專利名稱：糖抗原的糖基神經(jīng)酰胺佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗佐劑，尤其是用于糖抗原的疫苗佐劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
疫苗常常包含佐劑以增強(qiáng)免疫活性。已知佐劑的例子包括鋁鹽、水包油乳劑、皂苷類、細(xì)胞因子、脂質(zhì)和CpG寡核苷酸。目前，僅有鋁鹽和單磷酰基脂質(zhì)MF59TM被批準(zhǔn)用于人。然而，鋁鹽的安全性受到關(guān)注，并且與一些抗原不相容。因此，需要開發(fā)其它佐劑。
α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)是糖脂，更具體說是糖基神經(jīng)酰胺，最初分離自海綿動物[1]。MHC I類-樣分子CD1d將α-GalCer遞呈到未變異的天然殺傷T細(xì)胞上，起初研究α-GalCer誘導(dǎo)天然殺傷T細(xì)胞對抗腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)的能力[2]。未變異的天然殺傷T細(xì)胞也能誘導(dǎo)B細(xì)胞活化，增強(qiáng)B細(xì)胞增殖和抗體產(chǎn)生[3，4]。近年來證明，α-GalCer能用作各種共同給予的蛋白質(zhì)抗原的佐劑[5]。已證明，α-GalCer與經(jīng)輻射的子孢子或表達(dá)瘧抗原的重組病毒共同給予能提高小鼠的保護(hù)性抗瘧免疫力水平[6]。也證明，α-GalCer可用作編碼HIV-I gag和env基因的DNA疫苗的佐劑[7]。
然而，并非所有疫苗都含有蛋白質(zhì)抗原。幾種市售疫苗含有糖抗原。例如，PneumovaxTM是含有23種肺炎球菌血清型的糖抗原的疫苗。MencevaxTM和MenomuneTM是含有腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)A、C、Y和W-135的糖抗原的腦膜炎球菌疫苗。因此，需要將α-GalCer的佐劑應(yīng)用延伸至糖抗原。
盡管α-GalCer成功用作DNA和蛋白質(zhì)抗原的佐劑，但本發(fā)明者驚訝地發(fā)現(xiàn)，它不能用作一些糖抗原的佐劑。相反，發(fā)現(xiàn)α-GalCer與這些抗原一起給予會導(dǎo)致相對于無佐劑對照抗體滴度顯著降低。本發(fā)明的目的是克服存在α-GalCer時抑制抗-糖抗體應(yīng)答反應(yīng)的問題。

發(fā)明內(nèi)容
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，如果將糖抗原偶聯(lián)于運載體可逆轉(zhuǎn)α-GalCer存在下對抗-糖免疫應(yīng)答的此種抑制，甚至可以增強(qiáng)對糖抗原的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含(a)偶聯(lián)于運載體的糖抗原；和(b)α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑本發(fā)明組合物中包含的佐劑可以是本領(lǐng)域已知的任何合適α-糖基神經(jīng)酰胺。該α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑優(yōu)選為式(I)化合物 式中，R1代表H或OH，X代表1-30的整數(shù)，R2代表選自(a)-(e)的取代基(式中Y代表5-17的整數(shù))；(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3，R3代表H、OH、NH2、NHCOCH3或單糖，R4代表OH或單糖，R5代表H、OH或單糖，R6代表H、OH或單糖，和R7代表H、CH3、CH2OH或單糖。
X優(yōu)選為7-27，更優(yōu)選為9-24，更優(yōu)選為13-20。
Y優(yōu)選為7-15，更優(yōu)選為9-13。
當(dāng)R3是單糖時，它優(yōu)選選自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
當(dāng)R4是單糖時，它優(yōu)選選自β-D-呋喃半乳糖或N-乙酰α-D-吡喃半乳糖。
當(dāng)R5是單糖時，它優(yōu)選選自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
當(dāng)R6是單糖時，它優(yōu)選選自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
當(dāng)R7是單糖時，它優(yōu)選選自甲基α-D-吡喃半乳糖苷、甲基β-D-吡喃半乳糖苷、甲基α-D-吡喃葡糖苷或甲基β-D-吡喃葡糖苷。
優(yōu)選地，R5和R6不同。優(yōu)選地，R5和R6中一個是H。
參考文獻(xiàn)2中提供了適合包含于本發(fā)明組合物中的α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑的其它例子。
α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑優(yōu)選為α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)(即R3＝OH、R4＝OH、R5＝OH、R6＝H和R7＝CH2OH)。本發(fā)明組合物中包含的α-GalCer可直接分離自海綿動物，或者可以是化學(xué)合成產(chǎn)物。參考文獻(xiàn)8中提供了適合用于本發(fā)明組合物的α-半乳糖基神經(jīng)酰胺的例子。優(yōu)選的α-半乳糖基神經(jīng)酰胺是KRN7000，它具有式(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷?；被?-1，3，4-十八烷三醇((2S，3S，4R)-1-O-(α-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1，3，4-octadecanetriol)。參考文獻(xiàn)8中描述了KRN7000的合成。
α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑也可以是α-GalCer的截短類似物，其中與α-GalCer相比脂族?；満?或鞘氨醇鏈被截短。參考文獻(xiàn)9提供了α-GalCer的截短類似物的例子。α-GalCer的優(yōu)選截短類似物是′OCH′，其中與優(yōu)選的α-GalCer相比脂族?；溄囟塘藘蓚€烴基和鞘氨醇鏈截短了9個烴基(即R1＝H，X＝21，R2＝CH(OH)(CH2)4CH3，R3＝OH，R4＝OH，R5＝OH，R6＝H，R7＝CH2OH)。α-GalCer的其它優(yōu)選截短類似物包括與α-GalCer相比脂族酰基鏈截短了兩個烴基和鞘氨醇鏈截短了7個或3個烴基的類似物(即R1＝H，X＝21，R3＝OH，R4＝OH，R5＝OH，R6＝H，R7＝CH2OH，R2是CH(OH)(CH2)6CH3或CH(OH)(CH2)10CH3)。
糖抗原優(yōu)選地，本發(fā)明組合物中包含的偶聯(lián)于運載體的糖抗原是細(xì)菌糖，具體是細(xì)菌莢膜糖。
本發(fā)明組合物中可以包含的細(xì)菌莢膜糖的例子包括來自腦膜炎奈瑟球菌(血清型A、B、C、W135或Y)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(血清型4、6B、9V、14、18C、19F或23F)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(可分型菌株a、b、c、d、e或f)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等的莢膜糖。本發(fā)明組合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白念珠菌(Candida albicans)的葡聚糖)和真菌莢膜糖，如來自新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)莢膜的莢膜糖。
腦膜炎奈瑟球菌血清型A(MenA)莢膜是(α1→6)-連接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，在C3和C4位置上部分O-乙酰化。腦膜炎奈瑟球菌血清型B(MenB)莢膜是(α2→8)-連接的唾液酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清型C(MenC)莢膜糖是(α2→9)連接的唾液酸的均聚物，在7位和/或8位上具有可變的O-乙?；ＤX膜炎奈瑟球菌血清型W135糖是由唾液酸-半乳糖二糖單元[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→]組成的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上具有可變的O-乙?；痆10]。腦膜炎奈瑟球菌血清型Y糖類似于血清型W135糖，除了該二糖重復(fù)單元用葡萄糖代替了半乳糖[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→]。它在唾液酸的7位和9位上也具有可變的O-乙?；?br> B型流感嗜血桿菌莢膜(Hib)糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物[′PRP′，(聚-3-β-D-核糖-(1，1)-D-核糖醇-5-磷酸)]。
本發(fā)明組合物可含有糖抗原偶聯(lián)物的混合物。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物包含來自一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清型的糖抗原，如，組合物可含有來自血清型A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選組合物包含來自血清型C和Y的糖偶聯(lián)物。其它優(yōu)選組合物包含來自血清型C、W135和Y的糖偶聯(lián)物。
當(dāng)混合物包含來自血清型A的腦膜炎球菌糖和至少一種其它血清型糖時，MenA糖與任何其它血清型糖的比率(w/w)可能大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。來自血清型A∶C∶W135∶Y的糖的優(yōu)選比率(w/w)為1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。
本發(fā)明的其它優(yōu)選組合物包含Hib糖偶聯(lián)物和來自至少一種腦膜炎奈瑟球菌血清型，優(yōu)選來自一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清型的糖偶聯(lián)物。例如，本發(fā)明組合物可包含Hib偶聯(lián)物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的偶聯(lián)物。
本發(fā)明還包括包含肺炎鏈球菌糖偶聯(lián)物的組合物。該組合物優(yōu)選包含來自一種以上肺炎鏈球菌血清型的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選組合物包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯(lián)物(7價)。組合物還可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1和5的糖偶聯(lián)物(9價)或可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、3和7F的糖偶聯(lián)物(11價)。
其它優(yōu)選的本發(fā)明組合物包含肺炎球菌糖偶聯(lián)物和來自Hib和/或腦膜炎奈瑟球菌的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯(lián)物和Hib糖偶聯(lián)物。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯(lián)物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的糖偶聯(lián)物。本發(fā)明組合物也可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯(lián)物，Hib糖偶聯(lián)物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的糖偶聯(lián)物。
優(yōu)選的是，組合不會去除單個糖抗原偶聯(lián)物的保護(hù)功效，盡管可能降低實際免疫原性(如ELISA滴度)。
莢膜糖抗原的制備莢膜糖抗原的制備方法是熟知的。例如，參考文獻(xiàn)11描述了腦膜炎奈瑟球菌的糖抗原的制備。參考文獻(xiàn)12的第14章描述了流感嗜血桿菌的糖抗原的制備。本領(lǐng)域描述了肺炎鏈球菌的糖抗原和偶聯(lián)物的制備。例如，PrevenarTM是7-價肺炎球菌偶聯(lián)物疫苗。參考文獻(xiàn)13和14中詳細(xì)描述了無乳鏈球菌的糖抗原的制備方法。
可化學(xué)修飾糖抗原。例如，可修飾它們，以用封端基團(tuán)取代一個或多個羥基。這尤其可用于腦膜炎球菌血清型A，可用封端基團(tuán)取代乙?；苑乐顾鈁15]。這種修飾糖仍然是本發(fā)明含義內(nèi)的血清型A糖。
莢膜糖可以寡糖形式應(yīng)用。通過純化的莢膜多糖的片段化(如通過水解)方便地形成寡糖，片段化后通常純化所需大小的片段。
優(yōu)選進(jìn)行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最終小于30?？赏ㄟ^離子交換色譜或比色測定方便地測定DP[16]。
如果進(jìn)行水解，通常對水解產(chǎn)物進(jìn)行篩分，以去除短鏈寡糖[17]?？捎酶鞣N方式，如超濾后進(jìn)行離子交換色譜實現(xiàn)此目的。對于血清型A，優(yōu)選去除聚合程度小于或等于約6的寡糖，對于血清型W135和Y，優(yōu)選去除聚合程度小于約4的寡糖。
運載體運載體優(yōu)選蛋白質(zhì)。本發(fā)明組合物中糖抗原偶聯(lián)的優(yōu)選運載體蛋白是細(xì)菌毒素，如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。合適的運載體蛋白包括白喉毒素的CRM197突變體[18-20]、白喉類毒素、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[21]、合成肽[22，23]、熱激蛋白[24，25]、百日咳蛋白[26，27]、細(xì)胞因子[28]、淋巴因子[28]、激素[28]、生長因子[28]、包含多個來自各種病原體衍生抗原的人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[29]如N19蛋白[30]、流感嗜血桿菌的蛋白D[31，32]、肺炎球菌表面蛋白PspA[33]、肺炎鏈球菌溶血素[34]、攝鐵蛋白[35]、艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[36]等。
優(yōu)選通過(例如)運載體蛋白中賴氨酸殘基或精氨酸殘基側(cè)鏈中的-NH2基團(tuán)將糖抗原連接于運載體。當(dāng)糖具有游離醛基時，它可與運載體中的胺反應(yīng)，通過還原性胺化形成偶聯(lián)物。也可通過(例如)半胱氨酸殘基側(cè)鏈中的-SH基團(tuán)進(jìn)行連接。
當(dāng)該組合物含有一種以上糖抗原時，可能(例如)采用一種以上運載體，以降低運載體抑制的風(fēng)險。因此，不同運載體可用于不同糖抗原，如腦膜炎奈瑟球菌血清型A糖可偶聯(lián)于CRM197，而C型糖可偶聯(lián)于破傷風(fēng)類毒素。也可能將一種以上運載體用于一種具體糖抗原。糖可分為兩類，一些偶聯(lián)于CRM197，另外一些偶聯(lián)于破傷風(fēng)類毒素。然而，通常，優(yōu)選對所有糖采用相同運載體。
一種運載體蛋白可攜帶一種以上糖抗原[37，38]。例如，一種運載體蛋白偶聯(lián)的糖可以來自不同病原體或來自同一病原體的不同血清型。為了實現(xiàn)這個目標(biāo)，可在偶聯(lián)反應(yīng)前混合不同糖。然而，通常，優(yōu)選使各血清型形成不同偶聯(lián)物，偶聯(lián)后混合不同糖。不同偶聯(lián)物可基于同一種運載體。
優(yōu)選糖蛋白比率(w/w)為1∶5(即蛋白質(zhì)過量)-5∶1(即糖過量)的偶聯(lián)物。優(yōu)選比率為1∶2-5∶1，以及1∶1.25-1∶2.5。
偶聯(lián)物可與游離運載體聯(lián)用[39]。當(dāng)給定的運載體蛋白以游離和偶聯(lián)形式存在于本發(fā)明組合物中時，未偶聯(lián)形式優(yōu)選不多于組合物中運載體蛋白總量的5％，更優(yōu)選小于2重量％。
偶聯(lián)后，可分離游離和偶聯(lián)的糖。有許多合適的方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等[也參見參考文獻(xiàn)40和41等]。
可采用任何合適的偶聯(lián)反應(yīng)，需要時使用任何合適接頭。
一般在偶聯(lián)之前使糖活化或官能化?；罨砂?例如)氰基化試劑如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[42，43等])。其它合適技術(shù)采用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也參見參考文獻(xiàn)44的引言)。
可用任何已知方法，如參考文獻(xiàn)45和46所述的方法通過接頭基團(tuán)進(jìn)行連接。一種連接類型包括多糖的還原性胺化，將得到的胺基與己二酸接頭基團(tuán)的一端偶聯(lián)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于該己二酸接頭基團(tuán)的另一端[47，48]。其它接頭包括B-丙酰胺基[49]、硝基苯基-乙基胺[50]、鹵代?；u化物[51]、配糖鍵[52]、6-氨基己酸[53]、ADH[54]、C4-C12部分[55]等。作為采用接頭的替代方式，可以采用直接連接。直接連接蛋白質(zhì)可包括多糖的氧化，然后用蛋白質(zhì)還原性胺化，如參考文獻(xiàn)56和57所述。
優(yōu)選包括以下步驟的方法將氨基引入糖(如通過用-NH2取代末端＝O基團(tuán))，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生化，并與運載體蛋白反應(yīng)。
偶聯(lián)后，可分離游離和偶聯(lián)的糖。有許多合適的方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等[也參見參考文獻(xiàn)58和59等]。
當(dāng)本發(fā)明組合物包含解聚的糖時，優(yōu)選在偶聯(lián)之前進(jìn)行解聚。
本發(fā)明組合物的其它抗原性組分本發(fā)明組合物至少包含一種偶聯(lián)于運載體的糖抗原。然而，除上述偶聯(lián)于運載體的糖抗原以外，本發(fā)明組合物可包含一種或多種以下抗原-腦膜炎奈瑟球菌血清型B的蛋白抗原，如參考文獻(xiàn)60-66所述，尤其優(yōu)選蛋白′287′(見下)和衍生物(如′ΔG287′)。
-腦膜炎奈瑟球菌血清型B的外膜泡囊(OMV)制劑，如參考文獻(xiàn)67、68、69、70等所述。
-肺炎鏈球菌(如PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp133，如參考文獻(xiàn)71所述)的蛋白抗原。
-甲肝病毒，如失活病毒的抗原[如72、73；參考文獻(xiàn)78的第15章]。
-乙肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原[如73、74；參考文獻(xiàn)78的第16章]。
-丙肝病毒抗原[如75]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，也任選地與百日咳桿菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3聯(lián)用[如參考文獻(xiàn)76和77；參考文獻(xiàn)78的第21章]。
-白喉抗原，如白喉類毒素[如參考文獻(xiàn)78的第13章]。
-破傷風(fēng)抗原，如破傷風(fēng)類毒素[如參考文獻(xiàn)78的第27章]。
-淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)抗原[如60、61、62]。
-肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)抗原[如79、80、81、82、83、84、85]。
-沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)抗原[如86]。
-牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[如87]。
-脊髓灰質(zhì)炎抗原[如88，89；參考文獻(xiàn)78的第24章]如IPV。
-狂犬病抗原[如90]如凍干的失活病毒[如91，RabAvertTM]。
-麻疹、腮腺炎和/或風(fēng)疹抗原[如參考文獻(xiàn)78的第19、20和26章]。
-幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)抗原如CagA[92-95]、VacA[96、97]、NAP[98、99、100]、HopX[如101]、HopY[如101]和/或脲酶。
-流感抗原[如參考文獻(xiàn)78的第17和18章]，如血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。
-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[如102]。
-無乳鏈球菌(B型鏈球菌)的蛋白抗原[如103、104]。
-釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A型鏈球菌)的抗原[如104、105、106]。
-金黃色葡萄球菌抗原[如107]。
-副粘病毒如呼吸道合胞病毒(RSV[108、109])和/或副流感病毒(PIV3[110])的抗原。
-炭疽桿菌(Bacillus anthracis)抗原[如111、112、113]。
-黃病毒屬病毒，如黃熱病病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒的四種血清型、蜱傳播性腦炎病毒、西尼羅河病毒的抗原。
-瘟病毒抗原，如經(jīng)典的豬熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒和/或邊界病病毒的抗原。
-細(xì)小病毒，如細(xì)胞病毒B19的抗原。
該混合物可包含一種或多種這些其它抗原，需要時可對它們進(jìn)行解毒(如用化學(xué)和/或遺傳方法使百日咳毒素解毒)。
當(dāng)該混合物中包含白喉抗原時，也優(yōu)選包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。相似地，當(dāng)包含破傷風(fēng)抗原時，也優(yōu)選包含白喉和百日咳抗原。相似地，當(dāng)包含百日咳抗原時，也優(yōu)選包含白喉和破傷風(fēng)抗原。
混合物中各抗原的濃度一般是至少1μg/ml。通常，任何給定抗原的濃度將足以引起抗該抗原的免疫應(yīng)答。
作為混合物中采用蛋白抗原的替代方式，可采用編碼該抗原的核酸。因此，混合物的蛋白質(zhì)組分可被編碼該蛋白的核酸(優(yōu)選DNA，如質(zhì)粒形式)取代。相似地，本發(fā)明組合物可包含模擬糖抗原的蛋白質(zhì)如模擬表位[114]或抗-獨特型抗體。
藥物組合物的制劑本發(fā)明偶聯(lián)物和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑尤其適合包含在免疫原性組合物和疫苗中。因此，本發(fā)明方法可包括將偶聯(lián)物和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑制成免疫原性組合物或疫苗的步驟。本發(fā)明提供了可用此方式獲得的組合物或疫苗。
除偶聯(lián)于運載體蛋白的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑以外，本發(fā)明免疫原性組合物和疫苗一般包含′藥學(xué)上可接受的運載體′，其包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何運載體。合適運載體一般是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[115]、脂質(zhì)聚集體(如油滴或脂質(zhì)體)和失活的病毒顆粒。這些運載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。疫苗也可含有稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助性物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖性物質(zhì)等。藥學(xué)上可接受的賦形劑的全面討論見參考文獻(xiàn)116。
用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的糖抗原，以及所需的任何其它上述組分?！涿庖哂行Я俊渲敢詥蝿┝炕蛞幌盗袆┝康囊徊糠纸o予個體的量能有效治療或預(yù)防。該量依待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類組(例如，非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的制劑、主治醫(yī)生對醫(yī)學(xué)狀況的評價和其它相關(guān)因素而不同。預(yù)計該量屬于可由常規(guī)試驗確定的相對寬的范圍。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強(qiáng)劑量)。
該疫苗可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)用。在本發(fā)明免疫原性組合物中，α-糖基神經(jīng)酰胺用作佐劑。疫苗可包含其它佐劑。這些佐劑包括但不限于A.含有礦物質(zhì)的組合物本發(fā)明中適合用作佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽類，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦物鹽，例如氫氧化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如，參見參考文獻(xiàn)117的第8和9章]，或不同無機(jī)化合物的混合物，化合物可采用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優(yōu)選吸附性化合物。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒[118]。
磷酸鋁佐劑一般是無定形羥基磷酸鋁，PO4/Al摩爾比為0.84-0.92，包括約0.6mgAl3+/ml?？刹捎玫蛣┝苛姿徜X吸附，如50-100μgAl3+/偶聯(lián)物/劑。采用磷酸鋁并且不需要將抗原吸附于佐劑時，在溶液中包含游離的磷酸根離子(如采用磷酸鹽緩沖液)比較有利。
B.油乳劑適合用作發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳劑，如MF59[參考文獻(xiàn)117的第10章；也參見參考文獻(xiàn)119](5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span 85，用微流化機(jī)制成亞微米顆粒)。也可使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。
C.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)117的第22章]皂苷制劑也可用作本發(fā)明佐劑。皂苷是在大量植物種類的樹皮、葉、莖干、根和甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜糖苷的異源組合。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹(Quillaia saponaria)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質(zhì)制劑如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了使用這些技術(shù)純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優(yōu)選是QS21。生成QS21的方法參見參考文獻(xiàn)120。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[121]。
皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻(xiàn)117的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于ISCOM。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻(xiàn)121-123中進(jìn)一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[124]。
開發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻(xiàn)125和126。
D.病毒小體和病毒樣顆粒病毒小體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含一種或多種任選地與磷脂組合或配制入磷脂中的病毒蛋白。它們通常是非病原性、非復(fù)制性的，通常不含任何天然病毒基因組?？捎弥亟M方法產(chǎn)生或從全病毒分離得到這種病毒蛋白。這些適用于病毒小體或VLP中的病毒蛋白包括來源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Qβ-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在參考文獻(xiàn)127-132中有進(jìn)一步描述。病毒小體在(例如)參考文獻(xiàn)133中有進(jìn)一步描述。
E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如腸細(xì)菌的脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物。
LPS的無毒衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和3-O-脫酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A與4、5或6?；湹幕旌衔?。3脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A的優(yōu)選“小顆?！毙问揭妳⒖嘉墨I(xiàn)134中所述。3dMPL的這種“小顆粒”小到足以在除菌過濾時通過0.22μm膜[134]。其它無毒LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物如RC-529[135，136]。
脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)，如OM-174的脂質(zhì)A衍生物。(例如)參考文獻(xiàn)137和138中描述了OM-174。
適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結(jié)構(gòu)或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。
CpG可包含核苷酸修飾/類似物如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn)139、140和141公開了可能的類似取代，例如用2’-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻(xiàn)142-147中進(jìn)一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。
CpG序列可能導(dǎo)向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[148]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，例如CpG-A ODN，或它可更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-B ODN。參考文獻(xiàn)149-151中討論了CpG-A和CpG-B ODN。CpG優(yōu)選為CpG-AODN。
優(yōu)選地，構(gòu)建CpG寡核苷酸時使其5’端可為受體所識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3’端相連接形成“免疫聚體”。參見例如，參考文獻(xiàn)148和152-154。
細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選地，該蛋白獲自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。參考文獻(xiàn)155中描述了將解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻(xiàn)156中描述了將用作胃腸外佐劑。毒素和類毒素優(yōu)選包括A和B亞單位的全毒素形式。優(yōu)選地，A亞單位含有解毒突變；B亞單位優(yōu)選不突變。佐劑優(yōu)選是解毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻(xiàn)157-164中描述了將ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。氨基酸取代基的編號優(yōu)選根據(jù)參考文獻(xiàn)165中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對比，該參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容被特別納入本文作為參考。
F.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[166]等)[167]、干擾素(例如干擾素-γ)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。
G.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質(zhì)酸微球[168]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[169]。
H.微粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。由可生物降解和無毒材料(例如聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即直徑約100nm-150μm，更優(yōu)選直徑約200nm-30μm，最優(yōu)選直徑約500nm-10μm的微粒)，微粒經(jīng)任選處理而具有帶負(fù)電的表面(例如用SDS處理)或正電荷表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。
I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)117第13和14章)適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見參考文獻(xiàn)170-172所述。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適合用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[173]。這種制劑還包含聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑和辛苯糖醇[174]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[175]的混合物。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steoryl ether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)參考文獻(xiàn)176和177中描述了PCPP制劑。
L.胞壁酰肽適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。
M.咪唑喹諾酮(Imidazoquinolone)化合物適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，見參考文獻(xiàn)178和179所述。
本發(fā)明也包括一種或多種上述佐劑的組合。例如，本發(fā)明中可使用以下佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑[180]；(2)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)[181]；(3)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選地+甾醇)[182]；(5)3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[183]；(6)SAF，含10％角鯊?fù)椤?.4％吐溫80TM、5％普流羅尼嵌段聚合物L(fēng)121，及thr-MDP，經(jīng)微流體化成為亞微米乳劑或經(jīng)渦旋產(chǎn)生粒度較大的乳劑；(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi Immunochem)含2％角鯊?fù)椤?.2％吐溫80以及單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)中一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)；以及(8)一種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+LPS無毒衍生物(例如3dMPL)。
參考文獻(xiàn)117第7章中公開了用作免疫刺激劑的其它物質(zhì)。
醫(yī)學(xué)方法和用途配制好后，可將本發(fā)明組合物直接給予對象。待治療對象可以是動物；具體說，可治療人類對象。該疫苗尤其可用于接種兒童和青少年?？赏ㄟ^全身和/或粘膜途徑遞送它們。
一般將該免疫原性組合物制備為注射劑，如溶液或懸液；也可制備適合在注射前用液體載體溶解或懸浮的固體形式。也可將該制劑乳化或包裹在脂質(zhì)體中，以增強(qiáng)佐劑作用。通常通過胃腸道外(如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射，或遞送至組織間隙)直接遞送該組合物。也可將該組合物給予傷口。其它給藥方式包括口服和肺部給藥、栓劑、以及透皮或經(jīng)皮施用(參見例如參考文獻(xiàn)184)、針頭和無針注射器。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強(qiáng)劑量)。
本發(fā)明疫苗優(yōu)選無菌。它們優(yōu)選為無熱原。優(yōu)選將它們緩沖至(例如)pH 6-pH 8，通常約pH 7。當(dāng)疫苗包含氫氧化鋁鹽時，優(yōu)選采用組氨酸緩沖液[185]。
本發(fā)明疫苗可包含低水平(如＜0.01％)的去污劑(如吐溫，如吐溫80)。本發(fā)明疫苗可包含(如)約15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是在凍干情況下。
可憑經(jīng)驗評價單一抗原的最優(yōu)劑量。然而，通常，將以每劑每種糖0.1-100μg的劑量給予本發(fā)明糖抗原，劑量體積一般是0.5ml。劑量一般是每劑每種糖5-20μg。這些值均以糖計。
本發(fā)明疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性(即在感染后治療疾病)，但一般是預(yù)防性。
本發(fā)明提供了藥用的偶聯(lián)于運載體蛋白的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
本發(fā)明也提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予患者本發(fā)明疫苗。具體說，本發(fā)明提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予患者偶聯(lián)于運載體的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選為使患者保護(hù)性抵抗腦膜炎球菌病、肺炎球菌病或流感嗜血桿菌，可包括體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答?；颊呖梢允浅扇嘶騼和?。患者年齡可以是0-6月、6-12月、1-5歲、5-15歲、15-55歲或大于55歲。患者優(yōu)選為兒童。在已經(jīng)用腦膜炎球菌、肺炎球菌或流感嗜血桿菌初敏的患者中，該方法可產(chǎn)生增強(qiáng)應(yīng)答。
可同時、連續(xù)或分別給予糖抗原偶聯(lián)物和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。例如，可在給予糖抗原偶聯(lián)物之前或給予糖抗原偶聯(lián)物之后給予α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑以致敏哺乳動物，加強(qiáng)該哺乳動物對該偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答。在給予一種以上糖抗原偶聯(lián)物時，可同時給予α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑，其中分別、同時或連續(xù)給予α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑與糖抗原偶聯(lián)物混合物。
產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法可包括給予第一劑量的偶聯(lián)于運載體的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑，隨后任選給予無佐劑第二劑量的偶聯(lián)于運載體的糖抗原?？赏瑫r、連續(xù)或分別給予第一劑量的糖抗原偶聯(lián)物和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
本發(fā)明也提供偶聯(lián)于運載體的糖抗原在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中所述藥物與α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑一起給予。
本發(fā)明也提供α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中所述藥物與偶聯(lián)于運載體的糖抗原一起給予。
本發(fā)明也提供偶聯(lián)于運載體的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
本發(fā)明也提供偶聯(lián)于運載體的糖抗原在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中患者經(jīng)α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑預(yù)治療。
本發(fā)明還提供α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中患者經(jīng)偶聯(lián)于運載體的糖預(yù)治療。
本發(fā)明也提供偶聯(lián)于運載體的糖抗原在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥物在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中所述患者經(jīng)偶聯(lián)于運載體的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑預(yù)治療。
所述藥物優(yōu)選為免疫原性組合物(如疫苗)。所述藥物優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血癥、淋病等)、流感嗜血桿菌引起的疾病(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血癥、肺炎等)。因此，優(yōu)選預(yù)防和/或治療細(xì)菌性腦膜炎。
可用標(biāo)準(zhǔn)動物模型檢測疫苗(參見例如參考文獻(xiàn)186)。
本發(fā)明還提供了一種藥盒，其包括a)偶聯(lián)于運載體的糖抗原和b)α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
定義術(shù)語“含有”包括“包含”以及“由...組成”，例如“含有”X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。
與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語“約”表示，例如x±10％。
術(shù)語“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可完全不含Y?！盎旧稀笨梢曅枰獜谋景l(fā)明定義中省去。
附圖簡要說明

圖1A)用肺炎鏈球菌多糖與或不與α-GalCer組合的小鼠免疫方案。用1)PBS、2)0.1μg α-GalCer，3)3.5μg-10μg獲自肺炎鏈球菌23種不同血清型的多糖的混合物(Streptopur)或4)3.5μg-10μg Streptopur(SP)和0.1μg α-GalCer，免疫四組六周齡雌性小鼠(C57L/6WT、CD1d+/-、CD1d-/-或JA18-/-)。用50μl體積進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫。初敏4天、8天和12天后(4dp1、8dp1、12dp1)將小鼠放血，用ELISA測定血液中抗肺炎鏈球菌的抗體水平。初敏10周或12周后，用僅3.5μg-10μg SP的加強(qiáng)劑量免疫所有小鼠。加強(qiáng)4天、8天和12天后(4dp2、8dp2、12dp2)將小鼠放血，用ELISA測定血液中抗肺炎鏈球菌的抗體水平。初敏18-22周后，處死小鼠并用Elispot測定肺炎鏈球菌特異性B細(xì)胞的數(shù)量。
B)用肺炎鏈球菌多糖與或不與α-GalCer組合的小鼠免疫方案。如圖1A，但免疫采用3.5μgSP的50μl溶液。
C)用單獨的、與蛋白質(zhì)運載體偶聯(lián)或混合的不同多糖，與和不與α-GalCer組合的小鼠免疫方案。在第0天用1)PBS，2)0.1μg與α-GalCer組合，3)10μg MenC多糖，4)20μg CRM蛋白質(zhì)運載體，5)30μg MenC-CRM偶聯(lián)物，6)與CRM蛋白質(zhì)運載體混合的10μg MenC多糖，或3)-6)和α-GalCer的組合物(第7-10組)，使10組野生型C57BL/6小鼠初敏。初敏2周和4周后，用與初敏所用相同的組合物加強(qiáng)免疫小鼠。初敏2、4和6周后(2wp1、2wp2和2wp3)，將小鼠放血，測定抗MenC多糖和CRM運載體的抗體水平。
圖2與僅用Streptopur初敏的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的小鼠肺炎鏈球菌-特異性抗體滴度較低。顯示了僅用3.5μg Streptopur(SP)(黑柱)或用3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer(白柱)初敏后4天、8天和12天小鼠的肺炎鏈球菌-特異性IgM滴度(幾何平均數(shù))。(*指對僅有SP的p＜0.05，**指對僅有SP的p＜0.01)。
圖3與僅用Streptopur初敏和加強(qiáng)的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏并用Streptopur加強(qiáng)的小鼠肺炎鏈球菌特異性抗體滴度較低。A)用3.5-11.5μgStreptopur和PBS初敏后8天(黑色)或用3.5-11.5μg Streptopur和0.1μgα-GalCer初敏后8天(灰色)小鼠的肺炎鏈球菌特異性IgM滴度(幾何平均數(shù))的變化。(這些數(shù)據(jù)來自四次實驗)。B)用3.5-11.5μg Streptopur加強(qiáng)后8天，同一小鼠的肺炎鏈球菌特異性IgM滴度(幾何平均數(shù))的變化。(這些數(shù)據(jù)來自所進(jìn)行的實驗18、19和29)。用黑色表示用3.5-11.5μg Streptopur初敏的小鼠的結(jié)果，用灰色表示用3.5μg Streptopur和0.1μgα-GalCer初敏的小鼠的結(jié)果。
圖4與用PBS初敏并用Streptopur加強(qiáng)的小鼠相比，用α-GalCer初敏并用Streptopur加強(qiáng)的小鼠中每106脾細(xì)胞中肺炎鏈球菌特異性B細(xì)胞數(shù)量較低。在第0天用0.1μg或1.0μg α-GalCer(aGC)初敏兩組小鼠，12周后用11.5μg Streptopur(SP)免疫。在第0天用PBS免疫第三組小鼠，12周后用11.5μg SP 12免疫。在第0天和12周后用PBS免疫第四組小鼠12。初敏22周后，處死小鼠，用Elispot測定每106脾細(xì)胞中肺炎鏈球菌特異性B細(xì)胞的數(shù)量。
圖5α-GalCer增強(qiáng)抗MenC-CRM偶聯(lián)物中MenC多糖和CRM蛋白質(zhì)運載體的特異性抗體應(yīng)答。用10μg MenC多糖、20μg CRM蛋白質(zhì)運載體、10μg與CRM蛋白質(zhì)運載體混合的MenC多糖(MenC+CRM)或30μg MenC-CRM偶聯(lián)物，或者含α-GalCer的相同組合物初敏野生型小鼠。初敏后2周和4周，用與初敏所用相同的組合物加強(qiáng)免疫小鼠。該圖上面一排顯示了第二次免疫后1周(1wp2)和第二次免疫后2周(2wp2)用單獨的MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯(lián)物(黑色)或MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯(lián)物和α-GalCer(灰色)免疫的小鼠的MenC特異性Ig滴度。該圖的第二排顯示了第二次免疫后2周(2wp2)和第三次免疫后2周(2wp3)用單獨的MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯(lián)物(黑色)或MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯(lián)物和α-GalCer(灰色)免疫的小鼠的CRM-特異性Ig滴度。
圖6α-GalCer增強(qiáng)對Men A-CRM偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答。用10μg MenA多糖或MenA-CRM偶聯(lián)物與或不與α-GalCer組合免疫小鼠。在初敏后4天、8天和12天測定抗MenA多糖的抗體滴度，α-GalCer增強(qiáng)了對MenA多糖的免疫應(yīng)答。
圖7用α-GalCer和MenC-CRM偶聯(lián)物免疫的小鼠中抗體應(yīng)答增強(qiáng)。用30μgMenC-CRM偶聯(lián)物與PBS(黑色)或α-GalCer的混合物免疫小鼠。各組小鼠免疫三次。在第二次免疫后1周(1wp2)和第三次免疫后1周(1wp3)測定MenC特異性滴度。
圖8α-GalCer誘導(dǎo)對肺炎鏈球菌多糖反應(yīng)的抑制需要未變異的NKT細(xì)胞。在A)野生型小鼠、B)Ja18-/-小鼠、C)mCD1d-/-小鼠和D)mCD1d-/+小鼠中，比較僅用3.5μg SP(灰色標(biāo)識)或3.5μg SP和0.1μg α-GalCer(黑色標(biāo)識)初敏小鼠后4天、8天和12天，肺炎鏈球菌特異性抗體的水平。與用Streptopur與α-GalCer組合免疫的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠相比，僅用Streptopur免疫的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠的抗體滴度沒有顯著性差異。
圖9未變異的NKT細(xì)胞對肺炎鏈球菌多糖的抗體應(yīng)答有負(fù)調(diào)節(jié)作用。比較了按照圖1B所示方案僅用Streptopur初敏后4天、8天和12天小鼠的肺炎鏈球菌-特異性抗體(IgM滴度，幾何平均數(shù))水平。圖9A比較了C57野生型小鼠的抗體滴度(方形)與C57mCD1d+/-小鼠的抗體滴度(三角形)。圖9B比較了C57野生型小鼠的抗體滴度(方形)與C57mCD1d-/-小鼠的抗體滴度(三角形)。圖9C比較了C57野生型小鼠的抗體滴度(方形)與C57Ja281-/-小鼠的抗體滴度(圓形)。野生型小鼠的抗體滴度低于Ja18-/-、CD1-/-和CD1+/-小鼠。
圖10在3-8周齡小鼠中，α-GalCer抑制對Streptopur的免疫應(yīng)答。僅用3.5μgStreptopur(SP)(白色)或用3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer(黑色)使2周齡(2W)、3周齡(3W)、4周齡(4W)、5周齡(5W)和6-8周齡(6-8W)的小鼠初敏后8天，比較肺炎鏈球菌特異性IgM抗體(幾何平均數(shù))水平。
圖11用α-GalCer和Hib-HSA偶聯(lián)物免疫的小鼠中抗體應(yīng)答增強(qiáng)。用15μgHib-人血清白蛋白(Hib-HSA)偶聯(lián)物與PBS(結(jié)果太低，以致于不能檢測到)、α-GalCer(陰影)或MF59(灰色)的混合物免疫小鼠。各組小鼠免疫三次。在第二次免疫后1周(1wp2)和第三次免疫后1周(1wp3)測定Hib-特異性滴度。
實施本發(fā)明的方式實施例1α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應(yīng)答用1)PBS、2)0.1μg α-GalCer、3)3.5-10μg獲自肺炎鏈球菌的23種不同血清型的23種多糖的混合物(Streptopur)或4)3.5-10μg Streptopur和0.1μg α-GalCer免疫四組(每組五只)六周齡雌性小鼠(品系C57BL/6)。用100μl體積進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫。所有四組小鼠在12周后用3.5-10μg Streptopur加強(qiáng)免疫。免疫方案見圖1A。
初敏后4天、8天和12天和加強(qiáng)免疫后4天、8天和12天，將小鼠放血，用ELISA測定血液中肺炎鏈球菌特異性抗體的水平。與僅用Streptopur初敏的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的小鼠顯示出肺炎鏈球菌特異性抗體滴度降低(圖2和3)，特別是給予第一個劑量之后(圖3A)，這表明α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應(yīng)答。
18-22周后，處死小鼠并用Elispot測定其脾臟中肺炎鏈球菌特異性B細(xì)胞的數(shù)量。與用PBS初敏并用Streptopur加強(qiáng)的小鼠脾臟相比，用α-GalCer初敏并用Streptopur加強(qiáng)的小鼠脾臟中肺炎鏈球菌特異性B細(xì)胞的含量也較少(圖4)。這些結(jié)果都提示，α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應(yīng)答。
進(jìn)行進(jìn)一步實驗，以評價在Streptopur和α-GalCer免疫的小鼠中觀察到對肺炎鏈球菌多糖較低的抗體應(yīng)答是否需要未變異的天然殺傷T細(xì)胞。用1)PBS、2)0.1μgα-GalCer、3)3.5μg Streptopur(SP)或4)3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer，免疫四組六周齡雌性小鼠(C57L/6WT、CD1d+/-、CD1d-/-或JA18-/-)。用50μl體積進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫。初敏后4天、8天和12天將小鼠放血，用ELISA測定血液中肺炎鏈球菌特異性抗體的水平。免疫方案見圖1B。
與僅用Streptopur初敏的CD57L/6野生型小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的C57L/6野生型小鼠顯示出肺炎鏈球菌特異性抗體滴度降低(圖8A)，這驗證了α-GalCer抑制對肺炎鏈球菌糖抗原的免疫應(yīng)答。
相反，與僅用Streptopur初敏的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠相比，用Streptopur與α-GalCer初敏的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠的肺炎鏈球菌-特異性抗體滴度沒有顯著性差異(圖8B-D)。這些結(jié)果提示，α-GalCer-誘導(dǎo)的對肺炎鏈球菌糖應(yīng)答的抑制需要未變異的NKT細(xì)胞。
與僅用Streptopur初敏的JA218-/-、CD1d-/-和CD1d-/+的抗體滴度相比，僅用Streptopur而不用α-GalCer初敏的C57L/6野生型小鼠的肺炎鏈球菌-特異性抗體滴度較低(圖9)。這些結(jié)果提示，即使在沒有α-GalCer的情況下，未變異的NKT細(xì)胞可能對肺炎鏈球菌糖的抗體應(yīng)答有負(fù)面作用，在α-GalCer存在下進(jìn)一步加強(qiáng)此負(fù)面作用。
進(jìn)一步實驗證明，也在6-8周齡的小鼠中觀察到，α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應(yīng)答(圖10)。
實施例2a-GalCer能增強(qiáng)對糖抗原偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答與α-GalCer和肺炎鏈球菌的糖抗原(Streptopur)一起給予時觀察到抗體滴度降低相反，給予α-GalCer增強(qiáng)對偶聯(lián)于運載體蛋白的糖抗原的抗體應(yīng)答。
用Hib-人血清白蛋白偶聯(lián)物(Hib-HSA)和α-GalCer免疫的小鼠顯示出的Hib-特異性Ig滴度比用Hib-HSA偶聯(lián)物和PBS免疫的小鼠高很多(圖11)。相似地，與用MenC-CRM偶聯(lián)物和PBS免疫的小鼠相比，用MenC-CRM偶聯(lián)物和α-GalCer免疫顯示出MenC-特異性Ig滴度顯著增加(圖7，按照圖1C方案進(jìn)行免疫)。
如圖5所示，雖然在僅用MenC免疫的小鼠中未曾觀察到對MenC的抗體應(yīng)答，但與用MenC-CRM偶聯(lián)物和PBS免疫的小鼠相比，用MenC-CRM偶聯(lián)物和α-GalCer免疫的小鼠顯示出MenC特異性抗體滴度顯著增加?；旌夕?GalCer與偶聯(lián)物增強(qiáng)了對糖和偶聯(lián)物的抗體應(yīng)答。
用MenA-CRM偶聯(lián)物和α-GalCer進(jìn)行免疫也導(dǎo)致MenA特異性Ig滴度增加(圖6)。然而在同時進(jìn)行的實驗中，沒有觀察到α-GalCer對未偶聯(lián)MenA糖的強(qiáng)烈抑制作用。
總之，雖然α-GalCer可抑制對糖抗原的免疫應(yīng)答，但這種效果可被逆轉(zhuǎn)，如果糖抗原偶聯(lián)于運載體，可用α-GalCer增強(qiáng)對糖抗原的免疫應(yīng)答。
應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述本發(fā)明，可在不背離本發(fā)明構(gòu)思和范圍的情況下對詳細(xì)內(nèi)容進(jìn)行修改。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含(a)偶聯(lián)于運載體的糖抗原；和(b)α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑是α-半乳糖基神經(jīng)酰胺。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述α-半乳糖基神經(jīng)酰胺是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷?；被?-1，3，4-十八烷三醇。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的組合物，其特征在于，所述糖抗原是細(xì)菌莢膜糖。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)菌莢膜糖來自腦膜炎奈瑟球菌、流感嗜血桿菌或肺炎鏈球菌。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的組合物，其包含一種以上糖偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的組合物，其特征在于，所述運載體是蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述運載體是細(xì)菌毒素如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。
9.用于藥物的偶聯(lián)于運載體的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
10.一種在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括給予患者偶聯(lián)于運載體的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，同時、依次或分別給予所述糖抗原偶聯(lián)物和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答用于預(yù)防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血癥、淋病等)、流感嗜血桿菌引起的疾病(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血癥、肺炎等)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述藥物用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌性腦膜炎。
14.偶聯(lián)于運載體的糖抗原在制造用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑一起給予。
15.α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑在制造用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與偶聯(lián)于運載體的糖抗原一起給予。
16.偶聯(lián)于運載體的糖抗原和α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑在制造用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
17.偶聯(lián)于運載體的糖抗原在制造用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其中患者經(jīng)α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑預(yù)治療。
18.α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑在制造用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其中患者經(jīng)偶聯(lián)于運載體的糖預(yù)治療。
19.如權(quán)利要求14-18中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物用于預(yù)防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血癥、淋病等)、流感嗜血桿菌引起的疾病(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血癥、肺炎等)。
20.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物用于預(yù)防和/或治療細(xì)菌性腦膜炎。
21.一種藥盒，其包含(a)偶聯(lián)于運載體的糖抗原；和(b)α-糖基神經(jīng)酰胺佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有以下組分的組合物和藥盒(a)偶聯(lián)于運載體的糖抗原；和(b)α－糖基神經(jīng)酰胺佐劑。本發(fā)明還提供了利用該組合物進(jìn)行治療的方法。已發(fā)現(xiàn)，可通過將糖偶聯(lián)于運載體逆轉(zhuǎn)α－糖基神經(jīng)酰胺對抗－糖免疫應(yīng)答的抑制。
文檔編號A61K39/39GK101035546SQ200580034409
公開日2007年9月12日 申請日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日
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