接受的，， 是與制劑中的其它成分相容的且對(duì)受體無(wú)害的栽體、稀釋劑、賦形劑 和/或鹽。用于給藥的活性成分可以作為粉末或顆粒存在；作為溶液、 懸浮液或乳濁液。
可以通過本領(lǐng)域已知的方法使用公知的且易于荻得的成分來(lái)制備 含有本發(fā)明治療劑的藥物制劑。本發(fā)明的治療劑還可以配制成適于非 腸道給藥的溶液，例如通過肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)途徑。
本發(fā)明治療劑的藥物制劑還可以采用含水或無(wú)水溶液或分散體的 形式，或可替換的乳濁液或懸浮液的形式。
因此，可以配制治療劑來(lái)用于非腸道給藥(例如，通過注射，例 如，推注或連續(xù)輸注)和可以以單位劑型存在于安瓿、預(yù)填充的注射 器、小體積輸液容器或含有加入的防腐劑的多劑量容器中。活性成分 可以采用這樣的形式，如油性或含水載體中的懸浮液、溶液或乳濁液， 并可以含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可 以是粉末形式，通過無(wú)菌固體的無(wú)菌分離或通過溶液的凍干來(lái)獲得， 在使用前用合適的載體例如無(wú)菌無(wú)熱原的水來(lái)重配。
將認(rèn)識(shí)到每個(gè)劑型的單個(gè)氣溶膠劑量中所含的活性成分的單位含 量不需要自身構(gòu)成用于治療特定適應(yīng)癥或疾病的有效量，因?yàn)榭梢酝?過給藥多個(gè)劑量單位來(lái)獲得需要的有效量。此外，使用低于劑型中的 劑量，單個(gè)或連續(xù)給藥，可以獲得有效量。
本發(fā)明的藥物制劑可以包括，作為任選成分，藥物學(xué)上可接受的 載體、稀釋劑、穩(wěn)定劑或乳化劑和本領(lǐng)域公知類型的鹽。用于本發(fā)明
上可接受的緩沖鹽水溶液，如pH 7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖鹽水溶液。
可以配制本發(fā)明的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、多核苷酸和多肽(活性 成分)并給藥來(lái)治療各種病況，通過產(chǎn)生活性成分與生物體內(nèi)藥劑作 用位點(diǎn)接觸的任何方法。通過可獲得的用于藥物的任何常規(guī)方式來(lái)給 藥，作為單獨(dú)的治療活性成分或在治療活性成分組合中?？梢詥为?dú)給藥，但通常結(jié)合基于選定的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐選擇的藥物學(xué)載 體來(lái)給藥。
通常，水、合適的油、鹽水、含水右旋糖(葡萄糖)和相關(guān)的糖 溶液和二醇類如丙二醇或聚乙二醇是用于非腸道溶液的合適載體。用
于非腸道給藥的溶液含有活性成分、合適的穩(wěn)定劑和如果需要緩沖物 質(zhì)?？寡趸瘎┤缌蛩釟溻c、亞硫酸鈉或抗壞血酸，單獨(dú)或結(jié)合，是合
適的穩(wěn)定劑。還可以使用檸檬酸及其鹽和乙二胺四乙酸鈉(EDTA)。 此外，非腸道溶液可以含有防腐劑如苯扎氯銨、曱基或丙基對(duì)羥基苯 甲酸酯和氯丁醇。合適的藥物載體描述于Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學(xué))中，這是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn) 參考教科書。
本發(fā)明的活性成分可以配制成懸浮于適用于哺乳動(dòng)物特別是人的 藥物學(xué)上可接受的組合物中。這樣的制劑包括使用佐劑，如U. S.專利 No. 4， 082， 735; 4,082,736; 4, 101, 536; 4, 185,089; 4,235, 771和 4, 406, 890中所述的胞壁酰二肽衍生物(MDP)或類似物。其它有用的 佐劑包括明鞏(Pierce Chemical Co.)、脂質(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯 和溴化二曱基雙十八烷基銨(DDA)、弗氏佐劑和IL-12。其它成分包 括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(Pluronic )、非離子表面活性劑 和可代謝的油如角鯊烯(U. S.專利No. 4, 606, 918 )。
此外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)藥物方法來(lái)控制作用的持續(xù)時(shí)間。這些是本 領(lǐng)域公知的并包括控釋制劑，可以包括合適的大分子，例如聚合物、 聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-醋酸乙烯酯、甲基纖維素、 羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白。為了控制釋放可以調(diào)節(jié)大分子的濃度 以及摻入的方法。此外，可以將藥劑摻入聚合材料的顆粒中，聚合材 料如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯-醋酸乙烯酯共聚物。 除了摻入，這些物質(zhì)還可以用于將化合物捕獲于微膠嚢中。
因此，可以通過各種途徑傳送本發(fā)明的藥物組合物并傳送至哺乳 動(dòng)物體內(nèi)的各個(gè)部位來(lái)獲得特定的效果(參見，例如，Rosenfeld等， 1991a; Jaffe等，上文；Berkner，上文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到盡管可以使用多于一種途徑來(lái)給藥，特定的途徑可以提供比另 一種 途徑更即時(shí)且更有效的反應(yīng)?？梢酝ㄟ^給藥來(lái)實(shí)現(xiàn)局部或全身傳送， 包括將制劑應(yīng)用或灌輸至體腔、氣溶膠的吸入或吹入或通過非腸道引 入，包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜、皮下、皮內(nèi)以及局部給藥。
可以以單位劑型提供本發(fā)明的活性成分，其中每個(gè)劑量單位例如 一茶匙、片劑、溶液或栓劑，含有預(yù)定量的組合物，單獨(dú)或適當(dāng)結(jié)合 其它的活性劑。如在此所用的術(shù)語(yǔ)"單位劑型，，指的是物理上分開的 單位，適于用作人和哺乳動(dòng)物患者用的單位劑量，每個(gè)單位含有預(yù)定 量的本發(fā)明組合物，單獨(dú)或結(jié)合其它活性劑，計(jì)算的量足以產(chǎn)生所需 效果，在合適的情況下，結(jié)合藥物學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或介質(zhì)。 本發(fā)明單位劑型的規(guī)格取決于待獲得的特定效果以及在特定宿主中與 藥物組合物相關(guān)的特定藥物動(dòng)力學(xué)。
在此所述的這些方法決不是包括全部的，更多適于特定應(yīng)用的方 法是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的。此外，通過對(duì)已知發(fā)揮所需效果的化合 物的類似性可以進(jìn)一步估計(jì)組合物的有效量。
基因治療給藥
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到不同的傳送方法可以用來(lái)將載體給予細(xì)
胞中。實(shí)例包括(1)使用物理手段的方法，如電穿孔(電)、基因 槍(物理力)或使用大體積的液體(壓力)；和(2)其中將所述載體 與另一種實(shí)體如脂質(zhì)體、聚集的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)運(yùn)分子復(fù)合的方法。
此外，實(shí)際的劑量和給藥時(shí)間表可以根據(jù)組合物是否結(jié)合其他藥 物組合物給藥而改變，或根據(jù)個(gè)體間藥物動(dòng)力學(xué)、藥物分布和代謝差 異而改變。相似地，體外應(yīng)用的含量可以根據(jù)所用的特定細(xì)胞系而改 變(例如，基于細(xì)胞表面上存在的栽體受體的數(shù)量，或基因轉(zhuǎn)移所用 特定載體在該細(xì)胞系中復(fù)制的能力)。此外，每個(gè)細(xì)胞待加入的載體 含量可能根據(jù)插入載體中的治療基因的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性而改變，以及還 有序列的性質(zhì)，這是特別需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的參數(shù)，并可以由于非本 發(fā)明方法固有的因素(例如，與合成相關(guān)的成本)而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)特定情況的緊急需要而容易地進(jìn)行任何必需的調(diào)整。
含有治療劑的細(xì)胞還可以含有自殺基因，即，編碼可以用于破壞 細(xì)胞的產(chǎn)物的基因。許多基因治療情況中，理想的是能夠在宿主細(xì)胞 中表達(dá)用于治療目的的基因，而且還能隨意破壞宿主細(xì)胞。治療劑可 以連接自殺基因，在激活劑化合物不存在下其表達(dá)不被激活。當(dāng)需要 其中已經(jīng)引入藥劑和自殺基因的細(xì)胞死亡時(shí)，將激活劑化合物給藥于 細(xì)胞，因此激活自殺基因的表達(dá)并殺滅細(xì)胞?？梢允褂玫淖詺⒒?
藥物前體組合的實(shí)例是單純皰滲病毒-胸苷激酶(HSV-tk )和更昔洛韋 (ganciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir);氧化還原酶和放線菌酮；
胞嘧啶脫氨基酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶thymidilate激酶 (Tdk:: Tmk )和AZT;和脫氧胞苷激酶和阿糖胞苷。
在此所述的這些方法決不是包含全部的，且適于特定應(yīng)用的更多
方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。此外，可以通過已知發(fā)揮所需
效果的化合物的類推來(lái)進(jìn)一步估計(jì)組合物的有效量。
實(shí)施例
現(xiàn)在參照以下實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。只是為了說(shuō)明的目的來(lái)提供 這些實(shí)施例，且本發(fā)明不限于這些實(shí)施例，而是包括作為在此提供的
教導(dǎo)的結(jié)果而顯而易見的所有變化。
為了將DC用于開發(fā)對(duì)抗各種癌癥和感染因子的有效疫苗，進(jìn)行在 此公開的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究對(duì)DC抗原呈遞的調(diào)節(jié)。在此公開的結(jié)果證明了干 擾免疫細(xì)胞中的負(fù)向調(diào)節(jié)途徑，另外稱為抑制抑制劑，增強(qiáng)了其免疫 刺激能力。抑制抑制劑以增強(qiáng)細(xì)胞的免疫效能的概念作為研發(fā)更有效 疫苗的新方法。
現(xiàn)在描述在此公開的實(shí)驗(yàn)中所用的材料和方法。
siRNA oligo的DC轉(zhuǎn)染
還用21個(gè)堿基對(duì)的siRNA 寡核苷酸 (5 ， -CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-3， ; SEQ ID NO: 3 )轉(zhuǎn)染骨髓DC，使用GenePorter，根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案(Genlantis， SanDiego， CA)。 簡(jiǎn)而言之，將3jul 20jaM的寡核苷酸溶液加入3|il的GenePorter 試劑和94|111無(wú)血清RPMI 1640中。將混合物在25。C溫育30分鐘， 此后將100 ju 1GenePorter/寡核苷酸混合物加入每個(gè)孔中的骨髓DC中 并在37。C溫育4h。溫育后，將補(bǔ)充20%FBS的500 nl/孔R(shí)PMI 1640 加入骨髓DC中。
用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓來(lái)源的DC
使用本領(lǐng)域已知的方法制備小鼠骨髓來(lái)源的DC。簡(jiǎn)而言之，從肢 體中沖洗出小鼠骨髓，通過尼龍網(wǎng)，并用氯化銨耗盡紅細(xì)胞。用 RPMI-1640充分洗滌后，用2. 5ml補(bǔ)充磨BS、 mGM-CSF/ml( 20ng/ml ) 和重組小鼠IL-4 ( 20ng/ml; PeproTech， Inc. ， Rocky Hill， NJ )的 RPMI-164Q培養(yǎng)細(xì)胞。在培養(yǎng)的第2和4天，除去上清液并用含有 20ng/ml rmGM-CSF和20ng/ml rmIL-4的新鮮培養(yǎng)基替代。將所有培 養(yǎng)物在51潮濕的C02中37。C溫育。培養(yǎng)48小時(shí)后除去未貼壁的粒細(xì) 胞并加入新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)7天后，〉80°/。的細(xì)胞表達(dá)特征性DC特異性 標(biāo)記，如通過FACS所測(cè)定的。在24-孔平板中進(jìn)行小鼠骨髓來(lái)源DC 的轉(zhuǎn)導(dǎo)，加入5pg/ml聚凝胺(Sigma, St. Louis， M0 )。將DC洗滌 并以2 x 105細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔板中400 ju 1無(wú)血清RPMI 1640 中。以5 x 105細(xì)胞/1111的細(xì)胞密度將細(xì)胞暴露于不同感染復(fù)數(shù)(MOI ) 的慢病毒載體。轉(zhuǎn)導(dǎo)8小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞并在新鮮組織培養(yǎng)基 中進(jìn)一步溫育。
細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)印跡
4吏用ELISA分才斤(BD Biosciences, Uncoln Park, NJ )才艮據(jù)制 造商的說(shuō)明，使用細(xì)胞培養(yǎng)物上清液來(lái)定量各種細(xì)胞因子的含量。對(duì) 于蛋白質(zhì)印跡分析，以10:1比例用表達(dá)小鼠S0CSl-siRNA或無(wú)關(guān) GFP-siRNA的pSUPER載體和FLAG-標(biāo)記的S0CS1載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞并接受SDS-PAGE。轉(zhuǎn)移至Hybond-P膜 (Amersham, Arlington Heights, IL)后,通過蛋白質(zhì)印跡分析樣 品，使用抗-Flag (Sigma， St. Louis， MO)或肌動(dòng)蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA)抗體，接著用ECL-Plus試 劑(Amersham， Arlington Heights, IL)檢測(cè)。用光密度計(jì)SI掃描 膜并用 ImageQuant軟件(Molecular Dynamics, Piscataway， NJ) 定量SOCS-1/肌動(dòng)蛋白條帶。將S0CS1條帶的強(qiáng)度相對(duì)于p -肌動(dòng)蛋白 條帶的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。
S0CS1的定量RT-PCR分析
通過定量實(shí)時(shí)PCR來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染小鼠BM-DC中S0CS1的相對(duì)表達(dá)。 使用Trizol試劑(Invitrogen， Carlsbad, CA )從3. 5-5 x 105個(gè)BM-DC 中提取總RM。用隨機(jī)六聚體引物和Superscript第一鏈合成試劑盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA)逆轉(zhuǎn)錄每個(gè)樣品l.Opg總RNA。在 ABI 7900HT序歹寸檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)上在20jlz 1重復(fù)四份的反應(yīng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)5，-核酸酶熒光PCR分析， 使用每個(gè)反應(yīng)等量的5ng起始RM材料作為模板。從Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA購(gòu)買用于小鼠S0CS1 (6FAM) 和18S核糖體對(duì)照(VIC)的預(yù)先開發(fā)的引物/探針組(用于S0CS1的 引物，5， -ACCTTCTTGGTGCGCGAC-3 ， ； SEQ ID NO: 12和5， -AAGCCATCTTCACGCTGAGC-3 ， ； SEQ ID NO: 13和雜交探針， 6FAM-TCGCCAACGGAACTGCTTCTTCG-TAMRA; SEQ ID NO: 14 ) 。 PCR參數(shù) 為TaqMan通用PCR Master Mix試劑盒(Applied Biosystems, Inc.， FosterCity， CA)所推薦的，在分開的試管中進(jìn)行S0CS1和18S反應(yīng)。 將S0CS1含量相對(duì)于18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)化。使用比較Ct方法(Livak等， 2001， Methods 25: 402-408 )來(lái)計(jì)算相對(duì)于模擬轉(zhuǎn)染并刺激的BM-DC 的對(duì)照值的S0CS1表達(dá)。
OT-I細(xì)^ 的體外測(cè)試從OT-I小鼠收集脾臟，匯集，并破壞來(lái)獲得單個(gè)細(xì)胞懸浮液。使 用MACS CD8+ T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec Inc. ， Auburn, CA)通過陰性選擇來(lái)收集CD8+0T-IT細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，用生物素標(biāo)記 的CD4 (L3T4) 、 CD45R (B220) 、 DX5、 CDllb (Mac-1)和Ter-119 特異性的抗體包被細(xì)胞。將抗生物素磁性微珠(Miltenyi Biotec Inc.， Auburn, CA)加入細(xì)胞中，將其通過連接MACS磁鐵的分離柱。收集沒 有結(jié)合柱子的細(xì)胞，通過FACS測(cè)定為>95°/。 CD8+。將總共5xl(T個(gè)純 化的CD8+ OT-I T細(xì)胞和5 x 103個(gè)未成熟DC置于圓底96孔孩i量滴定 板每個(gè)孔的200 |i 1補(bǔ)充10% FCS、 4raM L-谷氨酰胺，lmM丙酮酸鈉、 100U/ml青霉素和鏈霉素、10mM HEPES和5 y M 2-ME的RPMI 1640培 養(yǎng)基中。通過在培養(yǎng)最后8小時(shí)每個(gè)孔加入1 nCipH]TdR在2天后測(cè) 量增殖。進(jìn)行了重復(fù)三次的測(cè)定并表示重復(fù)三次的實(shí)驗(yàn)。使用所示細(xì) 胞因子(BD Biosciences, San Jose, CA )的ELISA分析來(lái)測(cè)定OT-I/DC
共培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子分泌。 流式細(xì)力包分析
在預(yù)先阻斷FCy受體后，用含有0. 1，aN3和2%FCS的PBS中的 FITC、 PE、別藻藍(lán)素(APC)或PerCP綴合的mAb將細(xì)胞染色。從BD Biosciences, San Jose， CA購(gòu)買對(duì)小鼠CD4 ( RM4-5 ) 、 CD8( 53-6. 7 )、 CDllc ( HL30 ) 、 CD40 ( 3/23 ) 、 CD80 ( 16-10A1 ) 、 CD86 ( GL1 )特 異性的大鼠mAb和相配的同種型對(duì)照。在FACSCalibor ( Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ )流式細(xì)胞計(jì)和CRLIQuest軟件上分 析染色的細(xì)胞。
四聚體染色
使用H2-K7卵清蛋白四聚體測(cè)試來(lái)檢測(cè)卵清蛋白特異性CD8+T細(xì) 胞。DC免疫后不同天數(shù)，用抗CD8 a -FITC和H2-KV卵清蛋白(SIIFEKL ) -PE四聚體將免疫小鼠的脾細(xì)胞或T細(xì)胞雙重染色；SEQ ID NO: 11 (Beckman Coulter Immunomics， San Diego, CA)。將四聚體染色在4t:進(jìn)行1小時(shí)，每106個(gè)細(xì)胞用1 p g抗CD8a和10ju 1卵清蛋白 四聚體，根據(jù)制造商的說(shuō)明。
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)
將CTL肽用于CD8+T細(xì)胞刺激。還將人CD20分子的無(wú)關(guān)肽用作陰 性對(duì)照。使用MACSCD4 (L3T4)或MACS CD8 ( Ly-2 )微珠(Miltenyi Biotec Inc., Aub證，CA)從脾細(xì)胞分離CD8+T細(xì)胞。
CTL和NK測(cè)試
用標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)試評(píng)估CD8+CTL應(yīng)答，這測(cè)量了體外再次刺激的 脾細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力。在含有肽的RPMI 1640中將從免疫小鼠收 集的脾細(xì)胞再次體外刺激4-6天。用"Cr鉻酸鈉溶液標(biāo)記靶細(xì)胞和對(duì) 照細(xì)胞90分鐘。在96孔V底平板(200jal/孔)中用恒定數(shù)量的乾細(xì) 胞(lxl0V孑L) 37r溫育不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞3小時(shí)。收集重復(fù)三份 培養(yǎng)物的上清液(100p 1)。按照(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/ (最大釋 放-自發(fā)釋放)x IOO來(lái)計(jì)算裂解百分比。通過500U/ml的重組鼠IL-2 培養(yǎng)1 x 106個(gè)細(xì)胞/1111來(lái)從小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生NK細(xì)胞。用51Cr將對(duì)NK 細(xì)胞裂解高度易感的YAC-1細(xì)胞在37X:溫育1小時(shí)，洗滌，并以105 細(xì)胞/ml重懸浮。將NK細(xì)胞重復(fù)三份加入靶細(xì)胞中來(lái)獲得不同的E:T 細(xì)胞比例。溫育后，將平板離心并用y計(jì)數(shù)器(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton， CA)計(jì)數(shù)上清液流體中的放射性。
DC免疫和腫瘤模型
用MOI為5的LV-SOCSl-siRNA或LV-CFP-s iRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓來(lái)源的 DC(骨髓培養(yǎng)第5天)。然后用卵清蛋白或TRP2肽將DC脈沖8小時(shí)， 用PBS洗滌三次，并在另外培養(yǎng)36小時(shí)后用于免疫。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)， 用LPS (100ng/ml， Sigma, St. Louis, MO)刺激抗原脈沖的DC 24 小時(shí)，用PBS洗滌，然后通過腳墊注射至C57BL/6小鼠中(Jackson治療模型中，將EG7或B16腫瘤細(xì)胞(2. 5至5 x 10" 皮下注射(s.c.)至同系C57BL/6小鼠的右脅側(cè)。在腫瘤接種后的不 同天數(shù)，將小鼠隨機(jī)分組并注射5Qp 1抗原脈沖的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC或PBS 對(duì)照。在一些小鼠中，在接種疫苗后的所示天數(shù)腹膜內(nèi)給藥(i.p.) LPS。用卡尺測(cè)量腫瘤體積一周2或3次。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用了 Student' s t檢驗(yàn)，并取95%置信限是 顯著的，限定為P〈0. 05。通常將結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。 現(xiàn)在描述該實(shí)施例中呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例1:鼠S0CS-1 siRNA的鑒定和分析
使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)選擇靶向小鼠S0CS1的siRNA序 列SOCSl-siRNAl ( CCTTCCGCTCCCACTCCGA ; SEQ ID NO: 1 )， S0CSl-s iRNA2 ( CAGTCGCCAACGGAACTGC; SEQ ID NO: 2 )和S0CSl-s iRNA3 (CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT; SEQ ID NO: 3 )。將所有靼序列接受NCBI Blast查詢來(lái)證實(shí)缺乏與其他已知基因的同源性。設(shè)計(jì)正向和反向 oligo來(lái)編碼通過9nt間隔物隔開的有義和反義19nt靶序列。該核心 siRM序列兩側(cè)為Hl RNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列和5T終止子序列，和在退火 時(shí)引入的5， BglII和3， HindIII相容突出端?；贒NA的siRNA表 達(dá)載體pSUPER (Brummelkamp等，2002， Science 296:550-553 )使 用指導(dǎo)siRNA從頭合成的HI-RNA啟動(dòng)子。將合成并退火的寡核苷酸對(duì) 克隆至Bglll/Hindlll消化的pSUPER栽體中。通過限制性消化來(lái)鑒定 陽(yáng)性克隆并通過DM測(cè)序來(lái)證實(shí)。
用于小鼠SOCSl-siRM的慢病毒載體的產(chǎn)生和制備 該研究中所用的HIV轉(zhuǎn)移載體是pTRIP AU3 CMV eGFP，其包括 內(nèi)部巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子并是自我滅活的(SIN載體)，在3， 長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR) U3區(qū)域中具有400bp刪除，其除去了轉(zhuǎn)錄上活性的序列。慢病毒轉(zhuǎn)移載體，pTRIPAU3CMVGFP，含有178bp片段， 該片段在原始pHR主鏈的獨(dú)特CI a I位點(diǎn)中包括中心多嘌呤區(qū)段(cPPT ) 和中心終止序列(CTS)。將pTRIPAU3 CMV GFP進(jìn)行改進(jìn)來(lái)用于從 HI RNA啟動(dòng)子表達(dá)siRNA和共表達(dá)雙順反子殺稻瘟菌素抗性/eYFP選 擇標(biāo)記。為了適應(yīng)克隆并除去天然CMV啟動(dòng)子，使用引物(5， -GATCGAATTCACAAATGGC-3， ； SEQ ID NO: 4和5， -CTAGGGATCCATCG CCCCAAAGTGG-3， ； SEQ ID NO: 5 )來(lái)PCR擴(kuò)增pTRIP栽體的中心多嘌 呤區(qū)段/中心終止序列(cPPT/CTS)來(lái)插入用于克隆的5， -EcoRI和3， -BamHI位點(diǎn)。然后用EcoRI/BamHI消化cPPT-CTS PCR產(chǎn)物并再次插 入EcoR/BamHI消化的pTRIPAU3 CMV GFP栽體中。 <吏用引物(5， -GATCCTCGAGGTCGACAATCAACCTCTGGA-3 ' ; SEQ ID NO: 6和 5 ， -GATCGGTACCCAGGCGGGGAGG-3' ; SEQ ID NO: 7 )從pBS-SK-WPRE PCR 擴(kuò)增旱獺轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(wPRE)序列來(lái)添加5， Xhol/Sall和3， Kpnl 位點(diǎn)。然后用Xhol/Kpnl消化WPRE片段，并插入經(jīng)修飾的pTRIP △ U3 CMV GFP主鏈中來(lái)產(chǎn)生pTRIP-W。首先將siRM和雙順反子選擇標(biāo) 記盒裝配在pSUPER主鏈中用于轉(zhuǎn)移至pTRIP-W中。使用引物(5， -CAGTATCGATTTAATTAATCAATATTGGCCATTAG-3， ; SEQ ID NO:8和5， -CAGTGTCGACTTAATTAAGTGGCCGCTTTACTTG-3， ； SEQ ID NO: 9 )從質(zhì)粒 PYAP6 PCR擴(kuò)增雙順反子選擇標(biāo)記CMV-Blast iR-IRES-eYFP (BY)來(lái)引 入5， -Clal和3， -SalI位點(diǎn)。用Clal和Sail消化PCR產(chǎn)物，然后 連接到Clal/Sall消化的pSUPER載體中以在Hl-RNA啟動(dòng)子和pSUPER MCS的3，-端添加BY標(biāo)記，產(chǎn)生pSUPER-BY。然后BamHI/Sall消化 pSUPER-BY并連接到pTRIP-W主鏈來(lái)產(chǎn)生pTRIP-Hl-BY-W。
用BstBI和Clal消化含有hrGFP或S0CS1 ( 3 ) siRNA發(fā)夾序列的 隨后的pSUPER載體，用于插入pTRIP-Hl-BY-W中來(lái)產(chǎn)生 pTRIP-hrGFP-siRNA-BY-W (GFP-siRNA)和pTRIP-SOCSl-siRNA-BY-W (SOCSl-siRNA)。在最終載體的Clal位點(diǎn)插入最后的390bp間隔物 片段以從CMV啟動(dòng)子開始隔開siRNA的終止序列。通過DM測(cè)序來(lái)證 實(shí)所有的載體(Lone Star Labs， Houston, TX， USA)。通過將三個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中來(lái)產(chǎn)生重組假型慢病毒載 體。HIV衍生的包裝構(gòu)建體pCMVAR8.9編碼HIV-l gag和pol前體， 以及調(diào)節(jié)蛋白tat和rev。從質(zhì)粒pMD. G表達(dá)水泡性口炎病毒的糖蛋 白G (VSV-G)。用pCMVAR8.9、 pMD， G和慢病毒pTRIP s iRNA轉(zhuǎn)移載 體通過瞬時(shí)磷酸鈣共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生假型慢病毒。轉(zhuǎn)染后60至 72小時(shí)，通過在4匸50， OOOxg超離心2小時(shí)來(lái)濃縮上清液。將病毒 沉淀物重懸浮于RPMI中并在-8(TC冷凍用于將來(lái)的研究。通過用連續(xù) 稀釋的濃縮病毒和8 iu g/ml聚凝胺溫育293T細(xì)胞6小時(shí)來(lái)測(cè)定病毒滴 度，接著在72-96小時(shí)后熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析來(lái)測(cè)定eYFP-陽(yáng)性細(xì)胞。如下計(jì)算載體滴度滴度-Fx2xC。/VxD (其中D是病毒 稀釋倍數(shù)，V是接種體積，F(xiàn)是eYFP-陽(yáng)性293T細(xì)胞的頻率，C。是接 種時(shí)的耙細(xì)胞數(shù)量)。
實(shí)施例2:用GenePorter用S0CS1 s iRNA對(duì)小鼠BM-DC進(jìn)4亍轉(zhuǎn)染 和S0CS1 mRNA下調(diào)
為了研究對(duì)DC的抗原呈遞的S0CS1調(diào)節(jié)，如下首先鑒定特異性下 調(diào)S0CS1的小干擾RNA ( siRNA)。
在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4存在下，通 過GenePorter將合成的s iRNA ol igo雙鏈體有效地轉(zhuǎn)染至離體的小鼠 骨髓細(xì)胞來(lái)源的DC中，具有83%的轉(zhuǎn)染效率。簡(jiǎn)而言之，使用 GenePorter 用 21 個(gè)堿基對(duì) siRNA 寡核苷酸 (5 ， -CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-3， ； SEQ ID NO: 3)轉(zhuǎn)染骨髓DC，按照制 造商的實(shí)驗(yàn)方案。將3)al的20liM寡核苷酸加入3pl GenePorter 試劑和94jli 1無(wú)血清RPMI 1640中并在25。C溫育30分鐘，此后將100 jLi 1 GenePorter/寡核苷酸混合物加入每個(gè)孔的骨髓-DC中并在37。C溫 育4小時(shí)。溫育后，將500 ji 1/孔補(bǔ)充20%FBS的RPMI 1640加入骨髓 DC中?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，在生理學(xué)上可接受載體環(huán)境中，可以 將合成的siRNA oligo傳送至細(xì)胞?？山邮茌d體的實(shí)例是脂質(zhì)體。
圖1A證明了用表達(dá)S0CS1-siRNA的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中S0CS1得到了下調(diào)。簡(jiǎn)而言之，j吏用GenePorter以10:1的比例用表達(dá)小鼠 SOCSl-siRNA或無(wú)關(guān)GFP-siRNA的pSUPER ( pSUP )載體和FLAG-標(biāo)記 的mS0CSl表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后，接受蛋白質(zhì)印跡。 將S0CS1條帶的強(qiáng)度相對(duì)于p -肌動(dòng)蛋白條帶標(biāo)準(zhǔn)化，顯示了相對(duì)強(qiáng)度 (比例)。將S0CSl-siRNA3 ( -CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-; SEQ ID NO: 3)，稱為SOCSl-siRNA，用于隨后的研究中。
如通過定量RT-PCR測(cè)試證實(shí)的，與不能下調(diào)S0CS1的SOCSl siRNA 突變體轉(zhuǎn)染的DC中的水平相比較，用SOCSl siRM轉(zhuǎn)染的總DC群中 的SOCSl mRNA水平特異性地降低約60% (圖IB)。此外，觀察到在骨 髓DC體外培養(yǎng)過程中和成熟后SOCSl表達(dá)較高。
還觀察到用SOCSl siRNA轉(zhuǎn)染的DC對(duì)LPS或IFN-y的應(yīng)答比使 用siRNA突變體的DC強(qiáng)，如通過刺激時(shí)促炎癥細(xì)胞因子如IL-6和TNF-oc增加的分泌(圖2)，和通過STAT1、 I-kB和JNK增加的磷酸化所 示的。圖IB描述了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一中siRNA oligo或模擬轉(zhuǎn)染的 DC應(yīng)答LPS (lOOng/ml)或IFN-y (10ng/ml) 24小時(shí)而分泌的細(xì)胞 因子水平。siRNA突變體(5' -ACTATCTAAGTTACTACCCCTT-3' ; SEQ ID NO: 10 )在SOCSl siRNA3序列中含有四個(gè)突變。
這些數(shù)據(jù)與報(bào)道的SOCSl參與調(diào)節(jié)JAK/STAT途徑和TLR/NF-kB 途徑(Hanada等，2003， Immunity 19:437-450; Chong等，2003， Immunity 18:475-487 )相一致。在IFN-y和LPS刺激之前或之后， 用SOCSl siRNA轉(zhuǎn)染的DC顯示出比siRM-DC突變體略微更成熟的表 型。兩種轉(zhuǎn)染的DC都比模擬轉(zhuǎn)染的DC更成熟，這反映出siRNA非特 異性激活I(lǐng)FN基因的效果。
實(shí)施例3:用病毒載體轉(zhuǎn)染鼠BM-DC
為了評(píng)估SOCSl是否負(fù)向調(diào)節(jié)體內(nèi)的DC抗原呈遞，將SOCSl siRNA 或?qū)φ站G色熒光蛋白(GFP) siRM克隆至慢病毒載體(LV)中，其能 夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)DC(Rubinson等，2003，Nat. Genet. 33: 401-406; Schroers 等，2004， Methods Mol. Biol. 246:451-459 )，使得可以更可靠地評(píng)估S0CS1沉默的效果。根據(jù)本文別處所迷的方法產(chǎn)生了兩個(gè)構(gòu)建體， LV-SOCSl-siRNA和LV-GFP-siRNA，兩者都含有黃色熒光蛋白(YFP ) 標(biāo)記(圖3)。用LV-SOCSl-siRNA或LV-GFP-siRM載體轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓來(lái) 源的DC (>80%CDllc+)通常產(chǎn)生58-63% YFP陽(yáng)性的培養(yǎng)細(xì)胞。與之前 對(duì)siRNA oligo轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC的觀察相一致，觀察到與LV-GFP-s匿A-DC 相比較，LV-SOCSl-siRNA-DC在刺激時(shí)總轉(zhuǎn)導(dǎo)DC群中SOCSl mRNA水 平較低且促炎癥細(xì)胞因子的分泌增強(qiáng)。為了測(cè)定轉(zhuǎn)導(dǎo)DC中SOCSlmRNA 的含量，使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)來(lái)分離YFP+轉(zhuǎn)導(dǎo)DC，然后通 過實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)測(cè)定SOCSl mRNA的相對(duì)表達(dá)。觀察到與模擬轉(zhuǎn)導(dǎo) DC中的含量相比較，YFP+ LV-SOCSl-siRNA-DC群中的SOCSl mRNA含 量低約90%。用LV-SOCSl-siRNA和LV-GFP-siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC,用或不 用LPS刺激，顯示出CD86和CD40表達(dá)的水平相當(dāng)。不希望受到任何 特定理論的束縛，認(rèn)為觀察到的LV-GFP-siRM-DC形成比模擬DC含 量高的CD86和CD40很可能是由于s iRNA的非特異性激活和慢病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)的效應(yīng)而引起的。
實(shí)施例4:通過鼠SOCSl siRNADC誘導(dǎo)的OVA-特異性CTL和抗腫 瘤活性
進(jìn)行下一系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試對(duì)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL )的DC刺激是否受到SOCSl的調(diào)節(jié)。用卵清蛋白-I肽(SI藩EKL; SEQ ID NO: 11)脈沖并用卵清蛋白-特異性TCR T細(xì)胞(OT-I)共培 養(yǎng)沒有進(jìn)一步刺激至成熟的未成熟SOCSl-siRM-DC或siRNA突變DC 時(shí)，SOCSl-siRM-DC共培養(yǎng)物中的OT-I細(xì)胞增殖地比siRNA-DC突變 體共培養(yǎng)物中的多(圖4A)。與這些數(shù)據(jù)相一致，SOCSl-siRNA-DC 共培養(yǎng)物中分泌的促炎癥細(xì)胞因子的水平較高(圖4B)。此外，用 SOCSl-siRM-DC共培養(yǎng)后這些細(xì)胞所示的CTL測(cè)試顯示出更高活性的 對(duì)抗卵清蛋白+同源EG7細(xì)胞的細(xì)胞毒性，證明了 SOCSl促成對(duì)抗原特 異性T細(xì)胞的DC刺激的調(diào)節(jié)。
接著通過用卵清蛋白脈沖的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC在缺乏離體成熟情況下直接免疫小鼠來(lái)測(cè)試SOCSl-沉默的DC體內(nèi)引發(fā)抗原特異性應(yīng)答的能力。 四聚體染色表明與LV-GFP-siRNA-DC或模擬DC免疫的小鼠中各自只 有0. 64%和0. 43°/。相比較，用LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中總CD8+T 細(xì)胞的2.3%對(duì)于卵清蛋白-四聚體是陽(yáng)性的(圖5A)。因?yàn)?LV-SOCSl-siRNA-DC或LV-GFP siRNA-DC之間表面成熟標(biāo)記只存在較 小差異，這些數(shù)據(jù)表明增強(qiáng)的DC成熟不是引起LV-SOCSl-siRM-DC 功能性功效的唯一因素。使用干擾素-y (IFNy ) ELISPOT測(cè)試進(jìn)一 步評(píng)價(jià)免疫小鼠中CD8+T細(xì)胞的功能狀態(tài)。與分別給予未成熟模擬DC 或LV-GFP-siRNA-DC中1和18個(gè)斑點(diǎn)相比較，用不成熟 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠具有每2 x 105個(gè)CD8+T細(xì)胞68個(gè)IFN y+斑點(diǎn)(圖5B)。這些結(jié)果與CTL測(cè)試相一致，CTL測(cè)試顯示出來(lái)自 給予未成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的脾細(xì)胞對(duì)抗卵清蛋白+靶細(xì)胞更 有效的細(xì)胞毒性(圖5C)。用未成熟LV-S0CS1-siRNA-DC的免疫還誘 導(dǎo)了可觀察到的有效抗原特異性CD4+T-輔助細(xì)胞應(yīng)答。因此，S0CS1 沉默使得未成熟抗原呈遞DC獲得能夠引發(fā)體內(nèi)抗原特異性CD8+CTL應(yīng) 答的免疫原性狀態(tài)。不希望受到任何特定理論的束縛，認(rèn)為由于S0CS1 沉默的DC不需要之前的成熟就引發(fā)了獲得性免疫，因此S0CS1在維持 DC的致耐受性狀態(tài)中起調(diào)節(jié)作用。
S0CS1介導(dǎo)的對(duì)體內(nèi)成熟DC的調(diào)節(jié)
進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來(lái)研究之前沒有成熟的SOCSl沉默DC對(duì)CTL應(yīng)答的 引發(fā)是否是由DC應(yīng)答內(nèi)源環(huán)境刺激物而增強(qiáng)的成熟引起的。首先將卵 清蛋白脈沖的LV-SOCSl-siRNA-DC與LPS離體"小時(shí)成熟，然后在將 它們給予小鼠之前洗滌三次。LPS-成熟的LV-SOCSl-siRNA-DC顯示出 比得上成熟LV-GFP-siRNA-DC的成熟表型，兩種DC引發(fā)的CTL比不存 在體外成熟的DC更有效。然而，成熟的LV-S0CS1-siRM-DC在誘導(dǎo)抗 原特異性CTL中仍然明顯優(yōu)于成熟的LV-GFP-siRNA-DC,如通過卵清 蛋白四聚體染色所證明的(圖5A) 。 IFN-y ELISPOT測(cè)試也顯示出 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中增強(qiáng)的卯清蛋白特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(圖5B)，表明S0CS1沉默允許成熟DC對(duì)內(nèi)源環(huán)境刺激更高的應(yīng)答性，導(dǎo) 致增強(qiáng)的CTL應(yīng)答。
在進(jìn)一步的體內(nèi)測(cè)試中，將前一天已經(jīng)用未成熟 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠注射LPS—次。該刺激顯著(P<0. 01) 增強(qiáng)了未成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的CTL應(yīng)答(CD8+T細(xì)胞中 7. 87%卵清蛋白-四聚體+)，但是在未成熟DC-GFP-siRNA小鼠中的有 效性較低(CD8+T細(xì)胞中0. 64%卵清蛋白-四聚體+)(圖6A)。通過IFN-Y ELISPOT測(cè)試證實(shí)了未成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中體內(nèi)LPS刺 激后增強(qiáng)的卵清蛋白特異性CTL應(yīng)答(圖6B)。
為了測(cè)試成熟DC應(yīng)答環(huán)境刺激物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是否在T細(xì)胞致敏中 起作用，將前一天已經(jīng)用離體成熟LV-S0CS1-s iRM-DC免疫的小鼠注 射LPS —次或重復(fù)注射。LPS注射顯著(P<0. 01)增強(qiáng)了成熟 LV-SOCSl-siRM-DC小鼠中的CTL應(yīng)答，表明成熟DC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于 引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的重要性(圖6C和6D)。此外，LPS注射在增強(qiáng)用成 熟LV-SOCSl-s iRNA-DC免疫小鼠中的卵清蛋白特異性CTL應(yīng)答中更有 效。
為了直接檢測(cè)DC-S0CS1-siRNA對(duì)重復(fù)LPS刺激的反應(yīng)性，測(cè)試了 SOCSl-siRM-DC和GFP-siRNA-DC在體外產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受性的能力。 SOCSl-siRM-DC,但不是GFP-siRM-DC，通過產(chǎn)生高水平的促炎癥細(xì) 胞因子仍然強(qiáng)烈應(yīng)答重復(fù)的LPS刺激，表明SOCSl-沉默的DC持續(xù)應(yīng) 答刺激物。此外，通過S0CS1沉默降低了 DC對(duì)內(nèi)源刺激物如作為天然 危險(xiǎn)分子的熱激蛋白(HSP)的應(yīng)答性閾值。
合起來(lái)看，這些數(shù)據(jù)表明了 DC中S0CS1的沉默很可能降低了 DC 應(yīng)答性的閾值，并允許未成熟和成熟的抗原呈遞DC持續(xù)應(yīng)答內(nèi)源刺激 物，導(dǎo)致增強(qiáng)的抗原特異性CTL應(yīng)答。這種機(jī)制強(qiáng)調(diào)了 S0CS1控制成 熟DC抗原呈遞程度且因此控制獲得性免疫的大小的關(guān)鍵作用。
通過體內(nèi)刺激增強(qiáng)SOCSl-沉默DC免疫
為了研究使用細(xì)胞因子或Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑的體內(nèi)刺激
77是否可以進(jìn)一步地增強(qiáng)S0CS1-沉默DC的功效，給已經(jīng)用OVA-脈沖的 DC-LV-SOCSl-siRM免疫的小鼠i. p.注射LPS (30yg/小鼠)、CpG (60pg/小鼠)、poly I: C (50pg/小鼠)、抗CD40 ( 100 pg/小鼠)
或IFN-g (ljig/小鼠)， 一天一次，連續(xù)三天。觀察到這些刺激物優(yōu) 先增強(qiáng)了由DC-LV-S0CS1-siRNA小鼠誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答(圖6E )。這些 結(jié)果表明除了 LPS以外的許多刺激物可以進(jìn)一步增強(qiáng)S0CS1沉默DC 免疫的功效。
通過DC中的S0CS1沉默增強(qiáng)了抗腫瘤免疫
，見察至lj的S0CS1在DC抗/^、呈遞中的調(diào)節(jié)作月 的DC是否可能誘導(dǎo)更有效的抗原特異性抗腫瘤免疫從而導(dǎo)致對(duì)預(yù)先 建立的腫瘤生長(zhǎng)的控制的研究。用缺乏離體成熟的卵清蛋白脈沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC的免疫完全阻斷了所有測(cè)試小鼠中預(yù)先建立的卵 清蛋白+EG7腫瘤的生長(zhǎng)，與給予缺乏離體成熟的卵清蛋白脈沖的 LV-GFP-siRNA-DC或才莫擬DC的小鼠中胂瘤生長(zhǎng)的中度降低形成對(duì)比 (圖7A)。體內(nèi)抗體阻斷實(shí)驗(yàn)證明了抗CD8抗體阻斷(而不是抗CD4 ) 消除了由卵清蛋白脈沖的LV-SOCSl-siRNA-DC誘導(dǎo)的抗腫瘤活性(圖 7B)，表明CD8+CTL在抗胂瘤應(yīng)答中的關(guān)鍵作用。
為了測(cè)試S0CS1 siRNAoligo雙鏈體轉(zhuǎn)染的DC是否具有增強(qiáng)的抗 腫瘤活性。用SOCSl siRNAoligo雙鏈體或?qū)φ誳ligo雙鏈體轉(zhuǎn)染DC。 然后用已經(jīng)用OVA或TC-1腫瘤裂解物脈沖的轉(zhuǎn)染DC免疫小鼠組。用 脈沖的DC免疫小鼠后，用LPS ( 30jLig/小鼠)體內(nèi)刺激小鼠三次。DC 免疫后兩周，用0VA+EG7腫瘤或TC-1腫瘤攻擊經(jīng)免疫的小鼠。在EG7 和TC-1兩個(gè)腫瘤模型中都觀察到增強(qiáng)的抗腫瘤活性(圖7C和7D)。 此外，IFNy ELISPOT測(cè)試顯示出用TC-1腫瘤裂解物脈沖的S0CS1 siRNA oligo-DC免疫的小鼠中增強(qiáng)的腫瘤特異性CTL應(yīng)答(圖7E)。
進(jìn)一步測(cè)試了 S0CS1沉默的DC是否可增強(qiáng)對(duì)抗自身腫瘤相關(guān)抗原 的免疫應(yīng)答。為了這些實(shí)驗(yàn)，使用了在弱免疫原性B16黑素瘤細(xì)胞中 天然表達(dá)的鼠黑素細(xì)胞分化抗原酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRP) 2。將C57BL/6小鼠接種B16腫瘤細(xì)胞并在三天后用TRP2肽脈沖的用LPS體 外刺激的成熟LV-S0CS1-siRNA-DC或LV-GFP-siRNA-DC處理一次。成 熟LV-SOCSl-siRNA-DC有效地阻斷了預(yù)先建立的B16腫瘤的生長(zhǎng)，而 成熟LV-GFP-si MA-DC不具有任何抑制效果(圖8A )。增強(qiáng)的抗腫瘤 活性與LV-SOCSl-siRM-DC小鼠中有效的TRP2-特異性CTL應(yīng)答相關(guān)， 如通過ifn y elispot和ctl測(cè)試所檢測(cè)的(圖8B和8C)。只在給 予成熟LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中檢測(cè)到有活性的NK活性。與使用卵 清蛋白+EG7肺瘤的結(jié)果相比，用未成熟的TRP2脈沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC的免疫對(duì)B16肺瘤未能產(chǎn)生顯著的(P>0. 05)抑 制效果，表明產(chǎn)生有效的抗腫瘤活性需要DC的完全成熟和成熟后的連 續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。始終觀察到GFP siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)對(duì)抗外源抗原(卵清蛋白) 的CTL應(yīng)答的非特異性刺激效果。然而，非特異性刺激效果不足以增 強(qiáng)對(duì)抗自身抗原(TRP2)的CTL應(yīng)答。
檢測(cè)了用LV-S0CS1-siRNA-DC免疫誘導(dǎo)的可能的不利自身免疫病 理。觀察到用TRP2脈沖的SOCSl沉默DC免疫的小鼠的脫色素(白癜 風(fēng))。然而，在200多只用卵清蛋白或TRP2脈沖的LV-SOCSl-siRNA-DC 免疫的小鼠中在免疫后長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月沒有觀察到其他明顯毒性。免疫小 鼠所有主要器官和組織的組織學(xué)分析表明沒有病理性炎癥，且免疫組 織化學(xué)染色沒有顯示出腎臟中的IgG或IgM沉積。LV-SOCSl-siRNA-DC 和模擬DC小鼠中的IgG ( IgGl、 IgG2a)和抗-dsDNA的水平相當(dāng)。這 些數(shù)據(jù)表明LV-SOCSl-siRNA-DC免疫不在小鼠中引起病理性炎癥。不 希望受到任何特定理論的束縛，認(rèn)為SOCSl-沉默的DC具有強(qiáng)烈增強(qiáng) 的誘導(dǎo)能夠阻斷預(yù)先建立的弱免疫原性腫瘤生長(zhǎng)的有效的抗原特異性 抗腫瘤免疫的能力。
SOCSl的沉默增強(qiáng)了 DC的抗原呈遞和抗原特異性抗腫瘤免疫 在此呈現(xiàn)的結(jié)果證明了 DC的刺激能力和獲得性免疫的大小受到 DC中SOCSl的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)。沉默抗原呈遞DC中的SOCSl強(qiáng)烈增強(qiáng)了 抗原特異性抗腫瘤免疫。SOCSl代表用于定性和定量控制DC的抗原呈遞和獲得性免疫大小的抑制機(jī)制。
本發(fā)明的公開內(nèi)容證明了 S0CS1在調(diào)節(jié)成熟DC的抗原呈遞程度中 的關(guān)鍵作用，因此證明了允許DC控制獲得性免疫的大小和持續(xù)時(shí)間的 調(diào)節(jié)機(jī)制。在此具體說(shuō)明了 SOCS1在維持DC致耐受性狀態(tài)中的重要性， 因?yàn)榕c野生型DC相比，S0CS1沉默的DC被賦予了刺激性抗原呈遞能 力來(lái)引發(fā)體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答而不需要體外成熟。不希望受到任何特定理 論的束縛，認(rèn)為DC中的S0CS1控制獲得性免疫大小的確切機(jī)制涉及成 熟DC在以下方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和輸出的調(diào)節(jié)抗原肽呈遞、共刺激/共 抑制和應(yīng)答細(xì)胞因子、微生物產(chǎn)物以及還有可能的細(xì)胞-細(xì)胞接觸的刺 激的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
基于有限數(shù)量的研究，通常認(rèn)為成熟DC生命短。然而，最近使用 可靠遺傳學(xué)方法的研究證明了成熟抗原呈遞DC的生命周期比之前估 算的長(zhǎng)得多，在體內(nèi)持續(xù)2周，支持調(diào)節(jié)成熟DC抗原呈遞程度的必要 性和重要性。
本發(fā)明涉及沉默DC中的S0CS1作為一般方法通過使DC中的關(guān)鍵 制動(dòng)失效來(lái)增強(qiáng)腫瘤疫苗功效的新原理。用S0CS1沉默的DC接種疫苗 強(qiáng)烈地增強(qiáng)了抗原特異性抗腫瘤免疫，因?yàn)镾0CS1沉默允許抗原呈遞 免疫原性DC在體內(nèi)持久地刺激抗原特異性T細(xì)胞。SOCSl-沉默的DC 通過增強(qiáng)DC成熟和產(chǎn)生抑制調(diào)節(jié)T-細(xì)胞抑制的促炎癥細(xì)胞因子如 IL-6而能夠關(guān)閉調(diào)節(jié)T細(xì)胞。
對(duì)T細(xì)胞上CTLA-4的阻斷有效地破壞了耐受性并增強(qiáng)了腫瘤疫苗 功效，但是引起了患者嚴(yán)重的非特異性自身免疫炎癥。通過在抗原呈 遞水平耙向DC中的S0CS1，可以獲得更為抗原特異性的抗腫瘤應(yīng)答。 首先，用大量裝載腫瘤相關(guān)抗原的S0CS1沉默DC進(jìn)行免疫將誘導(dǎo)抗原 特異性免疫，與靶向效應(yīng)CTL上的CTLA-4形成對(duì)比，后者是一種不可 避免地激活對(duì)抗重要正常組織的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的方法。其次，使 用具有殘余S0CS1水平的部分SOCSl-沉默的DC可能不會(huì)引起嚴(yán)重的 自身免疫炎癥，因?yàn)殡s合SOCSl+小鼠沒有顯示出或只有輕微的自身免 疫炎癥跡象。此外，在S0CS1+小鼠中看到的嚴(yán)重自身免疫炎癥需要S0CS1的完全缺失，不僅在DC中而且在其他免疫細(xì)胞世系如T和NK 細(xì)胞中。在此呈現(xiàn)的結(jié)果提供了一種見識(shí)，這種見識(shí)不僅用于理解定 性和定量調(diào)節(jié)抗原呈遞和獲得性免疫，而且用于研發(fā)通過增強(qiáng)DC的刺 激潛能對(duì)抗癌癥和感染性疾病的有效疫苗。
實(shí)施例5:通過小鼠S0CS1 siRNA D(H秀導(dǎo)的TRP2-特異性CTL和 抗胂瘤活性
本發(fā)明的7>開內(nèi)容證明了成熟DC中表達(dá)由S0CS1 siRNA降低的 S0CS1表達(dá)的慢病毒載體可以增強(qiáng)自身抗原特異性CTL應(yīng)答的大小。 將小鼠黑素細(xì)胞分化抗原-酪氨酸酶相關(guān)蛋白2 (TRP2)用作模型自身 抗原用于該研究中。使用TRP2是因?yàn)樗谡：谒丶?xì)胞和弱免疫原性 B16黑素瘤細(xì)胞中都天然表達(dá)，且在TRP2中已經(jīng)鑒定出多個(gè)MHC I類 表位(van Elsas等，2001， J. Exp. Med, 194: 481-9 )。
現(xiàn)在描述該實(shí)施例中所示實(shí)驗(yàn)中所用的材料和方法。
小鼠/動(dòng)物模型
從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Ben Harbor, Maine, USA)購(gòu)買四至六周齡 的雌性C57BL/6、 CD4 K0、 CD8 K0或p35 (IL-12) K0小鼠，并根據(jù) 建立的指導(dǎo)飼養(yǎng)于Baylor College of Medicine (貝勒醫(yī)學(xué)院) (Houston, TX， USA)的無(wú)病原體小鼠設(shè)施中。
叢
通過Genemed Synthesis Inc. ( South San Francisco， CA， USA) 合成H2-Kb限制性TRP2a (VYDFFVWL; SEQ ID NO: 15 )和TRP2b (SVYDFFWk SEQ ID NO: 16) (vanElsas等，2001， J. Exp. Med. 194: 481-9 ),和對(duì)照H2-Kb-限制性0VA-I ( SII翻KL; SEQ ID NO: 11 )， 并通過HPLC純化至>95%的純度。在最終稀釋于無(wú)內(nèi)毒素PBS (Sigma, St. Louis, M0)之前將所有肽溶解于DMS0中。
81用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)BM來(lái)源的DC
如本文別處所述的產(chǎn)生重組慢病毒載體(LV-SOCSl-siRNA和 LV-GFP-siRNA)，滴定并用于轉(zhuǎn)導(dǎo)DC。
細(xì)胞因子ELISA和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)測(cè)試 在所示的時(shí)間點(diǎn)并使用所示的刺激物根據(jù)制造商的說(shuō)明使用DC 培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Pari, NJ)來(lái)定量各種促炎癥細(xì)胞因子的含量。如Huang等，2003， Cancer Res. 63: 7321-9中所述的進(jìn)行分離的CD4+或CD8+T細(xì)胞的ELISPOT測(cè)試。 H2-K7TRP2 I類肽用于小鼠CD8+T細(xì)胞刺激。還將來(lái)自O(shè)VA的無(wú)關(guān)肽 用作陰性對(duì)照。使用MACS CDS (Ly-2)微珠(Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA )從脾細(xì)胞分離CD8+ T細(xì)胞。
流式細(xì)胞分析
用含有0. 1% NaNs和2°/。FCS的PBS中的FITC或PE mAb將細(xì)胞染 色。從BD Pharmingen( Franklin Lakes，NJ )或eBioscince( San Diego， CA)購(gòu)買小鼠CD8 (53—6.7) 、 CDllc (HL3) 、 CD40 ( 3/23 ) 、 CD80 (16-10A1) 、 CD86 (GL1) 、 OX40L (RM13札)或PDL1 (MIH5)特異 性抗體和相配的同種型對(duì)照。在FACSCalibur (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ， Franklin Lakes, NJ)流式細(xì)月包計(jì)上分4斤染色的 細(xì)胞。
四聚體染色
使用H2-KVTRP2-PE四聚體測(cè)試來(lái)檢測(cè)TRP2-特異性小鼠CD8+ T 細(xì)胞。在Baylor College of Medicine Tetramer Core Facility (貝 勒醫(yī)學(xué)院四聚體核心機(jī)構(gòu))(Houston, TX, USA)合成TRP2-四聚體。 用抗CD8oc-FITC/抗CD3-PerCP和H2-Kb/TRP2-PE將來(lái)自免疫小鼠的 脾細(xì)胞共染色。使用每106個(gè)細(xì)胞ly g抗CD8cc-Fitc和1:100稀釋度的TRP2-PE四聚體在4C將四聚體染色進(jìn)行l(wèi)h，根據(jù)制造商的說(shuō)明。 DC免疫和腫瘤小鼠研究
如本文別處所述的用MOI為5的SOCSl-siRNA或GFP-siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo) BM來(lái)源的DC (脂培養(yǎng)的第4-5天)。簡(jiǎn)而言之，用肽將DC脈沖20 小時(shí)，用PBS洗滌三次，用LPS (100ng/ml， Sigma, St. Louis, MO) 或TNFa ( 500ng/ml， R&D Systems, Minneapolis, MN)刺激24小時(shí)， 用PBS洗滌三次，然后通過后腳墊注射至C57BL/6、 CD8 KO、 CD4 KO 或p35KO小鼠中。在治療模型中，將B16腫瘤細(xì)胞(2.5xl05)皮下 注射(s.c.)至同系小鼠的右脅側(cè)來(lái)建立腫瘤模型。在腫瘤接種后的 第三天，將小鼠隨機(jī)分組并注射30p 1肽脈沖的(50ng/ml)、轉(zhuǎn)導(dǎo) 的DC ( 1. 5 x 106)或PBS對(duì)照。 一些小鼠中，在DC接種后的所示天數(shù) 將LPS ( 30pg/小鼠)或重組鼠IL-12蛋白(1 jug/小鼠，Peprotech， Rocky Hill, NJ )腹膜內(nèi)給藥(i. p.)。用卡尺每?jī)商鞙y(cè)量腫瘤體積 直至實(shí)驗(yàn)完成。
CTL測(cè)試
用標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)試來(lái)測(cè)定CD8+ CTL應(yīng)答，這測(cè)量了體外再次刺激 的脾細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力(Huang等，2003 ， Cancer Res. 63:7321-9 )。從2-3只免疫小鼠匯集的脾細(xì)胞在含有H2-Kb/TRP2肽 的RPMI 1640中體外再次刺激4-6天。用51Cr鉻酸鈉溶液標(biāo)記TRP2+ 耙B16細(xì)胞(H2-Kb)和對(duì)照EG. 7細(xì)胞(ATCC， Manassas, VA )，在 37'C震蕩90分鐘。將不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞與恒定數(shù)量的靶細(xì)胞(5x 107孑L)在96孔U-底平板中(200|u 1/孔)在37。C溫育四小時(shí)。收集 并分析重復(fù)三份培養(yǎng)物的上清液。按照(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/ (最 大釋放-自發(fā)釋放)x ioo來(lái)計(jì)算裂解百分比。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
為了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用了 Sudent， s t檢驗(yàn)，并取95%置信限是顯著的，定義為p<0. 05。通常以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)來(lái)呈現(xiàn)結(jié)果。 現(xiàn)在描述該實(shí)施例中所示實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
成熟DC中通過S0CS1限制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制了自身抗原特異性CTL 應(yīng)答的大小和耐受性
用LPS體外成熟的TRP2肽脈沖的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC免疫C57BL/6小鼠。 然后在LPS存在或不存在下體內(nèi)刺激免疫小鼠一次或三次，并使用四 聚體分析來(lái)測(cè)量TRP2-特異性CTL應(yīng)答。選擇LPS來(lái)用于體內(nèi)刺激是 因?yàn)樗T導(dǎo)許多促炎癥細(xì)胞因子，其中許多受到S0CS1的調(diào)節(jié)，以及 證明的S0CS1在直接調(diào)節(jié)NF-kB (p65)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用(Ryo等， 2003， Mol. Cell. 12:1413-26)。在體內(nèi)LPS刺激不存在下，與 GFP-siRNA DC免疫小鼠中僅3， 1%相比較，SOCSl-siRNA DC免疫的小 鼠中總CD8+ T細(xì)胞的5. 1%對(duì)于TRP2-四聚體是陽(yáng)性(圖9A )。體內(nèi) LPS刺激1次或3次，顯著提高了 S0CS1-s iRNA DC免疫小鼠中的TRP2-四聚體陽(yáng)性CD8+ T細(xì)胞的百分比(各自為9. 7°/。和19.4%)，但在 GFP-siRNA DC免疫小鼠中基本上是未改變的(各自為3. 0%和4.0%) (圖9A)。相一致地，CTL測(cè)試(圖9C)和干擾素-y ( IFN-y )ELISPOT 顯示出相似的結(jié)果。此外，在免疫后3個(gè)月時(shí)共注射LPS的TRP2肽脈 沖的SCSl-siRNA DC免疫的大部分小鼠中白癜風(fēng)(皮毛變淺、脫色素 和/或掉毛)是明顯的(圖9B)，表明對(duì)通常在宿主黑素細(xì)胞中表達(dá) 的TRP2的自身耐受性的破壞。相反，在任何一只GFP-siRNA DC免疫 的小鼠中都沒有觀察到白癜風(fēng)，即使重復(fù)體內(nèi)LPS給藥，表明了 DC 中S0CS1用于維持對(duì)自身抗原的耐受性的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果證明了 成熟抗原呈遞DC中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制了 CTL應(yīng)答的大小和自身耐受性， 且成熟DC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到S0CS1的嚴(yán)格限制。
S0CS1限制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制了 DC破壞自身耐受性和誘導(dǎo)有效抗腫 瘤免疫的能力
腫瘤疫苗接種的主要目的是通過誘導(dǎo)強(qiáng)烈的對(duì)抗優(yōu)先在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的自身抗原的獲得性免疫應(yīng)答來(lái)破壞自身耐受性。觀察到的
S0CS1在調(diào)節(jié)自身抗原特異性CTL應(yīng)答的大小和自身耐受性中的作用 促使了對(duì)成熟DC誘導(dǎo)有效抗胂瘤免疫的能力是否受到S0CS1表達(dá)控制 的研究。為了測(cè)試這一點(diǎn)，用B16腫瘤細(xì)胞皮下接種C57BL/6小鼠并 在三天后用LPS體外成熟的TRP2-脈沖的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC免疫一次。圖10A 顯示了與GFP-siRNA DC免疫相比較，單獨(dú)S0CS1-siRNA-DC免疫能夠 顯著抑制B16腫瘤的生長(zhǎng)(P<0. 01)。然而，50% SOCSl-siRNA DC免 疫的小鼠最終在腫瘤接種后30天死于〉l， 500mn^的腫瘤負(fù)荷。為了測(cè) 定在SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中通過增強(qiáng)促炎癥信號(hào)是否可以提高小 鼠存活，在DC免疫后一天用LPS體內(nèi)刺激小鼠一次。將LPS刺激添加 至免疫實(shí)驗(yàn)方案中顯著阻斷了 SOCSl-siRMDC免疫小鼠中的B16腫瘤 生長(zhǎng)(圖10B)。這與GFP-siRNADC和模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC對(duì)照形成對(duì)比， 后兩者與非LPS刺激的小鼠相比較顯示出腫瘤負(fù)荷沒有降低(比較圖 IOA和IOB) 。 SOCSl-siRNA DC免疫和LPS攻擊的結(jié)合還將小鼠存活 顯著提高至100%>60天(圖10C) 。 SOCSl-siRNA DC免疫的小鼠中增 強(qiáng)的抗腫瘤活性與有效的TRP2-特異性CTL活性相關(guān)(圖10D)。通過 用SOCSl-siRNA DC免疫CD4和CD8敲除(K0 )小鼠，進(jìn)一步證明了抗 胂瘤活性需要CD8+和CD4+細(xì)胞，盡管在免疫的CD4 KO小鼠中觀察到 弱的抗胂瘤活性(圖10B-10D)?？偟恼f(shuō)來(lái)，這些結(jié)果表明成熟DC中 SOCSl限制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制了它們破壞耐受性和誘導(dǎo)有效抗腫瘤免疫 的能力，且通常受到S0CS1調(diào)節(jié)的其它促炎癥信號(hào)，可以進(jìn)一步增強(qiáng) 誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答控制預(yù)先建立的腫瘤負(fù)荷的能力。
S0CS1限制的信號(hào)3在控制自身耐受性和抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵作
S0CS1很可能通過調(diào)節(jié)抗原肽/MHC呈遞、共刺激和/或細(xì)胞因子信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分泌影響了成熟DC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和輸出。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來(lái)研究 對(duì)于自身抗原特異性CTL應(yīng)答和抗腫瘤免疫的控制，這三種信號(hào)中的 哪一種主要受到了 S0CS1的調(diào)節(jié)。首先測(cè)試了 S0CS1沉默是否影響了共刺激分子的表達(dá)(信號(hào)2)。 通過流式細(xì)胞測(cè)試，持續(xù)地觀察到在LPS誘導(dǎo)的成熟之前和之后，與 GFP-siRM DC上的那些相比較，SOCSl-siRNA DC上存在檢測(cè)不到的或 只是略微增強(qiáng)的共刺激/抑制分子(B7. 1、 B7. 2、 OX40L、 CD40或PDL1 ) 的表面水平(圖11A)。還檢測(cè)到SOCSl-siRNA DC和GFP-siRNA DC 上相當(dāng)?shù)腗HC-I和II分子水平。
鑒于CD8+T細(xì)胞在誘導(dǎo)抗肺瘤免疫力中的重要性，進(jìn)一步研究了 MHC-I限制性肽免疫原性(TCR親和性)是否在S0CS1限制的體內(nèi)抗原 呈遞中起著重要作用。因?yàn)橹拌b定了 TRP2 CTL肽的高親和性形式
(TRP2b)和低親和性形式(TRP2a) (vanElsas等，2001， J. Exp. Med. 194:481-9 )，將兩種TRP2肽都用來(lái)測(cè)試信號(hào)1的強(qiáng)度是否可以 影響轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力。圖11B顯示了裝載低
(TRP2a)或高親和性(TRP2b)肽的成熟GFP-s iRNA DC使用體內(nèi)LPS 刺激不能誘導(dǎo)B16腫瘤消退，盡管裝載TRP2b肽的GFP-siRNA DC顯示 出微弱的抗肺瘤活性(統(tǒng)計(jì)學(xué)不顯著)。相反，裝載低或高親和性TRP2 肽的SOCSl-siRMDC組有效阻斷了腫瘤生長(zhǎng)。還使用IFNY ELISPOT 測(cè)試研究了免疫小鼠中的TRP2-特異性CTL活性。圖IIC顯示了裝載 高親和性肽的GFP-s iRM DC誘導(dǎo)了比裝載低親和性肽的GFP-s iRNA DC 更強(qiáng)的IFNy應(yīng)答。然而，裝栽低或高親和性肽的兩組SOCSl-siRNA DC 都誘導(dǎo)了比裝載高親和性肽的GFP-siRNA DC強(qiáng)得多的IFNy應(yīng)答
(P<0. 01)，這與觀察到的抗腫瘤活性一致(圖11B)。此外，裝載 低或高親和性肽的SOCSl-siRNA DC誘導(dǎo)了相似的IFN Y應(yīng)答(圖 11C)。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了在成熟存在或不存在下，S0CS1沉默對(duì)DC 上的共刺激/抑制分子(信號(hào)2)以及MHC-I和II分子的表達(dá)不具有 顯著影響；裝載高或低親和性TRP2肽(信號(hào)l)的成熟DC在誘導(dǎo)有 效IFNy應(yīng)答和抗腫瘤免疫中是無(wú)效的，除非S0CS1是被沉默的。
實(shí)施例6:通過小鼠S0CS1 siRM DC誘導(dǎo)的CTL體內(nèi)IL-12提高和抗腫瘤活性
盡管已經(jīng)充分研究了通過樹突細(xì)胞(DC)啟動(dòng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (CTL)應(yīng)答，但對(duì)于調(diào)節(jié)自身耐受性的維持或破壞的機(jī)制仍然不太明 確。在這個(gè)實(shí)施例中，證明了其中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS) 1已經(jīng)沉默的成熟DC,而不是成熟的野生型DC,有效地破壞了自身耐 受性，尤其是用微生物產(chǎn)物或IL-12體內(nèi)刺激時(shí)。在此公開的實(shí)驗(yàn)證 明了通過抗原呈遞DC提供的SOCSl-限制的信號(hào)3 (IL-12),而不是 抗原親和性(信號(hào)1)和共刺激分子的水平(信號(hào)2 )，關(guān)鍵性地控制 了自身耐受性。此外，本發(fā)明的公開內(nèi)容證明了 SOCSl沉默的DC誘導(dǎo) 了有效的對(duì)抗自身抗原的免疫應(yīng)答，阻斷了預(yù)先建立的B16腫瘤的生 長(zhǎng)。此外，人SOCSl沉默的DC具有全面激活具有裂解效應(yīng)功能的自身 抗原特異性人CTL的優(yōu)異能力，意味著這種SOCSl沉默方法的翻譯潛 能。
SOCSl限制的信號(hào)3在控制自身抗原特異性CTL激活和耐受性中 的可能重要性促使了鑒定受成熟DC中SOCSl調(diào)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。最 初測(cè)試了幾種已知影響CTL激活的候選促炎癥細(xì)胞因子的重要性，使 用源自不同遺傳學(xué)純合KO小鼠的DC,用于結(jié)合SOCSl沉默的DC接種。 將來(lái)自IL-12 (p35—7—) KO小鼠的DC用于免疫時(shí)，觀察到裝載TRP2肽 的p35—〃SOCSl-siRNA DC不再抑制B16腫瘤的生長(zhǎng)(圖12A-12B), 表明SOCSl限制的和DC產(chǎn)生的IL-12對(duì)腫瘤消退的關(guān)鍵作用。為了進(jìn) 一步測(cè)定IL-12在SOCSl-限制的DC功能中的作用，評(píng)估了通過 p35—/_S0CS1-siRNA DC誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答。使用IFNy ELISPOT和CTL 測(cè)試，觀察到與野生型SOCSl-siRNADC相比較，p35+SOCSl-si醒DC 具有顯著降低的誘導(dǎo)TRP2特異性CTL應(yīng)答的能力(圖12C和12D)。 此外，LPS的體內(nèi)刺激未能增強(qiáng)由p35+SOCSl-siRNA DC誘導(dǎo)的CTL 應(yīng)答，如通過TRP2-四聚體分析所測(cè)量的(圖9A)。令人感興趣地， 與抗原呈遞DC產(chǎn)生的IL-12的基本作用相比，觀察到用野生型 SOCSl-siRNA DC免疫的IL-12 (p35+) KO小鼠也誘導(dǎo)了活性的抗腫 瘤免疫和CTL應(yīng)答，表明自身抗原特異性CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)不需要由常居的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12 (圖12A-12D)?？偟膩?lái)看，這些結(jié)果顯示 出由抗原呈遞DC產(chǎn)生的S0CS1限制的IL-12對(duì)于誘導(dǎo)有效的TRP2-特 異性CTL應(yīng)答和B16腫瘤根除是重要的。
S0CS1沉默的DC引起的持久和增強(qiáng)的IL-12和IL-12誘導(dǎo)的細(xì)胞 因子的產(chǎn)生vs.wtDC引起的短暫的和低的產(chǎn)生
DC應(yīng)答微生物產(chǎn)物如LPS和CD40連接而產(chǎn)生相當(dāng)大量的IL-12 (Schulz等，2000， Immunity 13: 453-62 ) 。 DC的IL-12產(chǎn)生緊緊 地限于誘導(dǎo)成熟后的短的時(shí)間段(8-16小時(shí))(Langenkamp等，2000， Nat. Immunol. 1: 311-6 )并受到SOCS1的調(diào)節(jié)(Eyles等,2002， J. Biol. Chem. 277: 43735-40 )。鑒于已識(shí)別的S0CS1限制的IL-12在 調(diào)節(jié)獲得性免疫中的重要作用，檢測(cè)了 S0CS1沉默對(duì)DC的IL-12產(chǎn) 生強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的效果，其可能與S0CS1-siRNADC破壞免疫耐受性 和誘導(dǎo)對(duì)TRP2的有效抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力密切相關(guān)。
圖13A顯示了與GFP-siRNA DC和才莫擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC相比較， SOCSl-siRM DC在72小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)應(yīng)答LPS和抗CD40 mAb的連續(xù) 刺激產(chǎn)生了顯著增加水平的IL-12 (p70)。然后通過用LPS/抗CD40 刺激24小時(shí)，然后將不含有LPS的新鮮培養(yǎng)基中的DC轉(zhuǎn)移至新的培 養(yǎng)平板中，測(cè)定了盡管除去了最初刺激物，S0CS1-siRM DC維持IL-l2 水平的能力。圖13B顯示了 GFP-siRM DC和模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC只在刺激 時(shí)短暫地產(chǎn)生了 IL-12，而S0CS1-siRMDC長(zhǎng)久地產(chǎn)生顯著較高水平 的IL-12,盡管除去了刺激物。不希望受到任何特定理論的束綽，除 去LPS/抗CD40后SOCSl-siRNA DC的延長(zhǎng)和增強(qiáng)的IL-12產(chǎn)生可能是 由于原始刺激物誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑延長(zhǎng)的激活和/或可能IL-12或 其他DC分泌的促炎癥細(xì)胞因子引起的自分泌/旁分泌刺激。這些結(jié)果 表明S0CS1沉默使得DC應(yīng)答刺激而產(chǎn)生持續(xù)且增加水平的IL-12,這 可能引起了 S0CS1沉默的DC破壞耐受性并根除預(yù)先建立的腫瘤的能 力。
由于S0CS1是介導(dǎo)IL-12和其他細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jak/Stat途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑(Kubo等，2003， Nat. Immunol. 4:1169-76; Alexander等，2004， A謹(jǐn).Rev. Immunol. 22: 503-29 )，進(jìn)行下一 系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試DC中的S0CS1沉默是否通過在它們自身和可能其他 鄰近DC之間產(chǎn)生細(xì)胞因子反饋回路而增強(qiáng)了細(xì)胞因子產(chǎn)生。為了測(cè)定 這一點(diǎn)，測(cè)量了 SOCSl-siRNA DC的肺瘤壞死因子(TNF) cc和IL-16 產(chǎn)生。測(cè)試了 (TNF) oc和IL-6，因?yàn)橐阎狪L-12刺激誘導(dǎo)這些細(xì)胞 因子(Trichieri等，2003， Nat. Rev. Immunol. 3:133—46 )。
圖13C顯示了 SOCSl-siRNA DC在除去最初的刺激物后長(zhǎng)久地產(chǎn)生 較高水平的TNFoc和IL-16,與GFP-siRNA DC和模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC相反， 后兩者只是短暫地產(chǎn)生低水平的TNFot和IL-6。為了進(jìn)一步測(cè)定IL-12 對(duì)于產(chǎn)生反饋回路的重要性，比較了 p35+S0CS1-siRNA DC和wt SOCSl-siRNA DC引起的TNF oc和IL-6產(chǎn)生。圖13D顯示了 p35+SOCS1-siRNA-DC不再能夠產(chǎn)生提高和延長(zhǎng)量的TNFoc和IL-6， 表明IL-12反饋是SOCSl-siRNA DC引起的TNFct和IL-16產(chǎn)生的關(guān)鍵 誘導(dǎo)因子。這些數(shù)據(jù)表明S0CS1沉默使DC中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)制動(dòng)失效， 因此使它們通過增強(qiáng)的反饋回路不僅連續(xù)應(yīng)答且產(chǎn)生IL-12,還有 IL-12誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子。在此公開的結(jié)果提供了可能的機(jī)制來(lái) 解釋裝載TRP2的SOCSl-siRNA DC誘導(dǎo)白癜風(fēng)和對(duì)B16腫瘤細(xì)胞的有 效抗胂瘤免疫的能力。
S0CS1限制的IL-12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于控制DC破壞自身耐受性的能力 的重要性
SOCSl-s iRM DC誘導(dǎo)對(duì)抗自身腫瘤相關(guān)抗原的有效CTL應(yīng)答的能 力暗示了 S0CS1沉默策略的治療應(yīng)用。由于臨床使用LPS作為患者體 內(nèi)刺激物的毒性太強(qiáng)，評(píng)估其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受S0CS1調(diào)節(jié)的IL-12在增強(qiáng) SOCSl-siRNA DC的功效中是否也是有效的。
將C57BL/6小鼠接種B16腫瘤細(xì)胞，三天后，用重組小鼠TNFot 體外成熟的TRP-2脈沖的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC免疫小鼠一次。DC免疫后，用 低劑量重組小鼠IL-12 ( 1 pg/小鼠)體內(nèi)刺激受體小鼠三次。圖14A
89顯示了有效地阻斷了 SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中B16腫瘤的生長(zhǎng)。相 比之下，與PBS對(duì)照相比較，體內(nèi)給予IL-12的GFP-siRNADC免疫對(duì) 腫瘤生長(zhǎng)具有很小的效果。SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中抗肺瘤活性與 增強(qiáng)的TRP2-特異性CTL活性相關(guān)，如通過IFNy ELISPOT測(cè)試所示 的(圖14B)。與早先的觀察(圖10A)相一致，與GFP-siRNA DC對(duì) 照相比較，用TRP2脈沖的、TNFoc成熟的SOCSl-siRNA DC免疫在體內(nèi) IL-12刺激不存在下也顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤活性。
這些結(jié)果表明體內(nèi)給予IL-12顯著增強(qiáng)了 SOCSl沉默DC的免疫刺 激能力，但沒有增強(qiáng)野生型DC的免疫刺激能力，很可能是由于IL-12 和IL-12誘導(dǎo)的細(xì)胞因子增強(qiáng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些結(jié)果進(jìn)一步暗示了抗 原呈遞DC中的SOCSl限制的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而不是細(xì)胞因子如 IL-12的全身濃度，對(duì)于誘導(dǎo)有效的抗自身腫瘤相關(guān)抗原的抗腫瘤免 疫是重要的。
免疫后長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月沒有觀察到共注射LPS或IL-12的TRP2-脈沖 的SOCSl-siRNA-DC小鼠中除了白瘕風(fēng)以外的明顯毒性。免疫小鼠的所 有主要器官和組織的組織學(xué)分析揭示沒有病理性炎癥。 SOCSl-siRNA-DC和模擬DC小鼠中的IgG和抗-dsDNA水平相當(dāng)。這些 數(shù)據(jù)表明TRP2-脈沖的SOCSl-siRNA DC免疫沒有引起小鼠的病理性炎 癥。
SOCSl限制的信號(hào)3的強(qiáng)度控制了 CTL激活、耐受性和抗腫瘤免
逸
在此公開的結(jié)果提供了對(duì)成熟DC調(diào)節(jié)CTL應(yīng)答的新見識(shí)，這對(duì)于 研發(fā)腫瘤疫苗應(yīng)當(dāng)具有深遠(yuǎn)的意義。已知成熟對(duì)于DC從未成熟致耐受 性狀態(tài)轉(zhuǎn)換至成熟免疫原性狀態(tài)是關(guān)鍵點(diǎn)(Banchereau等，1998， Nature 392:245-52 ; Stei畫n等，2003， A廳.Rev. Immunol. 21:685-711 )。認(rèn)為抗原呈遞DC和T細(xì)胞之間最初接觸(信號(hào)l和2) 的強(qiáng)度決定了 CTL應(yīng)答的大小和命運(yùn)，因?yàn)榛谟邢迶?shù)量的研究認(rèn)為 成熟DC的生命是短的(Porgador等，1998， Journal of ExperimentalMedicine 188: 1075-82; Ingulli等，1997， J. Exp. Med. 185: 2133-41; Ruedl等，2000, J. Immunol. 165:4910-6 )。然而，使用可靠遺傳 學(xué)方法的更近的研究證明了成熟抗原呈遞DC的生命周期比之前估計(jì) 的要長(zhǎng)得多，在體內(nèi)持續(xù)兩周(Garg等，2003， Nat. Immunol. 4:907-12 )，表明成熟DC與T細(xì)胞最初接合后可能的調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明的結(jié)果證明了成熟DC中受到SOCS1密切限制的促炎癥信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵性地控制了自身抗原特異性CTL應(yīng)答的大小。這表明了 CTL 應(yīng)答至少在兩個(gè)水平上受到DC的控制CTL應(yīng)答的啟動(dòng)需要DC成熟 和成熟DC與自身和CTL的進(jìn)行中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其大小受到 SOCS1表達(dá)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明的結(jié)果進(jìn)一步意味著DC和它們周圍環(huán)境的
互作用，這總地決定了自身耐受性的維持或破壞，因此決定了自身抗 原特異性CTL應(yīng)答的命運(yùn)。
在此公開的結(jié)果揭示了用于調(diào)節(jié)自身耐受性的維持或破壞的新機(jī) 制。發(fā)現(xiàn)由DC提供的SOCS1限制的信號(hào)3 (IL-12)，而不是肽親和 性和共刺激分子水平，關(guān)鍵性地控制了自身耐受性。細(xì)胞因子對(duì)于DC 介導(dǎo)的激活或過度激活T細(xì)胞的重要性在眾多自身免疫性疾病 (Banchereau等，2004， Immunity 20: 539-50 )和其他模型(Curtsinger 等，2003， J. Exp. Med. 197: 1141-51; Valenzuela等，2002， J. Immunl. 169:642-9 )的研究中暗示。
wt DC引起的細(xì)胞因子如IL-12產(chǎn)生是短暫的并在刺激時(shí)受到 SOCSl抑制，如在此和其他人的研究所證明的(Langenkamp等，2000, Nat. Immunol. 1:311-6)。觀察到與wt DC相反，SOCS1沉默的DC 應(yīng)答最初的刺激物可以持續(xù)產(chǎn)生顯著提高的IL-12和IL-12誘導(dǎo)的細(xì) 胞因子水平，通過使該途徑的可誘導(dǎo)反饋抑制劑失能后在DC中形成復(fù) 雜的通過Jak/Stat信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的自分泌(以及可能的旁分泌)信號(hào) 回路。相一致地，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)給予低劑量IL-12有效地增強(qiáng)了 SOCS1沉 默的DC而不是wt DC的破壞自身耐受性的能力。
總而言之，這些結(jié)果表明了通過SOCSl沉默的DC產(chǎn)生了持續(xù)而提高的IL-12和IL-12誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)很可能在自身耐 受性破壞和增強(qiáng)的抗腫瘤CTL應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。本發(fā)明的結(jié)果進(jìn) 一步表明DC中S0CS1引起的對(duì)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞內(nèi)抑制促成自身耐受 性的維持。盡管發(fā)現(xiàn)S0CS1通過其SOCS盒區(qū)域靶向p65蛋白進(jìn)行遍在 蛋白介導(dǎo)的蛋白水解而直接阻斷了 NF-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ryo等，2003， Mol. Cell. 12:1413-26) ， Gingras等報(bào)道了 S0CS1通過抑制I型 IFN的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間接調(diào)節(jié)了巨噬細(xì)胞中用于LPS介導(dǎo)毒性的TLR信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)(Gingras等，2004， J. Biol. Chem. 279:54702-7 )。不同于 通過I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的LPS誘導(dǎo)毒性，在此的結(jié)果證明了 SOCSl-沉 默DC誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答主要是由IL-12介導(dǎo)的。在此的結(jié)果還證明了 SOCSl-沉默的DC應(yīng)答LPS引起的多種細(xì)胞因子如TNF-ct、 IL-6和 IL-12的產(chǎn)生增加。
該研究證明了沉默DC中的SOCSl對(duì)于誘導(dǎo)有效的對(duì)抗自身腫瘤相 關(guān)抗原的抗腫瘤免疫的必要性。已經(jīng)將DC疫苗看作用于腫瘤疫苗接種 的最有前景策略之一，如近年中涉及1000多名患者的98項(xiàng)公開DC 疫苗臨床測(cè)試所證明的(Rosenberg等，2004, Nat. Med. 10: 909-15 )。 主要目的在于通過各種方法促進(jìn)抗原呈遞和DC成熟的這些嘗試大部 分是令人失望的,具有非常低的目標(biāo)臨床應(yīng)答率(Rosenberg等，2004， Nat. Med. 10:909-15 )。在此的數(shù)據(jù)證明了即使在用LPS或IL-12 體內(nèi)刺激后，裝載高親和性肽的wt DC仍然不能破壞自身耐受性。因 此，在此的結(jié)果可以解釋目前所述腫瘤疫苗的總體無(wú)效性(Rosenberg 等，2004, Nat. Med. 10:909-15 )，并通過沉默關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑 如SOCSl結(jié)合現(xiàn)有促進(jìn)DC抗原呈遞和成熟的策略，提供了研發(fā)更有效 肺瘤疫苗的新途徑(Gilboa， 2004， Nat.Rev. Cancer 4:401-11; You等，2000, J. Immunol. 165: 4581-4592; Soiffer等，2003， J. Clin. Oncol. 21:3343-50; Pardoll， 2002, Nat. Rev. Immunol. 2: 227-38 )。
本發(fā)明的SOCSl沉默方法，具有特異性增強(qiáng)由裝載抗原的DC誘導(dǎo) 的抗原特異性免疫應(yīng)答的能力，比系統(tǒng)性阻斷效應(yīng)T細(xì)胞上CTLA4的方法也更有吸引力，后種方法不加區(qū)別地過度激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞， 包括對(duì)抗重要組織和器官的那些(Hodi等，2003， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100: 4712-7; Phan等,2003， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100: 8372-7 )。總而言之，鑒于改進(jìn)腫瘤疫苗的集中努力聚焦于 抗原親和性/劑量和共刺激的改進(jìn)，本研究發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)自身耐受性的新 機(jī)制和SOCS I沉默的DC的增強(qiáng)的免疫刺激能力提供了可廣泛應(yīng)用的破 壞對(duì)抗腫瘤的自身耐受性限制的新疫苗接種策略。
實(shí)施例7:通過小鼠S0CS1 siRNA DC誘導(dǎo)的HIV特異性抗體和CTL
應(yīng)答
這個(gè)實(shí)施例證明了通過抑制宿主的天然免疫抑制劑誘導(dǎo)抗HIV免 疫應(yīng)答的可選策略。該研究證明了 S0CS1， DC中JAK/STAT途徑的負(fù)向 調(diào)節(jié)劑，不僅控制了 HIV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，而且控 制了抗體應(yīng)答。S0CS1沉默的DC對(duì)于HIV包膜介導(dǎo)的抑制是抗性的并 有效地誘導(dǎo)了小鼠中平衡的記憶HIV包膜特異性抗體和CTL應(yīng)答。本 發(fā)明的公開內(nèi)容代表了通過抑制宿主的免疫抑制劑來(lái)引發(fā)HIV特異性 抗體和CTL應(yīng)答的第一次嘗試。
現(xiàn)在描述該實(shí)施例中所示實(shí)驗(yàn)中所用的材料和方法。
用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)BM來(lái)源的DC
如本文別處所述的產(chǎn)生重組慢病毒栽體，LV-SOCSl-siRNA和 LV-GFP-siRNA,滴定并用于轉(zhuǎn)導(dǎo)DC。
細(xì)胞因子和抗體ELISA測(cè)試
根據(jù)制造商的說(shuō)明通過ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Park, NJ)來(lái)定量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子含量。為了測(cè)定 gpl20特異性抗體和亞類的滴度，將gpl20蛋白(碳酸鹽緩沖液[pH9. 6] 中5 m g/ml )在4X:包被過夜，將PBS-5%FBS中的l2倍連續(xù)稀釋的血 清在室溫加入孔中1小時(shí)。八次洗滌后，將生物素化的抗小鼠抗體(抗
93小鼠IgM、 IgG、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b或IgG3)在室溫加入孔中1小 時(shí)。將抗生蛋白鏈菌素-HRP用作過氧化物酶底物。通過加入50jLil2M H2S(h來(lái)停止反應(yīng)。在Bio Assay Reader上450nm處閱讀光密度。將 結(jié)果表示為終點(diǎn)滴度的倒數(shù)，從y軸上的光密度(OD)值和x軸上的 稀釋度-1的散點(diǎn)圖來(lái)確定，為此x-軸的標(biāo)尺是對(duì)數(shù)的。將數(shù)據(jù)作圖后， 將對(duì)數(shù)曲線擬合運(yùn)用至每個(gè)單個(gè)的稀釋系列，確定曲線擬合與陽(yáng)性-陰性截?cái)嘀到徊娴狞c(diǎn)。將每個(gè)抗體同種型的截?cái)嘀涤?jì)算為從對(duì)照小鼠 血清的所有稀釋度的平均值(+3SD)。在相同時(shí)間測(cè)試每個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè) 試的所有樣 品。
T-細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(EUSPOT)測(cè)試
如本文別處所述的進(jìn)行分離的CD4+或CD8+ T細(xì)胞的ELISPOT測(cè)試。
B細(xì)胞分離和產(chǎn)生gpl20抗體的B細(xì)胞ELISPOT測(cè)試 將完全RPMI 1640培養(yǎng)基中的脾臟制得的單細(xì)胞懸浮液在37°C 5°化02涂布于塑料培養(yǎng)皿中l(wèi)hr來(lái)除去粘附的巨噬細(xì)胞。用抗Thyl.2 和兔子補(bǔ)體在37。C處理非粘附細(xì)胞45分鐘來(lái)裂解T細(xì)胞。剩余B細(xì) 胞的純度通常超過90%。通過此前所述的改進(jìn)方法來(lái)進(jìn)行B細(xì)胞 ELISPOT測(cè)試(Le Bon等，2001， Immunity 14:461-7023 )。簡(jiǎn)而言 之，用PBS中的gpl20將96孔硝基纖維素基平板(Millipore Multiscreen PI)包被過夜。用PBS將平板洗滌六次并用含有10%FBS 的RPMI 1640在37'C封閉2小時(shí)。將分離的B細(xì)胞接種于孔中(5 x 105細(xì)胞/孔)并在37 t: 5% C02溫育20小時(shí)。然后用PBS 0. 5%吐溫 20(Sigma， St.Louis， MO )洗滌六次來(lái)除去細(xì)胞。加入在含有0. 5%FBS 的PBS中稀釋至lyg/ml的生物素化抗小鼠IgG (BDPharmgen)，并 將混合物在37。C溫育2小時(shí)。將抗生物素蛋白生物素化的酶復(fù)合物 (ABC, Vector Laboratories, Inc. Burlingame， CA)力口入另夕卜1 小時(shí)。在與AEC ( 3-氨基-9-乙基咔唑；Sigma， St. Louis, M0)反應(yīng)4分鐘后檢測(cè)抗gpl20 IgG。通過ZellNet Cousulting Inc. (New York, NY)使用自動(dòng)化ELISPOT閱讀系統(tǒng)(Carl Zeiss, Inc. Thornwood NY ) 來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)果，使用KS ELISPOT 4. 3軟件。
BAFF和APRIL的定量RT-PCR分析
通過定量實(shí)時(shí)PCR來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染小鼠BM-DC中的S0CS1的相對(duì)表達(dá)。 從DC提取總RNA,使用Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)， 用隨機(jī)六聚體引物和SuperScipt第一鏈合成試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)來(lái)逆轉(zhuǎn)錄每個(gè)樣品1. Ojug的總RNA。在ABI 7900HT序 歹寸檢領(lǐng)'J系纟克上(Applied Biosystems, Inc. ， Foster City， CA)在 20p 1重復(fù)四份的反應(yīng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)5，-核酸酶熒光PCR分析，每個(gè)反 應(yīng)用等量5ng起始RNA材料作為模版。以下引物用于BAFF和APRIL: BAFF,有義5， -TGCTATGGGTCATGTCATCCA-3， ( SEQ ID NO: 17)和反 義5， -GGCAGTGTTTTGGGCATATTC-3， (SEQ ID NO: 18) ; APIRL，有 義-TCACAATGGGTCAGGTGGTATC-3' ( SEQ ID NO: 19 )和反義5， -TGTA AATGAAAGACACCTGCACTGT-3， ( SEQ ID NO: 20 )。從Tapman Rodent 18S 對(duì)照試劑(Applied Biosystems, Inc. ， Foster City, CA)獲得用 于18S的TaqMan探針、正向和反向引物。PCR參數(shù)是對(duì)于TaqMan通 用PCR Master Mix試齊'J盒(Applied Biosystems, Inc. ， Foster City, CA)推薦的那些，在分開的試管中進(jìn)行BAFF、 APRIL和18S反應(yīng)。將 BAFF和APRIL含量相對(duì)于18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)通過比較Ct方法 (Livak等，2001, Methods 25: 402-8 )來(lái)計(jì)算BAFF或APRIL表達(dá)(相 對(duì)于模擬轉(zhuǎn)染的、刺激的DC的對(duì)照值)。
CTL測(cè)試
如本文別處所述的使用標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)試來(lái)測(cè)定CD8+ CTL應(yīng)答，這 測(cè)量了體外再次刺激的脾細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力。在含有g(shù)pU0蛋白 (20|ig/ml)的RPMI-1640中體外再次刺激從免疫小鼠匯集的脾細(xì)胞 4-6天。用"Cr鉻酸鈉溶液將20jig/ml gpl20蛋白脈沖過夜的靶細(xì)胞標(biāo)記90分鐘。用恒定數(shù)量的靶細(xì)胞(1 x IOV孑L )在96孔V-底平板(200 ja 1/孔)中在37X:溫育不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞3小時(shí)。收集重復(fù)三份培 養(yǎng)物的上清液(100jal)。按照(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/ (最大釋放-自發(fā)釋放)x IOO來(lái)計(jì)算細(xì)胞裂解百分比。
T和B細(xì)力包增殖測(cè)試
將如本文別處所述分離的CD4+或CD8+T細(xì)胞(1 x 106每孔)和B 細(xì)胞(1 x 105每孔)在重復(fù)三份的96孔平板孔中在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 存在或不存在各種刺激物。在培養(yǎng)的第四天，用ljuCi[3H]-胸苷脈沖 細(xì)胞16小時(shí)。然后收集平板并使用MicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器(TopCount NXT， Packard)測(cè)量摻入的[3H]-胸苷。
DC免疫
如本文別處所述的用MOI為5的LV-SOCSl-s iRNA或LV-GFP-s iRNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓來(lái)源的DC (BM培養(yǎng)第5天)。 現(xiàn)在描述本實(shí)施例所示試驗(yàn)的結(jié)果。
DC中S0CS1的沉默增強(qiáng)了 HIV Env特異性抗體應(yīng)答 首先研究了 SOCSl沉默對(duì)DC誘導(dǎo)抗HIV抗體應(yīng)答能力的作用。將 HIV Env用于該研究，因?yàn)槠淇梢哉T導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答和中和抗體應(yīng)答。如 本文別處所述的產(chǎn)生表達(dá)SOCSl s iRNA的重組慢病毒栽體 (LV-SOCSl-si謹(jǐn))和對(duì)照栽體(LV-GFP-siRNA) ， SOCSl siRNA具 有下調(diào)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中約90% SOCSl mRNA的能力。用裝載重組HIV gpl20 蛋白的LV-S0CS1 -siRNA或LV-GFP-siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨髓(BM)來(lái)源 的DC，并用LPS體外成熟。然后用轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC以一周的間隔將小鼠組 免疫兩次，每次DC免疫后接著體內(nèi)LPS刺激。基于如本文別處所公開 的可以進(jìn)一步增強(qiáng)通過SOCSl沉默DC誘導(dǎo)的對(duì)抗腫瘤相關(guān)抗原的CTL 應(yīng)答的觀察，使用體內(nèi)刺激。圖15A顯示了 LV-SOCSl-siRNA-DC引發(fā) 了比對(duì)照LV-GFP-siRNA-DC顯著強(qiáng)烈的gpl20特異性IgM和IgG應(yīng)答。其特征剖析表示截然不同免疫狀態(tài)的不同抗體亞類的產(chǎn)生取決于
CD4+T輔助(Th) 1-和Th2-極化細(xì)胞因子和Th細(xì)胞功能(Allen等， 1997， Immunol. Today 18: 387-92 )。圖15B顯示了與LV-GFP s iRM-DC 小鼠中相應(yīng)的亞類相比較，用LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中所有 IgG亞類中HIV Env特異性抗體滴度的顯著增加。Env-特異性抗體亞 類特征剖析顯示出IgGl和IgG2a的混合應(yīng)答，IgGl是Th2應(yīng)答的產(chǎn) 物，IgG2a是與Thl應(yīng)答相關(guān)的亞類，表明通過LV-SOCSl-siRNA-DC 誘導(dǎo)了 Thl-和Th2-依賴性免疫應(yīng)答。在重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中獲得了相似結(jié) 果。沒有進(jìn)行中和測(cè)試，因?yàn)閷?duì)于可靠測(cè)試HIV中和活性，小鼠不是 合適的物種(Burton等，2004， Nat. Immunol. 5:233-6 )。進(jìn)一步 觀察到S0CS1沉默增強(qiáng)了對(duì)其他HIV Env蛋白抹和抗原如卵清蛋白 (OVA)的抗體應(yīng)答。這些結(jié)果證明了通過DC中S0CS1的沉默顯著地 增強(qiáng)了包括所有IgG亞類的HIVEnv特異性抗體應(yīng)答，意味著DC中的 S0CS1在控制抗原特異性抗體應(yīng)答中的關(guān)鍵作用。
DC中S0CS1的沉默增強(qiáng)了 HIV gpl20特異性CTL應(yīng)答 進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估S0CS1沉默是否能夠增強(qiáng)HIVEnv特異性CTL 應(yīng)答。將IFNy ELISPOT、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和CTL測(cè)試用來(lái)測(cè)試免 疫小鼠中CD8+ T細(xì)胞的功能狀態(tài)。LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中對(duì)抗 gpl20脈沖的靶細(xì)胞的CTL活性比LV-GFP-siRNA-DC小鼠中的那些顯 著更有效(P^. 01)(圖15C)。這些測(cè)試中檢測(cè)的CTL活性是gp120 特異性的，因?yàn)閬?lái)自LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的脾細(xì)胞缺乏任何明顯 的對(duì)抗非gpl20脈沖的靶細(xì)胞的CTL活性。相一致地，在 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中，檢測(cè)到每5乂105個(gè)CD8+ T細(xì)胞 363個(gè)IFN y+斑點(diǎn)，與LV-GFP-siRNA-DC小鼠中的191個(gè)斑點(diǎn)相比較 (圖15D)。用IFN-Y對(duì)脾細(xì)胞胞內(nèi)染色也顯示出LV-SOCSl-siRNA-DC 小鼠中較高百分比的IFN-Y+ T細(xì)胞。合起來(lái)看，這些結(jié)果證明了 S0CS1沉默的DC免疫的小鼠中對(duì)抗HIV Env的平衡且增強(qiáng)的抗體和CTL 應(yīng)答，表明DC中的S0CS1關(guān)鍵性地調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫。S0CS1沉默的DC誘導(dǎo)的混合的、增強(qiáng)的Thl和Th2應(yīng)答 不希望受到任何特定理論的束縛，鑒于細(xì)胞因子在編程Thl對(duì)Th2 應(yīng)答中的作用(MacDonald等，2002， J. Immunol. 168: 3127-30; Gor 等，2003， Nat. Immunol. 4:503-5 ),認(rèn)為S0CS1沉默可能通過調(diào) 節(jié)DC引起的細(xì)胞因子產(chǎn)生而影響CTL和抗體應(yīng)答。圖16A證明了 LPS 刺激后與GFP-siRNA-DC相比較，LV-SOCSl-siRNA-DC產(chǎn)生的IL-12、 IFN-y和TNF-cc水平的顯著增加，這些細(xì)胞因子促進(jìn)了 Thl-極化的應(yīng) 答。令人感興趣地，在SOCSl沉默DC中也看到了 IL-4、 IL-6和IL-IO 的顯著增加，其促進(jìn)了 Th2-極化的應(yīng)答(P<0. 01) 。 SOCSl沉默DC 產(chǎn)生的促Thl-和Th2-細(xì)胞因子的較高水平可以解釋SOCSl沉默DC誘 導(dǎo)HIV Env特異性CTL和抗體應(yīng)答的能力的增強(qiáng)。
基于本發(fā)明的結(jié)果，DC中SOCSl沉默明顯促進(jìn)了抗體和CTL應(yīng)答。 以下的實(shí)驗(yàn)了解通過SOCSl沉默是否也增強(qiáng)了 HIV Env特異性CD4+ Th 應(yīng)答，其密切參與抗體和CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)。使用CD4+微珠從免疫小 鼠分離CD4+ T細(xì)胞并使用各種測(cè)試來(lái)分析。如圖16B中所示的， LV-SOCS1-siRNA-DC小鼠中g(shù)pl20特異性CD4+T細(xì)胞的頻率顯著高于 LV-GFP-siRNA-DC小鼠。力-胸苷摻入測(cè)試顯示出LV-SOCSl-siRNA-DC 小鼠的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答gpl20脈沖DC的刺激的增殖比LV-GFP-siRNA DC小鼠的更活躍(圖16C)。用gpl20脈沖的DC刺激后從 LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠分離的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子譜分析顯 示出Thl-極化(IFN-y 、 IL-2和TNFa )和Th2-極化(IL-4和IL-IO) 細(xì)胞因子的水平提高(圖16D)。這些結(jié)果表明SOCSl-沉默的DC誘導(dǎo) 了對(duì)抗HIV Env的增強(qiáng)的、混合的Thl和Th2應(yīng)答，這與圖15B中混 合的gpl20特異性IgG亞類譜相一致。
SOCSl沉默的DC增強(qiáng)了 gpl20特異性B細(xì)胞激活 已經(jīng)顯示出DC通過產(chǎn)生APRIL (誘導(dǎo)增殖配體)和BAFF (B淋巴 細(xì)胞刺激因子，也稱為BLyS),直接引發(fā)了 B細(xì)胞增殖、成熟和類別轉(zhuǎn)換重組，APRIL和BAFF是TNF超家族的成員(Balazs等，2002， Immunity 17: 341-52; Litinskiy等，2002， Nat. Immunol. 3: 822-9; MacLennan等，2002， Immunity 17:235-8 )。因此使用實(shí)時(shí)RT-PCR 評(píng)價(jià)了 SOCSl沉默對(duì)DC引起的APRIL和BAFF產(chǎn)生的作用。LPS刺激 時(shí)LV-SOCSl-siRNA-DC表達(dá)比LV-GFP-siRNA-DC水平高的APRIL和 BAFF (圖17A)，與S0CS1+DC中BAFF和APRIL增加的表達(dá)相一致
(Hanada等，2003， Immunity, 19:437-50 )。
為了測(cè)試SOCSl沉默的DC增強(qiáng)gpl20特異性B細(xì)胞激活的能力， 使用抗gpl20 IgG特異性B細(xì)胞Eli spot測(cè)試來(lái)直接檢測(cè)免疫小鼠中 產(chǎn)生抗gpl20 IgG的B細(xì)胞的頻率。LV-SOCSl-siRNA DC小鼠中產(chǎn)生 抗gpl20 IgG的B細(xì)胞的頻率顯著高于LV-GFP-siRNA DC小鼠中
(P<0. 01)(圖17B)。較高百分比的B細(xì)胞呈現(xiàn)出激活的表型，該 表型的特征在于與LV-GFP-siRNA-DC小鼠的B細(xì)胞相比較， LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中高水平的CD69、 CD40和CD86。此外，純 化來(lái)自免疫小鼠脾臟的B細(xì)胞并用各種刺激物刺激。圖17C顯示出用 抗CD40和IL-4共刺激時(shí)，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B細(xì)胞的增殖 比LV-GFP -siRNA -DC小鼠的B細(xì)胞更有活力。令人感興趣地， LV-S0CS1-siRNA-DC小鼠的B細(xì)胞，而不是LV-GFP-siRNA-DC小鼠的 B細(xì)胞，僅強(qiáng)烈應(yīng)答IL-4或抗CD40,表明通過LV-SOCSl-siRNA-DC 的免疫已經(jīng)體內(nèi)激活了增加數(shù)量的B細(xì)胞。還觀察到 LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B細(xì)胞應(yīng)答各種刺激物產(chǎn)生了更高水平的 多種細(xì)胞因子，包括IL-6、 IL-12和TNF-oc (圖17D)?？偠灾?， 這些結(jié)果表明了 SOCS1沉默的DC產(chǎn)生了增加水平的B淋巴細(xì)胞刺激因 子(BAFF和APRIL)和Th2極化細(xì)胞因子，導(dǎo)致對(duì)HIV Env特異性B 細(xì)胞和Th細(xì)胞更有效的激活。
SOCSl-沉默的DC誘導(dǎo)了長(zhǎng)期HIV Env特異性CTL和抗體應(yīng)答 已經(jīng)表明了 DC中的SOCSl沉默增強(qiáng)了初級(jí)HIV Env特異性CTL 和抗體應(yīng)答，進(jìn)一步評(píng)價(jià)SOCSl沉默的DC是否可以誘導(dǎo)記憶HIV特異性CTL和抗體應(yīng)答。圖18A顯示了用LV-GFP-siRNA-DC免疫的小鼠在 免疫后六個(gè)月具有非常低水平的gpl20特異性抗體，而 LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠在它們的血清中仍然保持相當(dāng)高滴度的 gpl20特異性IgGl和IgG2抗體。加強(qiáng)免疫后一周，LV-S0CSl-siRNA-DC 小鼠顯示出強(qiáng)烈的回憶抗體應(yīng)答，具有抗gpl20 IgGl 2xl()S和抗 gpl20 IgG2 1 x 105的平均滴度，而LV-GFP-siRNA-DC小鼠顯示出差的 回憶抗體應(yīng)答，具有IgGl 3xl(^和igG2 4xl()2的平均滴度。這些數(shù)
據(jù)表明與GFP-siRNA-DC相比較，S0CS1沉默的DC在IgGl和IgG2a 抗體的滴度方面分別呈現(xiàn)出約64和255倍的增加。
使用ifn-y elispot測(cè)試檢測(cè)gpl20特異性CD8+和CD4+ t細(xì)胞 應(yīng)答來(lái)評(píng)估記憶HIV特異性CTL和Th的維持。圖18B顯示了免疫后六 個(gè)月時(shí)在LV-SOCSl-siRNA DC小鼠中檢測(cè)到強(qiáng)烈的gpl20特異性CTL 應(yīng)答，但在LV-GFP-siRM DC小鼠中沒有(LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠 中每5 x 105 CD8+T細(xì)胞249個(gè)IFN y斑點(diǎn)對(duì)LV-GFP-s iRNA-DC小鼠中 3個(gè)IFN y斑點(diǎn))。通過加強(qiáng)免疫快速誘導(dǎo)了 LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠 中有力的gpl20特異性CTL應(yīng)答，但在LV-GFP-siRM DC小鼠中沒有
(加強(qiáng)后第7天LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中每5 x 105 CD8+ T細(xì)胞446 個(gè)IFN y斑點(diǎn)對(duì)LV-GFP-s iRNA-DC小鼠中16個(gè)IFNy斑點(diǎn))。CD8+ T 細(xì)胞的胞內(nèi)IFN-y和表面CD44記憶標(biāo)記的共染色也顯示出在免疫后 六個(gè)月時(shí)與LV-GFP-siRM-DC小鼠相比較，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠 中較高百分比的CD44hi和IFN y + CD8+ T細(xì)胞(圖18C )。相似地， 免疫后六個(gè)月時(shí)在LV-SOCSl-s iRNA-DC小鼠中維持并快速誘導(dǎo)gpl20 特異性CD4+Th應(yīng)答(加強(qiáng)后第7天時(shí)LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中每5
x 105個(gè)CD4+ T細(xì)胞391個(gè)IFNy斑點(diǎn)對(duì)LV-GFP-siRNA-DC小鼠中37 個(gè)IFNy斑點(diǎn))(圖18D)。因此，用S0CS1沉默的DC免疫有效地誘 導(dǎo)了長(zhǎng)期HIV Env特異性CTL、 Th和抗體應(yīng)答。
免疫后長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月沒有觀察到用 gpl20脈沖的 LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的小鼠中有明顯毒性。免疫小鼠所有主要器 官和組織的組織學(xué)分析表明沒有病理性炎癥。DC-LV-SOCSl-siRNA和模擬DC小鼠中的IgG和抗dsDNA水平相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)表明gpl20脈沖 的LV-S0CS1-siRNA-DC免疫沒有引起小鼠的病理性炎癥。
SOCSl沉默的DC對(duì)HIV Env介導(dǎo)的免疫抑制的抗性 包括gpl20蛋白的HIV病毒可以抑制DC產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子和刺 激T細(xì)胞的能力(Fantuzzi等，2004， J. Virol. 78:9763-72 ; Granelli-Piperno 等，2G04 ， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101: 7669-74; Barron等，2003， J. Infect. Dis. 187:26-37; Pacanowski等，2001 ， Blood 98:3016-21 )。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià) SOCSl沉默增強(qiáng)的DC激活是否可以克服gpl20蛋白對(duì)DC的細(xì)胞因子 產(chǎn)生和免疫刺激能力的抑制效果。選擇IL-12作為這些實(shí)驗(yàn)的代表性 細(xì)胞因子，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)DC產(chǎn)生的IL-12起著雙重作用驅(qū)動(dòng)Thl發(fā)展以 及直接發(fā)信號(hào)給B細(xì)胞用于產(chǎn)生體液應(yīng)答(Dubois等，1998 ， J. Immunol. 161:2223-31; Dubois等，1997， J. Exp. Med. 185:941-51; Skok等,1999， J. Immunol. 163:4284-91 )。
如圖19A中所示的，在gpl20蛋白存在下LV-S0CS1-siRNA-DC保 持應(yīng)答LPS的能力。相反，gpl20蛋白的存在嚴(yán)重?fù)p害了 LV-GFP-siRM-DC對(duì)LPS刺激的應(yīng)答。在體內(nèi)進(jìn)一步研究SOCSl沉默 的DC對(duì)gpl20介導(dǎo)的抑制的易感性。用0VA脈沖的轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC免疫小 鼠，用或沒用gpl20蛋白體外預(yù)處理。預(yù)先暴露于gpl20蛋白對(duì) LV-S0CS1-siRNA-DC誘導(dǎo)OVA特異性抗體應(yīng)答的能力不具有明顯效果 (圖19B和19C),也沒有損害由LV-SOCSl-siRM-DC誘導(dǎo)的OVA特 異性CD8+ CTL和CD4+Th應(yīng)答(P〉0. 05)(圖19D和19E)。然而， 這樣的預(yù)處理顯著降低了 LV-GFP-siRNA-DC誘導(dǎo)OVA特異性抗體和 CTL應(yīng)答的能力(P<0.05)(圖19B至19E)。這些結(jié)果表明SOCSl 沉默使得DC對(duì)HIV gpl20介導(dǎo)的抑制具有抗性，很可能是由于SOCSl-沉默DC增強(qiáng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和過度活化狀態(tài)(Hannada等，2003， Immunity 19: 437—50 )。
101實(shí)施例8:體內(nèi)DNA接種增強(qiáng)了 HIV特異性抗體和CTL應(yīng)答 這個(gè)實(shí)施例證明了用SOCSlsiRNA表達(dá)子DNA共免疫顯著增強(qiáng)了 HIV DNA接種的功效。該研究代表第一次嘗試通過抑制宿主的免疫抑 制劑來(lái)引發(fā)HIV特異性抗體和CTL應(yīng)答，這提出了研發(fā)更有效HIV疫 苗的新途徑。
現(xiàn)在描述該實(shí)施例中所示實(shí)驗(yàn)中所用的材料和方法。 DNA疫苗接種
如之前本文別處所述的，產(chǎn)生pSuper-SOCSl-siRNA表達(dá)載體。為 了產(chǎn)生HIVEnv retrogen表達(dá)栽體，首先構(gòu)建gpl40CF質(zhì)粒，通過刪 除gpl20/gp41切割位點(diǎn)和HIV gpl60的gp41的融合結(jié)構(gòu)域(密碼子 使用優(yōu)化的 JRFL )來(lái)促進(jìn)HIV Env的分泌。所得到的 pCMV/R-gpl40CF-Fc retrogen載體包含與CMV啟動(dòng)子控制下的IgGFc 片段融合的gpl40CF基因。從CHO細(xì)胞產(chǎn)生和由NIH AIDS Research and Reference Program提供重組gpl20 (JFRL)蛋白。用Qiagen試劑盒 制備無(wú)內(nèi)毒素DNA,以1 jug/jal的終濃度重懸浮于無(wú)內(nèi)毒素的PBS中
(Sigma, St. Louis, MO-Adrich Corp., St. Louis, MO)，并存儲(chǔ) 于-20。C直至用于注射。在預(yù)定的接種那天，將50pggpl40CF-FcDNA 或200 " g gpl40CF-Fc DNA (50 jug)和pSuper-SOCSl-s iRNA表達(dá)DNA
(150|ig)的混合物i.m.注射至每只小鼠的四頭肌中(Hauser等， 2004， Gene Ther. 11: 924—32 ; You等，2001 ， Cancer Resarch 61: 3704-11 )。然后在每次DNA免疫后1 、 3和5天用LPS(30jug/小 鼠)(IP)處理免疫小鼠三次。
現(xiàn)在描述該實(shí)施例中所示實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
通過用SOCS1 siRNA DNA的共免疫增強(qiáng)了 HIV DNA疫苗的功效 SOCS1沉默的DC增強(qiáng)HIVEnv特異性CTL和抗體應(yīng)答的能力表明 本發(fā)明的SOCS1沉默方法在增強(qiáng)HIV DM疫苗接種的功效中可能是有 用的。根據(jù)Hauser等，2004， Gene Ther. 11: 924-32和You等，2001，Cancer Research 61:3704-11使用"retrogen"免疫策略，該策略 使用受體介導(dǎo)的胞吞作用來(lái)增強(qiáng)DC耙向和抗原的固C呈遞。簡(jiǎn)而言之， 通過框內(nèi)融合IgG Fc片段和gpl40CF基因來(lái)產(chǎn)生gpl40CF retrogen, 其中刪除了 gpl20/gp41切割位點(diǎn)和gp41的融合結(jié)構(gòu)域。從 gpl40CF-Fc載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)和分泌所得到的gpl40CF-Fc融合蛋
—f 。
為了測(cè)試S0CS1 siRNA對(duì)DNA疫苗接種的作用，將小鼠每周只注 射gpl40CF-Fc DNA或gpl4-CF-Fc DNA和pSuper-SOCSl-siRNA表達(dá) DNA的混合物，持續(xù)三周，然后在一周后監(jiān)測(cè)小鼠的HIV Env特異性 免疫應(yīng)答。用pSuper-SOCSl-siRNA DNA共免疫小鼠中的HIV Env特 異性抗體滴度的升高是明顯的(圖20A )。通過共注射 pSuper-SOCSl-siRM DNA顯著增強(qiáng)了 HIV Env特異性CTL應(yīng)答，如通 過CTL和ELISPOT測(cè)試所證明的(圖20B和20C)。此外，通過共注 射SOCSl-siRNA DNA增強(qiáng)了 HIV Env特異性CD4+ Th應(yīng)答(圖20D)。 用細(xì)胞因子的胞內(nèi)染色還顯示出pSuper-SOCSl-siRNA DNA共免疫小鼠 中增強(qiáng)的gpl20-特異性CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答。這些結(jié)果表明由于免疫小 鼠中共轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞增強(qiáng)的免疫刺激能力，pSuper-SOCSl-siRM DNA共免疫增強(qiáng)了 HIVDM疫苗接種的功效。因此，在此呈現(xiàn)的S0CS1 沉默策略適用于體外基于DC的和體內(nèi)的疫苗接種情況。
種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的公開內(nèi)容證明了 DC中負(fù)向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑SOCSl的沉默 導(dǎo)致小鼠中HIVEnv特異性抗體和CTL應(yīng)答的顯著增強(qiáng)。觀察到S0CS1-沉默的DC誘導(dǎo)的HIV Env特異性抗體和CTL應(yīng)答都是長(zhǎng)效的。此外， 結(jié)果證明了用S0CS1 siRNA DM的共免疫顯著增強(qiáng)了 HIV DNA疫苗接 種的功效。因此，用S0CS1沉默的DC可以誘導(dǎo)平衡的對(duì)抗HIV的記憶 性體液和細(xì)胞應(yīng)答，且這種S0CS1沉默策略適用于治療性和預(yù)防性的 HIV疫苗接種情況。傳統(tǒng)上將DC在體液應(yīng)答誘導(dǎo)中的作用看作是CD4+ Th引發(fā)T細(xì)胞 和B細(xì)胞之間同源相互作用的結(jié)果。然而，已經(jīng)在體外和體內(nèi)證明了 DC在體液應(yīng)答刺激中的直接作用(Dubois等，1997， J. Exp. Med. 185: 941-5138; Inaba等，1983， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6041-5 )。值得注意的，發(fā)現(xiàn)DC強(qiáng)烈地增強(qiáng)了 CD40激活的B細(xì)胞 的增殖和抗體產(chǎn)生(Dubois等，1997, J. Exp. Med. 185: 941-51 )。 用裝載抗原的DC免疫可以誘導(dǎo)保護(hù)性體液應(yīng)答(Flamand等，1994， Eur. J. Immunol. 24:605-10 )。在此的結(jié)果證明了 SOCSl沉默的DC 增加了 Th2極化細(xì)胞因子以及B淋巴細(xì)胞刺激細(xì)胞因子(BAFF和 APRIL)的產(chǎn)生，這很可能引起了 SOCSl沉默DC免疫的小鼠中看到的 增強(qiáng)的Th和B細(xì)胞激活。這個(gè)發(fā)現(xiàn)受到之前報(bào)道的支持S0CS1+DC 誘導(dǎo)B細(xì)胞的異常擴(kuò)增和自身反應(yīng)性抗體產(chǎn)生(Hanada等，2003, Immunity, 19:437-50 )。因此，該研究證明了 DC中的SOCSl在控制 HIV特異性抗體應(yīng)答中的關(guān)鍵作用并意味著SOCSl的沉默可以普遍地 用于加強(qiáng)對(duì)抗除HIV Env以外抗原的抗體應(yīng)答。
該研究的重要發(fā)現(xiàn)是S0CS1沉默的DC誘導(dǎo)了平衡的記憶性 HIV-Env特異性抗體和CTL應(yīng)答，這對(duì)于預(yù)防或控制HIV感染是理想 的(Burton等，2004， Nat. Immunol. 5:233-6; McMichael等，2003， Nat. Med. 9:874-80; Nabel， 2001， Nature 410: 1002-7; Letvin 等，2002, A謂，Rev. Immunl. 20:73-99; Zolla-Pazner， 2004， Nat Rev. Immunol. 4: 199-210; Imami等，2002， J. Virol. 76:9011-23; Letvin等，2003， Nat. Med. 9:861-6)。不希望受到任何特定理論 的束縛，SOCSl沉默誘導(dǎo)平衡的記憶性體液和細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制可能涉 及由SOCSl沉默的DC和gpl20-特異性CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生的Thl-和Th2-極化細(xì)胞因子混合模式。這些結(jié)果與天然產(chǎn)生的對(duì)抗許多病原體如病 毒的混合抗體和CTL應(yīng)答相一致(Allen等，1997, Immunol. Today 18:387-92 )，表明Thl和Th2極化不是相互排斥的(Gor等，2003， Nat. Immunol. 4:503-5; Colonna， 2001， Nat. Immunol. 2:899-900 )。
SOCSl作為多種細(xì)胞因子使用的JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的反饋抑
104制劑且涉及TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的直接或間接調(diào)節(jié)(Baetz等，2004， J. Biol. Chem. 279:54708-15; Gingras等，2004， J. Biol. Chem. 279: 54702-7 )。在此的結(jié)果一致地顯示出S0CS1沉默的DC應(yīng)答LPS 引起的多種細(xì)胞因子如TNF-ot、 IL-6和IL-12的產(chǎn)生增加。LPS-TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活了多種NF-KB應(yīng)答性基因，包括許多炎癥細(xì)胞因子，其 可以以自分泌和旁分泌方式來(lái)起作用(Baetz等，2004， J. Biol. Chem. 279:54708-15; Grohmann等，1998， Immunity 9:315-23; Pan等， 2004, Immunol. Lett. 94:141—51)。鑒于SOCS1涉及間接削弱TLR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，JAK/STAT途徑中關(guān)鍵制動(dòng)的失能應(yīng)當(dāng)允許細(xì)胞因子建立自 分泌和/或旁分泌刺激回路，導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生的增強(qiáng)，而不是降低。 在此公開的結(jié)果涉及使用細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體敲除小鼠，表明自 分泌細(xì)胞因子刺激回路引起SOCSl沉默DC的細(xì)胞因子過度產(chǎn)生。
DC的功能缺陷和耗盡在HIV-感染個(gè)體中是常見的，很可能引起漸 進(jìn)性免疫缺陷。HIV gpl20蛋白可以抑制DC產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子和刺 激T細(xì)胞的能力(Fantuzzi等，2004， J. Virol. 78:9763-72; Carbonneil等，2004， J. Immunol. 172:7832-40 )。證明了由于增 強(qiáng)的促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和S0CS1沉默DC的過度活化狀態(tài)，S0CS1沉 默的DC抵抗HIV gpl20介導(dǎo)的抑制(Hanada等，2003, Immunity 19:437-50 )。該發(fā)現(xiàn)與治療性HIV疫苗的研發(fā)特別相關(guān)，這將用于免 疫抑制的HIV感染個(gè)體中(Lu等，2004, Nat. Med. 10:1359-1365 )。
在此所述的疫苗接種策略，代表第一次通過抑制宿主DC中免疫抑 制劑增強(qiáng)抗HIV免疫應(yīng)答的努力。因?yàn)樘烊幻庖咴诳刂艸IV-l感染中 是無(wú)效的，使宿主的免疫抑制劑失能對(duì)產(chǎn)生有效的抗HIV免疫應(yīng)答可 能是關(guān)鍵的。然而，僅僅HIV特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)可能不能引起保 護(hù)性HIV抗體和CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)。在這點(diǎn)上，這個(gè)策略給予了與目前 可獲得疫苗組合免疫的機(jī)會(huì)，如通過DNA疫苗和SOCS1 siRNA DM的 共同免疫所證明的。使用改進(jìn)的HIV免疫原和傳送系統(tǒng)時(shí)(Burton等， 2004, Nat. Immunol. 5: 233-6; Yang等，2002， J. Virol. 76:4634-42 )， 這種疫苗接種方法可以提供新的途徑來(lái)增強(qiáng)弱的保護(hù)性免疫應(yīng)答或產(chǎn)生更寬和更強(qiáng)烈的應(yīng)答，不僅對(duì)抗顯性表位，而且對(duì)抗弱免疫原性或 隱藏的但仍然是保護(hù)性的表位?？偠灾景l(fā)明的公開內(nèi)容證明了
抑制宿主DC中的信號(hào)抑制劑來(lái)增強(qiáng)HIV特異性抗體和CTL應(yīng)答的原 理，要求進(jìn)一步的研究來(lái)確定通過這種策略是否可以在猴子和最終在 人中誘導(dǎo)保護(hù)性抗HIV應(yīng)答。此外，這種S0CS1沉默策略可以用于增 強(qiáng)對(duì)抗其他病原體的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例9:人S0CS1 siRNA的鑒定和分析
使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)選擇靶向人S0CS1的siRNA序列 hSOCSl-siRNAl ( CACGCACUUCCGCACAUUC. dT. dT; SEQ ID NO:21 )， hS0CSl-siRNA2 ( UUCCGUUCGCACGCCGAUU. dT. dT; SEQ ID NO:22 )和 hSOCSl-siRNA3 ( GAGCUUCGACUGCCUCUUC.dT.dT; SEQ ID NO: 23)。將 所有目標(biāo)序列接受NCBI Blast查詢來(lái)證實(shí)缺乏與其他已知基因的同源 性。".dT.dT"的名稱指的是就在siRNA目標(biāo)序列下游的多dT序列。
實(shí)施例10:用GenePorter轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞-DC
為了研究人SOCSl在人DC調(diào)節(jié)中的作用，首先鑒定了具有特異性 下調(diào)人SOCSl能力的小干擾RNA (siRNA)。使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)選擇靶 向人SOCSl和293T細(xì)胞的s iRNA序列。然后每個(gè)合成的人SOCSl-s iRNA 寡核苷酸雙鏈體與flag標(biāo)記的人SOCSl表達(dá)載體以10: 1比例共轉(zhuǎn)染 至293T細(xì)胞中，使用GenePorter轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，如本文 別處所述的收集細(xì)胞，并通過蛋白質(zhì)印跡來(lái)分析。
圖21A顯示了人S0CS1 siRNA有效地下調(diào)了人SOCSl表達(dá)。通過 亂序的siRNAl寡核苷酸雙鏈體不能下調(diào)SOCSl mRNA證實(shí)siRNA對(duì)人 SOCSl mRNA下調(diào)的特異性。因此選擇人SOCSl siRMl用于進(jìn)一步的 研究。通過GenePorter將合成的siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染至源自人單核細(xì)胞 的DC中，具有85. 5%的轉(zhuǎn)染效率(圖21B )。如通過定量RT-PCR測(cè)試 所證實(shí)的，與模擬轉(zhuǎn)染DC中的水平相比較，用hSOCSl siRNAl雙鏈體 轉(zhuǎn)染的總DC群中hSOCSl mRNA水平特異性降低約60%(圖21C，p<0. 01 )。siRM效率和SOCSl RNA降低與使用合成siRNA雙鏈體耙向總體小鼠 骨髓來(lái)源的DC群中小鼠SOCSl的實(shí)驗(yàn)中觀察到的那些相似。
如本文別處所述的通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)評(píng)價(jià)人DC中人SOCSl 的相對(duì)表達(dá)。使用從Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA 預(yù)先開發(fā)的用于人SOCSl的引物/探針系列(引物，5 ， -TTTTTCGCCCTTAGCGGGAA-3 ' ; SEQIDNO: 24和5 ， -CTGCCATCCAGGTGAAAGC-3， ； SEQIDNO:25;和探針，6FAM-ATGGCCTC GGGACCCACGAG-TAMRA; SEQ ID NO:26 )。
人SOCSl沉默DC的表征
進(jìn)行下一系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)通過流式細(xì)胞分析評(píng)估人SOCSl是否調(diào)節(jié) DC上共刺激分子的表達(dá)。如本文別處所述的評(píng)估鼠SOCSl中所用的那 些進(jìn)行用于人SOCSl的流式細(xì)胞分析。觀察到hSOCSl-siRNA轉(zhuǎn)染的 DC和對(duì)照hSOCSl-s iRNA突變體轉(zhuǎn)染的DC顯示出在LPS-誘導(dǎo)的成熟之 前和之后在代表性共刺激分子的表達(dá)中只有輕微差異(圖22A)，這 與鼠DC中的觀察相一致。還檢測(cè)到hSOCSl-siRNA DC和突變-siRNA DC 上相當(dāng)水平的MHC-I和II分子。相比之下，觀察到hSOCSl-siRNA轉(zhuǎn) 染的DC對(duì)LPS刺激比siRNA突變體轉(zhuǎn)染的人DC反應(yīng)性更高，如通過 顯著增加的促炎癥細(xì)胞因子如IL-12、 IL-6和TNF- oc的分泌所示的(圖 22B和22C)。
表達(dá)人SOCSl siRNA的重組腺病毒載體的產(chǎn)生
使用 AdEasy 系統(tǒng)(El和E3缺失的 Ad (5); Quantum Biotechnologies Inc., Palo Alto， CA)來(lái)構(gòu)建和產(chǎn)生復(fù)制缺陷型 腺病毒。通過將Hl-人-SOCSl-s iRM DNA片段插入AdEasy載體中來(lái)構(gòu) 建穿梭載體Ad-hSOCSl-siRNA (圖28 )。通過DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)人 SOCSl-siRM的插入。隨后才艮據(jù)制造商的說(shuō)明(Quantum Biotechnologies Inc., Palo Alto, CA )產(chǎn)生重組腺病毒Ad-hSOCSl-siRNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明(Quantum Biotechnologies Inc.,Palo Alto， CA)在293細(xì)胞中產(chǎn)生并滴定重組腺病毒。觀察到重組 Ad(5)病毒能夠轉(zhuǎn)染人單核細(xì)胞來(lái)源的DC。
實(shí)施例11:通過人S0CS1 siRNA DC引發(fā)的MAGE3-特異性CTL應(yīng)
筌
進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來(lái)研究人S0CS1在調(diào)節(jié)人DC免疫刺激能力中的作 用。該實(shí)施例呈現(xiàn)的結(jié)果證明了人SOCSl-沉默的DC對(duì)微生物產(chǎn)物的 刺激是超反應(yīng)性的并具有增強(qiáng)的刺激能力來(lái)致敏自身抗原特異性人細(xì) 胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。重要地，人S0CS1沉默的DC，而不是野 生型DC,能夠充分激活CTL，該CTL對(duì)天然表達(dá)抗原的人腫瘤細(xì)胞具 有活性的裂解活性。此外，認(rèn)為人SOCSl沉默的DC致敏CTL的能力很 可能受到IL-12產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的S0CS1限制的控制。這些結(jié)果表明 人S0CS1在負(fù)向調(diào)節(jié)人DC中的關(guān)鍵作用并意味著這種S0CS1沉默方法
開發(fā)用于人患者的更有效腫瘤疫苗的翻譯潛能。
現(xiàn)在描述在此公開的實(shí)驗(yàn)中所用的材料和方法。
通過Genemed Synthesis Inc. ( South San Francisco， CA， USA) 合成HLA-A2-限制性MAGE3 CTL肽(FLWGPRALV; SEQ ID NO: 27 ) ( van der Bruggen等，1994， European Journal of Immunology 24: 3038-43 ) 和對(duì)照H-2Kb-限制性O(shè)VA-1 (SII訓(xùn)KL; SEQ ID NO: 11 )并通過HPLC 純化至〉95%的純度。在最終稀釋于無(wú)內(nèi)毒素PBS ( Sigma， St. Louis, MO)中之前，將肽溶解于DMSO中。
人S0CS1表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析
如本文別處所述的用合成的人SOCSl-siRNA寡核苷酸雙鏈體 (21bp)或無(wú)關(guān)寡聚物雙鏈體和flag標(biāo)記的人S0CS1表達(dá)栽體 (pCMV-hSOCSl)以10: 1的比例來(lái)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用GenePorter 試劑。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞，并接受SDS-PAGE。轉(zhuǎn)移至Hybond-P膜(Amersham, Arlington Heights, IL)后，通過蛋白質(zhì)印跡分析 樣品，使用抗-Flag ( Sigma, St. Louis, MO)或肌動(dòng)蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)抗體，接著用ECL-Plus試 劑(Amersham, Arlington Heights, IL)檢領(lǐng)寸。用Densitometer SI 掃描膜并用 ImageQuant軟件(Molecular Dynamics, Piscataway， NJ )來(lái)定量SOCSl-1/肌動(dòng)蛋白條帶。將SOCSl條帶的強(qiáng)度相對(duì)于e肌 動(dòng)蛋白條帶的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。
人SOCSl表達(dá)的定量RT-PCR分析
如本文別處所述的通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR來(lái)評(píng)價(jià)人DC中人SOCSl 的相對(duì)表達(dá)。
人單核細(xì)胞來(lái)源的DC的轉(zhuǎn)染和人T細(xì)胞的體外致敏 如Schroer等，2003， Clinical Can. Res. 9:4743-4755;和 Schroers等，2004， Methods Mol. Biol. 246:451-9中所述的來(lái)產(chǎn) 生并培養(yǎng)源自PBMC的人DC。從HLA-A2+健康捐獻(xiàn)者采集肝素化血液。 通過基于PCR-SSP-DNA的程序(The Methodist Hospital, Houston, Texas)進(jìn)行HLA分型。將PBMC重懸浮于無(wú)血清DC培養(yǎng)基中 (CellGenix， Antioch， II)并在濕潤(rùn)的5%C02中37。C溫育。在含有 1000IU/ml重組人GM-CSF ( rhGM-CSF; R&D System Inc， Minneapolis, MN)和1000IU/ml rhIL-4 (R&D System Inc, Minneapolis, MN)的 無(wú)血清DC培養(yǎng)基中培養(yǎng)粘附于塑料的細(xì)胞部分。在第5或第6天，用 120nMsiRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞來(lái)源的DC，根據(jù)制造商的說(shuō)明使 用GenePorter。然后用MAGE3肽(20 ji g/ml )將轉(zhuǎn)染的DC脈沖過夜。 在0. 5ml補(bǔ)充5°/ AB人血清、rhIL-2 ( 50U/ml )和TNF a (10ng/ml， R&D System Inc， Miineapolis, MN)的RPMI-1640中與5 x 104個(gè)MAGE3 脈沖的、轉(zhuǎn)染的DC ( 20: 1)共培養(yǎng)24孔平板每孔中總共1 x 106個(gè)人 T細(xì)胞。在共培養(yǎng)的第7天用自體MAGE3脈沖的、轉(zhuǎn)染的DC將共培養(yǎng) 的T細(xì)胞再次刺激一次。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)，每三天將抗人IL-12 (P70)抗體(20jig/ml， R&D System Inc, Minneapolis, MN )加入DC和T 細(xì)胞的共培養(yǎng)物中。在共培養(yǎng)兩周后，將T細(xì)胞用于免疫測(cè)試。
細(xì)胞因子ELISA和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)測(cè)試 根據(jù)制造商的說(shuō)明在所示的時(shí)間點(diǎn)和使用所示的刺激物使用DC 培養(yǎng)物上清液進(jìn)行ELISA分析(BD Biosciences, Uncoln Park, NJ ) 來(lái)定量各種促炎癥細(xì)胞因子的水平。如本文別處所述的進(jìn)行人外周淋 巴細(xì)胞的ELISPOT測(cè)試。
流式細(xì)胞分析
用含有0. 1。/。NaN3和2%FCS的PBS中的FITC或PE mAb將細(xì)胞染色。 從BD Biosciences, San Jose， CA購(gòu)買人CD40、 C廳和CD86特異 性抗體和相配的同種型對(duì)照。在FACSCalibur (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ )流式細(xì)月包計(jì)上分析染色的細(xì)胞。
四聚體染色
在Baylor College of Medicine Tetramer Core Facility (貝 勒醫(yī)學(xué)院四聚體核心機(jī)構(gòu))(Houston, TX, USA )合成人MAGE3/HLA-A2 四聚體。用抗-hCD8ct-FITC/抗hCD3-PerCP和MAGE3-PE四聚體共同
染色人外周血淋巴細(xì)胞或共培養(yǎng)物中的淋巴細(xì)胞。根據(jù)制造商的說(shuō)明， 在4。C下進(jìn)行四聚體染色lh，每106個(gè)細(xì)胞用1 jag抗CD8ot和1:100 稀釋度的MAGE3-PE四聚體。
HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的DC免疫
從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Maine, USA )購(gòu)買四至六周齡的雌性HLA-A2. 1 轉(zhuǎn)基因小鼠并根據(jù)建立的指導(dǎo)飼養(yǎng)于Baylor Col lege of Medicine(貝 勒醫(yī)學(xué)院)(Houston, TX， USA)的無(wú)病原體小鼠裝置中。如本文別 處所述的，從HLA-A2. 1轉(zhuǎn)基因小鼠制備小鼠BM來(lái)源的DC并用M0I 為5的重組慢病毒載體LV-SOCSl-siRNA或LV-GFP-siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后
110用MAGE3肽將DC脈沖20hr，用PBS洗滌三次，用TNFcx ( 500ng/ml， R&D System Inc, Miineapolis, MN)刺激24hr。然后通過后腳墊將 DC注射至HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中。在一些小鼠中，在DC接種后的所示 天數(shù)腹膜內(nèi)(i.p.)給予LPS (30jag/小鼠)或重組鼠IL-12 (1 n g/ 小鼠，PeproTech， Inc., Rocky Hill, NJ)。
CTL領(lǐng)'j試
如本文別處所公開的，用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放測(cè)試來(lái)評(píng)估CD8+ CTL應(yīng)答， 這測(cè)量了體外再次刺激的脾細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力(Huang等，2003， Cancer Res. 63: 73121-9 )。在含有MAGE3肽的RPMI-1640中將從2-3 只免疫小鼠收集的脾細(xì)胞體外再次刺激4-6天。用"Cr鉻酸鈉溶液將 人MAGE3+， HLA-A2+黑素瘤細(xì)胞(SK-Mel-37)和對(duì)照人MAGE3+， HLA-A2-黑素瘤細(xì)胞(NA-6-Mel)在37X:標(biāo)記90分鐘。用恒定數(shù)量的靶細(xì)胞 (5 x IOV孔)在96孔U底平板中(200|li 1/孔)在37。C溫育不同數(shù)量 的效應(yīng)細(xì)胞4h。收集重復(fù)三份培養(yǎng)物的上清液并分析。按照(實(shí)驗(yàn)釋 放-自發(fā)釋放)/ (最大釋放-自發(fā)釋放)xlOO來(lái)計(jì)算裂解百分比。
現(xiàn)在描述該實(shí)施例中所示實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
人S0CS1沉默的DC引發(fā)抗原特異性CTL應(yīng)答的免疫刺激功效增強(qiáng) 進(jìn)行下一系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估沉默的人S0CS1是否能夠增強(qiáng)人DC 引發(fā)自身抗原特異性CTL的刺激功效。將源自人MAGE3的HLA-A2限制 性肽(MAGE3是一種已知在成人睪丸和黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)的胚胎腫瘤 抗原(van der Bruggen等，1994， European Journal of Immunology 24:3038-43 ))用作模型人自身抗原。用hS0CSl siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染 從HLA-A2+健康志愿者的人單核細(xì)胞產(chǎn)生的DC，然后用MAGE3肽(20 lig/ml )脈沖過夜。在TNFa (成熟刺激)存在下(lOng/ml, R&D System Inc， Miineapolis, MN )，用5 x 1(T個(gè)MAGE3脈沖的、轉(zhuǎn)染的DC( 20: 1 ) 共培養(yǎng)每孔總共1 x 106個(gè)自體人T細(xì)胞。在共培養(yǎng)的第7天用自體 MAGE3脈沖的、轉(zhuǎn)染的DC將共培養(yǎng)的T細(xì)胞再次刺激一次。共培養(yǎng)兩周后，將T細(xì)胞用于免疫測(cè)試。與MAGE3-脈沖的突變-siRNA DC或模 擬DC各自共培養(yǎng)物中僅有的5.4%和4. 3°/ 相比較，用MAGE3肽脈沖的 hS0CSl siRNA轉(zhuǎn)染的DC的共培養(yǎng)物中，13. 9%的CD8+ T細(xì)胞對(duì)于 MAGE3-四聚體是陽(yáng)性的(圖23A)。來(lái)自相同捐獻(xiàn)者的未致敏(naive ) (未刺激的)原代人淋巴細(xì)胞的四聚體染色顯示出低水平的陽(yáng)性 MAGE3四聚體染色(0. 5°/。的CD8+ T細(xì)胞)。相一致地，胞內(nèi)IFN Y染 色(圖23B)顯示出與MAGE3肽脈沖的、突變siRNA DC ( 6. 9% IFNY + CD8+ T細(xì)胞)或模擬DC ( 5. 7% IFNy + CD8+ T細(xì)胞)相比較，hS0CSl siRNA DC顯著增強(qiáng)了 MAGE3-特異性CTL應(yīng)答(11. 18% IFNy+ CD8+ T 細(xì)胞)。此外，IFNy ELISPOT測(cè)試(圖23C )顯示出通過hS0CSl siRNA DC激活了增加數(shù)量的MAGE3特異性CTL。從HLA-A2+供體的重復(fù)實(shí)驗(yàn) 顯示出相似的結(jié)果。與沒有用抗原脈沖的DC共培養(yǎng)兩周后，大部分的 原代人T細(xì)胞死亡。總而言之，這些結(jié)果表明了人S0CSl-沉默的DC 具有增強(qiáng)的免疫刺激能力來(lái)引發(fā)自身抗原特異性CTL。
SCS01限制的IL-12在CTL致敏中的關(guān)鍵作用
由于S0CS1沉默的DC應(yīng)答微生物產(chǎn)物的刺激產(chǎn)生增加量的 IL-12，這是CTL應(yīng)答激活中的關(guān)鍵細(xì)胞因子(Trinchieri， 2003， Nat. Rev. Immunol. 3:133-46)，且由于IL-12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到S0CS1的限 制(Eyles等，2002， J. Biol. Chem. 277: 43735-40 )，因此檢測(cè)了 IL-12在人S0CS1沉默的DC致敏CTL中的作用。因此，每3天將抗人 IL-12抗體加入T細(xì)胞和MAGE3脈沖的、轉(zhuǎn)染DC的共培養(yǎng)物中。圖23A 至23C顯示了使用抗IL-12 (p70)抗體的IL-12抑制消除了 hSOCSl-siRM DC刺激MAGE3特異性CTL的增強(qiáng)能力，如通過四聚體 染色、胞內(nèi)IFN-Y染色和ELISPOT測(cè)試所證明的。
將人源化HLA-A2. 1轉(zhuǎn)基因小鼠用于進(jìn)一步測(cè)試IL-12在S0CS1 沉默DC誘導(dǎo)的增強(qiáng)的CTL應(yīng)答中的作用。用表達(dá)鼠S0CS1 siRNA的重 組慢病毒載體(LV-mSOCSl siRNA)或?qū)φ赵泽wLV-GFP siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo) HLA-A2. 1轉(zhuǎn)基因小鼠BM來(lái)源的DC并用A2限制的MAGE3肽脈沖。用TNFoc成熟后，以每周的間隔通過腳墊將轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC給予HLA-A2. 1轉(zhuǎn)基 因小鼠兩次。每次DC免疫后，用LPS或低劑量重組IL-12細(xì)胞因子體 內(nèi)刺激小鼠三次。由于誘導(dǎo)大量促炎癥細(xì)胞因子，其中許多受到S0CS1 的調(diào)節(jié)，并由于S0CS1在調(diào)節(jié)NF-kB (p65)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能的直接 作用(Ryo等，2003， Mol. Cell 12:1413-26)，因此使用LPS。使 用體內(nèi)IL-12刺激，與MAGE3脈沖的GFP-siRNADC免疫的小鼠中每2
xl(^個(gè)T細(xì)胞僅有的10個(gè)IFNy+斑點(diǎn)相比較，檢測(cè)到MAGE3脈沖的 S0CS1 siRNA DC免疫的小鼠中每2 x 105個(gè)T細(xì)胞239個(gè)IFNy+斑點(diǎn)
(圖24)。體內(nèi)LPS刺激還優(yōu)先地增強(qiáng)了由S0CS1-siRNA DC誘導(dǎo)的 CTL應(yīng)答(SOCSl-siRNA DC小鼠中每2 x 105個(gè)T細(xì)胞63個(gè)IFNy+斑 點(diǎn)對(duì)GFP-siRNA-DC小鼠中每2 x 105個(gè)T細(xì)胞24個(gè)IFNy+斑點(diǎn))(圖 24)。然而，對(duì)于增強(qiáng)SOCSl-siRNA-DC免疫小鼠中的MAGE3-特異性 CTL應(yīng)答，IL-12刺激比LPS刺激更有效(P<0. 01) 。 IL-12這種較好 的刺激能力很可能是由于S0CS1通過Jak/Stat途徑直接調(diào)節(jié)IL-12 刺激的能力，以及IL-12對(duì)S0CS1-siRNA DC免疫小鼠中已經(jīng)激活的 CTL的直接作用(Trinchieri， 2003， Nat, Rev. Immunol. 3:133-46 )。 總的來(lái)看，這些結(jié)果提供了 S0CS1限制抗原呈遞細(xì)胞中IL-12信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)的進(jìn)一步證據(jù)。這些結(jié)果還強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)決定基于細(xì)胞 因子的腫瘤治療效力的重要性。
通過人S0CS1沉默的DC而不是通過野生型DC激活的人CTL具有 腫瘤裂解效應(yīng)功能
為了測(cè)定激活的自身胂瘤相關(guān)抗原MAGE3特異性的T細(xì)胞是否具 有腫瘤裂解效應(yīng)功能，將天然MAGE3+人腫瘤細(xì)胞用作CTL測(cè)試的靶細(xì) 胞。通過MAGE3脈沖的SOCSl-siRNA DC或突變-siRNA DC激活的人T 細(xì)胞容易地殺滅了 MAGE3肽脈沖的、MAGE3+HAL-A2+黑素瘤細(xì)胞 (SK-Me卜37)。然而，通過MAGE3脈沖的突變-s iRNA DC激活的人T 細(xì)胞對(duì)沒有用MAGE3脈沖的天然SK-Me卜37細(xì)胞只顯示出微弱的細(xì)胞 裂解活性(圖25)。相反，通過MAGE3脈沖的SOCSl-siRNA DC激活的那些T細(xì)胞仍然具有強(qiáng)烈的對(duì)抗沒有用MAGE3脈沖的天然 SK-Me卜37細(xì)胞的細(xì)胞裂解活性(圖25 )。通過抗hIL-12抗體處理顯 著損害了與hSOCSl-siRNA DC共培養(yǎng)中的T細(xì)胞的腫瘤裂解活性。由 于通過MAGE3脈沖的SOCSl-siRNA DC激活的人T細(xì)胞只具有對(duì)抗 HLA-A2陰性的、MAGE3+黑素瘤細(xì)胞(M-6-Mel)的背景細(xì)胞裂解活性， 腫瘤細(xì)胞裂解活性由CTL特異性介導(dǎo)。不同供體的重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示出相 似的結(jié)果。
為了證實(shí)上述的觀察，測(cè)試了用MAGE3脈沖的S0CS1-siRNA DC 或GFP-siRNA DC免疫的HLA-A2. 1轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞的腫瘤裂解活 性。圖26顯示了 MAGE3脈沖的、mSOCSl siRNA DC免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠 的T細(xì)胞具有活性的對(duì)抗天然MAGE3+HLA-A2陽(yáng)性黑素瘤細(xì)胞 SK-Mel-37的細(xì)胞裂解活性。相反，用MAGE3脈沖的、GFP siRNA DC 免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞只具有微弱的對(duì)抗天然黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞 裂解活性，與圖25中所示的結(jié)果相一致。此外，觀察到低劑量重組 IL-12的體內(nèi)刺激顯著增強(qiáng)了由S0CS1 siRNA DC但不是GFP-siRNA DC 誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答(圖26)。總的來(lái)看，在此的結(jié)果表明了人S0CS1沉 默的DC具有完全激活CTL的獨(dú)特能力，該CTL具有對(duì)抗天然腫瘤細(xì)胞 的活性裂解效應(yīng)功能，很可能是由于抗原呈遞細(xì)胞增強(qiáng)的IL-12產(chǎn)生 和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
通過人S0CS1沉默的DC完全激活了自身抗原特異性人CTL
選的策略通過沉默JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑來(lái)增強(qiáng)人DC的 免疫刺激功效。在此公開的結(jié)果證明了人S0CS1在負(fù)向調(diào)節(jié)人DC引發(fā) 抗原特異性CTL的免疫刺激能力中的關(guān)鍵作用。人S0CS1沉默的DC 具有完全激活人CTL的獨(dú)特能力，該CTL具有強(qiáng)烈的對(duì)抗天然的、表 達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞的裂解功能。人S0CS1沉默的DC引發(fā)CTL的能力很 可能受到對(duì)IL-12產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的S0CS1限制的控制。因此，本發(fā) 明的公開內(nèi)容證明了這種普遍適用的S0CS1沉默方法用來(lái)研發(fā)更有效的腫瘤疫苗的翻譯潛能。
本發(fā)明的S0CS1沉默方法具有增強(qiáng)由裝載腫瘤相關(guān)抗原的DC誘導(dǎo) 的抗原特異性免疫應(yīng)答的能力。在最近十年間，腫瘤免疫學(xué)中的主要 進(jìn)展是鑒定和證實(shí)大量的人腫瘤特異性或相關(guān)抗原(Van den Eynd等， 1997， Current Opinion in Immunology 9:684-93 )。因此，接種裝 載腫瘤相關(guān)抗原的S0CS1沉默的DC比阻斷CTL上的CTLA4更有吸引力 來(lái)誘導(dǎo)抗原特異性抗腫瘤應(yīng)答。S0CS1沉默DC免疫的使用提供了附加 的治療益處，在于S0CS1沉默的DC不會(huì)引起嚴(yán)重的自身免疫炎癥，因 為雜合S0CS1+/—小鼠顯示出沒有或僅有輕微的自身免疫炎癥征象。此 外，S0CS1+小鼠中看到的嚴(yán)重自身免疫炎癥不僅需要DC中而且需要 其他免疫細(xì)胞世系如T細(xì)胞和NKT細(xì)胞中S0CS1完全缺乏(Kubo等， 2003， Nat. Immunol. 4: 1169-76; Alexander等，2004, A讓.Rev. Immunol. 22: 503-29; Metcalf等，2003， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100:8436-41; Chong等，2003， Immunity 18:475-87; Hanada 等，2003， Immunity 19:437-50; Kinjyo等，2002， Immunity 17: 583-91)。
大量增強(qiáng)腫瘤疫苗功效的努力聚焦于改進(jìn)腫瘤相關(guān)抗原的親和性 /劑量(信號(hào)l)和提高共刺激分子介導(dǎo)的信號(hào)2水平(Gilboa， 2004， Nat. Rev. Cancer 4:楊-11; Rosenberg等，2004 ， Nat. Med. 10: 909-15 )。本發(fā)明的公開內(nèi)容顯示出人S0CS1沉默的DC引發(fā)抗原 特異性CTL的優(yōu)異能力很可能是由于IL-12增加的產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(信 號(hào)3)。這個(gè)論斷基于以下的觀察1 )人S0CS1沉默的DC應(yīng)答微生 物產(chǎn)物的刺激產(chǎn)生增加水平的IL-12; 2) IL-12的抗體阻斷損害了人 S0CS1沉默DC的免疫刺激能力；和3)體內(nèi)給予低劑量的IL-12顯著 地增強(qiáng)了由SOCS1沉默的DC而不是由野生型DC誘導(dǎo)的抗原特異性CTL 應(yīng)答。這些結(jié)果得到Eyles， J. L.等對(duì)IL-12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠S0CS1調(diào) 節(jié)的發(fā)現(xiàn)(Eyles等，2002， J. Biol. Chem. 277:43735-40 )和本文 別處公開結(jié)果的支持。
已經(jīng)提出細(xì)胞因子作為DC提供的激活CTL的第三種信號(hào)(Curstinger等，2003， J. Exp. Med. 197:1141-51)。為了激活對(duì) 抗外源抗原的免疫應(yīng)答，同時(shí)限制過量的自身免疫激活，細(xì)胞因子產(chǎn) 生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到密切調(diào)節(jié)(Darnell等，1994， Science 264: 1415-21 )。細(xì)胞因子通常激活JAK,然后其將細(xì)胞因子受體的細(xì) 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域磷酸化，形成供轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活物(STAT)成員 的停泊位點(diǎn)(Alexander等，2004, A廳.Rev. Immunol. 22:503-29 )。 細(xì)^^因子還作為反饋抑制劑上調(diào)SOCSl的表達(dá)，然后其關(guān)閉DC的促炎 癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此削弱進(jìn)行中的免疫應(yīng)答并維持自身 耐受性(Alexander等，2004， A腿.Rev. Immunol. 22:503-29 )。 SOCSl通過其SH2結(jié)構(gòu)域作為假底物抑制劑特異性地結(jié)合JAK活化環(huán) 并靶向JAK2進(jìn)行遍在蛋白依賴性的蛋白降解而抑制了 STAT(Kubo等， 2003， Nat. Immunol. 4: 1169-76; Alexander等，2004， A謹(jǐn).Rev. Immunol. 22:503-29 )?？偟膩?lái)看，在此公開的結(jié)果顯示了抗原呈遞 細(xì)胞中受到SOCSl限制的IL-12產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在決定CTL應(yīng)答大小 中的關(guān)鍵重要性。
該研究的重大發(fā)現(xiàn)是人SOCSl沉默的DC具有完全激活具有活性裂 解效應(yīng)功能的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的獨(dú)特能力。在臨床和實(shí)驗(yàn)室研究中 經(jīng)常觀察到通過DC接種或體外敏化可以激活自身抗原特異性T細(xì)胞， 如通過各種免疫測(cè)試如四聚體染色和ELISPOT測(cè)試所測(cè)定的。然而， 盡管這樣激活的T細(xì)胞可以有效地殺滅人工抗原脈沖的腫瘤細(xì)胞或經(jīng) 遺傳修飾表達(dá)自身抗原的腫瘤細(xì)胞，但它們通常顯示出微弱的對(duì)抗天 然腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞裂解活性，認(rèn)為這是目前腫瘤疫苗功效差的主要原 因(Zaks等,1998， Cancer Research 58:4902-8; Yu等，2002， J. Clin. Invest. 110:289-94 )。在此公開的結(jié)果表明了完全激活自身 反應(yīng)性、低親和性的T細(xì)胞并賦予它們對(duì)抗天然肺瘤細(xì)胞的活性裂解 效應(yīng)功能可能需要由SOCSl沉默的DC提供的持久而增強(qiáng)的抗原呈遞/ 刺激。
實(shí)施例12: SOCSl siRNA oligo雙鏈體增強(qiáng)了蛋白免疫為了測(cè)試使用S0CS1 siRNA oligo雙鏈體的體內(nèi)免疫是否可以增 強(qiáng)蛋白免疫，將1) OVA蛋白與BCG免疫誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答與2) S0CS1 siRNA oligo雙鏈體-脂質(zhì)體和OVA蛋白與BCG共同免疫誘導(dǎo)的CTL應(yīng) 答相比較。用OVA蛋白和BCG混合物，S0CS1 siRNA oligo雙鏈體-脂 質(zhì)體與OVA蛋白和BCG的混合物免疫小鼠組，或通過腳墊共注射OVA 蛋白與BCG的混合物和S0CS1 siRNA oligo雙鏈體脂質(zhì)體，以一周的 時(shí)間間隔進(jìn)行兩次。觀察到第二次免疫后兩周，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和 ELISPOT測(cè)試(IFNy )顯示出S0CS1 siRNA oligo雙鏈體共免疫的小 鼠中誘導(dǎo)了更有效的OVA特異性CTL應(yīng)答(圖27A和27B)。
實(shí)施例13: S0CS1沉默的CTL具有增強(qiáng)的細(xì)胞裂解活性 為了研究T細(xì)胞中的S0CS1是否在調(diào)節(jié)CTL活性中起作用，用 S0CS1或突變siRNA ol igo轉(zhuǎn)染從OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室， Bar Harbor, Maine)分離的具有OVA表位特異性轉(zhuǎn)基因TCR的CD8+ OT-I細(xì)胞，4吏用GenePortor。將轉(zhuǎn)染的OT-I細(xì)胞用于CTL測(cè)試而沒 有進(jìn)一步刺激。觀察到與突變siRNA-oligo轉(zhuǎn)染的OT-I細(xì)胞相比較， SOCSl-siRNA oligo轉(zhuǎn)染的OT-I對(duì)同基因的OVA陽(yáng)性EG7細(xì)胞具有增 強(qiáng)的細(xì)胞裂解活性(圖29)。該結(jié)果表明了 T細(xì)胞中的S0CS1沉默增 強(qiáng)了它們的細(xì)胞裂解活性。
在此所引用的每項(xiàng)專利、專利申請(qǐng)和出版物的公開內(nèi)容在此以其 整體通過參考引入本文。
盡管已經(jīng)參照特定的實(shí)施方式公開了本發(fā)明，清楚的是本領(lǐng)域的 其他技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)出本發(fā)明的其他實(shí)施方案和改變而不脫離本發(fā) 明真實(shí)的精神和范圍。旨在將所附的權(quán)利要求解釋為包括所有這樣的 實(shí)施方案和等同變化。
11權(quán)利要求
1. 用于增強(qiáng)免疫細(xì)胞的免疫效能的組合物，所述組合物包括細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)或活化STAT的蛋白抑制劑(PIAS)中任一種或多種的抑制劑，其中所述抑制劑干擾所述細(xì)胞中的負(fù)向調(diào)節(jié)途徑。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制劑選自小千擾RNA( s iRNA )、 微RNA、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá)載體、胞內(nèi) 抗體、肽和小分子。
3. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述抑制劑是siRNA。
4. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述siRNA選自雙鏈寡核苷酸、單 鏈寡核苷酸和多核苷酸。
5. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述siRM是化學(xué)合成的。
6. 權(quán)利要求l的組合物，進(jìn)一步包括生理學(xué)上可接受的載體。
7. 權(quán)利要求6的組合物，其中所述生理學(xué)上可接受的載體是脂質(zhì)體。
8. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制劑是由克隆至表達(dá)栽體中 的分離的多核苷酸所編碼的。
9. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述表達(dá)載體選自質(zhì)粒DNA、病毒載體、細(xì)菌載體和哺乳動(dòng)物栽體。
10. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述表達(dá)栽體進(jìn)一步包括促進(jìn)所 述分離多核苷酸整合至宿主細(xì)胞基因組中的整合信號(hào)序列。
11. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述SOCS選自S0CS1、 S0CS2、 S0CS3、 S0CS4、 S0CS5、 S0CS6、 S0CS7和細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的含有SH2 結(jié)構(gòu)域的蛋白(CIS)。
12. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述SHP選自SHP-1和SHP-2。
13. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述PIAS選自PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy。
14. 權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包括具有至少一個(gè)表位的抗原，其中所述表位能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
15. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述抗原是由表達(dá)載體表達(dá)的。
16. 權(quán)利要求n的組合物，其中所述抗原是分離的多肽。
17. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述至少一個(gè)表位誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物 的CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答。
18. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述至少一個(gè)表位誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物 的CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答。
19. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述至少一個(gè)表位誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物 的B細(xì)胞應(yīng)答。
20. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述抗原與疾病相關(guān)。
21. 權(quán)利要求20的組合物，其中所述疾病選自感染性疾病、癌癥 和自身免疫性疾病。
22. 權(quán)利要求20的組合物，其中所述抗原與感染性疾病相關(guān)。
23. 權(quán)利要求22的組合物，其中所述感染性疾病是由選自病毒、 細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物的致病微生物引起的。
24. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述抗原是由病毒基因編碼的。
25. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述病毒基因源自選自乙肝病毒、 丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒和皰滲病毒的病毒。
26. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述抗原是由選自乙肝病毒e 抗原基因、乙肝病毒表面抗原基因和乙肝病毒核心抗原基因的病毒基 因所編碼的。
27. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述抗原是由選自人免疫缺陷病 毒Env gpl60基因、Gag基因、Pol基因、Rev基因、Tat基因、Vif 基因和Nef基因的病毒基因所編碼的。
28. 權(quán)利要求24的組合物，其中所述抗原是由選自乳頭瘤病毒 E7基因和乳頭瘤病毒E6的病毒基因所編碼的。
29. 權(quán)利要求25的組合物，其中所述抗原是由源自選自l型單純 皰滲病毒、2型單純皰滲病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人皰滲病毒6、 人皰滲病毒7和人皰滲病毒8的皰滲病毒的病毒基因所編碼的。
30. 權(quán)利要求21的組合物，其中所述癌癥選自乳癌、宮頸癌、黑 素瘤、腎癌和前列腺癌。
31. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述抗原是選自超表達(dá)的腫瘤相 關(guān)抗原、睪丸胂瘤抗原、突變的腫瘤相關(guān)抗原、分化腫瘤相關(guān)抗原酪 氨酸酶、MART、 trp、 MAGE-1、 MAGE-2、 MAGE-3、 gp100、 HER-2、 Ras 和PSA的腫瘤相關(guān)抗原。
32. 權(quán)利要求31的組合物，其中所述胂瘤相關(guān)抗原選自BCR-ABL、 CASP、 CDK、 Ras、 p53、 HER-2/neu、 CEA、 MUC、 TW1、 PAP、 survivin、 端粒酶、EGFR、 PSMA、 PSA、 PSCA、酪氨酸酶、MART、 TRP、 gp100、 MART、 MAGE、 BAGE、 GAGE、 LAGE/NY-ES0、 RAGE、 SSX-2、 CD19和CD20。
33. 權(quán)利要求20的組合物，其中所述疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、牛皮癬和節(jié)段性回腸炎。
34. 權(quán)利要求14的組合物，其中進(jìn)一步包括細(xì)胞因子或Toll樣 受體(TLR)激動(dòng)劑。
35. 權(quán)利要求34的組合物，其中所述細(xì)胞因子或TLR激動(dòng)劑是由 表達(dá)載體表達(dá)的。
36. 權(quán)利要求34的組合物，其中所述TLR激動(dòng)劑是分離的多肽。
37. 權(quán)利要求34的組合物，其中所述細(xì)胞因子是分離的多肽。
38. 權(quán)利要求34的組合物，其中所述細(xì)胞因子選自IL-12、 TNF a、 IFNoc、 IFNP 、 IFNy 、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
39. 權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步其中所述抑制劑抑制對(duì)Janus 激酶(JAK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。
40. 權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步其中所述抑制劑抑制對(duì)Toll 樣受體(TLR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。
41. 權(quán)利要求l的組合物，進(jìn)一步其中所述抑制劑抑制對(duì)NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。
42. 權(quán)利要求l的組合物，進(jìn)一步其中所述抑制劑抑制對(duì)抗原受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。
43. 用于增強(qiáng)細(xì)胞的免疫效能的組合物，所述組合物包括載體，該載體包括編碼抑制劑的第一多核苷酸和編碼具有至少一個(gè)表位的抗 原的第二多核苷酸，其中所述抑制劑抑制所述細(xì)胞中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，其中所述至少一個(gè)表位誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
44. 權(quán)利要求43的組合物，其中所述細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑選 自S0CS ( S0CSl-7， CIS ) 、 SHP ( SHP-1和SHP-2 )和PIAS ( PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
45. 權(quán)利要求43的組合物，其中所述抑制劑選自小干擾RNA (siRNA)、微RNA、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá)載體、胞內(nèi)抗體、肽和小分子。
46. 權(quán)利要求43的組合物，其中所述載體選自質(zhì)粒DNA、病毒載 體、細(xì)菌載體和哺乳動(dòng)物載體。
47. 用于增強(qiáng)細(xì)胞的免疫效能的組合物，所述組合物包括載體， 該載體包括編碼抑制劑的第 一 多核苷酸和編碼細(xì)胞因子或TLR激動(dòng)劑的第二多核苷酸，其中所述抑制劑抑制所述細(xì)胞中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 的調(diào)節(jié)劑。
48. 權(quán)利要求47的組合物，其中所述第二多核苷酸編碼選自以下 的細(xì)胞因子IL-12、 TNFoc、 IFNa、 IFN P 、 IFNy 、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
49. 含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑的細(xì)胞。
50. 權(quán)利要求49的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑選自 S0CS(S0CSl-7， CIS)、 SHP(SHP-1和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
51. 權(quán)利要求49的細(xì)胞，其中所述抑制劑選自小干擾RNA( siRNA)、微RNA、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá)載體、胞內(nèi) 抗體、肽和小分子。
52. 權(quán)利要求49的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自APC、樹突細(xì)胞、 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫細(xì)胞。
53. 權(quán)利要求52的細(xì)胞，其中T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助T 細(xì)胞和調(diào)節(jié)T細(xì)胞。
54. 權(quán)利要求49的細(xì)胞，進(jìn)一步包括具有至少一個(gè)表位的抗原， 其中所述表位能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
55. 權(quán)利要求49的細(xì)胞，進(jìn)一步包括表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括 編碼細(xì)胞因子的多核苷酸。
56. 產(chǎn)生沉默細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞接觸細(xì)胞因子信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑。
57. 權(quán)利要求56的方法，其中所述細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑選自 S0CS(S0CSl-7， CIS)、 SHP(SHP-1和SHP-2 )和PIAS ( PIAS1 、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
58. 權(quán)利要求56的方法，其中所述抑制劑選自小干擾RNA( s iRM )、 微RNA、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá)載體、胞內(nèi) 抗體、肽和小分子。
59. 產(chǎn)生經(jīng)沉默和脈沖的細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞接觸細(xì) 胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑并進(jìn)一步將所述細(xì)胞接觸具有至少一 個(gè)表位的抗原，其中所述表位能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
60，權(quán)利要求59的方法，其中所述細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑選自 S0CS(S0CS1-7， CIS)、 SHP(SHP-l和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
61. 權(quán)利要求59的方法，其中所述抑制劑選自小干擾RNA( s iRNA )、 微RM、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá)載體、胞內(nèi) 抗體、肽和小分子。
62. 引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將含有細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑的組合物給藥于有此需要的哺乳動(dòng)物。
63. 權(quán)利要求62的方法，其中所述細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑選自 S0CS(S0CS1-7， CIS)、 SHP(SHP-1和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy)。
64. 權(quán)利要求62的方法，其中所述抑制劑選自小干擾RNA( s iRM )、 微RNA、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá)載體、胞內(nèi) 抗體、肽和小分子。
65. 引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將含有沉默細(xì)胞 的組合物給藥于有此需要的哺乳動(dòng)物，其中所述沉默細(xì)胞包括細(xì)胞因 子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的抑制劑。
66. 權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑選自 S0CS( S0CS1-7, CIS)、 SHP(SHP-l和SHP-2)和PIAS(PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy )。
67. 權(quán)利要求65的方法，其中所述抑制劑選自小千擾RNA( siRNA)、 微RNA、反義核酸、核酶、編碼轉(zhuǎn)顯性陰性突變體的表達(dá)載體、胞內(nèi) 抗體、肽和小分子。
68. 權(quán)利要求65的方法，其中在將所述沉默細(xì)胞給藥于有此需要 的哺乳動(dòng)物之前將所述沉默細(xì)胞在體外接觸抗原。
69. 權(quán)利要求65的方法，其中在將所述沉默細(xì)胞給藥于有此需要 的哺乳動(dòng)物之后將所述沉默細(xì)胞在體內(nèi)接觸抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及在抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞中通過細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)節(jié)抗原呈遞。本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑如SOCS(SOCS1-7，CIS)、SHP(SHP-1和SHP-2)和PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASx和PIASy)來(lái)調(diào)節(jié)抗原呈遞的方法。本發(fā)明提供了疫苗和療法，其中通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑來(lái)增強(qiáng)抗原呈遞。本發(fā)明還提供了在依賴于自身腫瘤抗原呈遞的腫瘤疫苗接種方法中破壞自身耐受性的機(jī)制。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101437834SQ200580030987
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2005年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月19日
發(fā)明者K·C·艾沃-卡布勒, 蕾 沈, 陳思毅, 黃雪芬 申請(qǐng)人:貝勒醫(yī)學(xué)院