專利名稱：向肝臟定向遞送遺傳物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用氣囊導(dǎo)管向活體的靶器官遞送遺傳物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
基因治療是外來(lái)遺傳物質(zhì)的胞內(nèi)遞送，其校正了存在的缺陷或提供了細(xì)胞新的有益功能。肝臟是基因治療的重要靶器官，因?yàn)槠湓诖x和血清蛋白的生產(chǎn)中的重要作用。存在大量的已知疾病，其中一些疾病由肝臟特異性基因產(chǎn)物的缺陷所引起，其可以從分泌蛋白的肝臟產(chǎn)物中受益。家族性高膽固醇血癥、血友病、Gaucher氏和Fabry氏病正是幾個(gè)例子。許多這樣的疾病可應(yīng)用基因療法(Siatskas等人，J.Inherit Metab.Dis.2001，24(Suppl.2)25-41；Barranger等人，Expert Opin.Biol.Then 2001，1(5)857-867；Barranger等人，Neurochem Res.1999，24(5)601-615)。
已經(jīng)發(fā)展了各種方法來(lái)使用病毒性和非病毒性的載體向肝臟遞送外來(lái)的遺傳物質(zhì)。通常，每個(gè)方法具有確定的缺陷。上述使用病毒性載體遞送遺傳物質(zhì)的嘗試已經(jīng)由于中和宿主免疫應(yīng)答、由于現(xiàn)有的寄主免疫的毒性、需要將大劑量藥物注射到受試者循環(huán)中、在治療期間靶器官內(nèi)的高壓和在體內(nèi)定向特定細(xì)胞類型的困難而復(fù)雜化了。
病毒載體的門(mén)靜脈(Portal injection)注射已經(jīng)成為試圖定向于肝臟的方法。但是，門(mén)靜脈注射存在幾個(gè)問(wèn)題。當(dāng)將腺病毒基因遞送載體注射到大鼠的門(mén)靜脈時(shí)，在肝臟中觀察到高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Rosefeld等人，Science1991，252431-434)，但是這樣的表達(dá)是短暫的，并要求反復(fù)注射。另外，當(dāng)在血清陽(yáng)性的動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)中注射時(shí)，病毒載體可能迅速被預(yù)先存在的抗體所中和。重組腺病毒載體全身(systemic)注射的研究已經(jīng)表明中和宿主免疫應(yīng)答限制了在反復(fù)注射中這種載體的有效性(Yang等人，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.1994，914407-4411；Kozarsky等人，J.Biol.Chem.1994，26913695-13702)。
在其它情況下，病毒載體的全身或門(mén)靜脈注射與劑量依賴型毒性相聯(lián)系。這些毒性既是由于必須注射的相對(duì)大量的病毒，又是由于預(yù)先接觸到普通病毒血清型的環(huán)境而預(yù)先存在的免疫性。因此，期望即限制遞送給受試者的病毒的量，又限制病毒曝露于全身循環(huán)系統(tǒng)以及由此的免疫系統(tǒng)的程度。
對(duì)于病毒全身遞送的基因治療的另一個(gè)挑戰(zhàn)是在靶器官內(nèi)對(duì)于適當(dāng)?shù)募?xì)胞的定向治療。例如，在肝臟中，肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞(包括枯否(氏)細(xì)胞(KupfferCells)及其它抗原-呈遞細(xì)胞)都可能被轉(zhuǎn)染。肝細(xì)胞是極好的蛋白生產(chǎn)細(xì)胞，可以將表達(dá)的蛋白分泌到血清中，并經(jīng)常是功能喪失性缺陷的部位。所以，其想要與非肝細(xì)胞相比，使肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染最大化。但是，對(duì)于全身給藥的病毒基因療法來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞的重要部分是非肝細(xì)胞。
在非肝細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可能是負(fù)的的結(jié)果，例如在抗原-呈遞細(xì)胞中(包括枯否(氏)細(xì)胞、肝竇狀上皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell))。這樣的表達(dá)可以產(chǎn)生針對(duì)該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫響應(yīng)。
已經(jīng)進(jìn)行了上述的嘗試，使用氣囊封閉(balloon occlusion)導(dǎo)管將遺傳物質(zhì)遞送到身體的隔離區(qū)(美國(guó)專利No.5,698,531)。這些方法是針對(duì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染的。本發(fā)明提供了用于將遺傳物質(zhì)遞送到器官的實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的方法。
已經(jīng)描述了另一種使用氣囊導(dǎo)管將遺傳物質(zhì)遞送到靶器官的方法(WO2004/001049)。但是，該方法要求利用在靶器官內(nèi)的高壓。為了足夠地提高壓力，必須注入大量的藥物，并且因?yàn)樯鲜鲈蜻@些較大的劑量可能是不利的。此外，高壓可能冒損害靶器官的危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種通過(guò)靜脈脈管系統(tǒng)將病毒基因治療劑遞送到靶器官的方法，其對(duì)所述靶器官引流。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過(guò)靜脈脈管系統(tǒng)將病毒基因治療劑遞送到靶器官的方法，其對(duì)所述靶器官引流，不明顯增加所述靶器官的所述靜脈脈管系統(tǒng)內(nèi)的壓力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過(guò)靜脈脈管系統(tǒng)將病毒基因治療劑遞送到靶器官的方法，其對(duì)所述靶器官引流，其中所述器官是肝臟，靜脈脈管系統(tǒng)是肝靜脈、肝靜脈分支或下腔靜脈。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種為了表達(dá)由所述病毒基因治療劑編碼的蛋白，將病毒基因治療劑遞送到靶器官的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種為了在肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞中表達(dá)由所述病毒基因治療劑編碼的蛋白，將病毒基因治療劑遞送到肝臟的方法，其中表達(dá)由所述病毒基因治療劑編碼的蛋白的肝細(xì)胞占肝細(xì)胞全體加上表達(dá)由所述病毒基因的編碼蛋白的非肝細(xì)胞的分?jǐn)?shù)是至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8或至少0.9。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種為了表達(dá)由所述病毒基因治療劑編碼的蛋白，將病毒基因治療劑遞送到靶器官的方法，其中將病毒基因治療劑遞送到對(duì)于所述病毒基因治療劑具有預(yù)先存在的免疫性的受試者中。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種使用氣囊導(dǎo)管定向遞送遺傳物質(zhì)的方法。在一種方法中，接近在單個(gè)肝靜脈內(nèi)使用氣囊封閉導(dǎo)管，治療液通過(guò)這樣單個(gè)目標(biāo)肝葉的容器經(jīng)由導(dǎo)管向充氣(阻塞)氣囊的另一邊遞送到肝實(shí)質(zhì)中。遞送的藥物量大到足夠充滿靶器官的靜脈脈管系統(tǒng)，但小到足夠防止靜脈脈管壓力的明顯增加或試劑經(jīng)由側(cè)支循環(huán)(collateral circulation)散布到全身。通過(guò)復(fù)位氣囊來(lái)封閉不同的脈管，在相同操作的期間連續(xù)地治療多個(gè)肝葉。因?yàn)橹委熓歉叨榷ㄎ坏?，所以可以用不同的藥物以相同的操作?lái)治療單個(gè)器官的各種部分，所述不同的藥物可能是不相容的。
在另一種方法中，來(lái)自整體器官的靜脈流出物暫時(shí)被接近和遠(yuǎn)離肝臟靜脈流出物的下腔靜脈內(nèi)的氣囊導(dǎo)管位置所阻塞，并且基因治療劑經(jīng)由充氣(阻塞)氣囊的間隔內(nèi)的血管內(nèi)導(dǎo)管注入。此外，病毒藥物量大到足夠充滿靶器官的脈管系統(tǒng)，但小到足夠防止靜脈脈管壓力的明顯增加或試劑經(jīng)由側(cè)支循環(huán)散布到全身。當(dāng)使用該方法來(lái)向分離的肝臟遞送病毒基因治療劑時(shí)，實(shí)現(xiàn)了非常有效的基因遞送。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法也可以在病毒給藥之前包括一個(gè)“沖洗”步驟。沖洗使用生理學(xué)上適當(dāng)?shù)娜芤海缟睇}水，在病毒給藥之前充滿或部分充滿分離的器官或器官的部分來(lái)減少或除去預(yù)先存在的抗病毒載體的抗體，其否則可能降低基因遞送載體對(duì)于轉(zhuǎn)換或浸染靶細(xì)胞的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)肝臟是靶器官時(shí)，在病毒給藥之前的沖洗步驟可能增加感染的肝細(xì)胞的數(shù)目和比例。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在病毒給藥之前的沖洗步驟增加了在對(duì)于病毒載體給藥預(yù)先存在免疫性的動(dòng)物中感染的肝細(xì)胞的數(shù)目和比例。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括在靶器官中病毒基因治療劑的延長(zhǎng)滯留或停留時(shí)間。延長(zhǎng)停留時(shí)間可能增加在沒(méi)有增加與該瞬時(shí)方法有關(guān)的急性毒性均動(dòng)物中轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞的數(shù)目和比例。
本發(fā)明另外的目的和優(yōu)點(diǎn)將部分地在隨后的說(shuō)明書(shū)中部分地闡明，部分地將從說(shuō)明書(shū)中顯而易見(jiàn)，或可從本發(fā)明的實(shí)施中得到。將依靠尤其在附加權(quán)利要求中所指出的部分和組合來(lái)實(shí)現(xiàn)和獲得本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)。
應(yīng)當(dāng)理解，上述的一般性說(shuō)明及其后的詳細(xì)說(shuō)明都僅僅是示范性的和說(shuō)明性的，并不限制本發(fā)明，如所要求的。
附圖，將其并入本發(fā)明并并構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，闡述了本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案，并與說(shuō)明書(shū)一起起解釋本發(fā)明原理的作用。


圖1圖解了封閉肝靜脈(3)的氣囊導(dǎo)管(4)。導(dǎo)管通過(guò)頸靜脈(5)插入，經(jīng)過(guò)上腔靜脈(1)、心臟(2)，并進(jìn)入肝靜脈(3)內(nèi)。
圖2圖解了在兔子模型中通過(guò)肝靜脈的病毒氣囊導(dǎo)管給藥的熒光斑點(diǎn)影像。虛線表示腔靜脈和四個(gè)主要的肝靜脈?？梢?jiàn)導(dǎo)管向下通過(guò)上腔靜脈進(jìn)入右側(cè)的尾葉內(nèi)，在那里封閉氣球，使造影劑膨脹，阻斷從靜脈中流出?？梢?jiàn)包含造影劑的注射液突出了該葉的靜脈分支(虛線的圈)。僅在病毒注射之前記錄影像，并說(shuō)明選擇的肝靜脈的氣囊介導(dǎo)的封閉的明顯性。
圖3圖解了在肝靜脈內(nèi)氣囊導(dǎo)管(4)的熒光影像(HV區(qū))。在下腔靜脈內(nèi)使第二個(gè)氣囊(6)膨脹(IVC區(qū))。
圖4圖解了用于分離肝臟靜脈排出物的雙氣囊技術(shù)。一個(gè)氣囊(7)經(jīng)由在通過(guò)頸靜脈(5)插入之后的上腔靜脈(1)向肝臟前進(jìn)。第二個(gè)封閉的氣囊(8)通過(guò)下腔靜脈(18)插入。第一個(gè)氣囊(7)封閉了位于肝靜脈(3、10、11)上方的一部分下腔靜脈，第二個(gè)氣囊(8)封閉了位于肝靜脈(3、10、11)下方的一部分下腔靜脈(18)。第三導(dǎo)管(9)用于灌輸藥劑。
圖5圖解了另一個(gè)雙氣囊技術(shù)。氣囊(12、13)用于封閉，管腔可延伸通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)氣囊(12、13)的以便治療劑可以通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)導(dǎo)管頭(14、15)上的孔注入。
圖6圖解了在給藥1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal之后，使用氣囊導(dǎo)管和首次用于Ad2實(shí)驗(yàn)的兔子，β-半乳糖苷酶表達(dá)的分布作為3ml(A、B、C)、8ml(D、E、F)或20ml(G、H、I)的注射量的函數(shù)(function)。由免疫組織化學(xué)處理計(jì)算的表達(dá)用2個(gè)注射的動(dòng)物典型的顯微照片以10X顯示注射的肝葉(肝葉1)和未注射的肝葉(肝葉4)(A、B、D、E、G、H)。細(xì)菌β-半乳糖苷酶在每個(gè)肝葉的3個(gè)核心中的表達(dá)(C、F、&I)如示意圖所示；注射的肝葉用陰影表示。號(hào)碼表示在β-半乳糖苷酶/mg蛋白的相對(duì)光單位的表達(dá)。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，肝葉是有限的。注意注射的肝葉(肝葉1)為如圖2所示的限定的肝葉。
圖7圖解了在對(duì)首次用Ad2實(shí)驗(yàn)的兔子(A、C、E)和用包含抗-Ad2抗體的人類血清被動(dòng)免疫的兔子(B、D、F)，進(jìn)行包含全身給藥8ml量的1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal之后，β-半乳糖苷酶表達(dá)的分布。2-3個(gè)注射的動(dòng)物典型的顯微照片以10X和40X顯示β-半乳糖苷酶在肝葉1中表達(dá)的免疫化學(xué)定位。由ELISA測(cè)定的示意圖顯示了首次用于實(shí)驗(yàn)的(E)和被動(dòng)免疫(F)的兔子的β-半乳糖苷酶表達(dá)的分布(因?yàn)檫@是全身給藥，不可能區(qū)分肺葉)。
圖8圖解了在對(duì)首次用于實(shí)驗(yàn)的兔子(A-E)和對(duì)被動(dòng)免疫Ad2的兔子(F-J)使用氣囊導(dǎo)管和8ml量給藥1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal之后，β-半乳糖苷酶表達(dá)的分布。由免疫組織化學(xué)處理計(jì)算的用3個(gè)注射的兔子典型的顯微照片以10X和40X顯示注射的肝葉(肝葉1；A、C、F、H)和未注射的肝葉的表達(dá)(肝葉4；B、D、G、I)。由ELISA測(cè)定的在每個(gè)肝葉中的表達(dá)如圖所示；注射的肝葉用陰影表示。數(shù)字表示在來(lái)自每一肝葉的3個(gè)組織核心中pgβ-半乳糖苷醜酶/μg蛋白的平均表達(dá)。
圖9定量表示了在遞送根據(jù)本發(fā)明的方法的病毒基因治療劑之后，表達(dá)轉(zhuǎn)基因的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞的數(shù)目。在每個(gè)肝葉的每1mm2區(qū)域上β-半乳糖苷酶陽(yáng)性的肝細(xì)胞(填滿的條)和非肝細(xì)胞(空白的條)數(shù)目的變化量，所述肝葉按照局部(A、B和C)或全身(D和E)以相同量(8ml)遞送相同數(shù)量的病毒(1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal)到首次用于實(shí)驗(yàn)的兔子(A和D)或用包含抗-Ad2抗體的人血清被動(dòng)免疫的兔子(B、C和E)。在(C)中的動(dòng)物注射肝葉在8ml病毒給藥之前立即用20ml的生理鹽水沖洗。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示在每個(gè)給定肝葉中全部β-半乳糖陽(yáng)性細(xì)胞中β-半乳糖陽(yáng)性肝細(xì)胞的分?jǐn)?shù)。肝葉號(hào)數(shù)1和4相應(yīng)于圖6-8中所示的肝葉(A、B、C&E、N＝30塊，D；N＝45塊)。
圖10闡述了在向三只自然首次接受實(shí)驗(yàn)的兔子，使用氣囊導(dǎo)管介導(dǎo)的經(jīng)由局部給藥肝臟的總量8ml 5×1012滴度的AAV2DC 190HAGAL病毒之后人α-半乳糖苷酶在84天內(nèi)的表達(dá)。在全部84天期間，在三只兔子的兩只中發(fā)現(xiàn)表達(dá)，在第三只兔子中在第7天和第14天之間開(kāi)始，直到84天期間的其余天。
圖11A圖解了感染的肝細(xì)胞分?jǐn)?shù)，其為在根據(jù)本發(fā)明的方法用4分鐘的接觸時(shí)間將8ml量的Ad2βgal病毒(1.5×1012vp/kg)的局部的導(dǎo)管介導(dǎo)遞送到首次接受實(shí)驗(yàn)的兔子中，表達(dá)轉(zhuǎn)基因的肝細(xì)胞相對(duì)于表達(dá)轉(zhuǎn)基因的所有細(xì)胞的比例。用兩個(gè)注射的肝葉和一個(gè)未注射的肝葉組成的三部分來(lái)測(cè)定β-半乳糖苷酶陽(yáng)性的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞數(shù)目的變化量。每個(gè)條帶表示一個(gè)肝細(xì)胞部分分析中肝細(xì)胞的分?jǐn)?shù)[轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞/(轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞+轉(zhuǎn)染的非肝細(xì)胞)]。條帶8-20和8-22表示用4分鐘停留時(shí)間處理的兔子，而條帶4、5和1表示根據(jù)在前的實(shí)驗(yàn)使用除停留時(shí)間之外相同的方法，用1分鐘停留時(shí)間處理的兔子。
圖11B圖解了在使用氣囊導(dǎo)管向兔子給藥1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal，并用1)4分鐘的接觸時(shí)間(8-20和8-22)和與在前的實(shí)驗(yàn)其他方面相同條件；2)1分鐘接觸時(shí)間(4、5和1)之后，通過(guò)ELISA測(cè)定的β-半乳糖苷酶表達(dá)的分布。在四個(gè)肝葉、肺、腎和脾中測(cè)定表達(dá)。從每個(gè)測(cè)定表達(dá)的肝葉中取三個(gè)組織核心；它們?cè)诟稳~中近端的、中間的和遠(yuǎn)端的達(dá)到肝葉的入口肝靜脈進(jìn)入靜脈腔之內(nèi)的程度。RCP、RCM、RCD分別指右側(cè)的肝葉(注射的肝葉)，近端、中間和遠(yuǎn)端。RLP、RLM、RLD分別指右側(cè)中間的肝葉，近端、中間和遠(yuǎn)端。MP、MM、MD分別指左側(cè)中間的肝葉，近端、中間和遠(yuǎn)端。LP、LM、LD分別指左側(cè)的肝葉，近端、中間和遠(yuǎn)端。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在詳細(xì)參考本發(fā)明現(xiàn)有的實(shí)施方案，其中的實(shí)例結(jié)合附圖進(jìn)行闡述。只要可能，在提到相同或類似部分的附圖各處使用相同的參考數(shù)字。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施使用分子生物學(xué)(包括重組DNA技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)方法，所述方法都屬于本領(lǐng)域。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分地闡述，例如，分子克隆A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)；分子生物學(xué)中的現(xiàn)有技術(shù)(F.M.Ausubel等人，eds.，1987)；低聚核苷酸合成(MJ.Gait，ed.，1984)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(R.I.Freshney，ed.，1987)；酶學(xué)中的方法(Academic Press，Inc)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(D.M.Wei & CC.Blackwell，eds)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因遞送載體(J.M.Miller& M.P.Calos，eds.，1987)；PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Mullis等人，eds.，1994)；免疫學(xué)中的現(xiàn)有技術(shù)(J.E.Coligan等人，eds.，1991)；抗體實(shí)驗(yàn)指南(E.Harlow和D.Lane eds.(1988))和PCR2應(yīng)用方法(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指引入組織或器官的細(xì)胞中并能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下表達(dá)的多聚核苷酸，或相反地給細(xì)胞帶來(lái)有益特性?；谙胍委煹男Ч麃?lái)選擇轉(zhuǎn)基因。其可編碼例如激素、酶、受體或其它需要的蛋白質(zhì)。其還可以編碼小干擾RNA(siRNA)或反義RNA以便減少或除去內(nèi)源或外源給予基因的表達(dá)。例如，在家族性高膽甾醇血癥的治療中，可使用編碼LDL受體的轉(zhuǎn)基因(Kobayashi等人，J.Biol.Chem.2716852-6860)。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”可互換地以術(shù)語(yǔ)“基因遞送”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”使用，指轉(zhuǎn)基因的胞內(nèi)導(dǎo)入?！稗D(zhuǎn)染效率”指受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所接受的轉(zhuǎn)基因的相對(duì)數(shù)量。實(shí)際上，轉(zhuǎn)染效率是通過(guò)轉(zhuǎn)染之后的報(bào)道基因產(chǎn)物表達(dá)的量來(lái)估算的此處所用的基因遞送、基因傳送等是關(guān)于將外源多聚核苷酸(有時(shí)稱為“轉(zhuǎn)基因”)導(dǎo)入寄主細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)。導(dǎo)入的多聚核苷酸在寄主細(xì)胞中可為穩(wěn)定的或瞬時(shí)的。穩(wěn)定的維持一般要求包含和宿主細(xì)胞相容的復(fù)制原點(diǎn)或整合進(jìn)宿主細(xì)胞的復(fù)制子，例如染色體外的復(fù)制子或核或線粒體染色體中。如現(xiàn)有技術(shù)和此處所描述的，已知一些病毒載體能夠調(diào)節(jié)基因遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
將外來(lái)的多聚核苷酸插入病毒載體中來(lái)經(jīng)由本發(fā)明的方法遞送到寄主中。已知許多病毒載體，包括已經(jīng)為了基因治療目的而研究的每個(gè)的許多種和許多個(gè)。最通常使用的病毒載體包括來(lái)源于腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)和逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒，例如人類免疫缺陷性病毒(HIV)。
術(shù)語(yǔ)“病毒”指能將DNA或RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的試劑，其為必要的活的胞內(nèi)生命體但為非細(xì)胞性質(zhì)，由DNA或RNA和蛋白質(zhì)外殼組成。病毒不包括裸DNA、裸RNA、沒(méi)有蛋白質(zhì)外殼的質(zhì)粒DNA或沒(méi)有蛋白質(zhì)外殼的RNA。適用于本發(fā)明的方法的病毒包括例如腺病毒、腺相關(guān)病毒、甲病毒、桿狀病毒、hepadenaviruses、桿狀病毒、痘病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、正粘液病毒、乳多空病毒、副粘液病毒和細(xì)小病毒。另外，可能用到由任何這些病毒組合的雜種病毒。這些包括腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和質(zhì)粒載體。病毒的典型種包括HSV(單純皰疹病毒)、AAV(腺相關(guān)病毒)、HIV(人類免疫缺陷性病毒)、BIV(牛類免疫缺陷性病毒)和MLV(鼠科的白血病病毒)。
在利用本發(fā)明的方法選擇病毒來(lái)遞送給特定的哺乳動(dòng)物中，特定病毒的特有的血清型可根據(jù)想到要治療的哺乳動(dòng)物來(lái)選擇。血清型是從在這樣的哺乳動(dòng)物中分離的和/或可能對(duì)于治療的特定靶哺乳動(dòng)物的特定靶器官具有增強(qiáng)的趨向性的血清型中被選擇出來(lái)的。
替代地，在利用本發(fā)明的方法來(lái)選擇病毒用于遞送給特定哺乳動(dòng)物中，可選擇在特定種類的哺乳動(dòng)物中不被分離出的血清型。
腺病毒是具有大約36kb的基因組的非包被的、核DNA病毒，其通過(guò)對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究已經(jīng)被很好地表征了(Hurwitz，M.S.，腺病毒病毒學(xué)，第三版，F(xiàn)ields等人，eds.，Raven Press，New York，1996；Hitt，M.M.等人，腺病毒載體，人類基因療法的發(fā)展，F(xiàn)riedman，T.ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York 1999)。根據(jù)病毒蛋白質(zhì)的兩個(gè)暫時(shí)分類的世代，將病毒基因區(qū)分為早期(稱為E1-E4)和晚期(稱為L(zhǎng)1-L5)轉(zhuǎn)錄單元。這些時(shí)期的定界線是病毒DNA復(fù)制?；诎t血球的血凝集作用、致癌性、DNA和蛋白質(zhì)的氨基酸組成和同源性以及抗原性的關(guān)系，人類腺病毒被分成許多血清型(大約47種，因此編號(hào)并分為6組A、B、C、D、E和F)。
重組腺病毒載體具有用于基因運(yùn)載工具的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞的趨向，最小化發(fā)病潛在性，具有復(fù)制到高滴度來(lái)制備載體庫(kù)的能力和傳送大的插入物的潛在性(Berkner，K.L.，Curr.Top.Micro.Immunol.15839-66，1992；Jolly，D.，Cancer Gene Therapy 151-64 1994)。缺失各種腺病毒基因序列的腺病毒載體，例如假腺病毒載體(PAVs)和部分缺失的腺病毒(稱為″DeAd″)，被設(shè)計(jì)成能利用腺病毒的可取的使其成為適當(dāng)?shù)妮d體的特點(diǎn)來(lái)將核苷酸遞送到受體細(xì)胞。
特別地，假腺病毒載體(PAVs)，亦稱“假腺病毒”或小腺病毒載體，是來(lái)源于包含載體基因組復(fù)制和包裝所需要的最小順式作用核苷酸序列，并可包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的腺病毒基因組的腺病毒載體(參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,882,877，其涉及假腺病毒載體(PAV)和用于生產(chǎn)PAV的方法，作為參考并入此處)。PAVs被沒(méi)計(jì)成能利用腺病毒的可取的使其成為基因遞送的適當(dāng)載體的特點(diǎn)。腺病毒載體通?？梢杂蓪?duì)于病毒生長(zhǎng)非必需的缺失區(qū)域攜帶最多8kb大小的插入物，最大承載量可以借助于包含最多病毒編碼序列的缺失的腺病毒載體，包括PAVs來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)Gregory等人的美國(guó)專利No.5,882,877；Kochanek等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935731-5736，1996；Parks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9313565-13570，1996；Lieber等人，J.Virol.708944-8960，1996；Fisher等人，Virology 21711-22，1996；美國(guó)專利No.5,670,488；PCT公開(kāi)號(hào)WO96/33280，1996年10月24日公開(kāi)；PCT公開(kāi)號(hào)WO96/40955，1996年12月19日公開(kāi)；PCT公開(kāi)號(hào)WO97/25446，1997年7月19日公開(kāi)；PCT公開(kāi)號(hào)WO95/29993，1995年11月9日公開(kāi)；PCT公開(kāi)號(hào)WO97/00326，1997年1月3日公開(kāi)；Morral等人，Hum.Gene Ther.102709-2716，1998?？扇菁{達(dá)到大約36kb的外源核酸的這種PAVs是有益的，因?yàn)樵撦d體的承載能力最優(yōu)化的，寄主對(duì)載體或有復(fù)制能力的病毒的世代的免疫應(yīng)答的潛力減小了。PAV載體包含5′顛倒末端重復(fù)(ITR)和包含復(fù)制原點(diǎn)和PAV基因組包裝所需要的順式作用核苷酸序列的3′ITR核苷酸序列，并能容納含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)元件例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因。
另外，部分缺失腺病毒載體提供了部分缺失腺病毒(稱為“DeAd”)載體，其中從載體上刪除了病毒復(fù)制所需要的大部分腺病毒早期基因，并置于在條件啟動(dòng)子控制下的生產(chǎn)細(xì)胞染色體。置于生產(chǎn)細(xì)胞中的可刪除腺病毒基因可包括E1A/E1B、E2、E4(僅ORF6和ORF6/7必須被放入細(xì)胞)、pIX和pIVa2。E3也可以從載體上刪除，但因?yàn)樗皇禽d體生產(chǎn)所需要的，所以可從生產(chǎn)細(xì)胞中省略。通常在主要晚期啟動(dòng)子(MLP)控制下的腺病毒后期基因存在于載體中，但MLP可能被條件啟動(dòng)子所替代。
適合用于PAV或DeAd病毒載體和生產(chǎn)細(xì)胞系的條件啟動(dòng)子包括具有下列特征的啟動(dòng)子在未誘導(dǎo)狀態(tài)下低基礎(chǔ)表達(dá)，以便細(xì)胞毒素或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的腺病毒基因不在對(duì)細(xì)胞有害的水平上表達(dá)；在誘導(dǎo)狀態(tài)下高水平表達(dá)，以便產(chǎn)生足夠數(shù)量的病毒蛋白來(lái)維持載體復(fù)制和裝配。優(yōu)選的適合用于DeAd載體和生產(chǎn)細(xì)胞系的條件啟動(dòng)子包括二聚物聚合基因操縱系統(tǒng)、基于免疫抑制的試劑FK506和雷帕霉素、蛻皮激素基因操縱系統(tǒng)和四環(huán)素基因操縱系統(tǒng)。對(duì)本發(fā)明有用還有Abruzzese等人，Hum.Gene Ther.1999 101499-507所描述的GeneSwitchTM技術(shù)[Valentis，Inc.，Woodlands，TX]，將其所公開(kāi)的內(nèi)容作為參考并入此處。進(jìn)一步在WO99/57296中描述了部分缺失腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，將其所公開(kāi)的內(nèi)容作為參考并入此處。
腺病毒相關(guān)病毒(AAV)是單鏈人類DNA細(xì)小病毒，其基因組具有4.6kb大小。AAV基因組包含兩個(gè)主要基因rep基因，其編碼rep蛋白(Rep76、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因，其編碼AAV的復(fù)制、拯救、轉(zhuǎn)錄和整合，而cap蛋白形成AAV病毒顆粒。
AAV起源于它的依靠腺病毒或其它輔助病毒(例如皰疹病毒)的名稱來(lái)提供重要的基因產(chǎn)物以使AAV進(jìn)行有效感染，即在寄主細(xì)胞中的自然增殖。在沒(méi)有輔助病毒的情況下，AAV作為前病毒整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體中，直到其被用輔助病毒(通常是腺病毒)重復(fù)侵染的宿主細(xì)胞拯救為止(Muzyczka，Curr.Top.Micro.Immunol.15897-127，1992)。
對(duì)AAV作為基因遞送載體發(fā)生興趣是由于它在生物學(xué)上的幾個(gè)獨(dú)特性質(zhì)。在AAV基因組的兩端是被稱為顛倒末端重復(fù)(ITR)的核苷酸序列，其包含病毒復(fù)制、拯救、包裝和整合所需要的順式作用核苷酸序列。在轉(zhuǎn)運(yùn)中由rep蛋白所介導(dǎo)的ITR的整合功能使AAV基因組在沒(méi)有輔助病毒的情況下，在感染之后整合到細(xì)胞染色體中。該病毒的這個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)與AAV在基因遞送中的應(yīng)用相關(guān)，因?yàn)槠湓试S將包含目的基因的重組AAV整合進(jìn)細(xì)胞基因組。所以，對(duì)于基因遞送的許多目標(biāo)來(lái)說(shuō)理想的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化可通過(guò)rAAV載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，AAV的結(jié)合部位已經(jīng)確定，并已經(jīng)定位于人類的19號(hào)染色體上(Kotin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.872211-2215，1990)。結(jié)合部位的可預(yù)測(cè)性減少了隨機(jī)插入到細(xì)胞基因組內(nèi)的危險(xiǎn)，所述隨機(jī)插入可能活化或鈍化宿主基因或斷開(kāi)編碼序列，結(jié)果能限制AAV整合載體的使用，所以，對(duì)于基因遞送的許多目標(biāo)來(lái)說(shuō)理想的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化可通過(guò)rAAV載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，AAV的結(jié)合部位已經(jīng)確定，并已經(jīng)定位于人類的19號(hào)染色體上(Kotin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.872211-2215，1990)。結(jié)合部位的可預(yù)測(cè)性減少了隨機(jī)插入到細(xì)胞基因組內(nèi)的危險(xiǎn)，所述隨機(jī)插入可能活化或鈍化宿主基因或斷開(kāi)編碼序列，結(jié)果能限制AAV整合載體的使用，設(shè)計(jì)rAAV載體的該基因的去除可導(dǎo)致改變的整合模式，其在rAAV載體中被觀察到(Ponnazhagan等人，Hum Gene Ther.8275-284，1997)。
將AAV用于基因遞送還存在其它的好處。AAV的寄主范圍很寬。而且，與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，AAV可感染靜態(tài)的和分裂的細(xì)胞。另外，AAV與人類疾病無(wú)關(guān)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生基因遞送載體所帶來(lái)的許多擔(dān)心。
產(chǎn)生重組rAAV載體的標(biāo)準(zhǔn)方法要求一系列胞內(nèi)事件的協(xié)調(diào)用包含由AAV ITR序列位于側(cè)面的目的轉(zhuǎn)基因的rAAV載體基因組來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，由編碼轉(zhuǎn)運(yùn)中所需AAV rep和cap蛋白的基因的質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，以及用提供轉(zhuǎn)運(yùn)中所需非AAV輔助功能的輔助病毒來(lái)感染轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Muzyczka，N.，Curr.Top.Micro.Immunol.15897-129，1992)。腺病毒(或其它輔助病毒)蛋白活化AAV rep基因的轉(zhuǎn)錄，然后rep蛋白活化AAV cap基因的轉(zhuǎn)錄。然后cap蛋白利用ITR序列來(lái)將rAAV基因組包裝入rAAV顆粒中。所以，包裝的效率部分地由足夠量的結(jié)構(gòu)蛋白的可用性和在rAAV載體基因組中所需的所有順式作用包裝序列的可及性所決定。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是基因遞送的通用工具(Miller，Nature(1992)357455-460)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將未重排的單拷貝基因遞送入大量嚙齒類、靈長(zhǎng)類和人類體細(xì)胞中的能力使其很適合向細(xì)胞遞送基因。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，其中病毒基因組是RNA。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，基因組RNA反向轉(zhuǎn)錄到DNA中間體內(nèi)，所述DNA中間體非常高效地整合入感染細(xì)胞的染色體DNA中。該整合的DNA中間體被認(rèn)為是一種前病毒。前病毒的轉(zhuǎn)錄和裝配到有感染力的病毒中發(fā)生在存在適當(dāng)?shù)妮o助病毒或在包含在沒(méi)有同時(shí)產(chǎn)生污染的輔助病毒的條件下使包裝能夠進(jìn)行的適當(dāng)序列的細(xì)胞系的情況下。如果用于包裝的序列是由用適當(dāng)載體共轉(zhuǎn)染所提供的，則輔助病毒不是生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒所需的。
逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組和前病毒DNA具有三個(gè)基因gag、pol和env，在其側(cè)面有兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列。gag基因編碼固有的結(jié)構(gòu)(基質(zhì)、衣殼和核衣殼)蛋白；pol基因編碼RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)并且env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5′和3′LTR用于促進(jìn)病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和多腺苷酸化。LTR包含病毒復(fù)制所必需的全部其它順式作用序列。慢病毒具有包括vit、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)的附加基因。鄰近5′LTR的是基因組逆轉(zhuǎn)錄所必需的序列(tRNA引物結(jié)合位點(diǎn))和用于將病毒RNA有效殼體化到顆粒所必需的序列(Psi位點(diǎn))。如果殼體化(或逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA包裝到感染性病毒顆粒內(nèi))所必需的序列從病毒基因組中缺失，則導(dǎo)致妨礙基因組RNA殼體化的順式缺陷。但是，產(chǎn)生的突變體仍能指導(dǎo)所有病毒顆粒蛋白的合成。
慢病毒是復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，除了通用的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因gag、pol和env之外，其包含其它具有調(diào)節(jié)或結(jié)構(gòu)上的功能的基因。高度的復(fù)雜性使慢病毒能夠在潛伏感染期間調(diào)節(jié)其生活周期。典型的慢病毒是人類免疫缺陷性病毒(HIV)，AIDS的病原。在體內(nèi)，HIV可以感染極少分裂的末端分化細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在體外，HIV可感染單核細(xì)胞起源的巨噬細(xì)胞(MDM)的原代培養(yǎng)物以及用阿非迪霉素或γ射線照射處理的細(xì)胞周期停止的HeLa-Cd4或T淋巴樣細(xì)胞。細(xì)胞的感染取決于通過(guò)靶細(xì)胞核孔的HIVpreintegrate復(fù)合物活化的核輸入。這是通過(guò)靶細(xì)胞的核輸入結(jié)構(gòu)與復(fù)合物中多重、部分多余、分子的決定子相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。鑒定決定子包括gag基質(zhì)(MA)蛋白中的有功能的核定位信號(hào)(NLS)、karyophilic病毒顆粒相關(guān)蛋白、vpr和gag MA蛋白的C-末端磷酸酪氨酸殘基。例如美國(guó)專利6,013,516和美國(guó)專利5,994,136中描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因治療中的應(yīng)用，其所公開(kāi)的內(nèi)容因此并入此處作為參考。
關(guān)于適用于本發(fā)明的方法的病毒的附加信息可以在許多病毒學(xué)教科書(shū)中找到(Friedman，Theodore；The Development of Human Gene Therapy，Cold Sprng Harbor Laboratory Press，1998)。
本發(fā)明的方法所使用的病毒載體包含表達(dá)盒，其含有調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，可操作地與選擇的轉(zhuǎn)基因相連。用于選擇的病毒載體中的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)控元件包含啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件的組合，優(yōu)選其能在肝臟中指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，例如在PCT US 00/31444中所描述的，其公開(kāi)的內(nèi)容作為參考并入此處。其也包含組成型的或高表達(dá)啟動(dòng)子和一個(gè)或多個(gè)肝臟特異性增強(qiáng)子元件的組合。
強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可選自由以下啟動(dòng)子組成的組CMV啟動(dòng)子、截短的CMV啟動(dòng)子、人血清白蛋白啟動(dòng)子和α-1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子。在其它的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是截短的CMV啟動(dòng)子，其對(duì)于已知的翻譯阻遏子的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)被刪除了。肝臟特有的增強(qiáng)子元件可選自由以下增強(qiáng)子組成的組人血清白蛋白(HSA)增強(qiáng)子、人凝血酶原(HPrT)增強(qiáng)子、α-1-微球蛋白增強(qiáng)子和intronic醛縮酶增強(qiáng)子。一個(gè)或多個(gè)這些肝臟特有的增強(qiáng)子元件可與啟動(dòng)子組合使用。在表達(dá)盒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)HSA增強(qiáng)子與選自由CMV啟動(dòng)子或HSA啟動(dòng)子組成的組的啟動(dòng)子組合使用。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)選自由人凝血酶原(HPrT)增強(qiáng)子和α-1-微球蛋白(A1MB)增強(qiáng)子組成的組的增強(qiáng)子與CMV啟動(dòng)子組合使用。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，增強(qiáng)子元件選自由HPrT增強(qiáng)子和A1MB增強(qiáng)子組成的組，并與α-1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子組合使用。
本發(fā)明提供了一種將病毒基因治療的試劑遞送到哺乳動(dòng)物受試者選擇的器官，以便表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白的方法。本方法包括以下步驟在引流器官或器官的部分的靜脈脈管系統(tǒng)內(nèi)放置一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管；至少一個(gè)導(dǎo)管具有一個(gè)或多個(gè)膨脹的可擴(kuò)大的構(gòu)件；在通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)膨脹的可擴(kuò)大的構(gòu)件膨脹來(lái)在引流器官或器官的部分的靜脈脈管系統(tǒng)內(nèi)通過(guò)封閉液體的流動(dòng)來(lái)分離器官或器官的部分；在分離的器官或器官的分離的部分中用導(dǎo)致靜脈脈管壓力與正常靜脈壓相比升高不超過(guò)40％的量來(lái)遞送病毒基因治療劑；并使基因治療劑在脈管系統(tǒng)的離體部分內(nèi)保留一段足夠的時(shí)間以使治療上有效量的試劑來(lái)轉(zhuǎn)染。該方法也選擇性地包含在遞送病毒基因治療劑之前沖洗靜脈脈管系統(tǒng)來(lái)去除抗病毒抗體的步驟。
在本發(fā)明的方法中，將病毒基因治療劑以足以充滿引流分離的器官或器官的分離的部分的靜脈脈管系統(tǒng)的量來(lái)遞送，而不將在所述靜脈脈管系統(tǒng)內(nèi)的壓力提高到明顯高于該分離的器官或器官的分離的部分的正常靜脈壓。至于肝臟，在分離的器官或器官的分離的部分內(nèi)正常靜脈壓按楔形肝臟靜脈壓(WHVP)來(lái)調(diào)節(jié)。通過(guò)將氣囊導(dǎo)管插入到肝靜脈中，并膨脹氣囊導(dǎo)管來(lái)封閉肝臟靜脈來(lái)測(cè)定WHVP。在封閉的靜脈中的壓力是由在氣囊導(dǎo)管頂部尖端的壓力傳感器來(lái)測(cè)定的，并且該測(cè)得壓力等于WHVP。人類受試驗(yàn)者中WHVP的典型值是40到140mm生理鹽水。較高值可能存在于肝病、脈管病或心臟病的患者。
在本發(fā)明的方法中，將病毒基因治療劑遞送到引流分離的器官或器官的分離的部分的靜脈脈管系統(tǒng)中。對(duì)于遞送到整個(gè)器官，其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，引流器官的靜脈脈系統(tǒng)顯然是指引流整個(gè)器官的靜脈脈管系統(tǒng)。對(duì)于肝臟，引流肝臟的靜脈脈管系統(tǒng)是指肝靜脈、右或左肝靜脈、小葉下靜脈、中央靜脈和竇狀隙。門(mén)靜脈不被認(rèn)為是引流肝臟的靜脈脈管系統(tǒng)的一部分。此外，對(duì)于肝臟，根據(jù)本發(fā)明的方法，引流器官的靜脈脈管系統(tǒng)的一部分可能是封閉的來(lái)分隔出器官的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到根據(jù)本發(fā)明的方法引流器官和分離器官的部分的靜脈脈管系統(tǒng)的部分，可能通過(guò)用一個(gè)導(dǎo)管注入射線照片造影劑來(lái)進(jìn)行鑒定，所述導(dǎo)管用于遞送病毒治療試劑。通過(guò)注入等于可用于相同的分離的器官或器官的分離的部分的病毒治療劑的量的造影劑，離體部分將通過(guò)熒光鏡透視檢查來(lái)識(shí)別。對(duì)于肝臟，注入到封閉肝靜脈或肝靜脈的封閉部分的造影劑將在熒光檢查下顯示將被分隔的肝臟部分。
對(duì)于本發(fā)明的目的，當(dāng)注入到分離的器官或器官的分離的部分時(shí)，可選擇導(dǎo)致分離的器官或器官的分離的部分的靜脈壓與分離的器官或器官的分離的部分的正常靜脈壓相比升高10％、20％、30％或40％的注射量。再對(duì)于肝臟，引流肝臟的靜脈脈管系統(tǒng)的正常靜脈壓是由WHVP來(lái)調(diào)控的。對(duì)于100mm生理鹽水的WHVP，選擇的注射量導(dǎo)致WHVP升高到不超過(guò)10mm生理鹽水(0.75mm Hg)、不超過(guò)20mm生理鹽水(1.5mm Hg)、不超過(guò)30mm生理鹽水(2.25mm Hg)或不超過(guò)40mm生理鹽水(3.0mm Hg)?？蛇x擇注射量等于治療的靶器官或靶器官部分的量的1-5％、5-10％、10-20％、20-30％或30-40％。
在本發(fā)明的方法中，可將病毒基因治療劑遞送給對(duì)于病毒預(yù)先存在免疫性的哺乳動(dòng)物受試者，例如人類?？赏ㄟ^(guò)受試者的血清中病毒治療劑的一部分的抗體的存在或通過(guò)識(shí)別對(duì)于病毒基因治療劑的細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)辨別預(yù)先存在的免疫性?？贵w可能直接對(duì)應(yīng)于病毒上或其內(nèi)部包含的蛋白，或?qū)?yīng)于在病毒內(nèi)包含的DNA或RNA。用于在受試者的血清中鑒定抗體的各種方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫試驗(yàn)(RIA)或凝集試驗(yàn)。鑒定細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法包括混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)淋巴細(xì)胞溶解試驗(yàn)。用于識(shí)別抗體或測(cè)定細(xì)胞免疫反應(yīng)的這些方法在一般的免疫學(xué)教科書(shū)中進(jìn)行了描述(Kuby，Janis；Immunology，3rdEdition，1997；Roitt等人，Immunology，6thed.，2001，Mosby)。
在本發(fā)明的方法中，將病毒基因治療劑遞送到引流器官或器官的部分的分離靜脈脈管系統(tǒng)中以便在器官的靶細(xì)胞中表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。因?yàn)槠鞴偈怯筛鞣N細(xì)胞類型組成的，所以該發(fā)明提供了使在靶實(shí)質(zhì)細(xì)胞中與在非靶細(xì)胞中表達(dá)的比例達(dá)到最大值的方法。表達(dá)病毒編碼蛋白的細(xì)胞被定義為已經(jīng)被本發(fā)明的方法的病毒治療劑所感染，并隨后產(chǎn)生由病毒治療劑編碼的蛋白的那些細(xì)胞。
對(duì)于肝臟，靶實(shí)質(zhì)細(xì)胞是肝細(xì)胞，非靶細(xì)胞是非肝細(xì)胞。非肝細(xì)胞包括脈管內(nèi)皮細(xì)胞、枯否(氏)細(xì)胞和支持的基質(zhì)細(xì)胞。因此，在本發(fā)明的方法中，表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白的肝細(xì)胞與表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白的非肝細(xì)胞的比例將被最大化。該比例可能是至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8或至少0.9。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用小量的病毒基因治療劑轉(zhuǎn)染單個(gè)肝葉。將氣囊封閉的導(dǎo)管(4)通過(guò)頸靜脈(5)插入，經(jīng)由上腔靜脈(1)前進(jìn)，并進(jìn)入想要到達(dá)的肝靜脈(3)，如圖1所示。在血管內(nèi)經(jīng)導(dǎo)管注射轉(zhuǎn)染因子之前短時(shí)間內(nèi)，將導(dǎo)管上的氣囊(17)膨脹來(lái)阻擋靜脈流出物，從而將注入的溶液限定在進(jìn)入分離的靶肝葉的實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到通過(guò)使用經(jīng)由除了頸部靜脈的許多解剖學(xué)部位的靜脈脈管系統(tǒng)可以實(shí)行相同的方法。例如，也可使用股靜脈。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染單個(gè)肝葉。氣囊封閉(4)導(dǎo)管被放置在所選擇的肝臟靜脈的腔管內(nèi)。第二封閉氣囊(6)位于下腔靜脈的肝臟部分來(lái)阻擋肝臟的靜脈流出物，如圖3所示。在轉(zhuǎn)染因子經(jīng)導(dǎo)管注射之前，氣囊(4、6)在下腔靜脈和肝靜脈之內(nèi)膨脹來(lái)阻擋靜脈流出物，從而將注入的溶液限制在進(jìn)入分離的靶肝葉的實(shí)質(zhì)細(xì)胞中。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，以單次注射將轉(zhuǎn)染因子遞送到整個(gè)肝臟。如圖4所示，通過(guò)使用在下腔靜脈(18)中膨脹的兩個(gè)分離的雙內(nèi)腔氣囊導(dǎo)管(7、8)，在上腔和下腔(阻擋)肝臟靜脈流出物來(lái)分離肝臟。然后將轉(zhuǎn)染劑經(jīng)由位于氣囊之間的血管內(nèi)的導(dǎo)管(9)注入，并經(jīng)肝靜脈以逆行的方式流入整個(gè)肝實(shí)質(zhì)中。如圖4所示，血管內(nèi)的導(dǎo)管(9)可與氣囊封閉導(dǎo)管(15)之一相結(jié)合，降低必須配置的導(dǎo)管的數(shù)目。在本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，將氣囊調(diào)整到每個(gè)患者脈管的大小以保證在過(guò)程中防止損傷靶器官脈管流出物的堵塞。本發(fā)明的方法包括在基因治療的過(guò)程中病毒基因治療劑的應(yīng)用，但是，該方法同樣適用于化學(xué)療法或其它藥物因子、干細(xì)胞或圖象照影物質(zhì)的治療劑注射，其要求診斷或治療的溶液在可控壓力下定向遞送到分離的器官中。
本發(fā)明的方法也可包括在病毒給藥之前的一個(gè)“沖洗”步驟。沖洗使用生理學(xué)上適當(dāng)?shù)娜芤海缟睇}水，來(lái)在病毒給藥之前充滿或部分地充滿分離的器官或器官的部分。對(duì)于理論沒(méi)有限制地，沖洗溶液稀釋了器官的血液和生理性液體以致使流體組分和病毒之間的潛在的相互作用減到最低程度。通過(guò)將這些相互作用減到最低程度，增加了整個(gè)器官的轉(zhuǎn)染。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)肝臟是靶器官時(shí)，在病毒給藥之前的沖洗步驟可以增加轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞的數(shù)目和比例。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在病毒給藥之前的沖洗步驟增加了在對(duì)于給藥的病毒載體具有預(yù)先存在的免疫性的動(dòng)物中轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞的數(shù)目和比例。
本發(fā)明的方法也可包括病毒基因治療劑的停留時(shí)間的變化。停留時(shí)間是在把病毒基因治療劑注入到靶器官之后和在封閉氣囊放氣之前的時(shí)間從而恢復(fù)了通過(guò)靶器官的正常血流。停留時(shí)間可為最小限度的，其中注入病毒基因治療劑然后立即恢復(fù)。停留時(shí)間可被延長(zhǎng)，其中允許病毒基因治療劑在靶器官內(nèi)停留一段時(shí)間，而不會(huì)使與該方法有關(guān)的急性毒性增加到超過(guò)2等毒性。這段時(shí)間取決于在事件中的特定靶器官，并可能由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。延長(zhǎng)的停留時(shí)間可能是至少兩分鐘、至少三分鐘、至少四分鐘、至少五分鐘或更長(zhǎng)。能夠具有停留時(shí)間是本發(fā)明的一個(gè)特色，其可能是由于遞送過(guò)程的逆行性。因?yàn)樵摲椒ń?jīng)由逆行流動(dòng)遞送載體，所以靶器官可能被封閉以便允許病毒與器官組織保持經(jīng)常的聯(lián)系。對(duì)于在現(xiàn)有技術(shù)中使用的順行遞送方法，這樣的停留時(shí)間通常是不可能的。在這些順行方法中，正常血流不可能被安全地封閉。
也可在病毒基因治療載體給藥之前或伴隨給藥來(lái)給予動(dòng)物免疫抑制試劑，以便最小化或減少對(duì)于，例如，病毒載體或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)的可能性。例如，試劑可能用于抑制細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，其可識(shí)別任何表達(dá)的病毒殼體蛋白，并因此可以除去轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在器官移植領(lǐng)域通常使用的免疫抑制試劑很可能是適合于與本方法結(jié)合使用的免疫抑制試劑。這樣的試劑可單獨(dú)使用或與其它這樣的試劑結(jié)合使用。這些免疫抑制試劑可包括被用來(lái)誘導(dǎo)和/或被用來(lái)維持的試劑。典型的試劑包括環(huán)孢霉素(Neoral，Sandimmune)，強(qiáng)的松(Novo Prednisone，Apo Prednisone)，硫唑嘌呤(Imuran)，他克莫司或FK506(Prograf)，麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolatemofetil)(CellCept)，西羅莫司(sirolimus)(Rapamune)，OKT3(Muromorab CO3，Orthoclone)，ATGAM & Thymoglobulin。但是，可使用實(shí)現(xiàn)免疫抑制的任何臨床上批準(zhǔn)的試劑。在現(xiàn)有技術(shù)中通常應(yīng)用有效的免疫抑制劑方案。因此，適當(dāng)?shù)姆桨负蛣┝咳Q于在事件中的特定靶器官，并可能由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
本發(fā)明的方法也可包括各種特定的實(shí)施方案的組合。例如，在病毒遞送之前器官的沖洗可與延長(zhǎng)的保留時(shí)間組合應(yīng)用?；蛘咴诓《具f送之前器官的沖洗可與免疫抑制方案組合應(yīng)用?；蛘咴诓《具f送之前器官的沖洗可與選擇的對(duì)于治療的哺乳動(dòng)物具有增強(qiáng)的定向的血清型的應(yīng)用相組合?；蛘咴诓《具f送之前器官的沖洗可與延長(zhǎng)的保留時(shí)間和免疫抑制方案組合應(yīng)用。所述的例子是用來(lái)說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。
編碼當(dāng)存在于靶器官或者當(dāng)分泌到血流中時(shí)有用的分子的轉(zhuǎn)基因適合用于本方法。這樣的分子可包括蛋白和激素。典型的蛋白包括下列的溶酶體存儲(chǔ)病癥缺陷蛋白表1


*包含CNS其它的典型蛋白是治療哺乳動(dòng)物，包括人類中的其它疾病例如阿爾茨海默氏病的蛋白。在這樣的方法中，轉(zhuǎn)基因編碼metalloendopeptidase。metalloendopeptidase可以是，例如淀粉狀-β降解酶neprilysin(EC3.4.24.11；序列登錄號(hào)，例如P08473(SWISS-PROT))、胰島素-降解酶insulysin(EC 3.4.24.56；序列登錄號(hào)，例如P14735(SWISS-PROT))或甲拌磷寡肽酶(EC 3.4.24.15；序列登錄號(hào)，例如P52888(SWISS-PROT))。
另外，該轉(zhuǎn)基因可編碼選自由胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、鈣結(jié)合蛋白D28、細(xì)小白蛋白、HIF1-α、SIRT-2、VEGF、SMN-1、SMN-2、GDNF和CNTF(睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子)。這樣的蛋白可能適合于利用經(jīng)過(guò)隨著分泌到血流中的調(diào)節(jié)作用的該方法來(lái)治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。ALS是累進(jìn)的、致死性神經(jīng)肌肉的疾病，其與脊椎和腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的退化有關(guān)。該疾病的發(fā)展可以導(dǎo)致肢體、中軸和呼吸肌的退化。在小鼠和大鼠中超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因突變體的過(guò)表達(dá)概括了人類中ALS的臨床和病理學(xué)的特征。在該模型中在延遲癥狀中的化合物活性已經(jīng)被證明了其對(duì)于ALS患者所預(yù)測(cè)的臨床功效，因此是該疾病的治療上的相應(yīng)模型。以前已經(jīng)描述了這樣的小鼠模型Tu等人(1996)P.N.A.S.933155-3160；Kaspar等人(2003)Science 301839-842；Roaul等人(2005)Nat.Med.11(4)423-428和Ralph等人(2005)Nat.Med.11(4)429-433。
在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因可能編碼血友病缺陷蛋白，例如因子VIII或因子IX。所述的例子是用來(lái)說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。
下列典型的例子是用來(lái)說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。典型的方法在兔子中施行，其也可以在其它哺乳動(dòng)物例如非人靈長(zhǎng)類和人類受試者中以臨床上可行的參數(shù)來(lái)成功地施行。
實(shí)施例1導(dǎo)管介導(dǎo)的腺病毒基因治療載體向兔子肝臟遞送對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，都使用每個(gè)大約4千克重量的新西蘭白兔(Millbrook農(nóng)場(chǎng)，Amherst，MA)。使用的腺病毒載體Ad2βgal具有血清型2的骨架，并刪除了E1，但保留了E3和E4區(qū)。表達(dá)盒由巨細(xì)胞病毒(CMV)近早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、核定位β-半乳糖苷酶的cDNA和SV40多腺苷酸信號(hào)組成(Armentano，D.等人(1997).J.Virol.712408-2416)。給每個(gè)兔子注射1.5×1012病毒顆粒/千克(顆?！糜懈腥玖Φ膯挝恢龋?0∶1)的Ad2βgal病毒。
如下利用本發(fā)明的方法的實(shí)施方案將腺病毒基因治療載體遞送到兔子的肝臟中。為了進(jìn)入兔子的血管系統(tǒng)，通過(guò)從下頜弓開(kāi)始并延伸到尾部的中線切口，隨后以鈍器解剖暴露于右側(cè)的頸外靜脈的肌肉組織來(lái)暴露頸靜脈。將血管導(dǎo)管注射針插入暴露的頸靜脈中，并將導(dǎo)線插入注射針中。在熒光檢查的指導(dǎo)下，導(dǎo)線通過(guò)上腔靜脈和心臟前進(jìn)，并進(jìn)入到肝臟靜脈循環(huán)中。除去血管導(dǎo)管注射針，將氣囊封閉導(dǎo)管置于導(dǎo)線之上，并插入到頸靜脈中。在熒光檢查的指導(dǎo)下，導(dǎo)管沿導(dǎo)線前進(jìn)到肝靜脈。去除導(dǎo)線，并注入少量的含有非離子造影劑的生理鹽水來(lái)證實(shí)適當(dāng)導(dǎo)管的定位。然后用造影劑使封閉氣球膨脹，再一次通過(guò)注射小量對(duì)照介質(zhì)來(lái)確定其位置。在肝靜脈內(nèi)封閉氣囊的膨脹阻塞了引流肝臟右葉的肝靜脈，如圖1所示。然后將病毒溶液按大約1ml/秒的速率逆行注入到選擇的肝葉中，隨后注射小量(1ml)的PBS來(lái)將保留在導(dǎo)管系統(tǒng)中的任何病毒洗到肝葉中。允許病毒在組織中停留大約一分鐘，在此期間防止其回流到注射管中。根據(jù)停留時(shí)間，由注射器回吸，按與注射速率近似相等的速率回收代表注射量的體積。然后將封閉氣囊放氣，并去除導(dǎo)管。實(shí)現(xiàn)止血。并使用適當(dāng)?shù)牟牧祥]合切口。
使用上述的遞送方法，在兔子中計(jì)算了包含相同總數(shù)的病毒顆粒(1.5×1012病毒顆粒/千克的Ad2β半乳糖苷酶載體)的幾個(gè)劑量(3、8和20ml)來(lái)測(cè)定在每個(gè)劑量中由腺病毒載體介導(dǎo)的相關(guān)肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。通常的兔子肝葉估計(jì)大約是20g，其用來(lái)設(shè)置了對(duì)于病毒制劑的遞送量20ml的上限。預(yù)期該上限能將病毒制劑分散到遍及注射的肝葉。根據(jù)該假設(shè)，也選擇小量的3ml和8ml來(lái)達(dá)到病毒制劑在注射的肝葉中的不完全分布。三天后處理之后，殺死兔子。測(cè)定β-半乳糖苷酶在肝臟、腎、肺和脾中的表達(dá)。
表達(dá)的特點(diǎn)在于使用AMPGD(β-半乳糖苷酶的chemiluminogenic底物，3-{4-Methoxyspiro[1，2-dioxetane-3，29-三環(huán)(3.3.1.13，7癸醛]苯基β-D吡喃半乳糖苷(galactopyranoside))使用基于熒光的試驗(yàn)來(lái)獲得相對(duì)表達(dá)水平。在熒光試驗(yàn)中，使用Janke和Kunkel Ultra-Turrax T25均質(zhì)器將100到200mg的組織勻化在2X量的1X溶解緩沖液(Tropix Galacto-Light PlusKit，Tropix)中。勻漿物經(jīng)過(guò)兩輪凍融，隨后在48℃水浴中熱失活內(nèi)源的β-半乳糖苷酶1小時(shí)。將樣品在4℃下以14,000rpm離心10min，并將上清液遞送到干凈的1.5ml Eppendorf試管。使用Micro BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度，并使用BioRad EIA底片讀取器來(lái)讀取在570nm處的吸光度。使用Tropix Galacto-Light Plus Kit通過(guò)廠家的說(shuō)明書(shū)來(lái)測(cè)定每個(gè)樣品的β-半乳糖苷酶活性，并使用Tropix TR717微板光度計(jì)和WinGlow軟件讀取。
組織樣品的免疫組織化學(xué)處理通常如下進(jìn)行。將組織的四毫米切片在福爾馬林-鋅溶液中過(guò)夜固定，在PBS中漂清，嵌入石蠟中并切片。在Hemo-D，100％、95％、70％和50％的乙醇，重蒸餾水和PBS中逐次清洗來(lái)對(duì)切片去蠟(deparaffinize)。用3％過(guò)氧化氫的甲醇溶液除去內(nèi)源的過(guò)氧化物活性，然后在水中再水合。在含5％羊血清的PBS中的封閉切面。切片與鼠抗-β-半乳糖苷酶一起在4℃下孵化過(guò)夜，在PBS中沖洗兩次，然后在37℃下與親合純化的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG一起孵化一小時(shí)，然后在PBS中沖洗兩次，在pH7.5的0.5mMTris-HCl中沖洗一次。使用液體DAB底物-色原體系(DAKO)通過(guò)廠家的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)過(guò)氧化物酶標(biāo)記，然后將切片甲基綠復(fù)染色。
表達(dá)β半乳糖苷酶的細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定通常如下進(jìn)行。使用MetaMorph軟件來(lái)鑒別和測(cè)定被Ad2β-gal感染的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞的細(xì)胞核。β-半乳糖苷酶的免疫組織化學(xué)處理檢測(cè)的顯色時(shí)間對(duì)于確保與被感染細(xì)胞的MetaMorph檢測(cè)相容來(lái)說(shuō)是保持不變的。將每個(gè)肝臟部分掃描進(jìn)Metamorph，并從每個(gè)肝臟部分挑選五個(gè)區(qū)域(每個(gè)1mm2)來(lái)進(jìn)行MetaMorph分析。使用顏色定閾值來(lái)辨別代表陽(yáng)性β-半乳糖苷酶細(xì)胞核的褐色DAB(3，3′-二氨基聯(lián)苯胺)信號(hào)與非感染細(xì)胞的藍(lán)綠色細(xì)胞核。顏色定閾值和所有后面的MetaMorph分類都通過(guò)從樣品肝臟部分的細(xì)胞核的初步經(jīng)驗(yàn)分析所優(yōu)化，隨后由人確認(rèn)每個(gè)分類。
為了將細(xì)胞核分成肝細(xì)胞、非肝細(xì)胞或未知對(duì)象，使用MetaMorph來(lái)測(cè)定所有β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞核的“總面積”和“橢圓的形狀因子”?？偯娣e(TA)定義為滿足顏色閥值的給定β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞核的所有鄰近的像素的總和。橢圓的形狀因子(EFF)定義為給定β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞核的長(zhǎng)度除以其寬度。例如，完美的圓形的EFF是1.0，而橢圓的EFF通常大于1.25。
單一肝細(xì)胞的細(xì)胞核是大致的球形，產(chǎn)生EFF≤1.25和TA＝16-18的像素。雙倍肝細(xì)胞的細(xì)胞核表現(xiàn)為兩個(gè)間距小的球形，其(組織結(jié)構(gòu)上地)histologically不能被MetaMorph分析，并且所產(chǎn)生的EFF通常大于1.5，具有TA＞18的像素。β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞核的非肝細(xì)胞主要來(lái)源于肝臟巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)和內(nèi)皮細(xì)胞，并產(chǎn)生EFF＞1.25和TA＞6并且≤18。
由于在截面內(nèi)給定細(xì)胞核的定位與定向，一些β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞核被分類為未知對(duì)象因?yàn)槠洳荒芫_地被區(qū)分為肝細(xì)胞或非肝細(xì)胞。未知對(duì)象被認(rèn)為代表按其各自群體比例的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞，并不包括任何數(shù)量上的分析。未知受試者具有TA等于1但是≤6，和EFF為任意值，或TA＞6但是＜16并且EFF≤1.25。收集從兔子肝臟的四個(gè)主要葉的每個(gè)葉的近端、中間和遠(yuǎn)端的部分的五個(gè)區(qū)域(每個(gè)1mm2)，用于MetaMorph分析。
在用3ml藥劑注射來(lái)治療的兔子中，在注射的肝葉中β-半乳糖苷酶的表達(dá)是在20-300×106RLU/mg組織的范圍內(nèi)，其具有相對(duì)于注射部位遠(yuǎn)端的更多的表達(dá)。在未注射肝葉的表達(dá)的范圍為1-12×106RLU/mg組織的范圍內(nèi)，其不符合近端-遠(yuǎn)端表達(dá)模式。在腎、肺和脾中的表達(dá)基本上是不可探測(cè)的，在注射的肝葉中的β-半乳糖苷酶表達(dá)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位表示表達(dá)的細(xì)胞組織分布主要限于圍繞中央靜脈的區(qū)域，其是病毒制劑的遞送路線。主要限于圍繞中央靜脈的區(qū)域，其是病毒制劑的遞送路線。大多數(shù)的表達(dá)細(xì)胞是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在非注射的肝葉中，β-半乳糖苷酶表達(dá)細(xì)胞是免疫定位主要地圍繞肝門(mén)三聯(lián)征的區(qū)域。
在用8ml制劑注射治療的兔子的肝臟中β-半乳糖苷酶的表達(dá)明顯地高于由3ml制劑注射得到的表達(dá)。在注射的肝葉中β-半乳糖苷酶的表達(dá)是在300-600×106RLU/mg組織的范圍內(nèi)，而在非注射的肝葉中的表達(dá)是在100-300×106RLU/mg組織的范圍內(nèi)。如用3ml注射劑量所示，在注射的肝葉的相對(duì)于注射位點(diǎn)的近端到遠(yuǎn)端方向的表達(dá)增加。在非注射的肝葉中，不符合近端-遠(yuǎn)端表達(dá)模式。在腎、肺和脾中的表達(dá)基本上是不可探測(cè)的，在注射的肝葉中的β-半乳糖苷酶表達(dá)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位表示基本上均勻樣品的表達(dá)遍及肝葉；大多數(shù)的表達(dá)細(xì)胞是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。如根據(jù)免疫組織化學(xué)的定位來(lái)測(cè)定的，對(duì)于肝臟結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，β-半乳糖苷酶的表達(dá)在非注射的肝葉中也是一樣的。
在用20ml制劑注射治療的兔子中，β-半乳糖苷酶在注射的肝葉中的表達(dá)大約是隨著表達(dá)中相似的近端到遠(yuǎn)端的梯度的8ml量所獲得表達(dá)的一半。在非注射的肝葉中β-半乳糖苷酶的表達(dá)是均勻分布的，并且比注射的肝葉中測(cè)定的表達(dá)低大約10倍。在注射的肝葉中的β-半乳糖苷酶表達(dá)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位表示基本上均勻樣品的表達(dá)遍及肝葉；大多數(shù)的表達(dá)細(xì)胞是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在腎、肺和脾中的表達(dá)基本上不可探測(cè)的。
圖6說(shuō)明使用3、8和20ml注射量的表達(dá)分布。在免疫組織化學(xué)處理上，8ml量看來(lái)似乎在注射的肝葉(葉1)中(圖6D)和非注射的肝葉(葉4)中(圖6E)都產(chǎn)生了最大數(shù)量的表達(dá)細(xì)胞。這些定性結(jié)果被在從每個(gè)肝葉中除去的3個(gè)組織核心中的β-半乳糖苷酶蛋白水平的定量測(cè)定所證實(shí)。圖6C、6F和6I示意地顯示了在四個(gè)主要肝葉的每個(gè)中根據(jù)三個(gè)位置(從腔靜脈到肝靜脈的入口的近端、中間和遠(yuǎn)端)所決定的平均表達(dá)水平。從四個(gè)肝葉的每個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶的值的總和證明8ml注射量比3ml注射量高～40％，比20ml注射量高～60％。由此分析，選擇8ml量，所有后來(lái)的實(shí)驗(yàn)，局部的(導(dǎo)管)和全身的注射，都使用8ml注射量。
除全體表達(dá)之外，圖6也說(shuō)明了由不同的注射量引起的表達(dá)的不同分布。因此，例如，對(duì)于3ml注射量，在注射的肝葉中的表達(dá)細(xì)胞(圖6A)主要限于圍繞靜脈的區(qū)域，而圍繞肝門(mén)三聯(lián)征或在非注射的肝葉中定位著相對(duì)很少的表達(dá)細(xì)胞(圖6B)。與定量結(jié)果一起，在非注射的肝葉中顯示較少表達(dá)的結(jié)果(圖6C)表明病毒的初始分布限于圍繞注射的肝靜脈的接近區(qū)域。
與由3ml注射量得到的結(jié)果相反，圖6也表明8ml注射量實(shí)現(xiàn)了病毒制劑的明顯更廣分布。因此，圖6D顯示表達(dá)細(xì)胞遍及肝臟腺泡，而不局限于肝靜脈周?chē)膮^(qū)域，而圖6E顯示一些注射病毒已經(jīng)感染了非注射的肝葉。在圖6F中證實(shí)并量化了這些結(jié)果，其表現(xiàn)了在注射的肝葉(肝葉1)和非注射的肝葉(肝葉2、3和4)中顯著的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)是與遍及注射的肝葉的病毒制劑的初始分布相一致的，并進(jìn)入非注射的肝葉的肝門(mén)和靜脈循環(huán)內(nèi)，其可隨后再分布并感染非注射的肝葉。
預(yù)計(jì)初始病毒制劑的分配大大超出注射的肝葉的20ml注射量，在注射的肝葉(圖6G)和未注射的肝葉(圖6H)中產(chǎn)生分布廣泛的但僅有較少的(與8ml量相比)表達(dá)細(xì)胞。這些定性結(jié)果被β-半乳糖苷酶的定量所證實(shí)(圖6I)，并且是與注射病毒制劑很好地進(jìn)入門(mén)脈循環(huán)之內(nèi)的方案相一致的。
實(shí)施例2在首次用于實(shí)驗(yàn)的兔子中局部與全身給藥的比較為了確定病毒載體的局部遞送與全身遞送相比是否帶來(lái)了優(yōu)點(diǎn)，將Ad2βgal病毒遞送給兔子，通過(guò)1)使用如實(shí)施例1中所描述的氣囊導(dǎo)管介導(dǎo)的遞送來(lái)進(jìn)行局部遞送，或2)使用靜脈注射進(jìn)行全身遞送。不依賴于遞送路線，將1.5×1012病毒顆粒/kg的Ad2βgal病毒注射給每只兔子。
根據(jù)下列方案來(lái)進(jìn)行病毒載體的全身遞送。使用對(duì)耳朵安全的20-號(hào)血管導(dǎo)管注射針進(jìn)入服鎮(zhèn)靜劑的兔子的末端耳靜脈，并纏上紗布和醫(yī)用繃帶。路厄鎖定沖洗附于導(dǎo)管上，以及苯海拉明；1mg/kg，給藥IV以控制可能的過(guò)敏反應(yīng)。將包含Ad2βgal病毒的8ml量的生理鹽水以大約1ml/秒的速率注射到耳靜脈中。使用實(shí)施例1所述的氣囊導(dǎo)管-介導(dǎo)的遞送來(lái)向肝臟的局部遞送Ad2βgal病毒。
如下評(píng)估多種方法的毒性。在給予病毒之前從每個(gè)兔子收集血液，并在給予病毒之后的第一、二和三天收集血液。細(xì)胞計(jì)數(shù)的差別(白和紅細(xì)胞、血紅蛋白、血細(xì)胞容積計(jì)(hematocrit)、平均紅細(xì)胞容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量、具核的紅細(xì)胞數(shù)、分節(jié)的(segmented)嗜異性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞(兔子的中性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、血小板)，可以實(shí)施血清的化學(xué)模式(profile)(堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酸酶、白蛋白、總蛋白、球蛋白、總的和直接膽紅素、BUN、肌酸、膽固醇、葡萄糖、鈣、磷酸、碳酸氫鹽、氯化物、鉀和鈉)。
分析治療的兔子的肝臟的β-半乳糖苷酶的表達(dá)。如實(shí)施例1所述確定在兔子肝臟勻漿物中細(xì)菌β-半乳糖苷酶表達(dá)的數(shù)量，或使用市場(chǎng)上可買(mǎi)到的ELISA試劑盒(Roche)使用廠家的說(shuō)明書(shū)來(lái)確定其數(shù)量。如實(shí)施例1所述進(jìn)行組織樣品的免疫組織化學(xué)處理。進(jìn)行形態(tài)學(xué)來(lái)確定肝臟中的表達(dá)模式，確定了肝細(xì)胞與非肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染比例。
圖7A和7C顯示了在這些動(dòng)物中Ad2βgal的全身給藥導(dǎo)致對(duì)于肝臟結(jié)構(gòu)表達(dá)的相對(duì)均勻分布，并且大部分轉(zhuǎn)換細(xì)胞是肝細(xì)胞，如細(xì)胞核β-半乳糖苷酶染色高亮顯示了其圓核。轉(zhuǎn)換細(xì)胞的均勻性實(shí)質(zhì)上在全部肝葉中相同(未顯示數(shù)據(jù))，并且在圖7E中顯示的定量數(shù)據(jù)證實(shí)了該評(píng)價(jià)，即如ELISA所測(cè)定的，全部肝葉顯示了近似相等的β-半乳糖苷酶表達(dá)。
使用相同病毒劑量和注射量(8ml)的局部遞送方法，圖8A表明在注射的肝葉(肝葉1)中產(chǎn)生的表達(dá)細(xì)胞散布在腺泡中，按照在實(shí)施例1(圖6)中早期量的評(píng)價(jià)研究。在高倍放大(圖8C)下，在注射的肝葉中表達(dá)細(xì)胞核定位β-半乳糖苷酶的大多數(shù)細(xì)胞是肝細(xì)胞。與注射的肝葉相比，圖6B顯示了在非注射肝葉(肝葉4)中表達(dá)細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目非常少。在注射的肝葉中，在非注射肝葉中的表達(dá)細(xì)胞主要是肝細(xì)胞，并在腺泡內(nèi)均勻分布。
在首次接受實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中這些定性的發(fā)現(xiàn)得到圖6E所示的β-半乳糖苷酶的定量測(cè)定的支持，其顯示了在注射的肝葉中比在非注射肝葉中明顯大的全面表達(dá)。如用量評(píng)價(jià)試驗(yàn)所示(圖6)，所有的非注射肝葉都被轉(zhuǎn)換到近似相同的程度。
圖9A表明了在首次接受實(shí)驗(yàn)的的兔子中使用氣囊導(dǎo)管經(jīng)由肝靜脈路線的局部的、導(dǎo)管介導(dǎo)的遞送導(dǎo)致在注射的肝葉中比在非注射的肝葉中受感染細(xì)胞多2到3倍；在注射的肝葉和非注射的肝葉中被認(rèn)為是肝細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞的比例實(shí)質(zhì)上在注射的肝葉和非注射的肝葉中是相同的(～0.7)。
圖9D表明了在首次接受實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中的全身遞送導(dǎo)致在全體表達(dá)細(xì)胞中與局部遞送相比2到3倍的降低(圖9A)。肝葉1和4的評(píng)價(jià)(注意沒(méi)有用全身遞送的“注射的”或“未注射的”肝葉)，產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)上相同數(shù)量的表達(dá)細(xì)胞。表達(dá)細(xì)胞的肝細(xì)胞分?jǐn)?shù)的評(píng)價(jià)在注射的肝葉(0.63)和非注射的肝葉(0.69)中實(shí)質(zhì)上是相同的，并且大致等于在局部遞送之后所得到的分?jǐn)?shù)(～0.71；圖9A)。
綜合起來(lái)，該數(shù)據(jù)表明腺病毒的局部、導(dǎo)管介導(dǎo)的遞送相對(duì)于全身遞送帶來(lái)了優(yōu)點(diǎn)。使用肝靜脈途徑的局部遞送與使用全身途徑遞送(圖7E和9D)相比，導(dǎo)致2-3倍更多的表達(dá)(圖8E和9A)。
由通過(guò)局部(氣囊導(dǎo)管)和全身途徑遞送的Ad2-βgal所產(chǎn)生的毒性較少。在外科手術(shù)(初始期間)之前，腺病毒注射或生理鹽水假注射后一、兩和三天，將采自兔子的血樣進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清化學(xué)分析。
在用病毒處理的動(dòng)物中24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)輕的但統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的淋巴細(xì)胞減少(與初始期間相比減少50-60％)。在用病毒處理的動(dòng)物中24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)輕的但統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的血小板減少(與初始期間相比減少50％)。在用病毒處理或經(jīng)受假的外科手術(shù)(用生理鹽水局部注射)的動(dòng)物中24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)輕的但統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的嗜異染性(與初始期間相比增加100-200％)。
在用病毒處理或經(jīng)受假的外科手術(shù)(用生理鹽水局部注射)的動(dòng)物中24小時(shí)內(nèi)很明顯有統(tǒng)計(jì)上有顯著意義的血清肌酸激酶水平的升高(與初始期間相比增加100-1000％)。在病毒給藥或假的外科手術(shù)后三天內(nèi)所有的血細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清化學(xué)分析都恢復(fù)正常。
對(duì)由病毒或未感染動(dòng)物的局部或全身遞送所感染的動(dòng)物的肝臟部分進(jìn)行蘇木素伊紅染色的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，顯示沒(méi)有一致的肝細(xì)胞的變化可與任何特異療法有關(guān)。
實(shí)施例3在被動(dòng)免疫的兔子中局部與全身給藥的比較把腺病毒載體的局部、導(dǎo)管-介導(dǎo)的遞送與具有抗病毒免疫性的動(dòng)物的全身性注射相比較，來(lái)檢驗(yàn)在該情況下局部注射是否與全身注射相比帶來(lái)了優(yōu)點(diǎn)。為達(dá)到這個(gè)目的，在被動(dòng)免疫了存儲(chǔ)的已知抗腺病毒型2滴度(抗Ad2)的人血清的兔子體內(nèi)重復(fù)實(shí)施例2中的試驗(yàn)。
在病毒給藥的前一天，使用對(duì)耳朵安全的20-號(hào)血管導(dǎo)管注射針進(jìn)入服鎮(zhèn)靜劑的兔子的末端耳靜脈，并纏上紗布和醫(yī)用繃帶。路厄鎖定沖洗附于導(dǎo)管上，并靜脈給藥苯海拉明(1mg/kg)以控制可能的過(guò)敏反應(yīng)。然后以0.1ml/秒的速度注射四十毫升的包含抗-Ad2抗體的存儲(chǔ)人血清(Valley Biomedical，Winchester，VA)。該存儲(chǔ)人血清具有抗-Ad2滴度(總滴度＝12,800，中和滴度＝3,200)是通常的人抗-Ad2滴度的近似十倍(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，將該遞送藥劑稀釋到總體兔子循環(huán)(大約為350-400ml)中，預(yù)計(jì)會(huì)使其最后的抗-Ad2滴度接近通常的人類滴度。當(dāng)Ad2βgal給藥時(shí)，在所有動(dòng)物中實(shí)際測(cè)定的抗-Ad2滴度為抗Ad21,600的總滴度和400的中和滴度。
通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)定存儲(chǔ)的人血清和兔子血清中的抗-Ad2抗體滴度。向包被有熱失活腺病毒2型的96孔平板的孔中加入連續(xù)稀釋的血清。用辣根過(guò)氧化酶-共軛羊抗兔子免疫球蛋白G，IgM和IgA來(lái)檢測(cè)結(jié)合的病毒特異性抗體。然后通過(guò)與比色分析的底物30分鐘培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)兔子抗Ad2抗體。抗病毒滴度定義為產(chǎn)生OD490≥0.1的最大血清稀釋度的倒數(shù)。
根據(jù)抑制Ad2-βgal對(duì)易感染的細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力來(lái)測(cè)定存儲(chǔ)的人血清中的腺病毒中和抗體滴度。將HeLa細(xì)胞(ATTC)置于96孔組織培養(yǎng)平板的平底處，并在5％CO2大氣中37℃下孵化過(guò)夜。將血清樣品在DMEM中從1∶25連續(xù)烯釋到1∶6400，將Ad2-βgal(50MOI)加入血清稀釋物中，并在37℃中培養(yǎng)1小時(shí)，然后將其轉(zhuǎn)入平板的細(xì)胞中，并繼續(xù)培養(yǎng)3天。在第三天，采集并溶解細(xì)胞。用商業(yè)上可得到的AMPGD/β-半乳糖苷酶檢驗(yàn)試劑盒測(cè)定溶解產(chǎn)物的底物轉(zhuǎn)化。血清樣品的中和抗體滴度定義為相對(duì)于負(fù)對(duì)照(人免疫球蛋白-衰竭的血清)測(cè)得的相對(duì)發(fā)光值減少≥50％的稀釋度的倒數(shù)。所有兔子中在病毒給藥時(shí)的抗-Ad2總滴度為1∶1600；中和滴度為1∶400。此滴度實(shí)質(zhì)上與人類通常的抗-Ad2滴度相同。
在被動(dòng)免疫后一天，通過(guò)以下方式來(lái)遞送Ad2βgal病毒1)用靜脈注射全身遞送，或2)用例1和例2所述的氣囊導(dǎo)管-介導(dǎo)的遞送向肝臟局部遞送。除非說(shuō)明，所用材料與方法應(yīng)與例1和例2中所用的相似。與遞送途徑無(wú)關(guān)，每只兔子都應(yīng)注射1.5×1012病毒粒子/千克的ad2βgal病毒。
向被動(dòng)免疫的兔子全身給藥Ad2βgal導(dǎo)致一致的與肝臟結(jié)構(gòu)有關(guān)的β-半乳糖苷酶的表達(dá)，與中央靜脈或肝門(mén)三聯(lián)征周?chē)磉_(dá)細(xì)胞的表現(xiàn)濃度無(wú)關(guān)(圖7B和7D)。但是，與對(duì)首次接受實(shí)驗(yàn)的的動(dòng)物全身給藥相同劑量的病毒相比(圖7A和7C)，向預(yù)先存在抗-Ad2抗體的兔子中全身給藥導(dǎo)致減少的表達(dá)，即β-半乳糖苷酶總數(shù)減少～2倍(圖7F)。
對(duì)于根據(jù)被動(dòng)免疫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類(肝細(xì)胞與非肝細(xì)胞相比較)，圖9E表明與向首次接受實(shí)驗(yàn)的的動(dòng)物全身遞送(253±166肝細(xì)胞/區(qū)域)(圖9D)相比，向被動(dòng)免疫的兔子進(jìn)行全身遞送導(dǎo)致被感染肝細(xì)胞的數(shù)目下降10倍(18.0±14肝細(xì)胞/區(qū)域)。但是，在抗-Ad2抗體存在的情況下(被動(dòng)免疫)，與向首次接受實(shí)驗(yàn)的的動(dòng)物全身遞送(147±82非肝細(xì)胞/區(qū)域)(圖9D)相比，全身遞送導(dǎo)致被感染的非肝細(xì)胞的數(shù)目?jī)H有極小的下降(124±47非肝細(xì)胞/區(qū)域)(圖9E)。這些數(shù)據(jù)因而與得到的定性和定量表達(dá)的數(shù)據(jù)(圖7)一致，其也顯示了由于被動(dòng)免疫的在表達(dá)上2-3倍的下降。因此，按照病毒全身給藥，抗-Ad2抗體的最大的引人注目的效果是受感染肝細(xì)胞的比例從在首次接受實(shí)驗(yàn)的的動(dòng)物中所有受感染細(xì)胞的66％下降到在被動(dòng)免疫動(dòng)物中所有受感染細(xì)胞的14％。因此，在抗載體抗體存在的情況下全身遞送導(dǎo)致減少的表達(dá)，其中大部分表達(dá)細(xì)胞是非肝細(xì)胞，例如竇狀上皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞(圖9E)。在被動(dòng)免疫動(dòng)物中僅有～15％的表達(dá)細(xì)胞確定為肝細(xì)胞。
被動(dòng)免疫動(dòng)物中Ad2βgal的局部遞送導(dǎo)致β-半乳糖苷酶表達(dá)細(xì)胞在注射的肝葉中相似的分布(圖8F)，如接受Ad2βgal的首次接受實(shí)驗(yàn)的的動(dòng)物所表現(xiàn)的(圖8A)。在首次接受實(shí)驗(yàn)的的兔子(圖8E)和被動(dòng)免疫的兔子(圖8J)之間局部、導(dǎo)管聲-介導(dǎo)的給藥暗示抗Ad2抗體的存在導(dǎo)致肝臟β-半乳糖苷酶表現(xiàn)總量大約減少5-10倍。
除了在被動(dòng)免疫動(dòng)物中β半乳糖苷酶表現(xiàn)總量的下降之外，與在用局部、導(dǎo)管介導(dǎo)遞送腺病毒載體的首次接受實(shí)驗(yàn)的的動(dòng)物中的比例相比，其表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞類型的比例也有所改變。表達(dá)細(xì)胞的比例可確定為在注射的肝葉中的肝細(xì)胞從首次接受實(shí)驗(yàn)的的動(dòng)物中的0.72下降到被動(dòng)免疫動(dòng)物中的0.45(圖9A和9B)。更顯著的是存在于未注射的肝葉中的差異，其中由于被動(dòng)免疫，該比例由0.70減少到0.09(圖9A和9B)。
總之，由ELISA(圖7和圖8)和Metamorph(圖9)分析來(lái)測(cè)定的在局部和全身遞送之后在被動(dòng)免疫動(dòng)物中的肝臟所有區(qū)域的所有β-半乳糖苷酶的表達(dá)總量實(shí)質(zhì)上是相同的。但是，重要的是，按照局部遞送，確定為肝細(xì)胞的β-半乳糖苷酶表達(dá)細(xì)胞的分?jǐn)?shù)增加～7倍。這暗示在被動(dòng)免疫動(dòng)物中按照全身遞送的所有β-半乳糖苷酶表達(dá)的主要部分起源于非肝細(xì)胞，并且該論點(diǎn)可由定性的免疫組織化學(xué)處理(圖8G和8I)和定量的Metamorph數(shù)據(jù)(圖9E)所支持。并且，盡管抗Ad2抗體在總的感染和表達(dá)上存在副作用，但局部遞送可優(yōu)先鎖定肝細(xì)胞，即基因治療所要求的靶細(xì)胞。因此，向免疫的兔子全身遞送產(chǎn)生～14％確定為肝細(xì)胞的表示細(xì)胞，局部遞送在注射的肝葉中產(chǎn)生～45％確定為肝細(xì)胞的表示細(xì)胞，在非注射的肝葉中產(chǎn)生～10％。在非注射的肝葉中表達(dá)肝細(xì)胞的低百分?jǐn)?shù)是與病毒和分布在未注射的肝葉中的抗病毒抗體的較大程度的相互作用相一致的。
對(duì)于被動(dòng)免疫動(dòng)物來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果顯然表明局部遞送提供了與全身遞送相比明顯的優(yōu)點(diǎn)。在對(duì)被動(dòng)免疫動(dòng)物進(jìn)行局部遞送之后，轉(zhuǎn)基因在肝細(xì)胞中的表達(dá)與在非肝細(xì)胞中的比例明顯高于在對(duì)被動(dòng)免疫動(dòng)物進(jìn)行全身遞送之后的比例。因此，很明顯在向預(yù)先存在免疫性的動(dòng)物給藥病毒基因治療劑時(shí)，該方法提供了優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例4向被動(dòng)免疫的用生理鹽水預(yù)先沖洗的兔子肝臟中導(dǎo)管介導(dǎo)的腺病毒基因治療載體的遞送增加“沖洗”步驟來(lái)評(píng)階腺病毒載體的局部、導(dǎo)管介導(dǎo)的遞送，其中僅僅在病毒給藥之前經(jīng)由導(dǎo)管注入20ml的生理鹽水。這是在具有抗Ad2病毒免疫性的動(dòng)物中實(shí)施的，用來(lái)檢驗(yàn)用生理鹽水預(yù)先沖洗肝臟與沒(méi)有預(yù)先沖洗步驟的遞送相比是否會(huì)帶來(lái)優(yōu)點(diǎn)。
為了完成此操作，用已知抗-腺病毒型2滴度的儲(chǔ)存人血清(抗-Ad2)對(duì)兔子進(jìn)行被動(dòng)免疫，如例3所述。被動(dòng)免疫一天后，在下列步驟的附加步驟之前如例1和2所述進(jìn)行氣囊導(dǎo)管聯(lián)-介導(dǎo)的遞送方法。在輸送Ad2βgal之前，立即將20ml生理鹽水經(jīng)由導(dǎo)管遞送。
與接受局部導(dǎo)管-介導(dǎo)遞送處理而未用鹽水沖洗的被動(dòng)免疫接種的動(dòng)物相比，將生理鹽水沖洗加入到在被動(dòng)免疫的動(dòng)物中Ad2βgal的局部、導(dǎo)管介導(dǎo)遞送中增加了表達(dá)轉(zhuǎn)基因的數(shù)目和表達(dá)β-半乳糖苷酶的肝細(xì)胞的比例。在被動(dòng)免疫并用生理鹽水預(yù)先沖洗的動(dòng)物中，與未用生理鹽水預(yù)先沖洗的動(dòng)物相比，表達(dá)的肝細(xì)胞的數(shù)目增加大約5倍(圖9B和9C)?？纱_定為肝細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞的比例也增加，并為0.68(圖9C)，相比之下，被動(dòng)免疫并未用生理鹽水預(yù)先沖洗的動(dòng)物中為0.45(圖9B)，而在非免疫動(dòng)物中為0.71(圖9A)。更明顯的是在非注射的肝葉中的差別，其中由于在被動(dòng)免疫的動(dòng)物中，生理鹽水預(yù)先沖洗可確定為肝細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞的比例從0.09增加到0.40(圖9B和9C)。對(duì)于被動(dòng)免疫的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，很明顯除了局部導(dǎo)管-間接遞送病毒載體，生理鹽水預(yù)先沖洗在對(duì)病毒載體預(yù)先存在免疫性的動(dòng)物提供了重要的優(yōu)勢(shì)。在被動(dòng)免疫的動(dòng)物中，通過(guò)生理鹽水預(yù)先沖洗，表達(dá)細(xì)胞的總數(shù)和表達(dá)轉(zhuǎn)基因的肝細(xì)胞的分?jǐn)?shù)都明顯高于沒(méi)有用生理鹽水沖洗的動(dòng)物。因此，很明顯當(dāng)將病毒基因治療劑給予預(yù)先存在免疫性的動(dòng)物時(shí)，本方法的這一實(shí)施方案提供了優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例5給兔子肝臟導(dǎo)管介導(dǎo)遞送腺相關(guān)病毒基因治療載體在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用每只大約在4公斤重量的新西蘭白兔(MillbrookFarms，Amherst，MA)。使用腺相關(guān)病毒，AAV2/8DC 190HAGAL(AAV2/8)，包括AAV8血清型的殼體區(qū)和AAV2血清型的顛倒末端重復(fù)。表達(dá)盒包括兩個(gè)α-1微球蛋白增強(qiáng)子，一個(gè)α-1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子和人α-半乳糖苷酶A轉(zhuǎn)基因。如實(shí)施例1-3所述用氣囊導(dǎo)管-介導(dǎo)的遞送法將AAV2/8病毒的1.25×1011或1.25×1012DNA酶抵抗粒子(drp)/kg(總量8ml)局部遞送至肝臟。除非說(shuō)明，使用的材料與方法與實(shí)施例1-3中所使用的相似。
用如前所述的專為測(cè)定人α-半乳糖苷酶A使用的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法來(lái)測(cè)定動(dòng)物血清中的人α-半乳糖苷酶A(AGAL)的表達(dá)[Ziegler等人，(1999)。Hum Gene Ther.Jul1；10(10)1667-82]。
在用1.25×1011drp/千克的AAV2/8病毒處理的兔子中，其血清中的AGAL表達(dá)從3-31ng AGAL/ml血清變動(dòng)。在用1.25×1012DNA酶抵抗粒子(drp)/千克的AAV2/8處理的兔子中，其血清中的AGAL表達(dá)從15-132ng AGAL/ml血清變動(dòng)。
實(shí)施例6在向兔子肝臟的導(dǎo)管介導(dǎo)的遞送腺病毒相關(guān)病毒基因治療載體之后AGAL表達(dá)的時(shí)間過(guò)程使用大約每只4千克重量的新西蘭白兔(Millbrook Farms，Amherst，MA)。使用腺相關(guān)病毒，AAV2DC190HAGAL(AAV2/2)，包括殼體區(qū)和AAV2血清型的顛倒末端重復(fù)。表達(dá)盒包括兩個(gè)α-1微球蛋白增強(qiáng)子，一個(gè)α-1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子，和人α-半乳糖苷酶A轉(zhuǎn)基因。如實(shí)施例1-3所述用氣囊導(dǎo)管-介導(dǎo)的遞送將總量為8毫升的AAV病毒的5×1012DNA酶抵抗粒子(drp)局部遞送到肝臟。除非說(shuō)明，使用的材料與方法與實(shí)施例1-3中所使用的相似。
用如前所述的專為測(cè)定人α-半乳糖苷酶A使用的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法來(lái)測(cè)定動(dòng)物血清中的人α-半乳糖苷酶A(AGAL)的表達(dá)[Ziegler等人，(1999)。Hum Gene Ther.Jul 1；10(10)1667-82]。在84天之內(nèi)測(cè)定AGAL的表達(dá)。
同時(shí)隨著時(shí)間用ELISA測(cè)定處理的兔子的血清中的抗-AGAL抗體滴度。將連續(xù)稀釋的血清加到包被純化的重組人α-半乳糖苷酶A的96孔平板的孔中。用辣根過(guò)氧化酶-共軛羊抗兔子免疫球蛋白G、IgM和IgA檢測(cè)到結(jié)合人α-半乳糖苷酶A的特有抗體。然后使用比色分析的底物30分鐘培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)兔子抗Ad2抗體。抗病毒滴度定義為產(chǎn)生OD490≥0.1的最大血清稀釋度的倒數(shù)。
如圖10所示，在整個(gè)84天時(shí)間過(guò)程中，兔子血清中都存在著AGAL的表達(dá)。在整個(gè)84天時(shí)間里在兔子血清中均檢測(cè)不到抗AGAL抗體。遞送AAV2引起的毒性不強(qiáng)，與Ad2-βgal遞送引起的毒性實(shí)際上大體相似。
實(shí)施例7導(dǎo)管介導(dǎo)的腺病毒基因治療載體向兔子肝臟中的遞送并延長(zhǎng)其停留時(shí)間使用每只體重大約4公斤的新西蘭白兔(Millbrook Farms，Amherst，MA)。使用實(shí)施例1所述的腺病毒載體Ad2βgal。給每只白兔按每千克1.5×1012病毒顆粒的劑量注射Ad2βgal病毒。
除了病毒在組織中的停留時(shí)間大約為四分鐘而非一分鐘，使用實(shí)施例1-3中所述的方法將腺病毒基因治療載體遞送到兔子肝臟中其總注射量為8毫升。
注射三天后，對(duì)接受處理的兔子的肝臟進(jìn)行β-半乳糖苷酶表達(dá)的分析。用市場(chǎng)上可買(mǎi)到的ELISA試劑盒(Roche)按廠家的說(shuō)明書(shū)定量測(cè)定在兔子肝臟勻漿物中細(xì)菌β-半乳糖苷酶的表達(dá)，如實(shí)施例1所述對(duì)組織樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理。如實(shí)施例1所述進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析來(lái)確定肝臟的表達(dá)模式和肝臟的肝細(xì)胞與肝臟的非肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染比例。對(duì)于每只兔子，取注射的肝葉的三個(gè)部分和未注射的肝葉的三個(gè)部分進(jìn)行分析，得出肝細(xì)胞分?jǐn)?shù)[感染的肝細(xì)胞/(感染的肝細(xì)胞+感染的非肝細(xì)胞)]。
如圖11A所示，與上述應(yīng)用一分鐘停留時(shí)間的研究相比，延長(zhǎng)的停留時(shí)間明顯提高了在注射的和未注射的肝葉中確定為肝細(xì)胞的感染的細(xì)胞的比例。以4分鐘停留時(shí)間用腺病毒載體處理的兔子在注射的肝葉中具有肝細(xì)胞分?jǐn)?shù)大約0.75-0.90，在未注射的肝葉中具有肝細(xì)胞分?jǐn)?shù)大約0.70-0.90(參見(jiàn)圖11A所示8-20與8-22的條帶)。相比之下，使用相同遞送方法以1分鐘停留時(shí)間用腺病毒載體處理的兔子在注射的肝葉中具有肝細(xì)胞分?jǐn)?shù)大約0.6-0.75，在未注射的肝葉中具有肝細(xì)胞分?jǐn)?shù)大約0.30-0.70(參見(jiàn)圖11A所示4，5和1的條帶)。有趣的是，如圖11B所示，增加的停留時(shí)間看起來(lái)并未提高β-半乳糖苷酶的整體表達(dá)水平。
實(shí)施例8用流出物阻斷的肝葉的遞送如實(shí)施例1所述，肝葉的遞送方法只限遞送到封閉氣囊遠(yuǎn)側(cè)的儲(chǔ)存器官的一部分。為了更好地將儲(chǔ)存器官?gòu)捏w循環(huán)中隔離出來(lái)，所有肝靜脈的流出物阻斷可由在肝臟的腔靜脈中植入的氣囊導(dǎo)管(6)覆蓋肝臟靜脈口的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
為了實(shí)行該方法，將股靜脈從股內(nèi)前廉進(jìn)入經(jīng)由縱向的皮膚切口從大腿溝向下延伸。直接解剖肌肉筋膜來(lái)暴露神經(jīng)血管束。將股靜脈從締合的動(dòng)脈和神經(jīng)中小心地分解出來(lái)。分離并結(jié)扎出一端1-2cm長(zhǎng)的股靜脈。在接近結(jié)扎的位置，將一個(gè)7French插管器套插入股靜脈。利用熒光檢查的引導(dǎo)，將導(dǎo)線放入下腔靜脈。將5Fench 14毫米乘4厘米的氣囊導(dǎo)管由導(dǎo)線上穿過(guò)套植入腔靜脈的肝臟部分。套的外徑比兔子的股靜脈大，因此該方法很難在不產(chǎn)生脈管傷害的情況下在兔子模型中重復(fù)。在以人類為受試者中不期望出現(xiàn)這種并發(fā)癥。
對(duì)導(dǎo)管內(nèi)腔進(jìn)行肝素化處理。在經(jīng)由植入肝靜脈的氣囊封閉的氣囊導(dǎo)管注射轉(zhuǎn)染試劑前膨脹氣囊。伴隨氣囊的膨脹，將少量射線照相造影劑從導(dǎo)引器套注入以確保受阻隔的氣囊流入下腔靜脈。然后將8ml的轉(zhuǎn)染試劑從血管內(nèi)的導(dǎo)管注入一個(gè)單獨(dú)隔離出來(lái)的肝葉。然后立即將導(dǎo)管和套撤除并進(jìn)行止血處理。如圖3所示，濃的射線照相造影劑在隔離出來(lái)的肝葉上著色，而更稀的造影劑經(jīng)由門(mén)靜脈在肝臟的剩余部分進(jìn)行逆向的再循環(huán)。
實(shí)施例9靶整體-器官的遞送為了將基因治療劑通過(guò)一次注射遞送到整個(gè)肝臟上，通過(guò)使用肝臟靜脈流的上端或下端的下腔靜脈中的氣囊膨脹將肝臟隔離出來(lái)。然后在氣囊之間注入轉(zhuǎn)染試劑溶液，溶液經(jīng)由肝靜脈逆向流至整個(gè)肝臟實(shí)質(zhì)。此方法的一種方案見(jiàn)于圖4。在這個(gè)方案中，氣囊封閉的氣囊(7、8)自上通過(guò)頸靜脈(5)到右心房和最大肝靜脈(most superior hepatic vein)(11)之間的下腔靜脈(16)位置，自下由股靜脈最大腎靜脈(most superior renal vein)(19)和最小肝靜脈(3)之間的下腔靜脈(16)位置。將一根在靠近頂端有多個(gè)邊孔的4French辮形導(dǎo)管由相對(duì)的股靜脈前進(jìn)放入兩個(gè)閉塞氣囊之間的下腔靜脈。在通過(guò)辮形導(dǎo)線導(dǎo)管注射基因治療溶液前將氣囊膨脹以迅速隔離肝臟。
在此方法的另一實(shí)施方案中，氣囊封閉的氣囊可經(jīng)由兩個(gè)分離雙內(nèi)腔氣囊導(dǎo)管(12、13)遞送，如圖5所示。
實(shí)施例10使用局部、導(dǎo)管介導(dǎo)向?qū)AV8改變天然免疫力的恒河猴遞送AAV8.DC19OhAGA的預(yù)測(cè)研究使用局部、導(dǎo)管介導(dǎo)經(jīng)由肝靜脈的基于腺相關(guān)病毒(AAV)血清型8的包含凝血酶原增強(qiáng)子/人白蛋白啟動(dòng)子(DC190)驅(qū)動(dòng)的人α半乳糖苷酶(hAGA)基因的載體，對(duì)人α-半乳糖苷酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移和表達(dá)的效果是通過(guò)對(duì)AAV8具有大范圍天然免疫力的恒河猴而測(cè)定的。
將由于局部遞送的hAGA的表達(dá)與經(jīng)由周邊靜脈的全身遞送所獲得的表達(dá)相比較。將測(cè)定循環(huán)α-半乳糖苷酶的水平和持續(xù)時(shí)間、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抗AAV8和抗α半乳糖苷酶抗體的存在。也將確定該轉(zhuǎn)基因的組織分布。
很可能在AAV8.DC190hAGA給藥之前和隨著AAV8.DC190hAGA給藥來(lái)對(duì)動(dòng)物給予免疫抑制劑，以便減少或消除細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞識(shí)別病毒殼體蛋白而除去轉(zhuǎn)化細(xì)胞的可能性。在器官移植領(lǐng)域常用的免疫抑制試劑可單獨(dú)使用或與其它試劑結(jié)合使用。這樣的免疫抑制試劑可包括被用來(lái)誘導(dǎo)和/或被用來(lái)維持的試劑。這些試劑可包括環(huán)孢霉素(Neoral，Sandimmune)，強(qiáng)的松(Novo Prednisone，Apo Prednisone)，硫唑嘌呤(Imuran)，他克莫司或FK506(Prograf)，麥考酚酸嗎乙酯，mycophenolate mofetil(CellCept)，西羅莫司sirolimus(Rapamune)，OKT3(Muromorab CO3，Orthoclone)，ATGAM & Thymoglobulin。免疫抑制劑體系可能至少包含CELLCEPT口服懸浮液和Rapamune口服液。CELLCEPT口服懸浮液(MMF)將通過(guò)鼻管灌食法以大約12.5mg/kg的劑量每天兩次來(lái)給藥。Rapamune口服溶液將通過(guò)鼻管灌食法以大約2mg/kg的劑量來(lái)給藥。這些被認(rèn)為是適合于恒河猴的最大的合理估計(jì)量。
使用由局部、導(dǎo)管介導(dǎo)的途徑和全身途徑來(lái)單一靜脈注入AAV8.DC190hAGA。預(yù)測(cè)大約2×1013病毒顆粒/kg的AAV8.DC 19OhAGA的劑量水平足以評(píng)價(jià)AAV8.DC190hAGA的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性頤。劑量水平的選擇是根據(jù)來(lái)源于上述在兔子中進(jìn)行的研究和由其他的研究者用相關(guān)材料在恒河猴中進(jìn)行的研究的信息。
用抗AAV8抗體篩選猴子來(lái)確定對(duì)AAV8載體的天然免疫力的存在或缺失。AAV8最初分離自猴子，這就是為什么選擇該血清型用于研究的原因。分離自想要處理的哺乳動(dòng)物的血清型的應(yīng)用可以在提高靶氣管的轉(zhuǎn)導(dǎo)上提供優(yōu)勢(shì)。這樣的提高理論上是由這樣的血清型引起的，因?yàn)楦鶕?jù)病毒分離自哺乳動(dòng)物的事實(shí)，該血清型對(duì)于哺乳動(dòng)物的靶器官可能具有提高的向性。具有大范圍的天然免疫力的猴子的應(yīng)用也將考慮到評(píng)價(jià)在用對(duì)于選擇的病毒載體具有預(yù)先存在的免疫性的哺乳動(dòng)物中的本方法。
使用在實(shí)施例1和4中所描述的本發(fā)明的方法來(lái)處理經(jīng)由局部、導(dǎo)管介導(dǎo)遞送而接受病毒的猴子?？傊?，猴子通過(guò)如實(shí)施例4所述的具有附加的沖洗步驟的導(dǎo)管介導(dǎo)的方法來(lái)接受病毒。該沖洗步驟在理論上稀釋了存在于靶肝葉中的任何抗病毒抗體，其在理論上提高了病毒基因轉(zhuǎn)染，特別是肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。另外，該病毒的停留時(shí)間從如實(shí)施例1和4所述的1分鐘增加到停留時(shí)間不超過(guò)4分鐘。停留時(shí)間的增加在理論上提高了病毒基因轉(zhuǎn)染，特別是肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。
研究持續(xù)時(shí)間估計(jì)是365天。在貫穿研究過(guò)程的各個(gè)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)從全部動(dòng)物處收集評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因表達(dá)、抗體水平、血清化學(xué)和血液學(xué)參數(shù)的血樣。
上述研究評(píng)價(jià)了經(jīng)由最初從猴子分離的血清型遞送的治療性轉(zhuǎn)基因的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的效果。其將評(píng)價(jià)哺乳動(dòng)物中對(duì)于血清型預(yù)先存在的免疫性的自然分布范圍的的效果和表達(dá)。該研究的遞送方法利用在病毒給藥之前的器官的沖洗步驟和病毒的延長(zhǎng)的停留時(shí)間。抑制免抑反應(yīng)也屬于本研究方案的一部分。在理論上使用本方法的轉(zhuǎn)基因的效果和表達(dá)將產(chǎn)生等于甚至大于在基于兔子的模型中已經(jīng)觀察到的靶器官轉(zhuǎn)導(dǎo)。在理論上使用本方法的轉(zhuǎn)基因的效果和表達(dá)也將產(chǎn)生等于甚至大于在利用病毒載體順行遞送的哺乳動(dòng)物中基于其它導(dǎo)管的系統(tǒng)中已經(jīng)觀察到的靶器官轉(zhuǎn)導(dǎo)。
因?yàn)榧膊】筛腥靖鞣N器官或組織，顯而易見(jiàn)地是希望在身體的各種部位應(yīng)用本發(fā)明的方法。本發(fā)明可用來(lái)處理各種器官或組織，包括肝臟、腎、心臟、肺、骨骼肌、胃或腸。
根據(jù)說(shuō)明書(shū)中引用的教導(dǎo)和參考，可更充分地理解本說(shuō)明書(shū)，在本文中將其全部引入作為參考。在說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施方案提供了對(duì)本發(fā)明實(shí)施方案的闡述，并不應(yīng)當(dāng)理解為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到許多其它的實(shí)施方案也包括在要求的發(fā)明中，其意味著說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例認(rèn)為僅是示范性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神由下述權(quán)利要求來(lái)表述。
通過(guò)考慮對(duì)本文中公開(kāi)的本發(fā)明的說(shuō)明和實(shí)施，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。其意味著說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例被認(rèn)為僅僅是示范性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神由下述權(quán)利要求來(lái)表述。
權(quán)利要求
1.一種用于向哺乳動(dòng)物受試者的選定器官遞送病毒基因治療劑以便表達(dá)由該病毒基因治療劑編碼的蛋白的方法，包括a.在引流器官的靜脈脈管系統(tǒng)中植入一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管；至少一個(gè)導(dǎo)管具有一個(gè)或多個(gè)膨脹可擴(kuò)大的構(gòu)件；b.通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)該膨脹可擴(kuò)大的構(gòu)件膨脹，來(lái)封閉引流該器官或該器官的部分的靜脈脈管系統(tǒng)內(nèi)的液體流動(dòng)以分離器官或器官的部分；c.以一定體積遞送病毒基因治療劑，該體積導(dǎo)致在分離的器官或器官的分離體的部分中，脈管壓力與正常靜脈壓相比升高不超過(guò)40％；d.允許基因治療劑在分離的器官或器官的分離的部分保持一段時(shí)間，該時(shí)間足夠使治療有效量的該試劑轉(zhuǎn)導(dǎo)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的哺乳動(dòng)物受試者為人類。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靜脈脈管系統(tǒng)為肝靜脈、分支肝靜脈或下腔靜脈。
4.權(quán)利要求1的方法，其中肝細(xì)胞在肝細(xì)胞加上非肝細(xì)胞之中的分?jǐn)?shù)是至少0.2，其中所述的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞位于分離的器官或器官的分離的部分，并表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。
5.權(quán)利要求1的方法，其中肝細(xì)胞在肝細(xì)胞加上非肝細(xì)胞之中的分?jǐn)?shù)是至少0.3，其中所述的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞位于分離的器官或器官的分離的部分，并表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。
6.權(quán)利要求1的方法，其中肝細(xì)胞在肝細(xì)胞加上非肝細(xì)胞之中的分?jǐn)?shù)是至少0.4，其中所述的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞位于分離的器官或器官的分離的部分，并表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。
7.權(quán)利要求1的方法，其中肝細(xì)胞在肝細(xì)胞加上非肝細(xì)胞之中的分?jǐn)?shù)是至少0.5，其中所述的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞位于分離的器官或器官的分離的部分，并表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。
8.權(quán)利要求1的方法，其中肝細(xì)胞在肝細(xì)胞加上非肝細(xì)胞之中的分?jǐn)?shù)是至少0.6，其中所述的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞位于分離的器官或器官的分離的部分，并表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在病毒給藥之前用溶液沖洗該器官。
10.權(quán)利要求1的方法，其中脈管壓力與分離的器官或器官的分離的部分的正常靜脈壓相比升高不超過(guò)30％。
11.權(quán)利要求1的方法，其中脈管壓力與分離的器官或器官的分離的部分的正常靜脈壓相比升高不超過(guò)20％。
12.權(quán)利要求1的方法，其中脈管壓力與分離的器官或器官的分離的部分的正常靜脈壓相比升高不超過(guò)10％。
13.權(quán)利要求1的方法，其中導(dǎo)管是氣囊封閉導(dǎo)管。
14.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑通過(guò)血管內(nèi)的導(dǎo)管來(lái)遞送。
15.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑通過(guò)經(jīng)皮的注射針來(lái)遞送。
16.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括腺病毒載體。
17.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括腺相關(guān)病毒載體。
18.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括慢病毒載體。
19.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
20.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括皰疹病毒載體。
21.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括α病毒載體。
22.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括桿狀病毒載體。
23.權(quán)利要求1的方法，其中基因治療劑包括雜合病毒載體。
24.權(quán)利要求1的方法，其中器官是肝臟。
25.權(quán)利要求1的方法，其中器官是腎臟。
26.權(quán)利要求24的方法，其中在病毒給藥之前用溶液沖洗肝臟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中該溶液是生理鹽水。
28.權(quán)利要求7的方法，其中在病毒給藥之前用溶液沖洗該器官。
29.權(quán)利要求28的方法，其中該器官是肝臟，該溶液是生理鹽水。
30.權(quán)利要求1的方法，其中延長(zhǎng)了停留時(shí)間，并將肝細(xì)胞在肝細(xì)胞加上非肝細(xì)胞之中的分?jǐn)?shù)增加到至少0.8，其中所述的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞位于分離的器官或器官的分離的部分，并表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。
31.權(quán)利要求1的方法，其中在病毒給藥之前用溶液沖洗該器官，其中延長(zhǎng)了步驟d)，并且這樣的延長(zhǎng)將肝細(xì)胞在肝細(xì)胞加上非肝細(xì)胞之中的分?jǐn)?shù)增加到至少0.8，其中所述的肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞位于分離的器官或器官的分離的部分，并表達(dá)由病毒基因治療劑編碼的蛋白。
32.權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)從大約1分鐘到大約4分鐘長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)向哺乳動(dòng)物受試者靶器官的脈管系統(tǒng)中遞送各種藥物，例如基因治療劑的方法。公開(kāi)了在肝臟整體或單個(gè)肝葉中定向基因治療的方法。公開(kāi)的方法依靠以最低限度侵入的導(dǎo)管為基礎(chǔ)的步驟，其中分離出靶器官，并用基因治療劑局部治療。本方法提供了更有效的、組織的局部轉(zhuǎn)染，并非常適合于受試者中的基因治療。
文檔編號(hào)A61F2/958GK101068575SQ200580041379
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月1日
發(fā)明者R·K·朔伊倫, B·L·霍奇斯 申請(qǐng)人:建新公司