專利名稱:抗腫瘤組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及以氯化鉑,氯鉑酸鹽類作為有效成分,副作用小,對(duì)肺癌顯示出特別優(yōu)異的抗癌作用的抗腫瘤組合物。
背景技術(shù):
鉑,現(xiàn)已使用順鉑(CDDP),卡鉑,異丙鉑作為鉑復(fù)合物,但是抗腫瘤效果高的順鉑副作用強(qiáng),其副作用對(duì)于患者來(lái)說(shuō)難以忍受,因此使用多受限制,進(jìn)而由于對(duì)水的溶解性低,因此只能以低濃度提供。此外,比順鉑副作用低的卡鉑,異丙鉑,如果毒性降低,則活性降低,因此未必能獲得令人滿意的一些抗腫瘤效果。
因此,希望開(kāi)發(fā)抗腫瘤效果高且副作用、毒性低的抗腫瘤劑。
可是,羥基磷灰石通常是由Ca10(PO4)6(OH)2構(gòu)成的化學(xué)計(jì)量組成表示的,其是骨和牙齒的無(wú)機(jī)主成分,由于生物體親和性好,具有吸附蛋白質(zhì)等的作用,因此其被制備成人工骨,骨填充劑,潔牙劑等,并且現(xiàn)已設(shè)計(jì),公開(kāi)了以其作為藥劑的輔助成分的各種裝置。
作為抗腫瘤劑,現(xiàn)已公開(kāi)了,與在通往腫瘤局部的動(dòng)脈中注入使之吸附制癌劑的羥基磷灰石作為微栓塞來(lái)斷開(kāi)給腫瘤的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給的同時(shí),抑制腫瘤的發(fā)育的方法(特開(kāi)平1-51266號(hào)公報(bào)),在體內(nèi)植入埋入了抗腫瘤劑的羥基磷灰石,使藥劑緩釋的方法(特開(kāi)平2-200628號(hào)公報(bào)),通過(guò)在磷酸鈣微結(jié)晶體中添加藥劑,促進(jìn)藥劑的效果或使之延遲,使之癌細(xì)胞等各種細(xì)胞中選擇性吸附,使藥劑作用的方法(特開(kāi)平5-255095號(hào)公報(bào)),在腫瘤部位植入使之吸附了抗腫瘤劑的羥基磷灰石,加熱,用于熱化學(xué)療法的方法(“癌和化學(xué)療法”19(10)1644-1647,1992),使用平均粒子徑為36.1μm,表面積為2.5m2/g的多孔性羥基磷灰石作為緩釋劑,制作調(diào)整緩釋化卡鉑,使卡鉑緩釋的方法(“癌和化學(xué)療法”26(12)1791-1793,1999)。
專利文獻(xiàn)1特開(kāi)平1-51266號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開(kāi)平2-200628號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3特開(kāi)平5-255095號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4特開(kāi)平4-112832號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5特開(kāi)平4-112833號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1“癌和化學(xué)療法”19(10)1644-1647,1992非專利文獻(xiàn)2“癌和化學(xué)療法”26(12)1791-1793,1999發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明旨在提供具有優(yōu)異的抗腫瘤效果,毒性低的抗腫瘤劑。
用于解決問(wèn)題的方法本發(fā)明的特征在于,使微粒子的羥基磷灰石支持氯化鉑,氯化鉑酸鹽類作為毒性低且抗腫瘤活性高的抗腫瘤劑。
作為使用氯化鉑酸作為原料的抗腫瘤劑,除了前述的使用使之支持鉑的羥基磷灰石作為抗腫瘤劑的方法之外,還公開(kāi)了使用使之支持鉑的氯化磷灰石作為抗腫瘤劑的方法(特開(kāi)平4-112833號(hào)公報(bào)),在使用任一種小鼠的試驗(yàn)中,都不能說(shuō)與順鉑相比,小鼠的延長(zhǎng)壽命率高,抗腫瘤效果顯著優(yōu)異。本發(fā)明,通過(guò)將羥基磷灰石與毒性強(qiáng),無(wú)法作為抗腫瘤劑使用的氯化鉑和/或氯化鉑酸類配合,發(fā)現(xiàn)維持了氯化鉑的高抗腫瘤效果,并使毒性顯著降低。
本發(fā)明中使用的氯化鉑,氯化鉑酸類,可以使用四氯化鉑PtCl4,四氯鉑酸H2PtCl4,六氯鉑酸H2PtCl6,四氯鉑酸鈉Na2PtCl4,六氯鉑酸鈉Na2PtCl6,四氯鉑酸鉀K2PtCl4,六氯鉑酸鉀K2PtCl6等氯化鉑類,或它們的水合物,PtCl4·5H2O,H2PtCl6·6H2O,Na2PtCl4·4.5H2O,Na2PtCl6·4H2O等。
此外,本申請(qǐng)中使用的羥基磷灰石,通常由Ca10(PO4)6(OH)2構(gòu)成的化學(xué)計(jì)量組成表示的,但是具有即使Ca/P摩爾比不為1.67的非化學(xué)計(jì)量組成時(shí),也顯示羥基磷灰石的性質(zhì),可以獲得磷灰石結(jié)構(gòu)的特征。在本發(fā)明中,可以使用化學(xué)計(jì)量組成和非化學(xué)計(jì)量組成的羥基磷灰石中的任一種,并可以使用Ca/P摩爾比為1.4~1.8的羥基磷灰石。
羥基磷灰石的Ca/P摩爾比的控制通過(guò)原料的鹽的混合比率和合成條件的控制來(lái)進(jìn)行。例如,在羥基磷灰石的濕式混合法中,如果在合成時(shí)用氨水等將水溶液調(diào)整成堿性,Ca/P摩爾比變高,如果用稀酸將水調(diào)整成中性或弱酸性,Ca/P摩爾比可以降低。
作為本發(fā)明中使用的前述羥基磷灰石,可以使用結(jié)晶性和低結(jié)晶性的任意一種,但是優(yōu)選低結(jié)晶或非晶質(zhì)的。
本發(fā)明中所謂的“低結(jié)晶”是指X線衍射峰比高結(jié)晶的粉體寬的結(jié)晶質(zhì)粉體。
所謂“非晶質(zhì)”是指,X線衍射峰顯示出寬闊的halo,無(wú)法獲得顯示出結(jié)晶特征的衍射圖型的微粒構(gòu)成的粉體。以下,低結(jié)晶性羥基磷灰石,非品質(zhì)的羥基磷灰石分別被稱為“低結(jié)晶性磷灰石”和“非晶質(zhì)磷灰石”。
作為本發(fā)明中使用的低結(jié)晶性磷灰石或非晶質(zhì)磷灰石,使用例如,將前述通過(guò)三角火架濕式法合成的磷灰石冷凍干燥或在100℃以下的溫度干燥的產(chǎn)物,或者在300℃左右以下的溫度燒成的磷灰石。
低結(jié)晶性磷灰石或非晶質(zhì)磷灰石,與結(jié)晶性高的羥基磷灰石(以下,稱為“結(jié)品質(zhì)磷灰石”)相比,由粒徑更小的粒子構(gòu)成。
作為本發(fā)明中使用的羥基磷灰石粒子,從血管內(nèi)給藥方面考慮,優(yōu)選最大粒徑為1.0μm以下的粒子,從抗腫瘤效果方面考慮,更優(yōu)選最大粒徑為0.1μm以下的粒子。由于如果羥基磷灰石粒子更小,導(dǎo)致鈣的溶解,因此粒徑的下限優(yōu)選平均粒徑為0.02μm以上。
調(diào)整羥基磷灰石粒子的大小的方法可以通過(guò)粉碎來(lái)進(jìn)行。此時(shí),將羥基磷灰石粉碎成最大粒徑1.0μm以下,優(yōu)選最大粒徑0.1μm以下,平均粒徑的下限為0.02μm后,通過(guò)與氯化鉑類混合,獲得抗腫瘤劑,但是從降低氯化鉑類的毒性的效果上考慮,更為優(yōu)選通過(guò)與氯化鉑類和羥基磷灰石混合后進(jìn)行粉碎,調(diào)整上述粒子徑。
氯化鉑,氯鉑酸類相對(duì)于羥基磷灰石的重量?jī)?yōu)選為0.1-100%,進(jìn)而,為了獲得充分的毒性減低效果,并且從抗腫瘤劑的給藥量方面考慮,最佳為1-30%。
以下,就本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明,但是下述實(shí)施例所述的是作為毒性試驗(yàn)在用于LD50測(cè)定中使用的實(shí)施例,本發(fā)明的范圍并不受其限制。
是表示顯示在靜止期的成纖維細(xì)胞中添加了包含于CDDP的IC50中的鉑添加后的CDDP分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像的顯微鏡照片(10倍)。
是表示顯示在靜止期的成纖維細(xì)胞中添加了包含于CDDP的IC50中的鉑添加后的PtCl4·HAP分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像的顯微鏡照片(10倍)。
是表示顯示在靜止期的成纖維細(xì)胞中添加了包含于CDDP的IC50中的鉑添加后的PtCl4分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像的顯微鏡照片(10倍)。
是表示顯示在靜止期的成纖維細(xì)胞中添加了包含于CDDP的IC50中的鉑添加后的HAP分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像的顯微鏡照片(10倍)。
具體實(shí)施例方式
以下,通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
(四氯化鉑·羥基磷灰石抗腫瘤劑)[實(shí)施例1]四氯化鉑10%·羥基磷灰石90%抗腫瘤劑的調(diào)整原材料
1.羥基磷灰石(HAP)2.四氯化鉑(PtCl4)3.氫氧化鈉pH調(diào)整劑4.檸檬酸分散劑在預(yù)先的蒸餾水中添加1g稱量的四氯化鉑,攪拌后,添加氫氧化鈉,將pH調(diào)整成中性域(pH6.8-7.4)。該溶液中添加9g稱量的羥基磷灰石,減壓下進(jìn)行攪拌,該溶液中添加蒸餾水,將總量調(diào)整成500ml,在50-60℃的恒溫,暗處,密封容器中進(jìn)行約1個(gè)月的攪拌。
停止攪拌,用蒸發(fā)器濃縮后,進(jìn)行冷凍干燥,獲得粉末。
在該粉末中加入蒸餾水,將粉末濃度調(diào)整成約2%,進(jìn)而添加用氫氧化鈉將檸檬酸的pH調(diào)整成約7.0的分散劑,使分散劑的濃度調(diào)整成20mM/l。
在濕式分散·粉碎機(jī)Dyno-Mill(瑞士WAB公司制)中,使用用于冷卻的循環(huán)泵,粉碎溫度為3-5℃左右對(duì)該溶液進(jìn)行粉碎,獲得了0.05-0.1μm,平均粒徑約0.07μm的粒子的溶液。
使用用于滅菌的0.22μm的滅菌用過(guò)濾器對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾,獲得了四氯化鉑·羥基磷灰石抗腫瘤劑(PtCl4·HAP)。對(duì)于獲得的抗腫瘤劑,通過(guò)X射線和E-MAX分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)的分析和分析各元素的分布。
X射線衍射裝置的管電壓設(shè)為45KV,管電流設(shè)為300mA,用利用CuKα射線的鎳濾器,在發(fā)射狹縫1.0deg,分散狹縫1.0deg,受光狹縫0.3mm的條件下進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定為5000-7000deg,抽樣間隔為0.0500deg,掃描速度為4000deg/min。
用裝置附屬的Match Maker(Mac Science公司)分析獲得的衍射結(jié)果。
并且,通過(guò)掃描電子顯微鏡附帶的能量-分散形X射線分析來(lái)進(jìn)行用E-MAX的分析。
掃描電子顯微鏡使用株式會(huì)社日立制作所制造的S-2380N,各離子分布的分析中使用堀場(chǎng)制作所制造的能量-分散形X射線分析裝置EMAX-5770W。用掃描電子顯微鏡在加速電壓20kV,工作距離25mm的條件下進(jìn)行鉑磷灰石的觀察。在電子顯微鏡下,用能量-分散形X射線分析裝置進(jìn)行的元素分析的條件是,以600秒作為檢測(cè)元素的合計(jì)時(shí)間,無(wú)感時(shí)間(DT)20%。進(jìn)而,以測(cè)定時(shí)間20分/框,合計(jì)次數(shù)227次,512的像素?cái)?shù)作為檢測(cè)的各元素的作圖條件。
為了將抗腫瘤劑提供給電子顯微鏡,在將試劑放在試劑臺(tái)上后,進(jìn)行碳涂覆。
X射線衍射的結(jié)果是,抗腫瘤劑中的四氯化鉑和羥基磷灰石沒(méi)有發(fā)現(xiàn)位相的變化,結(jié)構(gòu)也沒(méi)有變化。
此外,用E-MAX的分析的結(jié)果是,在抗腫瘤劑的所有粒子中觀察到羥基磷灰石的主要構(gòu)成元素鈣和磷,進(jìn)而觀察到鉑和鹵素只分布在羥基磷灰石的粒子上,于是分布在粒子狀整體上,從而清楚了所有四氯化鉑均為在羥基磷灰石上所支持的混合物。
此外,通過(guò)同樣的調(diào)整方法,通過(guò)只改變四氯化鉑和羥基磷灰石的比例,獲得了四氯化鉑相對(duì)于羥基磷灰石的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
進(jìn)而,獲得了最大粒徑為1μm,平均粒徑約為約0.4μm,四氯化鉑的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
對(duì)于這些抗腫瘤劑,通過(guò)與上述相同的X射線分析和E-MAX的結(jié)構(gòu)分析和分析各元素的分布,獲得了相同的結(jié)果。
(六氯化鉑酸·羥基磷灰石抗腫瘤劑)[實(shí)施例2]六氯化鉑10%·羥基磷灰石90%抗腫瘤劑的調(diào)整原材料1.羥基磷灰石(HAP)2.六氯化鉑(H2PtCl6)3.氫氧化鈉pH調(diào)整劑4.檸檬酸鈉分散劑在預(yù)先的蒸餾水中添加1.005g稱量的六氯化鉑,攪拌后,添加氫氧化鈉,將pH調(diào)整成中性域(pH6.8-7.4)。該溶液中添加9g稱量的羥基磷灰石,減壓下進(jìn)行攪拌,該溶液中添加蒸餾水,將總量調(diào)整成200ml,在暗處,密封容器中進(jìn)行約2個(gè)月的攪拌。
停止攪拌,進(jìn)行冷凍干燥,獲得六氯化鉑與羥基磷灰石的粉末。
在該粉末中加入蒸餾水,將粉末濃度調(diào)整成約1%,進(jìn)而添加作為分散劑的檸檬酸鈉,使其濃度為10mM/l。
在濕式分散·粉碎機(jī)Dyno-Mill(瑞士WAB公司制)中,使用用于冷卻的循環(huán)泵,粉碎溫度為3-5℃左右對(duì)該溶液進(jìn)行粉碎,獲得了0.02-0.07μm,平均粒徑約0.05μm的粒子的溶液。
使用用于滅菌的0.22μm的滅菌用過(guò)濾器對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾,獲得了六氯化鉑·羥基磷灰石抗腫瘤劑(H2PtCl6·HAP)。
該抗腫瘤劑的結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果是,所有六氯化鉑均為被羥基磷灰石支持的混合物。
此外,通過(guò)同樣的調(diào)整方法,通過(guò)只改變六氯化鉑和羥基磷灰石的比例,獲得了六氯鉑酸相對(duì)于羥基磷灰石的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
進(jìn)而,獲得了最大粒徑為1μm,平均粒徑約為約0.3μm,六氯鉑酸的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
對(duì)于這些抗腫瘤劑,通過(guò)與實(shí)施例1相同的X射線分析和E-MAX的結(jié)構(gòu)分析和分析各元素的分布,所有六氯鉑酸均為被羥基磷灰石支持的混合物。
(六氯鉑酸鈉·羥基磷灰石抗腫瘤劑)[實(shí)施例3]六氯鉑酸鈉10%·羥基磷灰石90%抗腫瘤劑的調(diào)整原材料1.羥基磷灰石(HAP)2.六氯鉑酸鈉(Na2PtCl6)3.氫氧化鈉pH調(diào)整劑4.檸檬酸分散劑在預(yù)先的蒸餾水中添加1g稱量的六氯鉑酸鈉,攪拌后,添加氫氧化鈉,將pH調(diào)整成中性域(pH6.8-7.4)。該溶液中添加9g稱量的羥基磷灰石,減壓下進(jìn)行攪拌,該溶液中添加蒸餾水,將總量調(diào)整成500ml,在50-60℃的恒溫,在暗處,密封容器中進(jìn)行約1個(gè)月的攪拌。
停止攪拌,用蒸發(fā)器濃縮后,進(jìn)行冷凍干燥,獲得粉末。
在該粉末中加入蒸餾水,將粉末濃度調(diào)整成約2%,進(jìn)而添加用氫氧化鈉將檸檬酸的pH調(diào)整成約7.0的分散劑,使分散劑的濃度調(diào)整成20mM/l。
在濕式分散·粉碎機(jī)Dyno-Mill(瑞士WAB公司制)中,使用用于冷卻的循環(huán)泵,粉碎溫度為3-5℃左右對(duì)該溶液進(jìn)行粉碎,獲得了0.05-0.1μm,平均粒徑約0.07μm的粒子的溶液。
使用用于滅菌的0.22μm的滅菌用過(guò)濾器對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾,獲得了六氯鉑酸鈉·羥基磷灰石抗腫瘤劑(Na2PtCl6·HAP)。
該抗腫瘤劑的結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果是,所有六氯鉑酸鈉均為被羥基磷灰石支持的混合物。
此外,通過(guò)同樣的調(diào)整方法,通過(guò)只改變六氯鉑酸鈉和羥基磷灰石的比例,獲得了六氯鉑酸鈉相對(duì)于羥基磷灰石的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
進(jìn)而,獲得了最大粒徑為1μm,平均粒徑約為約0.3μm,六氯鉑酸鈉的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
對(duì)于這些抗腫瘤劑,通過(guò)與實(shí)施例1相同的X射線分析和E-MAX的結(jié)構(gòu)分析和分析各元素的分布,所有六氯鉑酸鈉均為被羥基磷灰石支持的混合物。
(四氯鉑酸鈉·羥基磷灰石抗腫瘤劑)[實(shí)施例4]四氯鉑酸鈉10%·羥基磷灰石90%抗腫瘤劑的調(diào)整原材料1.羥基磷灰石(HAP)2.四氯鉑酸鉀(K2PtCl4)3.氫氧化鈉pH調(diào)整劑4.檸檬酸分散劑在預(yù)先的蒸餾水中添加1g六氯鉑酸鉀,攪拌后,添加氫氧化鈉,將pH調(diào)整成中性域(pH6.8-7.4)。該溶液中添加9g羥基磷灰石,減壓下進(jìn)行攪拌,該溶液中添加蒸餾水,將總量調(diào)整成500ml,在50-60℃的恒溫,在暗處,密封容器中進(jìn)行約1個(gè)月的攪拌。
停止攪拌,用蒸發(fā)器濃縮后,進(jìn)行冷凍干燥,獲得粉末。
在該粉末中加入蒸餾水,將粉末濃度調(diào)整成約2%,進(jìn)而添加用氫氧化鈉將檸檬酸的pH調(diào)整成約7.0的分散劑,使分散劑的濃度調(diào)整成20mM/l。
在濕式分散·粉碎機(jī)Dyno-Mill(瑞士WAB公司制)中,使用用于冷卻的循環(huán)泵,粉碎溫度為3-5℃左右對(duì)該溶液進(jìn)行粉碎,獲得了0.05-0.1μm,平均粒徑約0.07μm的粒子的溶液。
使用用于滅菌的0.22μm的滅菌用過(guò)濾器對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾,獲得了四氯鉑酸鉀·羥基磷灰石抗腫瘤劑(K2PtCl4·HAP)。
該抗腫瘤劑的結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果是,所有四氯鉑酸鉀均為被羥基磷灰石支持的混合物。
此外,通過(guò)同樣的調(diào)整方法,通過(guò)只改變四氯鉑酸鉀和羥基磷灰石的比例,獲得了四氯鉑酸鉀相對(duì)于羥基磷灰石的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
進(jìn)而,獲得了最大粒徑為1μm,平均粒徑約為約0.3μm,四氯鉑酸鉀的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的抗腫瘤劑。
對(duì)于這些抗腫瘤劑,通過(guò)與實(shí)施例1相同的X射線分析和E-MAX的結(jié)構(gòu)分析和分析各元素的分布,所有四氯鉑酸鉀均為被羥基磷灰石支持的混合物。
進(jìn)而,使用四氯鉑酸,四氯鉑酸鈉,六氯鉑酸鉀,羥基磷灰石,進(jìn)行與上述同樣的操作,獲得了最大粒徑為0.1μm與1μm的鉑組合物的比例為0.1%,1%,5%,20%,50%,100%的四氯鉑酸·羥基磷灰石抗腫瘤劑(H2PtCl4·HAP),四氯鉑酸鈉·羥基磷灰石抗腫瘤劑(Na2PtCl4·HAP),六氯鉑酸鉀·羥基磷灰石抗腫瘤劑(K2PtCl6·HAP)。
對(duì)于這些抗腫瘤劑,通過(guò)與實(shí)施例1相同的X射線分析和E-MAX的結(jié)構(gòu)分析和分析各元素的分布,其結(jié)果是所有的鉑化合物均為被羥基磷灰石支持的混合物。
四氯化鉑·羥基磷灰石抗腫瘤劑(PtCl4·HAP),和六氯化鉑酸·羥基磷灰石抗腫瘤劑(H2PtCl6·HAP)對(duì)于人類癌細(xì)胞的效果(MTT檢測(cè))按照常規(guī)的試驗(yàn)方法“使用MTT的體外毒性試驗(yàn)法”,使用19種人類癌細(xì)胞,進(jìn)行PtCl4·HAP(粒徑在0.1μm以下)和H2PtCl6·HAP(粒徑在0.1μm以下)的MTT檢測(cè)。PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP為分別含有理論值10%的鉑的分散液,將最終分散濃度調(diào)整成1.0%,而后使用。作為比較,進(jìn)行PtCl4和CDDP的MTT檢測(cè)。PtCl4在適量溶解后,用PBS(-)分段稀釋后使用。CDDP使用maruko制的注射液。
由MTT檢測(cè)產(chǎn)生的IC50表示于表1。進(jìn)而,將IC50換算成鉑的濃度的數(shù)值示于表2。
此外,對(duì)于粒徑在0.1μm以下和1.0μm以下的四氯鉑酸·羥基磷灰石抗腫瘤劑(H2PtCl4·HAP),六氯鉑酸·羥基磷灰石抗腫瘤劑(H2PtCl6·HAP),四氯鉑酸鈉·羥基磷灰石抗腫瘤劑(Na2PtCl4·HAP),六氯鉑酸鈉·羥基磷灰石抗腫瘤劑(Na2PtCl4·HAP),四氯鉑酸鉀·羥基磷灰石抗腫瘤劑(K2PtCl4·HAP),六氯鉑酸鉀·羥基磷灰石抗腫瘤劑(K2PtCl6·HAP),作為比較的四氯鉑酸(H2PtCl4),六氯鉑酸(H2PtCl6),四氯鉑酸鈉(Na2PtCl4),六氯鉑酸鈉(Na2PtCl6),四氯鉑酸鉀(K2PtCl4),六氯鉑酸鉀(K2PtCl6),使用人類癌細(xì)胞Lu65的IC50示于表3。進(jìn)而,將IC50換算成鉑的濃度的數(shù)值示于表4。
人類癌細(xì)胞中MTT測(cè)試產(chǎn)生的IC50(ppm)
根據(jù)人類癌細(xì)胞中MTT測(cè)試產(chǎn)生的IC50計(jì)算的鉑量(ppm)
人肺癌細(xì)胞Lu65,Lu99中由MTT測(cè)試產(chǎn)生的IC50(ppm)
由人肺癌細(xì)胞Lu65,Lu99中由MTT測(cè)試產(chǎn)生的IC50計(jì)算的鉑量(ppm)(ppm)
(對(duì)于正常細(xì)胞的毒性和殺細(xì)胞效果試驗(yàn))用乙醚深麻醉成熟雄性大鼠,在截面用酒精擦拭其尾消毒。將其尾端部切斷數(shù)cm后,從尾骨除去皮膚。尾骨上附著腱,通過(guò)對(duì)其培養(yǎng),可以回收成纖維細(xì)胞。用滅菌的剪刀將尾骨部減得更細(xì),使其的底部在滅菌的塑料培養(yǎng)皿上在底部附著。靜置一會(huì)兒后,在培養(yǎng)皿中添加添加了10%FBS的DMEM。大概一周,成纖維細(xì)胞從尾骨部萌芽,在培養(yǎng)皿中增殖。從該大鼠尾端收集的成纖維細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)中。
曾殖期中四氯化鉑·羥基磷灰石抗腫瘤劑(PtCl4·HAP)和六氯鉑酸·羥基磷灰石抗腫瘤劑(H2PtCl6·HAP)的毒性試驗(yàn)按照常規(guī)的試驗(yàn)方法“使用MTT的體外毒性試驗(yàn)法”,使用19種人類癌細(xì)胞,進(jìn)行PtCl4·HAP(粒徑在0.1μm以下)和H2PtCl6·HAP(粒徑在0.1μm以下)的MTT檢測(cè)。PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP為分別含有理論值10%的鉑的分散液,將最終分散濃度調(diào)整成1.0%而后使用。作為比較,進(jìn)行PtCl4和CDDP的MTT檢測(cè)。PtCl4在適量溶解后,用PBS(-)分段稀釋后使用。CDDP使用maruko制的注射液。
用胰蛋白酶-EDTA將培養(yǎng)皿上處于增殖期的成纖維細(xì)胞剝離后,在培養(yǎng)基中調(diào)整成1×104個(gè)/ml,將其以平均100ml分注于96孔板上。
將添加了成纖維細(xì)胞的96孔板培養(yǎng)24小時(shí)后,每孔平均添加10μl的用PBS(-)分段稀釋的這些試樣。加入試驗(yàn)試樣48小時(shí)后,在96孔板中添加200μl PBS(-),大概1分鐘后除去所有液體。立刻在板上添加160μlDMSO。但是,在添加PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的板中,分別添加200μlDMSO。各板中。用振蕩器振蕩5分鐘,完全溶解形成的甲月替(formazan)。對(duì)于PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的板,由于認(rèn)為PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的沉淀抑制發(fā)色,因此靜置5分鐘,然后將160μl上清轉(zhuǎn)移至其它的96孔板中。對(duì)于各細(xì)胞,各濃度的試驗(yàn)試樣,進(jìn)行4孔以上的試驗(yàn),用微量培養(yǎng)板進(jìn)行550nm下的吸光度的測(cè)定。
在增殖期中由PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的毒性試驗(yàn)產(chǎn)生的IC50和由IC50換算成鉑的濃度的鉑量示于表5。
增殖期中由PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的毒性試驗(yàn)產(chǎn)生的IC50和由IC50換算成鉑的濃度的鉑量(ppm)
增殖期中的毒性試驗(yàn)的結(jié)果是,CDDP中,IC50為0.5ppm,顯示出強(qiáng)毒性作用,但是PtCl4·HAP的IC50為29.8ppm,H2PtCl6·HAP的IC50為25.2這樣的高值,與PtCl4的4.0ppm相比,值更高,表示沒(méi)有強(qiáng)抑制作用。此外,即使在將其換算成鉑量比較時(shí),PtCl4·HAP的值比PtCl4和CDDP的值高得多,H2PtCl6·HAP的值也比PtCl4和CDDP的值高,表明沒(méi)有強(qiáng)抑制作用。
靜止期中四氯化鉑·羥基磷灰石抗腫瘤劑(PtCl4·HAP)和六氯鉑酸·羥基磷灰石抗腫瘤劑(H2PtCl6·HAP)的毒性試驗(yàn)在96孔板上以通常的兩倍,即2×104個(gè)/ml接種100μl處于靜止期的大鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液,然后,連續(xù)培養(yǎng)72小時(shí),使細(xì)胞處于融合狀態(tài)。在各孔中,用倒立顯放鏡確認(rèn)細(xì)胞達(dá)到完全的融合狀態(tài)后,更換一次各孔的培養(yǎng)基。然后,用上述方法在孔中平均添加10μl的各種經(jīng)分段稀釋的試驗(yàn)試樣。添加后,48小時(shí),連續(xù)培養(yǎng),然后,按照與上述的“增殖期中PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的毒性試驗(yàn)”中所述的方法相同的步驟進(jìn)行PtCl4·HAP(粒徑在0.1μm以下)和H2PtCl6·HAP(粒徑在0.1μm以下)的MTT測(cè)試。
在靜止期中由PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的毒性試驗(yàn)產(chǎn)生的IC50和由IC50換算成鉑的濃度的鉑量示于表6。
靜止期中由PtCl4·HAP和H2PtCl6·HAP的毒性試驗(yàn)產(chǎn)生的IC50和由IC50換算成鉑的濃度的鉑量(ppm)
靜止期中的細(xì)胞由于大部分細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞分裂,鉑侵入細(xì)胞內(nèi),顯示出與DNA的某種作用,阻止其分裂的可能性少,顯示出鉑或藥物本身產(chǎn)生的細(xì)胞毒性,即將細(xì)胞驅(qū)趕至死的效果。此時(shí),CDDP與其它兩種試驗(yàn)紙藥相比,其殺細(xì)胞效果高,純鉑量為1.9ppm。
在該毒性試驗(yàn)的結(jié)果中,CDDP中,IC50為2.9ppm,換算成鉑量時(shí),顯示出1.9ppm這樣的很強(qiáng)的毒性作用,但是PtCl4·HAP的IC50為202.6ppm,即使換算成鉑量時(shí),也為20.3ppm,H2PtCl6·HAP的IC50為160.0ppm,即使換算成鉑量時(shí),也為16.0ppm,與PtCl4,CDDP的值相比,值更高得多,表示細(xì)胞毒性大大降低。
靜止期中毒性效果的顯微鏡觀察根據(jù)實(shí)施例7的結(jié)果,以CDDP使靜止期的成纖維細(xì)胞50%死亡的鉑量2ppm作為基準(zhǔn),對(duì)實(shí)現(xiàn)融合的成纖維細(xì)胞,在培養(yǎng)基中添加相當(dāng)于2ppm鉑量的CDDP,PtCl4·HAP,HtCl4和HAP分散液,培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)細(xì)胞的顯微鏡照片顯示為圖1-圖4。
圖1表示添加了CDDP分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像,圖2表示添加了PtCl4·HAP分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像,圖3表示添加了PtCl4分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像,圖4表示添加了HAP分散液的培養(yǎng)細(xì)胞像。
其結(jié)果是,PtCl4·HAP的添加,不損害成纖維細(xì)胞本來(lái)的形態(tài),大部分細(xì)胞呈紡錘形形狀,緊密連接,呈現(xiàn)出典型的紡錘形。添加PtCl4中,與PtCl4·HAP的情況相同,許多成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形,但是這些細(xì)胞中,觀察到大多數(shù)是圓形細(xì)胞,紡錘形變形的細(xì)胞。添加了CDDP時(shí),呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞本來(lái)的形態(tài)-典型的紡錘形,幾乎無(wú)法觀察到異常。
根據(jù)以上結(jié)果,清楚了添加了混合了氯化鉑,氯化鉑酸類和羥基磷灰石的微粒的抗腫瘤劑的血管內(nèi)給藥,抗腫瘤效果高,并且是一種抗腫瘤的副作用,毒性低的抗腫瘤劑。
工業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明,可以提供副作用少,尤其是對(duì)肺癌顯示出優(yōu)異的抗癌作用的抗腫瘤劑。
權(quán)利要求
1.抗腫瘤組合物,其特征在于使羥基磷灰石上支持至少一種以上的氯化鉑和/或氯鉑酸類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤組合物,其特征在于氯化鉑和氯鉑酸類為四氯化鉑、四氯鉑酸、六氯鉑酸、 四氯鉑酸鈉、六氯鉑酸鈉、四氯鉑酸鉀、六氯鉑酸鉀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗腫瘤組合物,其特征在于羥基磷灰石的最大粒子徑為1μm以下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤組合物,其特征在于羥基磷灰石的最大粒子徑為0.1μm以下。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中所述的抗腫瘤組合物,其特征在于氯化鉑和氯鉑酸類相對(duì)于羥基磷灰石的量為0.1-100%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的抗腫瘤組合物,其特征在于粉碎處理抗腫瘤劑和羥基磷灰石的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的抗腫瘤組合物,其特征在于使用檸檬酸和/或檸檬酸鈉作為分散劑。
全文摘要
抗腫瘤效果高的抗腫瘤劑副作用強(qiáng),如果毒性變低活性也變低,因此未必能獲得令人滿意的一些抗腫瘤效果。因此,希望開(kāi)發(fā)抗腫瘤效果高且抗腫瘤劑的副作用、毒性低的抗腫瘤劑。提供了配合了氯化鉑或氯鉑酸鹽類和羥基磷灰石的微粒的抗腫瘤劑。氯化鉑和氯鉑酸鹽類是四氯化鉑,四氯鉑酸,六氯鉑酸,四氯鉑酸鈉,六氯鉑酸鈉,四氯鉑酸鉀,六氯鉑酸鉀。羥基磷灰石的最大粒子徑為1μm以下。
文檔編號(hào)A61K47/04GK101027067SQ20058003210
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者佐久間周治, 渥美公則, 菊川馨一郎 申請(qǐng)人:三儀股份有限公司