專利名稱：磷脂用于傷口愈合的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于傷口愈合的藥物組合物和一種用于傷口治療(傷口處置)的方法。該組合物含有一種磷脂，尤其是一種稱作嘌嗎可坦的磷脂混合物。
目前對于尋找提高傷口愈合速度的方法有一種普遍的需求。哺乳動(dòng)物胎兒的組織修復(fù)與正常的愈合是完全不同的。在成人中，損傷的組織通過膠原沉積、膠原重塑和最終的疤痕形成來修復(fù)的，而胎兒傷口的愈合顯然更多是一種疤痕形成最小化或無疤痕形成的再生過程。成人傷口通過用含有超量的和非正常的組織膠原的疤痕替代正常的真皮來愈合。截然相反的是，胎兒的傷口含有始終豐富的透明質(zhì)酸(或稱作玻璃酸，hyaluronan)，而且膠原沉積是快速的且不過量，參見Bruce A Mast，M.D.，Robert F.Diegelmann，Ph.D.，Healing in the Mammalian Foetus，Surg.Gyn.And Ob.，Vol.174，pp.441-451，May 1992.
目前所知，透明質(zhì)酸在支配(harness)和操控組織成纖維細(xì)胞的自然修復(fù)能力方面具有明確的作用，并且透明質(zhì)酸蛋白復(fù)合物在體內(nèi)組織化或疤痕組織方面具有重要的作用，參見D.A.R.Burd，R.M.Greco，S.Regaurer，M.T.Longaker，J.W.Siebert and H.G.Garg，Hyaluronan and Wound Healinga New Perspective，Journal of PlasticSurgery，1991，pp.579-584.
應(yīng)當(dāng)明了，術(shù)語透明質(zhì)酸包括它的衍生物，并且泛指自然存在的、微生物和合成的由葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺殘基構(gòu)成的各種分子量的酸性多糖的衍生物。
成人的傷口愈合過程與在羊膜液(羊水)中發(fā)生的愈合相比較是明顯不同的。在最初的三天中，透明質(zhì)酸的濃度(水平)迅速上升是成人傷口愈合的特征。到第七天，則透明質(zhì)酸無法檢出。
胎兒傷口愈合的特點(diǎn)是在最初的三天內(nèi)透明質(zhì)酸的濃度(水平)迅速上升，但是與成人傷口愈合不同的是透明質(zhì)酸的濃度(水平)可以保持上升持續(xù)21天。這些發(fā)現(xiàn)是由Michael T.Longaker，M.D.，Ernie R.Harrison，M.D.和Robert Stern，M.D.給出的研究結(jié)果，并發(fā)表在題目為Studies in Foetal Wound HealingV.A.ProlongedPresence of Hyaluronic Acid Characterizes Foetal Wound Fluid，in Ann.Surg.，April 1991，pp.292-296的文章中。
已知將透明質(zhì)酸用于燒傷、瘡口、切口和傷口目的是創(chuàng)造與胎兒愈合條件類似的成人愈合條件。然而這些治療并沒有產(chǎn)生與預(yù)期同樣的益處。
已經(jīng)找到了改善這個(gè)問題的方法。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌用于治療傷口的磷脂。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供了一種通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌用于治療傷口的藥物組合物，該組合物包括一種磷脂和與之相關(guān)的藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種根據(jù)本發(fā)明的磷脂或藥物組合物在制備通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌用于治療傷口的藥物中的應(yīng)用。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將磷脂用于傷口時(shí)，它刺激透明質(zhì)酸的生成。不考慮任何特定理論的限制，由于在創(chuàng)傷部位磷脂誘導(dǎo)了自體的透明質(zhì)酸的分泌，因而認(rèn)為本發(fā)明是有益的。這比外部施用透明質(zhì)酸更好，外部施用透明質(zhì)酸不是必然對患者帶來益處，因?yàn)榇嬖谠S多各自具有相反的性質(zhì)的不同類型的透明質(zhì)酸。在本發(fā)明中，將磷脂用于在創(chuàng)傷部位產(chǎn)生透明質(zhì)酸，這種特性對于每位患者都是特別希望的。
該磷脂具有?；〈牧字；鶊F(tuán)。該?；梢园柡突虿伙柡王；?，其通常具有14到22個(gè)碳原子，優(yōu)選16到20個(gè)碳原子。優(yōu)選地，該磷脂可以包括各種?；?，飽和的基團(tuán)如軟脂酰基(棕櫚?；⑹轷；?C16:0和硬脂?；?十八烷酰基)C18:0和/或不飽和的基團(tuán)如油?；鵆18:1和C18:2。二酰基取代物是優(yōu)選的，且該磷脂更特別是包括兩個(gè)一樣的飽和或不飽和?；貏e是二軟脂?；?二棕櫚?；?和二硬脂?；蛄字幕旌衔?，其中這些基團(tuán)是主要的，特別是其中二軟脂?；侵饕亩；糠诌@樣的混合物。
該磷脂可選或者是動(dòng)物衍生的或植物衍生的或者是合成生產(chǎn)的。人造磷脂一般是指自然界中不存在的磷脂；優(yōu)選的是沒有引入動(dòng)物衍生蛋白危險(xiǎn)的合成磷脂。
該磷脂優(yōu)選作為唯一的活性成分用于治療傷口(處置傷口)。相應(yīng)的，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選僅含有該磷脂作為治療劑。該磷脂優(yōu)選完全無膽固醇或三酸甘油脂。
動(dòng)物衍生的磷脂可以通過切碎或灌洗哺乳動(dòng)物的肺如豬或牛肺的常規(guī)方法得到。可以使用的動(dòng)物衍生的磷脂的例子包括固爾蘇(一種肺表面活性劑，Curosurf)，(Chiesi Farmaceutici)它是從切碎的豬肺中生成的，且含有99％的磷脂和1％的表面活性劑蛋白(surfactant protein)；Alveofact(Dr.Karl Thomae，Ltd.，Germany)，它是從牛肺灌洗液中得到的化合物，且含有90％的磷脂、約1％的蛋白、3％的膽固醇、0.5％游離脂肪酸、和其它成分，包括三酸甘油脂；Survanta(一種肺表面活性劑)(Abbott，Ltd.，Germany)，它是通過脂質(zhì)提取切碎的牛肺制備的，且含有大約84％的磷脂、1％的蛋白、和6％的游離脂肪酸；BLES(BLES Bilchemicals，Canada)，它是通過牛肺灌洗液生產(chǎn)的；或Infasurf(Forest Labs)，也稱作卡爾法坦(calfactant)，它是通過小牛肺灌洗液制備的，且含有35mg/ml磷脂，其是26mg/ml磷脂酰膽堿(PC)、26mg/ml二軟脂?；字Ｄ憠A(DPPC)、0.65mg/ml蛋白和0.26mg/ml疏水肽。
合成磷脂優(yōu)選為二?；字Ｄ憠A(DAPC)如DPPC，二油?；字Ｄ憠A(DOPC)或二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)，磷脂酰甘油(PG)，PC，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰絲氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酸，和/或溶血磷脂質(zhì)。
該磷脂優(yōu)選為二?；字Ｄ憠A和磷脂酰甘油的混合物。有利地，該磷脂酰甘油為二酰基磷脂酰甘油。該磷脂酰甘油的?；梢允窍嗤幕虿煌?，有利的是可以具有14到22個(gè)碳原子的各脂肪酸?；鶊F(tuán)。實(shí)際上，該磷脂酰甘油組分可以是含有不同酰基基團(tuán)的磷脂酰甘油的混合物。優(yōu)選的是該磷脂酰甘油的至少一部分脂肪酸?；鶊F(tuán)是不飽和脂肪酸殘基，例如單或二不飽和C18或C20脂肪酸殘基。
在該磷脂酰甘油組分中，優(yōu)選的酰基取代物是軟脂?；?棕櫚?；?、油?；?、亞油?；?、亞麻?；突ㄉ南；?。該磷脂優(yōu)選包括二軟脂酰基磷脂酰膽堿(二棕櫚?；字Ｄ憠A)和磷脂酰甘油。
該磷脂優(yōu)選是重量比從1∶9到9∶1，優(yōu)選從6∶4到8∶2，更優(yōu)選約7∶3的DPPC和PG的混合物。DPPC可以使用Baer & Bachrea，Can.J.of Biochem.Physiol 1959，37page 953的方法通過?；视突姿崮憠A來合成制備，并且可以從Sigma(London)Ltd.商購得到。PG可以采用Comfurions et al，Biochem.Biophys Acta 1977，488，pages36-42；和Dawson，Biochem J.1967，102，pages 205-210的方法由蛋黃磷脂酰膽堿制備，或由其它的磷脂酰膽堿如大豆卵磷脂制備。
當(dāng)從普通溶劑如氯仿中與DPPC共沉淀時(shí)，PG與DPPC形成細(xì)粉。該磷脂優(yōu)選是DPPC和由蛋黃磷脂酰膽堿衍生的磷脂酰甘油的混合物，這導(dǎo)致磷脂?；衔锉籆16、C18(飽和及不飽和的)和C20(不飽和的)?；鶊F(tuán)的混合物取代。
可以用于本發(fā)明的可商購的合成磷脂產(chǎn)品的例子包括Surfaxin(Discovery Labs)，也稱作lucinactant，含有26摩爾份數(shù)的DPPC、8摩爾份數(shù)的POPG、5摩爾份數(shù)的PA和1摩爾份數(shù)的KL-4；肺表面活性因子LSF(Altana)，也稱作盧舒普肽(lusupultide)，含有重組體SP-C、DPPC、PG和PA；棕櫚膽磷(Exosurf，GSK，Germany)，其由DPPC(～84％)、十六醇、和四丁酚醛構(gòu)成；或嘌嗎可坦(Britannia Pharmaceuticals)，其由重量比為7∶3的DPPC和PG的混合物構(gòu)成。
該磷脂優(yōu)選是熔點(diǎn)大致等于或低于體溫(其為待治療的人或動(dòng)物體的溫度)的磷脂或磷脂的混合物。這樣的磷脂混合物優(yōu)選含有具有熔點(diǎn)大致等于或低于體溫的一種鋪展(spreading)磷脂，如PG、PE、PS、或PI。
優(yōu)選地，該磷脂以從1μg/cm2傷口，優(yōu)選從10μg/cm2傷口，更優(yōu)選從50μg/cm2傷口到1000μg/cm2傷口，優(yōu)選到800μg/cm2傷口，更優(yōu)選到300μg/cm2傷口的比率施用。
該磷脂優(yōu)選以干粉的形式施用。更為普遍的是，該粉狀磷脂可以具有的顆粒尺寸(粒度)的范圍是0.5到100μm，更適宜的是0.5到20μm，優(yōu)選0.5到10μm。該磷脂優(yōu)選為表面活性磷脂(SAPL)。
根據(jù)本發(fā)明的磷脂或組合物優(yōu)選誘導(dǎo)在上皮(表皮)或間皮細(xì)胞中的透明質(zhì)酸分泌。
根據(jù)本發(fā)明的待治療(處置)的傷口優(yōu)選為人或動(dòng)物體表面的切口或擦傷。待治療的人或動(dòng)物體表面可選或者是內(nèi)表面或者是外表面。該傷口優(yōu)選為物理損傷。它可以是內(nèi)或外部的物理損傷，例如由燒灼、意外或非手術(shù)切割、劇烈的或破壞性動(dòng)作造成的損傷或傷害。通過本發(fā)明治療的內(nèi)部物理損傷是作為意外或無意識(shí)動(dòng)作結(jié)果的傷害造成的內(nèi)部意外物理損傷。根據(jù)本發(fā)明待治療的外部物理損傷包括外部意外物理損傷以及由手術(shù)造成的外部手術(shù)物理損傷例如為植皮切除皮膚造成的損傷。該傷口可選在人或動(dòng)物體的表面部位，其中該表面的狀況是被如燒灼、切口或擦傷而意外損壞。
本發(fā)明中的傷口治療優(yōu)選包括促進(jìn)表皮細(xì)胞再生(上皮再形成，re-epithelialization)，特別是(促進(jìn))角質(zhì)形成細(xì)胞(的表皮細(xì)胞再生)。換句話說，該磷脂優(yōu)選用于通過促進(jìn)表皮細(xì)胞再生治療傷口。其中表皮細(xì)胞再生是指上皮細(xì)胞或其它表皮細(xì)胞的再生長。而且，本發(fā)明中的傷口治療優(yōu)選通過傷口閉合促使傷口愈合。根據(jù)本發(fā)明的磷脂或藥物組合物優(yōu)選局部施用于傷口。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包括藥學(xué)可接受的賦形劑。任何相容的賦形劑都可以使用。該賦形劑優(yōu)選不含水。當(dāng)載體或稀釋劑是液體時(shí)，它優(yōu)選是非水性的。該賦形劑優(yōu)選包括表面活性劑。表面活性劑是有用的，因?yàn)樗谷埸c(diǎn)高于體溫的磷脂可以用于該組合物中。更優(yōu)選地，該表面活性劑是藥學(xué)可接受的表面活性劑或疏水蛋白。這樣的試劑的例子包括KL-4，其是21個(gè)氨基酸的合成肽；四丁酚醛，其是一種非離子表面活性劑；鯨蠟醇(或十六烷醇)；或膽固醇棕櫚酸酯。更適宜的賦形劑是蛋白，尤其是改善吸收的蛋白如脫輔基蛋白B。
當(dāng)該組合物以液體形式提供時(shí)，該賦形劑優(yōu)選包括一種使磷脂分散或溶解在其中的載體液體。該載體液體一般是一種在體溫下基本不揮發(fā)或僅有少量揮發(fā)的載體液體。適宜的載體包括生理上可接受的二醇，尤其是丙二醇、聚乙二醇和/或甘油。
該組合物可選以液體、半液體或漿狀的形式提供。漿狀物可以通過簡單地將磷脂分散到適宜的載體中來制備，或者在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，將磷脂溶解到加熱的載體中并在冷卻時(shí)使磷脂以粉末狀沉淀，優(yōu)選以可以生成漿狀物的載樣量。作為載體丙二醇是特別有效的，因?yàn)樵谑覝叵铝字梢宰鳛闈{狀物分散在其中，但是在體溫下又形成可流動(dòng)的溶液。也可以制備聚乙二醇，它在室溫下是蠟狀固體而在體溫下是液體，例如PEG 600。磷脂在丙二醇中的各種分散方法如在美國專利6133249中所描述的，將其全部內(nèi)容通過引用合并于此作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供了一種治療傷口的方法，該方法包括對需要如此治療的人或動(dòng)物患者施用治療有效量的磷脂。該磷脂優(yōu)選是以根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的形式。
本發(fā)明將參考如下圖表予以闡述，它并不用于限制權(quán)利要求的范圍，在其中


圖1是用500μg嘌嗎可坦(稱為Adsurf)治療受傷的人腹膜間皮細(xì)胞單層的透明質(zhì)酸釋放與對照的比較圖。
圖2是用數(shù)字?jǐn)z像機(jī)拍攝的對照細(xì)胞的間皮細(xì)胞再生(re-mesothelisation)的一系列圖像，其中圖2A是于0小時(shí)拍攝的，圖2B是于10小時(shí)拍攝的，圖2C是于20小時(shí)拍攝的而圖2D是于30小時(shí)拍攝的。
圖3是用數(shù)字?jǐn)z像機(jī)拍攝的用嘌嗎可坦治療的細(xì)胞的間皮細(xì)胞再生的一系列圖像，其中圖3A是于0小時(shí)拍攝的，圖3B是于5小時(shí)拍攝的，圖3C是于10小時(shí)拍攝的而圖3D是于15小時(shí)拍攝的。
圖4是用嘌嗎可坦或胎牛血清治療的細(xì)胞與對照比較的傷口閉合速度的圖表；該圖表具有在像素/小時(shí)的y軸上的比例尺是從數(shù)字相機(jī)的定時(shí)圖像中得到的。
圖5是顯示通過用RT-PCR檢測的暴露于嘌嗎可坦或?qū)φ盏奶幱谏L抑制的HPMC醛糖HAS 3 v1 mRNA表達(dá)的時(shí)間過程的圖形；柱狀圖表示由所得到凝膠的圖像負(fù)片的光密度掃描得到的HAS3v1/對照(調(diào)節(jié)到1)的平均表達(dá)；以及圖6是顯示當(dāng)用Alamar Blue TM(Biosource)檢測方法測量時(shí)的相對熒光的圖形，它是一種未用嘌嗎可坦刺激的細(xì)胞或用嘌嗎可坦刺激的細(xì)胞的增殖情況的檢測。
本發(fā)明現(xiàn)在將參考下面的實(shí)施例予以說明，這些實(shí)施例并不用來限制權(quán)利要求的范圍。
實(shí)施例1將培養(yǎng)在6孔板中的生長抑制的HPMC以線性方式刮傷，并隨后進(jìn)行顯微觀察直到觀察到傷口愈合(96小時(shí))。一半的孔用500mg/cm2的干嘌嗎可坦治療(處置)，而另一半則留在無血清條件中(對照)。96小時(shí)之后，每個(gè)孔取上清，離心并儲(chǔ)存于-70℃直至分析。用商購的ELISA試劑盒(Corgenix Inc.)按照廠商的指導(dǎo)手冊(使用說明書)檢測上清的透明質(zhì)酸。如圖1所示，測定出透明質(zhì)酸的平均含量并與對照比較。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，嘌嗎可坦誘導(dǎo)間皮細(xì)胞中透明質(zhì)酸的分泌。
實(shí)施例2在本實(shí)施例中，利用已驗(yàn)證的間皮傷口愈合模型(Yung S，Davies M.Response of the human peritoneal mesothelial cell to injuryan in vitro model of peritoneal wound healing.Kidney Int.1998 Dec；54(6)2160-9)研究嘌嗎可坦對于促進(jìn)間皮細(xì)胞再生的作用。
將HPMC(人腹膜間皮細(xì)胞，其是培養(yǎng)自個(gè)別經(jīng)腹部手術(shù)患者的原代細(xì)胞)植于24孔培養(yǎng)板。在無血清的培養(yǎng)液中經(jīng)過生長抑制的該單層(細(xì)胞)用無菌滴頭通過機(jī)械線性刮擦造成損傷，從而留下一個(gè)無細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的可再生區(qū)域。用無血清的培養(yǎng)液清洗孔板以除去分離的細(xì)胞。用脈沖涂藥器(SMC Pneumatics，MiltonKeynes，UK)將嘌嗎可坦(500μg)以干(粉)形式施用于每平方厘米的該單層(細(xì)胞)上，并替換掉無血清培養(yǎng)液(1mL)。使用的對照僅有無血清培養(yǎng)液，或用2％(v/v)FCS補(bǔ)充的培養(yǎng)液。顯微觀測確定每個(gè)孔的裸露區(qū)域，并記錄坐標(biāo)用于隨后的數(shù)據(jù)捕獲。
用安裝有計(jì)算機(jī)控制XY自動(dòng)掃描平臺(tái)和孵育器的Axiovert100M倒置顯微鏡連續(xù)監(jiān)測間皮細(xì)胞再生。經(jīng)調(diào)濕的孵育器保持在37℃和5％CO2，其具有熱插入和矢量氣流(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)。在24孔板的每個(gè)孔中相同的位置上，使用2.5×的物鏡，以60分鐘為間隔在Orca C5985數(shù)字?jǐn)z像機(jī)(Hamamatsu Photonics，Hamamatsu City，Japan)上捕獲圖像。用Openlab 3.0.8版本在麥金托什(Macintosh)G4計(jì)算機(jī)(Improvision，Ltd.，Coventry，UK)上分析圖像。以60分鐘的間隔通過測量裸露區(qū)域(以像素計(jì))的減少直至觀察到傷口閉合來計(jì)算間皮細(xì)胞再生的速率。
在無血清的對照條件下，經(jīng)過20小時(shí)間皮損傷愈合完成(可以從圖2看出)。當(dāng)嘌嗎可坦以干粉施用時(shí)，間皮愈合比對照組增強(qiáng)了(可以從圖3和圖4看出)。因此，可以看出嘌嗎可坦確實(shí)加強(qiáng)了傷口閉合。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，研究了嘌嗎可坦對于透明質(zhì)酸合成酶(HAS)基因上調(diào)作用的影響。
對培養(yǎng)在補(bǔ)充有10％FCS的M199培養(yǎng)液的6孔板中的HPMC單層進(jìn)行生長抑制，并且或者以交叉線的方式刮傷或者保留不做接觸，然后將各孔用無血清培養(yǎng)液清洗以去除分離的細(xì)胞。將損傷和未損傷的細(xì)胞都分成兩個(gè)治療組，其中HPMC或者用脈沖涂藥器在每平方厘米的單層(細(xì)胞)上用干的嘌嗎可坦(500μg)和無血清培養(yǎng)液進(jìn)行治療或者僅僅用無血清培養(yǎng)液治療。然后以96小時(shí)為期間觀察培養(yǎng)物。在這96個(gè)小時(shí)的時(shí)間過程中在下面的時(shí)間點(diǎn)0、6、12、24、48和96小時(shí)從復(fù)制的培養(yǎng)物中取出上清并存儲(chǔ)在-20℃直至需用。
使用TRI試劑(Sigma，Poole，UK)通過溶解細(xì)胞膜而釋放出核內(nèi)物質(zhì)從HPMC中提取出在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總RNA，然后用Superscript II RNase H反轉(zhuǎn)錄酶(InVitrogen，Paisley，Scotland)和六堿基隨機(jī)引物系列(random hexamer)(100μm)(Amersham，Bucks，UK)從1μg總RNA中反轉(zhuǎn)錄cDNA。
用2μl在各時(shí)間點(diǎn)得到的cDNA產(chǎn)物在總體積50μl中用1×PCR緩沖液(1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、2.5單位的AmplitaqGold Taq聚合酶和1μM的HAS特異性寡核苷酸PCR引物(見下文))進(jìn)行HAS基因特異性(HASI、HASII和HASIII v.1)PCR反應(yīng)。
HAS基因特異性引物序列HAS I(SEQ ID No.1)正向ACT GGG TAG CCT TCA ATG TGG A(NM001523)(SEQ ID No.2)反向GAC GAG GGC GTC TCT GAG TAGHAS II(SEQ ID No.3)正向CAT AAA GAA AGC TCG CAA CAC G(NM005328)(SEQ ID NO.4)反向ACT GCT GAG GAA TGA GAT CCA GHAS III v.1(SEQ ID No.5)正向CAG CAC CTT CTC GTG CAT CA(NM005329)(SEQ ID No.6)反向ACT GCA CAC AGC CAA AGT AGG A
然后使該cDNA在94℃變性2分鐘并擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)(94℃30秒，65℃30秒以及68℃90秒)，包括一步68℃15分鐘的延伸步驟。
通過在15％電泳瓊脂凝膠上分離，分析來自各時(shí)間點(diǎn)和各個(gè)治療的反應(yīng)產(chǎn)物，利用BioRaD成像系統(tǒng)和Quantity One軟件使凝膠可視化并成像。如圖5所示出的，該凝膠的圖像負(fù)片的光密度掃描為特異性HAS基因的mRNA表達(dá)提供了標(biāo)準(zhǔn)化的定量數(shù)據(jù)。
由此可見，嘌嗎可坦在HPMC中以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)HAS基因表達(dá)的上調(diào)。
實(shí)施例4嘌嗎可坦對于角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用利用AlamarBlueTMAssay(Biosource)檢測。簡而言之，這種檢測是設(shè)計(jì)用來通過測量細(xì)胞代謝和還原REDOX指示劑(Alamar blue)的能力來測量不同細(xì)胞類型的增殖。REDOX指示劑的還原導(dǎo)致其熒光活性的改變。因此，測定的熒光活性正比于細(xì)胞增殖。
使用的細(xì)胞是人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(成人的)。它們是從TCSCellworks Ltd購買的(產(chǎn)品號(hào)ZHC-1111)。
批號(hào)26619T供者信息年齡39歲性別女膚色有色(dark)
增殖分析利用AlamarBlueTM Assay(Biosource)測試嘌嗎可坦對于角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用。簡而言之，這種檢測是設(shè)計(jì)用來通過測量細(xì)胞代謝和還原REDOX指示劑(Alamar blue)的能力來測量各種細(xì)胞類型的增殖。REDOX指示劑的還原導(dǎo)致其熒光活性的改變。因此，測定的熒光活性正比于細(xì)胞增殖。
該檢測涉及將10％Alamar blue加入到細(xì)胞中并隨后進(jìn)行1小時(shí)孵育。1小時(shí)后，通過在540nm(波長)處測量Alamar blue的熒光活性將細(xì)胞增殖定量。
實(shí)驗(yàn)方法將大約5mg(單劑量)的嘌嗎可坦施用于準(zhǔn)單層的角質(zhì)形成細(xì)胞(24孔板，通道2個(gè))。將無嘌嗎可坦刺激的細(xì)胞用作對照。對于經(jīng)刺激和未經(jīng)刺激的細(xì)胞都進(jìn)行增殖檢測。圖6中的熒光活性以“相對熒光”或“任意單位”表示。
結(jié)果經(jīng)嘌嗎可坦刺激的細(xì)胞明顯比未經(jīng)刺激的對照細(xì)胞增殖快(p＜0.05)，表明嘌嗎可坦可以誘導(dǎo)增加(大約10％)人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。這些初始數(shù)據(jù)與實(shí)施例2中涉及的人腹膜間皮細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)一致。
說明該實(shí)驗(yàn)是對于準(zhǔn)單層的細(xì)胞(少量細(xì)胞)和在早期的時(shí)間點(diǎn)(12小時(shí))進(jìn)行的，并且這些數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)認(rèn)作是初始數(shù)據(jù)。
序列表<110>大不列顛藥品有限公司<120>磷脂用于傷口愈合的應(yīng)用<130>P12776BKB<140>PCT/GB2005/004552<141>2005-11-28<150>GB 0426010.5<151>2004-11-26<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>Human<400>1actgggtagc cttcaatgtg ga 22<210>2<211>21<212>DNA<213>Human<400>2gacgagggcg tctctgagta g21<210>3<211>22<212>DNA<213>Human<400>3cataaagaaa gctcgcaaca cg 22<210>4<211>22<212>DNA<213>Human<400>4actgctgagg aatgagatcc ag 22<210>5<211>20<212>DNA<213>Human<400>5cagcaccttc tcgtgcatca 20<210>6<211>22<212>DNA<213>Human<400>6actgcacaca gccaaagtag ga 2權(quán)利要求
1.一種通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌用于傷口治療的磷脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂，所述磷脂是一種合成磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的磷脂，所述磷脂是二?；字Ｄ憠A、磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、和/或溶血磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的磷脂，所述磷脂是重量比從1∶9到9∶1，優(yōu)選從6∶4到8∶2，更優(yōu)選為約7∶3的二軟脂?；字Ｄ憠A和磷脂酰甘油的混合物。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的磷脂，所述磷脂以從1μg/cm2傷口，優(yōu)選從10μg/cm2傷口，更優(yōu)選從50μg/cm2傷口到1000μg/cm2傷口，優(yōu)選到800μg/cm2傷口，更優(yōu)選到300μg/cm2傷口的比率被施用
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的磷脂，所述磷脂是干粉的形式。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的磷脂，其中所述磷脂是用于治療傷口的唯一活性成分。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的磷脂，其中所述傷口是人或動(dòng)物體的內(nèi)表面或外表面的切口或擦傷。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的磷脂，其中所述動(dòng)物體是哺乳動(dòng)物體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9中所述的磷脂，其中所述傷口是物理損傷，優(yōu)選所述物理損傷是意外物理損傷或外部手術(shù)物理損傷。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的磷脂，其中所述傷口治療包括促進(jìn)表皮細(xì)胞再生。
12.一種通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌用于傷口治療的藥物組合物，所述組合物包括一種磷脂以及相關(guān)的藥學(xué)可接受的賦形劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述磷脂是如在權(quán)利要求2到7任一項(xiàng)中所述的磷脂。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述傷口是人或動(dòng)物體內(nèi)表面或外表面的切口或擦傷。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述動(dòng)物體是哺乳動(dòng)物體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述傷口是物理損傷，優(yōu)選所述物理損傷是意外物理損傷或外部手術(shù)物理損傷。
17.根據(jù)權(quán)利要求12到16中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述傷口治療包括促進(jìn)間皮細(xì)胞再生。
18.根據(jù)權(quán)利要求12到17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述賦形劑是表面活性劑、蛋白、和/或載體液體。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的磷脂或權(quán)利要求12到18中任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌用于傷口治療的藥物中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其中所述傷口是人或動(dòng)物體內(nèi)表面或外表面上的切口或擦傷。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所述動(dòng)物體是哺乳動(dòng)物體。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其中所述傷口是物理損傷，優(yōu)選所述物理損傷是意外物理損傷或外部手術(shù)物理損傷。
23.根據(jù)權(quán)利要求19到22中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述傷口治療包括促進(jìn)間皮細(xì)胞再生。
24.一種治療傷口的方法，所述方法包括對需要如此治療的人或動(dòng)物患者施用治療有效量的磷脂，用以誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述磷脂是如在權(quán)利要求2到7中任一項(xiàng)所述的磷脂。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述磷脂是如權(quán)利要求12到18中任一項(xiàng)所述的藥物組合物的形式。
27.根據(jù)權(quán)利要求24到26任一項(xiàng)所述的方法，其中所述傷口是人或動(dòng)物體內(nèi)表面或外表面上的切口或擦傷。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述動(dòng)物體是哺乳動(dòng)物體。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的方法，其中所述傷口是物理損傷，優(yōu)選所述物理損傷是意外物理損傷或外部手術(shù)物理損傷。
30.根據(jù)權(quán)利要求24到29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述磷脂促進(jìn)間皮細(xì)胞再生。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種磷脂和一種包括通過誘導(dǎo)透明質(zhì)酸分泌用于傷口治療的磷脂的藥物組合物；以及一種治療傷口的方法，包括對傷口施用一種磷脂。
文檔編號(hào)A61P41/00GK101065130SQ200580040786
公開日2007年10月31日 申請日期2005年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者尼克·托普利, 德里克·伍德科克 申請人:大不列顛藥品有限公司