專利名稱：純化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白(agp)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過選擇性方法從薊罌粟(Argemone mexicana)植物的葉和/或莖分離得到的一種純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物。
本發(fā)明也涉及從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到的一種純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物，其具有一種或多種如下效果免疫抑制、淋巴細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)如IL-2抑制、IFN-γ抑制或IL-10誘導(dǎo)；角質(zhì)細(xì)胞增殖抑制、角質(zhì)分離活性以及在小鼠耳腫實(shí)驗(yàn)(MEST)中的抑制活性。
縮寫/符號(hào)說明阿拉伯半乳聚糖-蛋白(Arabinogalactan-Protein)AGP高分子量阿拉伯半乳聚糖-蛋白AGP-HM低分子量阿拉伯半乳聚糖-蛋白AGP-LM


圖1純化的AGP組合物的選擇性分離方法的流程圖。
圖2表示AGP組合物的建議結(jié)構(gòu)。
圖3表示AGP組合物的IL-10誘導(dǎo)效果。
圖4表示AGP組合物的IL-2百分比抑制效果。
圖5表示AGP組合物的IFNγ百分比抑制效果。
圖6表示AGP組合物的GMCSF抑制效果。
圖7表示AGP組合物的人類TNFα抑制效果。
圖8表示AGP組合物對(duì)NGF誘導(dǎo)的人類角質(zhì)細(xì)胞的增殖效果。
圖9表示AGP組合物對(duì)NGF誘導(dǎo)的人類角質(zhì)細(xì)胞的增殖效果。
圖10表示AGP組合物對(duì)PPD激發(fā)豚鼠的皮膚厚度的效果。
圖11表示AGP組合物在TPA(12-O-四癸?；鸩ù?13-乙酸酯)誘導(dǎo)Balb/c小鼠表皮厚度的抑制效果。
圖12表示AGP組合物在DNFB誘導(dǎo)雌性C(57)BL/6小鼠的小鼠耳腫實(shí)驗(yàn)中的效果。
背景技術(shù)：
銀屑病是一種皮膚病，其特征為發(fā)炎和異常的表皮角質(zhì)細(xì)胞過量增殖導(dǎo)致表皮增生、變厚以及產(chǎn)生紅色鱗斑。根據(jù)特殊的臨床癥狀來識(shí)別慢性皮膚病，特征是外周紅色的斑上覆蓋白色的鱗片導(dǎo)致發(fā)癢、鱗片狀皮膚。銀屑病是一種非常明顯的疾病，常常發(fā)作于面部，頭皮，軀干和四肢。這種慢性疾病對(duì)身體的損害隨病情的緩解和加重而變化。
雖然銀屑病顯然是一種皮膚病，但是不遵從任何理論的，它被認(rèn)為是一種細(xì)胞調(diào)節(jié)減弱或有缺陷的免疫疾病。由于銀屑病的臨床癥狀主要是表皮變化引起的，因此這種疾病通常被認(rèn)為是角質(zhì)細(xì)胞過度增殖和異常分化。目前的證據(jù)表明銀屑病中的表皮變化是由皮膚病變區(qū)域的T淋巴細(xì)胞的活動(dòng)引起，T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)或維持疾病的進(jìn)程。銀屑病被描述為一種自體免疫疾病，其中活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子導(dǎo)致繼發(fā)性表皮異常。病變的淋巴細(xì)胞制造細(xì)胞因子以刺激凋亡-抵抗角質(zhì)細(xì)胞的增殖。銀屑病皮膚病變的特點(diǎn)是發(fā)炎，伴隨T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞滲透真皮和表皮，并且產(chǎn)生與表皮過量增殖和角質(zhì)細(xì)胞異常分化相關(guān)的鱗屑[Reich K.，Garbe C，Blaschke V.，Maurer C，Middel P.，Westhal G.，Lippert U.，andNeumann C，J.Invest.Dermatol，2001，116，319]。
自體免疫紊亂是身體對(duì)自身組織產(chǎn)生的免疫反應(yīng)疾病。自體免疫疾病的病因不為人所知，但是在很多自體免疫疾病的發(fā)展過程中似乎存在遺傳易患病體質(zhì)。
在少數(shù)幾種自體免疫疾病(例如風(fēng)濕熱)中，細(xì)菌或病毒觸發(fā)免疫反應(yīng)，抗體或T-細(xì)胞攻擊正常細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兡承┎糠值慕Y(jié)構(gòu)和感染病菌的部分結(jié)構(gòu)相似。
自體免疫疾病分為兩種常規(guī)類型損害許多器官的(系統(tǒng)性自體免疫疾病)，以及那些僅僅只有一個(gè)單獨(dú)的器官或組織直接被自體免疫過程直接損害的(局部的)。自體免疫紊亂最常見的一些類型歸納如下

發(fā)炎過程包括一系列可能被眾多因素引起的事件(例如感染試劑，缺血，抗原-抗體相互作用，以及熱或其它物理性損傷)。每種類型的刺激因素激發(fā)一種特定的應(yīng)答方式，代表一種相對(duì)微小的主題變化。從宏觀水平看，應(yīng)答通常伴隨著熟悉的臨床癥狀，即紅斑、水腫、壓痛和疼痛。
對(duì)銀屑病患者觀察到的癥狀包括表皮細(xì)胞增生和異常角質(zhì)化(歸因于高代謝導(dǎo)致的細(xì)胞過度更新)、表皮層炎癥反應(yīng)減弱、血管舒張和白細(xì)胞遷移并滲透到表皮細(xì)胞層中。然而，目前認(rèn)為表皮增生是對(duì)病灶皮膚區(qū)域的免疫系統(tǒng)活化的反應(yīng)，其依次通過聚集在患病皮膚中的CD8+和CD4+T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)。的確，銀屑病現(xiàn)在被認(rèn)為是人類最普遍的T細(xì)胞調(diào)節(jié)的炎性疾病。因此，銀屑病的癥狀表現(xiàn)為角質(zhì)細(xì)胞的過快生長(zhǎng)并且從皮膚表面脫落。在銀屑病患者的病變區(qū)域中，角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞更新時(shí)間縮短了大約8倍(36，正常皮膚311小時(shí))，分化細(xì)胞的數(shù)目加倍，導(dǎo)致表皮增生。藥物治療著眼于減緩該過程。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PUVA治療耗盡淋巴細(xì)胞，和疾病的改善相呼應(yīng)。這些數(shù)據(jù)與T細(xì)胞在發(fā)病機(jī)理中的角色相一致。環(huán)孢霉素是一種已知的免疫抑制劑，對(duì)于疾病活性具有重大的效果。由于環(huán)孢霉素對(duì)T細(xì)胞活性具有主要的抑制效果，因此有人認(rèn)為銀屑病根本上是一種炎性疾病。
T淋巴細(xì)胞必須滲透到真皮然后粘附到角質(zhì)細(xì)胞上以產(chǎn)生銀屑病斑。因此，分子調(diào)節(jié)的T細(xì)胞黏附和穿越成為合理的治療靶標(biāo)，并且其在病理生理學(xué)中的角色非常重要。通過阻滯趨化因子觸發(fā)反應(yīng)或阻滯整合素結(jié)合反應(yīng)(LFA-I至ICAM-I)來抑制血管內(nèi)黏附的發(fā)生。整合素阻滯或減少其表面表達(dá)對(duì)淋巴細(xì)胞穿越很重要，能夠輔助治療銀屑病。
已經(jīng)知道，抗銀屑病活性涉及到免疫抑制、淋巴細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)如IL-2抑制、IFN-γ抑制或IL-10誘導(dǎo)；角質(zhì)細(xì)胞增殖抑制、角質(zhì)分離活性、MEST中的抑制活性。
用于改善銀屑病的不同的甚至是毒性治療的次數(shù)是這種疾病抵抗性質(zhì)的證據(jù)。由于大多數(shù)(90％)銀屑病病人具有該疾病的有限類型，局部治療可以使用包括地蒽酚、焦油制品、皮質(zhì)甾類以及最近提出的維生素D3類似物(鈣泊三醇、骨化三醇)。少數(shù)(10％)銀屑病病人情況更為嚴(yán)重，對(duì)于他們使用一些系統(tǒng)性治療形式。特定的系統(tǒng)性治療包括UVB、PUVA、甲氨蝶呤、維生素A衍生物(阿維A)和免疫抑制劑如環(huán)孢霉素A。環(huán)孢霉素和FK-506的有效性證明了T細(xì)胞是銀屑病主要誘因的假說。
皮質(zhì)甾類的局部作用在于減輕銀屑病的癥狀。然而，當(dāng)需要長(zhǎng)時(shí)間對(duì)銀屑病患者病變區(qū)域進(jìn)行給藥治療時(shí)，必須增加劑量或者使用更強(qiáng)的藥物從而引起藥物耐受性，即會(huì)導(dǎo)致萎縮和色素缺乏或正常皮膚周邊失去色素[British National Formulary(BNF)，March 2001，No.41]。
利用光學(xué)治療方法(用紫外線照射)或者光化學(xué)治療方法，其包括補(bǔ)骨脂素體外或體內(nèi)給藥，以及用長(zhǎng)波紫外線照射感染區(qū)，伴隨著如加速老化或皮膚色素沉著和致癌的缺點(diǎn)[British National Formulary(BNF)，March2001，No.41]。
和甾體相比，體外使用煤焦油伴隨較少的副作用，但是比較臟而且具有包括強(qiáng)烈異味和腐蝕皮膚等的缺點(diǎn)。甚至可能導(dǎo)致刺激性皮炎。
盡管甲氨蝶呤是一種治療銀屑病患者的可選藥物，但是需要謹(jǐn)慎監(jiān)測(cè)，因?yàn)樗赡軙?huì)導(dǎo)致肝臟損害和/或減少載氧血紅細(xì)胞的產(chǎn)量、抗炎白血球和促凝血小板。長(zhǎng)期使用補(bǔ)骨脂素和甲氨蝶呤會(huì)顯著增加銀屑病患者患鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[Stern R.S.，and Laird N.，Cancer，1994，73，2759]。
頑固性銀屑病患者可以內(nèi)服類視色素如阿維A；然而它是致畸的，并且可能在體內(nèi)長(zhǎng)期累積，因此懷孕期間禁用[Stern R.S.，and Laird N.，Cancer，1994，73，2759]。
使用大環(huán)免疫抑制劑如環(huán)孢菌素、他克莫司和子囊霉素可能損傷腎功能或引起高血壓。羥基脲可能引起貧血以及白血球和血小板的減少。
鈣泊三醇(一種合成維生素D3的類似物)是一種廣泛描述的銀屑病治療劑。然而，其比潛在表面皮脂甾類更嚴(yán)重地刺激皮膚。通常的副作用包括損害或外周損害刺激、面部或頭皮刺激或急性發(fā)作銀屑病[Ashcroft D.M.，Wan Po A.L.，Williams H.C.and Griffiths C.E.M.，BMJ，2000，320，963]。
目前的治療銀屑病的生物技術(shù)方法涉及到細(xì)胞增殖方面或者疾病免疫組分方面的直接藥物調(diào)節(jié)發(fā)作。已經(jīng)知道免疫生物學(xué)的免疫抑制劑如Clenoliximab、MEDI-507、ICM3、IDEC-114、SMART Anti-CD3、Zenapax、Amavive、HuI 134、Xanelim、HuMaxCD4、IC747、IDEC-114 IDEC-131、Nuvion、DAB389IL-2、ONTAK和Etarnercept能夠阻滯不同階段的免疫應(yīng)答，它們目前正處于不同的臨床測(cè)試階段。
然而，上述提到的治療劑沒有一種是廣泛安全和有效的。銀屑病的影響大小類似于其它疾病如抑郁癥、高血壓和充血性心力衰竭。在美國(guó)治療該疾病的平均費(fèi)用是每人每年800美元，且該疾病可導(dǎo)致生產(chǎn)力的重大損失[Feldman S.R.，American Academy of Dermatology，August 2000]。
由于其散發(fā)性的過程，該疾病對(duì)治療劑的反應(yīng)不同，也可能具有不利作用。因而，它是一種難以治愈的疾病。銀屑病的毀滅性本質(zhì)被其副作用的程度所加重，患者希望疾病得到緩解，他們知道疾病遲早會(huì)復(fù)發(fā)。
并且，除了臨床上的表現(xiàn)和不便，疾病對(duì)病人的心理沖擊是巨大的。銀屑病是一種復(fù)雜疾病，影響到病人的各方面情感并且損害病人的身體，實(shí)質(zhì)上降低了全世界數(shù)以百萬計(jì)患者的生活質(zhì)量。加之其經(jīng)常是清楚可見的，因此使患者遭受痛苦、窘迫和不舒服[Fortune D.G.，Richards H.L.，Main C.J.，and Griffiths C.E.M.，J.Am.Acad.Dermatol，1998，39，196]。
我們美國(guó)專利公開文本2003/0194456A1公開一種植物來源的組合物，它提供了一種安全的、耐受性好且有效的銀屑病治療劑，克服了現(xiàn)有治療劑的缺點(diǎn)和限制。
美國(guó)專利公開文本2003/0194456A1公開了有用的治療劑/組合物的體內(nèi)外免疫學(xué)和藥理學(xué)活性，該治療劑包括薊罌粟植物的葉和/或莖的萃取物，或者與孜然(Cuminum cyminum)植物果實(shí)的萃取物聯(lián)合使用，用于治療和預(yù)防銀屑病和其它的疾病。所述萃取物(可以是一種水、乙醇或水-乙醇萃取物)除了表現(xiàn)出有用的免疫學(xué)和藥理學(xué)活性，還顯著降低了銀屑病的區(qū)域和沖擊指數(shù)(PASI)分值，在正常的可接受的限度范圍內(nèi)有較好的耐受性。作為患有慢性斑型銀屑病的患者的概念性研究的證據(jù)，當(dāng)將一種包含上述提到的萃取物的組合物進(jìn)行口服給藥時(shí)，PASI得分從6.33±2.84降至0.90±1.27，一些病人治療8周之后病愈。
美國(guó)專利公開文本2003/0194456A1中進(jìn)一步報(bào)道了薊罌粟植物的葉和/或莖的萃取物的急性毒性(LD50)在小鼠和大鼠通過口服和/或靜脈給藥方式的評(píng)價(jià)中，每kg動(dòng)物體重給藥量＞1000mg/時(shí)有50％的死亡率。
需要說明的是，薊罌粟植物由各種化合物組成，尤其包括i)生物堿，如金英花堿、硝基金英花堿、小檗堿、硝基小檗堿、隱品堿、別隱品堿、黃連堿、鹽酸血根堿、二氫鹽酸血根堿、去甲血根堿、6-丙酮基二氫鹽酸血根堿、二氫白屈菜紅堿、白屈菜紅堿、去甲基白屈菜紅堿、6-丙酮基二氫白屈菜紅堿、(-)cheilanthifolin、(-)-[β]-延胡索單酚堿methohydroxide、(-)-[a]-刺罌粟堿(-)-[a]和[β]-刺罌粟堿methohydroxides、(-)-cheilanthifolin、6-丙酮基二氫鹽酸血根堿、(-)-[a]-四氫掌葉防己堿methohydroxide、瑞枯靈、白蓬草福林、隱品巴馬亭、argemonine、norargeminine、argemexicaine A、argemexicaine B、N-去甲基氧基(demethyloxy)鹽酸血根堿；(+)-1，2，3，4-四氫-1-(2-羥基甲基-3，4-二甲氧基苯基甲基)-6，7-亞甲二氧基-異喹啉、helleritrine和oxyhydrastinine；ii)黃酮類，如異鼠李素、異鼠李素-3-葡糖苷；異鼠李素-3-O-葡糖苷、異鼠李素-3，7-二葡糖苷；3-甲氧基槲皮素、槲皮素5，3′，4′三甲基酯；木犀草素、argemexitin和北美圣草素；iii)脂肪酸，如軟脂酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亞油酸、月桂酸、山俞酸、木蠟酸、十六碳烯酸、蓖麻油酸、11-氧-三十烷酸和11-羥基-三十烷酸；iv)氨基酸，如組氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、精氨酸、絲氨酸、天門冬酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、羥基輔氨酸、輔氨酸、L-谷酰胺、羥基輔氨酸、β-丙氨酸和天門氨酸；v)碳水化合物，如葡萄糖、果糖和葡糖苷；vi)有機(jī)酸，如琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、馬來酸和蘋果酸；和vii)其它化合物，如蠟醇、β-谷甾醇、硝酸鉀、磷酸鈣和硫酸鈣。
根據(jù)美國(guó)專利公開文本2003/0194456A1，利用萃取過程如浸泡和過濾，使用水、乙醇和它們的混合物，從薊罌粟植物的葉和/或莖得到的萃取物實(shí)質(zhì)上包括所有上述化合物。換句話說，該萃取物由供萃取植物部分中的所有化合物組成，即由生物堿、類黃酮、脂肪酸、有機(jī)酸、氨基酸、糖和鹽的混合物組成。
按照美國(guó)專利公開文本2003/0194456A1描述的過程得到的萃取物具有體內(nèi)外免疫學(xué)和藥理學(xué)活性，已知它們和抗銀屑病活性有關(guān)，例如免疫抑制、淋巴細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)如IL-2抑制、IFNγ抑制和IL-10誘導(dǎo)；角質(zhì)細(xì)胞增殖抑制、角質(zhì)分離活性、內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞粘附分子表達(dá)抑制如ICAM-I、MEST抑制和酶抑制如p60src酪氨酸激酶。
進(jìn)一步地說，美國(guó)專利公開文本2003/0194456A1教導(dǎo)對(duì)上述薊罌粟植物的葉和/或莖的萃取物利用醇類溶劑如正丁醇和甲醇進(jìn)行分離，由此得到的組分也表現(xiàn)出包括抗銀屑病活性的體內(nèi)外免疫學(xué)和藥理學(xué)活性。
專利申請(qǐng)公開號(hào)2003/0194456A1描述的薊罌粟植物的葉和/或莖的水溶性萃取物的分離過程，是通過多級(jí)步驟、液-液分離色譜、沉淀和干燥該萃取物進(jìn)行的，得到的各組分中的主要組分實(shí)質(zhì)上是不同種類的化合物。
例如，按照美國(guó)專利公開文本2003/0194456A1描述的方法，向薊罌粟植物的葉和/或莖的水溶性萃取物中加入正丁醇制備正丁醇可溶性組分，從水層中分離出正丁醇層，接著用水洗滌正丁醇層并在減壓條件下蒸發(fā)溶劑得到的正丁醇可溶性組分的粘稠物質(zhì)。該水層和甲醇混合，結(jié)果沉淀出固體物質(zhì)。分離固體物質(zhì)，將該物質(zhì)溶于水并且凍干得到甲醇不溶性組分。將從甲醇-水混合物中分離甲醇不溶性沉淀之后得到的濾液蒸發(fā)，得到甲醇可溶性組分固體物質(zhì)。
通常地，薊罌粟植物產(chǎn)生約3-4.5％的正丁醇可溶性組分，46-54％的甲醇可溶性組分，總堿值在290-340之間；以及24-30％的甲醇不溶性組分，總堿值在350-380之間。這里所用的堿值是指中和1克樣品中的所有堿性組分的酸的用量。
正如上述提到的，三種組分的實(shí)質(zhì)差別在于它們所包括的化合物組成。正丁醇可溶性組分包括生物堿、類黃酮和其它低分子化合物；甲醇可溶性組分包括氨基酸、有機(jī)酸和鹽；甲醇不溶性組分包括糖、有機(jī)酸和鹽。
盡管對(duì)薊罌粟植物的不同部分進(jìn)行了多年的廣泛的化學(xué)研究，并且分離出一系列生物堿、類黃酮、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸等，然而，從來沒有系統(tǒng)地研究和報(bào)道關(guān)于該植物中其它成分的分離和鑒定。
在植物王國(guó)中普遍發(fā)現(xiàn)的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)就是其中一種成分，它本質(zhì)上是其中的碳水化合物和蛋白相關(guān)或相連的多糖類大分子。AGP主要由阿拉伯糖和半乳糖殘基組成。它們以多聚糖存在于植物中，并且與不同數(shù)量的蛋白有關(guān)，通常包括高比例的碳水化合物和相對(duì)少量的蛋白、通常少于10的蛋白，但是也發(fā)現(xiàn)了較高蛋白含量的AGP。AGP廣泛分布于大多數(shù)高等植物中，如紫錐菊、花煙草、歐洲葡萄、柿樹、唐菖蒲、黑麥草[Anderson，R.L.，Clarke，A.E.，Jermyn，M.A.，Knox，R.B.andStone，B.A.，Australian J.Plant Physiol，1977，4，143-158]、菜豆[Hawes，G.B.，Adams，G.A，Phytochemistry，1972，H，1461-1465]和Acacia arabica[Classen，B.，Witthohn，K.，and Blaschek，W.，Carbohydrate Research，，2000，327，497-504]。
AGP具有粘附性和儲(chǔ)水特性，并且對(duì)植物的傷口和感染有響應(yīng)。這些性質(zhì)確定細(xì)胞鑒定和特定相互作用。在細(xì)胞和組織分化及控制菌體胚胎形成中，它們也扮演著角色。它們也對(duì)各種生物行為有價(jià)值[WO01/00682A1，2001]。存在兩種類型的AGP，即AGPI和AGPII。后者即AGPII包括半乳糖中心并且是高度分支的，通常包括少于10％的蛋白，側(cè)鏈被阿拉伯呋喃糖殘基和偶爾其它糖(如鼠李糖、葡萄糖、甘露糖等)高度取代。也有報(bào)道稱存在糖醛酸和取代的衍生物。
正如上文所描述的，雖然已經(jīng)對(duì)薊罌粟所有部分的進(jìn)行了化學(xué)研究，然而，沒有對(duì)存在于該植物特定部分的AGP的分離、表征和生物性質(zhì)進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從薊罌粟植物的葉和/或莖的萃取物中以純化的形式分離AGP的選擇性方法，其表現(xiàn)出比美國(guó)專利申請(qǐng)公開2003/0194456A1中的薊罌粟植物的葉片和/或莖的萃取物和組分明顯優(yōu)異的抗銀屑病活性和其它有用的免疫學(xué)和藥理學(xué)活性。尤其是，從該選擇性方法得到的純化的AGP表現(xiàn)出的優(yōu)異的抗銀屑病活性在制備藥物組合物方面非常有用，因而提供了一種安全、有效和耐受性好的治療方法，由此形成本發(fā)明的基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種以高純度形式從薊罌粟植物的葉和/或莖分離出純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)的選擇性方法。
另一方面，本發(fā)明提供一種分離自薊罌粟植物的葉和/或莖的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)，具有從10KD至150KD的平均分子量。
本發(fā)明的又一方面是提供一種來自于薊罌粟植物的葉和/或莖的治療銀屑病的抗銀屑病組合物和治療方法，其不僅是高安全性的、有效的并且耐受性好的，而且克服了現(xiàn)有治療框架下的缺陷和限制。
本發(fā)明的另一方面是提供通過一種選擇性方法從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到的一種純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物，其表現(xiàn)出有用的免疫學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，如一種或多種免疫抑制、淋巴細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)如IL-2抑制、IFN-γ抑制或IL-10誘導(dǎo)、角質(zhì)細(xì)胞增殖抑制、角質(zhì)分離活性和MEST抑制。
本發(fā)明的又一方面是提供通過一種選擇性方法從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到的一種純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物，用于治療或預(yù)防一種或多種疾病，如皮炎、硬皮病、濕疹、炎癥和其它的自體免疫疾病，如銀屑病關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、多重硬化、腸易激綜合癥、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥和/或過敏如哮喘和慢性阻塞性肺病。
本發(fā)明還有一方面是提供一種可用于治療和/或預(yù)防前述疾病的藥物組合物，其包括通過一種選擇性方法從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物。
除非另有定義，本發(fā)明包含的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。
這里使用的術(shù)語“純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物”含義是基本上僅包含阿拉伯半乳聚糖-蛋白的一種組合物，其中可包含痕量的根據(jù)本發(fā)明從薊罌粟植物的莖和/或葉的萃取物得到的其它組分。該純化的AGP組合物區(qū)別于包含AGP組合物的藥物組合物，因?yàn)榧兓腁GP組合物不包含任何藥理學(xué)可接受的賦形劑。
我們的美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本2003/0194456A1公開了一種從薊罌粟植物的葉和/或莖獲得萃取物的方法，以及利用正丁醇和甲醇分離萃取物分別得到正丁醇可溶性、甲醇可溶性和甲醇不溶性組分。
美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本2003/0194456A1中公開的制備薊罌粟植物的莖和/或葉的各種組分的方法包括以下步驟i)通過一系列萃取步驟制備薊罌粟植物的葉和/或莖的萃取物，優(yōu)選方案是在室溫條件下，利用溶劑如水、乙醇或其混合物通過多步驟、連續(xù)浸泡和滲濾，得到相應(yīng)的萃取物，其由生物堿、類黃酮、氨基酸、有機(jī)酸、糖和鹽組成?？梢圆捎眠@些萃取物或?qū)⑵鋬龈?，二者都可以用來分離；ii)用正丁醇分離步驟i)得到的萃取物或凍干物質(zhì)的水溶液，將正丁醇層從水層中分離，接著用水洗滌正丁醇層，然后在減壓條件下蒸發(fā)溶劑，得到正丁醇可溶性組分粘稠物質(zhì)，其主要由生物堿、類黃酮和其它低分子量化合物組成；iii)將步驟ii)得到的水層和其6-7倍體積的甲醇混合并攪拌，過濾/離心沉淀的固體并干燥，得到甲醇不溶性組分，其主要由多糖、有機(jī)酸和鹽組成。將該物質(zhì)溶于水并冷凍得到凍干粉；和iv)在減壓條件下濃縮從步驟iii)得到的濾液即水-甲醇溶液，得到甲醇可溶性組分的固體物質(zhì)，其主要由氨基酸、有機(jī)酸和無機(jī)鹽組成。
根據(jù)美國(guó)專利申請(qǐng)公開2003/0194456A1的方法分離得到的甲醇不溶性組分的產(chǎn)率約為33％。雖然在說明書中提到該組分由糖、有機(jī)酸和鹽組成，然而這些組分在那時(shí)并沒有被表征。
目前的研究揭示，按照公開在US2003/0194456A1中的方法得到的甲醇不溶性組分包含約3％重量的AGP(相對(duì)于水溶性萃取物)，其余的組分為有機(jī)酸、氨基酸和無機(jī)鹽。也即，根據(jù)US2003/0194456A1中的方法得到的甲醇不溶性組分由AGP混合其它組分組成。雖然濃度和純度都很低，但甲醇不溶性組分包含AGP。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)AGP能夠以純化的形式被分離，其相對(duì)于薊罌粟植物的莖和/或葉的產(chǎn)率約為0.06％，或相對(duì)于通過一種高選擇性方法制備得到的凍干的水溶性萃取物約為1％，被分離出來的AGP比那些通過US2003/0194456A1中公開的方法得到的產(chǎn)品表現(xiàn)出更為優(yōu)異的抗銀屑病活性。
以純化的形式從薊罌粟植物的葉和/或莖分離AGP的選擇性方法包括以下步驟a)用1至10重量份的水、C1-C3醇或其混合物萃取1重量份的薊罌粟植物的葉和/或莖，得到一種水溶性萃取物，其可以但不必部分或完全濃縮或凍干；b)從步驟a)得到的水溶性萃取物、部分濃縮的萃取物、完全濃縮或凍干的萃取物的水溶液中除去堿性和酸性組分，將部分濃縮的萃取物或濃縮萃取物的水溶液通過離子交換色譜，得到中性的水溶性萃取物；c)用正丁醇分離步驟b)得到的中性水溶性萃取物，得到正丁醇可溶性組分；d)將從步驟c)得到的水溶性洗液和甲醇或乙醇混合并攪拌，分離沉淀的固體，得到甲醇或乙醇不溶性組分；和e)將步驟d)得到的甲醇或乙醇不溶性組分連續(xù)通過凝膠色譜和體積排阻色譜(size exclusion chromatography)，得到純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)。
圖1概述了該分離純化AGP的選擇性方法。
薊罌粟植物的葉、莖或二者都可用于萃取。優(yōu)選使用新鮮的葉、莖或二者，且在萃取之前，最好將它們粉碎成或粗或細(xì)的糊狀物。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，1重量份新鮮薊罌粟的粉碎的葉和/或莖用1-10重量份的水、C1-C3的醇或它們的混合物萃取2至4次，且合并的萃取液在20EC至45EC的溫度條件下滲濾2至20小時(shí)。
在另一個(gè)技術(shù)方案中，1重量份薊罌粟的新鮮的粉碎的葉和/或莖被1-3重量份的水、C1-C3的醇或它們的混合物萃取2至4次，合并的萃取液在20EC至45EC的溫度條件下滲濾2至16小時(shí)。
在另一個(gè)技術(shù)方案中，1重量份新鮮薊罌粟的粉碎的葉和/或莖用1-1.5重量份的水、C1-C3的醇或它們的混合物萃取2至4次，合并的萃取物在室溫下滲濾16小時(shí)。
C1-C3的醇選自甲醇、乙醇、1-丙醇和2-丙醇，優(yōu)選乙醇。
滲濾之后過濾或離心該萃取物，濾液可被部分濃縮至相對(duì)于原始萃取液的一定體積或被濃縮至干燥或被凍干。
當(dāng)萃取物被部分濃縮時(shí)，可以濃縮至萃取液原始體積的1/5至1/10。當(dāng)原始萃取液被濃縮至干燥或被凍干時(shí)，在離子交換色譜之前，1重量份干燥的萃取物或凍干的粉末可被再次溶解到12-50倍重量的水中。
在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在離子交換色譜之前，凍干的水溶性萃取物被溶解到12倍的水中。
或者該部分濃縮的萃取物的溶液，或者原始萃取物經(jīng)過完全濃縮得到的濃縮物或凍干粉的水溶液，通過順序離子交換色譜，即陽離子交換樹脂然后陰離子交換樹脂色譜，或者在另一個(gè)離子交換色譜技術(shù)方案中，陰離子交換樹脂之后是陽離子交換樹脂色譜，得到中性的水溶性萃取物。
使用的陽離子和陰離子交換樹脂的比例是相對(duì)于萃取物體積1至50重量份。
可使用的合適的陽離子交換樹脂包括磺化的聚苯乙烯強(qiáng)酸陽離子交換劑和羧酸型弱酸陽離子交換劑。合適的陽離子交換樹脂包括但不限于商業(yè)使用的和通常使用的磺化的聚苯乙烯強(qiáng)酸陽離子交換劑，如AG 50W(Bio-Rad，USA)、Amberlite IR-20(Rohm and Haas，USA)、Dowex 50W(DowChemical Co.，USA)、Duolite 225(Dia-Prosim Ltd)、Permutit RS(PermutitAG，Germany)和Permutite C50D(Philips and Pain-Vermorel，F(xiàn)rance)；羧酸型弱酸陽離子交換劑如Amberlite IRC-50(Rohm and Haas，USA)、Bio-Rex 70(Bio-Rad，USA)、Chelax 100(Bio-Rad，USA)、Duolite 436(Dia-Prosim Ltd)、Permutit C(Permutit AG，Germany)和Permutit H和H-70(Permutit Co.，USA)。
可使用的合適的陰離子交換樹脂包括脂肪胺型弱堿陰離子交換劑和強(qiáng)堿陰離子交換劑。陰離子交換樹脂包括但不限于商業(yè)使用的和通常使用的脂肪胺型弱堿陰離子交換劑，如Amberlites IR-45和IRA-67(Rohm andHaas，USA)、Dowex 3(Dow Chemical Co.，USA)、Permutit E(Permutit AG，Germany)、Permutit A 240A(Philips and Pain-Vermorel，F(xiàn)rance)；強(qiáng)堿陰離子交換劑如AG 2×8(Bio-Rad，USA)、Amberlite IRA-400(Rohm and Haas，USA)、Dowex 2×8(Dow Chemical Co.，USA)、Duolite 113(Dia-Prosim Ltd)、Permutit ESB(Permutit AG，Germany)和Permutite 330D(Philips andpain-Vermorel，F(xiàn)rance)。
凍干由此得到的中性水溶性萃取物，然后將凍干物質(zhì)利用正丁醇和水進(jìn)行分離。或者，同樣的中性水溶性萃取物可選用正丁醇進(jìn)行分離?？紤]到成本因素，通過陽離子和陰離子交換樹脂之后得到的中性組分的溶液優(yōu)選采用正丁醇進(jìn)行分離。
通常來說，將上述提到的中性萃取物的凍干物質(zhì)分散到水和正丁醇的混合物中，靜置該溶液并且分離水層和正丁醇層。重復(fù)該步驟2至4次，合并后的水層用甲醇或乙醇進(jìn)一步分離。
在本發(fā)明的一個(gè)例子中，通過陽離子(Amberlite IR 120)和陰離子(Amberlite IRA 400)交換樹脂之后得到的1體積份的中性水溶液組分加入到約10體積份的正丁醇中?；旌稀㈧o置，從水相中分離正丁醇層。重復(fù)該步驟2至4次，合并的水層用甲醇或乙醇進(jìn)一步分離。
從上述步驟中得到的合并的水相與甲醇或乙醇混合并攪拌，使其沉淀出甲醇/乙醇-不溶性組分。通常每1體積份水溶性萃取物使用1-20倍體積的甲醇或乙醇。
使用傳統(tǒng)的方法分離沉淀出來的固體(其中包含AGP)，如傾濾、過濾、離心等，然后干燥得到一種褐色的無定形粉末。
接著，將得到的固體AGP(其中包含AGP-HM和AGP-LM)先后通過凝膠色譜和體積排阻色譜，得到純化的AGP-HM和AGP-LM。
凝膠色譜采用常規(guī)技術(shù)和聚合物吸附劑，例如Amberlite吸附劑XAD-2、XAD-4或XAD-7，優(yōu)選XAD-7。將不純的固體AGP置于(requisite)柱頂端的狹窄帶并用移動(dòng)相(即水)洗滌。收集包含AGP的組分。
進(jìn)一步通過體積排阻色譜，利用常規(guī)技術(shù)純化含有不純的AGP的洗提液?？梢圆捎肧ephacryl(1∶25-1∶50)以獲得本發(fā)明純化的AGP、AGP(HM)和AGP(LM)?？梢允褂蒙虡I(yè)上的Sephracyl S-100、S-200 HR和S-300 HR，優(yōu)選S-200 HR。以1-2重量份相對(duì)于25到250體積份通過凝膠色譜得到的AGP溶液來使用Sephracyl。
在一個(gè)技術(shù)方案中，將粗AGP(100mg)溶解到水中并加載到sephacrylS-200(25ml)上。以0.5ml/分鐘的速度洗提該柱子，收集50份。用HPLC-ELSD監(jiān)測(cè)所有的組分。以HPLC為基礎(chǔ)，合并組分10-20得到AGP-HM，合并組份25-35得到AGP-LM。AGP組合物的具有10KD至150KD的平均分子量。
體積排阻色譜之后，本發(fā)明純化的AGP可通過常規(guī)技術(shù)手段如蒸發(fā)、凍干、噴霧干燥、冷凍干燥等從水溶液中分離出來。
獲得的純化AGP具有10KD至150KD之間的平均分子量。其具有一種或多種如下的效果免疫抑制、淋巴細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)如IL-2抑制、IFN-γ抑制、IL-10誘導(dǎo)、角質(zhì)細(xì)胞增殖抑制、角質(zhì)分離活性和MEST抑制。我們已經(jīng)知道這些效果與發(fā)炎紊亂、自體免疫疾病和過敏有關(guān)。我們知道這些效果也與抗銀屑病活性、皮炎、硬皮病、濕疹和鱗狀局部發(fā)癢有關(guān)。炎性疾病和自體免疫疾病包括銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩疾病、多重硬化、腸易激綜合癥、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥。銀屑病的類型包括斑塊型銀屑病、點(diǎn)滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和銀屑病甲。過敏包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病。IL-10誘導(dǎo)也可用于其它的慢性、復(fù)發(fā)性和其它包括皮膚淋巴抗原或皮膚白血球抗原的皮膚疾病。
純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物具有優(yōu)異的體內(nèi)和體外抗銀屑病活性(通過IL-10誘導(dǎo)調(diào)控)。
通過體積排阻色譜如sephacryl得到的本發(fā)明純化AGP(水溶性)由幾種具有不同分子量的組分組成。這些組分的平均分子量可高達(dá)115至150KD、低至10至15KD。高分子量的AGP表示為AGP-HM，低分子量的AGP表示為AGP-LM。通常來說，AGP組合物由不同比例的AGP-HM和AGP-LM組成。前述的AGP是通過生物途徑形成的，其中的碳水化合物/單糖不斷地尋找蛋白以形成共價(jià)鍵，最終形成低分子量(AGP-LM)和高分子量(AGP-HM)AGP。這種共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)不斷延伸，在某種特定的方法中，是以平均分子量小于10KD的AGP-LM結(jié)束，還是以平均分子量大于150KD的AGP-HM結(jié)束，取決于多種因素，例如所使用的植物的部位的狀態(tài)即用于萃取的薊罌粟植物的葉或莖是否新鮮，葉片的采集條件即是否是在雨季采集，等等。因此，由于前面提到的因素，通過本發(fā)明方法得到的純化AGP組合物的平均分子量可能在10KD至150KD的范圍之外。根據(jù)以上的觀點(diǎn)，平均分子量在10KD至150KD范圍外的AGP組合物仍然在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，AGP組合物的平均分子量下限為9KD或上限為155KD。
根據(jù)本發(fā)明方法得到的AGP的主要部分是碳水化合物和少量蛋白。AGP中的碳水化合物組分是阿拉伯糖、鼠李糖、甲基化糖醛酸、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和其它未鑒定的糖。它們和蛋白組分(包含各種氨基酸)相連，所述氨基酸是門冬氨酸、谷氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等，可以從說明書表-I和II清楚地看到。
我們發(fā)現(xiàn)，AGP-HM和AGP-LM不僅僅在糖基組成方面類似，即它們中單糖和蛋白的比率類似，而且它們的糖基連接也相似。
我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這兩種分子量組分的生物活性是可比的，沒有太大的區(qū)別。也就是說，分子量為10KD的純化AGP-LM具有一種或多種免疫抑制，淋巴細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)如IL-2抑制、IFN-γ抑制、和IL-10誘導(dǎo)，角質(zhì)細(xì)胞增殖抑制，角質(zhì)分離活性，MEST抑制和最重要的抗銀屑病活性，其能力和那些分子量為150KD的純化的AGP-HM的能力相當(dāng)。
本發(fā)明AGP組合物由AGP(AGP-HM和AGP-LM)組成，基本上不含有植物萃取物中的其它成分(它們?yōu)樯飰A、類黃酮、有機(jī)酸、氨基酸、糖、多糖、蛋白、蛋白聚糖類(不包括AGP)和鹽的混合物)。此處使用的術(shù)語“基本上不含有”是指AGP組合物包含從約0.0001％至約10％重量的植物萃取物中的其它組分。
正丁醇組分包含生物堿(如金英花堿、硝酸金英花堿、小檗堿、硝酸小檗堿、隱品堿、別隱品堿、黃連堿、鹽酸血根堿、二氫鹽酸血根堿、去甲基鹽酸血根堿、6-丙酮基二氫鹽酸血根堿、二氫白屈菜紅、白屈菜紅、去甲基白屈菜紅、6-丙酮基二氫白屈菜紅、(-)cheilanthifolin、(-)-[β]-延胡索單酚堿methohydroxide、(-)-[a]-刺罌粟堿methohydroxide、6-丙酮基二氫鹽酸血根堿、(-)-[a]-四氫掌葉防己堿methohydroxide、瑞枯靈、白蓬草福林、隱品巴馬亭、argemonine、norargeminine、helleritrine、oxyhydrastinine)，類黃酮(如異鼠李素、異鼠李素-3-葡糖苷和異鼠李素-3，7-二葡糖苷)及其它低分子量化合物的混合物；甲醇可溶性組分包含氨基酸(如組氨酸、酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、精氨酸、絲氨酸、門冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、羥基輔氨酸、輔氨酸和天門氨酸)、糖和鹽；且甲醇不溶性組分包含有機(jī)酸(如琥珀酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸)、單糖、多糖、蛋白多糖(包括AGP)和鹽。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，AGP組合物中其它植物萃取物組分的重量低于1％。
通過本發(fā)明的方法分離得到的純化的AGP組合物是一種優(yōu)秀的ConA活化的人PBMCs的IL-10誘導(dǎo)劑。在濃度為200μg/ml它產(chǎn)生約371％誘導(dǎo)，大大高于通過US2003/0194456A1方法得到的甲醇不溶性組分的數(shù)值(以同樣的濃度200μg/ml，約171％)。
特別值得注意的是，即使在非常低的0.2至2.0μg/ml的濃度，分離的AGP組合物表現(xiàn)出的IL-10誘導(dǎo)作用等價(jià)于或大于那些通過US2003/0194456A1中的方法得到的甲醇不溶性組分。
本發(fā)明中的AGP和通過US2003/0194456A1中描述的方法得到的甲醇不溶性組分的ConA誘導(dǎo)人PBMCs的IL-10誘導(dǎo)作用的濃度效果對(duì)比概括在表IA中。
表IA本發(fā)明的AGP組合物和US2003/0194456A1中描述的方法制備得到的甲醇不溶性組分的ConA誘導(dǎo)人PBMCs的IL-10誘導(dǎo)作用的效果的對(duì)比

*數(shù)值從底部以相對(duì)于對(duì)照百分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)來進(jìn)行描述。
**按照US2003/0194456A1中公開的方法得到的甲醇不溶性組分平均誘導(dǎo)率％在濃度200μg/ml時(shí)為171％。
通過所述方法獲得的AGP的強(qiáng)大的有效活性使其可以非常低的濃度(按照US2003/0194456A1描述的方法得到的萃取物/組分濃度的1/100至1/1000的劑量)來給藥，因而提供一種節(jié)約成本的、有效的和耐受性好的治療銀屑病和其它疾病的方法。
本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中包含有效量的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物(平均分子量為10KD至150KD，通過上文列舉的選擇性方法從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到)和藥理學(xué)可接受的賦形劑混合。本發(fā)明的組合物安全、有效并且耐受性好。
適合用于本發(fā)明的藥物組合物包括可達(dá)到治療目的有效量的活性成分。有效量指的是AGP組合物的量可引起組織、細(xì)胞、系統(tǒng)、動(dòng)物、非人類哺乳動(dòng)物或人類哺乳動(dòng)物生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)。所述情形中可存在疾病/癥狀的減速、中斷、穩(wěn)定或停止，但是疾病和癥狀不必然完全消除，但是包括疾病的預(yù)防治療。
與一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑混合，如載體、稀釋劑、填料和其它類似物，本發(fā)明AGP組合物可制成合適的劑型。合適的劑型是指適于口服或局部使用。這種劑型的實(shí)例包括但不限于液體、干粉、粉狀濃縮物、膠囊、片劑、糖丸、顆粒、凝膠、軟膏、乳膏、乳狀液、懸浮液、分散液、洗液、丸劑及其類似物。
通常情況下，口服的藥物組合物包含的AGP組合物活性成分在50-5000mg之間，優(yōu)選200mg。
通常情況下，典型的局部使用的藥物組合物包含AGP組合物活性成分0.1-10％重量，優(yōu)選2％重量。
AGP組合物或包含AGP組合物的藥劑的預(yù)防或治療劑量是每天50mg至5000mg，優(yōu)選每天200mg。該劑量可以一次給藥或多次給藥。
然而，病人或醫(yī)療衛(wèi)生人員可根據(jù)患者的情況、疾病發(fā)展?fàn)顩r以及是治療還是預(yù)防來選擇具體的劑型、給藥方式和劑量。具有患病風(fēng)險(xiǎn)的群體可以給予預(yù)防的劑量。風(fēng)險(xiǎn)因素包括但不限于遺傳和環(huán)境因素。最佳情況是，藥物組合物劑量能產(chǎn)生期望的結(jié)果又不會(huì)產(chǎn)生消極的副作用。術(shù)語“病人”意思是動(dòng)物、非人類哺乳動(dòng)物或人類哺乳動(dòng)物。
混合本發(fā)明的AGP組合物和藥學(xué)可接受的載體，制備合適的口服和局部使用藥劑。
適合口服給藥的劑型包括片劑、膠囊、濃縮粉、糖漿、酏劑或懸浮劑。適合局部使用的劑型包括軟膏、油膏、洗劑、油或經(jīng)皮藥劑傳送體系。
合適的藥學(xué)可接受賦形劑包括糖如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇和木糖醇；淀粉如玉米淀粉、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；磷酸鈣如磷酸二鈣和磷酸三鈣；硫酸鈉；硫酸鈣；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；植物油如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油和玉米油；非離子、陽離子和陰離子表面活性劑；乙烯乙二醇聚合物；β-環(huán)糊精；脂肪醇；水解谷類固體；以及其它非毒性相容填料、粘合劑、分解劑、緩沖劑、保護(hù)劑、抗氧化劑、潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑等。
本發(fā)明的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)制備。
藥學(xué)可接受的組合物是指它們適用于人和/或動(dòng)物。
本發(fā)明的AGP組合物和藥學(xué)組合物用于治療和/或預(yù)防這里描述的疾病。
本發(fā)明的AGP組合物或包含本發(fā)明AGP組合物的藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防銀屑病類皮膚病，如銀屑病(包括斑塊型銀屑病、點(diǎn)滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病、和銀屑病甲)，包括給予需要治療或具有患銀屑病風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物有效量的AGP組合物，或含有治療有效量的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物的藥物組合物。
AGP組合物或包含AGP組合物的藥物組合物可用于治療或預(yù)防炎性疾??；自體免疫疾病如銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、多重硬化、刺腸易激綜合癥、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和干燥綜合癥；過敏如哮喘和慢性阻塞性肺病；治療或預(yù)防包括給予需要治療的哺乳動(dòng)物或具有患病風(fēng)險(xiǎn)或正在發(fā)作這些疾病之一的哺乳動(dòng)物治療有效量的AGP組合物或包含治療有效量的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物的藥物組合物。
由于本發(fā)明的組合物可引起免疫抑制，因此對(duì)于那些希望進(jìn)行或已經(jīng)接受器官移植的病人也有用。
AGP組合物的結(jié)構(gòu)說明和表征測(cè)定AGP組合物中的碳水化合物的含量以D-半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)，通過苯酚-硫酸方法測(cè)定本發(fā)明AGP組合物中的總碳水化合物的含量。AGP組合物、AGP-HM和AGP-LM分別溶解到蒸餾水中至濃度為0.16mg/ml。三種溶液各取1ml，分別加入1ml 5％的苯酚溶液和10ml的硫酸。將它們旋轉(zhuǎn)混合，冷卻至室溫。在480nm測(cè)定其吸光度。和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)相比，AGP組合物中碳水化合物的含量分別在45-98％范圍內(nèi)。
測(cè)定AGP組合物的蛋白含量通過Bradford方法測(cè)定本發(fā)明AGP組合物中的總蛋白含量。AGP組合物、AGP-HM和AGP-LM中的蛋白含量在2-20％之間。使用標(biāo)準(zhǔn)、通過氨基酸分析儀鑒定，AGP組合物中的氨基酸組成為門冬氨酸、谷氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。
利用水解和薄層色譜(TLC)來鑒定AGP組合物中的糖基和氨基酸含量。將通過體積排阻色譜后的20mg中性組分加入密封小瓶?jī)?nèi)，用2M三氟乙酸(TFA，200μl)進(jìn)行水解。在100℃加熱小瓶1小時(shí)，濃縮并凍干。利用標(biāo)準(zhǔn)的糖和氨基酸樣品對(duì)混合物進(jìn)行薄層色譜(TLC)。觀察到的結(jié)果表明存在單糖如阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖。也觀察到了氨基酸如纈氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、γ-氨基丁酸、異亮氨酸和組氨酸。
測(cè)定AGP組合物中的糖基含量通過AGP-HM和AGP-LM酸性甲醇分解產(chǎn)生的單糖甲基葡萄糖的對(duì)-O-三甲基硅烷(TMS)衍生物，結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)分析來進(jìn)行糖基含量分析。
先將AGP的干品在80℃條件下(18-22小時(shí))，于存在1M鹽酸的甲醇中醇解，制備甲基葡萄糖，接著用吡啶和乙酸酐在甲醇中再次N乙酰化(測(cè)定氨基糖)。樣品接著用三硅酸(Pierce)在80℃條件下處理(0.5小時(shí))進(jìn)行對(duì)-O-三甲基硅烷化。這些程序和描述York，W.S.，Darvill，A.G.，McNeil，M.，Stevenson，T.T.，and Albersheim，P.，Methods Enzymol，1985，230，1-15和Methods Enzymol，1985，118，3-40中的一致。
TMS甲基葡萄糖的GC/MS分析用HP 5890 GC連接5970 MSD進(jìn)行，采用All Tech EC-1熔合硅膠柱(30m×0.25mm ID)。
表I概括了AGP組合物中的糖基組分表IAGP組合物中的糖基組分

測(cè)定AGP組合物中的糖基連接NaOH方法AGP組合物的樣品全甲基化、降解、還原和乙?；?；得到部分甲基化糖醇乙酸(PMAAs)，通過之前描述過的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)進(jìn)行糖基分析(York，W.S.，Darvill，A.G.，McNeil，M.，Stevenson，T.T.，and Albersheim，P.，Methods Enzymol.，1985，230，1-15；York，W.S.，Darvill，A.G.，McNeil，M.，Stevenson，T.T.，and Albersheim，P.，MethodsEnzymol，1985，118，3-40)。
起初，一份樣品全甲基化(通過Ciukanu and Kerek，Carbohydr.Res.，1984，131，209-217中的方法)，包括用氫氧化鈉和甲基碘在干燥的DMSO中處理。重復(fù)兩次全甲基化以幫助聚合物完全甲基化。之后是樣品診斷，用2M三氟乙酸水解全甲基化材料(在密封瓶中，121℃反應(yīng)2小時(shí))，用NaBD4還原，用無水乙酸/吡啶乙?；５玫降牟糠旨谆谴家宜?PMAAs)用Hewlett Packard 5890 GC連接5970 MSD分析(質(zhì)量選擇性檢測(cè)器，電子轟擊電離源)；在30m Supelco 2330鍵合相融合硅膠柱上進(jìn)行分離。
表-II概括了糖基連接的百分比。
表IIAGP組合物中的糖基連接

測(cè)定AGP組合物的分子量對(duì)AGP組合物、AGP-HM和AGP-LM，采用水體含水凝膠滲透色譜(GPC)儀器Model Alliance 2690(裝有累積溶劑和樣品管理單元及折光率檢測(cè)器，包括熱隔離流體單元和逆流光學(xué)熱交換器，以實(shí)現(xiàn)更好的基線穩(wěn)定性)分析。色譜工作站包括數(shù)據(jù)采集和控制軟件以及數(shù)據(jù)處理軟件Millenium。GPC柱來自于Tosoh公司(TSK-GEL PW型)，由基于半剛性凝膠的親水溶性聚合物組成。對(duì)多糖(葡聚糖)的排除限制從1,000至7,000,00分子量。這些柱子設(shè)計(jì)成用于分析和制備分離合成的水溶性聚合物、低聚物和生物學(xué)物質(zhì)如多糖、核酸、蛋白、肽等。普魯蘭(pullulan)試劑盒由用于柱標(biāo)定的不同分子量的多糖樣品組成。
可以根據(jù)各種分析條件如不同孔隙的柱、移動(dòng)相的濃度和性質(zhì)、流體速率、檢測(cè)靈敏度等來利用GPC方法。通過0.2M硝酸鈉溶液獲得最佳的多糖樣品分離結(jié)果，以下是表征基于多糖的藥物分子的分析條件。
通過比較體積排阻色譜的洗脫時(shí)間來測(cè)定AGP組合物的分子量。通過對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)AGP組合物的平均分子量在10KD至150KD之間。
以類似的方式測(cè)定AGP-LM和AGP-HM的分子量。通過對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)各組分的平均分子量分別為13KD和115KD。
AGP組合物的傅利葉變換紅外光譜(FT-IR)利用KBr小球中的石蠟糊，通過傅利葉變換紅外色譜(8201 PCShimadzu)測(cè)定本發(fā)明AGP-HM的紅外光譜。結(jié)果表明在3400cm-1有寬的吸收峰，揭示其中存在羥基基團(tuán)，2850-2960cm-1的峰揭示有CH鍵的拉伸。
h)AGP組合物的1H核磁共振光譜本發(fā)明的AGP的1H核磁共振光譜用Bruker DRX 500核磁共振光譜儀記錄在D2O中，500MHz。
通過甲基化分析檢測(cè)所有主要連接鍵的大規(guī)模質(zhì)子定位。在1H核磁共振光譜中，檢測(cè)到了對(duì)應(yīng)于β-D-Gal-p殘基(d 4.22-4.47)和a-L-Ara-f殘基(d 5.17-5.33)的H-1信號(hào)。d 3.53-4.22之間有多個(gè)信號(hào)，對(duì)應(yīng)于β-D-Gal-p殘基的H-2至H-6、a-L-Ara-f殘基的H-2至H-5、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖小殘基的H-2至H-5。進(jìn)行2D同核和異核試驗(yàn)，以分辨并將這些信號(hào)定位至特定的殘基。不同的連接鍵在2D光譜中的每個(gè)自旋體系上的定位，與表II中的連接鍵數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)中報(bào)道的其它AGP的NMR數(shù)據(jù)比較相一致。
端基質(zhì)子在d 5.33和d 5.17中觀察到的端基質(zhì)子被分別定位到端位和5聯(lián)(linked)a-L-Ara-f殘基。在d 5.17的信號(hào)也被定位到端基a-L-Rhap，d 5.10的信號(hào)定位至4聯(lián)a-L-Rha p。類似地，在d 4.61的信號(hào)被定位到3聯(lián)a-L-Rha p。在d 4.56的信號(hào)被定位到6聯(lián)β-D-Gal p。在d 4.61的信號(hào)被定位到3聯(lián)β-D-Gal p，在d 4.56和4.57的信號(hào)被定位到端基β-D-Gal p和3聯(lián)、6聯(lián)β-D-Gal p。
H-2質(zhì)子在d 4.31和4.22的信號(hào)被分別定位到端基和5聯(lián)a-L-Araf殘基的H-2。進(jìn)一步地，在d 3.45的信號(hào)被定位到β-D-Gal p，在d 3.74的信號(hào)被定位到3聯(lián)、6聯(lián)和3，6聯(lián)β-D-Gal p殘基。在d 4.03，3.74和3.57的信號(hào)被分別定位到4聯(lián)、3聯(lián)和端基a-L-Rha p的H-2質(zhì)子。
H-3質(zhì)子在d 4.03的信號(hào)被定位到端基和5聯(lián)a-L-Ara f殘基。進(jìn)一步地，在d 3.81的信號(hào)被定位到端基和6聯(lián)β-D-Gal p。類似地，在d 4.31的信號(hào)被定位到3聯(lián)和3，6聯(lián)β-D-Gal p基團(tuán)。在d 3.93、3.63和3.57的信號(hào)被分別定位到4聯(lián)、3聯(lián)和端基a-L-Rha p。
H-4質(zhì)子在d 4.22的信號(hào)被定位到端基和5聯(lián)a-L-Ara f。在d 3.63的信號(hào)被定位到3聯(lián)和6聯(lián)β-D-Gal p殘基。進(jìn)一步地，在d 3.86和4.03的信號(hào)被分別定位到端基和3，6-聯(lián)β-D-Gal p。類似地，在d 3.63、3.09和2.82的信號(hào)被定位到4聯(lián)、3聯(lián)和端基的a-L-Rha p基團(tuán)。
H-5質(zhì)子在d 3.81的信號(hào)被定位到6聯(lián)和3，6聯(lián)β-D-Gal p。類似地，在d 4.03的信號(hào)被定位到端基和3聯(lián)β-D-Gal p。在d 3.91和3.93的信號(hào)被分別定位到端基和5聯(lián)a-L-Ara f。在d 4.22、4.03和3.09的信號(hào)被定位到端基、4聯(lián)和3聯(lián)(linked)a-L-Rha p的H-5。在d 4.03，3.45和4.03的信號(hào)被分別定位到3聯(lián)β-D-Gal p和端基β-D-Gal p殘基的H-5。
H-6質(zhì)子在d 3.93的信號(hào)被定位到6聯(lián)和3，6聯(lián)β-D-Gal p。在d 3.91和3.81的信號(hào)被分別定位到端基和3聯(lián)β-D-Gal p。在d 1.03、1.34和1.40觀察到的甲基質(zhì)子被定位到3聯(lián)、4聯(lián)和端基的a-L-Rha p基團(tuán)。
上述定位被HOMOCOSY試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
氨基酸殘基在d 1.03觀測(cè)到纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的甲基，而蘇氨酸和丙氨酸的甲基分別在d 1.34和1.40。
在d 1.3-2.8之間觀測(cè)到精氨酸、門冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和纈氨酸的Ca、Cβ(C-H，CH2)、Cγ(CH2)和Cd(CH2)質(zhì)子。
在d 2.8-3.5之間觀測(cè)到門冬氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的Cβ(CH2，CH)、Cγ、Cd的質(zhì)子。
在d 3.5-3.9之間觀測(cè)到丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的Ca質(zhì)子。
在d 3.90-4.2之間觀測(cè)到門冬氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸的Ca質(zhì)子和絲氨酸、蘇氨酸中的Cβ質(zhì)子。
在低磁場(chǎng)區(qū)域d 6.6-7.5的弱信號(hào)被定位到苯胺和酪氨酸的N-H和芳香質(zhì)子。
i)AGP組合物的13C核磁共振光譜端基碳在13CNMR光譜中，在d 109.10和107.37的信號(hào)被定位到端基和5聯(lián)a-L-Ara f基團(tuán)的端基碳。在d 103-102之間的信號(hào)被定位到端基、3聯(lián)、6聯(lián)和3，6聯(lián)β-D-Gal p殘基的端基碳。在d 103-102之間重疊的同樣信號(hào)被定位到4聯(lián)β-D-Glu p，4聯(lián)β-D-xyl p，端基β-D-Glc p和3聯(lián)a-L-Rha p的端基碳。
C-2在d 81.97的信號(hào)被定位到5聯(lián)a-L-Ara f基團(tuán)。在d 72.94和72.72的C-2信號(hào)被分別定位到端基和6聯(lián)β-D-Gal p殘基。在d 72.56的信號(hào)被定位到3聯(lián)和3，6聯(lián)的β-D-Gal p殘基。類似地，在d 74.81、74.60和73.33觀測(cè)到的信號(hào)被分別定位到端基和6聯(lián)β-D-Glc p的C-2。在d 80.02、76.55和70.68觀測(cè)到的信號(hào)分別被定位到端基、3聯(lián)和4聯(lián)的a-L-Rha p殘基中的C-2。在d 81.24的信號(hào)被定位到2聯(lián)β-D-Man p殘基。
C-3在d 76.55的信號(hào)被定位到端基和5聯(lián)a-L-Araf。在d 74.81的信號(hào)被定位到端基和6聯(lián)β-D-Galp。進(jìn)一步地，在d 81.97的信號(hào)被定位到3聯(lián)和3，6聯(lián)β-D-Galp殘基。在d 76.55和74.81的信號(hào)被定位到端基、4聯(lián)和6聯(lián)β-D-Glc p基團(tuán)。類似地，在d 80.02、76.55和70.6的信號(hào)被分別定位到端基、3聯(lián)和4聯(lián)a-L-Rha p基團(tuán)。
C-4在d 83.85的信號(hào)被定位到端基和5聯(lián)a-L-Ara f基團(tuán)。在d 70.15的信號(hào)被定位到端基β-D-Galp殘基。在d 70.68的信號(hào)被定位到3聯(lián)和6聯(lián)β-D-Gal p殘基。而在d 73.33的信號(hào)被定位到3，6聯(lián)β-D-Gal p殘基。在d 80.02，70.68和70.15的信號(hào)被分別定位到6聯(lián)和端基β-D-Glc p基團(tuán)的C-4。在d 81-83的信號(hào)被定位到3聯(lián)、4聯(lián)和端基a-L-Rha p基團(tuán)的C-4。
C-5在d 69.17觀測(cè)到的信號(hào)被定位到5聯(lián)a-L-Ara f中的C-5，而在d 61.25觀測(cè)到的信號(hào)被定位到端基a-L-Ara f的C-5。在d 74-77之間觀測(cè)到的信號(hào)被定位在3聯(lián)、6聯(lián)和端基β-D-Gal p殘基的C-5，在d 75-76之間觀測(cè)到的信號(hào)被定位到端基β-D-Glc p基團(tuán)的C-5。
C-6在d 69.17觀測(cè)到的信號(hào)被定位到6聯(lián)、3，6聯(lián)β-D-Gal p殘基的C-6，在d 60.93和61.25觀測(cè)到的信號(hào)被分別定位到3聯(lián)和端基β-D-Galp殘基的C-6。在d 60-62之間觀測(cè)到的信號(hào)被定位到端基β-D-Glc p中的C-6，在d 70.1觀測(cè)到的信號(hào)被定位到6聯(lián)β-D-Glc p中的C-6。
甲基在d 16.7、19.9和22.2觀測(cè)到的信號(hào)被定位到a-L-Rha p的甲基。
上述信號(hào)的定位通過HETCOR試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
氨基酸在d 16.70的信號(hào)被定位到纈氨酸的Cγ和Cd甲基、丙氨酸的Cβ甲基和甲硫氨酸的Cd甲基。在d 19.97的信號(hào)被定位到蘇氨酸的Cγ甲基。在d 22.22的信號(hào)被定位到精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的Cγ(CH2)，Cγ(C-H)和亮氨酸的Cd和Ce甲基。
在d 31.01的信號(hào)被定位到精氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、脯氨酸的Cβ(CH2)和谷酰胺的Cγ(CH2)。
在d 38.05的信號(hào)被定位到門冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的Cβ(CH2)、甘氨酸的Ca和精氨酸、賴氨酸的Cd(CH2)。在d 48.45的信號(hào)被定位到丙氨酸、門冬氨酸、亮氨酸的Ca質(zhì)子以及脯氨酸的Cd。
在d 59.81的信號(hào)被定位到精氨酸、胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸的Ca質(zhì)子。在d 60.9的信號(hào)被定位到纈氨酸和蘇氨酸的Ca質(zhì)子，在61.25的信號(hào)被定位到脯氨酸的Ca質(zhì)子和絲氨酸的Cβ質(zhì)子。
在d 68.38的信號(hào)被定位到絲氨酸的Cβ(CH)。
在d 108-140之間的信號(hào)被定位到組氨酸的烯族質(zhì)子和苯丙氨酸的芳香質(zhì)子。
在d 155.64的信號(hào)被定位到精氨酸的Ce和酪氨酸的C-4，在d 166.19的羰基信號(hào)被定位到谷氨酸。
在低磁場(chǎng)區(qū)域，在d 171-175之間觀測(cè)到的信號(hào)被定位到氨基酸丙氨酸、精氨酸、門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羰基基團(tuán)。
總之，AGP-HM的結(jié)構(gòu)以6聯(lián)吡喃半乳糖和3，6聯(lián)吡喃半乳糖作為骨架，終端位置有呋喃阿拉伯糖基、吡喃阿拉伯糖基、吡喃鼠李糖基、吡喃葡萄糖基和吡喃半乳糖基。AGP進(jìn)一步包含3聯(lián)、4聯(lián)吡喃鼠李糖基，2聯(lián)吡喃甘露糖基，2聯(lián)吡喃葡萄糖基，3聯(lián)、4聯(lián)吡喃半乳糖基，6聯(lián)、3，6聯(lián)吡喃半乳糖基和4聯(lián)吡喃木糖糖基以及甲基糖醛酸。經(jīng)鑒定AGP組合物的氨基酸組成為門冬氨酸、谷氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。然而，氨基酸的連接位置還沒有確定。AGP-LM也具有類似的結(jié)構(gòu)但是分子量不同?；谇笆龅臄?shù)據(jù)，提出AGP組合物的以下結(jié)構(gòu)(圖2)。AGP-HM和AGP-LM均擁有類似的生物學(xué)活性，因此AGP組合物已經(jīng)被用于所有的生物學(xué)研究。
AGP組合物的免疫學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)以下部分描述細(xì)胞因子化驗(yàn)如IL-2、IFN-γ、IL-10和其它的體內(nèi)活性，如豚鼠中的遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)。表-III為按照US2003/0194456A1公開的方法得到的水溶性萃取物和本發(fā)明的AGP組合物的生物活性對(duì)比。
表III按照US2003/0194456A1公開的方法得到的水溶性萃取物(1)和本發(fā)明的AGP組合物(2)的生物活性對(duì)比

AGP組合物的毒性研究通過大鼠和小鼠口服、靜脈注射評(píng)價(jià)AGP組合物的急性毒性(LD50)。每種類型、每種方式、每種劑量的10只動(dòng)物作為一組進(jìn)行給藥，在第15天計(jì)算結(jié)果。
對(duì)于AGP組合物觀測(cè)到以下數(shù)值小鼠口服LD0 ＞5000mg/kg重量小鼠靜脈注射LD0 ＞1000mg/kg重量大鼠口服LD0 ＞5000mg/kg重量大鼠靜脈注射LD50 ＞250mg/kg重量
AGP組合物的生物學(xué)試驗(yàn)評(píng)價(jià)人類IL-10產(chǎn)生的方法為了評(píng)價(jià)AGP組合物治療銀屑病的潛在效力，用ConA誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生IL-10的試驗(yàn)評(píng)價(jià)體內(nèi)IL-10的誘導(dǎo)效果[Raychudhuri S.P.，F(xiàn)arber E.M.，Raychudhuri S.K.，Int.J.Immunopharmacol.，1999，21，609]。
簡(jiǎn)要地說，分離人類PBMCs(末梢血同核細(xì)胞)并用10μg/ml的ConA加上各種濃度的AGP組合物激活，在CO2保溫器中于5％CO2存在下37℃保溫48小時(shí)。收集上清液并在-70℃冷凍直到ELISA定量檢測(cè)。所用的人類IL-10 ELISA試劑盒來自用于檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中IL-10的R和D系統(tǒng)。根據(jù)對(duì)照來計(jì)算誘導(dǎo)百分率。結(jié)果歸納在表IV中。
分離自薊罌粟的AGP組合物在0.0002μg/ml至200μg/ml的范圍內(nèi)增加了ConA活化人類PBMCs的IL-10產(chǎn)量(圖3)。IL-10在銀屑病治療中是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，眾所周知其在抗銀屑病治療中產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。
IL-10誘導(dǎo)在治療和/或預(yù)防銀屑病、皮炎、硬皮病、炎性疾病和其它自體免疫疾病如銀屑病關(guān)節(jié)炎、斑塊型銀屑病、點(diǎn)滴狀銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、多重硬化、腸應(yīng)激綜合癥、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、過敏如哮喘、慢性阻塞性肺疾病和相關(guān)疾病如濕疹和鱗狀發(fā)癢斑塊中非常有用。IL-10誘導(dǎo)在其它慢性、復(fù)發(fā)性和其它皮膚疾病(涉及到皮膚淋巴抗原或皮膚白血球抗原的)中也有用。
表IVAGP組合物通過ConA誘導(dǎo)人類PBMCs的IL-10誘導(dǎo)效果

*數(shù)值以相對(duì)于底部的百分率增長(zhǎng)來描述。
評(píng)價(jià)人類IL-2和IFN-γ產(chǎn)生的方法為了評(píng)價(jià)AGP組合物對(duì)于銀屑病治療潛力的效力，通過植物血凝素(PHA)誘導(dǎo)PBMCs的IL-2和IFN-γ產(chǎn)生抑制試驗(yàn)來評(píng)價(jià)其體外調(diào)節(jié)IL-2和IFN-γ的效果[Brynskov J，Tvede N.，Out，1990，31(7)，795]。
這項(xiàng)研究的目的是評(píng)價(jià)AGP在PHA誘導(dǎo)產(chǎn)生人類淋巴細(xì)胞的IL-2和IFN-γ方面的效果。簡(jiǎn)要地說，從健康個(gè)體采集末梢血同核細(xì)胞(PBMC)。每毫升一百萬PBMC用PHA(5μg/ml)加上從薊罌粟分離得到的各種濃度的AGP組合物在存在5％CO2的CO2保溫器中于37℃激活48小時(shí)。收集上清液并在-70℃冷凍。使用的人類IL-2和人類IFN-γELISA試劑盒來自檢測(cè)培養(yǎng)物上清液中EL-2和IFN-γ的R和D系統(tǒng)。根據(jù)對(duì)照計(jì)算誘導(dǎo)百分率。
在濃度0.002μg/ml至20μg/ml之間，從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到的AGP組合物抑制有絲分裂素(mitogen)誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)生(圖4)。我們已經(jīng)知道對(duì)有絲分裂素IL-2產(chǎn)生的抑制活性是免疫抑制，并在治療和/或預(yù)防銀屑病方面非常有用。結(jié)果概括在表V中。
表VAGP組合物對(duì)PHA誘導(dǎo)人類PBMCs產(chǎn)生IL-2的效果

*該數(shù)值是相對(duì)于對(duì)照的抑制百分率濃度在0.0002μg/ml至2μg/ml之間的分離自薊罌粟的AGP組合物抑制有絲分裂素誘導(dǎo)IFNγ產(chǎn)生(圖5)。已知對(duì)有絲分裂素誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的抑制活性是免疫抑制，并在治療和/或預(yù)防銀屑病方面非常有用。結(jié)果概括在表VI中。
表VIAGP組合物對(duì)PHA誘導(dǎo)人類PBMCs產(chǎn)生IFN-γ的效果


*該數(shù)值是相對(duì)于對(duì)照的抑制百分率人類GMCSF和TNF-a產(chǎn)生的評(píng)價(jià)方法為了評(píng)價(jià)本發(fā)明AGP組合物的銀屑病治療潛力的效果，通過ConA和LPS激活PBMCs的GMCSF和TNFγ產(chǎn)生抑制試驗(yàn)來評(píng)價(jià)其體外粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)和TNF-a調(diào)節(jié)作用。
簡(jiǎn)要來說，從健康志愿者的血液分離得到人類PBMCs，用10μg/mlConA加上各種濃度的AGP組合物激活，在CO2保溫器中5％CO2存在下于37℃保溫48小時(shí)。加入5μg/ml的LPS，在同樣條件下保溫24小時(shí)。收集上清液并冷凍至用ELISA定量檢測(cè)細(xì)胞因子。根據(jù)對(duì)照計(jì)算抑制百分率。
在濃度0.02μg/ml至2μg/ml之間，從薊罌粟分離得到的AGP組合物抑制有絲分裂素誘導(dǎo)GMCSF產(chǎn)生(圖6)。已知對(duì)有絲分裂素GMCSF產(chǎn)生的抑制活性是免疫抑制，并在治療和/或預(yù)防銀屑病方面非常有用。結(jié)果概括在表VIII中。
表VIIAGP組合物通過ConA和LPS誘導(dǎo)人類PBMCs產(chǎn)生GMCSF的效果

*該數(shù)值是相對(duì)于對(duì)照的抑制百分率在濃度0.002μg/ml至2μg/ml之間，從薊罌粟分離得到的AGP組合物抑制有絲分裂素誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-a(圖7)。已知對(duì)有絲分裂素TNF-a產(chǎn)生的抑制活性是免疫抑制，并在治療和/或預(yù)防銀屑病方面非常有用。結(jié)果概括在表VIII中。
表VIIIAGP組合物通過ConA和LPS誘導(dǎo)人類PBMCs產(chǎn)生TNF-a的效果

*該數(shù)值是相對(duì)對(duì)照的抑制百分率AGP組合物對(duì)于NGF誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞增殖的效果角質(zhì)細(xì)胞從GIBCO(USA)購(gòu)買，并補(bǔ)充生長(zhǎng)因子，保持在角質(zhì)細(xì)胞-血清自由培養(yǎng)基(GIBCO，#10744-019)中。將含有2000個(gè)細(xì)胞的大約150μl的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)(KGM)加入到96孔平底培養(yǎng)板的每個(gè)孔中。第二天將介質(zhì)變?yōu)轶w積比為1∶2的KGM∶KBM(角質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)介質(zhì))。將30微升的稀AGP組合物一式三份加入到除對(duì)照細(xì)胞孔之外的每個(gè)孔中。將100ng/ml的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)加入到每個(gè)孔中。保溫8天之后除去介質(zhì)。細(xì)胞用PBS淋洗。加入LDH(乳酸脫氫酶)展開溶解溶液(development lysis solution)并在37℃保溫10分種。在波長(zhǎng)為492nm時(shí)用ELISA讀寫器測(cè)定OD。計(jì)算增殖/抑制百分率。結(jié)果概括在表IX中。
表IXAGP組合物在NGF誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞增殖方面的效果

*該數(shù)值是相對(duì)于對(duì)照的抑制百分率在濃度0.0001μg/ml至40μg/ml之間，分離自薊罌粟的AGP組合物抑制NGF誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞增殖(圖8和9)。已知NGF誘導(dǎo)人類角質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制活性是免疫抑制，并在治療和/或預(yù)防銀屑病方面非常有用。
利用豚鼠的延遲型過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)體內(nèi)免疫抑制效果的方法利用標(biāo)準(zhǔn)化程序來評(píng)價(jià)AGP組合物抑制純化的蛋白衍生物(PPD)誘導(dǎo)豚鼠的延遲型過敏反應(yīng)的能力的體內(nèi)效果。簡(jiǎn)單地說，豚鼠用100μg的PPD結(jié)合福氏完全佐劑皮下注射敏化。隨后用100μg的PPD結(jié)合福氏不完全佐劑間隔一星期給藥以增強(qiáng)。AGP組合物口服給藥一天一次，連續(xù)28天。在第28天給動(dòng)物皮下激發(fā)100μg的PPD，激發(fā)24小時(shí)之后用Varnier′s測(cè)徑器測(cè)量對(duì)照和注射了PPD的皮膚厚度的差異。通過減去同一只豚鼠用鹽水注射后的皮膚厚度來計(jì)算皮膚厚度的差異。通過對(duì)照鹽水激活的動(dòng)物來計(jì)算抑制百分率。
當(dāng)口服0.10-100mg/kg時(shí)，從薊罌粟分離得到的AGP組合物的PPD敏化和PPD激發(fā)豚鼠的免疫抑制活性為20-65.89％。PPD激發(fā)豚鼠引起皮膚厚度50％抑制的有效劑量(ED50)為口服0.508mg/kg(圖10)。證明了免疫抑制活性有效，并且對(duì)于治療銀屑病有用。
在DTH模型中的免疫抑制對(duì)于要求免疫抑制的很多疾病有用，如銀屑病、皮炎、硬皮病、發(fā)炎紊亂和其他自體免疫疾病如銀屑病關(guān)節(jié)炎、斑塊狀銀屑病和點(diǎn)滴狀銀屑病。結(jié)果概括在表X中。
表XAGP組合物對(duì)于PPD激發(fā)豚鼠的皮膚厚度的效果

TPA的評(píng)價(jià)方法隨機(jī)抽取Balb/C小鼠，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)新籠子5天。局部使用AnneFrench除去毛發(fā)并適當(dāng)清潔。分組，每組由六只小鼠組成。同時(shí)進(jìn)行丙酮對(duì)照組、TPA(12-O-四癸?；鸩ù?13-乙酸酯)對(duì)照組和藥物測(cè)試組。AGP組合物溶解在推薦介質(zhì)(丙酮)中，動(dòng)物口服藥物4天，每天一次。第二天在干凈的皮膚表面施用20微升100nM TPA并使其吸收。使用TPA72小時(shí)之后殺死動(dòng)物。皮膚切片用10％福爾馬林浸泡3天。隨后按照標(biāo)準(zhǔn)方法制作組織病理學(xué)切片。利用眼測(cè)量?jī)x(oculometer)測(cè)量至少10個(gè)不同區(qū)域的表皮厚度，抑制結(jié)果以百分率表示(圖11)。結(jié)果概括在表XI中。
表XIAGP組合物對(duì)TPA模型的效果

*該數(shù)值以相對(duì)于TPA對(duì)照的抑制百分率表示。
通過小鼠耳腫實(shí)驗(yàn)(MEST)評(píng)價(jià)體內(nèi)免疫抑制的方法采用標(biāo)準(zhǔn)程序評(píng)價(jià)AGP組合物對(duì)于小鼠的DNFB誘導(dǎo)延遲型過敏反應(yīng)能力的體內(nèi)抑制效果[Cornacoff J.B，House R.V，Dean J.H.，F(xiàn)undam.Appl.Toxicol，1988，10(1)，40；Fundam.Appl.Toxicol.，1992，19(1)，157]。
簡(jiǎn)要地說，該項(xiàng)試驗(yàn)中用到C57BL6小鼠。用0.2％DNFB(1∶4的橄欖油和丙酮)涂在小鼠背部使其敏化。隨后每三天用一次DNFB。用0.2％DNFB涂在小鼠耳廓將其激發(fā)。在24小時(shí)之后用Vamier′s測(cè)徑器測(cè)量耳朵中心部位的厚度。進(jìn)行分析，相對(duì)于陰性對(duì)照組(口服不同劑量)計(jì)算抑制百分率。結(jié)果概括在表-XII中。
表XIIAGP組合物對(duì)于DNFB誘導(dǎo)雌性C57/BL6小鼠的小鼠耳腫實(shí)驗(yàn)的效果


每個(gè)數(shù)據(jù)都來自于7-12只動(dòng)物的抑制百分率。AGP組合物和Milli Q水處理組比較，環(huán)孢菌素和2％吐溫80處理的動(dòng)物比較。
來自薊罌粟的葉和/或莖的AGP組合物對(duì)DNFB敏化的C57BL6小鼠具有免疫抑制作用。經(jīng)測(cè)定，AGP組合物的ED50為6.43mg/kg(圖12)。說明具有明顯的免疫抑制性質(zhì)，可以用于治療或預(yù)防銀屑病。
MEST模型中的免疫抑制可以用于評(píng)價(jià)很多要求免疫抑制的疾病，如銀屑病、皮炎、硬皮病、發(fā)炎紊亂和其它自體免疫疾病如銀屑病關(guān)節(jié)炎、斑塊狀銀屑病、點(diǎn)滴狀銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、多重硬化、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、過敏如哮喘、慢性阻塞性肺病，以及相關(guān)的疾病如濕疹、鱗狀發(fā)癢斑塊。
通過以下的非限定實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式分離AGP組合物、AGP-HM和AGP-LM10Kg薊罌粟(Argemone mexicana)的新鮮葉片，粉碎并用軟水(15升)萃取。離心漿料，真空條件下、低于40℃濃縮水溶性萃取物。凍干濃縮物質(zhì)，得到0.54Kg干的固體。
將500g干的水溶性萃取物溶解在6升水中，離心、傾析。上清液以10ml/分鐘的速度通過陽離子交換柱(5升)。收集洗脫液(7.5升)，濃縮(2.5升)并通過陰離子交換柱(5升)。將洗脫液(3升)濃縮至約1.5升。用另一份0.5kg材料(水溶性萃取物)重復(fù)該試驗(yàn)。
將合并洗脫液(1.5升)混合并濃縮至2.5升，并通過陽離子交換柱。將洗脫液(3升)濃縮至1.2升并通過陰離子交換柱。冷凍洗脫液(1.5升)，得到42.39g粉末。
將42g的上述粉末溶解在600ml水中，用正丁醇(3×400ml)和水進(jìn)行分離。丟棄正丁醇層。水層(600ml)中加入3升甲醇直至得到固體沉淀。離心溶液，傾析上清液。將上清液濃縮至體積為300ml。再次加入甲醇(1升)使甲醇不溶性組分沉淀出來。離心溶液，傾析上清液。冷凍兩次試驗(yàn)得到的固體沉淀(8.75g)。將干物質(zhì)溶解到水中，過XAD-2柱兩次。凍干水洗脫液，得到6.10g AGP組合物。接著過sephacryl色譜柱得到5mgAGP-HM和10.3mg AGP-LM。
分離AGP組合物、AGP-HM和AGP-LM22Kg薊罌粟的新鮮葉片，粉碎并用軟水(36升)萃取。離心槳料，在真空條件下、低于40℃濃縮水溶性萃取物。凍干濃縮物質(zhì)，得到1.25Kg干的固體。
將1.2kg干的水溶性萃取物溶解到12升水中，離心、傾析。上清液以10ml/分鐘的速度通過陽離子交換柱(5升)。收集洗脫液(15.5升)，濃縮(5.5升)并通過陰離子交換柱(5升)。濃縮洗脫液(6.25升)至約3.2升。
將洗脫液(3.2升)濃縮至2.6升并通過陽離子交換柱。將洗脫液(4升)濃縮至1.5升并通過陰離子交換柱。凍干洗脫液(1.6升)，得到54g粉末。
將40g上述粉末溶解到700ml水中，用正丁醇(3×500ml)和水進(jìn)行分離。棄去正丁醇層。將4升甲醇倒入水層(675ml)直至出現(xiàn)固體沉淀。離心溶液，傾析上清液。濃縮上清液至400ml。再次加入甲醇(3升)得到甲醇不溶性組分沉淀。離心溶液，傾析上清液。凍干固體沉淀(7.3g)。將得到的干物質(zhì)溶解在水中，通過XAD-2柱兩次。凍干水洗脫液得到5.5g AGP組合物。進(jìn)一步通過sephacryl色譜柱得到4.5mgAGP-HM和12.4mgAGP-LM。
表XIII包含本發(fā)明的AGP和藥學(xué)可接受的載體的膠囊制劑的單位劑量

混合上述表XIII提及的成分直至均勻，填充在“00”號(hào)的硬膠囊中。處理過程中最好保持在相對(duì)濕度40+5％(RH)和18-22EC。
制備本發(fā)明組合物的通常過程如下混合活性成分、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、硬酯酸鎂和膠體二氧化硅直至均勻。將它們填充在“00”號(hào)的硬膠囊中。處理過程最好保持在相對(duì)濕度40+-5％(RH)和在18EC to 22EC。
當(dāng)局部用藥時(shí)，薊罌粟植物的量相對(duì)于萃取物的重量為0.1％至10％。
包含本發(fā)明的AGP和藥學(xué)可接受的載體的局部使用軟膏的單位劑量概括在表XIV中。
表XIV包含本發(fā)明的AGP和藥學(xué)可接受載體的局部使用軟膏的單位劑量

制備局部使用的軟膏的通常過程包括通過常規(guī)方法將所有成分緩慢混合成光滑的凝膠，然后填裝到管中。
權(quán)利要求
1.一種純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)組合物，平均分子量10KD至150KD，通過以下步驟從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到i)用1至10重量份的水、C1-3醇或其混合物萃取1重量份薊罌粟植物的葉和/或莖，得到水性萃取物；部分或完全濃縮或凍干所述萃取物；ii)將水性萃取液、部分濃縮的水性萃取物或步驟i)獲得的完全濃縮或凍干的萃取物的水溶液連續(xù)通過離子交換色譜，得到中性水性萃取物；iii)用正丁醇分離步驟ii)中得到的中性水性萃取物，分離水相和正丁醇相；iv)將步驟iii)得到的水相與甲醇或乙醇混合并攪拌，分離固體沉淀，得到不溶性組分；和v)將步驟iv)得到的不溶性組分先后通過凝膠色譜和體積排阻色譜，獲得純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的C1-3醇選自甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的離子交換色譜是先陽離子交換色譜后陰離子交換色譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的離子交換色譜是先陰離子交換色譜后陽離子交換色譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的組合物，其中的陽離子交換色譜使用磺化聚苯乙烯強(qiáng)酸陽離子交換劑或羧酸型弱酸陽離子交換劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4的組合物，其中的陰離子交換色譜使用脂肪胺型弱堿陰離子交換劑或強(qiáng)堿陰離子交換劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，基本上不存在薊罌粟植物的葉和/或莖中的其它生物堿、黃酮類、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸和其它化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其骨架為6-吡喃半乳糖和3，6-吡喃半乳糖，并且呋喃阿拉伯糖、吡喃阿拉伯糖、吡喃鼠李糖基、吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖殘基位于末端位置，還包括3-、4-吡喃鼠李糖基，2-吡喃甘露糖基，2-吡喃葡萄糖基，3-、4-吡喃半乳糖基，6-、3，6-吡喃葡萄糖基，4-吡喃木糖基和甲基糖醛酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其由45-98％重量的碳水化合物組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白組合物，由2-20％重量的蛋白質(zhì)組成。
11.一種分離阿拉伯半乳聚糖-蛋白組合物的方法，包括i)用1至10重量份的水、C1-3醇或其混合物萃取1重量份的薊罌粟植物的葉和/或莖，得到水性萃取物，部分或完全濃縮或凍干該萃取物；ii)將該水性萃取物、從步驟i)得到的部分濃縮的水性萃取物或完全濃縮/凍干的萃取物的水溶液先后通過離子交換色譜得到中性水性萃取物；iii)用正丁醇分離步驟ii)得到的中性水性萃取物，分離水相和正丁醇相；iv)混合并攪拌步驟iii)得到得水相和甲醇或乙醇，分離固體沉淀，得到不溶性組分；以及v)將步驟iv)得到的不溶性組分通過連續(xù)凝膠色譜和體積排阻色譜，得到純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的C1-3醇選自甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的離子交換色譜是陽離子交換色譜之后接著陰離子交換色譜。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的離子交換色譜是陰離子交換色譜之后接著陽離子交換色譜。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中的陽離子交換色譜使用磺化聚苯乙烯強(qiáng)酸陽離子交換劑或羧酸型弱酸陽離子交換劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中的陰離子交換色譜使用脂肪胺型弱堿陰離子交換劑或強(qiáng)堿陰離子交換劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的凝膠色譜使用Amberlite聚合吸附劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的體積排阻色譜使用sephacryl。
19.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的凝膠色譜選自XAD-2、XAD-4和XAD-7的Amberlite聚合吸附劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中體積排阻色譜選自sephacryl S-100、sephacryl S-200 HR、和sephacryl S-300 HR的sephacryl。
21.一種藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白和藥學(xué)可接受載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，進(jìn)一步包括至少一種非毒性相容的填料、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、潤(rùn)滑劑或調(diào)味劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其中的藥學(xué)可接受載體選自糖、淀粉、纖維素以及它們的磷酸鈣、硫酸鈉衍生物；硫酸鈣；聚乙烯吡烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；植物油；非離子、陽離子和陰離子表面活性劑；乙二醇聚合物；β-環(huán)糊精；脂肪酸或水解谷類固體。
24.一種純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白，平均分子量10KD至150KD，分離自薊罌粟植物的葉和/或莖。
25.一種藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求59所述的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白和藥學(xué)可接受的載體。
26.一種純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白，平均分子量10KD至150KD，分離自薊罌粟植物的葉和/或莖。
27.權(quán)利要求1-10、24或26中任一項(xiàng)的純化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白在制藥中的用途，所述藥物用于治療哺乳動(dòng)物銀屑病、炎癥、自體免疫疾病、過敏、濕疹或鱗狀發(fā)癢斑塊或皮膚病。
28.權(quán)利要求21-23、25中任一項(xiàng)的組合物在制藥中的用途，所述藥物用于治療哺乳動(dòng)物銀屑病、炎癥、自體免疫疾病、過敏、濕疹或鱗狀發(fā)癢斑塊或皮膚病。
29.根據(jù)權(quán)利要求24或25的用途，其中的疾病選自皮炎、硬皮病、濕疹、銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏疾病、多重硬化、刺激性腸病、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥和鱗狀發(fā)癢斑塊。
30.根據(jù)權(quán)利要求24或25的用途，其中的過敏是哮喘或慢性阻塞性肺病。
31.根據(jù)權(quán)利要求24或25的用途，其中的銀屑病選自斑塊型銀屑病、點(diǎn)滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和銀屑病甲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過選擇性方法從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到的純化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白(AGP)組合物。同樣涉及一種從薊罌粟植物的葉和/或莖分離得到的純化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白(AGP)組合物，其具有一種或多種以下的效果免疫抑制、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化免疫抑制，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)如IL－2抑制、IFN－γ抑制、或IL－10誘導(dǎo)；角質(zhì)細(xì)胞增殖抑制，角質(zhì)分離活性和在小鼠耳腫實(shí)驗(yàn)(MEST)中的抑制活性。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101044161SQ200580035515
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月1日
發(fā)明者蘇得山·庫瑪·阿尤拉, 萬堤它·斯瑞瓦斯它哇, 塞米爾·商卡·沃倫 申請(qǐng)人:魯平有限公司