專利名稱：角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的治療制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的制劑和生產(chǎn)包含角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的凍干的組合物的方法。
背景技術(shù)：
角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)是在人類胚胎的肺成纖維細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中首先鑒定的上皮細(xì)胞特異的生長因子[Rubin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86802-806(1989)]。KGF的信使RNA的表達(dá)已經(jīng)在幾種來自各種發(fā)育階段的上皮組織的基質(zhì)成纖維細(xì)胞系中檢測(cè)到。在從正常的成年人腎臟和胃腸道的器官提取的RNA中，KGF的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也是明顯的[Finch et al.，Science 245752-755(1989)]。KGF從培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分泌并且在真皮中而不是表皮中體內(nèi)表達(dá)的證據(jù)表明，KGF可能是角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的重要的正常旁泌性效應(yīng)物。研究顯示，在刺激組織培養(yǎng)物中原發(fā)或繼發(fā)性人類角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖方面，KGF與表皮生長因子(EGF)一樣有效[Marchese et al.，J.Cell.Phys.144326-332(1990)]。KGF是由許多器官的上皮細(xì)胞附近的間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，這些器官包括表皮、口腔、低位胃腸上皮細(xì)胞、胰腺、肝臟、肺、尿道上皮、前列腺上皮細(xì)胞等[Finch et al，supra，Housley et al.，J Clin Invest.941764-77，(1994)；Yi et al.，Am J Path.14580-85，(1994)；Pierce et al.，J Exp.Med.179831-40，(1994)；Yi etal，J Urol.1541566-70，(1995)；和Ulich et al.，J Clin Invest.931298-1306，(1994)].
在國際專利公開WO 90/08771中描述了從人類胚胎成纖維細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基純化KGF，以及純化的KGF的部分氨基酸測(cè)序，KGF基因的克隆和在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)基因來產(chǎn)生生物學(xué)活性的重組KGF。這個(gè)出版物還公開了KGF或KGF樣多肽作為燒傷的傷口愈合試劑或刺激移植的角膜組織。
在正常的成年動(dòng)物中的體外和體內(nèi)研究顯示，KGF-1(以下“KGF”)產(chǎn)生了毛囊形態(tài)發(fā)生、肝細(xì)胞增殖和在肺、乳腺、胰腺、胃、小腸和大腸中的上皮細(xì)胞增殖方面的改變[Panos et al.，J.Clin.Invest.92969-977(1993)；Ulich et al.，Am.J.Path.144862-868(1994)；Yi et al.，Am.J.Path.14580-85(1994)；和Ulich et al.，J.Clin.Invest.931298-1306(1994)].KGF在胚胎或新生兒發(fā)育中的作用當(dāng)前正在研究中；然而，已經(jīng)記錄了KGF是新生小鼠中精囊發(fā)育的重要介體[Alarid et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911074-1078(1994)].此外，在肝細(xì)胞中過量表達(dá)KGF的小鼠展現(xiàn)出多囊腎[Nguyen et al.，Oncogene 122109-19，(1996)]，而使用表面活性物啟動(dòng)子在肺中過量表達(dá)KGF產(chǎn)生了具有肺部囊腺瘤的小鼠[Simonet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9212461-65，(1995)]，表明KGF在正常的腎臟和肺部發(fā)育中的重要性。
KGF已經(jīng)顯示了當(dāng)將重組KGF局部施用到兔耳或豬皮膚中手術(shù)誘導(dǎo)的傷口時(shí)提高了上皮重新形成和提高上皮細(xì)胞的厚度[Pierce et al.，J.Exp.Med.179831-840(1994])；和Staiano-Coico et al.，J.Exp.Med.178865-878(1993)]。Bosch等[J.Clin.Invest.982683-2687(1996)]報(bào)道了施用角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子將誘導(dǎo)肝細(xì)胞的增殖。
一般地，純化的多肽僅在含水狀態(tài)是勉強(qiáng)穩(wěn)定的，并在加工和保存期間經(jīng)歷引起生物學(xué)活性損失的化學(xué)和物理降解。此外，水溶液中的多肽組合物經(jīng)歷水解作用，例如脫酰胺作用和肽鍵斷裂。這些效果對(duì)于意圖在根據(jù)生物學(xué)活性定義的劑量范圍內(nèi)向人類施用的治療活性多肽是嚴(yán)重的難題。
施用純化的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子是治療許多影響人類群體的疾病的有前途的候選物。然而，KGF在各種保存條件下隨著時(shí)間保持為穩(wěn)定的藥物組合物并且對(duì)于患者在體內(nèi)是有效的能力還未被解決。因而，本領(lǐng)域中需要提供穩(wěn)定的制劑中的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子，其作為治療劑來治療將受益于KGF介導(dǎo)的上皮細(xì)胞生長刺激的各種疾病是有用的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了對(duì)于產(chǎn)生高穩(wěn)定KGF產(chǎn)物的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)的凍干有用的新制劑。穩(wěn)定的KGF產(chǎn)物作為治療劑在患有可受益于KGF施用的失調(diào)或狀況的個(gè)體治療中是有用的。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物，包含組氨酸、填充劑(bulking agent)、表面活性劑和糖類(sugar)，例如穩(wěn)定化糖類(stabilizing suger)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，KGF組合物包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其變體。KGF蛋白的變體包括等位變異，或者氨基酸的缺失、替換或插入，包括天然KGF的片段、嵌合或雜交分子。例如，本發(fā)明預(yù)期KGF是ΔN23 KGF(SEQ ID NO3)，其中天然KGF的前23個(gè)氨基酸被缺失。變體包括在此描述的那些分子，例如電荷改變的多肽，其中天然KGF(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基41-154的一個(gè)或多個(gè)被缺失，或用選擇來使蛋白具有降低的正電荷的中性殘基或帶負(fù)電殘基替換。KGF的更進(jìn)一步的實(shí)例包括但不限于，通過用具有更高的環(huán)形成潛力的至少一個(gè)氨基酸替換天然KGF的Ash115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119的環(huán)形成區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。更進(jìn)一步的實(shí)例包括在天然KGF的氨基酸123-133(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)的區(qū)域內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的蛋白質(zhì)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明預(yù)期使用填充劑/滲透性調(diào)節(jié)劑。填充劑可以是晶體的(例如，甘氨酸、甘露醇)或無定形的(例如，L-組氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素和乳糖)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述填充劑是甘露醇。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述甘露醇以約2％到約5％w/v的濃度摻入。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述濃度是約3％到約4.5％w/v。在另一個(gè)實(shí)施方式中，甘露醇是4％w/v的濃度。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定化糖類的組合物。預(yù)期使用的糖類包括但不限于，蔗糖、海藻糖或甘氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述糖類是蔗糖。在相關(guān)的實(shí)施方式中，所述蔗糖是約1-3％w/v的濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蔗糖是2％的濃度。
預(yù)期的是本發(fā)明的組合物被調(diào)節(jié)到約5.0到約8.0范圍內(nèi)的pH值。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述KGF組合物具有約6.0到約8.0范圍內(nèi)的pH值。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物具有約6.0到約7.0范圍內(nèi)的pH值。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述組合物具有約6.5的pH值。
在進(jìn)一步的方面，所述組合物預(yù)期使用表面活性劑。預(yù)期的是所使用的表面活性劑包括但不限于，聚山梨酯20或聚山梨酯80.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表面活性劑是聚山梨酯20(polysorbate 20).在相關(guān)的實(shí)施方式中，聚山梨酯20濃度在約0.1％到約0.004％w/v的范圍內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，聚山梨酯20濃度是約0.01％w/v。
在一個(gè)方面，本發(fā)明預(yù)期凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物，其包含10mM組氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖和0.01％聚山梨酯20，其中所述組合物是6.5的pH值。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的方法，包括步驟a)制備組氨酸、填充劑、穩(wěn)定化糖類；和表面活性劑的溶液；和b)凍干所述KGF.在相關(guān)的方面，本發(fā)明預(yù)期生產(chǎn)凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的方法，進(jìn)一步包括在凍干步驟之前b)調(diào)節(jié)所述溶液的pH值到約6.0和約8.0之間；c)制備含有角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的溶液；d)緩沖液交換步驟(c)的溶液成步驟(b)的溶液；e)添加適合數(shù)量的表面活性劑，和f)凍干來自步驟(e)的混合物。進(jìn)一步預(yù)期的是，所述KGF可以是SEQ ID NO2、SEQ ID NO3中列出的KGF蛋白質(zhì)，或其變體。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法預(yù)期使用填充劑/滲透性調(diào)節(jié)劑，其中所述填充劑可以是晶體的(例如，甘氨酸、甘露醇)或無定形的(例如，L-組氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素和乳糖)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述填充劑是甘露醇。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述甘露醇是約2％到約5％w/v的濃度。在相關(guān)的實(shí)施方式中，所述甘露醇是約3％到約4.5％w/v的濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述甘露醇是4％w/v的濃度。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法提供了包含糖類的組合物，其中所述糖類是穩(wěn)定化糖類。預(yù)期用于本發(fā)明的方法糖類包括但不限于，蔗糖、海藻糖或甘氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述糖類是蔗糖。在相關(guān)的實(shí)施方式中，所述蔗糖是約1％到約3％w/v的濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述蔗糖是2％的濃度。
本發(fā)明的方法預(yù)期的是調(diào)節(jié)pH值到生理pH值。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述pH值被調(diào)節(jié)到約5.0到約8.0的范圍。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述pH值被調(diào)節(jié)到約6.0到約8.0的范圍。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述pH值被調(diào)節(jié)到約6.0到約7.0的范圍。在更進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述pH值被調(diào)節(jié)到6.5的pH值。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的方法預(yù)期使用表面活性劑。預(yù)期的是所使用的表面活性劑包括但不限于，聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表面活性劑是聚山梨酯20。在相關(guān)的實(shí)施方式中，聚山梨酯20濃度在約0.1％到約0.004％w/v的范圍內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，聚山梨酯20濃度是約0.01％w/v。
在一個(gè)方面，本發(fā)明預(yù)期生產(chǎn)凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物的方法，所述組合物包含10mM組氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖和0.01％(w/v)聚山梨酯20，其中所述組合物是約6.5的pH值。
本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期通過提高KGF介導(dǎo)的上皮細(xì)胞生長刺激來治療疾病的方法，包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物。
預(yù)期的是要治療的疾病是腸毒性；粘膜炎；燒傷或其他部分和完全的深層損傷；毛囊、汗腺和皮脂腺的再生；附件結(jié)構(gòu)增生；大皰性表皮松解、化學(xué)療法誘導(dǎo)的脫發(fā)；男性型禿發(fā)；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；糜爛性胃炎、食管炎或食管回流；炎癥性腸病；透明膜病；煙霧吸入損傷；肺氣腫；肝硬化、肝衰竭、急性病毒性肝炎，對(duì)肝臟的其他毒性損害；或移植物抗宿主疾病(GVHD)。
本發(fā)明還預(yù)期的是用于制備含水藥物組合物的藥盒，其包含具有凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物的第一容器，和具有用于凍干的組合物的具有生理學(xué)可接受的重構(gòu)溶液的第二容器。預(yù)期的是，所述KGF蛋白可以是SEQ ID NO2、SEQ ID NO3中列出的KGF蛋白質(zhì)，或其變體。生理學(xué)可接受的重構(gòu)溶液可以是任何藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，包括但不限于，任何和所有的臨床上有用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲試劑等等，包括在此公開的那些試劑。此外，KGF組合物可以由治療醫(yī)師通過任何被認(rèn)為合適的途徑施用給受試者，所述途徑包括經(jīng)口地、局部地、經(jīng)皮地、胃腸外地，通過吸入噴霧、陰道地、直腸地，或通過顱內(nèi)注射。在此使用的術(shù)語胃腸外的包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腦池內(nèi)的注射，或輸注技術(shù)。通過靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、乳房內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鞘內(nèi)的、眼球后的、肺內(nèi)的注射，或在特定部位的外科植入的施用也是預(yù)期的。
附圖的簡(jiǎn)要說明附

圖1描繪了在不同pH值的液體KGF制劑中可溶蛋白的大小排阻(SE)-HPLC(附圖1A)和陽離子交換(CE)-HPLC(附圖1B)分析。
附圖2描繪了比較在10mM組氨酸、0.01％聚山梨酯20以及4％甘露醇/2％蔗糖或3％甘露醇/2％蔗糖中凍干的KGF制劑的反相(RP)HPLC層析圖。附圖2A描繪了凍干后的零時(shí)間，而附圖2B顯示了在4℃保存1年后的產(chǎn)品。插圖顯示了主峰旁的區(qū)域。
附圖3表現(xiàn)了作為來自在45℃保存24周后凍干的KGF制劑的SE-HPLC分析的蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)的主峰百分比。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及用于純化的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的凍干的制劑，其提供了穩(wěn)定的蛋白產(chǎn)物并提高了純化的蛋白的貨架期。本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)包含角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的凍干的組合物的方法。
如在此使用的，“角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子”或“KGF”是指角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子多核苷酸(SEQ ID NO1，Genbank檢索號(hào)NM_002009)或SEQ ID NO2中所列的多肽(Genbank檢索號(hào)NP_002000)或其類似物，或作為選擇，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的活性片段或其類似物，例如，ΔN23 KGF(SEQ ID NO3)，或結(jié)合并活化角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子受體的因子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，KGF是ΔN23KGF，KGF的重組生產(chǎn)的形式，其中氨基末端的前23個(gè)氨基酸已經(jīng)從成熟KGF上缺失(沒有連接信號(hào)序列)。參見，例如，US專利No.5,677,278；6,677,301、6,074,848、5,843,883、5,863,767和5,773,586，所有都轉(zhuǎn)讓給CHIRON Corp.，U.S.Pat.No.5,731,170，和1990年8月9日公開的PCT申請(qǐng)No.WO 90/08771(涉及KGF的全長形式和變體)；和1996年4月25日公開的申請(qǐng)No.WO 96/11949；1996年4月25日公開的PCT申請(qǐng)No.WO 96/11951；1998年6月11日公開的PCT申請(qǐng)No.WO 98/24813(涉及KGF的穩(wěn)定的類似物)，所有這些通過包括附圖的完全引用合并在此。
在PCT國際公開WO 96/11951和美國專利No.6,677,301中描述了具有相對(duì)天然KGF提高的穩(wěn)定性的KGF類似物，這種KGF類似物是本發(fā)明預(yù)期的。做為選擇，保持了完全的或甚至部分KGF活性的完整KGF多肽的任何片段或其類似物是預(yù)期的。
應(yīng)理解的是，在本說明書中采用的術(shù)語“角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子”和“KGF”意圖包括，并且除非另行指出可互換地意指天然KGF和KGF類似物蛋白(或“突變蛋白(muteins)”)，其特征是與天然KGF的全部或部分肽序列基本上相同的肽序列，并且保持了天然KGF的某些或所有的生物學(xué)活性，特別是非成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞增殖，例如，展現(xiàn)出比NIH/3T3成纖維細(xì)胞高至少約500倍的BALB/MK角質(zhì)形成細(xì)胞刺激，和比BS/589上皮細(xì)胞或CC1208上皮細(xì)胞高至少約50倍的BALB/MK角質(zhì)形成細(xì)胞刺激，如通過H-胸腺嘧啶核苷摻入所測(cè)定的。本發(fā)明還預(yù)期的是肽，“其特征是與天然KGF的肽序列基本上相同的肽序列”，是指由在如在此例示的中度到高度嚴(yán)格雜交條件下能與SEQ ID NO1的編碼區(qū)雜交的DNA序列編碼的肽序列。
在雜交的上下文中，嚴(yán)格條件是一般在雜交反應(yīng)中控制的鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其他參數(shù)的嚴(yán)格組合的條件。示范性的嚴(yán)格雜交條件是在4×SSC，在62℃-67℃雜交，繼之以0.1×SSC、在62℃-67℃洗滌約一小時(shí)。做為選擇，示范性的嚴(yán)格雜交條件是在45-55％甲酰胺中、4×SSC在40°-45℃雜交。[參見，T.Maniatis et.al.，MolecularCloning(A Laboratory Manual)；Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，pages 387 to 389.]KGF蛋白包括等位基因變異，或氨基酸的缺失、替換或插入，包括天然KGF的片段、嵌合或雜交的分子。本發(fā)明優(yōu)選的KGF分子是ΔN23 KGF。KGF的其他實(shí)例包括，無限制地，相應(yīng)于SEQ ID NO2的Cys1和Cys15的殘基被替換或缺失的蛋白，與親本分子相比產(chǎn)生的分子具有改善的穩(wěn)定性(如所擁有的U.S.專利6,008,328中一般教導(dǎo)的)。KGF的其他實(shí)例包括但不限于，電荷改變的多肽，其中天然KGF的氨基酸殘基41-154的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選的殘基Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153或Thr154)被缺失或被選擇以使蛋白降低正電荷的中性殘基或帶負(fù)電殘基替換。KGF的更進(jìn)一步的實(shí)例包括但不限于，通過用具有更高的環(huán)形成潛力的至少一個(gè)氨基酸替換天然KGF的Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119的環(huán)形成區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(如US專利6,008,328中教導(dǎo)的)。更進(jìn)一步的實(shí)例包括在天然KGF的氨基酸123-133區(qū)域(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或添加的蛋白質(zhì)。
具體地預(yù)期的KGF蛋白包括以下的KGF分子(通過SEQ ID NO4中列出的成熟蛋白質(zhì)(減去信號(hào)序列)中該位置存在的殘基，繼之以括號(hào)中的氨基酸位置，然后是替代的殘基或標(biāo)記缺失的“-”來命名)ΔN15、ΔN16、ΔN18、ΔN23、ΔN24、ΔN25、ΔN26、或ΔN27 KGF、C(1，15)S、ΔN15-ΔN24、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)-、ΔN8/C(15)S、ΔN8/C(15)-、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q、ΔN23/R(144)Q、C(1，15，40)S、C(1，15，102)S、C(1，15，102，106)S、ΔN23/N(137)E、ΔN23/K(139)E、ΔN23/K(139)Q、ΔN23/R(144)A、ΔN23/R(144)E、ΔN23/R(144)L、ΔN23/K(147)E、ΔN23/K(147)Q、ΔN23/K(153)E、ΔN23/K(153)Q、ΔN23/Q(152)E/K(153)E；R(144)Q和H(116)G。
KGF對(duì)許多不同類型的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖效果表明它是在影響個(gè)體的許多狀況或疾病的治療中有用的治療劑。以下是可以用本發(fā)明的KGF治療的疾病和醫(yī)學(xué)狀況的說明。
腸毒性是在放射和化學(xué)療法治療方式中主要的限制因素。用KGF預(yù)治療可能對(duì)小腸粘膜具有細(xì)胞保護(hù)效果，容許提高這些治療的劑量而降低腸毒性的潛在致死副作用。新近在用化學(xué)治療劑5-氟尿嘧啶治療之前施用重組人類KGF的患者的I期臨床試驗(yàn)表明，用KGF治療將產(chǎn)生降低的粘膜炎發(fā)生率[Meropol et al.，J Clin Oncol.211452-8(2003)]。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的輻射誘導(dǎo)腸毒性的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Withers and Elkind，″MicrocolonySurvival Assay for Cells of Mouse Intestinal Mucosa Exposed toRadiation″，Int.J.Radiat.，17261-267(1970)。預(yù)示人類治療效力的化學(xué)療法誘導(dǎo)的腸毒性的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的。Sonis，et al.，″AnAnimal Model for Mucositis Induced by Cancer Chemotherapy，OralSurg.″，Oral Med.Oral Pathol.，69437-431(1990)；和Moore，″Clonogenic Response of Cells of Murine Intestinal Crypts to 12Cytotoxic Drugs″，Cancer Chemotherapy Pharmacol.，1511-15(1985)]。
KGF治療對(duì)于整個(gè)胃腸道的粘液產(chǎn)量具有驚人的影響。這種性質(zhì)在保護(hù)腸粘膜避免攝取的有害物質(zhì)方面，或在例如炎癥性腸病的情況下限制損傷的擴(kuò)散方面可能是有用的。
附件結(jié)構(gòu)例如毛囊、汗腺和皮脂腺的增殖和分化的刺激，在患有燒傷和其他部分和完全的深層損傷的患者的再生表皮和真皮中具有關(guān)鍵性的意義。目前，通過傷疤形成和角質(zhì)形成細(xì)胞重鋪表面來治愈體表缺陷；皮膚的完全再生仍是不可能的。當(dāng)前在完全的深層皮膚缺損，包括燒傷中不會(huì)發(fā)生毛囊、汗腺和皮脂腺的再生。使用KGF可以容許這種再生。附件結(jié)構(gòu)增生和刺激的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的，其容許對(duì)于燒傷和其他部分和完全深層損傷具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試[Mustoe，et al.，“Growth factor-induced acceleration of tissuerepair through direct and inductive activities in a rabbit dermal ulcermodel”J.Clin. Invest.，87694-703(1991)；Pierce，et al.，“Platelet-derived growth factor(BB homodimer)，transforming growth factor-beta 1，and basic fibroblast growth factor in dermal wound healing.Neovessel and matrix formation and cessation of repair”Am.J.Path.1401375-88(1992)；和Davis，et al.，“Second-degree burn healingthe effect of occlusive dressings and a cream.”J.of Surgical Res.48245-248(1990)]。
大皰性表皮松解是在表皮對(duì)下層真皮的粘附方面的缺陷，引起頻繁的開裂、痛苦的水泡，其可以引起嚴(yán)重的發(fā)病。這些病變的加速的上皮重新形成，例如通過用KGF治療，將產(chǎn)生較低風(fēng)險(xiǎn)的感染、減少的疼痛和較少的傷口護(hù)理。
當(dāng)用惡性腫瘤的化學(xué)療法療程治療患者時(shí)，產(chǎn)生化學(xué)療法誘導(dǎo)的脫發(fā)。在防止引起短暫脫發(fā)的毛囊細(xì)胞死亡方面，目前沒有治療劑是有效的。KGF提供了這種手段。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的化學(xué)療法誘導(dǎo)脫發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的。[Sawada，et al.，″Cyclosporin A Stimulates Hair Growth in Nude Mice″，LaboratoryInvestigation，56(6)684(1987)；Holland，″Animal Models of Alopecia″，Clin.Dermatol，6159162(1988)；Hussein，″Protection fromChemotherapy-induced Alopecia in a Rat Model″，Science，2491564-1566(1990)；和Hussein，et al.，″Interleukin 1 Protects against 1-B-D-Arabinofuranosyulcytosine-induced Alopecia in the NewbornRat Animal Model″，Cancer Research，513329-3330(1991)]。
男性型禿發(fā)是普遍的和基本上不可治療的。在男性和女性中漸進(jìn)性的脫發(fā)是嚴(yán)重的美容難題。KGF缺陷小鼠展現(xiàn)出波紋的蓬亂皮毛，而KGF受體敲除展現(xiàn)了薄皮、低數(shù)量的毛囊和延遲的傷口愈合[Werner et al.，Science 266819-22(1994)]。在脫發(fā)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，用重組KGF預(yù)處理保護(hù)了由化學(xué)治療劑阿糖胞苷(ARA-c)施用誘導(dǎo)的大約50％的脫發(fā)[Danilenko et al.，Am J Path.147145-54，(1995)]?？梢匀淼兀蛉绻幬锉皇┘硬⑼ㄟ^頭皮吸收則局部地，或通過使用空氣槍或類似技術(shù)噴霧注射到頭皮中，使用KGF來治療這些狀況。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的男性型禿發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的。[Uno，″The Stumptailed Macaque as a Modelfor Baldnesseffects of Minoxidil″，International Journal of CosmeticScience，863-71(1986)；Porter R.，“Mouse models for human hair lossdisorders”J Anat.202125-31(2003)]。
研究顯示施用KGF可以誘導(dǎo)胃腸道中的細(xì)胞生長[Playford et al.，J Pathol.184316-22，(1998)]。胃潰瘍，雖然可以用H2拮抗劑治療，但是產(chǎn)生了顯著的病狀和復(fù)發(fā)率，通過粘膜內(nèi)層的傷疤形成來治愈。在患有胃潰瘍的患者中更快速地再生腺性粘膜的能力，例如，通過用KGF治療，將在胃潰瘍的治療中提供顯著的治療改善。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的胃潰瘍的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的，例如，Tarnawski，et al.，[″Indomethacin Impairs Quality of ExperimentalGastric Ulcer HealingA Quantitative Histological and UltrastructuralAnalysis″，InMechanisms of Injury，Protection and Repair of theUpper Gastrointestinal Tract，(eds)Garner and O′Brien，Wiley & Sons(1991)；和Astudillo et al.，[“Gastroprotective activity of oleanolic acidderivatives on experimentally induced gastric lesions in rats and mice”JPharm Pharmacol.54583-8(2002)]。
十二指腸潰瘍，象胃潰瘍一樣，是可治療的，但是開發(fā)更完全和更快速地再生十二指腸的粘膜內(nèi)層的治療劑將是重要的進(jìn)展。此外，再生性地治愈這些潰瘍并降低它們的復(fù)發(fā)的治療劑將是有益的。KGF提供了這種潛力。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的十二指腸潰瘍的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Berg，et al.，″Duodenal ulcersproduced on a diet deficient in pantothenic acid″，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，7374-376(1949)；Szabo and Pihan，″Development andSignificance of Cysteamine and Propionitrile Models of DuodenalUlcer″，Chronobiol.Int.，631-42(1987)；Robert，et al.，″Productionof Secretatogues of Duodenal Ulcers in the Rat″，Gastroenterology，5995-102(1970)；和Keshavarzian et al.，“Gastroduodenal ulcers in ratsinduced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，5，6-tetrahydropyridine(MPTP)requirement for gastric acid secretion and the role ofprostaglandins”Res Commun Chem Pathol Pharmacol.7021-48(1990)]。
胃和食道的糜爛，象糜爛性胃炎、食管炎或食管回流，是可治療的，但是開發(fā)更完全和快速地再生胃和食道的粘膜內(nèi)層的治療劑將是重要的進(jìn)展。此外，再生性地治愈這些糜爛并降低它們的復(fù)發(fā)的治療劑將是有益的。KGF提供了這種潛力。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的胃和食道糜爛，如糜爛性胃炎、食管炎或食管回流的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Geisinger et al，″The histologic development ofacid-induced esophagitis in the cat″，Mod-Pathol.，3619-624(1990)；Carlborg et al.，″Tetracycline induced esophageal ulcers.Aclinical and experimental study″，Laryngoscope，93184-187(1983)；Carlborg et al.，″Esophageal lesions caused by orally administered drugs.An experimental study in the cat″，Eur-Surg-Ethanol on esophagealmotility in cats，Alcohol-Clin-Exp-Res.，15116-121(1991)和Katzet al.，″Acid-induced esophophagitis in cats is prevented by sucralfatebut not synthetic prostaglandin E.″，Dig-Dis-Sci.，33217-224(1988)]。
炎癥性腸病，如克羅恩氏病(主要影響小腸)和潰瘍性結(jié)腸炎(主要影響大腸)是病原不明的慢性疾病，其引起粘膜表面的破壞、炎癥、修復(fù)期間的傷疤和粘連形成和影響個(gè)體的顯著病癥。當(dāng)前的治療用來控制炎癥，然而，KGF治療已經(jīng)顯示了在IBD影響的動(dòng)物中誘導(dǎo)胃腸道上皮細(xì)胞的增殖[Housley et al.，J Clin Invest.941764-77，(1994)]。刺激粘膜表面的重鋪、引起更快的治愈的治療劑例如KGF，在控制疾病的進(jìn)展中可能是有益的。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的炎癥性腸病的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的。[Morris，et al.，″Hapten-induced Models of Chronic Inflammation and Ulceration in the RatColon″，Gastroenterology，96795-803(1989)；Rachmilewitz，et al.，″Inflammatory Mediators of Experimental Colitis in Rats″，Gastroenterology，97326-327(1989)；Allgayer，et al.，″Treatment with16，16′-dimethyl-prostaglandin E2 before and after induction of colitiswith trinitrobenzenesulfonic acid in Rats″，Gastroenterology，961290-1300(1989)；″ReviewExperimental Colitis in Animal Models″，Scand.J.Gastroenterol，27529-537(1992)]。
早產(chǎn)兒的透明膜病引起肺內(nèi)II型肺細(xì)胞的表面活性物質(zhì)生產(chǎn)的缺乏，引起肺泡的坍縮。透明膜病具有急性和慢性期。透明膜病的急性期(嬰兒呼吸窘迫綜合征-IRDS)用機(jī)械通氣來治療，并用80-100％濃度的呼吸用氧氣和通過施用外源的表面活性物質(zhì)來治療。經(jīng)歷的延長的療程的那些患者可能發(fā)展出透明膜病的慢性疾病階段(支氣管肺發(fā)育異常-BPD)。雖然表面活性物質(zhì)大大地降低了與IRDS相關(guān)的死亡率，與BPD相關(guān)的病狀仍然很高。因而，需要開發(fā)有效的治療來加速新生中肺的成熟和表面活性物質(zhì)的分泌以降低BPD的發(fā)病率。雖然皮質(zhì)類固醇可以在二十八周齡和更大的胎兒中在很大程度上加速成熟和分泌，當(dāng)前對(duì)于更小的胎兒沒有治療方法，在這些群體中產(chǎn)生顯著的病狀和死亡率。BPD的歷史表明，IRDS治療中的改善將與甚至更小的早產(chǎn)嬰兒的機(jī)械通氣和在這些較小嬰兒中BPD發(fā)病率的隨后提高匹配。誘導(dǎo)II型肺細(xì)胞的增殖和分化的治療劑如KGF[Yi et al.，Inflammation 22315-25(1998)]將在這些疾病的治療中具有相當(dāng)?shù)囊嫣帯Ｔ试S具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的IRDS的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的。Seider，et al.，″Effects of antenatal thyrotropin-releasing hormone，antenatal corticosteroids，and postnatal ventilationon surfactant mobilization in premature rabbits″，Am.J.Obstet.Gynec.，1661551-1559(1992)；Ikegami，et al.，″Corticosteroid and thyrotropin-releasing hormone effects on preterm sheep lung function″，J.Appl.Physiol.，702268-2278(1991)。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的BPD的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Yuh-Chin，et al.，″Naturalsurfactant and hyperoxide lung injury in primates I.Physiology andbiochemistry″，J.Appl.Physiol.76991-1001(1994)；and Galan，et al.，″Surfactant replacement therapy in utero for prevention of hyalinemembrane disease in the preterm baboon″，Am.J.Obstet.Gynecol.，169817-824(1993)]。
煙霧的吸入是在燒傷損傷后一周內(nèi)由于細(xì)支氣管上皮和肺泡的壞死而發(fā)病和死亡的重要原因。刺激這些結(jié)構(gòu)的增殖和分化并誘導(dǎo)它們的修復(fù)和再生的生長因子例如KGF將在治療吸入損傷中有益。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的煙霧吸入的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的。Hubbard，et al.，″Smoke inhalation injury in sheep″，Am.J.Pathol.，133660-663(1988)。
肺氣腫是肺泡的漸進(jìn)性損失引起的?？梢源碳ぶ匦律L，或?qū)τ诒３址闻菔羌?xì)胞保護(hù)性的生長因子例如KGF[Kaza et al.，Circulation.106(12 Suppl 1)I120-4(2002)]將有治療益處。目前，不能獲得有效的治療。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的肺氣腫的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Stolk et al.，″Induction of emphysema andbronchial mucus cell hyperplasia by intratracheal instillation oflipopolysaccharide in the hamster.″J.Pathol.，167349-56(1992)]。
繼發(fā)于病毒性肝炎和慢性酒精攝入的肝硬化是發(fā)病和死亡的主要原因。例如通過使用KGF對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)、增殖和分化[Danilenki，D.，Toxicol Pathol.2764-71(1999)]來提高肝功能對(duì)于減慢和防止肝硬化的發(fā)展是有益的。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的肝硬化的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Tomaszewski，et al.，″The productionof hepatic cirrhosis in rats″，J.Appl.Toxicol.，11229-231(1991)]。
暴發(fā)性肝衰竭是伴隨末期肝硬化發(fā)生的危急生命的狀況。可以誘導(dǎo)剩余肝細(xì)胞增殖的試劑例如KGF對(duì)于這種疾病將有直接益處，這在當(dāng)前僅能用肝臟移植來治療。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的暴發(fā)性肝衰竭的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Mitchell，et al.，″Acetaminophen-induced hepatic necrosis I.Role of drug metabolism″，J.Pharmcol.Exp.Ther.，187185-194(1973)；和Thakore andMehendale，″Role of hepatocellular regeneration in CC14autoprotection″，Toxicologic Pathol.1947-58(1991)]。
急性病毒性肝炎經(jīng)常是亞臨床的和自我限制的。然而，在少數(shù)患者中，嚴(yán)重的肝臟損傷可能在幾個(gè)星期中產(chǎn)生。細(xì)胞保護(hù)試劑例如KGF將是在防止肝細(xì)胞退化中有用的。
由醋氨酚、氟烷、四氯化碳和其他毒素引起的對(duì)肝臟的毒性損害可以通過對(duì)于肝細(xì)胞是細(xì)胞保護(hù)性的生長因子(KGF)來改善。允許具有人類治療效力的化合物的預(yù)示測(cè)試的肝臟毒性的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)模型是公知的[Mitchell，et al.(1973)，supra，and Thakore and Mehendale(1991)，supra)]。
移植物-抗-宿主疾病(GVHD)(慢性的或急性的)是在患者中無效的骨髓或造血細(xì)胞移植的主要原因。由于免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒性因子的上調(diào)，GVHD導(dǎo)致幾個(gè)器官系統(tǒng)的損傷。GVHD引起對(duì)多個(gè)區(qū)域的損害，包括胃腸道、肺、肝臟、皮膚，和眼中的粘膜腺、口中的唾液腺，和潤滑胃粘膜和腸的腺體。在用GVHD誘導(dǎo)的動(dòng)物中新近的研究表明，rHuKGF治療的接受者不發(fā)展腸GVHD，不發(fā)展內(nèi)毒素血癥，并且不死亡[Panoskaltsis-Mortari et al.，“Keratinocyte growthfactor facilitates alloengraftment and ameliorates graft-versus-hostdisease in mice by a mechanism independent of repair of conditioning-induced tissue injury”Blood.964350-6(2000)]。這些數(shù)據(jù)表明，通過保護(hù)由TNF-α、NO和其他可能的細(xì)胞毒性因子介導(dǎo)的上皮細(xì)胞損傷，KGF阻止了急性致死性GVHD的發(fā)展?？梢栽谠S多這些細(xì)胞類型中誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖的試劑例如KGF將在人類移植接受者中治療GVHD中有直接益處。
制劑和施用對(duì)于在藥物制劑中使用來治療如上所述的人類疾病，KGF蛋白或肽是有用的。KGF可以制備為液體或凍干制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，KGF組合物被凍干。凍干可以使用本領(lǐng)域常見的技術(shù)來進(jìn)行，并應(yīng)當(dāng)為所開發(fā)的組合物進(jìn)行優(yōu)化[Tang et al.，Pharm Res.21191-200，(2004)and Chang et al.，Pharm Res.13243-9(1996)]。
凍干循環(huán)通常由三個(gè)步驟組成冷凍、初次干燥和二次干燥[A.P.Mackenzie，Phil Trans R Soc London，Ser B，Biol 278167(1977)]。在冷凍步驟中，溶液被冷卻來啟動(dòng)結(jié)冰和完成。此外，這個(gè)步驟誘導(dǎo)填充劑的結(jié)晶。冰在初次干燥階段中升華，通過降低室壓力低于冰的蒸氣壓，使用真空并引入熱量來促進(jìn)升華。最后，在降低的室壓力和提高的擱板溫度下，在二次干燥階段吸附的或結(jié)合的水被除去。該過程產(chǎn)生稱為凍干塊的材料。此后所述塊可以用無菌注射水或合適的多劑量重構(gòu)溶液在使用之前被重構(gòu)。
凍干循環(huán)不僅確定了賦形劑的最終物理狀態(tài)，而且影響其他參數(shù)，例如重構(gòu)時(shí)間、外觀、穩(wěn)定性和最終含水量。冷凍狀態(tài)的組合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行經(jīng)過幾個(gè)轉(zhuǎn)變(例如，玻璃化轉(zhuǎn)變和結(jié)晶)，其在特定溫度下發(fā)生，可以用來了解和優(yōu)化凍干過程。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)可以提供關(guān)于溶質(zhì)的物理狀態(tài)的信息，可以通過示差掃描量熱法(DSC)來測(cè)定。這是在設(shè)計(jì)凍干循環(huán)時(shí)必需考慮的重要的參數(shù)。此外，在干燥狀態(tài)，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度提供了關(guān)于最終產(chǎn)物的保存溫度的信息。
在當(dāng)前組合物的特定實(shí)施方式中，穩(wěn)定劑被添加到凍干制劑來防止或降低凍干誘導(dǎo)的或存儲(chǔ)誘導(dǎo)的聚集和化學(xué)降解。重構(gòu)時(shí)模糊和混濁的溶液表明蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀。術(shù)語“穩(wěn)定劑”是指處于水性或固體狀態(tài)時(shí)能夠防止聚集或其他物理降解，以及化學(xué)降解(例如，自體分解、脫酰胺基、氧化，等等)的賦形劑。可以使用通常在藥物組合物中采用的穩(wěn)定劑，包括但不限于，蔗糖、海藻糖或甘氨酸[Carpenter etal.，Develop.Biol.Standard 74225，(1991)]。表面活性劑穩(wěn)定劑，例如聚山梨酯20(Tween 20)或聚山梨酯80(Tween 80)也可以以合適的數(shù)量添加來防止冷凍和干燥期間表面相關(guān)的聚集現(xiàn)象[Chang，B，J.Pharm.Sci.851325，(1996)]。如果期望，凍干組合物也可以包括適合于形成凍干“塊”的合適數(shù)量的填充和滲透性調(diào)節(jié)劑。填充劑可以是晶體的(例如，甘露醇、甘氨酸)或無定形的(例如，蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述填充劑是甘露醇。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，甘露醇以約2％到約5％w/v的濃度摻入，在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，以約3％到4.5％w/v的濃度摻入，來產(chǎn)生機(jī)械上和藥學(xué)上穩(wěn)定和精美的塊。在另一個(gè)實(shí)施方式中，甘露醇濃度是2％w/v。
還發(fā)現(xiàn)藥學(xué)上可接受的緩沖液和pH值的選擇影響當(dāng)前組合物的穩(wěn)定性。選擇組合物中存在的緩沖系統(tǒng)為生理上相容的，來維持重構(gòu)溶液中以及凍干前的溶液中期望的pH值。優(yōu)選的，緩沖液具有約pH6.0到約pH8.0范圍內(nèi)的pH緩沖能力。一般地進(jìn)行包括上述參數(shù)的一系列篩選研究來選擇最穩(wěn)定的制劑條件。
組合物預(yù)計(jì)在凍干狀態(tài)在2℃到8℃穩(wěn)定至少兩年。這種長期穩(wěn)定性對(duì)于延長藥物產(chǎn)品的貨架期是有益的。
本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期用于當(dāng)前KGF制劑的制備的方法。在一個(gè)方面，制備凍干的KGF制劑的方法包括步驟(a)在包含組氨酸、填充劑、糖類和表面活性劑的緩沖液中混合所述KGF組合物；(b)凍干所述KGF。
當(dāng)前方法進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)以下步驟在凍干前向所述混合物添加穩(wěn)定劑，在凍干前向所述組合物添加選自填充劑和滲透性調(diào)節(jié)劑和表面活性劑的至少一種試劑。所述填充劑可以是以上闡述的任何填充劑。優(yōu)選的，所述填充劑是甘露醇。糖類可以是以上闡述的任何穩(wěn)定化糖類。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定劑是蔗糖。表面活性劑可以是以上闡述的任何表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表面活性劑是聚山梨酯20。
凍干的材料的標(biāo)準(zhǔn)重構(gòu)操作是回添一定體積的純水或無菌注射水(WFI)(一般等量于凍干期間除去的體積)，而抗菌劑的稀釋溶液有時(shí)在腸胃外施用的藥物的生產(chǎn)中使用[Chen，Drug Development andIndustrial Pharmacy，181311-1354(1992)]。
凍干的KGF組合物可以被重構(gòu)為水溶液。各種含水載體，例如，無菌注射水、具有多種劑量用途的防腐劑的水，或具有合適數(shù)量的表面活性劑(例如，聚山梨酯20)、0.4％鹽、0.3％甘氨酸的水，或含水懸浮液可以含有所述活性化合物，與適合于含水懸浮液的生產(chǎn)的賦形劑混合。這種賦形劑是懸浮劑，例如，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散或潤濕劑可以是天然發(fā)生的磷脂，例如卵磷脂，或氧化烯與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，例如heptadecaethyl-eneoxycetanol，或環(huán)氧乙烷與來源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨糖醇一油酸酯，或環(huán)氧乙烷與來源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯單油酸山梨醇酐酯。含水懸浮液也可以含有一種或多種防腐劑，例如，乙基或正丙基、對(duì)羥基苯甲酸鹽。
為了向人類或試驗(yàn)用動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物，優(yōu)選的是在包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的組合物中配制組合物。術(shù)語“藥學(xué)上”或“藥理學(xué)上可接受的”是指分子實(shí)體和組合物是穩(wěn)定的，抑制蛋白質(zhì)降解例如聚集和切割產(chǎn)物，此外當(dāng)使用如下所述本領(lǐng)域公知的途徑施用時(shí)不產(chǎn)生過敏性，或其他有害反應(yīng)?！八帉W(xué)上可接受的載體”包括任何和所有臨床上有用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲試劑等等，包括以上公開的那些試劑。
可以口服地、局部地、經(jīng)皮地、胃腸外地、通過吸入噴霧、陰道地、直腸地或通過顱內(nèi)的注射來施用角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物。如在此使用的術(shù)語胃腸外的包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腦池內(nèi)注射或輸注技術(shù)。靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、乳房內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)注射或在特定部位的外科植入也是預(yù)期的。一般地，組合物基本上不含致熱原，以及對(duì)接受者有害的其他雜質(zhì)。
藥盒作為另外的方面，本發(fā)明包括藥盒，其包含以便于它們向受試者施用來使用的方式封裝的一種或多種化合物或組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，這種藥盒包括在此描述的化合物或組合物(例如，包含角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的組合物)，封裝在容器中，例如密封的瓶子或容器，具有附著在容器上或包括在包裝中、描述在實(shí)踐所述方法中使用該化合物或組合物的標(biāo)簽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥盒含有第一容器，其具有凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物，和第二容器，其具有用于所述凍干的組合物的生理學(xué)可接受的重構(gòu)溶液。優(yōu)選的，所述化合物或組合物以單位劑型封裝。所述藥盒可以進(jìn)一步包括適合于根據(jù)特定施用途徑來施用組合物的設(shè)備。優(yōu)選的，所述藥盒含有描述所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物的用途的標(biāo)簽。
根據(jù)以下實(shí)施例，本發(fā)明的其他方面和細(xì)節(jié)將是明顯的。
實(shí)施例1KGF的液體制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性、貨架期和生物活性對(duì)于任何治療效力的組合物是重要的方面。設(shè)計(jì)和配制當(dāng)在建議的貯存溫度保存延長的時(shí)間期是穩(wěn)定的、但保持了顯著的生物學(xué)活性的組合物，是藥物組合物的關(guān)鍵元素。
在先前的實(shí)驗(yàn)中，KGF的液體制劑顯示了在升高的溫度(37℃)下顯著的聚集和隨后的蛋白質(zhì)損失。為了確定為KGF組合物提供了最大穩(wěn)定性的pH值，在3.0到9.0的pH值范圍上測(cè)試了角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的液體制劑的pH值。
在以下的實(shí)驗(yàn)，例如，實(shí)施例1-3中使用的KGF是ΔN23 KGF分子。使用濃縮的HCl或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值。在37℃孵育后的時(shí)間0、6和28小時(shí)采集不同pH值的KGF制劑(0.5mg/ml，10mM緩沖液，0.1M NaCl))的樣品(附圖1)。通過SE-HPLC(附圖1A)或通過CE-HPLC(附圖1B)測(cè)量回收的蛋白質(zhì)的百分比。對(duì)于大小排阻HPLC(SE-HPLC)，將樣品(40μg)加樣到連接于HP 1090/1050機(jī)器的G2000SWx1柱(7.8mm×30cm)上。使用pH7.0的20mM磷酸鈉(NaP)，1M NaCl洗脫蛋白質(zhì)。通過215nm處的吸光度監(jiān)視蛋白質(zhì)。單體的峰值表明在KGF制劑中幾乎沒有聚集物。
陽離子交換(CE)-HPLC在裝備有Mono-S柱的HP 1090/1050上在室溫下進(jìn)行。40μg KGF蛋白質(zhì)裝載到柱上，使用pH8.0的20mM磷酸鈉緩沖液和鹽梯度(1M NaCl)來洗脫。通過215nm處的吸光度監(jiān)視洗脫的蛋白質(zhì)。
反相HPLC(RP-HPLC)在HP 1090/1050機(jī)器上使用來自Vydac的、孔徑大小300A的C4柱(4.6×250mm)進(jìn)行。將蛋白質(zhì)(30μg)注射到柱上，使用具有0.1％三氟乙酸(TFA)(v/v)和90％ ACN，水中的0.1％ TFA(v/v)的乙腈(ACN)梯度來洗脫。通過215nm處的吸光度監(jiān)視蛋白質(zhì)峰。
在pH5.0到9.0范圍上在時(shí)間0觀察到蛋白質(zhì)的完全回收。然而，由于即時(shí)的沉淀，在pH3.0觀察到完全的蛋白損失，pH4.0引起約80％的蛋白損失。在37℃6小時(shí)之后，從pH4.0樣品沒有獲得可溶的蛋白質(zhì)。當(dāng)可溶的KGF被配制在pH5到9時(shí)，在37℃下28小時(shí)后回收的蛋白質(zhì)百分比是低于20％。然而，在pH7.0，僅20％的總蛋白質(zhì)損失了。在37℃在28小時(shí)后可溶蛋白質(zhì)的損失主要是由于聚集。
這些結(jié)果表明液體制劑中的KGF蛋白在中性pH值是最穩(wěn)定的，然而即使在該最佳的pH范圍中，作為液體來保持KGF由于聚集引起了顯著的蛋白質(zhì)損失。
實(shí)施例2用于凍干的KGF組合物的制劑為了開發(fā)更穩(wěn)定的KGF組合物，決定將KGF配制為凍干的產(chǎn)品。配制凍干的KGF組合物的早先的努力包括操作重構(gòu)溶液，產(chǎn)生了取決于重構(gòu)溶液的組成產(chǎn)生較少蛋白聚集的組合物[Zhang et al.，Pharm.Res.121447-52(1995)]。然而，在這個(gè)早先的研究中，在重構(gòu)期間所見的任何聚集很難或不可能被逆轉(zhuǎn)。
這個(gè)實(shí)施例描述了在溶液中凍干蛋白質(zhì)，其將防止在重構(gòu)時(shí)獨(dú)立于重構(gòu)溶液的聚集，來消除對(duì)常規(guī)重構(gòu)溶液的需求。
為了確定穩(wěn)定的凍干制劑的組成，在改變的條件下凍干KGF，例如ΔN23 KGF，改變參數(shù)例如pH值、填充劑、糖類濃度和表面活性劑濃度。然后在建議的儲(chǔ)存溫度下測(cè)定KGF的長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
凍干循環(huán)為了凍干，將樣品裝載到預(yù)先冷卻到約4℃的室溫度的VirTisGenesis 12 EL試驗(yàn)規(guī)模(VirTis，Gardiner，N.Y.)冷凍干燥器中。樣品被快速地冷凍(約1℃/分鐘到-50℃)并保持在該溫度至少2小時(shí)。一旦樣品被置于冷凍干燥器中，擱板溫度以大約27℃/小時(shí)的速度降低到-50℃。樣品保持在-50℃2小時(shí)以確保完全冷凍。在結(jié)晶甘露醇的可選的步驟中，擱板溫度以10℃/小時(shí)的速度升高到-25℃，平衡2-3小時(shí)，然后以9℃/小時(shí)的速度冷卻到-55℃。在另外保持至少2小時(shí)之后，施加大約100mTorr的真空。擱板溫度升高到-35℃用于初次干燥，但可以在-45℃到-10℃的范圍內(nèi)。初次干燥持續(xù)40小時(shí)，但可以在24-48小時(shí)的范圍內(nèi)。擱板溫度然后以5℃/小時(shí)的速度升高到+20℃到+25溫度用于二次干燥，真空度降低到大約50mTorr)。二次干燥進(jìn)行36小時(shí)，但可以是進(jìn)行24-72小時(shí)的任何時(shí)間。在二次干燥完成時(shí)，在真空(≤25mTorr)下閉塞樣品，從冰凍干燥器上移除小瓶。將小瓶壓切去頭并置于各種溫度下用于穩(wěn)定性測(cè)試。
pH值對(duì)凍干的KGF的穩(wěn)定性的影響首先評(píng)定在一定pH值范圍內(nèi)的KGF穩(wěn)定性。在pH6.0、pH6.5或pH7.0下，在包含10組氨酸、3％甘露醇、2％蔗糖和0.01％聚山梨酯20的溶液中配制KGF(5mg/ml)。預(yù)先凍干的樣品的SE-HPLC表明了99％的主峰百分比，其相應(yīng)于99％的單體活性成分。
為了進(jìn)行加速的穩(wěn)定性研究，將一些樣品轉(zhuǎn)移到恒溫箱保存。其他樣品轉(zhuǎn)移到-70℃冰箱作為對(duì)照物。小瓶的大部分保存在4℃。在分析之時(shí)，用1.2mL無菌注射水(WFI)重構(gòu)樣品。
在45℃保存6個(gè)月后的凍干的KGF樣品的SE-HPLC表明，在所有測(cè)試的pH下樣品的主峰百分比是大約97.5％，表明在6.0到7.0的pH范圍內(nèi)凍干的KGF組合物在高溫下保存6個(gè)月后是穩(wěn)定的。這些研究還表明了當(dāng)制劑保存在4℃時(shí)5.0到8.0的pH值范圍提供了穩(wěn)定的蛋白。
蔗糖濃度對(duì)KGF穩(wěn)定性的影響為了評(píng)定為凍干的KGF提供最大穩(wěn)定性的蔗糖的量，將重組人類KGF(1mg/l)配制在pH7.0、缺乏蔗糖或者具有2％蔗糖(w/v)的溶液中包含10mM組氨酸、3％甘露醇的組合物中。如上凍干樣品并容許在45℃孵育直至3個(gè)月。
有或沒有蔗糖的KGF制劑的主峰百分比的SE-HPLC測(cè)量表明，添加2％蔗糖為凍干的KGF制劑提供了顯著的穩(wěn)定性。用2％蔗糖凍干的KGF展現(xiàn)了緊接著凍干之后的大約99.5％主峰，和在凍干后1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)的98.5％主峰。缺乏蔗糖的制劑展現(xiàn)了在凍干后1個(gè)月和3個(gè)月分別大約96％主峰和大約93.5％主峰。
這些結(jié)果表明，在沒有蔗糖的制劑中，在45℃保存3個(gè)月之后活性單體峰值百分比降低7％，而在具有蔗糖的制劑中單體峰值中僅有很小的降低。因此，當(dāng)添加到凍干的制劑時(shí)，蔗糖作為對(duì)KGF有力的穩(wěn)定劑起作用。
使用包含10mM組氨酸、pH6.5、1％到3％蔗糖的蔗糖濃度范圍上的KGF凍干產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分析，其中溶液總是用合適百分比的甘露醇維持等滲性。具有1％-3％蔗糖并在37℃保存一年的凍干產(chǎn)物顯示了與2％蔗糖的制劑相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性，對(duì)所有測(cè)試的制劑，主峰百分比保持99％以上。
聚山梨酯20濃度對(duì)KGF穩(wěn)定性的影響在KGF的凍干制劑中聚山梨酯20的濃度根據(jù)它在重構(gòu)時(shí)消除顆粒形成的能力來選擇。將重組人類KGF配制在包含10mM組氨酸、3％甘露醇、2％蔗糖、pH7.0的組合物中并凍干。然后在含有變化濃度的聚山梨酯20的溶液中重構(gòu)KGF。凍干的塊包括如上配制的5mg/mlKGF。表1說明了在重構(gòu)時(shí)凍干制劑的記錄的觀察結(jié)果。
表1
進(jìn)一步的研究顯示，與在重構(gòu)溶液中添加聚山梨酯20相比，凍干之前在塊中包括聚山梨酯20的制劑在45℃4個(gè)月后是相等地穩(wěn)定的。SE-HPLC分析[Biorad Biosil SEC 125(7.8mm×30cm)，20mMNaP，pH7.0，1M NaCl，40μg注射裝載]顯示，在0、1和4個(gè)月，對(duì)于所有測(cè)試的聚山梨酯濃度(如表1)單體KGF的損失可以忽略。根據(jù)它在重構(gòu)時(shí)一致地消除可見顆粒的能力選擇0.01％(w/v)的濃度用于包括在制劑中。
甘露醇濃度對(duì)KGF穩(wěn)定性的影響將甘露醇和其他填充劑包括在制劑中來獲得良好的塊外觀和質(zhì)量。此外，它們幫助維持具有生理性液體的藥物組合物的等滲性。例如，生理性液體具有290-320mOsm的摩爾滲透壓濃度。最終的KGF制劑中甘露醇濃度調(diào)節(jié)到與生理性液體等滲。
為了評(píng)定在凍干制劑中提供蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的甘露醇濃度百分比，在包含10mM組氨酸、2％蔗糖和0.01％聚山梨酯20，pH7.0，以及3％甘露醇或4％甘露醇的制劑中凍干3mg/ml的KGF。凍干KGF制劑并在4℃保存1年。使用來自Advanced Instruments(Norwood，MA)的Osmometer Model 3D3測(cè)量摩爾滲透壓濃度。4％甘露醇溶液的測(cè)量的摩爾滲透壓濃度是312mOsm，而3％甘露醇制劑產(chǎn)生250mOsm的溶液。
附圖2顯示了在零時(shí)間(附圖2A)或4℃保存1年后(附圖2B)與稍微低滲的3％甘露醇/2％蔗糖制劑相比，等滲的4％甘露醇/2％蔗糖制劑的反相(RP-HPLC)層析圖的覆蓋圖。結(jié)果表明，在2到8℃的建議的儲(chǔ)存溫度1年后，等滲的制劑是穩(wěn)定的。此外，等滲制劑的塊外觀也很好，它的含水量是低于2％。根據(jù)這項(xiàng)研究，4％甘露醇推薦用于凍干制劑中。
蛋白質(zhì)濃度對(duì)rHuKGF穩(wěn)定性的影響凍干樣品中的蛋白質(zhì)濃度也可能對(duì)蛋白質(zhì)的凍干質(zhì)量穩(wěn)定性以及重構(gòu)產(chǎn)物的穩(wěn)定性有影響。
在0.5、1、2、3和5mg/ml探索KGF濃度對(duì)穩(wěn)定性的影響。在10mM組氨酸、3％甘露醇、2％蔗糖和0.005％聚山梨酯20、pH6.5中配制和凍干樣品。凍干樣品在重構(gòu)前在45℃保存24周。通過SE-HPLC、RP-HPLC、CE-HPLC和SDS-PAGE監(jiān)視蛋白質(zhì)降解。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，使用HP系統(tǒng)和G2000SWx1柱如上進(jìn)行SE-HPLC。
附圖3顯示了在45℃保存24周后KGF的SE-HPLC分析的作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)的主峰百分比。短劃線表示測(cè)量數(shù)據(jù)的走向線。根據(jù)SE-HPLC數(shù)據(jù)，穩(wěn)定性隨著KGF濃度的提高而提高，至少直到5mg/ml的濃度。通過RP-HPLC和CE-HPLC測(cè)定的主峰百分比對(duì)蛋白質(zhì)濃度的依賴性與用SE-HPLC所見的類似。進(jìn)一步的研究表明，15mg/mL的蛋白質(zhì)濃度也產(chǎn)生了穩(wěn)定的凍干制劑。
包含10mM組氨酸、0.01％聚山梨酯20、2％蔗糖和3％甘露醇、pH6.5的優(yōu)化的KGF凍干制劑在2到8℃保存了超過4年。在重構(gòu)時(shí)，KGF制劑顯示維持了如下測(cè)試的KGF活性，表明特定的組合物維持了治療有效的藥物組合物所必需的穩(wěn)定性和活性類型。
實(shí)施例3重構(gòu)的KGF制劑的生物測(cè)定藥學(xué)上有效的產(chǎn)物的制劑中因素之一是對(duì)高生物學(xué)活性的目標(biāo)蛋白質(zhì)的需求。
KGF，例如ΔN23 KGF制劑的生物活性使用32D KECA克隆16細(xì)胞來測(cè)試，其是在KGF的存在下增殖的IL-3依賴性鼠原淋巴細(xì)胞，類似于32D克隆3細(xì)胞(ATCC#CRL-11346)，是有用的增殖分析系統(tǒng)，如Hsu et al.，1999 Biochemistry，38，2523-2534中所描述的。
32D克隆16細(xì)胞在37℃和5.5％ CO2維持在生長培養(yǎng)基[RPMI，胎牛血清(10％)(Hyclone，Logan，UT)，谷氨酰胺(1％)(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA，)，遺傳霉素(2％)(Gibco)和鼠IL-3(12ng/mL)(Biosource International，Camarillo，CA)]中。在分析培養(yǎng)基[RPMI，F(xiàn)BS(6％)，谷氨酰胺(1％)，肝素(0.6μg/ml)(Sigma，St.Louis，MO)]中將樣品KGF制劑或參考標(biāo)準(zhǔn)物(在-70℃凍干保存的ΔN23 KGF)重構(gòu)到大約25ng/mL。然后進(jìn)行連續(xù)稀釋來獲得從大約25ng/ml到1.6ng/ml的濃度范圍。
為了測(cè)試KGF制劑的生物活性，32D克隆16細(xì)胞以2.0×105細(xì)胞/mL的150μL平板接種。期望濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)物、對(duì)照物和KGF測(cè)試樣品以50μL體積添加到樣品孔中。細(xì)胞和樣品的平板在37℃和5.5％ CO2下培養(yǎng)大約24小時(shí)。在第2天，將40μL Alomar Blue(AccuMed International，Chicago，IL)添加到所有孔中并混合。在37℃和5.5％CO2下將平板孵育另外24小時(shí)。24小時(shí)后，使用530-560nm的激發(fā)波長和590nm的發(fā)射波長在Fluorescence Reader(CytofluorII或Cytofluor Series 4000，PerSeptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA)上測(cè)量熒光。
在2到8℃下保存7天的3個(gè)重構(gòu)份的凍干的KGF制劑顯示了與參考標(biāo)準(zhǔn)KGF蛋白質(zhì)(在-70℃凍干保存的)類似的生物活性，在第0天展現(xiàn)了≥100％生物活性，在第7天分別為92％、100％和107％活性。與天然KGF相比，在25℃保存的KGF制劑在時(shí)間0顯示了≥100％生物活性，在4小時(shí)后其分別稍微降低到90％、95％和100％生物活性。在25℃保存重構(gòu)的KGF制劑24小時(shí)后也維持了這種活性水平，表明了KGF制劑的穩(wěn)定性。
這些結(jié)果表明，在此描述的重構(gòu)的KGF制劑與參考標(biāo)準(zhǔn)KGF蛋白質(zhì)一樣有效，制劑對(duì)于KGF例如ΔN23KGF的穩(wěn)定性沒有有害效果，因而在治療個(gè)體以促進(jìn)上皮細(xì)胞等等的生長中作為治療是有用的。
此外，通過重構(gòu)制劑促進(jìn)Balb/C-MK細(xì)胞的生長的能力，可以評(píng)定KGF生物活性。在補(bǔ)充有10％胎牛血清、0.25μg/ml兩性霉素B和10ng/ml aPGF的低鈣Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中生長和維持Balb/MK細(xì)胞的儲(chǔ)用培養(yǎng)物。在10％CO2、99％濕度的大氣中在37℃孵育細(xì)胞。對(duì)于生物活性分析，如Gospodarowicz et al[J.Cell.Physiol.142325-333(1990)]中描述的，將細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞每孔的密度在1ml培養(yǎng)基中接種到12孔平板上。將預(yù)定數(shù)量的KGF制劑添加到細(xì)胞培養(yǎng)孔。FGF用作陽性對(duì)照。
培養(yǎng)五天后，將細(xì)胞胰蛋白酶消化，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定最終的細(xì)胞密度。通過用含有0.9％NaCl、0.01M磷酸鈉(pH7.4)、0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA(STV)的溶液替換培養(yǎng)基來從平板上釋放細(xì)胞，在37℃孵育5-10分鐘，然后將儲(chǔ)用培養(yǎng)物培養(yǎng)基添加到細(xì)胞。
與未處理的細(xì)胞相比在KGF處理的樣品中Balb/C-MK細(xì)胞群體的增加顯示了KGF組合物在配制過程期間不損失它的生物活性，表明KGF制劑提供了有效的治療劑來治療需要提高的KGF活性的受試者。
如上述說明性實(shí)例中闡述的本發(fā)明的許多修飾和變型預(yù)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能想到的。因而，如附隨的權(quán)利要求中出現(xiàn)的這種限制應(yīng)當(dāng)置于本發(fā)明之上。
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<120>角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的治療制劑<130>01017/40453<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3853<212>DNA<213>homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(446)..(1030)<400>1acgcgctcac acacagagag aaaatccttc tgcctgttga tttatggaaa caattatgat 60tctgctggag aacttttcag ctgagaaata gtttgtagct acagtagaaa ggctcaagtt 120gcaccaggca gacaacagac atggaattct tatatatcca gctgttagca acaaaacaaa 180agtcaaatag caaacagcgt cacagcaact gaacttacta cgaactgttt ttatgaggat 240ttatcaacag agttatttaa ggaggaatcc tgtgttgtta tcaggaacta aaaggataag 300gctaacaatt tggaaagagc aactactctt tcttaaatca atctacaatt cacagatagg 360aagaggtcaa tgacctagga gtaacaatca actcaagatt cattttcatt atgttattca 420tgaacacccg gagcactaca ctata atg cac aaa tgg ata ctg aca tgg atc 472Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile1 5ctg cca act ttg ctc tac aga tca tgc ttt cac att atc tgt cta gtg 520Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val10 15 20 25ggt act ata tct tta gct tgc aat gac atg act cca gag caa atg gct 568Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala30 35 40aca aat gtg aac tgt tcc agc cct gag cga cac aca aga agt tat gat 616Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp45 50 55tac atg gaa gga ggg gat ata aga gtg aga aga ctc ttc tgt cga aca 664Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr60 65 70cag tgg tac ctg agg atc gat aaa aga ggc aaa gta aaa ggg acc caa 712Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln75 80 85gag atg aag aat aat tac aat atc atg gaa atc agg aca gtg gca gtt 760Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val90 95 100 105gga att gtg gca atc aaa ggg gtg gaa agt gaa ttc tat ctt gca atg 808
Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met110 115 120aac aag gaa gga aaa ctc tat gca aag aaa gaa tgc aat gaa gat tgt856Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys125 130 135aac ttc aaa gaa cta att ctg gaa aac cat tac aac aca tat gca tca904Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser140 145 150gct aaa tgg aca cac aac gga ggg gaa atg ttt gtt gcc tta aat caa952Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln155 160 165aag ggg att cct gta aga gga aaa aaa acg aag aaa gaa caa aaa aca 1000Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr170 175 180 185gcc cac ttt ctt cct atg gca ata act taa ttgcatatgg tatataaaga 1050Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr190acccagttcc agcagggaga tttctttaag tggactgttt tctttcttct caaaattttc 1110tttcctttta ttttttagta atcaagaaag gctggaaaaa ctactgaaaa actgatcaag 1170ctggacttgt gcatttatgt ttgttttaag acactgcatt aaagaaagat ttgaaaagta 1230tacacaaaaa tcagatttag taactaaagg ttgtaaaaaa ttgtaaaact ggttgtacaa 1290tcatgatgtt agtaacagta atttttttct taaattaatt tacccttaag agtatgttag 1350atttgattat ctgataatga ttatttaaat attcctatct gcttataaaa tggctgctat 1410aataataata atacagatgt tgttatataa ggtatatcag acctacaggc ttctggcagg 1470atttgtcaga taatcaagcc acactaacta tggaaaatga gcagcatttt aaatgctttc 1530tagtgaaaaa ttataatcta cttaaactct aatcagaaaa aaaattctca aaaaaactat 1590tatgaaagtc aataaaatag ataatttaac aaaagtacag gattagaaca tgcttatacc 1650tataaataag aacaaaattt ctaatgctgc tcaagtggaa agggtattgc taaaaggatg 1710tttccaaaaa tcttgtatat aagatagcaa cagtgattga tgataatact gtacttcatc 1770ttacttgcca caaaataaca ttttataaat cctcaaagta aaattgagaa atctttaagt 1830ttttttcaag taacataatc tatctttgta taattcatat ttgggaatat ggcttttaat 1890aatgttcttc ccacaaataa tcatgctttt ttcctatggt tacagcatta aactctattt 1950taagttgttt ttgaacttta ttgttttgtt atttaagttt atgttattta taaaaaaaaa 2010accttaataa gctgtatctg tttcatatgc ttttaatttt aaaggaataa caaaactgtc 2070tggctcaacg gcaagtttcc ctcccttttc tgactgacac taagtctagc acacagcact 2130tgggccagca aatcctggaa gcagacaaaa ataagagcct gaagcaatgc ttacaataga 2190tgtctcacac agaacaatac aaatatgtaa aaactctttc accacatatt cttgccaatt 2250aattggatca tataagtaaa atcattacaa atataagtat ttacaggatt ttaaagttag 2310aatatatttg aatgcatggg tagaaaatat catattttaa aactatgtat atttaaattt 2370agtaattttc taatctctag aaatctctgc tgttcaaaag gtggcagcac tgaaagttgt 2430
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>信號(hào)肽<400>2Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg1 5 10 15
Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys2O 25 30Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser35 40 45Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile50 55 60Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp65 70 75 80Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn85 90 95Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly100 105 110Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr115 120 125Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu130 135 140Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly145 150 155 160Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly165 170 175Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala180 185 190Ile Thr<210>3<211>140<212>PRT<213>homo sapiens<400>3Set Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe1 5 10 15Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys20 25 30Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr35 40 45Val Ala Val Gly Ile Va1 Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr
50 55 60Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn65 70 75 80Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr85 90 95Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala100 105 110Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu115 120 125Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr130 135 140
權(quán)利要求
1.一種凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)組合物，其包含緩沖劑組氨酸、填充劑、糖類和表面活性劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和其變體構(gòu)成的組。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述KGF包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述KGF包含SEQ ID NO3中列出的ΔN23 KGF。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述填充劑是甘露醇。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述甘露醇是約2％到約5％w/v的濃度。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述甘露醇是4％w/v的濃度。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述糖類是蔗糖。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述蔗糖是約1％到約3％w/v的濃度。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述蔗糖是2％w/v。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中pH值在約6.0到約8.0的范圍內(nèi)。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中pH值在約6.0到約7.0的范圍內(nèi)。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述pH值是約6.5。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨酯20。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述聚山梨酯20濃度在約0.1％到約0.004％w/v的范圍內(nèi)。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述聚山梨酯20濃度是0.01％w/v。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中KGF濃度在3mg/mL到15mg/mL之間。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中KGF濃度是5mg/mL。
19.一種凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物，其包含10mM組氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖和0.01％(w/v)聚山梨酯20，其中所述組合物的pH值是6.5。
20.生產(chǎn)凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的方法，其包括步驟a)制備組氨酸、填充劑、糖類和表面活性劑的溶液；和b)凍干所述KGF。
21.權(quán)利要求20的方法，其還包括在凍干之前的下列步驟b)調(diào)節(jié)溶液的pH值到約6.0到約8.0之間的pH值；c)制備含有角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的溶液；d)緩沖液交換步驟(c)的溶液成步驟(b)的溶液；e)添加合適量的表面活性劑，和f)凍干來自步驟(e)的混合物。
22.權(quán)利要求20或21的方法，其中所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和其變體構(gòu)成的組。
23.權(quán)利要求20或21的方法，其中所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求20或21的方法，其中所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子包含SEQ ID NO3中所列的ΔN23 KGF。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述表面活性劑是聚山梨酯20。
26.一種通過提高上皮細(xì)胞生長的KGF介導(dǎo)的刺激用于治療疾病的方法，其包括向受試者施用有效量的權(quán)利要求1的凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述疾病是腸毒性；粘膜炎；燒傷或其他部分和完全的深層損傷；毛囊、汗腺和皮脂腺的再生；附件結(jié)構(gòu)增生；大皰性表皮松解；化學(xué)療法誘導(dǎo)的脫發(fā)；男性型禿發(fā)；胃潰瘍；十二指腸潰瘍；糜爛性胃炎、食菅炎或食管回流；炎癥性腸?。煌该髂げ?；煙霧吸入的損傷；肺氣腫；肝硬化、肝衰竭、急性病毒性肝炎、對(duì)肝臟的其他有毒損害；或移植物-抗-宿主疾病(GVHD)。
28.一種用于制備含水藥物組合物的藥盒，其包含具有凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子組合物的第一容器，和具有用于所述凍干組合物的生理學(xué)上可接受的溶劑的第二容器。
29.權(quán)利要求28的藥盒，其中所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和其變體構(gòu)成的組。
30.權(quán)利要求28的藥盒，其中所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
31.權(quán)利要求28的藥盒，其中所述角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子包含SEQ ID NO3中所列的ΔN23 KGF。
全文摘要
本發(fā)明提供了凍干的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的長期穩(wěn)定的制劑，和制備包含角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子的凍干組合物的方法。
文檔編號(hào)A61K47/18GK101084008SQ200580043314
公開日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日
發(fā)明者M·J·特洛伊黑特, V·達(dá)馬瓦拉姆, J·普爾特爾, S·E·羅伊 申請(qǐng)人:安姆根有限公司