專利名稱：改良抗癌治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對tNOX的抑制作用得到改善的治療方法和組合物。
特別的是，本發(fā)明涉及選擇性抑制tNOX從而抑制癌細(xì)胞生長的組合物和治療方法。
背景技術(shù)：
癌癥是細(xì)胞生長失控的現(xiàn)象。成熟動物體內(nèi)的正常細(xì)胞以一種受控的方式進(jìn)行分裂。細(xì)胞生長異常且失控時，出現(xiàn)癌細(xì)胞，這些癌細(xì)胞最終會破壞周圍的機體組織。在很多情況下，癌癥還會擴散到機體的其他部位，這個過程被稱為轉(zhuǎn)移。
2003年美國死亡率統(tǒng)計中，癌癥占所有死亡原因的23％，2名男性中的1名和3名女性中的1名有發(fā)生癌癥的可能性。
癌癥的現(xiàn)代療法包括化療、放療和腫瘤切除手術(shù)。
化療涉及各種復(fù)合藥物的使用，其中很多藥物都是在實驗室中合成的，這樣的藥物通常與其他化合物聯(lián)用，目的是破壞癌細(xì)胞的生長周期。
這些藥物中，很多都會對人類產(chǎn)生明顯的副作用，包括脫發(fā)、嘔吐、惡心和白細(xì)胞計數(shù)下降，白細(xì)胞計數(shù)下降會增加患者發(fā)生繼發(fā)性感染的可能性。這是因為目前的很多抗癌藥物會影響正常細(xì)胞。由于這些藥物會引起有害的副作用，導(dǎo)致患者缺乏對藥物治療方案的依從性，從而不能達(dá)到療效。
此外，合成藥物的生產(chǎn)通常比較困難，需要投入大量的時間和財力，而這些投資最終會轉(zhuǎn)嫁給患者。患者在決定是否使用某種化療方案時，抗癌治療的有效性和費用是需要考慮的重要因素。
維護(hù)人類健康的一個重要問題是需要廉價且安全有效的癌癥防治方法(Cooper，Elements of Human Cancer，Jones and Bartlett，Boston，1992)。
人們已經(jīng)知道，可以采用天然的植物提取物治療各種疾病。例如，JP 10-236968公開了用辣椒粉提取物以一種濃度依賴性方式抑制癌細(xì)胞的方法。不過，為了達(dá)到這種效果，需要采取的第一步是利用有機溶劑，如丙酮和己烷，從植物中提取適當(dāng)?shù)幕衔铩?br> 美國專利5,830,887公開了一種治療癌癥的方法，這種方法使用富含天然植物雌激素或類似物的組合物治療癌癥，天然的植物雌激素或類似物從染料木素、黃豆苷元、芒柄花黃素、雞豆黃素A中選擇。這些植物雌激素可從大豆胚軸和紅苜蓿中得到。
現(xiàn)在非常傾向采用天然提取物治療癌癥?；颊吒敢饨邮芴烊粊碓?例如植物)的藥物，因為他們認(rèn)為這樣的藥物產(chǎn)生的副作用不像非天然藥物那么嚴(yán)重。
此外，如果有效成分的主要來源可以從天然來源中獲取，最終抗癌治療或藥物的價格可以大幅度下降，從而提高了有效性。
從辣椒中提取的化合物已經(jīng)作為麻醉劑使用(US 4313958和4493848)。此外，辣椒類化合物還與其他鎮(zhèn)痛類化合物一起使用，例如非甾族類消炎藥(NSAID)(US 4812446)或阿片類(US 4599342)。這些不同種類的鎮(zhèn)痛類化合物聯(lián)用會產(chǎn)生協(xié)同作用，鎮(zhèn)痛效果比這些化合物單獨使用時更強。
US 5665378描述了一種經(jīng)皮膚吸收的藥物組合物，以貼劑形式給藥，由辣椒素、NSAID和帕馬溴組成。使用的NSAIDs包括二氟尼柳、苯氧苯丙酸、布洛芬、吲哚美辛、甲氯芬那酸、奈普生等。
辣椒素還被用于其他組合物中，用來治療各種疾病，如關(guān)節(jié)炎、拉傷、擦傷和扭傷，為外用藥物，主要以貼劑給藥，但也有很多局部用藥的霜劑和氣霧劑。
在多數(shù)情況下，使用活性成分辣椒素時還要使用第二種成分，目的是在某種程度上減輕辣椒素引起的皮膚刺激癥狀，這種成分通常是一種皮膚麻醉劑或與辣椒素結(jié)合的一種化合物。
綜上所述，以辣椒素為主的組合物及治療方法主要是緩解局部疾病的癥狀。
十字花科蔬菜，例如花椰菜、卷心菜和甘藍(lán)，都含有1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥?sulforaphane)，這是一種異硫氰酸鹽，異硫氰酸鹽是已知的抗氧化劑。人們認(rèn)為1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥楹推渌惲蚯杷猁}可以降低發(fā)生癌癥的風(fēng)險，這與食用椰菜和其他十字花科蔬菜有關(guān)。
不過，使用此類異硫氰酸鹽只能發(fā)揮微小的預(yù)防作用。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種治療癌癥的方法。
更具體地說，本發(fā)明的目的是提供針對生存實體的一種協(xié)同性聯(lián)用方法、組合物和一種治療方法，每種都能提供對tNOX的抑制作用，其方式與以前的方式不同。
更具體地說，本發(fā)明的目的是通過提高1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥榈幕钚?，提供一種治療癌癥的方法。
本發(fā)明的另一目的是克服，或至少顯著地改進(jìn)先前技術(shù)的不足和缺點。
在下面的介紹中將逐步闡明本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點，介紹時將結(jié)合圖表，通過圖解和舉例的方式，以實施例進(jìn)一步說明。

發(fā)明內(nèi)容
以下陳述介紹的內(nèi)容不是本發(fā)明的唯一形式，或最廣泛的形式。這里介紹了一種抑制含有表達(dá)tNOX的癌細(xì)胞生存實體內(nèi)tNOX的方法，此方法包括給該實體使用有效治療量的植物性產(chǎn)品的結(jié)合物，植物性產(chǎn)品從十字花科蔬菜和辣椒植物中選擇。
十字花科蔬菜中首選椰菜。
優(yōu)選的，所述辣椒植物來源于辣椒屬(Capsicum annum species)。
優(yōu)選的，使用辣椒植物果實的超細(xì)粉末。
優(yōu)選的，所述果實包含辣椒野香草(Capsicum vanilloids)。
優(yōu)選的，所述野香草(Vanilliods)是辣椒素(Capsaicin)和/或香蘭素胺(Vanillylamine)。
優(yōu)選的，所述椰菜含有1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥?。
本發(fā)明進(jìn)一步，為需要抗癌治療的患者提供了一種癌癥治療方法，這種療法為給患者使用有效抗癌量的一種組合物，該組合物是從辣椒植物和十字花科蔬菜中選出的至少兩種植物的產(chǎn)品。
優(yōu)選的，辣椒植物產(chǎn)品為由干燥果實研磨而成的超細(xì)粉末。
優(yōu)選的，十字花科蔬菜為椰菜。
優(yōu)選的，椰菜產(chǎn)品從椰菜芽、市售椰菜芽和椰菜芽提取物溶液中選擇。
優(yōu)選的，椰菜苗芽提取物溶液最好為水性提取物。
優(yōu)選的，治療癌癥的方法最好為在哺乳類動物中聯(lián)用至少兩種所述提取物，用量應(yīng)足以提供協(xié)同作用，時間應(yīng)至少達(dá)到這些材料聯(lián)用對癌細(xì)胞的tNOX活性產(chǎn)生抑制。
優(yōu)選的，椰菜干燥提取物與辣椒干燥果實的所述有效抗癌量的重量比例最好為10比1到100比1。
優(yōu)選的，所述椰菜為椰菜芽。
優(yōu)選的，所述椰菜芽為凍干的椰菜芽。
優(yōu)選的，組合物中包含一種藥用可接受的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種癌癥療法，用于需要癌癥治療的患者，這種療法包括給所述患者聯(lián)合使用有效抗癌劑量的物質(zhì)，該物質(zhì)為生理學(xué)可接受制劑的純化辣椒素和1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷。
優(yōu)選的，辣椒素來源于辣椒培育植物的果實粉末和/或其成分。
優(yōu)選的，1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥閬碓从趦龈傻囊搜?。
“藥用可接受的載體”一詞的意思是，但不限于，一種非毒性的固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)充填劑、稀釋劑、可形成膠囊的材料或任何類型的制劑輔助物。
進(jìn)一步來說，本發(fā)明可以說是一種對生存實體的治療方法，目的是抑制該實體內(nèi)癌細(xì)胞的復(fù)制，該實體是一類有生命持續(xù)過程的實體，而且實體內(nèi)腫瘤會以一種獨特的形式表達(dá)tNOX，這種表達(dá)形式與正常細(xì)胞或非癌細(xì)胞的任何表達(dá)形式相反。這種治療方法為在實體內(nèi)引入治療物質(zhì)，以便在實體內(nèi)發(fā)揮有效的活性，至少維持相當(dāng)長的時間，治療物質(zhì)為十字花科蔬菜的提取物(含有相當(dāng)數(shù)量的1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥?和辣椒，或辣椒的提取物，該提取物能夠發(fā)揮協(xié)同作用，改善十字花科蔬菜提取物的作用。
優(yōu)選的，辣椒提取物為含野香草的辣椒制劑(vanilloid-containingCapsicum)。
更進(jìn)一步來說，本發(fā)明可以說是治療生存實體內(nèi)腫瘤的一種治療物質(zhì)，這種物質(zhì)是100個單位重量的椰菜提取物和1到10個單位重量的辣椒提取物(可為混合物，或共同包裝，或同時使用或出售)。
優(yōu)選的，所述辣椒提取物來源于辣椒屬。
優(yōu)選的，述辣椒提取物為辣椒植物的超細(xì)粉狀果實。
優(yōu)選的，所述辣椒提取物含有辣椒野香草。
優(yōu)選的，所述野香草為辣椒素和/或香蘭素胺。
優(yōu)選的，所述椰菜提取物最好含硫氰酸鹽。
再進(jìn)一步，本發(fā)明可以說是一種植物類補充物，這種補充物包含凍干椰菜芽和粉狀紅辣椒(辣椒屬)，重量比例為10比1到100比1，采用這種配比，可以協(xié)同增強椰菜芽對tNOX和細(xì)胞培養(yǎng)物的腫瘤細(xì)胞分裂抑制活性。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種獨特的細(xì)胞質(zhì)膜NADH氧化酶(NOX)，這是一種獨特的細(xì)胞表面蛋白，具有對苯二酚(NADH)氧化酶和蛋白二硫化物-硫醇互換活性，對激素和生長因子有應(yīng)答。而且，還報道了一種激素非敏感性和藥物應(yīng)答性的NOX，命名為tNOX，這種NOX為腫瘤細(xì)胞特有。
由于NOX蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜外表面，且不是跨膜性的，因此認(rèn)為其不太可能具有NADH氧化酶的作用。而NADH的氧化作用為檢測這種活性提供了一種簡便的方法，最終的電生理供體最可能是對苯二酚類，這種對苯二酚具有對苯二酚氧化反應(yīng)的特異性活性，活性強度超過或等于NADH氧化反應(yīng)和/或蛋白的硫醇-二硫化物互換作用。
CNOX最初的定義是對藥物不反應(yīng)的組成性NADH氧化酶活性，它和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜有關(guān)，是tNOX的正常對應(yīng)物。實際上，從大鼠肝臟和植物中分離出的一種36kD蛋白質(zhì)具有對tNOX抑制劑無應(yīng)答的NOX活性。
腫瘤細(xì)胞既表現(xiàn)出藥物應(yīng)答性和激素、生長因子的無反應(yīng)性(tNOX)，還表現(xiàn)出藥物抑制性和激素、生長因子依賴性(CNOX)活性，而未轉(zhuǎn)化細(xì)胞只表現(xiàn)出藥物無反應(yīng)性、激素應(yīng)答性和藥物應(yīng)答性CNOX。最初對未轉(zhuǎn)化細(xì)胞和組織的所謂組成性或CNOX活性的描述中，大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)膜的活性受生長因子、二鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的刺激。隨后的研究表明，觀察到的NADH氧化作用由一種獨特的酶催化，這種酶表現(xiàn)出對多種激素和生長因子的應(yīng)答性。與線粒體氧化酶不同，大鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)膜的這種激素刺激性NADH氧化酶活性不受氰化物的抑制。這種酶與其他氧化酶的不同之處還在于它對多種常見的氧化還原酶抑制劑(例如過氧化氫酶，疊氮化物，氯喹)以及各種去垢劑(如膽酸鈉，Triton X-100和CHAPS)的反應(yīng)。CNOX與癌細(xì)胞的tNOX一樣，是一種與膜相關(guān)的獨特蛋白，能夠氧化NADH，但其活性受激素和生長因子的調(diào)控。
由于傳統(tǒng)的化療藥物具有非選擇性，通常會引起不良反應(yīng)，因此需要不會產(chǎn)生這些不良反應(yīng)的癌癥療法。
上述辣椒與椰菜產(chǎn)品的結(jié)合使用對一種與膜相關(guān)的細(xì)胞外蛋白tNOX具有抑制作用，可以選擇性抑制癌細(xì)胞的生長，從而最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。
本發(fā)明提供一種在此之前未知的治療癌癥的途徑或方法。1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷是椰菜中的主要抗癌成分，這種方法把1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥榕c辣椒素和香草基胺等辣椒素聯(lián)用，可以增強1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥榈幕钚?，使其達(dá)到一種以前未知的水平。但是1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥楹屠苯匪氐陌邢蚴前┌Y相關(guān)性且與生長有關(guān)的ECTO-NOX蛋白tNOX。療效評估的依據(jù)是對人類宮頸癌(HeLa)細(xì)胞的tNOX活性、HeLa以及培養(yǎng)的4T1(小鼠乳腺癌)細(xì)胞生長的抑制能力。在這兩種系統(tǒng)中都觀察到了1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷和辣椒素的協(xié)同抑制作用。這里明確介紹了一種新型的植物性補充物，這種補充物由凍干椰菜芽和紅辣椒粉(辣椒屬)聯(lián)合組成，兩者比例為10比1到100比1，兩者聯(lián)用時，椰菜芽對tNOX和細(xì)胞培養(yǎng)物的抑制能力與椰菜芽或紅辣椒粉以相同濃度單獨使用時相比，增強了2到5倍。


圖1 1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥閷eLa細(xì)胞表面NOX活性(全部氧化)的抑制。
圖2 1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥閷eLa細(xì)胞表面NOX活性(無過氧化氫)的抑制。
圖3 1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥辂}對4T1小鼠乳腺細(xì)胞NOX活性(全部氧化)的抑制。
圖4 1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥閷θ狈NOX的人類乳腺(非乳腺癌)上皮細(xì)胞的NOX活性沒有抑制作用。
圖5 1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷對于從黑暗中萌發(fā)生長的缺乏tNOX的大豆胚芽分離出的細(xì)胞質(zhì)膜的NOX活性沒有抑制作用。
圖6 1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥閷?jīng)過培養(yǎng)48小時和72小時的HeLa和人類乳腺癌(BT-20)細(xì)胞培養(yǎng)物的作用。
圖7 A-D.按照從左往右的順序，依次加入1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥?、辣椒素和EGCg，對HeLa細(xì)胞表面NOX活性的影響。
圖8 按照從左往右的順序，依次加入1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥椤⑾闾m素胺(Vanillylamine)和EGCg，對HeLa細(xì)胞表面NOX活性的影響。
圖9 單獨使用椰菜提取物(A)以及椰菜提取物與各種辣椒粉聯(lián)合使用對HeLa細(xì)胞表面NOX活性的抑制。
圖10 單獨使用椰菜提取物，用不同稀釋濃度的提取物進(jìn)行72小時處理后，HeLa細(xì)胞和4T1細(xì)胞的存活率。
圖11 比較使用兩種不同的辣椒(辣椒屬)粉時HeLa(A和C)和4T1(B和D)細(xì)胞的存活率A，B，安祖辣椒(Ancho)；C，D，Piquin辣椒。聯(lián)合使用時辣椒粉和凍干椰菜芽的最佳配比為1比25。
圖12 除了兩種辣椒粉的混合物，其他與圖11相同。辣椒粉和凍干椰菜芽的最佳配比也是1比25。
圖13比較使用不同比例的凍干椰菜芽和辣椒粉時NADH氧化酶的活性。發(fā)揮抑制作用的最佳配比為一份辣椒粉比25份凍干椰菜芽。
圖14培養(yǎng)中的LnCap(人類前列腺癌)細(xì)胞的存活率以及對凍干椰菜芽(BSL)添加或不添加辣椒粉(PP)[加辣椒粉時配比為25比1]時細(xì)胞的反應(yīng)。G＝guiallijo辣椒.A＝ancho辣椒。
具體實施例方式
本發(fā)明的基礎(chǔ)是細(xì)胞表面NADH氧化酶的發(fā)現(xiàn)，以及將其作為一種篩選方法以尋找潛在抗癌制劑的應(yīng)用。較強效的NOX抑制劑包括辣椒堿(8-甲基-N-香草基-6-壬烯胺)、紅辣椒中的辣素和EGCg((-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯)，主要的茶葉兒茶酸。在此處的應(yīng)用中，我們描述了由辣椒屬植物的粉狀果實和/或其成分以及凍干椰菜芽和/或其成分組成的組合物，這種組合物可用于癌癥的治療和/或預(yù)防。
左旋1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥?L-Sulforaphane)是椰菜中所富含的一種異硫氰酸鹽，是tNOX癌癥靶向的強抑制劑，能夠阻斷化學(xué)品引起的癌癥的發(fā)生。研究顯示，具有約為1mM的EC50的左旋1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷的活性對HeLa的tNOX(圖1和2)以及4T1小鼠乳腺細(xì)胞的tNOX(圖3)具有作用。非癌癥MCF-10A人類乳腺上皮細(xì)胞的CNOX不受左旋1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥榈挠绊?圖4)，大豆細(xì)胞質(zhì)膜的CNOX活性也不受左旋1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥榈挠绊?圖5)。具有0.1mM到1mM之間的EC50的左旋1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥橐种艸eLa和人類乳腺癌(BT-20)細(xì)胞的生長(圖6)。不過，由于非癌癥MCF-10A細(xì)胞受抑制的程度幾乎與癌細(xì)胞相同，細(xì)胞生長的安全率不到十分之一。
1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷與其他天然來源的tNOX抑制劑，例如辣椒素、香蘭素胺和EGCg聯(lián)合使用時，發(fā)現(xiàn)辣椒素(圖7)和香蘭素胺(圖8)在1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷加入之前(圖7B，圖8B)或之后(圖7A，圖8A)都表現(xiàn)出有利的反應(yīng)。EGCg和綠茶一樣，在所有聯(lián)合使用的情況下(圖7C-F，圖8C-F)都是拮抗性的。
為了開發(fā)一種植物性補充物，根據(jù)以上介紹的這些觀察結(jié)果，采用了凍干椰菜芽。使有機椰菜種子(Sun Organic Farm，San Marcos，CA)在黑暗中萌芽生長，采集在25℃的溫度條件下萌發(fā)且生長了4天的芽，直接冷凍并凍干。超細(xì)研磨并過篩的芽或市售的芽(Arizona Health Foods)在檢測前放置于冷水中過夜(圖9)。1.25毫克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)椰菜提取物稀釋為1∶10、1∶20或1∶50，然后加入在96孔板、稀釋比例為1∶100中生長的HeLa或4T1細(xì)胞中。椰菜提取物抑制HeLa和4T1細(xì)胞生長的EC50為1∶500(最終稀釋濃度)(圖10)。
椰菜提取物與不同種類的超細(xì)粉狀辣椒果實(辣椒粉)聯(lián)用使椰菜提取物的細(xì)胞殺滅能力增強了約5倍(圖11)。兩種不同來源的辣椒粉混合物比單一來源的辣椒粉的活性更強(圖12)。凍干椰菜芽和辣椒粉的最佳配比確定為25份凍干椰菜芽比1份辣椒粉(圖12)。對HeLa細(xì)胞表面的NADH氧化酶活性的抑制作用中，也得到了類似的結(jié)果(圖13)。
培養(yǎng)的LnCap(人類前列腺癌)細(xì)胞的生長受到凍干椰菜芽提取物的抑制，但必須加入25∶1的辣椒粉混合物，才能產(chǎn)生強抑制反應(yīng)(圖14)。細(xì)胞的生長HeLa(ATCC CCL-2)人類宮頸腺癌細(xì)胞在最低要求培養(yǎng)基(Eagle培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含2mM左旋1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥楹驼{(diào)節(jié)到含1.5克/升碳酸氫鈉的Earle氏平衡鹽溶液，0.2mM非必需氨基酸，1.0mM丙酮酸鈉，加入10％小牛血清(熱滅活)以及50毫克/升硫酸慶大霉素(Sigma)。
4T1乳腺癌細(xì)胞系來源于BALB/c C3H小鼠(Miller等人，1987)。4T1細(xì)胞在DME-10培養(yǎng)基中生長，這種培養(yǎng)基是Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基，添加了5％胎牛血清，5％新生小牛血清，1mM非必需氨基酸混合物，2mM左旋谷氨酸，青霉素(每毫升100單位)和鏈霉素(每毫升100毫克)。
HeLa細(xì)胞和無細(xì)胞提取物的制備HeLa S細(xì)胞(在懸浮液中生長)通過離心采集，保存在0.1m醋酸鈉中，pH5，比例為1毫升單位細(xì)胞容積比1毫升醋酸，以冷凍狀態(tài)由供應(yīng)商(Cellex Biosciences，Minneapolis，MN)運送。細(xì)胞在室溫下解凍，重新懸浮并在37℃溫育1小時，以釋放出蛋白質(zhì)。在37000g的速度下離心60分鐘，去除細(xì)胞，獲得的無細(xì)胞上清液重新冷凍，樣本以1毫升為單位，保存在-70℃的溫度條件下。
分光光度法檢測NADH氧化酶在一種反應(yīng)混合物中(這種混合物含25mM Tris-Mes緩沖液(pH7.2)、1mM KCN以抑制低水平的線粒體氧化酶活性，以及150J-MNADH，溫度37℃，帶溫度控制[±0.5℃]，并攪拌(14))，測定340nm處NADH的消耗量，從而測定NADH氧化酶的活性。用日立U3210分光光度計檢測活性。加入NADH后，檢測過程開始。對于細(xì)胞質(zhì)膜和全細(xì)胞，檢測時間為1分鐘，每隔1.5分鐘重復(fù)檢測同一份樣本，持續(xù)指定時間。采用6.22的毫摩爾消光系數(shù)來檢測特定活性。用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，采用二辛可寧酸法進(jìn)行蛋白的評估。
生長測定采用Lin等人介紹的96孔板檢測法測定生長情況。把HeLa(5×104)或CHO(104)細(xì)胞種到板上的每個孔內(nèi)(Costar組織培養(yǎng)板)。加入待評估的物質(zhì)后，細(xì)胞在37℃的溫度條件下生長24小時，隨后根據(jù)指示，再溫育48或72小時。去除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖生理鹽水沖洗細(xì)胞，然后加入100毫升2.5％(v/v)戊二醛，固定0.5小時，隨后用蒸餾水沖洗。細(xì)胞用100毫升1％結(jié)晶紫水溶液染色0.5小時，隨后先用蒸餾水后用200毫升33％(v/v)醋酸徹底沖洗5分鐘。用全自動酶標(biāo)儀檢測580nm處的吸光率。根據(jù)公式[(b-c)×100]/(a-c)測定生長情況，其中a＝細(xì)胞在未經(jīng)處理的培養(yǎng)基中的吸光率，b＝處理后培養(yǎng)基中細(xì)胞的吸光率，c＝培養(yǎng)基本身的吸光率(背景)。
根據(jù)這些結(jié)果，我們認(rèn)為，血清中的結(jié)果表明同時使用這兩種指示物質(zhì)會產(chǎn)生明顯的協(xié)同效應(yīng)，而且這些結(jié)果表明體內(nèi)會出現(xiàn)同等程度的有益性增強。
體內(nèi)實驗結(jié)果為三名PSA(前列腺特異抗原)升高的患者提供了椰菜提取物和前面所述的不同種類辣椒粉的結(jié)合物。每名患者每4個小時攝入700毫克這種由椰菜提取物和超細(xì)辣椒粉組成的結(jié)合物。
每個病例都出現(xiàn)了PSA水平的明顯反應(yīng)，表現(xiàn)為PSA水平總體上升速度下降或PSA水平持平。
一名患者在治療前PSA水平8個月內(nèi)以13.3％的速度上升，聯(lián)用椰菜提取物和超細(xì)辣椒粉治療期間，PSA的上升速度下降到2.78％。
另一名患者治療前PSA水平據(jù)記錄為每天上升5個單位，14天治療期間，患者攝入這種結(jié)合物，PSA水平不再上升，且開始略有下降。試驗結(jié)束后，患者的PSA水平重新開始以每天6個單位的速度上升。
此份描述的目的是進(jìn)一步對本發(fā)明加以說明，不是對其加以限制。
雖然在一個優(yōu)選實施例中對本發(fā)明進(jìn)行了演示和介紹。但可以理解的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以出現(xiàn)改變，本發(fā)明的范圍不限于此處描述的細(xì)節(jié)，但應(yīng)符合下文中權(quán)利要求書的所有范圍，以便包含任何和所有相等的方法。
權(quán)利要求
1.一種抑制生存實體內(nèi)tNOX的方法，這種生存實體內(nèi)有表達(dá)tNOX癌細(xì)胞，此方法包括給該實體使用治療量的從十字花科蔬菜和辣椒植物中選擇的植物性產(chǎn)品結(jié)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于十字花科蔬菜為椰菜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于椰菜中含有1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于辣椒植物來源于辣椒屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于使用辣椒植物的超細(xì)粉狀果實。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于果實中含有辣椒野香草。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于野香草從含有辣椒素和香蘭素胺的群體中選擇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于椰菜中含有1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷。
9.在需要癌癥治療的患者中，治療癌癥的一種方法，包括給所述患者使用有效抗癌量的組合物，該組合物包括從十字花科蔬菜和辣椒植物中選擇的至少兩種植物組成的產(chǎn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于辣椒植物的產(chǎn)品是干果實的超細(xì)粉末。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于果實中含有辣椒野香草。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于野香草從含有辣椒素和香蘭素胺的群體中選擇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于十字花科蔬菜為椰菜。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于椰菜產(chǎn)品從超細(xì)研磨的椰菜芽、市售椰菜芽和椰菜芽提取物溶液中選擇。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于椰菜芽提取物溶液是提取物水溶液。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于癌癥治療方法涉及在哺乳動物中使用至少兩種所述提取物的結(jié)合物，用量應(yīng)保證結(jié)合物能夠提供有效的協(xié)同作用，使用時間應(yīng)至少保證這些材料聯(lián)用(結(jié)合物)對癌細(xì)胞的tNOX活性發(fā)揮抑制作用。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于用重量計算時，椰菜的干燥提取物與干燥辣椒果實的有效抗癌量之比為10∶1到100∶1。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于椰菜提取物為椰菜芽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于椰菜芽為凍干椰菜芽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于組合物包括一種藥用可接受的載體。
21.在需要癌癥治療的患者中，治療癌癥的一種方法，包括給所述患者使用一種有效抗癌量的結(jié)合物，該結(jié)合物為生理學(xué)可接受制劑的純化辣椒素類和1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥椤?br> 22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于辣椒素類來源于辣椒屬培育植物的粉狀果實和/或其成分。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷來源于凍干椰菜芽。
24.一種治療生存實體內(nèi)癌癥的組合物，此類癌癥的癌細(xì)胞表達(dá)tNOX，其特征在于該組合物包括有效治療量的植物性產(chǎn)品的結(jié)合物，植物性產(chǎn)品從十字花科蔬菜和辣椒植物中選擇。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于十字花科蔬菜是椰菜。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其特征在于辣椒植物來源于辣椒屬。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于辣椒植物的果實為超細(xì)粉末。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其特征在于果實中含有辣椒野香草。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于野香草從含有辣椒素、香蘭素胺的群體中選擇。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于椰菜中含有1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥?。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于椰菜是凍干椰菜芽。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于凍干椰菜芽與紅辣椒粉(辣椒屬)以10∶1到100∶1的重量配比結(jié)合。
33.一種抑制生存實體內(nèi)癌細(xì)胞分裂的方法，其特征在于此類癌癥的癌細(xì)胞表達(dá)tNOX，此方法包括給該生存實體使用植物性產(chǎn)品的結(jié)合物，該植物性產(chǎn)品從十字花科蔬菜和辣椒植物中選擇，通過抑制癌細(xì)胞內(nèi)tNOX的表達(dá)，達(dá)到預(yù)防性治療癌癥的作用。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于十字花科蔬菜為椰菜。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于椰菜中含有1-異硫氰基-4R-甲基亞硫酰基丁烷。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于辣椒植物來源于辣椒屬。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于使用辣椒植物的超細(xì)粉狀果實。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于果實中含有辣椒野香草。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于野香草從含有辣椒素和香蘭素胺的群體中選擇。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于椰菜中含有1-異硫氰基-4R-甲基亞硫?；⊥椤?br> 全文摘要
一種抑制生存實體內(nèi)tNOX的方法，這種生存實體內(nèi)有表達(dá)tNOX癌細(xì)胞，此方法包括給該實體使用治療量的從十字花科蔬菜和辣椒植物中選擇的植物性產(chǎn)品結(jié)合物。
文檔編號A61K36/31GK101068558SQ200580035568
公開日2007年11月7日 申請日期2005年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月19日
發(fā)明者大衛(wèi)·阿奇博爾德, 桃樂茜·莫瑞, D·詹姆士·莫瑞 申請人:普渡研究基金會, 大衛(wèi)·阿奇博爾德