專利名稱：具有減少的毒性的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有減少的體內(nèi)毒性的新治療劑，包含新治療劑的組合物，用于在體內(nèi)減少治療劑毒性的方法以及包括施用新治療劑的用于治療患者的方法。
背景技術(shù)：
已嘗試使用抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)來局部遞送細胞毒劑或細胞生長抑制劑，即在癌癥治療中殺死或抑制腫瘤細胞的藥物(Payne，G.(2003)CancerCell 3207-212；Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26151-172；US4975278)。理論上，在全身施用這些未偶聯(lián)的藥物試劑對正常細胞會產(chǎn)生無法接受的毒性水平下，藥物部分應(yīng)靶向腫瘤并被內(nèi)在化(Baldwin等，(1986)Lancet pp.(Mar.15，1986)603-05；Thorpe，(1985)″Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review，″in Monoclonal Antibodies′84Biological And Clinical Applications，A.Pinchera等(編輯)，pp.475-506)。
多克隆抗體和單克隆抗體都已被用于制造ADC(Rowland等，(1986)Cancer Immunol.Immunother.，21183-87)。在這些方法中使用的藥物包括道諾霉素、多柔比星、甲氨喋呤和長春地辛(Rowland等，(1986)同上)?？贵w-毒素偶聯(lián)物中使用的毒素包括諸如白喉毒素的細菌毒素，諸如蓖麻毒蛋白的植物毒素，諸如格爾德霉素(Mandler等(2000)J. of the Nat.Cancer Inst.92(19)1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters101025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate Chem.13786-791)、美登素類(EP1391213；Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 938618-8623)和加利車霉素(Lode等(1998)Cancer Res.582928；Hinman等(1993)CancerRes.533336-3342)的小分子毒素。新近，已將auristatin肽、auristatin E(AE)和monomethylauristatin(MMAE)以及多拉司他汀的合成類似物(WO02/088172)與全長抗體偶聯(lián)(如Klussman，等(2004)，Bioconjugate Chemistry15(4)765-773；Doronina等(2003)Nature Biotechnology 21(7)778-784；Francisco等(2003)Blood 102(4)1458-1465；US2004/0018194；WO04/032828；Mao，等(2004)Cancer Res.64(3)781-788；Bhaskar等(2003)Cancer Res.636387-6394；WO03/043583；Mao等(2004)Cancer Res.64781-788)。在US5767237；US6124431中也披露了auristatin E的變體。
ZEVALIN(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen Idee Inc.)是一種抗體-放射性同位素偶聯(lián)物，由針對見于正常和惡性的B淋巴細胞表面的CD20抗原的鼠IgGlκ單克隆抗體和111In或90Y放射性同位素通過硫脲接頭-螯合劑連接組成(Wiseman等(2000)Eur.J. Nucl.Med.27(7)766-77；Wiseman等(2002)Blood 99(12)4336-42；Witzig等(2002)J. Clin. Oncol.20(10)2453-63；Witzig等(2002)J. Clin.Oncol. 20(15)3262-69)。雖然，ZEVALIN具有針對B-細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，但是在大多數(shù)患者中施用引起嚴重及持久的血細胞減少癥。MYLOTARGTM(吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，一種由連接加利車霉素的CD33抗體組成的抗體藥物偶聯(lián)物，在2000年被批準通過注射用于治療急性髓細胞樣白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)686；US專利號4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。cantuzumab mertansine(Immunogen，Inc.)，一種由通過二硫化物接頭SPP連接美登素類藥物部分DM1的huC242抗體組成的抗體藥物偶聯(lián)物(Xie等(2004)J. of Pharm.and Exp. Ther.308(3)1073-1082)，正進入用于治療表達CanAg的癌癥諸如結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等等的II期試驗。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，一種由連接美登素類藥物部分DM1的抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單克隆抗體組成的抗體藥物偶聯(lián)物，正在開發(fā)用于前列腺腫瘤的潛在治療。
業(yè)已嘗試了多種方法以改善小分子或生物治療劑的半衰期。例如，已將糖基化位點導(dǎo)入分子中(Keyt等，1994，PNAS USA 913670-74)，以及將分子與PEG偶聯(lián)(Clark等，1996，J. Biol.Chem.，27121969-77；Lee等，1999，Bioconjugate Chem.10973-981；Tanaka等，1991，CancerRes.513710-14)以增加分子的大小和增加消除半衰期(elimination half-time)。一些人已嘗試使用人血清清蛋白來改善藥物的治療用途。例如，清蛋白業(yè)已連接上小分子(Syed等，1997，Blood 893243-3252；Burger等，2001 Int.J. Cancer92718-724；Wosikowski K，等，Clin Cancer Res.2003 May 9(5)1917-26)；CD4(Yeh等，1992，PNASUSA 891904-1908)；IgG的Fc部分(Ashkenazi等(1997)Curr.Opin in Immunol.9195-200；IL-2(Yao，Z等，(2004 May)CancerImmunol Immunother.53(5)404-10)以及在抗-gp72抗體和甲氨喋呤分子之間的橋接(Affleck，K等，(1992)Br J Cancer.65(6)838-44)。
還已研究了清蛋白結(jié)合多肽的用途。已報道了與來自鏈球菌G蛋白的清蛋白結(jié)合域融合的人1型可溶性補體受體(sCR1)的體內(nèi)半衰期延長(Makrides等，(1996) J. Pharmacol.Exptl.Ther.277532-541)。已描述了標記的G蛋白的清蛋白結(jié)合域(EP0486,525)。申請人已描述了一些噬菌體展示衍生的清蛋白結(jié)合肽。參見WO01/45746，美國專利公開號2004/0001827，和Dennis，MS，等，(2002)JBC 277(38)35035-43。理論上，血清清蛋白結(jié)合肽在體內(nèi)與血清清蛋白非共價結(jié)合。照此，血清清蛋白結(jié)合肽是血清清蛋白自身從體內(nèi)循環(huán)機制中除去的步驟所必需的。
描述如下的本發(fā)明提出了在上下文與靶向劑/細胞毒劑的偶聯(lián)物中，清蛋白結(jié)合肽的出乎意料的有利用途。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含共價連接的至少一個血清清蛋白結(jié)合部分(SABM)、靶向劑(TA)和細胞毒劑(CA)的組合的偶聯(lián)物分子。根據(jù)一個實施方案，偶聯(lián)物分子包含2個或更多個CA。根據(jù)一個實施方案，偶聯(lián)物分子包含2個或更多個TA。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，SABM包含至少50％同一于DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)序列的氨基酸序列，其中氨基酸序列具有兩個Cys殘基，在Cys殘基之間具有5個氨基酸殘基。根據(jù)一個實施方案，氨基酸序列與SEQ ID NO8具有選自至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性和至少99％同一性的同一性百分數(shù)。
根據(jù)另一個實施方案，SABM包含DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)氨基酸序列的變體，其中除Cys殘基外，SEQ ID NO8的1-5個任何殘基為不同的氨基酸殘基所取代。
根據(jù)另一個實施方案，SABM包含線性或環(huán)狀氨基酸序列，選自Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-XaaPhe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys[SEQ ID NO1]Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe[SEQ ID NO2]Cys-Tyr-Xaal-Pro-Gly-Xaa-Cys[SEQ ID NO3]Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp[SEQ ID NO4]Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys[SEQ ID NO5]；Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp[SEQ ID NO6]；CXXGPXXXXC[SEQ ID NO21]XXXXCXXGPXXXXCXXXX[SEQ ID NO22]CXXXXXXCXXXXXXCCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO23]CCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO24]CCXXXXXCXXXXCXXXXCC[SEQ ID NO25]CXCXXXXXXXCXXXCXXXXXX[SEQ ID NO26]XXXXXDXCLPXWGCLWXXXX[SEQ ID NO155]XXXXDXCLPXWGCLWXXX[SEQ ID NO156]DXCLPXWGCLW[SEQ ID NO423]XXXXDICLPRWGCLWXXX[SEQ ID NO424]，XXXXXDICLPRWGCLWXXXX[SEQ ID NO425]XXEMCYFPGICWMXX[SEQ ID NO426]XXDLCLRDWGCLWXX[SEQ ID NO427]其中X是任意氨基酸殘基。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，上述通式的SABM序列，特別是SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，在N-末端(Xaa)x和C-末端(Xaa)z處包含額外的氨基酸，其中Xaa是一種氨基酸，x和z是大于或等于0(零)的整數(shù)，一般小于100，優(yōu)選小于10以及更優(yōu)選為0，1，2，3，4或5，更優(yōu)選4或5，Xaa1選自Ile、Phe、Tyr和VaI。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含序列DICLPRWGCLW[SEQ ID NO 8]的清蛋白結(jié)合肽的用途。根據(jù)一個實施方案，SABM包含任一選自SEQ ID NOs7-20、27-154和157-421的氨基酸序列。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，SABM包含選自SEQID NOs7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列。
根據(jù)另一個實施方案，SABM包含下列氨基酸序列Xaai-Cys-Xaaj-Cys-Xaak，其中i、j和k的和為約25或更少，Xaa是任意氨基酸殘基。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，i、j和k的和為約18個殘基或更少。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，i、j和k的和為約11個殘基或更少。
根據(jù)另一個實施方案，SABM包含表1-9中所描述的任意一個的肽序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所有上述的SABM序列與血清清蛋白結(jié)合，具有約100μM或更低的Kd。根據(jù)另一個實施方案，Kd選自約10μM或更小、約1μM或更小、約500nM或更小、約100nM或更小、約50nM或更小和約10nM或更小。
根據(jù)另一個實施方案，TA是包含能與靶細胞表面蛋白結(jié)合的氨基酸序列的多肽，其中TA包含細胞表面蛋白的配體、粘附素或抗體、或能與細胞表面蛋白結(jié)合的上述任一的片段的氨基酸序列。根據(jù)一個實施方案，要被靶向的細胞表面蛋白是B細胞表面標志。根據(jù)另一個實施方案，要被靶向的受體選自HER2、CD20、EGFR、PDGFR、BR3、Flt-1、KDR和EphB2。根據(jù)另一個實施方案，TA是針對任一那些受體的抗體。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，抗體以任一下列形式存在Fab、F(ab)2、scFv和雙抗體。根據(jù)另一個實施方案，TA包含本文中所述的VH或VL序列(如包含SEQ ID NO428和429的抗原結(jié)合部分的抗-HER2抗體)。
根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428和429的可變區(qū)。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列的變體，其中至少一個或多個選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的Q27(VL)、D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)和T94(VL)的氨基酸為除丙氨酸之外的任何氨基酸所取代。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列的變體，其中可變區(qū)的至少一個或多個氨基酸具有選自D28(VL)Q、D28(VL)G、N30(VL)S、T31(VL)S、A32(VL)G、Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V、F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、Y92(VL)W和T94(VL)S的取代。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列的變體，其中可變區(qū)包含至少三個取代Y49(VL)D、F53(VL)W和Y55(VL)W。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列的變體，其中可變區(qū)包含至少三個取代N30(VL)S、H91(V1)F和Y92(VL)W。
根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，其中至少一個或多個選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Y100a(VH)和Y102(VH)的氨基酸為除丙氨酸之外的任何氨基酸所取代。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ IDNO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，其中可變區(qū)包含至少一個或多個選自W95(VH)Y、D98(VH)W、D98(VH)R、D98(VH)K、D98(VH)H、F100(VH)P、F100(VH)L、F100(VH)M、F100(VH)W、Y100a(VH)F、Y102(VH)V、Y102(VH)K和Y102(VH)L的取代。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，其中可變區(qū)包含至少F100(VH)P和Y102(VH)K的取代。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，其中可變區(qū)包含至少F100(VH)P和Y102(VH)L的取代。
根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，其中至少一個或多個選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、T94(VL)、W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Y100a(VH)和Y102(VH)的氨基酸為除丙氨酸之外的任何氨基酸所取代。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，包含至少一個或多個下列取代D28(VL)Q、D28(VL)G、N30(VL)S、T31(VL)S、A32(VL)G、Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V、F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、Y92(VL)W、T94(VL)S、W95(VH)Y、D98(VH)W、D98(VH)R、D98(VH)K、D98(VH)H、F100(VH)P、F100(VH)L、F100(VH)M、Y100a(VH)F、Y102(VH)V、Y102(VH)K和Y102(VH)L。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，包含至少下列的取代Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P和Y102(VH)K。根據(jù)一個實施方案，抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428的輕鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO429的重鏈可變區(qū)序列的變體，包含至少下列的取代Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P和Y102(VH)L。根據(jù)另一個實施方案，所述抗-HER2抗體是任何披露于2003年4月9日提交的美國專利公開號2003/0228663A1；WO03/087131；Carter等，(1992)PNAS894285-4289的抗-HER2抗體，這些出版物在此特別并入作為參考。
根據(jù)一個實施方案，除與細胞外表面上的蛋白質(zhì)結(jié)合的能力之外，TA具有額外的生物活性。根據(jù)另一個實施方案，所述其他的生物活性是阻斷配體介導(dǎo)的細胞通過細胞發(fā)信號的能力。根據(jù)另一個實施方案，所述其他的生物活性是誘導(dǎo)被靶向的細胞凋亡的能力。根據(jù)另一個實施方案，TA是與所考慮的細胞上的蛋白質(zhì)結(jié)合，具有選自10uM或更小、1uM或更小、500nm或更小、100nm或更小和10nm或更小的Kd的多肽。
根據(jù)一個實施方案，與正常細胞相比，TA結(jié)合的感興趣細胞上的蛋白質(zhì)在癌細胞中過表達。根據(jù)另一個實施方案，被TA靶向的細胞是致病細胞，諸如腫瘤細胞。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，細胞毒劑是monomethylauristatin(MMAE)。
根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，偶聯(lián)物分子包含位于所述SABM和靶向劑或細胞毒劑之間的接頭部分。在一個實施方案中，接頭部分包含氨基酸序列GGGS(SEQ ID NO422)。
根據(jù)另一個實施方案，SABM與人清蛋白結(jié)合。根據(jù)另一個實施方案，SABM被偶聯(lián)至TA的重鏈或輕鏈可變區(qū)的N-或C-末端區(qū)。
本發(fā)明提供了包含與藥用載體混合的偶聯(lián)物分子的組合物。本發(fā)明還提供了偶聯(lián)物分子在藥物制備中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了用于減少治療劑毒性的方法，包括用偶聯(lián)有治療劑的血清清蛋白結(jié)合部分(SABM)產(chǎn)生治療劑的步驟。該方法可進一步包括比較具有SABM的治療劑與沒有SABM的治療劑的毒性的步驟。根據(jù)一個實施方案，該方法進一步包括測定治療劑SABM偶聯(lián)物毒性的步驟。
本發(fā)明提供了減少哺乳動物中治療劑毒性的方法，包括給哺乳動物施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物分子。根據(jù)一個實施方案，該方法進一步包括測定治療劑SABM偶聯(lián)物毒性的步驟。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，哺乳動物患有自身免疫性疾病或癌癥。
本發(fā)明提供了治療哺乳動物中腫瘤的方法，包括用治療有效量的與腫瘤細胞或腫瘤周圍的脈管系統(tǒng)結(jié)合的本發(fā)明的偶聯(lián)物分子處理患有腫瘤的哺乳動物的步驟。本發(fā)明還提供了治療哺乳動物中自身免疫性紊亂的方法，包括用治療有效量的本發(fā)明的偶聯(lián)物分子處理患有自身免疫性紊亂的哺乳動物的步驟。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，偶聯(lián)物分子與有助于或引起自身免疫性紊亂的B-細胞結(jié)合。本發(fā)明還提供了治療哺乳動物中細胞增殖性紊亂的方法，包括用治療有效量的本發(fā)明的偶聯(lián)物分子處理患有細胞增殖性紊亂的哺乳動物的步驟。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了用于消減哺乳動物中B細胞的方法，包括用治療有效量的與B細胞結(jié)合的本發(fā)明的偶聯(lián)物分子處理哺乳動物的步驟。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的治療方法進一步包括測定哺乳動物中偶聯(lián)物分子的毒性的步驟。
根據(jù)一個實施方案，毒性顯示為選自體重減輕、造血毒性、腎毒性、肝毒性、胃腸毒性、減少的定向造血干細胞(造血祖細胞)由骨髓至外周血的動員、貧血、骨髓抑制、各類血細胞減少、血小板減少、嗜中性粒細胞減少、淋巴細胞減少、白細胞減少、口炎、脫發(fā)、頭痛和肌肉痛的任一項。
本發(fā)明還提供了包含容器、在容器中的包含本發(fā)明的偶聯(lián)物分子的組合物、含有施用治療有效劑量的使用說明的包裝插頁的產(chǎn)品。
附圖簡述

圖1顯示了在注射對照媒介(圓形)、Herceptin-vc-Pab-MMAE(正方形)、Ab.Fab4D5-H-vc-PAB-MMAE(菱形)、Fab3D4-vc-PAB-MMAE(三角形)和Ab.Fab對照-vc-PAB-MMAE(空心圓形)之后，隨著時間的過去的腫瘤體積。
圖2顯示了在施用Herceptin-vc-MMAE(正方形)、Herceptin-F(ab′)24D5-vc-MMAE(十字形)、游離MMAE(圓形)之后，體重的組變化(groupchange)。
圖3顯示了在施用Herceptin-vc-MMAE(菱形)、Fab4D5-vc-MMAE(三角形)、AB.Fab4D5-H-vc-MMAE(圓形)和PBS(正方形)之后，體重的組變化。
圖4顯示了人源化抗-HER2抗體的輕鏈可變區(qū)[SEQ ID NO428]和人源化抗-HER2抗體的重鏈可變區(qū)[SEQ ID NO429]的氨基酸序列。
優(yōu)選實施方案的詳述I.定義術(shù)語“血清清蛋白結(jié)合肽”或“血清清蛋白結(jié)合部分”(“SABM”)指包含結(jié)合血清清蛋白的氨基酸序列的化合物或多肽。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，SABM結(jié)合人血清清蛋白。根據(jù)一個實施方案，SABM包含至少一個序列表中所述的結(jié)合兔、大鼠、小鼠或人血清清蛋白的任一序列。根據(jù)另一個實施方案，SABM包含至少一個序列表中所述的結(jié)合多種物種的血清清蛋白的任一序列。根據(jù)一個實施方案，SABM包含至少一個表1-9中所述的結(jié)合兔、大鼠、小鼠或人血清清蛋白中任何一種或組合的任一序列。根據(jù)另一個實施方案，SABM包含至少一個表1-9中所述的結(jié)合多種物種的血清清蛋白的任一序列。多種物種結(jié)合物的例子包括那些至少結(jié)合人和大鼠血清清蛋白的SABM；那些至少結(jié)合人、大鼠和兔血清清蛋白的；那些至少結(jié)合人和兔血清清蛋白的；及那些至少結(jié)合人和小鼠血清清蛋白的。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，SABM肽是能結(jié)合清蛋白的非天然存在的氨基酸序列。在本發(fā)明上下文中的SABM可以是小于約50個氨基酸殘基，優(yōu)選小于約40個氨基酸殘基的受約束的(也就是說，具有一些結(jié)構(gòu)元件，例如，存在起始β-轉(zhuǎn)角或β-折疊片的氨基酸，或者例如，通過成二硫鍵的Cys殘基的存在而環(huán)化)或無約束的(線性)氨基酸序列。小于約40個氨基酸殘基的SABM優(yōu)選是在約10個至約30個氨基酸殘基之間的SABM，特別是約20個氨基酸殘基的SABM。但是，在閱讀本公開書后，熟練的技術(shù)人員應(yīng)當認識到不是特定SABM的長度，而是其與清蛋白結(jié)合的能力才能用于辨別本發(fā)明的SABM。
本發(fā)明的“靶向劑”或“TA”會以足夠的親和力和特異性結(jié)合細胞表面上的靶分子，如果TA在體外及優(yōu)選在體內(nèi)“歸巢”至、“結(jié)合”或“靶向”靶分子，諸如攜帶靶分子的特定細胞類型的話(參見例如，Pasqualini和Ruoslahti，1996 Nature，380364-366和Arap等，1998 Science，279377-380中術(shù)語“歸巢至”、“歸巢”和“靶向”的應(yīng)用)。一般而言，TA會以特征為解離常數(shù)Kd小于約10μM、優(yōu)選小于約100nM和小于約10nM的親和力結(jié)合靶分子。但是，在本發(fā)明上下文中，對靶分子具有小于約1nM和優(yōu)選在約1pM和1nM之間的親和力的多肽或小分子同樣可能勝任TA。優(yōu)選地，TA是多肽(如抗體)。一般而言，可通過任何一種本領(lǐng)域已知的諸多技術(shù)分離并鑒定上述與特定靶分子結(jié)合的TA。
TA是上述可含有天然及非天然存在的氨基酸殘基的氨基酸序列，諸如噬菌體展示衍生的抗體。在本發(fā)明上下文中，所謂的包括模擬特定氨基酸或肽的非氨基酸化學(xué)結(jié)構(gòu)的“肽模擬物”和“肽類似物”可以是TA。這樣的模擬物或類似物通常表征為展現(xiàn)見于它們的肽對應(yīng)物中的，存在于適當?shù)目臻g取向中的類似的物理特性，諸如大小、電荷或疏水性。肽模擬化合物的一個具體例子是其中一個或多個氨基酸之間的酰胺鍵為例如碳-碳鍵或其他本領(lǐng)域眾所周知的鍵所取代的化合物(參見例如Sawyer，1995，InPeptideBased Drug Design pp.378-422，ACS，Washington DC)。
“B細胞表面標志”或“B細胞表面抗原”在本文中指在B細胞表面上表達、可用結(jié)合它的拮抗劑靶向它的抗原。例示性B細胞表面標志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白細胞表面標志(描述參見《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等人編，AcademicPress，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B細胞表面標志包括RP105、FcRH2、CD79A、C79B、CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、BTLA、NAG14(aka LRRC4)、SLGC16270(ala LOC283663)、FcRH1、IRTA2、ATWD578(aka MGC15619)、FcRH3、IRTA1、FcRH6(akaLOC343413)和BCMA(aka TNFRSF17)。
特別感興趣的B細胞表面標志在B細胞上較之哺乳動物的其它非B細胞組織優(yōu)先表達，且可在前體B細胞和成熟B細胞二者上表達。本文中優(yōu)選的B細胞表面標志是CD20和CD22。
“CD20”抗原是在超過90％來自外周血或淋巴樣器官的B細胞表面上發(fā)現(xiàn)的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細胞發(fā)育過程中表達，并保留至漿細胞分化。CD20存在于正常B細胞以及惡性B細胞二者上。CD20在文獻中的其它名稱包括“B淋巴細胞限制抗原”B1和“Bp35”。CD20抗原記載于例如Clark et al.，PNAS(USA)821766(1985)。人CD20的氨基酸序列顯示于《The Leukocyte Antigen Facts Book》，Barclay等人，見上文，第182頁；及EMBL基因庫編號X12530和Swissprot P11836。
“CD22”抗原，也稱為BL-CAM或Lyb8，是分子量約130(縮短的)至140kD(未縮短的)的1型整合膜糖蛋白。它在B淋巴細胞的細胞質(zhì)和細胞膜二者中表達。CD22抗原在B細胞淋巴細胞分化的早期出現(xiàn)，大約在與CD19抗原相同的階段。與其它B細胞標志不同，CD22膜表達局限于成熟B細胞(CD22+)和漿細胞(CD22-)之間包含的分化晚期。CD22抗原記載于例如Wilson et al.，J. Exp.Med. 173137(1991)和Wilson et al.，J.Immunol.1505013(1993)。
“CD19”抗原指通過例如HD237-CD19或B4抗體鑒定的抗原(Kiesel etal.，Leukemia Research II 121119(1987))。CD19見于原B細胞、前B細胞、未成熟的和成熟的、激活的及記憶B細胞上，直到終未分化成漿細胞之前的那一刻。CD19和CD20兩者都不在造血干細胞或漿細胞上表達。拮抗劑對CD19的結(jié)合可引起CD19抗原的內(nèi)在化。人CD19的氨基酸序列顯示于《The Leukocyte Antigen Facts Book》，Barclay等人，見上文，第180頁；及EMBL基因庫編號M28170和Swissprot P11836。
在用于本文時，“B細胞消減”指在藥物或抗體處理后，與處理前的水平相比，動物或人中B細胞水平的降低。B細胞水平可使用已知測定法測量，諸如通過獲取全部血細胞計數(shù)，通過對已知B細胞標記染色的FACS分析，及通過諸如實驗實施例中描述的方法。B細胞消減可以是部分的或完全的。在一個實施方案中，表達CD20的B細胞的消減是至少25％。在接受B細胞消減藥的患者中，B細胞消減的持續(xù)時間通常是藥物在患者體內(nèi)循環(huán)的時間及B細胞恢復(fù)的時間。
因此，術(shù)語“氨基酸”在本發(fā)明的范圍內(nèi)以其最廣義使用，意圖包括天然存在的Lα-氨基酸或殘基。本文中使用了天然存在氨基酸的常用單字母和三字母縮寫(Lehninger，A.L.，1975，《Biochemistry》，第2版，第71-92頁，Worth Publishers，New York)。標準單字母代碼和標準三字母代碼之間的對應(yīng)關(guān)系是熟練技術(shù)人員眾所周知的，復(fù)述于此A＝Ala；C＝Cys；D＝Asp；E＝Glu；F＝Phe；G＝GIy；H＝His；I＝Ile；K＝Lys；L＝Leu；M＝Met；N＝Asn；P＝Pro；Q＝Gln；R＝Arg；S＝Ser；T＝Thr；V＝VaI；W＝Trp；Y＝Tyr。該術(shù)語包括D-氨基酸以及經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸諸如氨基酸類似物，通常不摻入蛋白質(zhì)的天然存在氨基酸諸如正亮氨酸，及具有本領(lǐng)域已知為氨基酸特征之特性的化學(xué)合成化合物。例如，容許與天然苯丙氨酸或脯氨酸相同的對肽化合物的構(gòu)象限制的Phe或Pro類似物或模擬物包括在氨基酸的定義內(nèi)。這樣的類似物和模擬物在本文中稱為氨基酸的“功能等效物”。氨基酸的其它例子列于Roberts和Vellaccio，1983，在《The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology》中，Gross和Meiehofer編，第5卷，第341頁，Academic Press，Inc.，N.Y.，收入本文作為參考。
通過例如標準固相合成技術(shù)合成的SABM和TA不限于基因編碼的氨基酸。通常遇到的、不是遺傳密碼編碼的氨基酸包括例如那些國際公開號WO90/01940中記載的，諸如例如對于Glu和Asp的2-氨基己二酸(Aad)；對于Glu和Asp的2-氨基庚二酸(Apm)；對于Met、Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基丁酸(Abu)；對于Met、Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基庚酸(Ahe)；對于Gly的2-氨基異丁酸(Aib)；對于Val、Leu和Ile的環(huán)己基丙氨酸(Cha)；對于Arg和Lys的高精氨酸(Har)；對于Lys、Arg和His的2，3-二氨基丙酸(Dpr)；對于Gly、Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；對于Gly、Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGly)；對于Asn和Gln的N-乙基天冬酰胺(EtAsn)；對于Lys的羥基賴氨酸(Hyl)；對于Lys的別羥基賴氨酸(AHyl)；對于Pro、Ser和Thr的3-(和4-)-羥基脯氨酸(3Hyp，4Hyp)；對于Ile、Leu和Val的別異亮氨酸(AIle)；對于Ala的對脒基苯丙氨酸；對于Gly、Pro和Ala的N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)；對于Ile的N-甲基異亮氨酸(MeIle)；對于Met和其它脂肪族氨基酸的正纈氨酸(Nva)；對于Met和其它脂肪族氨基酸的正亮氨酸(Nle)；對于Lys、Arg和His的鳥氨酸(Orn)；對于Thr、Asn和Gln的瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亞砜(MSO)；對于Phe的N-甲基苯丙氨酸(MePhe)、三甲基苯丙氨酸、鹵代(F，Cl，Br和I)苯丙氨酸、三芴基苯丙氨酸。
SABM和TA在本發(fā)明的語境中可以是“(工程)改造的”，即可以是非天然的或非天然存在的TA?！胺翘烊坏摹被颉胺翘烊淮嬖诘摹币馕吨囟⊿ABM的氨基酸序列在自然界中找不到。也就是說，非天然的或非天然存在的TA或SABM的氨基酸序列無需對應(yīng)于天然存在蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列。這種TA或SABM可使用多種技術(shù)生成或選擇，包括那些熟練技術(shù)人員眾所周知的。例如，利用本領(lǐng)域標準技術(shù)，例如Lowman et al.，1998，Biochemistry 378870-8878，可在噬菌體上隨機產(chǎn)生并展示受約束或無約束的肽文庫。
SABM和TA及細胞毒劑在本發(fā)明的語境中使用時可彼此“偶聯(lián)”。術(shù)語“偶聯(lián)”以其最廣義使用，涵蓋本領(lǐng)域已知的共價附著或連接的所有方法。例如，在一個典型的實施方案中，SABM是一種蛋白質(zhì)，TA是SABM的C-或N-末端的一段氨基酸延伸。另外，短氨基酸接頭序列可位于蛋白質(zhì)治療劑和SABM之間。在這種情況中，SABM、任選的接頭和TA將由這樣的核酸編碼，它包含編碼SABM的序列且其可操作連接(就DNA序列是連續(xù)的且處于讀碼框中)任選的編碼如下所述的短多肽的接頭序列和編碼TA的序列。在該典型情況中，認為SABM與TA任選經(jīng)接頭序列“偶聯(lián)”。在一個相關(guān)實施方案中，SABM氨基酸序列可中斷或取代TA氨基酸序列的一部分，當然，倘若SABM氨基酸序列的插入不干擾蛋白質(zhì)治療劑的功能的話。在另一個典型的實施方案中，SABM將與TA或其它治療劑任選經(jīng)接頭序列通過例如化學(xué)偶聯(lián)而連接。典型的是，根據(jù)此實施方案，SABM將與TA經(jīng)TA中部不干擾TA識別靶活性的能力的某處氨基酸的側(cè)鏈連接。再次，認為SABM與TA“偶聯(lián)”。
術(shù)語“抗體”以最廣義使用，具體覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望生物學(xué)活性。
本發(fā)明抗體的“功能性片段”包含完整抗體的一部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)或者保留FcR結(jié)合能力的抗體Fc區(qū)?？贵w片段的例子包括線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異的，每種針對一種或兩種抗原性位點，通常是一種位點。另外，與針對一種抗原由動物衍生使得數(shù)種抗體針對不同決定簇(表位)的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler et al.，Nature 256495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見如美國專利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可使用例如Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J. Mol. Biol.222581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及這樣的抗體的片段，只要它們展現(xiàn)期望生物學(xué)活性(美國專利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。制備嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。
非人(如鼠)抗體的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。在極大程度上，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體互補決定區(qū)(CDR)的殘基為具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基所取代。在有些情況中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基為相應(yīng)非人殘基所取代。此外，人源化抗體可包含在受體抗體和輸入CDR或框架序列中都未找到的殘基。進行這些修飾以進一步改善和最大化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個，通常兩個基本上整個可變區(qū)，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些，盡管FR區(qū)可包含一處或多處改善結(jié)合親和力的氨基酸替代。FR中這些氨基酸替代的數(shù)目通常在H鏈中不超過6個，在L鏈中不超過3個。人源化抗體最好還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。更多細節(jié)參見Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature 332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。人源化抗體包括PRIMATIZED抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過例如用目的抗原免疫獼猴產(chǎn)生的抗體。制備人源化抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。
還可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)生成人抗體，包括噬菌體展示庫。Hoogenboom and Winter，J. Mol. Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體。Cole等人，《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》，Alan R.Liss，第77頁，1985；Boerner et al.，J. Immunol.147(1)86-95(1991)。
在用于本文時，術(shù)語“免疫粘附素”指將異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)物功能聯(lián)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不同于抗體的抗原識別和結(jié)合位點(即是“異源”的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受體或配體的結(jié)合位點的連續(xù)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列可從任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
“融合蛋白”和“融合多肽”指具有至少兩個共價連接的部分的多肽，其中每個部分是具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物學(xué)特性，諸如體外或體內(nèi)活性。所述特性還可以是簡單的化學(xué)或物理特性，諸如與靶分子的結(jié)合、催化反應(yīng)等。所述部分可通過單個肽鍵直接連接，或者經(jīng)由包含一個或多個氨基酸殘基的肽接頭。通常，所述部分和接頭將彼此處于讀碼框中。
“分離的”多肽或抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該多肽或抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測定，抗體重量超過95％，最優(yōu)選重量超過99％，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分將不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。
人源化抗ErbB2(HER2)抗體包括如美國專利5,821,337表3中記載的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，明確收入本文作為參考；如共同未決的申請流水號09/811115中記載的人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4抗體，及包含WO03/087131和美國專利公開號2003/0228663中披露的抗HER2變體的可變區(qū)的抗體，收入本文作為參考。在整篇公開書中，術(shù)語“huMAb4D5-8”和“hu4D5-8”可互換使用。
術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。細胞毒劑應(yīng)當能夠內(nèi)在化和/或能夠從細胞外抑制細胞生長而無需結(jié)合細胞表面。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，該藥劑是小分子。根據(jù)另一個實施方案，細胞毒劑的活性部分是1100道爾頓或更小。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，如At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Bi213、P32和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素(如MMAE)，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤或抗癌藥或者生長抑制劑。下文描述了其它細胞毒劑。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，細胞毒劑不是放射性同位素。
“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的例子包括烷化劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(參見如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994))；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptinium acetate；埃坡霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖復(fù)合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；GEMZAR吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春堿(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；NAVELBINE長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)；奧沙利鉑(oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras和EGFR的抑制劑(如erlotinib(TarcevaTM))；及任何上述物質(zhì)的制藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。
“生長抑制劑”在用于本文時指在體外和/或在體內(nèi)抑制細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、TAXOL紫杉醇(paclitaxel)、和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見《The Molecular Basis ofCancer)》，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為“Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13頁。
“生長抑制劑”的例子包括表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(如erlotinib(TarcevaTM))，血小板衍生生長因子抑制劑(如GleevecTM(甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制劑(如塞來考昔(celecoxib))和其它生物活性及有機化學(xué)劑等。
術(shù)語“治療有效量”指偶聯(lián)物分子有效“減輕”或“處置”受試者中疾病或紊亂的量。就偶聯(lián)物分子可防止現(xiàn)有癌細胞生長和/或殺死其而言，它可以是抑制細胞的和/或毒害細胞的(細胞毒性的)。
“處置”或“治療”指疾病或紊亂的改善或緩解。需要處置的受試者包括早就患有紊亂的受試者以及要預(yù)防紊亂的受試者。如果在依照本發(fā)明的方法接受治療量的偶聯(lián)物后，患者在特定疾病的一項或多項征候和癥狀中顯示出可觀察和/或可測量的降低或消失，那么受試者成功“治療”了癌癥或自身免疫病。例如，對于癌癥，癌細胞數(shù)減少或癌細胞消失；腫瘤體積縮小；腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤生長受到一定程度的抑制；消退期延長；和/或與特定癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀得到一定程度的減輕；發(fā)病率和死亡率降低；及生命質(zhì)量提高。疾病的征候或癥狀的減輕還可以由患者感受到。處置可實現(xiàn)完全響應(yīng)，定義為癌癥的所有征候消失，或者部分響應(yīng)，其中腫瘤體積縮小，優(yōu)選超過50％，更優(yōu)選75％。如果患者病情穩(wěn)定，那么該患者也視為得到治療。在一個優(yōu)選的實施方案中，癌癥患者在1年后，優(yōu)選在1 5個月后癌癥仍然沒有進展。用于評估疾病的成功治療和改善的這些參數(shù)易于通過本領(lǐng)域具有適當技能的醫(yī)師所熟悉的常規(guī)流程測量。在一個優(yōu)選的實施方案中，與可接受缺少SABM的相同偶聯(lián)物分子處置的受試者相比，受試者顯示不適的改善，同時經(jīng)受的副作用更少。
術(shù)語“癌癥”和“癌性的”指或描述哺乳動物中典型的以細胞生長不受調(diào)節(jié)為特征的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌(如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝瘤(hepatoma)、乳癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝的癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、腦癌、以及頭和頸癌，及相關(guān)轉(zhuǎn)移。
術(shù)語“細胞增殖性紊亂”和“增殖性紊亂”指與一定程度的異常細胞增殖有關(guān)的紊亂。在一個實施方案中，細胞增殖性紊亂是癌癥。
“腫瘤”在用于本文時指所有瘤性細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。
B細胞調(diào)節(jié)的自身免疫病包括關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎)，銀屑病，皮炎包括特應(yīng)性皮炎；慢性自身免疫性蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮壞死松解癥，系統(tǒng)性硬皮病和硬化，與炎性腸病(IBD)有關(guān)的應(yīng)答(克羅恩氏(Crohn)病、潰瘍性結(jié)腸炎)，呼吸窘迫綜合征，成人型呼吸窘迫綜合征(ARDS)，腦膜炎，變應(yīng)性鼻炎，腦炎，葡萄膜炎，結(jié)腸炎，腎小球腎炎，變應(yīng)性狀況，濕疹，哮喘，牽涉T細胞浸潤和慢性炎性應(yīng)答的狀況，動脈粥樣硬化，自身免疫性心肌炎，白細胞粘附缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡(包括狼瘡腎炎、非腎狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡脫發(fā))，幼發(fā)型糖尿病，多發(fā)性硬化，變應(yīng)性腦脊髓炎，與細胞因子和T-淋巴細胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答、結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病包括韋格納氏(Wegener)肉芽腫病，粒細胞缺乏，血管炎(包括ANCA)，再生障礙性貧血，庫姆斯氏(Coombs)陽性貧血，戴-步二氏(Diamond Blackfan)貧血，免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)，惡性貧血，純紅細胞再生障礙(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒細胞減少癥，全血細胞減少癥，白細胞減少癥，牽涉白細胞滲出的疾病，CNS炎性紊亂，多器官損傷綜合征，重癥肌無力，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基膜疾病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，貝切特氏(Bechet)病，卡斯爾曼氏(Castleman)綜合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)綜合征，蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無力綜合征，雷諾氏(Reynaud)綜合征，斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征，史-約二氏(Stevens-Johnson)綜合征，實體器官移植排斥(包括預(yù)處理針對高反應(yīng)性抗體滴度組、組織中的IgA沉積等)，移植物抗宿主病(GVHD)，大皰性類天皰瘡，天皰瘡(都包括尋常型、落葉型)，自身免疫性多內(nèi)分泌腺病，萊特氏(Reiter)病，僵人綜合征，巨細胞動脈炎，免疫復(fù)合物腎炎，IgA腎病，IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性甲狀腺功能減退癥；自身免疫性內(nèi)分泌病，包括自身免疫性甲狀腺炎，慢性甲狀腺炎(橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎)，亞急性甲狀腺炎，特發(fā)性甲狀腺功能減退癥，阿狄森氏(Addison)病，格雷夫斯氏(Graves)病，自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)，I型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和席漢氏(Sheehan)綜合征；自身免疫性肝炎，淋巴樣間質(zhì)性肺炎(HIV)，梗阻性細支氣管炎(非移植)較之NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barre)綜合征，大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細胞(高安氏(Takayasu))動脈炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和結(jié)節(jié)性多動脈炎)，強直性脊柱炎，貝格爾氏(Berger)病(IgA腎病)，急進性腎小球性腎炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)，冷球蛋白血癥，ALS，冠狀動脈病。
B細胞瘤包括CD20陽性何杰金氏(Hodgkin)病，包括淋巴細胞為主型的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞性白血病(ALL)；慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；毛細胞白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低級/濾泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞(SL)NHL、中級/濾泡NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞NHL、高級成淋巴細胞NHL、高級小無核裂細胞NHL、貯積病(bulky disease)NHL、類漿細胞淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥。還設(shè)想了這些癌癥復(fù)發(fā)的處置。LPHD是一類在放射或化療處置后仍趨于頻繁復(fù)發(fā)的何杰金氏病，特征為CD20陽性的惡性細胞。CLL是白血病的四種主要類型之一。稱為淋巴細胞的成熟B細胞的一種癌癥，CLL表現(xiàn)為細胞在血液、骨髓和淋巴組織中漸進累積。緩慢進展淋巴瘤是一種緩慢發(fā)展的不治之癥，其中在多個緩解和復(fù)發(fā)期后，患者的平均存活為6-10年。
為了處置的目的，“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選的是，哺乳動物指人。將依照本發(fā)明處置的受試者是哺乳動物。
“紊亂”指將受益于包含本發(fā)明偶聯(lián)物分子的組合物的處置的任何狀況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括那些使哺乳動物易患所討論紊亂的病理狀況。
“消除半衰期”以其通常含義使用，如《Goodman and Gillman′s ThePharmaceutical Basis of Therapeutics》，第21-25頁，Alfred Goodman Gilman，Louis S.Goodman和Alfred Gilman編，第6版，1980中所述。簡而言之，該術(shù)語意圖涵蓋藥物消除時程的定量測量。由于藥物濃度通常未達到那些飽和消除過程所要求的，因此大多數(shù)藥物的消除是指數(shù)式的(即遵循一級動力學(xué))。指數(shù)過程的速率可表述為其速率常數(shù)，k，其表示每單位時間分數(shù)變化，或者表述為其半衰期，t，所述過程完成50％所需要的時間。這兩個常數(shù)的單位分別是時間-1和時間。反應(yīng)的一級速率常數(shù)和半衰期是簡單相關(guān)的(kxt＝0.693)，因此可互換。由于一級消除動力學(xué)指示每單位時間藥物喪失的恒定分數(shù)，因此藥物濃度的對數(shù)對時間的曲線在初始分布階段后(即在藥物吸收和分布完成后)一直是線性的?？筛鶕?jù)這樣的圖精確測定藥物消除的半衰期。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，與缺少SABM的偶聯(lián)物分子相比，本發(fā)明的偶聯(lián)物分子具有更長的半衰期和更低的毒性。
“轉(zhuǎn)染”指宿主細胞對表達載體的攝取，不管任何編碼序列事實上是否表達。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道多種轉(zhuǎn)染方法，例如CaPO4沉淀和電穿孔。當宿主細胞內(nèi)出現(xiàn)該載體運轉(zhuǎn)的任何跡象時，一般認為轉(zhuǎn)染是成功的。
“轉(zhuǎn)化”指將DNA導(dǎo)入生物體使得DNA可復(fù)制，或是作為染色體外元件或是作為染色體組成部分。根據(jù)所用宿主細胞，使用適于此類細胞的標準技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。如Sambrook等人，1989，《Molecular Cloning》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，NY的1.82節(jié)所述，采用氯化鈣的鈣處理通常用于原核生物或具有堅固細胞壁屏障的其它細胞。如Shaw et al.，Gene 23315(1983)和1989年6月29日公開的WO89/05859所述，使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于轉(zhuǎn)化某些植物細胞。對于沒有此類細胞壁的哺乳動物細胞，優(yōu)選Sambrook等人，見上文的16.30-16.37節(jié)中所描述的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般情況已記載于1983年8月16日公告的Axel的美國專利4,399,216。酵母的轉(zhuǎn)化通常依照VanSolingen et al.，J. Bact.130946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)763829(1979)的方法進行。然而，也可使用將DNA導(dǎo)入細胞的其它方法，諸如通過核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合。
在用于本文時，術(shù)語“肺部施藥”指通過吸入經(jīng)肺施用本發(fā)明的配制劑。在用于本文時，術(shù)語“吸入”指攝入空氣至肺泡。在具體的例子中，攝入可通過吸氣時本發(fā)明配制劑的自我施用，或者通過經(jīng)呼吸機如給予呼吸機上的患者的施用而發(fā)生。關(guān)于本發(fā)明的配制劑使用時，術(shù)語“吸入”與“肺部施藥”同義。
在用于本文時，術(shù)語“腸胃外”指通過除腸之外的途徑將本發(fā)明的化合物導(dǎo)入體內(nèi)，特別是靜脈內(nèi)(i.v.)、動脈內(nèi)(i.a.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、肌肉內(nèi)(i.m.)、心室內(nèi)和皮下(s.c.)路徑。
在用于本文時，術(shù)語“氣霧劑”指空氣中的懸浮液。具體而言，氣霧劑指本發(fā)明配制劑的顆?；?particlization)及其在空氣中的懸浮。根據(jù)本發(fā)明，氣霧劑劑型是一種包含本發(fā)明的化合物，適于在空氣中氣霧化(aerosolization)即顆?；蛻腋。┪牖蚍尾渴┧幍膭┬?。
II.實施本發(fā)明的方式A.SABM本發(fā)明語境中的SABM結(jié)合清蛋白。優(yōu)選的結(jié)合血清清蛋白的SABM包括線性肽和環(huán)狀肽，優(yōu)選包含下列公式的環(huán)狀肽化合物或為與下列公式的肽競爭結(jié)合特定哺乳動物物種的血清清蛋白的肽Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-XaaPhe-Cys-Xaa-Asp-Typ-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys[SEQ ID NO1]Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe[SEQ ID NO2]Cys-Tyr-Xaa1-Pro-Gly-Xaa-Cys[SEQ ID NO3]知Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp[SEQ ID NO4]優(yōu)選的是在N-末端(Xaa)x和C-末端(Xaa)z包含額外的氨基酸的前述通式的肽化合物，其中Xaa是氨基酸，x和z是大于或等于0(零)的整數(shù)，一般小于100，優(yōu)選小于10，更優(yōu)選0、1、2、3、4或5，還優(yōu)選4或5，并且其中Xaa選自Ile、Phe、Tyr和Val。
更優(yōu)選的結(jié)合血清清蛋白的SABM規(guī)定為在本文的語境中所描述的下列通式Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys(SEQ ID NO5)and Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp[SEQ ID NO6]其中額外的氨基酸可位于N-末端(Xaa)x及C-末端(Xaa)z，其中Xaa是氨基酸，x和z是大于或等于0的整數(shù)，一般小于100，優(yōu)選小于10，更優(yōu)選0、1、2、3、4或5，還優(yōu)選4或5。
根據(jù)本發(fā)明的該方面，選擇結(jié)合哺乳動物血清清蛋白的肽配體可參考下文實施例，特別是其中所包含的表格，它們顯示了尤其例示性肽以及適當?shù)陌被?。在一個優(yōu)選的方面，選擇交叉結(jié)合幾種物種的血清清蛋白的SABM可參考表7。
根據(jù)本發(fā)明的該方面，優(yōu)選的化合物包括
DLCLRDWGCLW(SEQ ID NO7)DICLPRWGCLW(SEQ ID N08)MEDICLPRWGCLWGD(SEQ ID NO9)QRLMEDICLPRWGCLWEDDE (SEQ ID NO10)QGLIGDICLPRWGCLWGRSV (SEQ ID NO11)QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK (SEQ ID NO12)EDICLPRWGCLWEDD(SEQ ID NO13)RLMEDICLPRWGCLWEDD (SEQ ID NO14)MEDICLPRWGCLWEDD (SEQ ID NO15)MEDICLPRWGCLWED(SEQ ID NO16)RLMEDICLARWGCLWEDD (SEQ ID NO17)EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG (SEQ ID NO18)RAPESFVCYWETICFERSEQ (SEQ ID NO19)EMCYFPGICWM(SEQ ID NO20)在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的SABM結(jié)合人血清清蛋白，并可在使用具有如下所示通式的SABM的體外測定中通過其競爭結(jié)合人血清清蛋白的能力來鑒定，在所述通式中額外的氨基酸殘基可存在于N-末端(Xaa)x和C-末端(Xaa)zDXCLPXWGCLW (SEQ ID NO4)FCXDWPXXXSC (SEQ ID NO1)VCYXXXICF(SEQ ID NO2)CYX1PGXCX(SEQ ID NO3)其中Xaa是氨基酸，x和z優(yōu)選4或5，Xaa選自Ile、Phe、Tyr和Val。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的SABM會與任一在此上述的SEQ IDNO7-20所示的SABM競爭，并優(yōu)選會與SEQ ID NO10競爭與人血清清蛋白的結(jié)合。
由前文將領(lǐng)會，術(shù)語“競爭”和“競爭的能力”是相關(guān)的術(shù)語。因此，上述術(shù)語在用于描述本發(fā)明的SABM時，指在本文所述標準競爭測定法中以50μM存在時，優(yōu)選以1μM存在時，更優(yōu)選100nM，及優(yōu)選以1nM或更少存在時，對例如SEQ ID NO10所代表的肽的結(jié)合產(chǎn)生50％抑制的SABM。然而，對血清清蛋白具有小于約1nM，優(yōu)選約1pM-1nM的親和力的SABM同樣可能是本發(fā)明語境中的SABM。
對于用于確定肽或其它化合物是否具有與SABM競爭結(jié)合本文所述血清清蛋白的“能力”的體外測定系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用多種標準競爭測定法中的任一種。競爭性結(jié)合測定法依賴于經(jīng)標記標準品與測試樣品分析物競爭結(jié)合有限量的配體的能力。測試樣品中分析物的量與變成與配體結(jié)合的標準品的量成反比。
因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用下述流程來確定肽或其它化合物是否具有與SABM競爭結(jié)合清蛋白的能力，包括但不限于使用下述技術(shù)的競爭性測定系統(tǒng)，諸如放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA)優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、“三明治式”免疫測定法、免疫放射測定法、熒光免疫測定法和免疫電泳測定法，恕不一一列舉。
為了這些目的，選擇的SABM將用可檢測模塊標記(經(jīng)可檢測標記的SABM此后稱為“示蹤物”)并在競爭測定法中用于與候選化合物競爭結(jié)合清蛋白?？衫枚喾N可檢測標記物，它們可優(yōu)選分為以下幾類(a)放射性同位素，諸如35S、14C、125I、3H和131I。SABM可使用例如Coligen等人編，1991，《Current Protocols in Immunology》，第1和2卷，Wiley-Interscience，New York，N.Y.中所描述的技術(shù)用放射性同位素標記。放射性可使用閃爍計數(shù)測量。
(b)可利用熒光標記物，諸如稀土金屬螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物、羅丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰(dansyl)、麗絲胺(lissamine)、藻紅蛋白和得克薩斯紅(Texas Red)。熒光標記物可使用例如《CurrentProtocols in Immunology》(見上文)中所披露的技術(shù)與肽化合物偶聯(lián)。熒光可使用熒光計定量。
(c)可利用多種酶-底物標記物，美國專利4,275,149提供了其中一些的綜述。酶優(yōu)選催化可使用多種技術(shù)測量的顯色底物的化學(xué)改變。例如，酶可催化可通過分光光度法測量的底物的顏色變化?；蛘?，酶可改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。上文描述了用于定量熒光變化的技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)成為電子受激的，然后可發(fā)出可測量的光(例如使用化學(xué)發(fā)光光度計(chemiluminometer))或?qū)⒛芰渴诮o熒光受體。酶標記物的例子包括螢光素酶(如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利4,737,456)、螢光素、2，3-二氫酞嗪二酮(dihydrophthalazinedione)、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶諸如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶、等等。
酶-底物組合的例子包括例如(i)辣根過氧化物酶(HRP)及作為底物的過氧化氫，其中過氧化氫氧化染料前體(如ABTS、鄰苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸化物(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)及作為底物的對硝基苯基磷酸酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)及顯色底物(如對硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或熒光底物4-甲基傘形基-β-D-半乳糖苷。
根據(jù)一種特定測定法，示蹤物與固定化靶物一起在存在不同濃度的未標記候選化合物時溫育。提高成功的候選化合物的濃度有效競爭示蹤物與固定化靶物的結(jié)合。最大結(jié)合示蹤物的50％遭到置換時未標記候選化合物的濃度稱為“IC50”，它反映了候選化合物的靶物結(jié)合親和力。因此，IC50為1mM的候選化合物展示出比IC50為1μM的候選化合物實質(zhì)性弱的與靶物的相互作用。
在有些噬菌體展示ELISA測定法中，突變(“mut”)序列的結(jié)合親和力使用Cunningham et al.，EMBO J.132508(1994)中所描述的方法直接與對照(“con”)肽比較，并表征為參數(shù)EC50。測定法在EC50(con)/EC50(mut)將近似Kd(con)/Kd(mut)的條件下進行。
因此，本發(fā)明提供了在所述體外測定法中“有能力競爭”清蛋白諸如人血清清蛋白結(jié)合的化合物。優(yōu)選的是，化合物對靶物諸如人血清清蛋白具有小于1μM的IC50。在這些化合物中優(yōu)選具有小于約100nM，優(yōu)選小于約10nM或小于約1nM的IC50的化合物。在根據(jù)本發(fā)明該方面的另一個優(yōu)選實施方案中，化合物對靶分子諸如人血清清蛋白展示出小于約100pM，更優(yōu)選小于約10pM的IC50。
用于測定候選化合物與本文所述SABM競爭的能力的一種優(yōu)選的體外測定法如下，而且在實施例中有更完整的描述。在優(yōu)選的實施方案中，候選化合物是肽。候選化合物與經(jīng)標記SABM示蹤物競爭結(jié)合人血清清蛋白的能力使用ELISA監(jiān)測。將候選化合物在緩沖液中的稀釋液與示蹤物一起加至用人血清清蛋白包被(如實施例部分所述)的微量滴定板達1小時。將微量滴定板用清洗緩沖液清洗，并測量與人血清清蛋白結(jié)合的示蹤物的量。
B.SABMTA細胞毒劑組合SABM與TA細胞毒劑連接而形成包含至少一個每種組分(即至少三個不同組分)的偶聯(lián)物分子。每種組分可任選經(jīng)柔性接頭域互相連接。
根據(jù)連接的類型及其產(chǎn)生方法，SABM域可經(jīng)其N-或C-末端連接TA的N-或C-末端。例如，在通過重組技術(shù)制備本發(fā)明的偶聯(lián)物分子時，編碼SABM的核酸將可操作連接編碼TA序列的核酸，任選經(jīng)接頭域。典型的是，構(gòu)建體編碼其中SABM的C-末端連接TA的N-末端的融合蛋白。然而，尤其是在采用合成技術(shù)時，例如其中SABM的N-末端連接TA的N-或C-末端的融合蛋白也是可能的。
在有些情況中，SABM域可插入TA分子內(nèi)，而非連接TA的N-或C-末端。此構(gòu)造可用于實踐本發(fā)明，只要SABM域和TA的功能得到保留。例如，SABM可插入免疫球蛋白的非結(jié)合輕鏈CDR，而不干擾免疫球蛋白與其靶物結(jié)合的能力。可以憑經(jīng)驗鑒定TA分子中可容納SABM域插入的區(qū)域(即通過隨機選擇插入位點，對所得偶聯(lián)物測定TA的功能)，或者通過在相關(guān)TA的家族中進行序列比較(如對于是蛋白質(zhì)的TA)以定位低序列同源性的區(qū)域。與非常保守的區(qū)域相比，低序列同源性區(qū)域更有可能容忍SABM域的插入。對于其三維結(jié)構(gòu)已知(如通過X-射線結(jié)晶學(xué)或NMR研究)的TA，該三維結(jié)構(gòu)可提供SABM插入位點的指導(dǎo)。例如，與更高級別結(jié)構(gòu)的區(qū)域或涉及配體結(jié)合或催化的區(qū)域相比，環(huán)或具有高靈活性(mobility)的區(qū)域(即大的溫度或“B”系數(shù))更有可能容納SABM域插入。
C.接頭域SABM域任選經(jīng)接頭連接TA。本發(fā)明偶聯(lián)物分子的接頭組分不是必需參與的，但可能有助于偶聯(lián)物分子的功能。因此，接頭域定義為在TA和SABM域之間提供空間橋接的任何分子基團。
接頭域可以是不同長度和組成的，然而，對于建立空間橋接來說，重要的是接頭域的長度而非其結(jié)構(gòu)。接頭域優(yōu)選容許偶聯(lián)物分子的SABM結(jié)合靶分子，基本上沒有空間和/或構(gòu)象限制。因此，接頭域的長度取決于偶聯(lián)物分子的兩個“功能”域即SABM和TA的特性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，基于不同鍵之間的已知距離，不同原子組合提供不同長度分子。參見例如Morrison和Boyd，1997，《(OrganicChemistry》，第3版，Allyn and Bacon，Inc.，Boston，MA。接頭域可以是不同長度的多肽。多肽的氨基酸組成決定了接頭的特性和長度。在一個優(yōu)選的實施方案中，接頭分子包含柔性的、親水性的多肽鏈。例示性接頭域包含一個或多個Gly和/或Ser殘基，諸如那些下文實施例部分中所描述的。
D.重組合成本發(fā)明涵蓋物質(zhì)組合物，其包含編碼本文所述SABM或包含SABM和多肽TA的偶聯(lián)物分子的分離的核酸，優(yōu)選DNA。編碼本發(fā)明肽的DNA可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于通過Engels et al.，1989，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28716-734(其完整公開書收入本文作為參考)中所描述的任何方法的化學(xué)合成，諸如三酯、亞磷酸酯、亞磷酰胺和H-膦酸酯化學(xué)合成法。在一個實施方案中，編碼DNA的設(shè)計中使用表達宿主細胞所優(yōu)選的密碼子?；蛘?，編碼肽的DNA可通過使用重組DNA技術(shù)改變成編碼一種或多種變體，諸如位點特異誘變(Kunkel et al.，1991，Methods Enzymol.204125-139；Carter et al.，1986，Nucl.Acids Res.134331；Zoller et al.，1982，Nucl.Acids Res.106487)、盒式誘變(Wells et al.，1985，Gene 34315)、限制性選擇誘變(Carter，1991，在《Directed MutagenesisAPractical Approach》，M.J.McPherson編，IRL Press，Oxford)、等等。
根據(jù)上述優(yōu)選方面，核酸編碼能夠結(jié)合靶分子的SABM。靶分子包括例如胞外分子諸如各種血清因子，包括但不限于血漿蛋白質(zhì)諸如血清清蛋白、免疫球蛋白、載脂蛋白或運鐵蛋白，或者在紅細胞或淋巴細胞表面上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，當然，倘若SABM與細胞表面蛋白質(zhì)的結(jié)合基本上不干擾細胞的正常功能的話。優(yōu)選用于本發(fā)明的是以期望親和力結(jié)合血清清蛋白的SABM，例如，以高親和力，或以促進與SABM融合的生物活性分子的有用組織攝取和擴散的親和力。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，核酸編碼包含SABM序列和TA的偶聯(lián)物分子。在本發(fā)明的該方面，TA可包含可用作治療劑或診斷劑的任何多肽化合物，如酶、激素、細胞因子、抗體或抗體片段。根據(jù)本發(fā)明該方面的核酸分子編碼偶聯(lián)物分子，而且編碼SABM序列的核酸可操作連接(就DNA序列是連續(xù)的且處于讀碼框中而言)編碼生物活性劑的核酸。任選的是，這些DNA序列可經(jīng)編碼接頭域氨基酸序列的核酸序列連接。
根據(jù)該方面，本發(fā)明進一步包含與編碼本發(fā)明肽的DNA分子可操作連接的表達控制序列；包含所述DNA分子的表達載體，諸如質(zhì)粒，其中控制序列受到用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞的識別；及用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。一般而言，質(zhì)粒載體包含衍生自與宿主細胞相容的物種的復(fù)制和控制序列。載體通常攜帶復(fù)制位點以及編碼能夠在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的蛋白質(zhì)的序列。
對于在原核宿主中表達，合適的載體包括pBR322(ATCC No.37,017)、phGH107(ATCC No.40,011)、pBO475、pS0132、pRIT5、pRIT20或pRIT30系列的任何載體(Nilsson and Abrahmsen，1990，Meth.Enzymol.185144-161)、pRIT2T、pKK233-2、pDR540和pPL-λ。包含本發(fā)明表達載體的原核宿主細胞包括大腸桿菌K12菌株294(ATCC No.31,446)、大腸桿菌菌株JM101(Messing et al.，1981，Nucl.AcidRes.9309)、大腸桿菌菌株B、大腸桿菌菌株_1776(ATCC No.31537)、大腸桿菌c600、大腸桿菌W3110(F-，γ-，原養(yǎng)型，ATCC No.27,325)、大腸桿菌菌株27C7(W3110，tonA，phoA E15，(argF-lac)169，ptr3，degP41，ompT，kanr)(美國專利5,288,931，ATCC No.55,244)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesans)和假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。
除原核生物外，真核生物體，諸如酵母，或衍生自多細胞生物體的細胞可用作宿主細胞。對于在酵母宿主細胞中表達，諸如常見的面包酵母或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，合適的載體包括基于2微米質(zhì)粒的附加型復(fù)制載體、整合型載體及酵母人工染色體(YAC)載體。對于在昆蟲宿主細胞中表達，諸如Sf9細胞，合適的載體包括桿狀病毒載體。對于在植物宿主細胞中表達，特別是雙子葉植物宿主，諸如煙草，合適的表達載體包括衍生自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti質(zhì)粒的載體。
有用的哺乳動物宿主細胞的例子包括SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎系(為在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293或293細胞，Graham et al.，1977，J. Gen Virol. 3659)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin，1980，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，774216)；小鼠塞爾托利(Sertoli)細胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23243-251)；猴腎細胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather et al.，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系(Hep G2)。對于在哺乳動物宿主細胞中表達，有用的載體包括衍生自SV40的載體、衍生自巨細胞病毒的載體諸如pRK載體包括pRK5和pRK7(Suva et al.，1987，Science 237893-896；EP307,247(3/15/89)；EP278,776(8/17/88))、衍生自牛痘病毒或其它痘病毒的載體、及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體諸如衍生自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)的載體。
任選的是，編碼目的肽的DNA可操作連接分泌前導(dǎo)序列，導(dǎo)致宿主細胞將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。分泌前導(dǎo)序列的例子包括STII、大腸桿菌素、lamB、皰疹GD、lpp、堿性磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶和α因子。也適用于本文的是蛋白A的36個氨基酸的前導(dǎo)序列(Abrahmsen et al.，1985，EMBO J. 43901)宿主細胞用上述本發(fā)明的表達或克隆載體轉(zhuǎn)染和優(yōu)選轉(zhuǎn)化，并在為誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼期望序列的基因而恰當改良的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
用于生成本發(fā)明肽的原核生物宿主細胞可大體如Sambrook等人，見上文中所述培養(yǎng)。
用于生成本發(fā)明肽的哺乳動物宿主細胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，本領(lǐng)域有記載的任何培養(yǎng)基(例如Ham and Wallace，1979，Meth.Enz.5844；Barnes and Sato，1980，Anal.Biochem.102255；美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；WO90/03430；WO87/00195；美國專利復(fù)審30,985；或美國專利5,122,469，各自公開書收入本文作為參考)都可用作宿主細胞的培養(yǎng)基。任何這些培養(yǎng)基可視需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GentamycinTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。任何其它必需補充物還可以本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知道的適當濃度包括在內(nèi)。培養(yǎng)條件，諸如溫度、pH、等等，就是那些先前用于為表達而選擇的宿主細胞的，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本公開書中提及的宿主細胞涵蓋體外培養(yǎng)中的細胞以及宿主動物內(nèi)的細胞。
E.化學(xué)合成生成本發(fā)明SABM的另一種方法牽涉化學(xué)合成。這可通過使用本領(lǐng)域眾所周知的方法學(xué)來實現(xiàn)(參見Kelley and Winkler，1990，在《GeneticEngineering Principles and Methods》中，Setlow，J.K.編，Plenum Press，N.Y.，第12卷，第1-19頁；Stewart et al.，1984，J.M.Young，J.D.，Solid Phase PeptideSynthesis，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL。還可參見美國專利4,105,603；3,972,859；3,842,067；3,862,925)。
本發(fā)明的SABM可使用固相肽合成方便的制備。Merrifield，1964，J. Am.Chem.Soc.852149；Houghten，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825132。固相肽合成還可用于制備本發(fā)明的偶聯(lián)物分子組合物，如果TA是多肽或包含多肽的話。
固相合成開始于新生肽的羧基末端，通過將受保護的氨基酸偶聯(lián)至惰性固相支持物。惰性固相支持物可以是能夠充當起始氨基酸C-末端的錨的任何大分子。典型的是，大分子支持物是如Stewart和Young，見上文的第2和4頁圖1-1和1-2中所示的交聯(lián)聚合物樹脂(如聚酰胺或聚苯乙烯樹脂)。在一個實施方案中，C-末端氨基酸偶聯(lián)至聚苯乙烯樹脂以形成芐酯。大分子支持物的選擇應(yīng)使得肽錨連接在肽合成中用于受封閉氨基酸的α-氨基脫保護的條件下是穩(wěn)定的。如果使用堿不穩(wěn)定的α-保護基，那么期望在肽和固相支持物之間使用酸不穩(wěn)定連接。例如，酸不穩(wěn)定的醚樹脂對于堿不穩(wěn)定的Fmoc-氨基酸肽合成是有效的，如Stewart和Young，見上文的第16頁所述。或者，可使用對酸解作用差異不穩(wěn)定的肽錨連接和α-保護基。例如，氨甲基樹脂諸如苯乙酰胺甲基(Pam)樹脂結(jié)合Boc-氨基酸肽合成運轉(zhuǎn)很好，如Stewart和Young，見上文的第11-12頁所述。
在起始氨基酸偶聯(lián)至惰性固相支持物之后，用例如二氯甲烷中的三氟乙酸(TFA)除去起始氨基酸的α-氨基保護基，并在例如三乙胺(TEA)中中和。在起始氨基酸的α-氨基脫保護之后，添加合成中的下-個α-氨基和側(cè)鏈受保護的氨基酸。然后通過縮合以期望次序順序偶聯(lián)剩余的α-氨基和必要時側(cè)鏈受保護的氨基酸，以獲得與固相支持物連接的中間化合物?；蛘撸行┌被峥杀舜伺悸?lián)以形成期望肽的片段，隨后將肽片段加至生長中的固相肽鏈。
可依照常用的縮合方法進行兩個氨基酸、或氨基酸和肽、或肽和肽之間的縮合反應(yīng)，諸如axide法、混合酸酐法、DCC(N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺)或DIC(N，N’-二異丙基碳二亞胺)法、活性酯法、對硝基苯酯法、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三[二甲氨基]膦六氟磷酸酯)法、N-羥基琥珀酸亞氨酯法等、及Woodward試劑K法。
在肽的化學(xué)合成中常常用合適的保護基保護氨基酸的任何反應(yīng)性側(cè)鏈基團。最終，在順序裝配好期望多肽鏈之后，除去這些保護基。同樣，常常在氨基酸或肽片段的C-末端羧基與生長中的固相多肽鏈的游離N-末端氨基起反應(yīng)時保護氨基酸或肽片段上的α-氨基，然后選擇性除去α-氨基以容許將下一個氨基酸或肽片段加至固相多肽鏈。因此，在多肽合成中常常生成含有每個氨基酸殘基且它們在肽鏈中以期望順序定位的中間化合物，其中各個殘基仍然攜帶側(cè)鏈保護基。這些保護基可在從固相上除去之后基本上同時除去，以生成期望的多肽產(chǎn)物。
α-和ε-氨基側(cè)鏈可用芐氧羰基(縮寫為Z)、異煙氧羰基(iNOC)、鄰氯芐氧羰基[Z(2Cl)]、對硝基芐氧羰基[Z(NO2)]、對甲氧基芐氧羰基[Z(OMe)]、叔丁氧羰基(Boc)、叔戊氧羰基(Aoc)、異冰片氧羰基、金剛烷氧羰基、2-(4-聯(lián)苯基)-2-丙氧羰基(Bpoc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、甲磺酰乙氧羰基(Msc)、三氟乙?；?、酞(酰)基、甲酸基、2-硝基苯亞磺?；?NPS)、二苯基硫膦基(Ppt)和二甲基硫膦基(Mpt)、等等保護。
用于羧基官能團的保護基的例子有芐基酯(OBzl)、環(huán)己基酯(Chx)、4-硝基芐基酯(ONb)、叔丁基酯(Obut)、4-吡啶基甲基酯(OPic)、等等。通常期望特定氨基酸諸如具有氨基和羧基以外官能團的精氨酸、半胱氨酸和絲氨酸受到合適保護基的保護。例如，精氨酸的胍基可用硝基、對甲苯磺?；⑵S氧羰基、金剛烷氧羰基、對甲氧基苯磺酰基、4-甲氧基-2，6-二甲基苯磺?；?Nds)、1，3，5-三甲基苯磺?；?Mts)、等等保護。半胱氨酸的巰基可用對甲氧芐基、三苯甲基、等等保護。
上述受封閉氨基酸中的許多可從商業(yè)來源獲得，諸如Novabiochem(SanDiego，CA)、Bachem CA(Torrence，CA)或Peninsula Labs(Belmont，CA)。
Stewart和Young，見上文提供了關(guān)于制備肽的方法的詳細信息。α-氨基的保護記載于第14-18頁，側(cè)鏈封閉記載于第18-28頁。用于胺、羥基和巰基官能團的保護基列表提供于第149-151頁。
在完成期望氨基酸序列之后，肽可從固相支持物上切下，回收，并純化。肽通過能夠破壞肽-固相連接的試劑從固相支持物上切下，并任選對肽上受封閉的側(cè)鏈官能團脫保護。在一個實施方案中，肽用液體氫氟酸(HF)通過酸解作用從固相上切下，HF還除去了任何殘余的側(cè)鏈保護基。優(yōu)選的是，為避免肽中的殘基烷化(例如甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸殘基的烷化)，酸解反應(yīng)混合物含有硫甲酚和甲酚清除劑。HF切割后，用醚清洗樹脂，并通過乙酸溶液的連續(xù)清洗從固相萃取游離肽。將合并的清洗液凍干，將肽純化。
F.偶聯(lián)物分子的化學(xué)偶聯(lián)在某些實施方案中，偶聯(lián)物分子可包含作為具有診斷或治療用途的有機化合物的TA，或者，SABM和多肽TA之間、其構(gòu)造不能在一條核酸中編碼的融合物。后一種實施方案的例子包括SABM的氨基末端和TA的氨基末端之間的融合物，或SABM的羧基末端和TA的羧基末端之間的融合物。
化學(xué)偶聯(lián)可用于制備偶聯(lián)物分子的這些實施方案，使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物?？捎糜趯⒓毎緞┡c多肽諸如抗體偶聯(lián)的方法是已知的。
G.二硫鍵連接的肽如上所述，本發(fā)明的有些實施方案包括環(huán)化的SABM。SABM可通過在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而環(huán)化。此類肽可通過如上所述的化學(xué)合成然后通過二硫鍵形成中所使用的任何方便方法來制備。例如，肽可以從固相合成回收其巰基處于還原形式，溶解于稀溶液，其中分子內(nèi)半胱氨酸濃度超過分子間半胱氨酸濃度以優(yōu)化分子內(nèi)二硫鍵形成，諸如25mM-1μM的肽濃度，優(yōu)選500μM-1μM，更優(yōu)選25μM-1μM，然后通過將游離巰基暴露于足以產(chǎn)生分子內(nèi)二硫鍵的弱氧化劑而氧化，如具有或沒有催化劑諸如金屬陽離子、鐵氰化鉀、連四硫酸鈉、等等的分子氧?；蛘?，肽可以如Pelton et al.，1986，J. Med.Chem.292370-2375中所述而環(huán)化。
環(huán)化可通過例如能夠形成二硫鍵的第一和第二殘基，例如Cys、Pen、Mpr和Mpp及其含2-氨基的等效物之間二硫鍵或內(nèi)酰胺鍵的形成來實現(xiàn)。能夠形成內(nèi)酰胺橋的殘基包括例如Asp、Glu、Lys、Orn、αβ-二氨基丁酸、二氨基乙酸、氨基苯甲酸和巰基苯甲酸。本文中的化合物可以經(jīng)由例如內(nèi)酰胺鍵而環(huán)化，可利用不相鄰殘基的側(cè)鏈基團以形成與Cys或其它氨基酸的N-末端氨基的共價附著。備選橋結(jié)構(gòu)也可用于環(huán)化本發(fā)明的化合物，包括例如可經(jīng)S-S、CH2-S、CH2-O-CH2、內(nèi)酰胺酯或其它連接環(huán)化的肽和肽模擬物。
H.藥用組合物包含本發(fā)明偶聯(lián)物分子的藥用組合物可以任何合適的方式施用，包括腸胃外、局部(topical)、口服或局部(local)(諸如氣霧劑或經(jīng)皮膚)，或其任意組合。
其它合適的本發(fā)明組合物包含任何上述偶聯(lián)物分子及制藥學(xué)可接受載體。載體的性質(zhì)隨施藥方式而不同。例如，對于口服施藥，優(yōu)選固體載體；對于靜脈內(nèi)施藥，通常使用液體鹽溶液載體。
本發(fā)明的組合物包含與受試者和本發(fā)明蛋白質(zhì)相容的制藥學(xué)可接受組分。這些通常包括懸浮液、溶液和酏劑，最尤其是生物學(xué)緩沖劑，諸如磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、Dulbecco氏培養(yǎng)基、等等。氣霧劑也可以使用，或是諸如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、?；瘎?、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、等等的載體(在口服固體制劑的情況中，諸如粉劑、膠囊和片劑)。
在用于本文時，術(shù)語“制藥學(xué)可接受的”通常意味著得到聯(lián)邦或州政府管理機構(gòu)的批準或者列于美國藥典或其它公認的藥典，供動物、更特別的是人使用。
選擇的配制劑可使用多種前述緩沖劑，或甚至賦形劑包括例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉纖維素、碳酸鎂、等等來完成。組合物的“PEG化”可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來實現(xiàn)(參見例如國際專利公開號WO92/16555；Enzon的美國專利5,122,614；和國際專利公開號WO92/00748)。
本發(fā)明的優(yōu)選施藥路徑是氣霧劑或吸入形式。本發(fā)明的化合物，與分散劑組合，可作為干粉以氣霧劑施用或者與稀釋劑以溶液或懸浮液施用。
在用于本文時，術(shù)語“分散劑”指幫助化合物氣霧化或蛋白質(zhì)在肺組織中吸收或二者的藥劑。優(yōu)選的是，分散劑是制藥學(xué)可接受的。合適的分散劑是本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于表面活性劑等等。例如，可使用本領(lǐng)域通常用于減少溶液霧化形成液體氣溶膠所引起的表面誘導(dǎo)的化合物，尤其是肽化合物的聚集的表面活性劑。此類表面活性劑的非限制性例子是諸如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，及聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯的表面活性劑。表面活性劑的用量可以變化，通常在配制劑重量的約0.001％至約4％的范圍內(nèi)。在一個特定的方面，表面活性劑是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯或山梨聚糖三油酸酯。合適的表面活性劑是本領(lǐng)域眾所周知的，可根據(jù)具體劑型、化合物濃度、稀釋劑(在液體劑型中)或粉末形式(在干粉劑型中)等等，基于期望特性來選擇。
此外，根據(jù)偶聯(lián)物分子的選擇、期望的治療效果、肺組織的品質(zhì)(如患病或健康的肺)及許多其它因素，液體或干燥劑型可包含其它組分，如下文進一步討論的。
液體氣霧劑劑型通常在生理學(xué)可接受稀釋劑中含有偶聯(lián)物分子和分散劑。本發(fā)明的干粉氣霧劑劑型由細微分散的固體形式的偶聯(lián)物分子和分散劑組成。無論是液體還是干粉氣霧劑劑型，該劑型都必須氣霧化。也就是說，它必須碎裂成液體或固體顆粒，以確保氣霧化劑量真正到達肺泡。一般而言，團塊中間動態(tài)直徑(mass median dynamic diameter)應(yīng)為5微米或更小，以確保藥物顆粒到達肺泡(Wearley，1991，Crit. Rev. in Ther.Drug CarrierSystems 8333)。術(shù)語“氣霧劑顆?！痹诒疚闹杏糜诿枋鲞m于肺部施用，即應(yīng)到達肺泡的液體或固體顆粒。其它考慮事項諸如投遞裝置的構(gòu)造、配制劑中的其它組分及顆粒特性是重要的。藥物肺部施用的這些方面是本領(lǐng)域眾所周知的，而且劑型的操作、氣霧化手段及投遞裝置的構(gòu)造至多要求本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進行例行試驗。
對于投遞裝置的構(gòu)造，本領(lǐng)域已知的任何氣霧化形式，包括但不限于液體劑型的噴霧(nebulization)、霧化(atomization)或泵霧化(pumpaerosohzation)及干粉劑型的煙霧化(aerosolization)，都可用于本發(fā)明的實踐。預(yù)見了為施用固體劑型而獨特設(shè)計的投遞裝置。通常，液體或干粉劑型的氣霧化需要推進劑。推進劑可以是本領(lǐng)域通常使用的任何推進劑。此類有用推進劑的具體非限制性例子是氯碳氟化物(chlorofluorocarbon)、氫碳氟化物(hydrofluorocarbon)、氫氯碳氟化物(hydochlorofluorocarbon)或碳氫化合物(hydrocarbon)，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，用于氣霧化的裝置是壓力定量吸入器(metered dose inhaler)。壓力定量吸入器在施藥時提供特定劑量，而非依賴于施用的可變劑量。此類壓力定量吸入器可以與液體或干粉氣霧劑劑型一起使用。壓力定量吸入器是本領(lǐng)域眾所周知的。
一旦偶聯(lián)物分子到達肺，許多依賴劑型的因素會影響藥物吸收。應(yīng)當領(lǐng)會，在處置要求化合物的循環(huán)水平的疾病或紊亂時，諸如氣霧劑顆粒尺寸、氣霧劑顆粒形狀、感染存在與否、肺疾病或栓塞的因素可影響化合物的吸收。對于本文中描述的每種劑型，某些潤滑劑、吸收增強劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或助懸劑可能是恰當?shù)?。這些額外藥劑的選擇將隨目的而變化。應(yīng)當領(lǐng)會，在希望或?qū)で缶植客哆f化合物的情況中，諸如吸收增強等變量將不太重要。
I.液體氣霧劑劑型本發(fā)明的液體氣霧劑劑型通常將與噴霧器一起使用。噴霧器可以是壓縮空氣驅(qū)動的或者是超聲波的。本領(lǐng)域已知的任何噴霧器都可與本發(fā)明聯(lián)合使用，諸如但不限于Ultravent，Mallinckrodt，Inc.(St.Louis，MO)；AcornII噴霧器(Marquest Medical Products，Englewood CO)?？膳c本發(fā)明聯(lián)合使用的噴霧器記載于1986年11月25日公告的美國專利4,624,251；1972年11月21日公告的3,703,173；1971年2月9日公告的3,561,444；和1971年1月13日公告的4,635,627。
配制劑可以包含載體。載體是可溶于循環(huán)系統(tǒng)的大分子，它是生理學(xué)可接受的，其中生理學(xué)可接受的意味著本領(lǐng)域技術(shù)人員將認可給患者注射所述載體，作為治療方案的一部分。載體優(yōu)選是在循環(huán)系統(tǒng)中相對穩(wěn)定的，具有可接受的消除半衰期。這樣的大分子包括但不限于大豆卵磷脂、油酸和山梨聚糖三油酸酯，優(yōu)選山梨聚糖三油酸酯。
此實施方案的配制劑還可包含可用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)滲透壓的其它藥劑。藥劑的例子包括但不限于鹽類，諸如氯化鈉或氯化鉀，和碳水化合物類，諸如葡萄糖、半乳糖或甘露糖，等等。
J.氣霧劑干粉劑型還設(shè)想了本發(fā)明的藥用配制劑將作為包含細微分散的粉末形式的SABM和分散劑的干粉吸入劑型使用。化合物的形式將通常是凍干粉末。偶聯(lián)物分子的凍干形式可通過標準技術(shù)獲得。
在另一個實施方案中，干粉劑型將包含含有一種或多種本發(fā)明化合物的細微分散的干粉、分散劑及填充劑?？梢月?lián)合本發(fā)明配制劑使用的填充劑包括諸如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇的藥劑，其量促進粉末從裝置散布。
本文中引用的所有出版物(包括專利和專利申請)完整收入本文作為參考。
在此說明書和權(quán)利要求書全文中，詞語“包含”或變化諸如“包括”或“含有”應(yīng)理解為意指含括所述整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。
下列實施例作為例示提供，絕非限制。說明書中所有引文的公開內(nèi)容明確收入本文作為參考。
實施例實施例1-材料為了這些研究，與p185HER2(HER2)的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人源化抗體的Fab被重組改造以包括清蛋白結(jié)合肽(AB)。在該研究中使用的抗體humAb4D5-8的可變區(qū)序列可見于Carter等，(1992)PNAS 894285-4289。之前，人源化的Fab業(yè)已衍生自鼠單克隆抗體muMAb4D5(在此4D5)，該單克隆抗體是由在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Virginia)保藏并具有ATCC入藏登記號CRL 10463的雜交瘤產(chǎn)生的。制備人源化的抗-Her-2抗體的方法及例示可變區(qū)序列的鑒定提供于如美國專利5,821,337和6,054,297和Carter等，(1992)PNAS 894285-4289中。
通過編碼接頭序列，GGGS(SEQ ID NO422)的核酸序列，將編碼清蛋白結(jié)合肽(“AB”)，QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(SEQ ID NO1)的核酸序列與編碼Fab的核酸序列連接。編碼接頭的核酸序列連接到Fab的重鏈C-末端KTHT殘基上。作為對照，通過重組DNA工程，構(gòu)建通過其輕鏈與AB融合的含有D3H44抗體可變區(qū)的抗組織因子Fab。關(guān)于D3H44氨基酸序列，參見Presta，L.，等，(2001)Thromb.Haemost.85379-389。
將所得到構(gòu)建體作為融合蛋白(“AB.Fab4D5-H”或“rhuABFabATFL”)自大腸桿菌表達并分泌，然后分離并純化。接著，融合蛋白被偶聯(lián)至monomethylauristatin(MMAE)。對于腫瘤功效研究，通過具有馬來酰亞胺部分和對氨基芐基氨基甲酰(PAB)間隔物的纈氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接頭試劑，將融合蛋白與MMAE連接。關(guān)于將MMAE與抗體連接的方法的例子參見Klussman，K等，(2004)Bioconjugate Chem.15765-773。對于毒性研究，經(jīng)例如使用琥珀酰亞胺基乙酰硫代乙酸酯(succinimidylacetylthioacetate)(Sata)以產(chǎn)生游離的硫醇，之后偶聯(lián)到纈氨酸-瓜氨酸-MMAE(“vc-MMAE”)，通過融合蛋白的賴氨酸與使用馬來酰亞胺己酰基(maleimidocaproyl)的活化衍生物改性的MMAE的偶聯(lián)，將融合蛋白與MMAE連接。MMAE在所得到的AB.Fab4D5-H上的比率通常平均在約1∶1左右，最高4∶1，最低0∶1，使得0-4個MMAE部分被隨機分配到暴露的賴氨酸上，總平均數(shù)為每個AB.Fab4D5-H約1個MMAE。
實施例2-使用MMAE偶聯(lián)物的功效研究對已建立的MMTV-HER2轉(zhuǎn)基因乳房腫瘤(Fo5)測試AB.Fab-4D5-H-MMAE偶聯(lián)物。該腫瘤系不應(yīng)答Herceptin，但很好地應(yīng)答Herceptin-MC-vc-PAB-MMAE偶聯(lián)物。
將單劑靜脈內(nèi)的1650μg MMAE/m2rhuAB.Fab-4D5-H-vc-MMAE(即帶有AB)、rhuFab4D5vcMMAE(即沒有AB)或rhuABFabATFL-vc-MMAE(陰性對照)施用給帶有mMMTV-HER2 Fo5腫瘤的小鼠。每只處理的小鼠具有100-200mm3的平均腫瘤體積。在研究的第0天，施用MMAE偶聯(lián)的分子或磷酸鹽緩沖鹽水(“媒介”)，并每周進行兩次腫瘤測量，持續(xù)17天。使用一種已知有效的MMAE偶聯(lián)物Herceptin-MC-vc-PAB-MMAE在1245μg/m2MMAE劑量下作為比較。實施基于腫瘤倍增時間的對數(shù)細胞殺死(Log Cell Kill)分析。對數(shù)細胞殺死分析使用了基于與對照相比，處理開始后腫瘤大小倍增所需時間的腫瘤生長延遲的數(shù)學(xué)計算。該數(shù)學(xué)方程式為
圖1顯示了通過Fisher氏PSLD，在rhuAB.Fab4D5-H-vc-MMAE和Herceptin-MC-vc-PAB-MMAE組之間沒有顯著差異(p＝0.0001)，而陰性MMAE對照Fab，rhuABFabATFL-vc-MMAE與媒介對照沒有顯著差異(p＝0.6)。
實施例3-IgG-MMAE、F(ab’)2-MMAE偶聯(lián)物和游離的MMAE的毒性將重量在75-80克之間的雌性Spraque-Dawley(SD)大鼠(Charles RiverLaboratories，Hollister，CA)用于下列研究以比較游離的MMAE、Fab-MMAE和F(ab')2-MMAE偶聯(lián)物的毒性。
給藥組
給藥組對于Herceptin-val-cit-MMAE，使用718作為MMAE的分子量(MW)和145167作為Herceptin的分子量計算μg MMAE/m2。對于HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE，使用718作為MMAE的分子量和100000作為HerceptinF(ab’)2的分子量計算μg MMAE/m2。體表面積計算如下{[(體重克數(shù)0.667)x 11.8]/10000}。(產(chǎn)業(yè)指導(dǎo)和評論。在用于成年健康志愿者的治療劑的臨床試驗中估計安全起始劑量。美國健康和公共事業(yè)部食品與藥品管理局，藥物評估和研究中心(CDER)，生物制劑評估和研究中心(CBER)。2002年12月(Guidance for Industry and Reviewers.Estimating the SafetyStarting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers.U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Research(CDER)，Center for BiologicsEvaluation and research(CBER)，December 2002))。
在研究的第1天，以10mL/kg的劑量體積(在PBS中稀釋)，通過單次靜脈內(nèi)推注，經(jīng)尾靜脈注射施用劑量溶液。每日進行一次常規(guī)臨床觀察。每日進行兩次發(fā)病率和死亡率檢查(上午和下午)。在研究的第1天給藥前測定動物的體重，此后每日測定一次。將全血收集在含有EDTA的試管中用于血液學(xué)參數(shù)(如平均血清AST水平、ALT水平、GGT水平和膽紅素水平)以及不同細胞計數(shù)(如平均白細胞計數(shù)和血小板計數(shù))。將全血收集在血清分離管中用于臨床化學(xué)參數(shù)。在研究的第-4天給藥前、研究的第3天和第5天在尸體剖檢時收集血樣。在尸體剖檢時，還將全血收集在含有肝素鋰的試管中，并將血漿冷凍于-70℃供隨后的分析。在尸體剖檢中收集下列組織肝、腎、心、胸腺、脾、腦、胸骨和胃腸道(GI tract)切片，包括胃、大腸和小腸。在尸體剖檢時，僅稱重脾和胸腺。對第5天的體重進行所有的統(tǒng)計分析，使用One Way ANOVA，Tukey’s檢驗，(SigmaStat 2.03軟件)。
在研究的第3天，第4和5給藥組(分別為27.14mg/kg HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE和516ug/kg游離的MMAE)的動物瀕死。所有第4和5組的動物都極度昏睡，且大多數(shù)在泌尿生殖區(qū)中具有黃色排出物。在第3天對這些給藥組中的動物進行尸體剖檢。在研究的第5天，第3給藥組(10.83mg/kg HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE)中的動物也在泌尿生殖區(qū)中具有黃色排出物。
僅獲得第1-3組的臨床化學(xué)和血液學(xué)數(shù)據(jù)的完全集(基線，第3和5天)；第4和5組的第5天數(shù)據(jù)無法得到，因為由于明顯的病態(tài)或體重減輕這些動物在第3天就被尸體剖檢了。當與在第5天結(jié)束的動物中觀察到的那些結(jié)果比較時，在判讀這些動物的組織學(xué)變化時還應(yīng)當考慮這些發(fā)現(xiàn)。
在第3天，第4組(高劑量的HerceptinF(ab’)2)和第5組(游離的MMAE)的動物在肝相關(guān)的血清酶ALT、AST和GGT中顯示最高的升高，以及最低的血小板和白細胞計數(shù)。在這兩組中AST和ALT升高是類似的，但是，與第5組相比，第4組顯示顯著更高的GGT和總膽紅素升高。GGT和總膽紅素升高可指示肝排泄功能或膽道系統(tǒng)出問題。對于該觀察結(jié)果，組織學(xué)評估并不顯示形態(tài)學(xué)上的相關(guān)，而且不清楚是否游離的MMAE與免疫偶聯(lián)物之間的PK特性差異就能解釋該發(fā)現(xiàn)。在第3天，低劑量HerceptinF(ab’)2-vc-MMAE第3組顯示短暫的肝功能檢查的升高，其在第5天回歸基線水平。但是，在第5天血小板和白細胞計數(shù)保持減少，沒有恢復(fù)的跡象。用全長免疫偶聯(lián)物Herceptin-vc-MMAE(MMAE的劑量匹配于第4和5組)處理的動物顯示肝功能檢查增強和白細胞及血小板減少的典型毒理學(xué)特征(profile)。在5天期間，除膽紅素之外的所有參數(shù)都顯示了有進展；但是，在第3天，與第4和5組相比，第2組中的變化較小。
在形態(tài)學(xué)上，在第2-5組中觀察到的毒性樣式是相同的，且與之前的研究中所看到的匹配。盡管只有少數(shù)器官被評估，臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)并不暗示在其他部位有明顯的器官特異性損傷。在第3組(低劑量HerceptinF(ab’)2)中形態(tài)變化最小，而在第4和5組(高劑量HerceptinF(ab’)2和游離的MMAE)中最大。所述變化包括骨髓細胞過少，帶有明顯凋亡活性的胸腺萎縮，在具有不同程度粘膜退化和萎縮的腸粘膜中有絲分裂和凋亡細胞數(shù)增加，以及在肝細胞和膽道上皮中有絲分裂和凋亡細胞數(shù)增加。第2、4和5組的動物也顯示了肝細胞失控(dropout)和偶見的肝壞死區(qū)的跡象。
與第1天的體重相比，第4和5組(分別為27.14mg/kg HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE和516ug/kg游離的MMAE)中的動物在第3天分別損失14.5和12克體重。施用可比較的量MMAE(2105ug MMAE/m2)的第2組動物體重減少并不如第4和5組動物嚴重。如圖2所示，與Fa(b′)2用藥法(沒有血清清蛋白結(jié)合蛋白)一樣，游離的MMAE用藥法產(chǎn)生類似的體重減輕特征(profile)。體重減輕是毒性的指示。
總之，HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE(賴氨酸)以劑量依賴性方式引起急性毒性。與接受相同量的藥物像Herceptin-val-cit-MMAE的動物相比，高劑量HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE中的動物顯示明顯更大的體重減輕。以與高劑量的HerceptinF(ab’)2-val-cit-MMAE可比較的劑量(2150ug/m2)施用游離的MMAE的動物具有可比較的體重減輕和肝相關(guān)的血清酶水平以及白細胞和血小板計數(shù)的變化。所述發(fā)現(xiàn)與施用抑制微管蛋白形成的藥物一致(Wood KW，Cornwell WD和Jackson JR.Past and future ofthe mitotic spindle as an oncology target.Current Opinion in Pharmacology，1370-377.2001)。
實施例4-使用MMAE-Fab偶聯(lián)物的毒性研究在雌性Sprague-Dawley大鼠(80-100克)中比較Herceptin-monomethylauristatin(MMAE)免疫偶聯(lián)物、Fab4D5-MMAE和AB.Fab4D5-H-MMAE免疫偶聯(lián)物的毒性。
以10ml/kg的劑量體積(在PBS中稀釋)，經(jīng)尾靜脈注射給雌性大鼠施用等效劑量(2105ug MMAE/m2)。所有的劑量溶液以單次推注注射施用。
給藥組1＝PBS，6只雌性2＝20.2mg/kg Herceptin-val-cit-MMAE，6只雌性3＝5.7mg/kg Fab4D5-vc-MMAE4＝14.24mg/kg Fab4D5-vc-MMAE，6只雌性5＝7.85mg/kg AB.Fab4D5-H-vc-MMAE6＝19.62mg/kg AB.Fab4D5-H-vc-MMAE，6只雌性在之前的研究中，Herceptin-val-cit-MMAE的2105ug MMAE/m2劑量引起肝相關(guān)的血清酶水平和血液學(xué)參數(shù)中等嚴重的變化。在目前的研究中，也施用5.7mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE和7.85mg/kgrhuFab4D5-H-val-cit-MMAE的劑量，以得到大約840ug MMAE/m2的MMAE暴露。
在這些測定中，一般在研究的第-3天(給藥前)和第3天，在異氟烷麻醉下通過眼窩后竇(retro-orbital sinus)收集血樣(大約500ul)用于臨床化學(xué)和血液學(xué)。也在第5天尸體剖檢時在氯胺酮麻醉下，通過下腔靜脈收集血液。臨床觀察和體重記錄每日進行一次，籠側(cè)死亡率檢查每日進行兩次(上午/下午)。使瀕死的動物安樂死。
在研究的第5天尸體剖檢過程中，通過腹主動脈收集大鼠的血液用于臨床化學(xué)和血液學(xué)。收集下列組織心、肺、氣管、肝、腎、胸腺、脾、腦、腋窩淋巴結(jié)、完整的胃腸道、皮膚、膀胱和骨髓。此外，記錄肝、胸腺、脾和腦的器官重量。在尸體剖檢中，稱重肝、脾和胸腺。檢驗包括動物體重、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、AST水平、ALT水平、GGT水平和血清膽紅素水平的組平均值變化的檢驗。
在研究的第4天，第3和4給藥組(5.7和14.25mg/kgrhuFab4D5-val-cit-MMAE)中的動物具有中等的豎毛，許多動物昏睡。在第4天，在14.25mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE給藥組中的兩只動物瀕死，并對其進行尸體剖檢。
auristatin E偶聯(lián)的全長抗體(Herceptin-MC-val-cit-PAB-MMAE，第2組)顯示了與之前研究中所看到的相同的毒性特征(profile)在第3和5天，肝功能檢查是升高的，并顯示了除GGT之外的在第5天恢復(fù)的跡象。在5天的研究中，相同的動物顯示進行性的嗜中性粒細胞和血小板減少癥。用兩種類型的抗體片段(rhuFab4D5和rhuFab4D5-H)處理的動物顯示劑量依賴性毒性。在第3和5天，對于第3和5組(分別為低劑量的rhuFab4D5和rhuFab4D5-H)，肝相關(guān)的血清酶水平基本上相同于媒介處理的動物。在第5組(rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE)的動物中，AST和ALT十分輕微的升高，但是，無論該變化是否是統(tǒng)計顯著的，無論其是否實際上代表了肝毒性是不清楚的。在第5天，第3組(低劑量rhuFab4D5-val-cit-MMAE)中的動物顯示了十分輕微的血小板減少癥，白細胞減少50％，而在第5天，第5組中的動物顯示正常的白細胞計數(shù)(在第3天輕微的短時間的下降之后)，且在第5天有輕微的血小板增多。在第3和5天，第4和6組(分別為高劑量的rhuFab4D5和rhuFab4D5-H)中的動物顯示清楚的毒性跡象。在第4組中，毒性似乎更嚴重，在第4天，基于病態(tài)征兆使兩只動物安樂死。在這兩個時間點，與第2和6組(可比較的藥物劑量的Herceptin-val-cit-MMAE和rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE)相比，第4組中的動物的AST、ALT和GGT水平更高。與第2組相比，第6組中的動物的水平稍微更低。在第5天，第4和6組中的動物顯示十分嚴重的血小板和白細胞減少。與那些在第2組動物中所看到的相比，水平更低，第6組中的動物似乎稍微更好于第4組中的動物。
組織病理學(xué)評估的結(jié)果與臨床觀察(體重測定)以及臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)十分相關(guān)。第2、3、4和6組中的動物顯示明顯的骨髓細胞減少；再生的跡象僅出現(xiàn)在第3組的動物中。與此相反，第5組中的動物顯示接近正常細胞構(gòu)成的骨髓。在胸腺中觀察到了類似的發(fā)現(xiàn)第2、4和6組的動物顯示明顯的萎縮和凋亡活性，而第3和5組的動物則顯示輕微的萎縮，沒有明顯的凋亡活性。肝、小腸和大腸中的變化更難以定量，但是，與第3和5組相比，在第2、4和6組動物的這些器官中的有絲分裂和/或凋亡細胞數(shù)似乎更大。小區(qū)域的壞死僅在第4組的兩只動物中觀察到。有趣的是，只有第5組的動物(在媒介處理的動物之外)在肝中保留髓外造血的小焦點(foci)，暗示在這些動物中有較低水平的游離藥物。與用全長抗體偶聯(lián)物處理的動物相比，在用Fab免疫偶聯(lián)物處理的動物中，臨床病理學(xué)或組織病理學(xué)數(shù)據(jù)并沒有顯示任何不同的毒性樣式的跡象。
用兩種類型的抗體片段處理的動物顯示劑量依賴性毒性。在第3和5天，施用高劑量rhuFab 4D5-val-cit-MMAE和rhuFab 4D5-H-val-cit-MMAE(含有清蛋白結(jié)合肽)的動物顯示清楚的毒性征兆。在rhuFab 4D5組中毒性似乎更嚴重，在第4天使兩只動物安樂死，因為它們是瀕死的。組織病理學(xué)評估結(jié)果與臨床觀察結(jié)果(體重測定)和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)十分相關(guān)。與用全長抗體偶聯(lián)物處理的動物相比，在用Fab免疫偶聯(lián)物處理的動物中，臨床病理學(xué)或組織病理學(xué)數(shù)據(jù)并沒有顯示任何不同的毒性樣式的跡象。所述發(fā)現(xiàn)與施用抑制微管蛋白形成的藥物的結(jié)果一致(Wood等，2001)。
圖3表明清蛋白結(jié)合肽能改變藥物偶聯(lián)物的毒性。與Fab4D5-vc-MMAE相比，在研究的第5天，在大鼠中Ab.Fab4D5-H-vc-MMAE(含有清蛋白結(jié)合肽)具有明顯更小的毒性。在施用5.7mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE和7.85mg/kg rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE(第3和5組)的動物中，體重的組平均變化彼此之間并無顯著差異。第2、4和6給藥組(分別為20.2mg/kgHerceptin-val-cit-MMAE、14.24mg/kg rhuFab4D5-val-cit-MMAE和19.62mg/kg rhuFab4D5-H-val-cit-MMAE)都接受了2105ug/M2MMAE。在第2和4組動物中，體重的組平均減少較第6組動物更嚴重。
實施例5-通過表面等離振子共振進行親和力測定使用BIAcore 3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)獲得SA肽和清蛋白之間的結(jié)合親和力。在大約5000共振單位(RU)下使用胺偶聯(lián)在CM5芯片中捕獲清蛋白。將SA肽(0、0.625、1.25、2.5、5和10μM)以20μl/min流速注射30秒。在基質(zhì)再生之前，使用10mM甘氨酸，pH3讓結(jié)合的肽解離5分鐘。
將來自通過未偶聯(lián)的槽(cell)的注射的信號減去固定的槽(cell)的信號以產(chǎn)生相應(yīng)于作為時間的函數(shù)結(jié)合的肽的量的傳感圖。所運行的緩沖液，含有0.05％TWEEN-20T的PBS，被用于所有的樣品稀釋。BIAcore動力學(xué)評估軟件(v 3.1)用于根據(jù)結(jié)合和解離速率確定解離常數(shù)(Kd)，使用了一對一結(jié)合模型。
通過BIAcore測定以及SA08肽競爭性測定評估所選擇的肽結(jié)合人(HAS)、兔(BuSA)、大鼠(RSA)和小鼠(MSA)清蛋白的親和力。如下表8所顯示的數(shù)據(jù)證明了在競爭性測定中獲得的IC50值能順利地與在BIAcore測定中獲得的Kd值比較。在競爭性測定中，代表用于結(jié)合兔清蛋白的共有肽的肽SA15具有最低的IC50值，但通過表面等離振子共振對兔清蛋白具有最高的親和力。一種相同于SA06，但兩個Cys殘基都改變?yōu)锳la的線性肽，具有大于50μM的IC50，證明了二硫鍵的重要性。
實施例6-相對Kd的測定引言在評估蛋白質(zhì)之間的結(jié)合能力中，所選擇的方法是ELISA。由于容易開發(fā)高特異性和定量的測定，因此使得ELISA能得到廣泛應(yīng)用。但是，在蛋白質(zhì)直接固定在固體表面的情況下，由于變性或遮蔽結(jié)合表位，可出現(xiàn)潛在的偽像。
為檢測與Fab分子(Fab-H)偶聯(lián)的清蛋白結(jié)合肽對清蛋白的親和力，我們開發(fā)了兩種ELISA。第一種包括將清蛋白吸附在孔表面，并用山羊-抗-huFab-HRP檢測結(jié)合的Fab。第二種包括在溶液中用清蛋白結(jié)合Fab-H，并測定解離常數(shù)(Kd)。第二種測定的基本原理是在溶液中讓恒定濃度的Fab-H與不同量的清蛋白結(jié)合以達到平衡，并在包被著清蛋白的ELISA孔中測定未結(jié)合的Fab-H。可使用斯卡查德分析(Scatchard Analysis)通過分析數(shù)據(jù)確定Kd值(Munson等，1980，Anal.Biochem.，107220)。
材料和方法材料小鼠清蛋白-凍干形式，目錄號A3139大鼠清蛋白-凍干形式，目錄號A6414兔清蛋白-凍干形式，目錄號A0639通過將10mg清蛋白溶解在10ml PBS中制備1mg/ml清蛋白溶液。將溶液貯藏在4℃。
測定緩沖液PBS+0.5％雞蛋清蛋白(Sigma#A5503)+0.5％Tween 20，pH7.4。
直接結(jié)合的ELISA測定在4℃下，將小鼠、大鼠或兔清蛋白(Sigma)以2μg/ml固定在NUNCMaxisorp 96孔平板上過夜。在除去包被液之后，在25℃下用結(jié)合緩沖液(PBS，0.5％卵清蛋白和0.05％Tween 20)封閉平板1小時。將在結(jié)合緩沖液中連續(xù)稀釋的Fab-Hx以100ul/孔添加，并在25℃下使之結(jié)合包被的清蛋白30分鐘。通過用0.05％PBS/Tween20洗滌孔除去未結(jié)合的Fab-Hx，通過在25℃下與山羊抗人Fab’2-HRP溫育1小時檢測結(jié)合的Fab-Hx分子。然后，用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)/H2O2溶液測定結(jié)合的HRP。在溫育15分鐘后，通過添加1M磷酸淬滅反應(yīng)。用650nm的參比波長讀出在450nm的吸光度。
Kd(帶有預(yù)溫育的溶液結(jié)合)ELISA測定首先，在溶液中溫育固定濃度的Fab-H(在上述結(jié)合的ELISA中測定的)和不同濃度的溶于測定緩沖液的清蛋白。在室溫下≥2小時溫育后，將100μl的混合液轉(zhuǎn)移到清蛋白包被的ELISA平板中。然后，通過如上所述的直接結(jié)合的ELISA測定游離的Fab-Hx的濃度。
固定濃度的Fab-H和起始濃度的清蛋白列于下表中。清蛋白以1∶3連續(xù)稀釋8次。
結(jié)果Friguet等在1985年首先公開了使用ELISA的親和力測定。在測定Kd以及選擇HER2 ECD的人源化抗體中，我們已使用該方法(Carter等，Proc.Natl.Acad. Sci.89，4285，1992)。
一般而言，結(jié)合平衡研究要求抗體的濃度應(yīng)當接近于，或低于解離常數(shù)值。因為解離常數(shù)是事先未知的，因此在用于測定游離的Fab-Hx的結(jié)合ELISA中最好選擇給出足夠的吸光度的總Fab-H濃度。通過在直接結(jié)合的ELISA中滴定Fab-Hx測定該濃度。
為檢驗抗體-清蛋白已達到平衡，將Fab-H與兔清蛋白溫育1小時、2小時及過夜，然后在結(jié)合的ELISA中測定反應(yīng)混合液。在2小時溫育后，到達平衡。
為確定游離的Fab-H結(jié)合孔中的包被的清蛋白需要的最佳時間，將Ab-清蛋白混合液與孔中包被的清蛋白溫育15、30、45、60和120分鐘?；谠摐y定，確定30分鐘是結(jié)合所有的游離的Fab-H所需要的最少時間。Kd(帶有預(yù)溫育的溶液結(jié)合)ELISA測定的結(jié)果如表10所示。
序列表
表1清蛋白結(jié)合噬菌體肽的物種特異性
表2
表3多物種結(jié)合物
表4在大鼠清蛋白上選擇的序列
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表4(續(xù))
表5在兔清蛋白上選擇的序列
表6在人清蛋白上選擇的序列
表7結(jié)合多物種清蛋白的肽
表8表面等離振子共振肽競爭Kd(nM) IC50(nM)
表9
表10Kd(帶有預(yù)溫育的溶液結(jié)合)ELISA測定
權(quán)利要求
1.一種偶聯(lián)物分子，包含至少一個血清清蛋白結(jié)合部分(SABM)、至少一個靶向劑(TA)和至少一個細胞毒劑(CA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM包含至少50％同一于DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)序列的氨基酸序列，其中氨基酸序列具有兩個Cys殘基，在Cys殘基之間具有5個氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM包含DICLPRWGCLW(SEQ ID NO8)的氨基酸序列的變體，其中除Cys殘基外，SEQ ID NO8的1-5個任何殘基為不同的氨基酸殘基所取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM包含線性或環(huán)狀氨基酸序列，選自Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-XaaPhe-Cys-Xaa-Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys[SEQ ID NO1]Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe[SEQ ID NO2]Cys-Tyr-Xaal-Pro-Gly-Xaa-Cys[SEQ ID NO3]Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp[SEQ ID NO4]Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys[SEQ ID NO5]；Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp[SEQ ID NO6]；CXXGPXXXXC[SEQ ID NO21]XXXXCXXGPXXXXCXXXX[SEQ ID NO22]CXXXXXXCXXXXXXCCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO23]CCXXXCXXXXXXC[SEQ ID NO24]CCXXXXXCXXXXCXXXXCC[SEQ ID NO25]CXCXXXXXXXCXXXCXXXXXX[SEQ ID NO26]XXXXXDXCLPXWGCLWXXXX[SEQ ID NO155]XXXXDXCLPXWGCLWXXX[SEQ ID NO156]D X C L P X W G C L W[SEQ ID NO423]X X X X D I C L P R W G C L W X X X[SEQ ID NO424]，X X X X X D I C L P R W G C L W X X X X[SEQ ID NO425]X X E M C Y F P G I C W M X X[SEQ ID NO426]X X D L C L R D W G C L W X X[SEQ ID NO427]其中X是任意氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM包含任一選自SEQ IDNOs7-20、27-154和157-421的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM包含選自SEQ ID NOs7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM包含表1-9中所描述的任一肽序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM與血清清蛋白結(jié)合，具有約100μM或更小的Kd。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中TA是抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的偶聯(lián)物分子，其中抗體是Fab、F(ab)2、scFv或雙抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中TA與在癌癥中升高的細胞表面蛋白結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的偶聯(lián)物分子，其中細胞表面蛋白是HER2、PSMA、PCMA、KDR和Flt-1。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的偶聯(lián)物分子，其中細胞表面蛋白是B細胞表面標志。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的偶聯(lián)物分子，其中細胞表面蛋白是B細胞表面標志，是CD20或BR3。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中TA是抗-HER2抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的偶聯(lián)物分子，其中TA是具有SEQ ID NO428和429的VH和VL序列的抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的偶聯(lián)物分子，其中TA包含抗-HER2抗體的變體序列，所述抗-HER2抗體包含SEQ ID NO428和SEQ ID NO429。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中細胞毒劑是monomethylauristatin(MMAE)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中位于所述的SABM和靶向劑或細胞毒劑之間的接頭部分是GGGS。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子，其中SABM結(jié)合人清蛋白。
21.一種用于治療用途的組合物，包含與藥用載體混合的根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子。
22.一種用于減少治療劑毒性的方法，包括用偶聯(lián)有治療劑的血清清蛋白結(jié)合部分(SABM)產(chǎn)生治療劑的步驟。
23.一種用于減少哺乳動物中治療劑毒性的方法，包括給哺乳動物施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，進一步包括測定體內(nèi)治療劑SABM偶聯(lián)物毒性的步驟。
25.一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子治療患有癌癥的哺乳動物的步驟。
26.一種治療哺乳動物自身免疫性紊亂的方法，包括用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子治療患有自身免疫性紊亂的哺乳動物的步驟，所述偶聯(lián)物分子與有助于或引起自身免疫性紊亂的B-細胞結(jié)合。
27.一種產(chǎn)品，包含容器、容器中包含根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物分子的組合物、含有施用治療有效劑量的使用說明的包裝插頁。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有減少的毒性的治療劑，包含血清清蛋白結(jié)合肽(SABP)、靶向劑和細胞毒劑。本發(fā)明還涉及用于減少治療劑毒性的方法以及使用具有減少的毒性的治療劑治療的方法。
文檔編號A61K39/395GK101072581SQ200580041758
公開日2007年11月14日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月5日
發(fā)明者馬克·S·丹尼斯 申請人:健泰科生物技術(shù)公司