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用尋靶因子進(jìn)行工程改造的制作方法

文檔序號(hào):1110803閱讀:336來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:用尋靶因子進(jìn)行工程改造的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及可植入裝置的支架的組織工程和細(xì)胞接種。本發(fā)明還涉及確保用細(xì)胞體外和/或體內(nèi)接種基質(zhì)的分子。
背景人工心臟瓣膜可能引發(fā)并發(fā)癥,如血栓形成、心內(nèi)膜炎、機(jī)械故障、組織降解、鈣化。這些問(wèn)題和這些假體在兒科患者中缺少生長(zhǎng)和重建潛能的事實(shí)是心臟瓣膜組織工程改造的動(dòng)機(jī)。
組織工程的主要目的是通過(guò)將能夠整合的活元件遞送給患者而恢復(fù)功能。組織工程改造主要基于以下3個(gè)元件-細(xì)胞,代表活部件-基質(zhì),提供三維支持結(jié)構(gòu)-影響基因表達(dá)和胞外基質(zhì)沉積的信號(hào)分子。
組織工程改造聯(lián)用細(xì)胞和支架,以構(gòu)建新組織。對(duì)于基質(zhì)的細(xì)胞接種,目前研究了兩種選擇培養(yǎng)自體細(xì)胞用于體外接種和體內(nèi)吸引自體細(xì)胞。
組織工程改造中考慮了不同基質(zhì)(見(jiàn)

圖1)?;|(zhì)可以是合成聚合物或膠原或纖維蛋白的模塑支架。支架可以是天然(如非細(xì)胞根)的,或可以是交聯(lián)假體。
此外,設(shè)計(jì)了不同方案,以獲得可存活的組織工程改造的心臟瓣膜。完整方案描述了通過(guò)體外聯(lián)用細(xì)胞和支架構(gòu)建瓣膜,然后在生物反應(yīng)器中使該構(gòu)建物體外成熟(圖2)。然后,可將成熟的構(gòu)建物植入患者,該構(gòu)建物有可能進(jìn)行體內(nèi)重建(綜述見(jiàn)Rabkin和Schoen(2002)Cardiovasc.Pathol.11,305-317)。研究得最透徹的構(gòu)建物是Hoerstup等((2002)Circulation 106,1143-1150))產(chǎn)生的瓣膜。他們用生物反應(yīng)器的完整方案成功地獲得可存活且重建的綿羊肺動(dòng)脈瓣。
Campbell等((1999)Circ.Res.85,1173-1178)提示,確保血管的組織工程中接種支架利用已知的防御機(jī)制,即異物反應(yīng)。成熟的異物反應(yīng)由巨噬細(xì)胞層、數(shù)層成纖維細(xì)胞和外部間皮層組成(Butler等(2001a)Biomed.Sci.Instrum.37,19-24.;Butler等(2001b)J.Invest Surg.14,139-152)。雖然Campbell等(1999,同上)斷言,成纖維細(xì)胞衍生自轉(zhuǎn)分化的巨噬細(xì)胞,但仍未見(jiàn)明確證據(jù)發(fā)表。
為了成功,這些方法滿足了許多調(diào)控問(wèn)題,包括優(yōu)化功能和耐久性。為了證明組織工程瓣膜物有所值,必須證明它們比現(xiàn)有瓣膜的質(zhì)量更好。此外,所有上述技術(shù)必須克服生物安全性的問(wèn)題。生物安全性問(wèn)題和FDA在這方面的指導(dǎo)已見(jiàn)諸文獻(xiàn)(“由離體操作和準(zhǔn)備用于結(jié)構(gòu)修復(fù)或重建的活自體細(xì)胞組成的產(chǎn)品的應(yīng)用指南”(Guidance on applications for products comprised of living autologous cell manipulated exvivo and intended for structural repair or reconstruction),95N-0200(1996);“管理細(xì)胞和組織產(chǎn)品的建議方法-食品藥品管理局”(Proposed approach to regulation of cellularand tissue-based products-The food and drug administration),Journal of Hematotherapy6195-212(1997);“工業(yè)指南-人體細(xì)胞治療和基因治療的指南”(Guidance forindustry-Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy),Human gene therapy91513-1524(1998);“異種移植中傳染病問(wèn)題的PHS指南”(PHS guideline oninfectious disease issues in xenotransplantation),(2001);“可傳播性海綿狀腦病顧問(wèn)委員會(huì)會(huì)議”(Transmissible spongiform encephalopathies advisory committee meeting),(2001))。
使用體外培養(yǎng)或甚至收獲的細(xì)胞有一些具體問(wèn)題。如圖3所示,細(xì)胞的收獲和培養(yǎng)可誘導(dǎo)遺傳不穩(wěn)定或誘變。這可歸因于不同因素。收獲和培養(yǎng)通常需要利用外來(lái)蛋白。蛋白水解酶或血清的異種來(lái)源是種間病原體污染的可能來(lái)源。如果檢測(cè)不到這種污染,不僅培養(yǎng)物本身處于風(fēng)險(xiǎn)中,接受者也處于風(fēng)險(xiǎn)中。某些病毒的增殖機(jī)制可將其基因組插入宿主基因組中,根據(jù)插入位點(diǎn),這可引起有害突變。某些病毒基因也可用作癌基因。異種物質(zhì)的應(yīng)用同樣碰到生物安全問(wèn)題。除病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)以外,細(xì)胞培養(yǎng)也使細(xì)胞接觸非生理性條件,如氧張力升高。哺乳動(dòng)物組織接觸的平均氧張力范圍為2-8%,而培養(yǎng)箱通常采用氧張力為21%的壓縮空氣。已證明,原代鼠成纖維細(xì)胞的DNA極易受損,從而導(dǎo)致衰老和自發(fā)性永生化。盡管這些實(shí)驗(yàn)中人成纖維細(xì)胞受到的影響小得多,但其它研究證明,人細(xì)胞并非對(duì)氧化應(yīng)激不敏感。例如,已證明人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激敏感。利用細(xì)胞系證明氧主要在快速增殖的細(xì)胞中誘導(dǎo)基因組重排。而且已證明,人成纖維細(xì)胞也對(duì)氧化應(yīng)激起反應(yīng)而衰老,從而以依賴于氧化應(yīng)激的速率引起端??s短和端粒DNA的單鏈斷裂。在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中,在氧張力下降時(shí)群體倍增數(shù)增加。另一明顯的觀察結(jié)果是衰老上調(diào)了纖連蛋白、骨粘連蛋白和α1-前膠原等八種基因。
生物安全性是體外細(xì)胞接種的心臟瓣膜的調(diào)控問(wèn)題中非常重要的方面,并要求在植入接受者之前對(duì)各個(gè)瓣膜假體進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。調(diào)控問(wèn)題增加也會(huì)顯著增加假體的成本,從而限制它在特定患者群體中的應(yīng)用。
本領(lǐng)域需要一種方式獲得可存活的組織工程改造的心臟瓣膜和其它可植入裝置。更具體說(shuō),需要適用于細(xì)胞接種,尤其是體內(nèi)細(xì)胞接種,最尤其是需要在剪切應(yīng)力增加的條件下進(jìn)行細(xì)胞接種接種時(shí)的支架,如心臟瓣膜和血管的支架。
發(fā)明概述本發(fā)明總體涉及利用尋靶(homing)因子產(chǎn)生用于植入動(dòng)物或人體的組織和器官支架。根據(jù)一個(gè)具體方面,本發(fā)明涉及利用尋靶因子產(chǎn)生植入體內(nèi)后易受高剪切應(yīng)力影響的支架。最具體地說(shuō),本發(fā)明涉及用于心血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)或其它管道如尿道的支架。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
涉及包含用一種或多種尋靶因子包被的結(jié)構(gòu)基質(zhì)的支架。更具體說(shuō),本發(fā)明尋靶因子是能夠結(jié)合干細(xì)胞或祖細(xì)胞的因子。
本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及準(zhǔn)備在體內(nèi)長(zhǎng)期使用和起作用的可植入裝置的支架,即持久生物相容但生物不可降解的基質(zhì)。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式
,結(jié)構(gòu)基質(zhì)是非交聯(lián)假體或或非細(xì)胞化的主動(dòng)脈根。
本發(fā)明的另一具體方面涉及包含一種或多種尋靶因子的支架,其中所述尋靶因子是受體的配體,或包含受體結(jié)合域的其片段,或者是能結(jié)合于受體的肽。更具體說(shuō),該受體是干細(xì)胞或祖細(xì)胞上表達(dá)的受體。
用于本

發(fā)明內(nèi)容
的尋靶因子或?qū)ぐ械鞍椎?b>具體實(shí)施方式
是基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1、干細(xì)胞因子、VCAM-1、纖維蛋白原P1區(qū)和纖維蛋白原P2區(qū),更具體是基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1(SDF-1)或干細(xì)胞因子(SCF),或其片段或衍生物。

具體實(shí)施例方式
中,用一種或多種尋靶因子以及有利于細(xì)胞和支架基質(zhì)之間相互作用的蛋白質(zhì)包被支架基質(zhì)。這種蛋白質(zhì)可以是(但不限于)纖連蛋白、膠原或纖維蛋白原。在尋靶蛋白是VCAM-1的具體實(shí)施方式
中,通過(guò)加入多效性蛋白酶抑制劑α2-巨球蛋白任選進(jìn)一步增強(qiáng)VCAM-1和其細(xì)胞受體之間的相互作用。
在本發(fā)明具體實(shí)施方式
中,尋靶因子通過(guò)連接臂的方式化學(xué)交聯(lián)于結(jié)構(gòu)基質(zhì)。在本文中,連接臂位于尋靶因子和結(jié)構(gòu)基質(zhì)之間。尋靶因子和基質(zhì)之間的結(jié)合可以是不可逆(永久)或可生物降解的。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式,本發(fā)明尋靶因子可以是與有利于結(jié)合結(jié)構(gòu)基質(zhì)的蛋白質(zhì)融合的形式(即兩種蛋白形成一條連貫的多肽鏈)。

具體實(shí)施例方式
中,本發(fā)明支架的結(jié)構(gòu)基質(zhì)是生物物質(zhì)如交聯(lián)的牛心包膜或豬主動(dòng)脈根。
在又一實(shí)施方式中,尋靶因子化學(xué)交聯(lián)于本發(fā)明支架的基質(zhì)。
本發(fā)明也涉及制備本發(fā)明支架的方法,藉此用一種或多種尋靶因子包被支架基質(zhì)。根據(jù)具體實(shí)施方式
,通過(guò)浸漬,即通過(guò)在含有一種或多種上述尋靶因子的合適浸漬緩沖液(如磷酸鹽緩沖鹽水)的溶液中孵育基質(zhì)以確保包被。此方法的具體實(shí)施方式
包括用有利于尋靶因子和結(jié)構(gòu)基質(zhì)之間相互作用的一種或多種蛋白質(zhì)預(yù)包被的步驟。
根據(jù)
具體實(shí)施例方式
,本發(fā)明支架不包含趨化因子(chemo-attractant factor)或動(dòng)員因子(mobilisation factor)?;蛘?,本發(fā)明支架包含一種或多種本發(fā)明尋靶因子,以及一種或多種趨化因子和/或動(dòng)員因子。
因此,本發(fā)明提供了包括結(jié)構(gòu)基質(zhì)和一種或多種尋靶因子的成套工具,它任選為可植入裝置的形式,例如但不限于血管或心臟瓣膜。
因此,本發(fā)明涉及使用尋靶因子以提高在適合代替功能障礙或患病的組織或器官的支架上體內(nèi)接種。使用尋靶因子特別有利于產(chǎn)生用于植入高剪切應(yīng)力部位的支架,如用于心血管系統(tǒng)的支架如心臟瓣膜或血管移植物。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開(kāi)了支架,更具體說(shuō)是包含基質(zhì)的可植入裝置的支架,其中存在一種或多種尋靶因子以保證合適的細(xì)胞與其結(jié)合。本文所用″支架″涉及用于組織修復(fù)、恢復(fù)、增加或再生,或者用于置換患者體內(nèi)患病、損傷、缺失或受其它損傷的組織或器官的可植入醫(yī)療裝置。本文所用″可植入醫(yī)療裝置″指旨在引入,任選植入人體的裝置,包括用于植入血管、導(dǎo)管或身體器官的裝置,如移植片固定模(stent),導(dǎo)尿管,插管(canunula),血管或動(dòng)脈移植物鞘,用于植入食管、氣管、直腸、膽管、尿路的裝置,整形外科裝置等。


發(fā)明內(nèi)容
中尤其感興趣的是旨在用于剪切應(yīng)力將對(duì)合適細(xì)胞與基質(zhì)的天然粘著產(chǎn)生不利影響的部位的支架。因此,本發(fā)明內(nèi)容中尤其感興趣的是用于置換和/或恢復(fù)易受高剪切應(yīng)力影響的組織,如血管或心臟瓣膜、輸尿管、膽管、胰管、膽囊管、肝管或普通膽管等的支架。
可以在體內(nèi)原位(即在患病或受損動(dòng)脈的部位植入)、體內(nèi)離位(即植入身體的另一部位)或體外(如生物反應(yīng)器)保證接種這種支架。
尋靶蛋白或?qū)ぐ幸蜃佣x為與一種或多種特定細(xì)胞類型相互作用的停靠分子,因此,連接于基質(zhì)時(shí),能夠在基質(zhì)上富集這種細(xì)胞類型。這種??糠肿颖WC了基質(zhì)和細(xì)胞表面分子,如另一蛋白質(zhì)或碳水化合物結(jié)構(gòu)之間的相互作用,本文中也稱為細(xì)胞靶分子。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,尋靶因子是保證基質(zhì)和一種或多種特定細(xì)胞類型之間特異性相互作用的分子;可通過(guò)以下方法保證這種作用使尋靶因子結(jié)合于基本上僅在一種或多種特定細(xì)胞類型表面上出現(xiàn)的分子或調(diào)節(jié)尋靶因子以使其僅結(jié)合于一種或多種特定細(xì)胞類型上的細(xì)胞靶分子。
尋靶因子和細(xì)胞之間的相互作用一般是配體-受體相互作用。因此,本發(fā)明具體實(shí)施方式
涉及包含一種或多種受體的配體的支架,所述配體結(jié)合于某種細(xì)胞類型,更具體是下述細(xì)胞類型。
根據(jù)另一實(shí)施方式,尋靶因子是特異性結(jié)合于干細(xì)胞或祖細(xì)胞上最特異性表達(dá)的碳水化合物結(jié)構(gòu)的分子。保留糖結(jié)合特性的這些碳水化合物結(jié)合蛋白的各部分同樣適合用作尋靶因子。
適用于本發(fā)明支架和方法的尋靶因子可以是截短的蛋白質(zhì)和/或衍生物如突變蛋白,只要它保留結(jié)合于細(xì)胞靶分子的能力??赏ㄟ^(guò)對(duì)截短缺失繪圖確定尋靶蛋白的最小結(jié)合區(qū)。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,細(xì)胞靶分子是受體,尋靶因子是其配體的片段,如其受體結(jié)合片段。作為蛋白質(zhì)配體或其片段的衍生物或突變形式的尋靶因子一般在保留結(jié)合于細(xì)胞靶分子的能力的同時(shí)與天然配體或其片段的氨基酸序列相同性至少為80%,特別是至少90%,最特別地至少95%。
本發(fā)明尋靶因子保證和/或提高了各種條件下細(xì)胞與基質(zhì)的粘附。細(xì)胞通過(guò)本發(fā)明尋靶因子結(jié)合特別有利于在高剪切應(yīng)力條件下接種組織支架。
以本發(fā)明尋靶因子方式捕獲的細(xì)胞是在產(chǎn)生合適支架,即與其置換的組織或器官功能相似的支架中感興趣的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,尋靶因子是能夠結(jié)合干細(xì)胞或祖細(xì)胞(即未分化但肯定會(huì)分化為一種或多種細(xì)胞譜系),更具體是造血祖細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,尋靶因子是能夠結(jié)合間充質(zhì)或造血干細(xì)胞的分子。本發(fā)明證明,干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞尋靶于基質(zhì)上將保證用分化為成肌纖維細(xì)胞等的細(xì)胞接種基質(zhì)支架。
尤其合適的尋靶分子是纖維蛋白原的P1和P2表位、干細(xì)胞因子(SCF)、基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1(SDF-1)、纖連蛋白(FN)和血管細(xì)胞粘著分子-1(VCAM-1)(圖4),最特別是SDF-1或SCF或其保留受體結(jié)合親和力的片段或衍生物。
本發(fā)明
具體實(shí)施例方式
涉及將SDF-1用作接種基質(zhì)的尋靶蛋白。SDF-1(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1)也稱為前B細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子(PBSF)或趨化因子、cxc基序、配體12(CXCL12)。SDF-1 cDNA和蛋白質(zhì)的序列分別參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)E09668和NP_001029058。SDF-1存在兩種不同形式,分別是68個(gè)氨基酸(α)和72個(gè)氨基酸(β)的形式,其中與α形式相比,β形式的羧基端具有4個(gè)額外氨基酸。SDF-1是CXCR4受體的配體(Bleuel等(1996)Nature 382,829-833)。SDF1的完整N末端對(duì)于受體結(jié)合的重要性見(jiàn)諸文獻(xiàn)[如Sadir J Biol Chem.2004 279,43854-43860]。因此,對(duì)于本發(fā)明,SDF-1片段是保留該蛋白氨基末端的片段。根據(jù)具體實(shí)施方式
,SDF-1的片段或衍生物含有氨基末端區(qū)(氨基酸1-14)和中心β片層(氨基酸15-54),但羧基末端區(qū)(α和β形式分別為氨基酸55-68和55-72)缺少一個(gè)或多個(gè)氨基酸??扇鏢adir等(同上)所述評(píng)價(jià)此片段的受體結(jié)合活性。
根據(jù)本發(fā)明又一實(shí)施方式,SCF用作基質(zhì)的尋靶蛋白。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)通過(guò)小鼠的蛋白酪氨酸激酶受體(c-kit)或人的CD117識(shí)別SCF(Jiang等(2002)Nature418,41-49;Nakamura等(2004)Exp.Hematol.32,390-396),因此SCF可保證MSC的尋靶。此外,CD117是造血祖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的主要因子(Agis等(1993)J Immunol.151,4221-4227)。SCF(干細(xì)胞因子)也稱為KIT配體(KITLG)、肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)和青灰因子(SF)同源物。SCF的cDNA和蛋白質(zhì)序列以登錄號(hào)M59964保存于Genbank。SCF是KIT酪氨酸激酶受體的配體。天然情況下,SCF作為膜錨定形式或可溶同種型存在,這些形式是RNA另路剪接和蛋白水解加工的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,SCF的片段或衍生物包含189個(gè)氨基酸的氨基末端片段,其中含有SCF的胞外結(jié)構(gòu)域?;蛘?,SCF的片段或衍生物包含天然產(chǎn)生的可溶形式,其中含有SCF氨基末端的165個(gè)氨基酸。根據(jù)又一具體實(shí)施方式
,SCF的片段或衍生物包含氨基末端141個(gè)殘基,其中含有SCF的受體結(jié)合核心。這些片段的編號(hào)指切割前導(dǎo)序列后釋放的248個(gè)氨基酸的蛋白序列。Langley等(1994)Arch Biochem Biophys.311,55-61描述了上述SCF片段和其受體結(jié)合能力。本發(fā)明SCF或SCF的片段或衍生物可以是單體或二聚體??赏ㄟ^(guò)氧化或交聯(lián)參與二聚體結(jié)合的半胱氨酸殘基獲得二聚體片段?;蛘撸琒CF或其片段與它們之間的間隔肽串聯(lián)重組表達(dá)。
本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
涉及將VCAM-1用作尋靶蛋白。VCAM-1的cDNA和蛋白序列以登錄號(hào)M60335保存于Genbank。
本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式
涉及聯(lián)用尋靶因子及影響該尋靶分子和其細(xì)胞靶分子之間相互作用的分子(本文中也稱為促進(jìn)(facilitating)蛋白,見(jiàn)下文)。根據(jù)一種實(shí)施方式,將VCAM-1與α2-巨球蛋白一起加入基質(zhì)中(圖7),因?yàn)檫@種多效蛋白酶抑制劑可穩(wěn)定VCAM-1與VLA4之間的結(jié)合。此功能是抑制能降解VCAM-1蛋白的多效蛋白酶的結(jié)果(Levesque等(2001)Blood 98,1289-1297)。α2-巨球蛋白的cDNA和蛋白序列以登錄號(hào)NM_000014保存于Genbank。
根據(jù)另一具體實(shí)施方式
,纖維蛋白原的P1和P2表位用作尋靶蛋白。P1和P2被巨噬細(xì)胞(MF)的macl-整聯(lián)蛋白結(jié)合。已證明,纖維蛋白原吸附于外來(lái)表面啟動(dòng)了異物反應(yīng)。這誘導(dǎo)分子的構(gòu)象改變,導(dǎo)致P1和P2的2個(gè)表位暴露(Hu等(2001)Blood98,1231-1238)。然后,結(jié)合的巨噬細(xì)胞會(huì)吸引干細(xì)胞,正如它們?cè)凇鍢?biāo)準(zhǔn)″異物反應(yīng)中所作的那樣。本發(fā)明一種實(shí)施方式是包含P1和P2表位以吸引內(nèi)源性干細(xì)胞并且適合直接置換缺陷、患病或功能障礙的心臟瓣膜的合適基質(zhì)。P1和P2表位可連接于基質(zhì)。本發(fā)明也包括利用P1和P2表位包被支架,所述P1和P2表位用于在植入后吸引干細(xì)胞。如Hu等(2001,同上)所述,P1表位指纖維蛋白原γ的氨基酸190-202,而P2表位指纖維蛋白原γ的氨基酸377-395。
根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方式,該基質(zhì)包含纖連蛋白以尋靶表達(dá)VLA4或VLA-5的祖細(xì)胞。人纖連蛋白(FN1)的不同剪接變體參見(jiàn)NIH核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)以下登錄號(hào)NM_212482(變體1)、NM_212475(變體2)、NM_002026(變體3)、NM_212478(變體4)、NM_212476(變體5)、NM_212474(變體6)和NM_054034(變體7)。
尤其適用于本發(fā)明支架的是包含纖連蛋白和/或VCAM-1,還包含SDF-1從而能與纖連蛋白和/或VCAM-1協(xié)同作用的基質(zhì)或支架。
將以下物質(zhì)用作心臟瓣膜或血管的支架尋靶物是本發(fā)明一部分上文特征鑒定的尋靶蛋白基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1、干細(xì)胞因子、VCAM-1、纖維蛋白原P1區(qū)或纖維蛋白原P2區(qū),以及本領(lǐng)域目前已知或本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的它們的功能同源物或衍生物。
理論上,本發(fā)明尋靶因子可獲自支架受體,但出于實(shí)踐目的,更可能通過(guò)合成或重組方法(來(lái)自原核或真核生物)獲得尋靶因子。所有上述尋靶蛋白均可購(gòu)得。重組人SDF-1和重組人SCF(大腸桿菌(E.coli))可獲自不同公司(Sigma RBI,R&D systems,Campro and Calbiochem)。重組人VCAM-1(小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)可購(gòu)自R&D systems。衍生自人成纖維細(xì)胞的天然纖連蛋白可購(gòu)自Sigma RBI和Calbiochem。衍生自人血漿的天然纖維蛋白原可購(gòu)自Sigma RBI和Calbiochem。
對(duì)于纖維蛋白原的P1和P2表位,該表位可通過(guò)蛋白酶解切割天然蛋白質(zhì)而衍生自天然纖維蛋白原,但更優(yōu)選通過(guò)按照Hu等(上述)所述蛋白序列進(jìn)行體外生物合成。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面,存在一種或多種尋靶因子保證了一種或多種特定細(xì)胞類型與基質(zhì)的結(jié)合。因此,在組織工程改造中,更具體地說(shuō)在血管或淋巴器官或其它管道如尿道的組織工程改造中,當(dāng)該基質(zhì)與液體,如血液或淋巴液和其中的細(xì)胞保持接觸時(shí),單獨(dú)存在尋靶物可能足以保證基質(zhì)群與合適的細(xì)胞(結(jié)合)。本發(fā)明證明,尋靶因子可用于將合適的細(xì)胞物理性且特異性地連接于所選基質(zhì)(圖5)。因此,本發(fā)明具體實(shí)施方式
涉及包含尋靶因子的支架。最具體說(shuō),本發(fā)明涉及表面上僅含一種或多種尋靶因子,而不含參與趨化(chemo-attraction)、動(dòng)員等的其它蛋白的支架。不僅尋靶因子足以保證相關(guān)細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合,而且不存在影響細(xì)胞吸引和/或動(dòng)員的其它分子可能避免了重要的不利副作用,如移植物的血管化。
然而,本發(fā)明也考慮利用尋靶因子和其它生物活性分子的組合包被組成本發(fā)明支架的基質(zhì)。
因此,根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式,除了一種或多種尋靶因子以外,基質(zhì)還包含有助于合適細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合的一種或多種其它因子。這種其它因子包括動(dòng)員劑、趨化物和促進(jìn)因子(facilitating factor)。
在本

發(fā)明內(nèi)容
中,″動(dòng)員劑(mobilisation agent)″是使細(xì)胞,如干細(xì)胞從其起源的身體部位移開(kāi)的物質(zhì)。更具體說(shuō),用動(dòng)員劑提高血液中的干細(xì)胞量。動(dòng)員劑的具體例子是粒細(xì)胞集落刺激因子或G-CSF。此天然產(chǎn)生的因子具有低毒性,與其它造血生長(zhǎng)因子聯(lián)用時(shí)具有協(xié)同作用。其它動(dòng)員劑是腺苷、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-1(IL1)、IL3、IL7、IL11和IL12(Fu和Liesveld(2000)Blood Rev.14,205-218.)。除了利用本發(fā)明尋靶因子以外,考慮體內(nèi)接種基質(zhì)的工具和方法對(duì)利用動(dòng)員因子特別感興趣。動(dòng)員劑任選包含在基質(zhì)中,但也可在植入支架之前給予患者。
此外或另外,本發(fā)明考慮了聯(lián)用一種或多種趨化因子和尋靶因子及任選的上述動(dòng)員劑。本文所用″趨化物″或″趨化性化合物″是能夠吸引細(xì)胞的化合物。它們以梯度存在時(shí)通常對(duì)細(xì)胞有影響。干細(xì)胞的趨化物可能是胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)(Young等(1999)Clin.Exp.Metastasis 17,881-888)。
此外或另外,本發(fā)明考慮聯(lián)用一種或多種促進(jìn)劑和尋靶因子及任選的上述其它劑?!宕龠M(jìn)因子″是有助于或加強(qiáng)細(xì)胞與本發(fā)明尋靶蛋白或因子結(jié)合的因子。這種促進(jìn)蛋白的例子包括可溶性膠原、白蛋白、纖維蛋白原或纖連蛋白。促進(jìn)蛋白可與尋靶因子一起包被在基質(zhì)上,或者可以作為單獨(dú)層包被。
因此,本發(fā)明涉及用于管道或其它可植入支架,如血管或心臟瓣膜的組織工程的基質(zhì),所述管道或支架包含具有一種或多種尋靶因子的基質(zhì)。更具體說(shuō),本發(fā)明涉及包含SDF-1和/或SCF的基質(zhì),該基質(zhì)設(shè)計(jì)用于置換缺陷、患病或功能障礙的心臟瓣膜和用于體內(nèi)再細(xì)胞化。載有SDF-1的基質(zhì)或支架可包含其它尋靶劑,還可包含一種或多種選自下組的動(dòng)員劑粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、腺苷、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-1(IL1)、IL3、IL7、IL11和IL12或其組合?;|(zhì)還可包含一種或多種選自下組的趨化物胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)或其組合。
根據(jù)一種實(shí)施方式,本發(fā)明的細(xì)胞化范例包括三個(gè)步驟(圖2)。任選的初始干細(xì)胞動(dòng)員步驟,其次是植入尋靶因子包被的支架(如血管或瓣膜),然后任選地由支架釋放趨化物。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式
,這種支架是用于心血管系統(tǒng)的血管或瓣膜。然而,在此實(shí)施方式中,由于瓣膜或血管移植物植入了患病的瓣膜或血管位置,從而與血液緊密接觸,因此植入含有尋靶因子的基質(zhì)足矣,可任選聯(lián)用與趨化物。
本發(fā)明為內(nèi)源性細(xì)胞粘附制備的心臟瓣膜構(gòu)建物可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)植入方法植入,例如但不限于下述方法之一。在完全或部分去除天然瓣膜或者未完全或部分去除天然瓣膜的情況下同位植入或異位植入心臟瓣膜。如本文所述采用經(jīng)典植入技術(shù),或者植入可包括最低侵入性、血管內(nèi)或經(jīng)皮(見(jiàn)下)方法。本領(lǐng)域已知血管移植物的植入方法。
本發(fā)明技術(shù)也可通過(guò)文獻(xiàn)(例如但不限于EP 1152780A1和WO 0045874A1)所述方法應(yīng)用于經(jīng)皮可植入的瓣膜假體。這些專利申請(qǐng)描述了通過(guò)經(jīng)皮途徑植入心臟瓣膜的裝置,它由外周擴(kuò)張氣球和中心軸血流泵組成,尤其適用于不需要體外接種或成熟化的移植物。
因此,本發(fā)明涉及用于器官或組織支架,更具體說(shuō)是接觸剪切應(yīng)力的器官和/或組織支架,如心血管或淋巴系統(tǒng)支架或尿路支架的工程改造的基質(zhì)。最具體說(shuō),本發(fā)明涉及心臟瓣膜和血管組織支架。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,使包含具有本發(fā)明尋靶因子的基質(zhì)的支架模塑成待用的可植入裝置形式,從而對(duì)應(yīng)于預(yù)制作的器官、瓣膜或管道。支架應(yīng)該是生物相容性,并且可經(jīng)手術(shù)或經(jīng)皮植入的支架。本發(fā)明考慮了有固定模(stented)和無(wú)固定模(stentless)的支架。
用于本發(fā)明的合適基質(zhì)的例子包括人工生產(chǎn)和模塑的支架,它可以是合成聚合物或生物物質(zhì)如膠原或纖維蛋白,和天然支架如非細(xì)胞根物質(zhì)或交聯(lián)的天然物質(zhì)如心包膜構(gòu)成(圖1)。生物基質(zhì)包括由生物物質(zhì)從頭獲得的基質(zhì)(如人纖維蛋白凝膠)以及保留了原始結(jié)構(gòu)的基質(zhì),例如但不限于非細(xì)胞化的主動(dòng)脈根。生物基質(zhì)可以是自體(來(lái)自準(zhǔn)備植入該裝置的患者)、同源(如如果植入物準(zhǔn)備植入人體的話來(lái)自人體物質(zhì))或異源(如在人植入物的情況下來(lái)自牛、豬或羊)的。生物基質(zhì)是新鮮或經(jīng)處理的,處理方式不會(huì)破壞細(xì)胞在基質(zhì)表面上生長(zhǎng)或基質(zhì)彈性(如深低溫保藏、UV輻射、光致氧化)。合成移植物可由以下物質(zhì)組成,如聚酯、膨脹型聚四氟乙烯(ePTFE)和本領(lǐng)域已知的其它復(fù)合材料。具體說(shuō),根據(jù)本發(fā)明,合成基質(zhì)是生物相容性或可生物降解的材料,如聚乙醇酸網(wǎng)狀物和聚羥基烷酸酯、細(xì)菌衍生的熱塑性聚酯?;蛘?,合成裝置可由諸如聚酯、膨脹型聚四氟乙烯(ePTFE)和本領(lǐng)域已知的其它復(fù)合材料等材料制成。
根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,該基質(zhì)是不可生物降解的,因此持久耐用,能夠在體內(nèi)長(zhǎng)期存在和發(fā)揮作用。本發(fā)明內(nèi)容中考慮了衍生自去除去細(xì)胞的牛心包膜的基質(zhì)(如Veritas∞Collagen Matrix或SynerGraft∞)。
可通過(guò)各種方式在本發(fā)明基質(zhì)上″包被″尋靶因子。在這些包被方法中,三種包被方法尤其適合;對(duì)于天然結(jié)合于基質(zhì)的尋靶因子,可采用浸漬法。此結(jié)合同時(shí)是尋靶因子-依賴性和基質(zhì)-依賴性。浸漬包括在合適溶劑,例如但不限于磷酸鹽緩沖鹽水配制的尋靶因子溶液中孵育基質(zhì)。此溶液可應(yīng)用于預(yù)包被的裝置和能夠在手術(shù)室進(jìn)行植入前包被的包被成套裝置。
或者,根據(jù)本發(fā)明,與可溶性膠原、白蛋白、纖維蛋白原或纖連蛋白共同包被。當(dāng)采用與這些蛋白質(zhì)相互作用的尋靶因子時(shí)尤其適合采用此方法。該方法包括用胞外基質(zhì)蛋白進(jìn)行預(yù)包被。預(yù)包被基于與基質(zhì)中的交聯(lián)天然蛋白及其天然對(duì)應(yīng)物的相互作用。在第二步中,尋靶因子將結(jié)合于這些加入的胞外基質(zhì)蛋白。同樣,此方法可在可植入裝置運(yùn)輸之前應(yīng)用以及可以是能夠在手術(shù)室中包被的成套工具形式。
或者,可確定在基質(zhì)和尋靶分子之間有無(wú)間隔分子的化學(xué)交聯(lián)。間隔分子可以是永久性或可生物降解的接頭,一旦連接于細(xì)胞,尋靶分子的存在不再重要。可將該因子立即交聯(lián)于基質(zhì),只要它保持有功能。另一實(shí)施方式包括與間隔的連接臂進(jìn)行生物化學(xué)交聯(lián)。此連接臂的特定結(jié)構(gòu)能夠控制交聯(lián)的生物降解性,以及加入的尋靶因子的藥代動(dòng)力學(xué)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了此交聯(lián)的不同方法。尤其有用的范例是采用光化學(xué)交聯(lián),如EP 0820483B1所述,但考慮了交聯(lián)的不同方法(如專利公開(kāi)EP0991944B1、EP1035879B1和WO0159455A2所述方法)。
根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
,一種或多種尋靶因子和/或趨化物和動(dòng)員因子以融合蛋白的形式存在于基質(zhì)上。可通過(guò)重組技術(shù)獲得融合蛋白。然后,專門(mén)選擇與基質(zhì)相互作用的融合蛋白,以使融合蛋白包含尋靶部分和基質(zhì)相互作用部分。融合蛋白通常由通過(guò)插入基因遺傳改變的宿主生物產(chǎn)生,所述基因由各編碼特定蛋白的2個(gè)基因的組合組成。這允許將任何上述尋靶因子與能和交聯(lián)基質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)組合。同樣,融合蛋白構(gòu)建物中后一種蛋白可以是以下分子的全長(zhǎng)或部分多肽,例如但不限于膠原、纖維蛋白原或纖連蛋白。通常根據(jù)特異性細(xì)胞尋靶和基質(zhì)結(jié)合特性選擇融合蛋白。融合蛋白可應(yīng)用于運(yùn)輸之前的可植入裝置或臨植入接受者之前的成套裝置形式。
需要小心,以防止瓣膜的任何后續(xù)處理(即滅菌)使蛋白質(zhì)失活。優(yōu)選不顯著改變動(dòng)員劑、趨化物或?qū)ぐ袆┑纳锘钚缘臏缇夹g(shù)。本領(lǐng)域已知的滅菌條件足夠保持動(dòng)員劑、趨化物或?qū)ぐ袆┑纳锘钚?,如?例如)低劑量γ輻射或環(huán)氧乙烷對(duì)加載的基質(zhì)進(jìn)行滅菌。尤其適合的滅菌方法是用環(huán)氧乙烷在37-63℃的溫度范圍內(nèi)滅菌或用約1-3mRad γ輻射或電子束輻射滅菌。如果生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)或肽,可通過(guò)包含以下制劑在γ輻射滅菌期間優(yōu)化生物活性1)外來(lái)蛋白,如白蛋白或明膠;和2)自由基清除劑(抗氧化劑),如沒(méi)食子酸丙酯,3-叔丁基-4-羥基苯甲醚(BHA)或抗壞血酸,用量能有效阻止輻射誘導(dǎo)的生物活性肽降解。滅菌優(yōu)選在低溫、如-70℃下進(jìn)行。
根據(jù)另一方面,本發(fā)明涉及治療具有患病或損傷的組織、管道或器官,例如但不限于患病或損傷的血管或心臟瓣膜的患者的方法,該方法包括將用一種或多種尋靶因子包被的本發(fā)明支架植入所述患者。
根據(jù)
具體實(shí)施例方式
,植入該支架用于體內(nèi)接種?;蛘?,也考慮了體外接種。體外接種可以在生物反應(yīng)器中進(jìn)行。本領(lǐng)域已知適用于本發(fā)明內(nèi)容的生物反應(yīng)器,包括Hoerstrup等(2002,Tissue Engineering 8(5)863-870)所述的生物反應(yīng)器。
用于本發(fā)明的尋靶因子和與其連接的細(xì)胞的具體實(shí)施方式
見(jiàn)圖4。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白,可由尋靶因子形成各種組合。而且,也考慮了本發(fā)明支架的制造和使用中以及系統(tǒng)和方法的構(gòu)建中的各種改進(jìn)和改變。
與具有圖3所示許多風(fēng)險(xiǎn)的現(xiàn)有支架相比,本發(fā)明支架提供了特別有利。第一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)是患者細(xì)胞接觸異種病原體(如朊病毒、病毒等)。通過(guò)蛋白水解酶或培養(yǎng)基引入的偶然性物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)。雖然這些因素一般存在于心臟瓣膜組織工程的體外階段,但風(fēng)險(xiǎn)不僅限于這些感染途徑。其它感染途徑是用同一設(shè)備(facility)治療時(shí)異種基質(zhì)物質(zhì)或患者細(xì)胞的交叉感染。病毒感染引起一些特定風(fēng)險(xiǎn),其中許多依賴于感染菌株,如植入后患者感染、病毒DNA插入基因組所致誘變和病毒蛋白的原癌基因功能可能誘導(dǎo)永生化。第二類風(fēng)險(xiǎn)是在體外條件下細(xì)胞接觸的非生理性細(xì)胞環(huán)境因素。一個(gè)例子是非生理性氧張力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能引起DNA損傷。結(jié)論是,需要測(cè)試各個(gè)因素,因?yàn)榧?xì)胞是″自身的(self)″且將被患者免疫系統(tǒng)接受,不管它們是否可能誘導(dǎo)損傷。
附圖簡(jiǎn)述下圖說(shuō)明了本發(fā)明,但不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限制于其所述的具體實(shí)施方式
。
圖1顯示根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
選擇的支架的概況的示意圖。第一組是模塑支架。它們采用生物或非生物熱塑性材料產(chǎn)生瓣膜支架。通常采用允許熱塑性材料硬化的鑄型或稱為電旋轉(zhuǎn)(electrospinning)的工藝實(shí)現(xiàn)此過(guò)程。另一選擇是利用蛋白質(zhì)如膠原或纖維蛋白產(chǎn)生這種瓣膜。這些構(gòu)建物由獲自(如)患者的天然蛋白制成,它們可以是同種或異種來(lái)源或重組形成的。然后,使這些蛋白在瓣膜塑模中彼此相互作用。第二組是天然支架,即同種或異種生物瓣膜??煞譃閮煞N主要類型(1)非細(xì)胞化的主動(dòng)脈根和(2)交聯(lián)假體。
圖2顯示完整組織工程改造范例的示意圖,正如本發(fā)明一種實(shí)施方式的心臟瓣膜組織工程改造中實(shí)施的那樣。通過(guò)將合適細(xì)胞接種于適當(dāng)選擇的支架上制備瓣膜構(gòu)建物。這些細(xì)胞可以是內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。然后,將體外產(chǎn)生的瓣膜構(gòu)建物放入生物反應(yīng)器中一段時(shí)間,以使構(gòu)建物成熟,同時(shí)使細(xì)胞習(xí)慣于逐漸增加的流速和壓力。一般在數(shù)周后將成熟構(gòu)建物植入接受者,其在接受者中可進(jìn)行體內(nèi)重建。
圖3該示意圖顯示本發(fā)明一種實(shí)施方式的心臟瓣膜組織工程改造的完整范例的風(fēng)險(xiǎn)。
圖4該示意圖顯示本發(fā)明一種實(shí)施方式的特定細(xì)胞類型上存在的尋靶蛋白和各自受體。纖維蛋白原的P1或P2表位能與巨噬細(xì)胞表達(dá)的mac1整聯(lián)蛋白相互作用。干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合于“間充質(zhì)”干細(xì)胞(MSC)的蛋白酪氨酸激酶受體(c-kit或CD117)??赏ㄟ^(guò)不同相互作用實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞(HSC)的尋靶。優(yōu)選通過(guò)結(jié)合于其受體CXCR4的基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1(SDF-1)實(shí)現(xiàn)此過(guò)程。HSC也通過(guò)極遲抗原(VLA)4或5連接于纖連蛋白(FN),此外,VLA-4也能結(jié)合血管細(xì)胞粘著分子1或VCAM-1。后一結(jié)合可通過(guò)多效蛋白酶抑制劑a2-巨球蛋白(macroplobuline)(a2-MG)增強(qiáng)后一結(jié)合。
圖5按照本發(fā)明一個(gè)方面細(xì)胞接種后本發(fā)明支架的示意性結(jié)構(gòu)?;|(zhì)上的尋靶蛋白與吸引細(xì)胞的受體發(fā)生作用。通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇尋靶蛋白測(cè)定細(xì)胞結(jié)合的特異性。
圖6按照本發(fā)明一個(gè)方面自發(fā)性接種的小葉(leaflet)(A)和預(yù)接種的IP(B)的例子。C圖顯示,1周和1個(gè)月時(shí)自發(fā)性接種和IP預(yù)接種的小葉的再細(xì)胞化(總細(xì)胞計(jì)數(shù)/小葉長(zhǎng)度),*p<0.05。
圖7組織學(xué)。圖A1周和1個(gè)月時(shí)自發(fā)性接種和IP預(yù)接種的小葉的過(guò)度生長(zhǎng)的中值。圖B光致氧化的牛心包膜上新沉積基質(zhì)的中間面。圖C從表面至頂端測(cè)定的小葉長(zhǎng)度的中值。*p<0.05圖8用本文實(shí)施例1中所述細(xì)胞標(biāo)記物的抗體特征鑒定植入的瓣膜。數(shù)據(jù)表示為中值[95%Cl]。*表示1周組之間有顯著性差異;表示對(duì)照組之間或IP接種組之間的顯著性差異;表示1個(gè)月組之間的差異;§表示與IP測(cè)試樣品的顯著不同,e表示不可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,因?yàn)閚<6。
圖9FBR不同階段期間材料中存在的(A)VLA-4+(B)CD44+和(C)CD172a+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。點(diǎn)和誤差線代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,a)與6小時(shí)顯著不同(p<0.05);b)與6小時(shí)、1天、2天和3天顯著不同(p<0.05);c)與3天顯著不同(p<0.05);d)與2天顯著不同(p<0.05)。對(duì)于CD172a,從統(tǒng)計(jì)分析中排除6小時(shí)數(shù)據(jù),因?yàn)閬G失了2個(gè)大鼠數(shù)據(jù)。細(xì)胞結(jié)合和尋靶能力在植入后立即升高,通常隨后逐漸降低,除了CD172a+細(xì)胞在第三天達(dá)到顯著峰值。
圖10在FBR不同階段期間材料中存在的(A)CD133+和(B)Sca-1+原代干細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)以及(C)CD34+和(D)CD117+祖細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。點(diǎn)和誤差線代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,a)與5天顯著不同(p<0.05);b)與3、5和7天顯著不同(p<0.05);c)與3天顯著不同(p<0.05);d)與2天顯著不同(p<0.05)。如圖所示,Sca-1+原代干細(xì)胞在植入6小時(shí)后其存在出現(xiàn)峰值,而CD34+和CD117+祖細(xì)胞在植入2和3天后其存在出現(xiàn)峰值。
圖11微陣列評(píng)價(jià)本發(fā)明一個(gè)方面的1.5和3天后腹膜內(nèi)植入物和腹膜巨噬細(xì)胞(IP)的基因表達(dá)分布型得到的結(jié)果。
圖12對(duì)照和SDF-1和SCF浸漬(經(jīng)過(guò)或未經(jīng)FN預(yù)包被)的頸動(dòng)脈移植物上存在的CD117(a)和Sca-1(b)陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)的結(jié)果。星號(hào)表示與對(duì)照顯著不同(各組中n=6),#表示與SDF組不同。
圖13植入綿羊動(dòng)脈的小片(patch)上的CD34+細(xì)胞(造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞)。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)IP植入支架工程改造瓣膜為了獲得接種基質(zhì)以鑒定參與合適細(xì)胞粘著的關(guān)鍵因子,用未成熟的異物反應(yīng)重建(repopulate)交聯(lián)的生物基質(zhì),即光致氧化的牛心包膜。這種基質(zhì)類型本身保證了耐久性。在綿羊中,用具有間充質(zhì)來(lái)源和未成熟分化的母細(xì)胞樣細(xì)胞覆蓋腹膜內(nèi)(IP)植入三天的支架或小片,所述細(xì)胞通??梢圆⒋_實(shí)分化為成肌纖維細(xì)胞表型。更具體說(shuō),發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞是波形蛋白陽(yáng)性,但是Δ平滑肌肌動(dòng)蛋白和重鏈肌球蛋白陰性(見(jiàn)表1)。
表1在綿羊和大鼠中比較3天IP接種。


*表示綿羊和大鼠之間有顯著性差異(p<0.05)發(fā)現(xiàn),可獲得證實(shí)具有耐久性的穩(wěn)定基質(zhì),可在數(shù)天內(nèi)分化為不同表型。
由綿羊IP-成熟的材料構(gòu)建瓣膜并植入綿羊的肺動(dòng)脈,評(píng)價(jià)其功能。植入了24個(gè)瓣膜(12個(gè)未接種的對(duì)照,12個(gè)腹膜內(nèi)接種的瓣膜)。這兩組中各自研究了兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)植入肺動(dòng)脈1周(n=每組6個(gè))和1個(gè)月(n=每組6個(gè))后。通過(guò)回波心動(dòng)描計(jì)術(shù)評(píng)價(jià)瓣膜功能。沒(méi)有觀察到異常。在腹膜內(nèi)接種的移植物中沒(méi)有觀察到大塊血栓形成,而對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)一例。
表2綿羊和回波心動(dòng)描計(jì)術(shù)數(shù)據(jù)

采用組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照和腹膜內(nèi)接種的瓣膜構(gòu)建物的細(xì)胞化有顯著差異。與對(duì)照相反,在腹膜內(nèi)接種的瓣膜上觀察到細(xì)胞顯著沉積和新基質(zhì),這也明確顯示了原始基質(zhì)的重建(參見(jiàn)圖6和7)。對(duì)外植瓣膜和對(duì)照樣品的7μm低溫?cái)嗝孢M(jìn)行下述分子的免疫熒光染色CD44(克隆BAT 31A,VMRD Inc.)、CD45(克隆1.11.32,Serotec)、CD172a(克隆DH59B,VMRD Inc.)、波形蛋白(克隆V9,DAKO)、ASMA(克隆1A4,DAKO)、SMMS-1(克隆SMMS-1,DAKO)、磷酸化組蛋白H3(多克隆,CAMPRO scientific)、CD117(多克隆,ABCAM)、ecNOS(克隆3,BD Biosciences)、MHC-I(克隆H58A,VMRD,Inc)、MHC-II(克隆TH14B,VMRD.Inc)和CD34(克隆QBEnd 10,DAKO)。
在一個(gè)完整小葉切片(leaflet section)上,對(duì)植入的基質(zhì)材料中或其上存在的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在植入肺部1周和1個(gè)月后,自發(fā)性接種對(duì)照的每個(gè)切片上分別具有3753[995,17254]和3345[1562,4298]個(gè)細(xì)胞。另一方面,1周和1個(gè)月后,IP預(yù)接種的瓣膜的每個(gè)切片上分別具有12126[4571,28216]和20404[4723,32084]個(gè)細(xì)胞。自發(fā)性和IP預(yù)接種的瓣膜之間細(xì)胞數(shù)增加4-7倍具有顯著性。
圖8的表格中總結(jié)了瓣膜切片中發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。所有組和染色的數(shù)據(jù)表示為中值和95%置信區(qū)間(confidence interval)。由于它們是百分?jǐn)?shù),僅顯示了陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù),記住觀察到的總細(xì)胞的大差異,絕對(duì)細(xì)胞類型計(jì)數(shù)明顯存在大差異。
這些發(fā)現(xiàn)明確表明了這些細(xì)胞使含有成肌纖維細(xì)胞的穩(wěn)定化生物基質(zhì)新生的潛能。而且,1個(gè)月植入物已經(jīng)顯示出自發(fā)性再內(nèi)皮化的跡象。再細(xì)胞化的過(guò)程似乎是自我限制的,因?yàn)樾鲁练e材料的量不是不斷增加的,并且逐漸被內(nèi)皮覆蓋。這阻止了新細(xì)胞粘著并有助于再細(xì)胞化過(guò)程。
雖然利用了穩(wěn)定化生物基質(zhì),但通過(guò)腹膜接種獲得的細(xì)胞能夠修飾此基質(zhì)并且沉積其本身。
由異種基質(zhì)材料和自身細(xì)胞構(gòu)建的生物雜交瓣膜結(jié)合了基質(zhì)的可靠性與細(xì)胞的活力。細(xì)胞是間充質(zhì)來(lái)源的,在細(xì)胞重建中可分化為合適表型、成肌纖維細(xì)胞。本研究證明,雖然重建是巨噬細(xì)胞介導(dǎo)或啟動(dòng)的,但重建是(造血)干細(xì)胞衍生的。
實(shí)施例2干細(xì)胞吸引至腹膜內(nèi)基質(zhì)將基質(zhì)材料通過(guò)腹膜內(nèi)途徑引入大鼠,研究吸引的細(xì)胞類型。
動(dòng)物選擇雄性Wistar大鼠(n=36;380-400g)。使其隨意獲取食物。按照‘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南’(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,NIH刊物85-23,1985年修訂)。該研究由本地倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
方法用混于100%氧中的4%異氟烷以1L/分誘導(dǎo)麻醉5分鐘,在大約20分鐘的手術(shù)期間用混于100%氧中的2%異氟烷以0.5L/分鐘維持麻醉。剃毛和消毒后,經(jīng)過(guò)皮膚、腹肌和腹膜作約1.5cm的直腸旁切口。將含有基質(zhì)材料的不銹鋼盒插入腹腔并用經(jīng)腹縫線(Ticron 3-0)固定于腹壁。用連續(xù)縫線(Ticron 3-0)縫合腹膜和腹肌,皮內(nèi)縫合(Ticron 3-0)皮膚,以避免理毛時(shí)弄開(kāi)傷口。手術(shù)后,停止麻醉。約5分鐘后,動(dòng)物恢復(fù)意識(shí),將其放入單個(gè)籠中。
條件在不同時(shí)間點(diǎn)上回收基質(zhì)材料。不同回收時(shí)間是植入后6小時(shí),1、2、3、5和7天,這取決于該動(dòng)物被分配的組別。為該目的,再次麻醉動(dòng)物,再次打開(kāi)傷口,取出盒。
材料將回收的基質(zhì)材料包埋到組織冰凍培養(yǎng)基中(Leica-Van Hopplynus設(shè)備,比利時(shí)布魯塞爾),用液氮迅速冷凍,儲(chǔ)存于-80℃。在Microm HM500 OM低溫恒溫器(Prosan,比利時(shí)Merelbeke)上進(jìn)行低溫切割。將7μm切片放在聚-L-賴氨酸包被的載玻片上,儲(chǔ)存于-20℃直到染色。
染色前,用冰冷的丙酮固定該材料10分鐘。然后,用抗體對(duì)基質(zhì)切片進(jìn)行免疫組化染色。用FITC-偶聯(lián)的第二抗體檢測(cè)第一抗體。用裝有Zeiss Axiocam MRc5相機(jī)(Zeiss;比利時(shí)Zaventem)的Axioplan 2成像顯微鏡在室溫下拍照。所用物鏡是Plan-NEOFLUAR 1x/0.025,Plan-APOCHROMAT 10X/0.45和20x/0.75。用AxiovisionRel.4.4進(jìn)行圖像分析。
為了詳細(xì)研究細(xì)胞表型(免疫組化),按照功能或特異性將其分組。腹膜內(nèi)植入后,研究了六個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度和增殖(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=6)。
表3細(xì)胞計(jì)數(shù)和原位增殖

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,a,與6小時(shí)有顯著性差異(p<0.05);b,與5天有顯著性差異(p<0.05);c,與3天有顯著性差異(p<0.05)。
表3顯示,腹膜內(nèi)接種6小時(shí)后,細(xì)胞存在于完全非細(xì)胞的植入材料上。在植入物中,通??捎^察到細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加,從第1天起變得顯著。植入7天后,觀察到細(xì)胞數(shù)量增加了4倍以上。在植入后第三天原位細(xì)胞增殖中,用于評(píng)價(jià)原位細(xì)胞增殖的標(biāo)記物磷酸化組蛋白H3(PPH-H3)顯示出約5%的明顯峰值。除了第三天細(xì)胞增殖中存在峰值,這些數(shù)據(jù)支持由細(xì)胞流入而非細(xì)胞分裂引起組織新生。僅在第三天,細(xì)胞增殖似乎有助于提高細(xì)胞性(cellularity)。
用VLA-4(CD49d)、CD44和CD172a或信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的抗體評(píng)價(jià)細(xì)胞結(jié)合和尋靶能力。圖9顯示出,包含約20%細(xì)胞群體的FBR的第一階段中明確出現(xiàn)VLA4+細(xì)胞,這個(gè)比例在腹膜內(nèi)植入5天后顯著降低至約為零。CD44+細(xì)胞顯示相似的初始存在,但與6小時(shí)測(cè)定結(jié)果相比第2、5和7天結(jié)果顯著降低,但其存在維持在約10%直到第7天。CD172a數(shù)據(jù)顯示了這些細(xì)胞存在的相似模式,與CD44數(shù)據(jù)處于同一數(shù)量級(jí),除了該降低不顯著存在和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性小峰出現(xiàn)在第3天。T細(xì)胞、B細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、CD34+造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的VLA-4(CD49d)是結(jié)合骨髓基質(zhì)上的血管細(xì)胞粘著分子-1(VCAM-1)并參與干細(xì)胞和祖細(xì)胞尋靶至骨髓基質(zhì)的的整聯(lián)蛋白分子(Krause等(1996)Blood 87,1-13)。VLA-4也介導(dǎo)造血祖細(xì)胞粘著于纖連蛋白(Levesque和(1999)Exp.Hematol.27,579-586)。白細(xì)胞、造血祖細(xì)胞(Netelenbos等(2002)J Leukoc.Biol.72,353-362)和間充質(zhì)干細(xì)胞(Rombouts和Ploemacher(2003)Leukemia 17,160-170)上的粘著分子CD44已顯示能介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞-ECM相互作用,從而在白細(xì)胞運(yùn)輸至炎癥部位中起作用,并且共同刺激淋巴細(xì)胞活化和組織浸潤(rùn)(Wu等(2005)Cell Res.15,483-494)。而且,細(xì)胞表面蛋白聚糖CD44與胞外基質(zhì)糖胺聚糖乙酰透明質(zhì)酸(HA)的相互作用是炎癥中的關(guān)鍵事件(Levesque等同上)。植入后VLA-4+和CD44+細(xì)胞組分水平立即升高明確表明,這些分子介導(dǎo)了細(xì)胞結(jié)合和尋靶能力提高,該能力在細(xì)胞開(kāi)始分化的晚期顯著降低,也觀察到絕對(duì)細(xì)胞數(shù)顯著降低。
最重要的是,研究了干細(xì)胞/祖細(xì)胞主要表達(dá)的5種標(biāo)記物CD133、干細(xì)胞抗原-1(Sca-1)、CD34和CD117(c-kit)(見(jiàn)圖10)。代表研究最多的原代干細(xì)胞的CD133+細(xì)胞組分(Gehling等(2000)Blood 95,3106-3112)非常小,在1只大鼠中植入3天后達(dá)到其峰值2.3%。已知原代造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞遞呈Sca-1。在腹膜內(nèi)植入早期,發(fā)現(xiàn)了約7%這些細(xì)胞。CD34和c-kit(CD117)都是循環(huán)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的標(biāo)記物(Okamoto等(2005)Blood 105,2757-2763)。C-kit也在間充質(zhì)干細(xì)胞上表達(dá)。CD34+細(xì)胞的臨時(shí)分布型顯示出植入物材料上發(fā)現(xiàn)的這些細(xì)胞的分?jǐn)?shù)逐漸增加,在第2和第3天達(dá)到顯著峰值,約為5-8%。值得注意的是,在第5天已經(jīng)明顯看出CD34+細(xì)胞非常迅速地回到低水平,然后到第7天再一次顯著增加。c-kit模式顯示在第2和第3天水平顯著增加,約為2%??缒ぜ?xì)胞表面抗原CD133的表達(dá)僅限于CD34+干細(xì)胞和祖細(xì)胞的亞組(Buhring等(1999)Ann.N.Y.Acad.Sci.872,25-38)和內(nèi)皮前體細(xì)胞(Gehling等2000,同上)。此外,約0.2%的一小部分CD34-細(xì)胞表達(dá)它(Gallacher等,同上)。原代和髓樣祖細(xì)胞中富含CD34+CD133+細(xì)胞,而CD34+CD133-細(xì)胞主要由B細(xì)胞和晚期紅細(xì)胞樣祖細(xì)胞組成(Buhring等1999,同上)。CD133抗原零星存在于植入的小片上,表明這些原代細(xì)胞在FBR新組織形成中的作用非常有限。Sca-1表達(dá)于骨髓和外周血中的多能原代造血干細(xì)胞上,以及間充質(zhì)干細(xì)胞上。Sca-1+細(xì)胞比Sca-1細(xì)胞更原始,對(duì)造血因子組合的反應(yīng)更好,包括SCF和基質(zhì)細(xì)胞(Okada等(1992)Blood 80,3044-3050;Rombouts和Ploemacher同上;Spangrude等(1991)Blood78,1395-1402.)。有趣的是,在植入后立即觀察到更大比例的這些細(xì)胞,后期逐漸降低。在植入2天后觀察到絕對(duì)細(xì)胞數(shù)量的峰值??傊?,所述發(fā)現(xiàn)明確表明這些細(xì)胞是FBR反應(yīng)的主要早期貢獻(xiàn)物(contributor)。
與CD133和Sca-1相比,CD34和CD117均用作更定型的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的標(biāo)記物。單鏈膜蛋白標(biāo)記物CD34表明造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存在。C-kit(CD117)是受體酪氨酸激酶家族成員和干細(xì)胞因子(SCF)受體,它在造血原代干細(xì)胞和定型祖細(xì)胞(Okada等同上)、循環(huán)系統(tǒng)未成熟細(xì)胞(Taguchi等(2004)Circulation 109,2972-2975)和間充質(zhì)干細(xì)胞(Rombouts和Ploemacher同上)上表達(dá)。這些結(jié)果顯示在植入后第2和第3天,CD34+和c-kit+細(xì)胞水平臨時(shí)升高,這在CD34+細(xì)胞組分中尤其顯著。這些細(xì)胞在第3天顯示接近Sca-1+細(xì)胞的初始分?jǐn)?shù)的清晰峰值。這些發(fā)現(xiàn)可解釋為Sca-1+細(xì)胞分化為更定型的c-kit+或CD34+細(xì)胞,或者通過(guò)早期FBR中存在的其它細(xì)胞,可能是巨噬細(xì)胞釋放的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子從血流中臨時(shí)募集這些細(xì)胞類型。由于處于峰值的CD34+細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量大大超過(guò)Sca-1細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù),后一種解釋更可接受。
本發(fā)明驚訝地發(fā)現(xiàn)在大鼠腹膜內(nèi)植入模型中,在未成熟異物反應(yīng)期間,干細(xì)胞和祖細(xì)胞粘附于組織,并主動(dòng)參與含有成(肌)纖維細(xì)胞的基質(zhì)重建。
實(shí)施例3組織新生中的特異性基因表達(dá)。
如上所述,在成年動(dòng)物模型的FBR中發(fā)生組織新生時(shí)研究組織新生,因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生具有類似于血管結(jié)構(gòu)如心臟瓣膜的細(xì)胞組分的片層組織(Butler等2001a同上;Butler等2001b同上)。不幸的是,成熟組織不是理想的解決方案,因?yàn)樾枰谑中g(shù)室中構(gòu)建瓣膜假體,這種方法易引起瓣膜質(zhì)量改變(Grabenwoger等(2000)J HeartValve Dis 9,104-109)。然而,組織新生本身(in se)是有趣的特征,因?yàn)樗袠?gòu)建新組織必需的所有組件,即細(xì)胞(實(shí)施例2)、新胞外基質(zhì)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和尋靶蛋白。鑒定了尋靶蛋白,它是負(fù)責(zé)將細(xì)胞與胞外基質(zhì)物理連接的分子。
與實(shí)施例2相似,光致氧化的牛心包膜是完全非細(xì)胞的交聯(lián)基質(zhì),將其重懸于不銹鋼盒中,并植入Wistar大鼠的腹腔。用每組2只大鼠研究了兩個(gè)不同植入時(shí)間(1.5天和3天)。根據(jù)動(dòng)物分配的組別,在1.5天或3天后回收植入物。為該目的,再次麻醉動(dòng)物,再次打開(kāi)傷口,取出盒。取出后,立即將基質(zhì)小片放入RNAlater RNA穩(wěn)定試劑(Qiagen)中,直到抽提RNA。
背景基因表達(dá),即巨噬細(xì)胞的基因表達(dá),獲自3只大鼠中經(jīng)巰基乙酸酯-(無(wú)菌鹽水配制的2ml 3%巰基乙酸酯,過(guò)濾除菌)誘導(dǎo)的腹膜內(nèi)巨噬細(xì)胞。
用TRIzol試劑(Invitrogen)抽提總RNA,然后用Rneasy小抽柱(Mini SpinColumn)(Qiagen)進(jìn)一步純化。在VIB(Flemish Interuniversitary Institute forBiotechnology)的微陣列試驗(yàn)室分別用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies)和Nanodrop分光光度計(jì)控制總RNA的完整性和純度。按照Affymetrix指南由5μg總RNA制備探針,證實(shí)沒(méi)有降解或雜質(zhì)的跡象(260/280和260/230>1.8)。簡(jiǎn)要說(shuō),用聚dT-T7引物從總RNA逆轉(zhuǎn)錄聚-A RNA,在T7體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間用AffymetrixIVT標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記(目錄號(hào)900449,Affymetrix,High Wycombe,英國(guó))。純化探針(GeneChip樣品清潔模塊,目錄號(hào)P/N900371,Affymetrix,英國(guó)),并再次分析產(chǎn)率(30-120μg)和純度(260/280和260/230>1.8)。用堿水解使20μg片段化。將片段化的aRNA和對(duì)照摻加物(spike)重懸在300μl雜交緩沖液溶液中(真核雜交控制試劑盒,目錄號(hào)900299,Affymetrix,High Wycombe,英國(guó)),在45℃的電熱恒溫箱中雜交200μl探針。洗滌基因芯片(Affymetrix基因芯片大鼠基因組230 2.0陣列,Affymetrix,英國(guó)),并在基因芯片流體臺(tái)(GeneChip Fluidics Station)400(Affymetrix,英國(guó))上用EukGE-WS2v4方案染色,然后用基因芯片掃描儀3000(Affymetrix,UK)掃描。用GCOS進(jìn)行圖像分析。
用獲自不同動(dòng)物的非集合樣品一式三份地進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。用GCOS進(jìn)行圖像分析。達(dá)到上述背景水平且具有顯著性(p<0.05)的探針強(qiáng)度值被認(rèn)為是有信號(hào)。用按照基因本體論分類法對(duì)基因分類的Onto-Express進(jìn)行微陣列數(shù)據(jù)的功能分析。[Draghici等(2003)Nucleic Acids Res.31,3775-3381]。
如實(shí)施例3所示,初步反應(yīng)發(fā)生后,建立胞外基質(zhì)分子和尋靶蛋白,可在第三天提供細(xì)胞粘著位點(diǎn)。
分析中考慮了微陣列芯片上存在的所有基因(±31000)。維恩圖解(圖11)給出了基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)的概況。比較FBR和IP的表達(dá)分布型,發(fā)現(xiàn)了3868個(gè)FBR3和2957個(gè)FBR1.5特定基因(非巨噬細(xì)胞來(lái)源)。主要感興趣的基因編碼胞外基質(zhì)蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,這些蛋白能夠吸引和尋靶已顯示參與非成熟FBR的干細(xì)胞,。雖然同時(shí)在FBR1.5和FBR3中發(fā)現(xiàn)了諸如不同膠原和層粘連蛋白等結(jié)構(gòu)分子的顯著信號(hào),但GO分組的這些分子的總體表達(dá)僅在后一組中有顯著性。這意味著不管FBR1.5組中一些結(jié)構(gòu)分子的表達(dá)如何,僅在FBR3組中發(fā)現(xiàn)那些基因在細(xì)胞尋靶后的突出貢獻(xiàn)。在FBR3和FBR1.5中,分別將85種和116種基因歸因于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物活性,GO術(shù)語(yǔ)是例如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1γ(SDF-1),它是能結(jié)合于造血干細(xì)胞的分子,因此是整合入生物物質(zhì)的感興趣候選物。
從這些結(jié)果可以看出,SDF-1和SCF都出現(xiàn)在這種成年組織新生中,它們都是用于研究體內(nèi)干細(xì)胞/祖細(xì)胞尋靶至血管/瓣膜假體的候選尋靶蛋白。
實(shí)施例4大鼠的頸動(dòng)脈移植物。
通過(guò)將小口徑血管移植物作為插入物植入普通頸動(dòng)脈來(lái)評(píng)價(jià)納米材料包被材料的再接種潛力。該移植物是含有1μg/管的SDF-1或SCF(30μl PBS配制)的光致氧化心包膜手工制作,牛心包膜經(jīng)或未經(jīng)纖連蛋白的預(yù)先包被。該移植物僅在適當(dāng)位置保留24小時(shí),足以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞粘著,但不足以導(dǎo)致細(xì)胞分化,這會(huì)導(dǎo)致丟失其干細(xì)胞特性。制備牛心包膜的管道,使其內(nèi)徑約為大鼠頸動(dòng)脈的內(nèi)徑。通過(guò)將一小片光致氧化的材料在小規(guī)格塑料插管上卷繞并用顯微外科技術(shù)縫合長(zhǎng)邊制造移植物。移植物長(zhǎng)約5mm,內(nèi)徑小10倍。將移植物的內(nèi)徑與普通頸動(dòng)脈的內(nèi)徑相比看出移植物的內(nèi)徑約大20%。選擇較大內(nèi)徑是因?yàn)槌醮沃踩胛镌诨颊唧w內(nèi)保留數(shù)周。
植入方案修改的Boeckx(1997)Ann.Thorac.Surg.63,S128-S134)公開(kāi)的家兔方案。用異氟烷(誘導(dǎo)4%;手術(shù)2%)麻醉380-400g的雄性Wistar大鼠(各材料組n=6)。剃毛并用碘酒消毒后,將普通頸動(dòng)脈從周?chē)M織中分離出來(lái),并裝上Acland-型微鉗。然后橫切動(dòng)脈,采用7點(diǎn)縫合技術(shù)用10/0單絲尼龍縫合移植構(gòu)建物的近端和遠(yuǎn)端(Kirsch等(1992)Am.Surg.58,722-727),共需要9-12針。針頭抓住管壁的全部厚度。需要小心的是,僅針頭接觸動(dòng)脈內(nèi)膜。在不用解痙藥(如罌粟堿)和抗凝藥(如肝素)的情況下進(jìn)行整個(gè)過(guò)程??p好最后一針后,去除兩個(gè)Acland型微鉗。數(shù)分鐘后(保證完全止血),縫合皮膚。停止麻醉,約5分鐘后動(dòng)物蘇醒,將其轉(zhuǎn)移到單個(gè)籠中。
24小時(shí)后,再次打開(kāi)傷口,先提起移植物,用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。切下移植物和各接合部位上的一小段天然頸動(dòng)脈。用磷酸鹽緩沖鹽水溫和沖洗內(nèi)腔,然后充滿組織冷凍培養(yǎng)基。包埋到相同培養(yǎng)基中后,用液氮迅速冷凍樣品,保存于-80℃。在Microm HM500 OM低溫恒溫器(Prosan,Merelbeke,比利時(shí))上進(jìn)行切片。將7μm縱向切片放在聚-L-賴氨酸包被的玻片上,儲(chǔ)存于-20直到染色。
要強(qiáng)調(diào)干細(xì)胞吸引,因此,用免疫組化法染色樣品的四種標(biāo)記物CD3(BDPharmingen;克隆G4.18),c-kit(Santa Cruz Biotechnology;克隆H-300),CD34(DAKO;克隆QBEnd 10),Sca-1(R&D Systems;山羊多克隆)。下表說(shuō)明了用各抗體染色的細(xì)胞類型。
表4用于細(xì)胞染色的抗體

所有第一抗體都用熒光染料、FITC或得克薩斯紅偶聯(lián)的抗體檢測(cè)。用Axioplan2成像顯微鏡(Zeiss,Zaventem,比利時(shí))和Axiovision 4.4軟件包(Zeiss,Zaventem,比利時(shí))進(jìn)行圖像分析。為進(jìn)行細(xì)胞表型分析,共評(píng)價(jià)了250個(gè)細(xì)胞各自的縱截面,結(jié)果表示為百分?jǐn)?shù)。為了避免偏見(jiàn),按照隨機(jī)列表取數(shù)張圖片,切成四塊并計(jì)數(shù)。
總之,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)定量細(xì)胞粘附的顯著性差異(表5)表5細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)

在兩組中發(fā)現(xiàn)了CD34陽(yáng)性細(xì)胞。這些細(xì)胞存在于對(duì)照組(1.85
%),植入大鼠血管后僅進(jìn)行自發(fā)性接種。而且,它們顯示出存在于SCF浸漬的光致氧化牛心包膜中(3.84
%),雖然發(fā)現(xiàn)了數(shù)值上的增加,但由于個(gè)體之間的巨大差異這種增加沒(méi)有顯著性。其余三組不含CD34+細(xì)胞。
CD117免疫染色的結(jié)果見(jiàn)圖12(A)。由光致氧化的心包膜組成的對(duì)照樣品顯示在植入大鼠頸動(dòng)脈后存在(中值)4.70[2.14,12.17]%的CD117+細(xì)胞。用SCF或SDF-1浸漬相同基質(zhì)材料能顯著增加植入物內(nèi)腔側(cè)上或其中的CD117+細(xì)胞分?jǐn)?shù)。對(duì)于SCF和SDF-1,分別發(fā)現(xiàn)15.78[10.04,47.90]%和34.02[26.32,37.39]%的分?jǐn)?shù)。雖然纖連蛋白共浸漬對(duì)CD34+和Sca-1+細(xì)胞的存在沒(méi)有影響,但發(fā)現(xiàn)CD117+細(xì)胞的尋靶顯著增加。纖連蛋白和SCF的共浸漬產(chǎn)生的CD117+細(xì)胞分?jǐn)?shù)為47.84[41.10,66.00]%。雖然數(shù)值上增加較大,但由于SCF組中CD117+分?jǐn)?shù)的巨大差異,這種增加沒(méi)有顯著性。另一方面,發(fā)現(xiàn)與SDF-1組相比時(shí),纖連蛋白和SDF-1共浸漬組的CD117+分?jǐn)?shù)的增加(48.90[42.32,54.08]%)是顯著性增加。通常,發(fā)現(xiàn)所有浸漬方案都能誘導(dǎo)CD117陽(yáng)性細(xì)胞尋靶增強(qiáng),尤其是SCF或SDF-1與纖連蛋白的組合導(dǎo)致約50%細(xì)胞成為此標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。
最后,研究了經(jīng)或不經(jīng)纖連蛋白預(yù)包被的含有SDF-1或SCF的光致氧化牛心包膜對(duì)Sca-1+干細(xì)胞的吸引(參見(jiàn)圖12b)。在對(duì)照中,在總共6個(gè)移植物的2個(gè)中發(fā)現(xiàn)一些Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞。當(dāng)浸漬相同基質(zhì)材料時(shí),這導(dǎo)致所有植入物中粘著了Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞,也導(dǎo)致Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增加。Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞可歸因于干細(xì)胞組或T細(xì)胞亞組。所有植入物中都顯示T細(xì)胞染色(抗CD3免疫組化)陰性,從而驗(yàn)證了Sca-1陽(yáng)性干細(xì)胞特異性尋靶到浸漬材料。
實(shí)施例5植入綿羊頸動(dòng)脈的小塊。
已經(jīng)將SCF和SDF-1浸漬的牛心包小片植入綿羊頸動(dòng)脈。采用這兩種蛋白之前用或不用纖連蛋白包被基質(zhì)材料。將四小片植入各(左和右)頸動(dòng)脈。在各側(cè)植入對(duì)照以及1μg、3μg和10μg/cm2的包被小片。對(duì)照植入下游,隨后植入1、3和10μg/cm2小片,其中將10μg/cm2小片植入最上游的位置。圖13顯示發(fā)現(xiàn)了一些CD34+細(xì)胞(造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞)。
權(quán)利要求
1.一種包含結(jié)構(gòu)基質(zhì)的支架,其特征在于,用一種或多種尋靶因子包被所述基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的支架,其特征在于,所述支架是血管支架或心臟瓣膜。
3.如權(quán)利要求1或2所述的支架,其特征在于,所述尋靶因子能夠?qū)⒆婕?xì)胞或干細(xì)胞結(jié)合于所述基質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的支架,其特征在于,所述結(jié)構(gòu)基質(zhì)是不可生物降解的。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的支架,其特征在于,所述尋靶因子是受體的配體,或包含受體結(jié)合域的配體片段,或結(jié)合于受體的肽。
6.如權(quán)利要求5所述的支架,其特征在于,所述受體在所述干細(xì)胞或祖細(xì)胞上表達(dá)。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的支架,其特征在于,所述尋靶因子選自基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1、干細(xì)胞因子、VCAM-1、纖維蛋白原P1區(qū)或纖維蛋白原P2區(qū)。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的支架,其特征在于,所述尋靶因子是基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1或SCF。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的支架,它不包含趨化因子或動(dòng)員因子。
10.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的支架,它還包含趨化因子和/或動(dòng)員因子。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的支架,其特征在于,還涂有促進(jìn)尋靶因子和結(jié)構(gòu)基質(zhì)之間相互作用的一種或多種蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的支架,其特征在于,所述促進(jìn)蛋白選自纖連蛋白、膠原或纖維蛋白原。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的支架,其特征在于,所述尋靶因子通過(guò)連接臂的方式包被于所述結(jié)構(gòu)基質(zhì)。
14.如權(quán)利要求13所述的支架,其特征在于,所述連接臂是可生物降解的。
15.如權(quán)利要求11所述的支架,其特征在于,所述尋靶因子和促進(jìn)結(jié)合結(jié)構(gòu)基質(zhì)的蛋白以融合蛋白形式連接于基質(zhì)。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的支架,其特征在于,所述結(jié)構(gòu)基質(zhì)是非交聯(lián)假體或非細(xì)胞主動(dòng)脈根。
17.一種制備支架的方法,其包括用尋靶因子包被基質(zhì)的步驟。
18.如權(quán)利要求17所述的方法,其特征在于,所述支架是心臟瓣膜或血管支架。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法,其特征在于,用促進(jìn)尋靶因子和結(jié)構(gòu)基質(zhì)之間相互作用的一種或多種蛋白預(yù)包被所述支架的基質(zhì)。
20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述尋靶因子化學(xué)交聯(lián)于所述結(jié)構(gòu)基質(zhì)。
21.如權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,通過(guò)用含有所述尋靶因子的溶液浸漬所述基質(zhì)進(jìn)行所述包被。
22.一種成套工具,其包括用于移植物的結(jié)構(gòu)基質(zhì)和一種或多種尋靶因子。
23.如權(quán)利要求22所述的成套工具,其特征在于,所述移植物是血管或心臟瓣膜的形式。
24.如權(quán)利要求22或23所述的成套工具,其特征在于,所述尋靶因子是干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞特異性受體的配體。
25.如權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的成套工具,其特征在于,所述尋靶因子選自基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1、干細(xì)胞因子、VCAM-1、纖維蛋白原P1區(qū)或纖維蛋白原P2區(qū),或者保留其受體結(jié)合能力的它們的片段或衍生物。
26.如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的成套工具,還包括促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子和結(jié)構(gòu)基質(zhì)之間相互作用的蛋白。
27.如權(quán)利要求26所述的成套工具,其特征在于,所述促進(jìn)尋靶因子和結(jié)構(gòu)基質(zhì)之間相互作用的蛋白選自纖連蛋白、膠原和纖維蛋白原。
28.一種將尋靶因子用于制備可植入裝置的應(yīng)用。
29.如權(quán)利要求28所述的應(yīng)用,其特征在于,所述裝置是心臟瓣膜或血管移植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基質(zhì),其包含用于可植入醫(yī)療裝置如心臟瓣膜和血管移植物的體內(nèi)再細(xì)胞化的尋靶因子。
文檔編號(hào)A61L27/50GK101094697SQ200580038223
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月8日
發(fā)明者W·弗萊蒙, G·德菲瑟爾 申請(qǐng)人:魯汶天主教大學(xué)研究開(kāi)發(fā)部, 阿爾法-根股份有限公司
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