專利名稱：硝化細(xì)菌的聚生體的制作方法
序列表的參考文獻(xiàn)本申請(qǐng)包括一個(gè)序列表，在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種硝化細(xì)菌的聚生體及其應(yīng)用，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面。
相關(guān)技術(shù)的描述在水產(chǎn)養(yǎng)殖體系中，高濃度氨和亞硝酸鹽的積累對(duì)水生生物是有毒的，這一般通過硝化微生物(包括氨氧化細(xì)菌(Ammonia oxidizing bacteria)(AOB)和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(nitrite oxidizing bacteria)(NOB))的有效清除來預(yù)防。通常認(rèn)為魚池中負(fù)責(zé)氧化氨和亞硝酸鹽的細(xì)菌是歐洲亞硝化單孢菌(Nitrosomonas europaea)和維氏硝化桿菌(Nitrobacter winogradskyi)。在新建的水族池中，在形成足夠生物量的AOB和NOB前，氨和亞硝酸鹽會(huì)達(dá)到對(duì)魚、甲殼類和其他水生無脊椎動(dòng)物有害的濃度。為減少NOB形成的時(shí)間，現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了這些生物的商品化制備方法，它們可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中環(huán)境中的接種，包括自養(yǎng)AOB和NOB生物的混合培養(yǎng)物。
專利公開號(hào)為2004/0101944的美國(guó)專利申請(qǐng)涉及一種微生物培養(yǎng)物及其應(yīng)用，尤其是用于去除有害物質(zhì)，如氮化合物；該微生物可以從硝化微生物中選擇，例如Nitrosomonas eutropha和維氏硝化桿菌。
專利號(hào)為6,207,440的美國(guó)專利描述了分離的能夠?qū)喯跛猁}氧化為硝酸鹽的菌株，及應(yīng)用其來預(yù)防或減輕含水培養(yǎng)基中亞硝酸鹽積累的方法。
本發(fā)明的目的之一是提供一種改進(jìn)的硝化細(xì)菌的聚生體。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種Nitrosomonas eutropha和維氏硝化桿菌的聚生體，該聚生體比常用的歐洲亞硝化單孢菌(Nitrosomonas europea)和維氏硝化桿菌的聚生體能夠更有效的去除氨和亞硝酸鹽，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，例如養(yǎng)蝦。在水產(chǎn)養(yǎng)殖如蝦池中添加該聚生物可以增加總產(chǎn)量，增大蝦的大小，降低食物轉(zhuǎn)化率(獲得每公斤蝦需要更少的食物)，從而增加所有單位池塘的收益。
因此，本發(fā)明提供這樣一種硝化細(xì)菌的聚生體及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，尤其在蝦池中。
發(fā)明的詳細(xì)描述微生物保藏一種有代表性的細(xì)菌聚生體是1994年以前從采集的天然來源的樣本中分離的。該聚生體因?qū)＠康母鶕?jù)布達(dá)佩斯條約保藏于ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，10801 University Blvd.Manassas，VA 20108 USA。Novozymes Biologicals Inc.在2004年9月23日進(jìn)行了保藏，相應(yīng)的保藏號(hào)為PTA-6232。
保藏的聚生體包括氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌。為分類學(xué)目的，測(cè)定了這兩種生物的16S rDNA序列，分別參見SEQ ID NO1和2。經(jīng)過與GenBank提供的所有其它已公開的序列(Nucleic Acids Research 2004 Jan 1；32(1)23-6)比對(duì)，將氨氧化菌分類為Nitrosomonas eutropha(Koops et al.，J.Gen.Microbiol.1991，137，1689-1699)，亞硝酸鹽氧化菌分類為維氏硝化桿菌。
硝化聚生體硝化聚生體包括氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)。
AOB可能屬于Nitrosomonas eutropha，和/或其具有的16S rDNA序列與SEQ ID NO1的不相似度小于2％(同一性大于98％)，尤其不相似度小于1％(同一性大于99％)。優(yōu)選的，AOB具有SEQ ID NO1所示的16S rDNA序列或其是包含在ATCC PTA-6232中的Nitrosomonas eutropha菌株。
NOB可能屬于維氏硝化桿菌，和/或其具有下述的16S rDNA序列，該16SrDNA序列與SEQ ID NO2的不相似度小于10％(同一性大于90％)，尤其不相似度小于6％或小于3％(同一性大于94％或97％)。優(yōu)選的，NOB含有與SEQ ID NO2所示的或其是包含于ATCC PTA-6232的維氏硝化桿菌菌株。
給定的序列可以與SEQ ID NO1或2進(jìn)行比對(duì)，然后使用BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool，參見www.ebi.ac.uk/blast/index.html)計(jì)算它們的不相似度或同一性，其中期望值(expectation value)設(shè)為10，核苷酸錯(cuò)配罰值設(shè)為-3，配對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)值(the reward for match)設(shè)為+1，空位設(shè)值罰值(gap opening penalty)設(shè)為-5，空位延伸罰值(gap extension penalty)設(shè)為-2?？刹捎脕碜訮HYLIP Phylogenitic Inference Package(Felsenstein，J.1989.PHYLIP--Phylogeny Inference Package(Version 3.2).Cladistics 5164-166)的CLUSTALW程序產(chǎn)生序列比對(duì)結(jié)果。也可以采用基于IUB/BESTFIT weightmatrix的Accurate Method，空位罰值和延伸罰值分別設(shè)為-15和-6.66。然后將得到的比對(duì)結(jié)果利用PHYLIP的根據(jù)Jukes-Cantor模型建立的DNADIST程序計(jì)算％不相似度(和％同一性)。
AOB和NOB可以與其他細(xì)菌一起使用，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)的(如商品化的Prawn Bac PB-628(Novozymes Biologicals的產(chǎn)品))，腸桿菌屬(Enterobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。
硝化聚生體可制成液體，凍干粉或生物膜(例如在麩(bran)或谷蛋白(corn gluten)上)。通常接種氨氧化菌使氨氧化率達(dá)到約50-5000mgNH3-N/L/hr(通常約800)，接種亞硝酸鹽氧化菌使亞硝酸鹽氧化率達(dá)到約10-2000mg NO2-N/L/hr(通常約275)。
氨和亞硝酸鹽氧化率以NH4Cl作為底物在30℃和pH8.0條件下孵育測(cè)定氨氧化率。以NaNO2作為底物在30℃和pH7.5-7.8條件下孵育測(cè)定亞硝酸鹽氧化率。
培養(yǎng)聚生體可采用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行大量培養(yǎng)。參見，如H Koops，UPurkhold，A Pommerening-Roser，G Timmermann，and M Wagner，″TheLithoautotrophic Amnmonia-Oxidizing Bacteria，″in M.Dworkin et al.，eds.，TheProkaryotesAn Evolving Electronic Resource for the MicrobiologicalCommunity，3rd edition，release 3.13，2004，Springer-Verlag，New York。
硝化聚生體可制成液體，凍干粉或生物膜(例如在麩或谷蛋白)上)。通常配制為使氨氧化率約50-5000mg NH3-N/L/hr(通常約800)，使亞硝酸鹽氧化率約10-2000mg NO2-N/L/hr(通常約275)。
聚生體的應(yīng)用聚生體可用于硝化含氨或亞硝酸鹽的液體。因此，它可用來喂養(yǎng)水生生物如魚(淡水或咸水魚)或甲殼類(如蝦)，尤其用于生產(chǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖的食物源(food stock)，保持水產(chǎn)養(yǎng)殖容器中氨和亞硝酸鹽水平在有害濃度以下。水生生物可能在容器(例如水產(chǎn)養(yǎng)殖容器，桶，水族箱，池塘，室外商品化或觀賞性的魚或蝦池，或育種池)的液體(淡水或咸水)中培養(yǎng)。因此，在用于海蝦養(yǎng)殖的蝦池中添加該微生物可將有毒的有機(jī)和無機(jī)廢物降到一個(gè)對(duì)環(huán)境安全的水平。
通常在水產(chǎn)養(yǎng)殖容器中每500,000升加入0.5～300升硝化聚生體處理，例如，每500,000升中加入1-300升處理，優(yōu)選的處理方法是在10周處理期間每周每500,000升水中加入約2升硝化聚生體處理。通常接種氨氧化菌使NH3氧化率達(dá)到0.01-10mg NH3-N/L/hr，例如0.03-3或0.1-10mg NH3-N/L/hr，尤其是0.3-3mg NH3-N/L/hr。通常接種亞硝酸鹽氧化菌使NO2氧化率達(dá)到約0.003-3mg NO2-N/L/hr，例如0.03-3mg NO2-N/L/hr，尤其是0.01-1或0.1-1mgNO2-N/L/hr。
池或水族箱(aquarium)中液體的鹽度范圍可以在0-36ppt(parts perthousand，千分之一)之間，優(yōu)選的鹽度范圍是4-22ppt。溫度可以在約18-38℃，典型的是在約30℃。pH可以在約6.8-8.5。水產(chǎn)養(yǎng)殖容器可用傳統(tǒng)裝置如槳輪或噴射泵通氣充氧，典型的是達(dá)到40-100％氧氣飽和度，或溶氧3.5-7.5mg/L。水產(chǎn)養(yǎng)殖容器也可用非機(jī)械、自然的方法放氣。
可加入抗生素(如環(huán)己酰亞胺(cycloheximide))以阻止原生生物(如阿米巴蟲(amoebas))生長(zhǎng)。
在其中氨和/或亞硝酸鹽已達(dá)到有害水平(例如在不同的工業(yè)廢水處理設(shè)施，城市廢物處理，或觀賞性池塘中)情況下，在常規(guī)基礎(chǔ)上添加相似量的硝化聚生物可能有利于其他的環(huán)境裝置，這依賴于水力停留時(shí)間(hydraulic retention time)及初始氨和亞硝酸鹽的濃度。
實(shí)施例實(shí)施例1瓶中氨的氧化在仔細(xì)維持的條件下(包括仔細(xì)維持溫度下，4ppt的鹽水培養(yǎng)基(pH8)，充氧到目標(biāo)DO(溶氧；4-5mg/L O2)水平，30℃培育，并提供特定水平的標(biāo)準(zhǔn)食物顆粒(每天每池中添加蝦重的5-10％))，蝦在養(yǎng)殖槽中活躍地生長(zhǎng)4天，然后從活躍地蝦的養(yǎng)殖槽中取水作為起始底物溶液，用于在瓶中進(jìn)行研究。4天后，氨積累到大約1.4-2.0ppm NH3，這個(gè)濃度水平開始不利于蝦的進(jìn)一步生長(zhǎng)。該培養(yǎng)基經(jīng)過濾除去背景微生物(異養(yǎng)生物)，分裝到搖瓶中進(jìn)行下一步研究。瓶中接種下列菌株到指定的氧化率
在從第0天到第8天的硝化過程中測(cè)定了下列三個(gè)關(guān)鍵因素氨(NH4+)，亞硝酸鹽(NO2)和硝酸鹽(NO3)。
1.氨(ppm NH4+)變化
2.亞硝酸鹽(ppm NO2)變化
3.硝酸鹽(ppm NO3)變化
結(jié)果清楚顯示Nitrosomonas eutropha和維氏硝化桿菌的聚生體能夠更有效的將氨氧化為硝酸鹽。只含氨氧化菌Nitrosomonas eutropha的參比(reference)能夠?qū)毖趸癁閬喯跛猁}，但不能將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽?，F(xiàn)有技術(shù)的聚生體能夠?qū)毖趸癁閬喯跛猁}，但去除氨的效率不高。
實(shí)施例2蝦養(yǎng)殖槽中氨的氧化為在蝦養(yǎng)殖槽中進(jìn)行研究，蝦養(yǎng)在如實(shí)施例1所述的養(yǎng)殖槽中，只在研究的第一天接種一次。槽中研究使用的接種率是實(shí)施例1比率(rate)的1/10th。典型的，在5加侖養(yǎng)殖用鹽水中加入2.5ml硝化菌株濃縮物，其氨氧化率為800mg NH3-N/L/hr，亞硝酸鹽氧化率(在適用之處)至少為270mgNO2-N/L/hr。最終氨氧化率為0.1mg NH3-N/L/hr，亞硝酸鹽氧化率(在適用之處)至少為0.03mg NO2-N/L/hr。槽中氨，亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累用實(shí)施例1中相同的菌株處理。水中也存在異養(yǎng)細(xì)菌(天然存在于食物和蝦本身，和漁場(chǎng)池塘(farm ponds)一樣)，它們可能附著于絮狀硝化聚生體并抑制氨或亞硝酸鹽的有效利用。
1.氨(ppm NH4+)變化
2.亞硝酸鹽(ppm NO2)變化
3.硝酸鹽(ppm NO3)變化
出乎意料的是，Nitrosomonas eutropha和維氏硝化桿菌的聚生體在自然環(huán)境中也能進(jìn)行有效的氨氧化，但現(xiàn)有技術(shù)中的Nitrosomonas europea和維氏硝化桿菌的聚生體的效率要低得多。盡管現(xiàn)有技術(shù)中的聚生體在實(shí)施例1的瓶中與本發(fā)明聚生體針對(duì)氨的效率幾乎相同，但本實(shí)施例中現(xiàn)有技術(shù)中的聚生體效率要低得多。值得注意的是本發(fā)明中亞硝酸鹽(NO2)的水平高于參比(因?yàn)榍罢咻^高的氨氧化活性)，并且由于本發(fā)明的亞硝酸鹽氧化活性將形成的亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，所以本發(fā)明的硝酸鹽水平(NO3-)也較高。
實(shí)施例3田間實(shí)驗(yàn)(field trial)田間實(shí)驗(yàn)采用預(yù)選的Litopenaeus vannamei幼蝦，購(gòu)自商業(yè)化的蝦苗孵育場(chǎng)，投苗(stock)密度為每平方米110個(gè)幼蝦。兩個(gè)獨(dú)立的蝦池(每個(gè)0.8公頃)用硝化微生物產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)方案處理，在投苗后第4周每池加入4加侖濃縮的硝化聚生體，然后在第5和6周分別加入2加侖，第13周加入1加侖。在研究過程中，所有接種的AOB細(xì)菌的量相當(dāng)于0.01mg NH3-N/L/hr，所有接種的NOB細(xì)菌的量相當(dāng)于0.003mg NO2-N/L/hr。另外5個(gè)大小和投苗(sized and stocked)相似的池塘作為未處理的對(duì)照，與接受處理的池塘加入相同數(shù)量的食物。所有的池塘都通過機(jī)械供氧，白天氧氣水平達(dá)到至少4.5mg/L O2。
池塘中的水溫和鹽度隨典型地季節(jié)波動(dòng)，平均溫度在27-32℃之間，鹽度在22-24ppt之間。每天均對(duì)池塘進(jìn)行投食，在鄰近收獲時(shí)每天達(dá)到投食四次。
五個(gè)未處理對(duì)照池中的四個(gè)在第六周出現(xiàn)由于氨應(yīng)激性和病毒病導(dǎo)致的蝦的死亡。剩余的對(duì)照池養(yǎng)殖到第82天收獲，此時(shí)氨的水平已造成飼喂應(yīng)激性(stress)和疾病敏感性。而經(jīng)過處理的池塘在超過100天后仍保持健康狀態(tài)。
經(jīng)處理的池塘的蝦產(chǎn)量(kg/ha)；食物轉(zhuǎn)化率(Feed Conversion Ratio，F(xiàn)CR)；和單個(gè)蝦重量(wt/pcs)等所有這些關(guān)鍵指標(biāo)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于未處理的對(duì)照池。
氨氮(NH3-N)和亞硝酸氮(NO2-N)是本實(shí)驗(yàn)最重要的物理參數(shù)。在前8周的檢測(cè)中，與所有對(duì)照池中氨和亞硝酸鹽水平穩(wěn)定上升相比，所有接受處理的池中氨和亞硝酸鹽的水平保持非常低的水平。很明顯，這些NH3和NO2的增加結(jié)果非常嚴(yán)重，導(dǎo)致四個(gè)對(duì)照池中的蝦由于死亡而提前結(jié)束生長(zhǎng)。隨著生長(zhǎng)的進(jìn)行，在存活的對(duì)照池中觀察到顯著的氨和硝酸鹽水平的增加，而接受處理的池中其水平非常低，接近于零。
在第8周從接受處理的池中取出的蝦比取自對(duì)照池中的蝦個(gè)頭略大，更有活力(跳躍)。這可能是因?yàn)橄鄬?duì)于接受處理的池中較低的氨和亞硝酸鹽水平，對(duì)照池中二者濃度較高造成的。與存活的對(duì)照池中5.2kg/ha的產(chǎn)量相比，接受處理的池中最終平均產(chǎn)量是19.5kg/ha。
這個(gè)數(shù)據(jù)表明生物前期處理可產(chǎn)生顯著的、可重復(fù)的效果，尤其考慮到氨和亞硝酸鹽的水質(zhì)以及蝦生長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)的增加。此外，與以往收獲時(shí)觀察到的和未處理的對(duì)照池的底部相比，接受處理的蝦池底部的殘留淤泥顯著減少。
序列表<110>諾維信生物股份有限公司(NOVOZYMES BIOLOGICALS，INC.)Drahos，David J.
<120>硝化細(xì)菌的聚生體<130>10708-000-US<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1508<212>DNA<213>Nitrosomonas eutropha<400>1tggagagttt gatcctggct cagattgaac gctggcggca tgctttacac atgcaagtcg60aacggcagcg ggggcttcgg cctgccggcg agtggcgaac gggtgagtaa tacatcggaa 120cgtgtccttg agtggggaat aacgcatcga aagatgtgct aataccgcat atttctcagg 180aagaaagcag gggatcgaaa gaccttgcgc taaaggagcg gccgatgtct gattagctag 240ttggtgaggt aaaggcttac caaggcaacg atcagtagct ggtctgagag gacgatcagc 300cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga 360caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga agaaggcctt cgggttgtaa 420agctctttta gtcggaaaga aagaattatg gttaatagcc atgatttatg acggtaccga 480cagaaaaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt 540taatcggaat tactgggcgt aaagggtgcg caggcggcct tgcaagtcag atgtgaaagc 600cccgggctta acctgggaat tgcgtttgaa actacaaagc tagagtgcag cagaggggag 660tggaattcca tgtgtagcag tgaaatgcgt agagatgtgg aagaacaccg atggcgaagg 720cagctccctg ggttgacact gacgctcatg cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780
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1.細(xì)菌組合物，其包括Nitrosomonas eutropha作為氨氧化菌，和硝化桿菌屬作為亞硝酸鹽氧化菌。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中亞硝酸鹽氧化菌是維氏硝化桿菌。
3.權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌組合物，其中氨氧化菌包含與SEQ IDNO1不相似性低于2％的核苷酸序列，亞硝酸鹽氧化菌包含與SEQ ID NO2不相似性低于10％的核苷酸序列。
4.細(xì)菌組合物，包括氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌，所述氨氧化菌包含與SEQ ID NO1不相似性低于2％的核苷酸序列，所述亞硝酸鹽氧化菌包含與SEQ ID NO2不相似性低于10％的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求4所述的組合物，其中氨氧化菌包含與SEQ ID NO1不相似性低于1％的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求3-5中任一所述的組合物，其中亞硝酸鹽氧化菌包含與SEQID NO2不相似性低于6％的核苷酸序列，尤其是不相似性低于3％。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的組合物，其中氨氧化菌含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或是為ATCC PTA-6232所含有的Nitrosomonas eutropha菌株。
8.權(quán)利要求1-7中任一所述的組合物，其中亞硝酸鹽氧化菌含有SEQ IDNO2所示核苷酸序列或其為ATCC PTA-6232所含的維氏硝化桿菌菌株。
9.硝化包含氨或含亞硝酸鹽液體的方法，包括在液體中培養(yǎng)權(quán)利要求1-8中任一所述的細(xì)菌組合物。
10.養(yǎng)殖水生生物的方法，包括在權(quán)利要求1-8中任一所述的細(xì)菌組合物存在的條件下養(yǎng)殖水生生物。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中水生生物包括甲殼類或魚類。
12.權(quán)利要求9-11中任一所述的方法，其中接種氨氧化菌使NH3氧化率達(dá)到0.1-10mg NH3-N/L/hr，尤其是0.3-3mg NH3-N/L/hr。
13.權(quán)利要求9-12中任一所述的方法，其中接種亞硝酸鹽氧化菌使NO2氧化率達(dá)到0.03-3mg NO2-N/L/hr，尤其是0.1-1mg NO2-N/L/hr。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Nitrosomonas eutropha和維氏硝化桿菌的聚生體，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，例如蝦池。該聚生體比常用的Nitrosomonas europea和維氏硝化桿菌的聚生體能夠更有效的去除氨和亞硝酸鹽，蝦池在水產(chǎn)養(yǎng)殖如蝦池中添加該聚生物可以增加總產(chǎn)量，增大蝦的大小，降低食物轉(zhuǎn)化率(所得每公斤蝦需要更少的食物)，從而增加所有單位池塘的收益。
文檔編號(hào)A61K39/02GK101039692SQ200580035202
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月14日
發(fā)明者戴維·J·德拉霍斯 申請(qǐng)人:諾維信生物股份有限公司