專(zhuān)利名稱(chēng)：(5s)－3－[(s)－氟(4－三氟甲基苯基)甲基]－5,6,7,8－四氫喹啉－5－醇衍生物和它 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的四氫喹啉衍生物，它的制備方法，它對(duì)于治療和/或防止疾病的自身或組合應(yīng)用，以及它對(duì)于制備藥物的應(yīng)用，特別是作為治療和/或防止心血管疾病，特別是低脂蛋白血癥，異常脂肪血癥，高甘油三酯血癥，高脂血癥，高膽固醇血癥和動(dòng)脈硬化的膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)的抑制劑。
由動(dòng)脈硬化引起的冠心病是現(xiàn)代社會(huì)的死亡主因之一。在大量研究中，顯示HLD膽固醇的低血漿濃度是動(dòng)脈硬化形成的重要危險(xiǎn)因素[Barter and Rye，Atherosclerosis121，1-12(1996)]。除了LDL(低密度脂蛋白)和VLDL(非常低密度脂蛋白)，(高密度脂蛋白)是一類(lèi)脂蛋白，其最重要的功能是在血液中脂的運(yùn)輸，例如膽固醇，膽固醇酯，甘油三酯，脂肪酸或磷脂。高LDL膽固醇濃度(＞160mg/dl)和低HDL膽固醇濃度(＜40mg/dl)基本上促成了動(dòng)脈硬化的形成[ATP III Guidelines，Report of the NCEP ExpertPanel]。除了冠心病，不利的HLD/LDL比率也促進(jìn)了外周血管疾病和中風(fēng)的形成。因此，提高血漿中HDL膽固醇的新方法是防止和治療動(dòng)脈硬化和與其有關(guān)的疾病的治療上有用的進(jìn)步。
膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)調(diào)節(jié)血中不同脂蛋白間的膽固醇酯和甘油三酯的交換[Tall，J.Lipid Res.34，1255-74(1993)]。這里特別重要的是膽固醇酯由HDL到LDL的轉(zhuǎn)移，其導(dǎo)致了血漿HDL膽固醇濃度的減少。固此，CETP的抑制應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致了HDL膽固醇的血漿濃度的升高和LDL膽固醇血漿濃度的減少并因此導(dǎo)致了血漿中脂質(zhì)性質(zhì)的治療上有用的影響[McCarthy，Medicinal Res.Rev.13，139-59(1993)；Sitori，Pharmac.Ther.67，443-47(1995)；Swenson，J.Biol.Chem.264，14318(1989)]。
具有藥理學(xué)活性的四氫喹啉由EP-A-818 448，WO 99/14215，WO99/15504和WO 03/028727是已知的。具有藥理學(xué)活性的取代四氫喹啉由WO 99/14174是已知的。
本發(fā)明的目的是提供控制疾病，特別是心血管疾病的新的物質(zhì)，該物質(zhì)具有改進(jìn)的治療性能。
本發(fā)明提供了具有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物 其中R1代表環(huán)己基或環(huán)戊基，R2和R3各自代表甲基或一起形成環(huán)丁烷，R4代表環(huán)戊基或異丙基，和它們的鹽，溶劑化物和鹽的溶劑化物。
本發(fā)明特別提供了具有系統(tǒng)命名(5′S)-4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′-醇和結(jié)構(gòu)式(Ia)的化合物 和它的鹽，溶劑化物和鹽的溶劑化物。
本發(fā)明還特別提供了具有系統(tǒng)命名(5′S)-2′，4′-二環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′-醇和結(jié)構(gòu)式(Ib)的化合物
和它的鹽，溶劑化物和鹽的溶劑化物。
本發(fā)明還特別提供了具有系統(tǒng)命名(5′S)-4′-環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-2′-異丙基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-5′-醇和結(jié)構(gòu)式(Ic)的化合物 和它的鹽，溶劑化物和鹽的溶劑化物。
本發(fā)明還特別提供了具有系統(tǒng)命名(5S)-2，4-二環(huán)戊基-3-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-5-醇和結(jié)構(gòu)式(Id)的化合物 和它的鹽，溶劑化物和鹽的溶劑化物。
本發(fā)明還特別提供了具有系統(tǒng)命名(5S)-4-環(huán)戊基-3-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-2-異丙基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-5-醇和結(jié)構(gòu)式(Ie)的化合物
和它的鹽，溶劑化物和鹽的溶劑化物。
在下文，具有根據(jù)本發(fā)明的式(Ia)-(Ie)的化合物以單數(shù)稱(chēng)作具有根據(jù)本發(fā)明的式(I)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的化合物也可以以立體異構(gòu)的形式(對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體)存在。本發(fā)明包括所有的對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體和它們各自的混合物。從這種對(duì)映異構(gòu)體和/或非對(duì)映異構(gòu)體的混合物，可以以已知的方式分離立體異構(gòu)的均一組分。優(yōu)選式(I)中顯示的在C-5′和在C-3′a的S-構(gòu)型。
在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的鹽是根據(jù)本發(fā)明的化合物的生理可接受鹽。本發(fā)明還包括本身不適合于藥物應(yīng)用，但是可以例如用于分離或純化根據(jù)本發(fā)明的化合物的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的化合物的生理可接受鹽包括無(wú)機(jī)酸，羧酸和磺酸的酸加成鹽，例如氫氯酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，甲烷磺酸，乙烷磺酸，甲苯磺酸，苯磺酸，萘二磺酸，乙酸，三氟乙酸，丙酸，乳酸，酒石酸，蘋(píng)果酸，檸檬酸，富馬酸，馬來(lái)酸和苯甲酸的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的化合物的生理可接受鹽還包括普通堿的鹽，例如和優(yōu)選堿金屬鹽(例如鈉鹽和鉀鹽)，堿土金屬鹽(例如鈣鹽和鎂鹽)和衍生自氨或具有1-16個(gè)碳原子的有機(jī)胺，例如和優(yōu)選乙胺，二乙胺，三乙胺，乙基二異丙胺，一乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，二環(huán)己基胺，二甲基氨基乙醇，普魯卡因，二芐基胺，N-甲基嗎啉，精氨酸，賴(lài)氨酸，乙二胺和N-甲基哌啶的銨鹽。
在本發(fā)明的上下文中，溶劑化物指本發(fā)明的化合物的那些形式，其以固體或液體的狀態(tài)通過(guò)與溶劑分子的配位作用形成配合物。水合物是溶劑化物的特定形式，其中配位作用是與水進(jìn)行。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的溶劑化物是水合物。
并且，本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的化合物的藥物前體(Prodrug)。術(shù)語(yǔ)“藥物前體”包括本身可以是生物活性或非活性但其僅在身體內(nèi)停留期間被轉(zhuǎn)化(例如代謝或水解)成本發(fā)明的化合物的化合物。
在本發(fā)明的上下文中，(C1-C4)-烷基代表具有1-4個(gè)碳原子的直鏈或分支烷基基團(tuán)。例如和優(yōu)選可以提到下列基團(tuán)甲基，乙基，正-丙基，異丙基，正-丁基，異-丁基，仲-丁基和叔-丁基。
本發(fā)明還提供了制備具有根據(jù)本發(fā)明的式(I)的化合物方法，其中R1，R2，R3和R4各自如以上所定義并且對(duì)于具有式(Ia)的化合物其以實(shí)施例的方式顯示，特征在于具有式(II)的化合物 首先通過(guò)不對(duì)稱(chēng)還原轉(zhuǎn)化成具有式(III)的化合物 其之后[A]通過(guò)引入羥基保護(hù)基團(tuán)轉(zhuǎn)化成具有式(IV)的化合物
其中PG代表羥基保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選具有式-SiR1R2R3的基團(tuán)，其中R1，R2和R3是相同的或不同的和代表(C1-C4)-烷基，和之后通過(guò)非對(duì)映選擇性還原轉(zhuǎn)化成具有式(V)的化合物 其中PG如以上所定義，或反應(yīng)順序相反的順序[B]首先通過(guò)非對(duì)映選擇性還原產(chǎn)生具有式(IV)的化合物 其之后通過(guò)區(qū)域選擇性的引入羥基保護(hù)基團(tuán)PG轉(zhuǎn)化成具有式(V)的化合物，具有式(V)化合物之后使用氟化劑反應(yīng)產(chǎn)生具有式(VII)的化合物 其中PG如以上所定義，和之后通過(guò)常規(guī)方法再去掉羥基保護(hù)基團(tuán)PG產(chǎn)生具有式(I)的化合物和任選地具有式(I)的化合物用合適的(i)溶劑和/或(ii)堿或酸轉(zhuǎn)化成它的溶劑化物，鹽和/或鹽的溶劑化物。
具有式(II)的化合物可以通過(guò)在質(zhì)子酸或路易斯酸存在的條件下以3-組分反應(yīng)具有式(VIII)，(IX)和(X)的化合物 彼此反應(yīng)產(chǎn)生具有式(XI)的化合物
和之后氧化該化合物成具有式(II)的化合物。
具有式(VIII)和(X)的化合物可商購(gòu)，由文獻(xiàn)已知或類(lèi)似于文獻(xiàn)已知的方法制備(參見(jiàn)WO 99/14215和WO 03/028727)。
具有式(IX)的化合物可以通過(guò)酸催化的環(huán)丙酮縮醛與1-(三苯基正膦叉基)丙酮(1-(triphenylphosphoranylidene)acetone)的維悌希反應(yīng)獲得以產(chǎn)生1-環(huán)丙叉基丙酮和隨后與丙二酸酯反應(yīng)(見(jiàn)方案1；參見(jiàn)WO 03/028727和I.Kortmann，B.Westermann，Synthesis1995，931-933)。
對(duì)于各個(gè)方法步驟合適的惰性溶劑是例如醚，例如乙醚，二異丙基醚，二烷，四氫呋喃，乙二醇二甲基醚或二乙二醇二甲基醚，烴，例如，例如苯，甲苯，二甲苯，己烷，環(huán)己烷或礦物油組分，或鹵代烴，例如二氯甲烷，三氯甲烷，四氯化碳，1，2-二氯乙烷，三氯乙烯，或氨苯。也可能使用提到的溶劑的混合物。
在方法步驟(II)→(III)，(IV)→(V)和(III)→(V)中的還原通常使用適合于將酮還原成羥基化合物的還原劑進(jìn)行。這些特別包括絡(luò)合氫化鋁或硼氫化物，例如氫化鋰，氫化鈉，氫化鉀，硼氫化鋅，氫化鋁鋰，二異丁基氫化鋁(DIBAH)，二氫化二(2-甲氧基乙氧基)鋁鈉，三烷基硼氫化鋰或氫化三烷氧基鋁鋰，或硼烷配合物，例如硼烷四氫呋喃，硼烷二甲基硫醚或硼烷N，N-二乙基苯胺配合物。
在方法步驟(II)→(III)中的不對(duì)稱(chēng)還原在催化量(0.01-0.3摩爾當(dāng)量)的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體純(1R，2S)-1-氨基茚滿(mǎn)-2-醇作為手性誘導(dǎo)體存在的條件下進(jìn)行。為此目的優(yōu)選使用的還原劑是硼烷，N，N-二乙基苯胺配合物。反應(yīng)通常在以上列出的一種醚中或在甲苯中，優(yōu)選在進(jìn)行四氫呋喃中，在-80℃-+50℃，優(yōu)選0℃-+30℃的溫度范圍進(jìn)行。
對(duì)于還原(IV)→(V)和(III)→(V)使用的還原劑優(yōu)選二異丁基氫化鋁(DIBAH)。反應(yīng)通常在以上列出的一種醚中或在甲苯中，優(yōu)選在進(jìn)行四氫呋喃或甲苯中，在-80℃-+50℃，優(yōu)選-60℃-+30℃的溫度范圍進(jìn)行。
對(duì)于方法步驟(III)→(IV)或(VI)→(V)優(yōu)選的羥基保護(hù)基團(tuán)是甲硅烷基基團(tuán)，例如三甲基甲硅烷基，三乙基甲硅烷基，三異丙基甲硅烷基或叔-丁基二甲基甲硅烷基。特別優(yōu)選叔-丁基二甲基甲硅烷基。甲硅烷基基團(tuán)通常在堿，例如三乙基胺，N，N-二異丙基乙基胺，吡啶，2，6-盧剔啶或4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)存在的條件下在作為溶劑的以上列出的一種烴，鹵代烴，醚或在二甲基甲酰胺中加入。
在方法步驟(III)→(IV)中，使用的甲硅烷基化劑優(yōu)選與作為堿的2，6-盧剔啶結(jié)合的三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯。反應(yīng)優(yōu)選在二氯甲烷或甲苯中，在-40℃-+40℃，優(yōu)選-20℃-+30℃的溫度范圍進(jìn)行。
在方法步驟(VI)→(V)中，使用的甲硅烷基化劑優(yōu)選與作為堿的三乙基胺和DMAP結(jié)合的叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物。反應(yīng)優(yōu)選在二甲基甲酰胺中，在0℃-+100℃，優(yōu)選+20℃-+80℃的溫度范圍進(jìn)行。
在方法步驟(VI)→(VII)中的氟化通常在以上列出的一種烴或鹵代烴或乙腈，優(yōu)選在甲苯或二氯甲烷中進(jìn)行，使用作為氟化劑的二乙基氨基三氟化硫(DAST)或嗎啉三氟化硫。
在方法步驟(VII)→(I)中甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)的除去通常在酸，例如氫氯酸或三氟乙酸的幫助下，或在氟化物，例如氟化氫或四丁基氟化銨(TBAF)的幫助下進(jìn)行。合適的惰性溶劑是以上列出的醚，醇，例如甲醇或乙醇，或以上列出的溶劑的混合物。除去通常使用TBAF在作為溶劑的四氫呋喃中進(jìn)行。反應(yīng)通常在-20℃-+60℃，優(yōu)選0℃-+30℃的溫度范圍進(jìn)行。
縮合反應(yīng)(VIII)+(IX)+(X)→(XI)通常在以上列出的一種醚中，在醇，例如甲醇，乙醇，正-丙醇或異丙醇中，在乙腈或提到的溶劑的混合物種進(jìn)行。優(yōu)選使用二異丙基醚。
適合于該方法步驟的質(zhì)子酸通常是有機(jī)酸，例如乙酸，三氟乙酸，草酸或?qū)?甲苯磺酸，或無(wú)機(jī)酸，例如氫氯酸，硫酸，或磷酸。合適的還是路易斯酸，例如氯化鋁或氯化鋅。優(yōu)選三氟乙酸。
通常，反應(yīng)在0℃-+120℃，優(yōu)選+20℃-+80℃的溫度范圍進(jìn)行。
在方法步驟(XI)→(II)中氧化(脫氫)通常在以上列出的一種鹵代烴中，或任選在醇，例如甲醇或乙醇中，在乙腈中或在水中進(jìn)行。合適的氧化劑是，例如硝酸，硝酸銨銫(IV)，2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)，氯鉻酸吡啶(PCC)，四氧化鋨，二氧化錳或使用二氧化鉑或炭載鉑的催化脫氫。優(yōu)選在作為溶劑的二氯甲烷中使用DDQ的氧化。氧化通常在-50℃-+100℃，優(yōu)選0℃-+40℃的溫度范圍進(jìn)行。
各個(gè)方法步驟在大氣壓，升壓或減壓(例如0.5-5bar)下進(jìn)行。通常，方法步驟在大氣壓下進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明具有式(Ib)→(Ie)的化合物的制備類(lèi)似地進(jìn)行和通過(guò)以下的合成方案解釋方案a1
方案a2
方案b1 方案b2
方案c
方案d
方案e [縮寫(xiě)tBu＝叔-丁基；DAST-二甲基氨基三氟化硫；DDQ2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌；DIBAH＝二異丁基氫化鋁；Et＝乙基；Me＝甲基；Ph＝苯基；p-TsOH＝對(duì)-甲苯磺酸；TBAF＝四丁基氟化銨；TBDMSOTf＝三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯；TFA＝三氟乙酸]。
根據(jù)本發(fā)明的化合物具有不可預(yù)見(jiàn)的有用的藥理學(xué)活性譜。因此，它適合于用作治療和/或預(yù)防人和動(dòng)物疾病的藥物活性化合物。
根據(jù)本發(fā)明的化合物打開(kāi)了進(jìn)一步的治療選擇并且代表藥理學(xué)的進(jìn)步。與已知的和以前使用的制劑相比，根據(jù)本發(fā)明的化合物顯示了改進(jìn)的作用譜。
它優(yōu)選以巨大的特異性，好的耐受性和較少的副作用，和減少的毒性而突出，特別是在心血管領(lǐng)域和在肝領(lǐng)域。
根據(jù)本發(fā)明的化合物的優(yōu)點(diǎn)是它在人血漿中的高活性。根據(jù)本發(fā)明的化合物的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是減少的與代謝酶，特別是細(xì)胞色素P450酶和更特別是與P450 3A4酶相互作用的潛力。另外，根據(jù)本發(fā)明的化合物具有減少的在脂肪組織中沉淀的傾向。
根據(jù)本發(fā)明具有式(I)的化合物具有有用的藥理學(xué)性能和可以用于防止和治療疾病。根據(jù)本發(fā)明的化合物特別是膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)的高效抑制劑并刺激逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)。它升高了血中的HDL膽固醇濃度。根據(jù)本發(fā)明的化合物特別適合于治療和初級(jí)或中級(jí)防止冠心病疾病，例如心肌梗死。另外，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以用于治療和防止動(dòng)脈硬化，再狹窄，中風(fēng)和阿爾茨海默病。并且，根據(jù)本發(fā)明的化合物也可以用于治療和防止低脂蛋白血癥，異常脂肪血癥，高甘油三酯血癥，高脂血癥，高膽固醇血癥，肥胖(Adipositas)，肥胖癥(Obesitas)，胰腺炎，胰島素依賴(lài)型和非胰島素依賴(lài)型糖尿病，糖尿病后遺癥，例如視網(wǎng)膜病，腎病和神經(jīng)病，復(fù)合性高脂血癥和代謝綜合征。
根據(jù)本發(fā)明的化合物的藥理學(xué)作用可以使用以下描述的CETP抑制試驗(yàn)測(cè)定。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的化合物對(duì)于治療和/或防止疾病，特別是以上提到的疾病的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的化合物對(duì)于制備用于治療和/或防止疾病，特別是以上提到的疾病的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了使用有效量的根據(jù)本發(fā)明的化合物治療和/或防止疾病，特別是以上提到的疾病的方法。
本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明的化合物和一種或多種活性化合物用于治療和/或防止疾病的藥物。適合于組合的活性化合物是例如和優(yōu)選·抗糖尿病藥，·具有抗血栓作用的物質(zhì)，·降血壓物質(zhì)，
·脂質(zhì)代謝改性物質(zhì)，·抗炎性物質(zhì)，·穩(wěn)定動(dòng)脈硬化性鼠疫(Plaque)的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明具有式(I)的化合物可以?xún)?yōu)選與以下一種或多種物質(zhì)組合·在Roten Liste 2002/II，第12章中提到的抗糖尿病藥，·具有抗血栓作用的劑，例如和優(yōu)選血小板聚集抑制劑或抗凝劑，·降血壓藥，例如和優(yōu)選鈣拮抗劑，血管緊張素AII拮抗劑，ACE抑制劑，β阻滯劑，磷酸二酯酶抑制劑，可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的刺激劑，cGMP增強(qiáng)物和利尿藥，和/或·改性脂質(zhì)代謝的活性物質(zhì)，例如和優(yōu)選甲狀腺受體激動(dòng)劑，膽固醇合成抑制劑，例如HMG-CoA還原酶抑制劑，角鯊烯合成抑制劑，角鯊烯環(huán)氧酶抑制劑或氧化角鯊烯環(huán)化酶抑制劑，ACAT抑制劑，MTP抑制劑，PPAR激動(dòng)劑，fibrate(貝特)，脂酶抑制劑，膽固醇吸收抑制劑，膽酸再吸收抑制劑，聚合膽酸吸收劑和脂蛋白拮抗劑。
抗糖尿病藥理解為例如和優(yōu)選胰島素或胰島素衍生物，和與低血糖癥作用的口服有效的化合物。
這里胰島素或胰島素衍生物包括動(dòng)物，人或生物技術(shù)起源的胰島素和其混合物。
與低血糖癥作用的口服有效的化合物包括例如和優(yōu)選，磺酰脲類(lèi)，雙胍類(lèi)，格列萘類(lèi)(meglitinide)衍生物，二唑二酮，四氫噻唑二酮，葡糖苷酶抑制劑，胰高血糖素拮抗劑，GLP-1激動(dòng)劑，胰島素敏化劑，涉及葡糖異生作用和/或糖原分解作用的刺激的肝酶抑制劑，葡糖吸收和鉀通道開(kāi)放劑的調(diào)節(jié)劑，例如，在WO 97/26265和WO99/03861中揭示的那些。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與胰島素結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與磺酰脲類(lèi)，例如和優(yōu)選甲苯磺丁脲，格列本脲(glibenclamide)，格列美脲(glimepiride)，格列吡嗪(glipizide)或格列其特(gliclazide)結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與雙胍類(lèi)，例如和優(yōu)選二甲雙胍(Metformin)混合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的的化合物與格列萘類(lèi)衍生物，例如和優(yōu)選瑞格列萘(repaglinide)或那格列萘(nateglinide)結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的的化合物與PPARγ激動(dòng)劑，例如來(lái)自四氫噻唑二酮類(lèi)，例如和優(yōu)選吡格列酮(pioglitazone)，或羅格列酮(rosiglitazone)結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的的化合物與PPARα/γ激動(dòng)劑，例如和優(yōu)選GI-262570(farglitazar)，GW 2331，GW409544，AVE 8042，AVE 8134，AVE 0847，MK-0767(KRP-297)或或AZ-242結(jié)合服用。
具有抗血栓作用的劑優(yōu)選理解為選自血小板聚集抑制劑的化合物，例如和優(yōu)選阿司匹林，氯吡格雷，噻氯匹定或雙嘧達(dá)莫，或抗凝劑。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與凝血酶抑制劑，例如和優(yōu)選希美加群(ximelagatran)，美拉加群(melagatran)，比伐盧定(bivalirudin)或克塞(clexane)結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與GP II b/IIIa拮抗劑，例如和優(yōu)選替洛非班或阿昔單抗結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與因子X(jué)a抑制劑，例如和優(yōu)選DX 9065a，DPC 906，JTV 803或BAY 59-7939結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與肝素或低分子量的(LMW)肝素衍生物結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與維生素K拮抗劑，例如和優(yōu)選香豆素(coumarine)結(jié)合服用。
降血壓藥理解為例如和優(yōu)選來(lái)自鈣拮抗劑的化合物，例如和優(yōu)選化合物硝苯地平，氨氧地平，尼群地平，尼索地平，維拉帕米或地爾硫草，血管緊張素A II拮抗劑，ACE抑制劑，β阻滯劑和利尿藥。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與α1受體的拮抗劑結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與利血平，米諾地爾，二氮嗪，二肼屈嗪，肼屈嗪和與氧化氮-釋放物質(zhì)，例如和優(yōu)選硝酸甘油或硝普鈉結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與血管緊張素A II拮抗劑，例如和優(yōu)選洛沙坦，纈沙坦，坎德沙坦，替米沙坦，embursatan，依貝沙坦，奧美沙坦，他索沙坦或沙普立沙坦(saprisartan)結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與ACE抑制劑，例如和優(yōu)選依那普利，卡托普利，雷米普利，西拉普利，福辛普利，喹那普利(quinopril)，培哚普利或群多普利結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與β阻滯劑，例如和優(yōu)選心得安或阿替洛爾結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與利尿藥，例如和優(yōu)選腹安酸結(jié)合服用。
脂質(zhì)代謝改性劑理解為，例如和優(yōu)選來(lái)自以下的化合物甲狀腺受體激動(dòng)劑，膽固醇合成抑制劑，例如HMG-CoA還原酶抑制劑或角鯊烯合成抑制劑，ACAT抑制劑，MTP抑制劑，PPAR激動(dòng)劑，fibrate(貝特)，膽固醇吸收抑制劑，膽酸再吸收抑制劑，脂酶抑制劑，聚膽酸吸收劑和脂蛋白拮抗劑。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與甲狀腺受體激動(dòng)劑，例如和優(yōu)選D-甲狀腺素，3，5，3′-三碘甲腺原氨酸(T3)，CGS 23425或axitirome(CGS 26214)結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與角鯊烯合成抑制劑，例如和優(yōu)選BMS-188494或TAK-475結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與ACAT抑制劑，例如和優(yōu)選阿伐麥布，eflucimibe或CS-505結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與膽固醇吸收抑制劑，例如和優(yōu)選依澤替米貝，替喹胺或帕馬喹結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與膽酸再吸收劑抑制劑，例如和優(yōu)選barixibat，AZD 7508，SC 435，SC 635 S-8921，264W94或HM 1453結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與MTP抑制劑，例如和優(yōu)選implitapide，BMS-201038或R-103757結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與PPAR-激動(dòng)劑，例如貝特菲諾貝特，氨貝胺，苯扎貝特，環(huán)丙貝特或吉非貝齊，例如和優(yōu)選GW 9578，GW 7647，LY-518674或NS-220結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與PPAR-δ激動(dòng)劑，例如和優(yōu)選GW 501516結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與混合的PPARα/δ激動(dòng)劑，例如和優(yōu)選GI-262570(farglitazar)，GW 2331，QW409544，AVE 8042，AVE 8134，AVE 0847，MK-0767(KRP-297)或AZ-242結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與混合的PPARα/γ/δ激動(dòng)劑，例如和優(yōu)選MCC-555結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與來(lái)自?xún)?nèi)皮脂酶抑制劑，胰脂酶抑制劑，胃脂酶抑制劑，荷爾蒙-敏感脂酶抑制劑或肝脂酶抑制劑結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與胰脂酶抑制劑，優(yōu)選利普司他汀(lipstatin)，例如奧利司他結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與聚膽酸吸收劑，例如和優(yōu)選考來(lái)烯胺，考來(lái)替泊，colesolvam，CholestaGel或colestimid結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與脂蛋白拮抗劑，例如和優(yōu)選gemcabene calcium(I-1027)或煙酸結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與煙酸受體拮抗劑，例如和優(yōu)選niaspan，阿西莫斯或戊四煙酯結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與Antioxidans，例如和優(yōu)選Probucol，AGI1067或Bo653結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與LDL受體誘導(dǎo)物，例如和優(yōu)選利非貝羅結(jié)合服用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有式(I)的化合物與來(lái)自抑制素類(lèi)的HMG-CoA還原酶抑制劑，例如和優(yōu)選洛伐他汀，斯伐他汀，普伐他汀，氯伐他汀，阿托伐他汀，瑞舒伐他汀，西立伐他汀(cerivastatin)或匹伐他汀鈣(pitavastatin)結(jié)合服用。
本發(fā)明還提供了具有式(I)的化合物與減少HMG-CoA還原酶基因表達(dá)的物質(zhì)的組合。這種物質(zhì)可以是例如HMG-CoA還原酶轉(zhuǎn)錄或HMG-CoA還原酶翻譯的抑制劑?？梢岳缤ㄟ^(guò)抑制S1P(位置-1)蛋白酶，或降低SREBP(甾醇受體結(jié)合蛋白)濃度影響HMG-CoA還原酶基因表達(dá)的抑制。
本發(fā)明還提供了具有式(I)的化合物與具有抗炎性作用和/或穩(wěn)定動(dòng)脈硬化性鼠疫的物質(zhì)的組合。這種物質(zhì)可以是例如來(lái)自NSAID類(lèi)的化合物，PAF-AH拮抗劑或趨化因子受體拮抗劑，例如IL-8受體拮抗劑或MCP-1拮抗劑。
根據(jù)本發(fā)明的活性化合物組合具有有用的藥理學(xué)性能并且可以用于預(yù)防和治療疾病。
根據(jù)本發(fā)明的活性化合物組合特別適合于治療和初級(jí)或中級(jí)防止冠心病疾病，例如心肌梗死。另外，它們可以用于治療和防止動(dòng)脈硬化，再狹窄，中風(fēng)和阿爾茨海默病。并且，提到的活性化合物組合也可以用于治療和防止低脂蛋白血癥，異常脂肪血癥，高甘油三酯血癥，高脂血癥，高膽固醇血癥，肥胖(Adipositas)，肥胖癥(Obesitas)，胰腺炎，胰島素依賴(lài)型和非胰島素依賴(lài)型糖尿病，糖尿病后遺癥，例如視網(wǎng)膜病，腎病和神經(jīng)病，復(fù)合性高脂血癥和代謝綜合征。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明活性化合物組合適合于治療高血壓，心力衰竭，心絞痛，缺血和炎癥。
本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明的化合物，通常與一種或多種惰性無(wú)毒藥理學(xué)合適的助劑一起的藥物，和它們對(duì)于以上提到的目的的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的化合物可以全身和/或局部起作用。為此目的，它們可以以合適的方式，例如口服，腸外，肺，鼻，舌下，舌，含服，直腸，真皮，經(jīng)皮，結(jié)膜，耳或作為植入或支架(stent)施用。
對(duì)于這些施用途徑，本發(fā)明的化合物可以以合適的施用形式服用。
對(duì)于口服合適的是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)起作用的、快速地和/或以改進(jìn)的形式傳遞本發(fā)明的化合物，該形式包含以結(jié)晶和/或非結(jié)晶和/或溶解的形式的本發(fā)明的化合物，例如片(未涂覆的或涂覆的片，例如具有以延遲的方式溶解的或不溶解的和控制本發(fā)明的化合物的釋放的腸溶衣或衣)，在口腔中快速分解的片或膜/糯米紙，膜/凍干物(lyophylisate)，膠囊(例如硬的或軟的凝膠膠囊)，糖涂覆的片，顆粒，丸，粉末，乳液，懸浮液，氣霧劑或溶液。
腸外服可以避免吸收步驟(例如靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，心內(nèi)，椎管內(nèi)或腰內(nèi))，或隨著吸收(例如肌內(nèi)，皮下，皮內(nèi)，經(jīng)皮或腹膜內(nèi))進(jìn)行。對(duì)于腸外服用合適的服用形式特別是以溶液，懸浮液，乳液，凍干物或無(wú)菌粉末形式的注射或灌注制劑。
對(duì)于其它服用途徑合適的是，例如對(duì)于吸入(特別是粉末吸入器，霧化器)的藥物形式，滴鼻劑，鼻溶液或噴霧劑，舌下、舌或含服服用的片，膜/糯米紙或膠囊，栓劑，耳或眼服用的制劑，陰道膠囊，含水的懸浮液(洗劑，振搖混合物)，親油懸浮液，軟膏劑，乳膏，經(jīng)皮治療體系(例如硬膏劑)，乳狀液，膏，泡沫，傾倒粉末，植入或支架(stent)。
優(yōu)選口服或腸外服，特別是口服。
根據(jù)本發(fā)明的化合物可以轉(zhuǎn)化成以上提到的服用形式。這可以以本身已知的方式通過(guò)與情性無(wú)毒的藥理學(xué)合適的助劑混合進(jìn)行。這些助劑特別包括載體(例如微晶纖維素，乳糖，甘露醇)，溶劑(例如液體聚乙二醇)，乳化劑和分散劑或濕潤(rùn)劑(例如十二烷基硫酸鈉，聚氧失水山梨糖醇油酸鹽)，粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮)，合成的或天然的聚合物(例如清蛋白)，穩(wěn)定劑(例如抗氧化劑，例如抗壞血酸)，著色劑(例如無(wú)機(jī)顏料，例如氧化鐵)，和風(fēng)味和/或氣味矯正藥。
通常，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)為了獲得有效的結(jié)果在腸外服的情況下大約0.001-1mg/kg，優(yōu)選大約0.01-0.5mg/kg體重的服用量是有利的。在口服的情況下，劑量是大約0.01-100mg/kg，優(yōu)選大約0.01-20mg/kg和非常特別優(yōu)選0.1-10mg/kg體重。
盡管這樣，偏離以上提到的量可能是必須的，即取決于體重，服用途徑，個(gè)人對(duì)于活性化合物的反應(yīng)，制劑的類(lèi)型和服用進(jìn)行的間隔時(shí)間。因此，在一些情況下服用少于以上提到的最小量可能是足夠的，然而在其它情況下必須超過(guò)以上提到的上限。在相對(duì)大量服用的情況下，建議劃分這些成一天服用的多個(gè)各個(gè)劑量。
以下進(jìn)行的實(shí)施例解釋了本發(fā)明。該發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
以下的試驗(yàn)和實(shí)施例中的百分比是重量百分比，除非特別指明；份是重量份。溶劑比率，稀釋比率和液體/液體溶液的濃度在每一種情況下基于體積。
具有式(Ia)的化合物的試驗(yàn)部分A.實(shí)施例縮寫(xiě)和首字母縮拼詞CE膽固醇酯CETP 膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白DAST 二甲基氨基三氟化硫DCI 直接化學(xué)電離(在MS中)DDQ 2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌de非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亞砜d.Th 理論的(在產(chǎn)率中)EDTA 乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸ee對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量eq. 當(dāng)量ESI 電霧化電離(在MS中)h 小時(shí)HDL 高密度脂蛋白HPLC 高壓-高效液相色譜LC/MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用LDL 低密度脂蛋白min 分鐘MS質(zhì)譜MTBE 甲基叔丁基醚NMR 核磁共振譜Rt保留時(shí)間(在HPLC中)SPA 閃爍親近測(cè)定法TBAF 四丁基氟化銨TBDMSOTf 三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯
TFA三氟乙酸THF四氫呋喃起始材料和中間體實(shí)施例1A1-環(huán)丙叉基丙酮 274g(1.57mol)[(1-乙氧基環(huán)丙基)氧基](三甲基)硅烷，650g(2.04mmol)1-(三苯基膦正叉基)丙酮(1-(triphenylphosphoranylidene)acetone)和29.9g(157mmol)對(duì)-甲苯磺酸一水合物懸浮于1.58升1，2-二氯苯中并在100℃下攪拌2.5h。加熱后，溶解1-(三苯基正膦叉基)丙酮。之后反應(yīng)混合物冷卻到室溫并且粗產(chǎn)物在硅膠上(流動(dòng)相開(kāi)始石油醚，之后二氯甲烷)色譜分離。濃縮產(chǎn)物組分并且在高真空下短暫干燥。
產(chǎn)率78.5g(理論的46％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝6.42(t，1H)，2.31(s，3H)，1.53-1.46(m，2H)，1.36-1.29(m，2H)MS(DCI，NH3)m/z＝114[M+NH4]+.
實(shí)施例2A螺[2.5]辛烷-5，7-二酮
開(kāi)始在388ml甲醇中加入37.09g(687mmol)甲醇鈉并隨著攪拌，在回流下加熱。添加96.2g(728mmol)丙二酸二甲基酯，并且混合物在回流下再攪拌10min和之后冷卻到室溫。之后在室溫下滴加來(lái)自實(shí)施例1A的66g(687mmol)1-環(huán)丙叉基丙酮，并且隨后混合物在回流下攪拌4h。除去熱浴后，快速(zügig)滴加84.75g(1.51mol)氫氧化鉀在264ml水中的溶液，并且在回流下連續(xù)攪拌1h。之后使用半濃鹽酸調(diào)整pH到1-2(起泡)，并且混合物再攪拌15min。在55℃的浴溫下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在減壓下除去甲醇直到達(dá)到60mbar的壓力。用乙酸乙酯提取燒瓶中的內(nèi)容物兩次，合并有機(jī)相，在減壓下干燥并濃縮。濃縮產(chǎn)生的油，在二氯甲烷中溶解并且在硅膠上(流動(dòng)相二氯甲烷/甲醇95∶5)色譜分離。濃縮產(chǎn)物組分并且之后殘余的油用乙醚研制。使用抽吸濾掉產(chǎn)生的固體并且在高真空下在室溫下干燥。
產(chǎn)率37.2g(理論的39％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝3.49(s，2H)，2.47(s，4H)，0.58(s，4H)MS(DCI，NH3)m/z＝156[M+NH4]+.
實(shí)施例3A4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-3′-[4-(三氟甲基)苯甲?；鵠-4′，8′-二氫-1′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′(6′H)-酮 在350ml二異丙基醚中開(kāi)始加入8.0g(28.24mmol)3-氨基-3-環(huán)戊基-1-(4-三氟甲基苯基)丙烯酮(根據(jù)WO 03/028727，實(shí)施例4制備)，并且添加3.63ml(47.1mmol)三氟乙酸和3.25g(23.53mmol)螺[2.5]辛烷-5，7-二酮(實(shí)施例2A)。在室溫下攪拌10min后，添加5.70ml(47.1mmol)環(huán)己烷甲醛，并且之后混合物在回流下加熱18h。冷卻后，混合物在冰浴下攪拌15min，并且用抽吸濾掉產(chǎn)生的沉淀和用冷的二異丙基醚洗滌。
產(chǎn)率2.92g(理論的25％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.80(d，2H)，7.67(d，2H)，5.88(s，1H)，3.80(d，1H)，3.51(五重峰，1H)，2.85(d，1H)，2.69(d，1H)，2.26-2.14(m，1H)，2.00(t，2H)，1.80-1.46(m，9H)，1.44-1.31(m，2H)，1.25-1.13(m，1H)，1.12-0.96(m，4H)，0.93-0.75(m，2H)，0.62-0.43(m，4H)MS(DCI)m/z＝498[M+H]+.
實(shí)施例4A4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-3′-[4-(三氟甲基)苯甲?；鵠-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′(8′H)-酮 在60ml二氯甲烷中溶解1.90g(3.82mmol)來(lái)自實(shí)施例3A的化合物，并且在室溫下用950mg(4.20mmol)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)攪拌。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物并且殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相環(huán)己烷/乙酸乙酯20∶1→10∶1)。
產(chǎn)率1.3g(理論的69％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.10-7.82(br.s，2H)，7.74(d，2H)，3.41-3.14(br.s，1H)，3.05(dd，2H)，2.71-2.50(m，3H)，1.98-1.36(m，16H)，1.24-1.05(m，2H)，0.62-0.50(m，4H)MS(ESIpos)m/z＝496[M+H]+.
實(shí)施例5A[(5′S)-4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-5′-羥基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-3′-基][4-(三氟甲基)苯基]甲酮
在150ml THF中開(kāi)始加入190mg(1.24mmol)(1R，2S)-1-氨基茚滿(mǎn)-2-醇，并在室溫下添加5.40g(33.1mmol)硼烷-N，N-二乙基苯胺配合物。氣體的釋放停止后，混合物冷卻到0℃，并且添加溶解于150ml THF中的4.10g(8.27mmol)來(lái)自實(shí)施例4A的化合物。伴隨攪拌，使混合物能夠經(jīng)過(guò)幾個(gè)小時(shí)暖到室溫。反應(yīng)結(jié)束后，添加甲醇，濃縮反應(yīng)混合物并在乙酸乙酯中吸收殘余物。在每一種情況下混合物用1N鹽酸，飽和的碳酸氫鈉溶液和飽和的氯化鈉溶液洗滌兩次。有機(jī)相通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)柱色譜純化粗產(chǎn)物(硅膠，流動(dòng)相開(kāi)始環(huán)己烷，之后環(huán)己烷/乙酸乙酯10∶1)。
產(chǎn)率3.4g(理論的83％)對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量測(cè)定為71％ee。
隨后在手性相上對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的色譜分離[柱Chiralpak AD，500mm×40mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速50ml/min；溫度25℃；檢測(cè)254nm]提供了2.83g對(duì)映異構(gòu)體純的標(biāo)題化合物。
Rt＝4.96min[Chiralpak AD，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速1.0ml/min；檢測(cè)254nm]1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.50-7.35(m，4H)，5.48-5.02(m，1H)，3.43-3.14(m，2H)，2.71-2.27(m，3H)，2.18-0.93(m，19H)，0.83-0.73(m，1H)，0.72-0.56(m，1H)，0.52-0.43(m，2H)MS(ESIpos)m/z＝498[M+H]+.
實(shí)施例6A[(5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-3′-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲酮
在氬下，在0.75ml無(wú)水甲苯中溶解100mg(0.20mmol)來(lái)自實(shí)施例5A的化合物和86mg(0.80mmol)2，6-二甲基吡啶并冷卻到-20℃。在該溫度下，滴加106mg(0.40mmol)三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯在0.25ml無(wú)水甲苯中的溶液，并且隨后混合物在-20℃下攪拌15min，之后暖到0℃并且在該溫度下再攪拌1h。向混合物中添加3ml 0.1N鹽酸，其之后用乙酸乙酯重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的碳酸氫鈉溶液和飽和的氯化鈉溶液1∶1混合物洗滌一次并用飽和的氯化鈉溶液洗滌一次，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。殘余物在硅膠上色譜純化(流動(dòng)相開(kāi)始環(huán)己烷，之后環(huán)己烷/乙酸乙酯15∶1)。
產(chǎn)率115mg(理論的94％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.02-7.48(m，4H)，5.51-5.18(br.s，1H)，3.25-2.68(m，2H)，2.65-2.45(m，1H)，2.13-1.03(m，21H)，0.93-0.83(m，9H)，0.81-0.70(m，1H)，0.68-0.58(m，1H)，0.44-0.39(m，1H)，0.38-0.28(m，1H)，0.25-0.14(m，6H)MS(ESIpos)m/z＝612[M+H]+.
實(shí)施例7A(S)((5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-3′-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇
在氬下，在50ml無(wú)水甲苯中開(kāi)始加入3.10g(5.07mmol)來(lái)自實(shí)施例6A的化合物并冷卻到-50℃。在該溫度下，緩慢滴加25.4mg(25.4mmol)二異丁基氫化鋁在甲苯中的1M溶液?；旌衔镌?50℃下再攪拌10min并之后經(jīng)過(guò)1h暖到室溫。伴隨冰冷，向混合物中添加20％濃度的酒石酸鈉鉀溶液，其之后用乙酸乙酯重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌一次，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。這產(chǎn)生了3.2g粗產(chǎn)物。
隨后在手性相上非對(duì)映異構(gòu)體的色譜分離[柱Chiralpak AD，500mm×40mm，20μm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速50ml/min；室溫；檢測(cè)254nm]產(chǎn)生了1.4g(理論的45％)非對(duì)映異構(gòu)體純的標(biāo)題化合物(反式-異構(gòu)體)和1.3g(理論的42％)非對(duì)映異構(gòu)的順式異構(gòu)體。
反式-非對(duì)映異構(gòu)體Rt＝8.09min[柱Chiralpak IA，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷3∶97；流速1.0ml/min；檢測(cè)254nm]1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.58(d，2H)，7.42(d，2H)，6.68和6.49(2br.s，一起1H)，5.58和5.21(2br.s，一起1H)，3.45-3.22(m，1H)，2.99-2.78(m，2H)，2.33-2.18(m，1H)，2.14-1.05(m，20H)，0.95-0.82(m，9H)，0.80-0.70(m，1H)，0.68-0.43(m，2H)，0.42-0.26(m，1H)，0.25-0.02(m，6H)MS(ESIpos)m/z＝614[M+H]+.
順式-非對(duì)映異構(gòu)體Rt＝5.70min[柱Chiralpak IA，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷3∶97；流速1.0ml/min；檢測(cè)254nm]
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.59-7.51(m，2H)，7.48-7.28(m，2H)，6.64和6.49(2br.s，一起1H)，5.58和5.22(2br.s，一起1H)，3.45-3.22(m，1H)，3.10-2.76(m，2H)，2.33-2.18(m，1H)，2.12-1.05(m，20H)，0.94-0.82(m，9H)，0.80-0.70(m，1H)，0.68-0.43(m，2H)，0.42-0.27(m，1H)，0.26-0.01(m，6H)MS(ESIpos)m/z＝614[M+H]+.
實(shí)施例8A(5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉] 在氬下，在17ml甲苯中溶解813mg(1.32mmol)來(lái)自實(shí)施例7A的化合物并冷卻到-20℃。在該溫度下，滴加0.29ml(2.19mmol)二乙基氨基三氟化硫。除去冷卻，并且之后混合物再攪拌2h。向混合物中添加水，其之后用二氯甲烷重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌一次和用飽和的氯化鈉溶液洗滌兩次，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。粗產(chǎn)物在高真空下干燥和反應(yīng)而沒(méi)有進(jìn)一步純化。
產(chǎn)率770mg(理論的94％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.60(d，2H)，7.46-6.98(m，3H)，5.59和5.22(2br.s，一起1H)，3.42-3.20(m，1H)，3.02-2.67(m，3H)，2.20-0.99(m，20H)，0.90(s，9H)，0.82-0.68(m，1H)，0.67-0.48(m，2H)，0.44-0.27(m，1H)，0.25-0.01(m，6H)MS(ESIpos)m/z＝616[M+H]+.
實(shí)施的實(shí)施例實(shí)施例1
(5′S)-4′-環(huán)己基-2′-環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′-醇 在氬下，在1ml THF中溶解770mg(1.25mmol)來(lái)自實(shí)施例8A的化合物，添加6.25ml(6.25mmol)TBAF在THF中的1M溶液并且混合物在室溫下攪拌2h。向混合物中添加50ml 0.2N鹽酸，其之后用乙酸乙酯重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌兩次，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。殘余物在硅膠上色譜純化(流動(dòng)相開(kāi)始環(huán)己烷，之后環(huán)己烷/乙酸乙酯10∶1)。
產(chǎn)率594mg(理論的95％)在手性相上使用色譜進(jìn)一步分離仍然存在于產(chǎn)物中的非對(duì)映異構(gòu)體[柱KBD 5945，400mm×30mm，基于手性選擇劑聚(N-異丁烯?；?L-亮氨酸-叔-丁基酰胺；流動(dòng)相MTBE/異己烷20∶80；流速50ml/min；室溫；檢測(cè)254nm)提供了540mg非對(duì)映異構(gòu)體純的標(biāo)題化合物Rt＝3.76min[柱KBD 5945，250mm×4.6mm；流動(dòng)相MTBE/異己烷3∶7；流速1.0ml/min；檢測(cè)265nm]1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.61(d，2H)，7.48-7.29(m，3H)，5.47-5.39和5.18-5.07(2m，一起1H)，3.60-3.46(m，1H)，3.31-3.11(m，1H)，2.96-2.68(m，1H)，2.47-2.20(m，2H)，2.10-1.10(m，19H)，0.84-0.70(m，2H)，0.66-0.58(m，1H)，0.50-0.38(m，2H)MS(ESIpos)m/z＝502[M+H]+.
B.藥理學(xué)活性的評(píng)價(jià)B-I.CETP-抑制試驗(yàn)B-I.1.CETP的獲得
CETP由人的血漿通過(guò)差示離心和柱色譜以部分純化的形式獲得并用于該試驗(yàn)。為此，使用NaBr將人血漿調(diào)整到每ml 1.21g的密度并在4℃下在50000rmp下離心18h。底部組分(d＞1.21g/ml)用于Sephadex-Phenyl-Sepharose 4B(Pharmacia公司)柱，用0.15MNaCl/0.001M TrisHCl pH 7.4洗滌和之后用蒸餾水洗脫。收集CETP活性組分，以50mM乙酸鈉pH 4.5滲析并施加于CM-Sepharose柱(Pharmacia公司)。之后混合物使用線(xiàn)性梯度(0-1M NaCl)洗脫。收集的CETP組分用10mM TrisHCl pH 7.4滲析和之后進(jìn)一步通過(guò)色譜在Mono Q柱(Pharmacia)上純化。
B-I.2.CETP熒光試驗(yàn)CETP催化的脂質(zhì)體間的熒光膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定[根據(jù)Bisgaier等，J.Lipid Res.34，1625(1993)的步驟改進(jìn)]為了制備供體脂質(zhì)體，隨著在超聲波浴中輕輕的加溫在600μl的二烷中溶解1mg膽甾烯基-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省(indacene)-3-十二烷酸酯(膽甾烯基BODIPYFLC12，Molecular Probes公司)、15.35mg三油精和6.67mg磷脂酰膽堿并且在室溫下用超聲波作用非常緩慢地向63ml 50mM TrisHCl/150mMNaCl/2mM EDTA緩沖液pH 7.3中添加該溶液。之后懸浮液在Branson超聲浴中在大約50瓦下在N2氛下超聲破碎30min，溫度保持在大約20℃。
由溶解于1.2ml二烷和114ml以上緩沖液中的86mg油酸膽甾醇酯，20mg三油精和100mg磷脂酰膽堿通過(guò)在30分鐘50瓦(20℃)下的超聲作用類(lèi)似地獲得受體脂質(zhì)體。
B-I.2.1.富集CETP的CETP熒光試驗(yàn)為了試驗(yàn)，使用由1份以上緩沖液，1份供體脂質(zhì)體和2份受體脂質(zhì)體構(gòu)成的試驗(yàn)混合物。
用48μl富集的CETP組分(1-3μg)和2μl要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液處理50μl試驗(yàn)混合物，該CETP組分通過(guò)疏水色譜由人的血漿獲得，并且在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.2.人血漿的CETP熒光試驗(yàn)向42μl(86％v/v)人血漿(Sigma P9523)中添加6μl(12％v/v)供體脂質(zhì)體和1μl(2％v/v)要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液，并且混合物在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。
在510/520nm下的熒光改變(縫寬2.5nm)是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.3.活體外離體CETP熒光試驗(yàn)向80μl試驗(yàn)混合物中添加10μl緩沖液和2μl血清，并且混合物在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.3.放射性標(biāo)記的HDL的獲得50ml新鮮的人EDTA血漿使用NaBr調(diào)整到1.12的密度并在4℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h。上層相用于獲得冷的LDL。下層相用3×4升PDB緩沖液(10mM TrisHCl，pH 7.4，0.15mM NaCl，1mM EDTA，0.02％NaN3)滲析。之后每10ml滲余物體積添加20μl3H-膽固醇(Dupont NET-725；在乙醇中溶解1μC/μl)并且混合物在37℃下在N2下培養(yǎng)72小時(shí)。
之后該批料使用NaBr調(diào)整到密度1.21并在20℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h?；厥丈蠈酉嗖⑶彝ㄟ^(guò)梯度離心純化脂蛋白組分。為此，分離的、標(biāo)記的脂蛋白使用NaBr調(diào)整到1.26的密度。在離心管(SW 40轉(zhuǎn)子)中用4ml密度為1.21的溶液和4.5ml密度為1.063的溶液覆蓋4ml每一份的該溶液(PDB緩沖液和NaBr的密度溶液)并且之后在38000rpm和20℃下在SW 40中轉(zhuǎn)子離心。位于密度1.063和1.21之間的中間層，其包含標(biāo)記的HDL，在4℃下用3×100體積的PDB緩沖液滲析。
滲余物包含放射性標(biāo)記的3H-CE-HDL，其調(diào)整到大約5×106cmp/ml，用于該試驗(yàn)。
R-I.4.CETP-SPA試驗(yàn)為了試驗(yàn)CETP的活性，測(cè)定3H-膽固醇酯由人的HD脂蛋白到生物素化作用的LD脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，反應(yīng)通過(guò)添加鏈霉抗生物素蛋白-SPA珠子(Amersham公司)結(jié)束并且轉(zhuǎn)移的放射活性直接在液體閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。
在試驗(yàn)批料中，10μl HDL-3H-膽固醇酯(約50000cpm)在37℃下用10μl生物素-LDL(Amersham公司)在包含10μl CETP(1mg/ml)的50mM Hepes/0.15M NaCl/0.1％牛血清白蛋白/0.05％NaN3pH 7.4和3μl要試驗(yàn)的物質(zhì)(溶解于10％DMSO/1％RSA的溶液)中培養(yǎng)18小時(shí)。之后添加200μl SPA-鏈霉抗生物素蛋白珠子溶液(TRKQ 7005)，進(jìn)一步隨著振搖培養(yǎng)1h并且之后在閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。用10μl緩沖液，在4℃下的10μl CETP和在37℃下的10μl CETP的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)作為對(duì)照。
在使用CETP的對(duì)照批料中在37℃下轉(zhuǎn)移的活性看作100％轉(zhuǎn)移。該轉(zhuǎn)移減少到一半時(shí)的的物質(zhì)濃度規(guī)定為IC50值。
B-II.1.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠上活體外離體活性的測(cè)定為了試驗(yàn)CETP抑制活性，使用胃管給內(nèi)部喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠[Dinchuk等，BBA 1295-301(1995)]口服該物質(zhì)。為此，在開(kāi)始試驗(yàn)前一天雄性動(dòng)物隨意安排成具有等同數(shù)量動(dòng)物，通常n＝4的組。在施用該物質(zhì)前，由每一只鼠通過(guò)眶后靜脈叢(retroorbitalenVenenplexus)的穿刺采集用于測(cè)定它的血清中基本CETP活性的血(時(shí)間點(diǎn)T1)。之后使用胃管給動(dòng)物服用該試驗(yàn)物質(zhì)。在試驗(yàn)物質(zhì)施用后的規(guī)定時(shí)間，通過(guò)穿刺第二次(時(shí)間點(diǎn)T2)從動(dòng)物中取血，通常在施用物質(zhì)后16或24h，但是如合適這也可以在另一時(shí)間進(jìn)行。
為了能夠評(píng)估物質(zhì)的抑制活性，對(duì)每一時(shí)間，即16或18小時(shí)，使用動(dòng)物僅僅接受沒(méi)有物質(zhì)的制劑的相應(yīng)對(duì)照組。在對(duì)照動(dòng)物中，為了能夠測(cè)定經(jīng)過(guò)相應(yīng)的試驗(yàn)時(shí)間間隔(16或24h)沒(méi)有抑制劑的CETP活性的改變，在物質(zhì)處理的動(dòng)物中進(jìn)行每一動(dòng)物的二次血樣采集。
凝固結(jié)束后，血樣樣品離心并且用吸管除去血清。為了測(cè)定CETP活性，測(cè)定經(jīng)過(guò)4h的膽甾烯基酯(Cholesterylester)的運(yùn)輸。為此，通常在試驗(yàn)批料中使用2μl血清并且試驗(yàn)如在B-I.2.3.下描述的進(jìn)行。
對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)膮^(qū)別[pM CE/h(T2)-pMCE/h(T1)]并在組中求平均值。在時(shí)間點(diǎn)之一中減少了＞20％膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)被認(rèn)為是活性的。
B-II.2.在敘利亞金黃色倉(cāng)鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定內(nèi)部喂養(yǎng)并具有150-200g重量的雌性敘利亞金黃色倉(cāng)鼠(種BAYDSN)用于測(cè)定CETP抑制劑對(duì)于血清脂蛋白和血清甘油三酯的口服作用。每個(gè)籠子的六只動(dòng)物分成一組并且任意喂養(yǎng)和進(jìn)水馴化兩周。
就在試驗(yàn)開(kāi)始前和物質(zhì)服用后，通過(guò)靜脈叢的眶后穿刺取血并在室溫下培養(yǎng)30min和在30000g下離心20分鐘后用于獲得血清。該物質(zhì)溶解于20％Solutol/80％水并且通過(guò)胃管口服，對(duì)照動(dòng)物接受相同體積的溶劑而沒(méi)有試驗(yàn)物質(zhì)。
使用分析儀器COBAS INTEGRA 400 plus(來(lái)自Roche Diagnostics公司)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定甘油三酯，膽固醇總量，HDL膽固醇和LDL膽固醇。來(lái)自測(cè)定值，對(duì)于每一個(gè)參數(shù)，對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算由用物質(zhì)處理引起的百分比的改變并且每一組規(guī)定為具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值(n＝6或n＝12)。如果與用溶劑處理的組比較，物質(zhì)的影響是顯著的，加入通過(guò)t-試驗(yàn)測(cè)定的p-值(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.005)。
B-II.3.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定為了測(cè)定對(duì)于脂蛋白和甘油三酯的口服作用，使用胃管給轉(zhuǎn)基因小鼠[Dinchuk等，BBA，1295-1301(1995)]服用試驗(yàn)物質(zhì)。試驗(yàn)開(kāi)始前，為了測(cè)定血清中的膽固醇和甘油三酯由鼠的眶后抽血。對(duì)于倉(cāng)鼠如以上描述獲得的血清在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜并且隨后在6000g下離心。三天后，為了測(cè)定脂蛋白和甘油三酯再一次由鼠取血。測(cè)定的參數(shù)的改變表達(dá)為與開(kāi)始值比較的百分比的改變。
C.藥物組合物的實(shí)施的實(shí)施例本發(fā)明的化合物可以以下列方法轉(zhuǎn)化成藥物制劑片組合物100mg本發(fā)明的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(國(guó)產(chǎn))，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(來(lái)自BASF，Ludwigshafen，德國(guó))和2mg硬脂酸鎂。
片重量212mg。直徑8mm，彎曲半徑12mm。
生產(chǎn)本發(fā)明的化合物、乳糖和淀粉的混合物在水中和5％濃度的PVP溶液(m/m)造粒。干燥之后顆粒與硬脂酸鎂混合5分鐘。該混合物使用常規(guī)壓片機(jī)(對(duì)于片的形式參見(jiàn)以上)壓片。15kN的壓力用作壓片的指導(dǎo)值。
可以口服的懸浮液組合物1000mg本發(fā)明的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg Rhodigel(來(lái)自FMC的黃原膠，賓夕法尼亞，美國(guó))和99g水。
10ml口服懸浮液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)Rhodigel懸浮于乙醇中，和向懸浮液中添加本發(fā)明的化合物。隨著攪拌添加水?；旌衔飻嚢璐蠹s6h直到Rhodigel溶脹完成。
可以口服的溶液組合物500mg本發(fā)明的化合物，2.5g聚山梨醇酯和97g聚乙二醇400。20g口服溶液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)
隨著攪拌，本發(fā)明的化合物懸浮于聚乙二醇和聚山梨醇酯的混合物中，繼續(xù)攪拌直到本發(fā)明的化合物完全溶解。
體內(nèi)溶液以低于飽和溶解性的濃度，本發(fā)明的化合物溶解于生理可接受溶劑(例如等滲鹽水，葡萄糖溶液5％和/或PEG 400溶液30％)中。溶液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾并裝入無(wú)菌的和無(wú)熱原的注射容器中。
具有式(Ib)的化合物的試驗(yàn)部分A.實(shí)施例縮寫(xiě)和首字母縮拼詞CE膽固醇酯CETP 膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白DAST 二甲基氨基三氟化硫DCI 直接化學(xué)電離(在MS中)DDQ 2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌de非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亞砜d.Th 理論的(在產(chǎn)率中)EDTA 乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸ee對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量eq. 當(dāng)量ESI 電霧化電離(在MS中)h 小時(shí)HDL 高密度脂蛋白HPLC 高壓-高效液相色譜LC/MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用LDL 低密度脂蛋白min 分鐘MS質(zhì)譜MTBE 甲基叔丁基醚NMR 核磁共振譜
Rt保留時(shí)間(在HPLC中)SPA 閃爍親近測(cè)定法TBAF四丁基氟化銨TBDMSOTf三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯TFA 三氟乙酸THF 四氫呋喃起始材料和中間體實(shí)施例1A1-環(huán)丙叉基丙酮 274g(1.57mol)[(1-乙氧基環(huán)丙基)氧基](三甲基)硅烷，650g(2.04mol)1-(三苯基正膦叉基)丙酮(1-(triphenylphosphoranylidene)acetone)和29.9g(157mmol)對(duì)-甲苯磺酸一水合物懸浮于1.58升1，2-二氯苯中并在100℃下攪拌2.5h。加熱后，溶解1-(三苯基正膦叉基)丙酮。之后反應(yīng)混合物冷卻到室溫并且粗產(chǎn)物在硅膠上(流動(dòng)相開(kāi)始石油醚，之后二氯甲烷)色譜分離。濃縮產(chǎn)物組分并且在高真空下短暫干燥。
產(chǎn)率78.5g(理論的46％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝6.42(t，1H)，2.31(s，3H)，1.53-1.46(m，2H)，1.36-1.29(m，2H)MS(DCI，NH3)m/z＝114[M+NH4]+.
實(shí)施例2A螺[2.5]辛烷-5，7-二酮
開(kāi)始在388ml甲醇中加入37.09g(687mmol)甲醇鈉并隨著攪拌，在回流下加熱.添加96.2g(728mmol)丙二酸二甲基酯，并且混合物在回流下再攪拌10min和之后冷卻到室溫。之后在室溫下滴加來(lái)自實(shí)施例1A的66g(687mmol)1-環(huán)丙叉基丙酮，并且隨后混合物在回流下攪拌4h。除去熱浴后，快速滴加84.75g(1.51mol)氫氧化鉀在264ml水中的溶液，并且在回流下連續(xù)攪拌1h。之后使用半濃鹽酸調(diào)整pH到1-2(起泡)，并且混合物再攪拌15min。在55℃的浴溫下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在減壓下除去甲醇直到達(dá)到60mbar的壓力。用乙酸乙酯提取燒瓶中的內(nèi)容物兩次，合并有機(jī)相，在減壓下干燥并濃縮。濃縮產(chǎn)生的油，在二氯甲烷中溶解并且在硅膠上(流動(dòng)相二氯甲烷/甲醇95∶5)色譜分離。濃縮產(chǎn)物組分并且之后殘余的油用乙醚研制。使用抽吸濾掉產(chǎn)生的固體并且在高真空下在室溫下干燥。
產(chǎn)率37.2g(理論的39％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝3.49(s，2H)，2.47(s，4H)，0.58(s，4H)MS(DCI，NH3)m/z＝156[M+NH4]+.
實(shí)施例3A2′，4′-二環(huán)戊基-3′-[4-(三氟甲基)苯甲?；鵠-4′，8′-二氫-1′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′(6′H)-酮 在350ml二異丙基醚中開(kāi)始加入9.0g(31.77mmol)3-氨基-3-環(huán)戊基-1-(4-三氟甲基苯基)丙烯酮(根據(jù)WO 03/028727，實(shí)施例4制備)，并且添加4.08ml(52.95mmol)三氟乙酸和3.66g(26.47mmol)螺[2.5]辛烷-5，7-二酮(實(shí)施例2A)。在室溫下攪拌10min后，添加5.20g(52.95mmol)環(huán)戊烷甲醛，并且混合物在冰浴下攪拌18h。冷卻后，混合物在冰浴下攪拌15min，并且用抽吸濾掉產(chǎn)生的沉淀和用冷的二異丙基醚洗滌。
產(chǎn)率1.9g(理論的15％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.81(d，2H)，7.67(d，2H)，5.91(s，1H)，3.88(d，1H)，3.52(五重峰，1H)，2.88(d，1H)，2.70(d，1H)，2.26-2.14(m，1H)，1.94(dd，2H)，1.80-1.24(m，14H)，1.16-0.88(m，2H)，0.62-0.40(m，4H)MS(ESIpos)m/z＝484[M+H]+.
實(shí)施例4A2′，4′-二環(huán)戊基-3′-[4-(三氟甲基)苯甲?；鵠-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′(8′H)-酮 在150ml二氯甲烷中溶解4.80g(9.93mmol)來(lái)自實(shí)施例3A的化合物，并且在室溫下用2.48mg(10.92mmol)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)攪拌。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物并且殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相環(huán)己烷/乙酸乙酯20∶1→10∶1)。
產(chǎn)率2.7g(理論的56％)1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.98(d，2H)，7.76(d，2H)；3.18-2.97(m，3H)，2.72-2.55(m，3H)，1.98-1.64(m，10H)，1.60-1.36(m，6H)，0.64-0.49(m，4H)MS(DCI)m/z＝482[M+H]+.
實(shí)施例5A[(5′S)-2′，4′-二環(huán)戊基-5′-羥基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-3′-基][4-(三氟甲基)苯基]甲酮 在100ml THF中開(kāi)始加入130mg(0.84mmol)(1R，2S)-1-氨基茚滿(mǎn)-2-醇，并在室溫下添加3.66g(22.43mmol)硼烷-N，N-二乙基苯胺配合物。氣體的釋放停止后，混合物冷卻到0℃，并且添加溶解于150ml THF中的2.70g(5.61mmol)來(lái)自實(shí)施例4A的化合物。伴隨攪拌，使混合物能夠經(jīng)過(guò)幾個(gè)小時(shí)暖到室溫。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)混合物中添加甲醇，濃縮反應(yīng)混合物并在乙酸乙酯中吸收殘余物。在每一種情況下混合物用1N鹽酸，飽和的碳酸氫鈉溶液和飽和的氯化鈉溶液洗滌兩次。有機(jī)相通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。通過(guò)柱色譜純化粗產(chǎn)物(硅膠，流動(dòng)相開(kāi)始環(huán)己烷，之后環(huán)己烷/乙酸乙酯20∶1)。
產(chǎn)率2.8g(化學(xué)純度大約83％，對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量91％ee)。
隨后在手性相上對(duì)對(duì)映異構(gòu)體的色譜分離[柱Chiralpak AD，500mm×40mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速50ml/min；溫度24℃；檢測(cè)254nm]由以上獲得的2.65g產(chǎn)物提供了2.4g對(duì)映異構(gòu)體純的標(biāo)題化合物。
Rt＝6.78min[Chiralpak AD，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速1.0ml/min；檢測(cè)254nm]1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.00-7.89(m，2H)，7.72(d，2H)，5.68-5.59(m，1H)，3.36-3.14(m，2H)，2.65-2.50(m，2H)，2.34(d，1H)，2.20-2.04(m，2H)，1.94-1.30(m，16H)，0.83-0.73(m，1H)，0.72-0.59(m，1H)，0.53-0.41(m，2H)MS(DCI)m/z＝484[M+H]+.
實(shí)施例6A
((5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2′，4′-二環(huán)戊基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-3′-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲酮 在氬下，在20ml無(wú)水甲苯中溶解2.25mg(4.65mmol)來(lái)自實(shí)施例5A的化合物和1.99g(18.61mmol)2，6-二甲基吡啶并冷卻到-20℃。在該溫度下，滴加2.46g(9.31mmol)三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯在5ml無(wú)水甲苯中的溶液，并且隨后混合物在-20℃下攪拌15min，之后暖到0℃并且在該溫度下再攪拌1h。向混合物中添加75ml0.1N鹽酸，其之后用乙酸乙酯重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的碳酸氫鈉溶液和飽和的氯化鈉溶液1∶1混合物洗滌一次并用飽和的氯化鈉溶液洗滌一次，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。殘余物在硅膠上色譜純化(流動(dòng)相開(kāi)始環(huán)己烷，之后環(huán)己烷/乙酸乙酯15∶1)。
產(chǎn)率2.18g(理論的78％)1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.00-7.87(m，2H)，7.71(d，2H)，5.28-5.18(m，1H)，3.38-3.11(m，1H)，2.96(d，1H)，2.80(d，1H)，2.65-2.43(m，1H)，2.08-1.23(m，18H)，0.87(s，9H)，0.76-0.58(m，2H)，0.46-0.38(m，1H)，0.37-0.25(m，1H)，0.18(s，3H)，0.10(s，3H).
MS(ESIpos)m/z＝598[M+H]+.
實(shí)施例7A(S)((5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2′，4′-二環(huán)戊基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-3′-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇
在氬下，在35ml無(wú)水甲苯中開(kāi)始加入2.10g(3.51mmol)來(lái)自實(shí)施例6A的化合物并冷卻到-50℃。在該溫度下，緩慢滴加17.56mg(17.56mmol)二異丁基氫化鋁在甲苯中的1M溶液。混合物在-50℃下攪拌10min并之后經(jīng)過(guò)1h暖到室溫。伴隨冰冷，向混合物中添加20％濃度的酒石酸鈉鉀溶液，其之后用乙酸乙酯重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。這產(chǎn)生了2.4g粗產(chǎn)物。
隨后在手性相上對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體的色譜分離[柱Chiralpak AD，500mm×40mm，20μm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速50ml/min；溫度24℃；檢測(cè)254nm]產(chǎn)生了1.2g(理論的56％)非對(duì)映異構(gòu)體純的標(biāo)題化合物(反式-異構(gòu)體)和0.9g(理論的42％)非對(duì)映異構(gòu)的順式異構(gòu)體。
反式-非對(duì)映異構(gòu)體Rt＝5.25min[柱Chiralpak AD，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速1.5ml/min；檢測(cè)250nm]1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.58(d，2H)，7.41(d，2H)，6.23(br.s，1H)，5.20(t，1H)，3.68-3.55(m，1H)，3.08-2.70(m，3H)，2.29-2.18(m，1H)，2.12-1.94(m，2H)，1.90-1.22(m，15H)，0.89(s，9H)，0.76-0.68(m，1H)，0.62-0.55(m，1H)，0.43-0.36(m，1H)，0.33-0.25(m，1H)，0.13(s，3H)，0.11(s，3H)MS(ESIpos)m/z＝600[M+H]+.
順式-非對(duì)映異構(gòu)體Rt＝4.36min[柱Chiralpak AD，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異丙醇/異己烷2.5∶97.5；流速1.5ml/min；檢測(cè)250m]
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.56(d，2H)，7.34(d，2H)，6.23(br.s，1H)，5.20(t，1H)，3.68-3.55(m，1H)，3.13-2.60(m，3H)，2.29-2.11(m，2H)，2.10-1.98(m，1H)，1.90-1.22(m，15H)，0.89(s，9H)，0.76-0.68(m，1H)，0.62-0.55(m，1H)，0.43-0.36(m，1H)，0.33-0.25(m，1H)，0.13(s，3H)，0.11(s，3H)MS(ESIpos)m/z＝600[M+H]+.
實(shí)施例8A(5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2′，4′-二環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉] 在氬下，在10ml甲苯中溶解500mg(0.83mmol)來(lái)自實(shí)施例7A的化合物并冷卻到-20℃。在該溫度下，滴加0.18ml(1.38mmol)二乙基氨基三氟化硫。除去冷卻，并且之后混合物再攪拌2h。向混合物中添加水，其之后用二氯甲烷重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌一次和用飽和的氯化鈉溶液洗滌兩次，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。粗產(chǎn)物在高真空下干燥和反應(yīng)而沒(méi)有進(jìn)一步純化。
產(chǎn)率485mg(理論的96％)1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.61(d，2H)，7.38(d，2H)，6.91(d，1H)，5.21(t，1H)，3.66-3.55(m，1H)，2.97-2.80(m，3H)，2.16-2.00(m，2H)，1.98-1.60(m，12H)，1.50-1.22(m，3H)，1.20-1.05(m，1H)，0.90(s，9H)，0.78-0.70(m，1H)，0.63-0.57(m，1H)，0.44-0.37(m，1H)，0.35-0.28(m，1H)，0.13(s，1H)，0.11(s，3H)MS(ESIpos)m/z＝602[M+H]+.
實(shí)施的實(shí)施例實(shí)施例1(5′S)-2′，4′-二環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丙烷-1，7′-喹啉]-5′-醇 在氬下，在1ml THF中溶解475mg(0.79mmol)來(lái)自實(shí)施例8A的化合物，添加3.95ml(3.95mmol)TBAF在THF中的1M溶液并且混合物在室溫下攪拌2h。向混合物中添加50ml 0.2N鹽酸，其之后用乙酸乙酯重復(fù)提取。合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌兩次，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾和濃縮。殘余物在硅膠上色譜純化(流動(dòng)相開(kāi)始環(huán)己烷，之后環(huán)己烷/乙酸乙酯10∶1)。
產(chǎn)率293mg(理論的76％)，具有90％的非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量。
在手性相上使用色譜進(jìn)一步分離仍然存在于產(chǎn)物中的非對(duì)映異構(gòu)體[柱KBD 5945，400mm×30mm，基于手性選擇劑聚(N-異丁烯酰基-L-亮氨酸-叔-丁基酰胺；流動(dòng)相MTBE/異己烷20∶80；流速50ml/min；溫度24℃；檢測(cè)254nm)提供了251mg非對(duì)映異構(gòu)體純的標(biāo)題化合物Rt＝4.67min[柱KBD 5945，250×4.6mm；；流動(dòng)相MTBE/異己烷3∶7；流速1.0ml/min；檢測(cè)280nm]1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.62(d，2H)，7.36(d，2H)，6.97(d，1H)，5.12(br.s，1H)，3.84(五重峰，1H)，3.24(dd，1H)，2.98-2.86(m，1H)，2.48(d，1H)，2.36(d，1H)，2.22-1.52(m，14H)，1.49-1.20(m，3H)，1.06-0.90(m，1H)，0.80-0.72(m，1H)，0.67-0.58(m，1H)，0.51-0.40(m，2H)MS(ESIpos)m/z＝488[M+H]+.
B.藥理學(xué)活性的評(píng)價(jià)B-I.CETP-抑制試驗(yàn)
B-I.1.CETP的獲得CETP由人的血漿通過(guò)差示離心和柱色譜以部分純化的形式獲得并用于該試驗(yàn)。為此，使用NaBr將人血漿調(diào)整到每ml 1.21g的密度并在4℃下在50000rmp下離心18h。底部組分(d＞1.21g/ml)用于Sephadex-Phenyl-Sepharose 4B(Pharmacia公司)柱，用0.15MNaCl/0.001M TrisHCl pH 7.4洗滌和之后用蒸餾水洗脫。收集CETP活性組分，以50mM乙酸鈉pH 4.5滲析并施加于CM-Sepharose柱(Pharmacia公司)。之后混合物使用線(xiàn)性梯度(0-1M NaCl)洗脫。收集的CETP組分用10mM TrisHCl pH 7.4滲析和之后進(jìn)一步通過(guò)色譜在Mono Q柱(Pharmacia)上純化。
B-I.2.CETP熒光試驗(yàn)CETP催化的脂質(zhì)體間的熒光膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定[根據(jù)Bisgaier等，J.Lipid Res.34，1625(1993)的步驟改進(jìn)]為了制備供體脂質(zhì)體，隨著在超聲波浴中輕輕的加溫在600μl的二烷中溶解1mg膽甾烯基-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省(indacene)-3-十二烷酸酯(膽甾烯基BODIPYFLC12，Molecular Probes公司)、15.35mg三油精和6.67mg磷脂酰膽堿并且在室溫下用超聲波作用非常緩慢地向63ml 50mM TrisHCl/150mMNaCl/2mM EDTA緩沖液pH 7.3中添加該溶液。之后懸浮液在Branson超聲浴中在大約50瓦下在N2氛下超聲破碎30min，溫度保持在大約20℃。
由溶解于1.2ml二烷和114ml以上緩沖液中的86mg油酸膽甾醇酯，20mg三油精和100mg磷脂酰膽堿通過(guò)在30分鐘50瓦(20℃)下的超聲作用類(lèi)似地獲得受體脂質(zhì)體。
B-I.2.1.富集CETP的CETP熒光試驗(yàn)為了試驗(yàn)，使用由1份以上緩沖液，1份供體脂質(zhì)體和2份受體脂質(zhì)體構(gòu)成的試驗(yàn)混合物。
用48μl富集的CETP組分(1-3μg)和2μl要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液處理50μl試驗(yàn)混合物，該CETP組分通過(guò)疏水色譜由人的血漿獲得，并且在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.2.人血漿的CETP熒光試驗(yàn)向42μl(86％v/v)人血漿(Sigma P9523)中添加6μl(12％v/v)供體脂質(zhì)體和1μl(2％v/v)要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液，并且混合物在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。
在510/520nm下的熒光改變(縫寬2.5nm)是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.3.活體外離體CETP熒光試驗(yàn)向80μl試驗(yàn)混合物中添加10μl緩沖液和2μl血清，并且混合物在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.3.放射性標(biāo)記的HDL的獲得50ml新鮮的人EDTA血漿使用NaBr調(diào)整到1.12的密度并在4℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h。上層相用于獲得冷的LDL。下層相用3×4升PDB緩沖液(10mM TrisHCl，pH 7.4，0.15mM NaCl，1mM EDTA，0.02％NaN3)滲析。之后每10ml滲余物體積添加20μl3H-膽固醇(Dupont NET-725；在乙醇中溶解1μC/μl)并且混合物在37℃下在N2下培養(yǎng)72小時(shí)。
之后該批料使用NaBr調(diào)整到密度1.21并在20℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h?；厥丈蠈酉嗖⑶彝ㄟ^(guò)梯度離心純化脂蛋白組分。為此，分離的、標(biāo)記的脂蛋白使用NaBr調(diào)整到1.26的密度。在離心管(SW 40轉(zhuǎn)子)中用4ml密度為1.21的溶液和4.5ml密度為1.063的溶液覆蓋4ml每一份的該溶液(PDB緩沖液和NaBr的密度溶液)并且之后在38000rpm和20℃下在SW 40中轉(zhuǎn)子離心。位于密度1.063和1.21之間的中間層，其包含標(biāo)記的HDL，在4℃下用3×100體積的PDB緩沖液滲析。
滲余物包含放射性標(biāo)記的3H-CE-HDL，其調(diào)整到大約5×106cmp/ml，用于該試驗(yàn)。
B-I.4.CETP-SPA試驗(yàn)為了試驗(yàn)CETP的活性，測(cè)定3H-膽固醇酯由人的HD脂蛋白到生物素化作用的LD脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，反應(yīng)通過(guò)添加鏈霉抗生物素蛋白-SPA珠子(Amersham公司)結(jié)束并且轉(zhuǎn)移的放射活性直接在液體閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。
在試驗(yàn)批料中，10μl HDL-3H-膽固醇酯(約50000cpm)在37℃下用10μl生物素-LDL(Amersham公司)在包含10μl CETP(1mg/ml)的50mM Hepes/0.15M NaCl/0.1％牛血清白蛋白/0.05％NaN3pH 7.4和3μl要試驗(yàn)的物質(zhì)(溶解于10％DMSO/1％RSA的溶液)中培養(yǎng)18小時(shí)。之后添加200μl SPA-鏈霉抗生物素蛋白珠子溶液(TRKQ 7005)，進(jìn)一步隨著振搖培養(yǎng)1h并且之后在閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。用10μl緩沖液，在4℃下的10μl CETP和在37℃下的10μl CETP的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)作為對(duì)照。
在使用CETP的對(duì)照批料中在37℃下轉(zhuǎn)移的活性看作100％轉(zhuǎn)移。該轉(zhuǎn)移減少到一半時(shí)的的物質(zhì)濃度規(guī)定為IC50值。
B-II.1.在轉(zhuǎn)基固hCETP小鼠上活體外離體活性的測(cè)定為了試驗(yàn)CETP抑制活性，使用胃管給內(nèi)部喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠[Dinchuk等，BBA 1295-301(1995)]口服該物質(zhì)。為此，在開(kāi)始試驗(yàn)前一天雄性動(dòng)物隨意安排成具有等同數(shù)量動(dòng)物，通常n＝4的組。在施用該物質(zhì)前，由每一只鼠通過(guò)眶后靜脈叢(retroorbitalenVenenplexus)的穿刺采集用于測(cè)定它的血清中基本CETP活性的血(時(shí)間點(diǎn)T1)。之后使用胃管給動(dòng)物服用該試驗(yàn)物質(zhì)。在試驗(yàn)物質(zhì)施用后的規(guī)定時(shí)間，通過(guò)穿刺第二次(時(shí)間點(diǎn)T2)從動(dòng)物中取血，通常在施用物質(zhì)后16或24h，但是如合適這也可以在另一時(shí)間進(jìn)行。
為了能夠評(píng)估物質(zhì)的抑制活性，對(duì)每一時(shí)間，即16或18小時(shí)，使用動(dòng)物僅僅接受沒(méi)有物質(zhì)的制劑的相應(yīng)對(duì)照組。在對(duì)照動(dòng)物中，為了能夠測(cè)定經(jīng)過(guò)相應(yīng)的試驗(yàn)時(shí)間間隔(16或24h)沒(méi)有抑制劑的CETP活性的改變，在物質(zhì)處理的動(dòng)物中進(jìn)行每一動(dòng)物的二次血樣采集。
凝固結(jié)束后，血樣樣品離心并且用吸管除去血清。為了測(cè)定CETP活性，測(cè)定經(jīng)過(guò)4h的膽甾烯基酯(Cholesterylester)的運(yùn)輸。為此，通常在試驗(yàn)批料中使用2μl血清并且試驗(yàn)如在B-I.2.3.下描述的進(jìn)行。
對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)膮^(qū)別[pM CE/h(T2)-pMCE/h(T1)]并在組中求平均值。在時(shí)間點(diǎn)之一中減少了＞20％膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)被認(rèn)為是活性的。
B-II.2.在敘利亞金黃色倉(cāng)鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定內(nèi)部喂養(yǎng)并具有150-200g重量的雌性敘利亞金黃色倉(cāng)鼠(種BAYDSN)用于測(cè)定CETP抑制劑對(duì)于血清脂蛋白和血清甘油三酯的口服作用。每個(gè)籠子的六只動(dòng)物分成一組并且任意喂養(yǎng)和進(jìn)水馴化兩周。
就在試驗(yàn)開(kāi)始前和物質(zhì)服用后，通過(guò)靜脈叢的眶后穿刺取血并在室溫下培養(yǎng)30min和在30000g下離心20分鐘后用于獲得血清。該物質(zhì)溶解于20％Solutol/80％水并且通過(guò)胃管口服，對(duì)照動(dòng)物接受相同體積的溶劑而沒(méi)有試驗(yàn)物質(zhì)。
使用分析儀器COBAS INTEGRA 400 plus(來(lái)自Roche Diagnostics公司)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定甘油三酯，膽固醇總量，HDL膽固醇和LDL膽固醇。來(lái)自測(cè)定值，對(duì)于每一個(gè)參數(shù)，對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算由用物質(zhì)處理引起的百分比的改變并且每一組規(guī)定為具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值(n＝6或n＝12)。如果與用溶劑處理的組比較，物質(zhì)的影響是顯著的，加入通過(guò)t-試驗(yàn)測(cè)定的p-值(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.005)。
B-II.3.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定為了測(cè)定對(duì)于脂蛋白和甘油三酯的口服作用，使用胃管給轉(zhuǎn)基因小鼠[Dinchuk等，BBA，1295-1301(1995)]服用試驗(yàn)物質(zhì)。試驗(yàn)開(kāi)始前，為了測(cè)定血清中的膽固醇和甘油三酯由鼠的眶后抽血。對(duì)于倉(cāng)鼠如以上描述獲得的血清在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜并且隨后在6000g下離心。三天后，為了測(cè)定脂蛋白和甘油三酯再一次由鼠取血。測(cè)定的參數(shù)的改變表達(dá)為與開(kāi)始值比較的百分比的改變。
C.藥物組合物實(shí)施的實(shí)施例本發(fā)明的化合物可以以下列方法轉(zhuǎn)化成藥物制劑片組合物100mg本發(fā)明的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(國(guó)產(chǎn))，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(來(lái)自BASF，Ludwigshafen，德國(guó))和2mg硬脂酸鎂。
片重量212mg。直徑8mm，彎曲半徑12mm。
生產(chǎn)本發(fā)明的化合物，乳糖和淀粉的混合物在水中和5％濃度的PVP溶液(m/m)造粒。干燥之后顆粒與硬脂酸鎂混合5分鐘。該混合物使用常規(guī)壓片機(jī)(對(duì)于片的形式參見(jiàn)以上)壓片。15kN的壓力用作壓片的指導(dǎo)值。
可以口服的懸浮液組合物1000mg本發(fā)明的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg Rhodigel(來(lái)自FMC的黃原膠，賓夕法尼亞，美國(guó))和99g水。
10ml口服懸浮液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)Rhodigel懸浮于乙醇中，和向懸浮液中添加本發(fā)明的化合物。隨著攪拌添加水?；旌衔飻嚢璐蠹s6h直到Rhodigel溶脹完成。
可以口服的溶液組合物500mg本發(fā)明的化合物，2.5g聚山梨醇酯和97g聚乙二醇400。20g口服溶液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)
隨著攪拌，本發(fā)明的化合物懸浮于聚乙二醇和聚山梨醇酯的混合物中，繼續(xù)攪拌直到本發(fā)明的化合物完全溶解。
體內(nèi)(i.v.)溶液以低于飽和溶解性的濃度，本發(fā)明的化合物溶解于生理可接受溶劑(例如等滲鹽水，葡萄糖溶液5％和/或PEG 400溶液30％)。溶液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾并裝入無(wú)菌的和無(wú)熱原的注射容器中。
具有式(Ic)的化合物的試驗(yàn)部分A.實(shí)施例縮寫(xiě)和首字母縮拼詞CE膽固醇酯CETP 膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白DAST 二甲基氨基三氟化硫DCI 直接化學(xué)電離(在MS中)DDQ 2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌de非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亞砜d.Th 理論的(在產(chǎn)率中)EDTA 乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸ee對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量eq. 當(dāng)量ESI 電霧化電離(在MS中)h 小時(shí)HDL 高密度脂蛋白HPLC 高壓-高效液相色譜LC/MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用LDL 低密度脂蛋白min 分鐘MS質(zhì)譜NMR 核磁共振譜Rf保留指數(shù)(在薄層色譜中)
Rt保留時(shí)間(在HPLC中)SPA 閃爍親近測(cè)定法TBAF四丁基氟化銨TBDMSOTf三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯TFA 三氟乙酸THF 四氫呋喃HPLC和LC/MS方法方法1柱Chiralpak IA，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異己烷/1-丙醇97∶3；流速1.0ml/min；UV-檢測(cè)254nm。
方法2具有DAD檢測(cè)的HP 1100；柱Kromasil RP-18，60mm×2mm，3.5μm；流動(dòng)相A5ml HClO4/l水，流動(dòng)相B乙腈；梯度0min 2％B→0.5min 2％B→4.5min 90％B→9min 90％B；流速0.75ml/min；溫度30℃；UV-檢測(cè)210nm。
方法3(LC/MS)MS儀器類(lèi)型Micromass ZQ；HPLC儀器類(lèi)型HP 1100系列；UV DAD；柱Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20mm×4mm；流動(dòng)相A1l水+0.5ml 50％濃度的甲酸，流動(dòng)相B1l乙腈+0.5ml 50％濃度的甲酸；梯度0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速0.0min 1ml/min→2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；爐50℃；UV-檢測(cè)210nm。
起始材料和中間體實(shí)施例1A4′-環(huán)戊基-2′-異丙基-3′-[4-(三氟甲基)苯甲?；鵠-4′，8′-二氫-1′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-5′(6′H)-酮
在188ml二異丙基醚中開(kāi)始加入6.3g(24.5mmol，1.2eq.)3-氨基-3-異丙基-1-(4-三氟甲基苯基)丙烯酮(根據(jù)WO 03/028727，實(shí)施例2制備)，并且添加3.14ml(40.8mmol，2.0eq.)三氟乙酸和3.1g(20.4mmol，1eq.)螺[3.5]壬烷-6，8-二酮(根據(jù)WO 03/028727，實(shí)施例5制備)。在室溫下攪拌10min后，添加3.0g(30.6mmol，1.5eq.)環(huán)戊烷甲醛。之后混合物在回流下在水分離器上加熱18h。冷卻后，混合物在冰浴下攪拌30min，并且用抽吸濾掉產(chǎn)生的沉淀和用冷的二異丙基醚洗滌并在高真空下除去溶劑殘余物。
產(chǎn)率4.37g(理論的45.5％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.91(m，2H)，1.05(d，3H)，1.28(d，3H)，1.21-2.07(m，13H)，2.43和2.70(2d，2H)，2.63(s，2H)，3.47(七重峰，1H)，3.80(d，1H)，6.03(s，1H)，7.66(d，2H)，7.77(d，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝472[M+H]+.
實(shí)施例2A4′-環(huán)戊基-2′-異丙基-3′-[4-(三氟甲基)苯甲?；鵠-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-5′(8′H)-酮 在180ml二氯甲烷中溶解5.19g(11.0mmol)來(lái)自實(shí)施例1A的化合物，并且在室溫下分批添加2.75g(12.1mmol，1.1eq.)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)攪拌。混合物在室溫下攪拌1h。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮混合物并且殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯100∶0→50∶50)。
產(chǎn)率4.74g(理論的91.6％)
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝1.10(d，3H)，1.19(d，3H)，1.33-2.10(m，14H)，2.59(七重峰，1H)，2.82(s，2H)，2.99(七重峰，1H)，3.30(s，2H)，7.75(d，2H)，7.94(m，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝470[M+H]+.
實(shí)施例3A[(5′S)-4′-環(huán)戊基-5′-羥基-2′-異丙基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-3′-基][4-(三氟甲基)苯基]甲酮 在250ml THF中開(kāi)始加入120mg(0.81mmol，0.08eq.)(1R，2S)-1-氨基茚滿(mǎn)-2-醇，并在室溫下添加6.6g(40.4mmol，4.0eq.)硼烷-N，N-二乙基苯胺配合物。氣體的釋放停止后，混合物冷卻到0℃，并且添加溶解于250ml THF中的4.74g(10.1mmol，1eq.)來(lái)自實(shí)施例2A的化合物。伴隨攪拌，使混合物能夠經(jīng)過(guò)18h暖到室溫。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)混合物中添加20ml甲醇，其之后蒸發(fā)至干。通過(guò)色譜純化粗產(chǎn)物(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯混合物)。
產(chǎn)率4.33g(理論的91.1％)根據(jù)方法1測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量為94.0％ee。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝0.99-1.19(m，6H)，1.29-2.41(m，14H)，2.53(七重峰，1H)，2.93(d，1H)，3.15-3.54(m，2H)，5.13(m，1H)，7.73(d，2H)，7.94(m，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝472[M+H]+.
實(shí)施例4A((5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4′-環(huán)戊基-2′-異丙基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-3′-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲酮
在氬下，在30ml無(wú)水甲苯中溶解4.00g(8.48mmol)來(lái)自實(shí)施例3A的化合物。在室溫下，之后添加3.64g(33.9mmol，4eq.)2，6-盧剔啶，并且混合物冷卻到-16℃。向該溶液中滴加溶解于10ml甲苯中的3.90ml(17.0mmol，2eq.)三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯。15min后，反應(yīng)混合物暖到0℃并且在該溫度下再攪拌80min。為了后處理，添加124ml 0.1N鹽酸，并且混合物暖到室溫后用乙酸乙酯提取。有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液和飽和的碳酸氫鈉1∶1混合物洗滌。合并的含水相用乙酸乙酯重提取兩次。合并的有機(jī)相通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯9∶1)。
產(chǎn)率4.61g(理論的92.7％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.12(s，3H)，0.23(s，3H)，0.86(s，9H)，1.06(d，3H)，1.12(d，3H)，1.24-2.12(m，14H)，2.19-2.35(m，2H)，2.51(m，1H)，2.89-3.44(m，3H)，5.17(m，1H)，7.73(d，2H)，7.84-8.02(m，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝586[M+H]+.
實(shí)施例5A(S)((5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4′-環(huán)戊基-2′-異丙基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-3′-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇
在0℃下，向2.71g(4.6mmol)來(lái)自實(shí)施例4A的化合物在46ml無(wú)水THF的溶液中添加5.1ml1M氫化鋁鋰(5.1mmol，1.1eq.)在THF中的溶液。伴隨攪拌，混合物經(jīng)過(guò)3.5h暖到室溫。為了后處理，仔細(xì)添加120ml飽和的酒石酸鉀鈉溶液。氣體的釋放停止后，混合物用乙酸乙酯提取四次，并且合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。殘余物色譜純化，導(dǎo)致了產(chǎn)物非對(duì)映異構(gòu)體的分離(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯95∶5)。
產(chǎn)率1.39g(理論的51.2％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.16(s，3H)，0.25(s，3H)，0.67-0.98(m，18H)，1.02-2.34(m，14H)，2.80-3.76(m，4H)，5.19(m，1H)，6.21(br.s，1H)，7.43(d，2H)，7.59(d，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝588[M+H]+LC/MS(方法3)Rt＝3.03min.
順式-非對(duì)映異構(gòu)體(R)((5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4′-環(huán)戊基-2′-異丙基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-3′-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇產(chǎn)率1.04g(理論的38.1％)實(shí)施例6A(5′S)-5′-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4′-環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-2′-異丙基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]
在-15℃下和在氬下，向0.94g(1.6mmol)來(lái)自實(shí)施例5A的化合物在15ml無(wú)水甲苯中的溶液中滴加0.42ml二乙基氨基三氟化硫(3.2mmol，1.1eq.)?；旌衔飻嚢?h，暖到0℃。為了后處理，伴隨冰冷卻仔細(xì)添加40ml飽和碳酸氫鈉溶液。混合物總共用乙酸乙酯提取三次。之后合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾通過(guò)硅膠純化(流動(dòng)相環(huán)己烷/乙酸乙酯9∶1)。
產(chǎn)率0.65g(理論的69.0％)Rf＝0.72(異己烷/乙酸乙酯9∶1)實(shí)施的實(shí)施例實(shí)施例1(5′S)-4′-環(huán)戊基-3′-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-2′-異丙基-5′，8′-二氫-6′H-螺[環(huán)丁烷-1，7′-喹啉]-5′-醇 在0℃下，向0.65g(1.1mmol)來(lái)自實(shí)施例6A的化合物在6ml無(wú)水THF的溶液中滴加4.4ml1M四丁基氟化銨(4.4mmol，4.0eq.)?；旌衔镌诒≈袛嚢?h。為了后處理，混合物用20ml乙酸乙酯稀釋并用20ml水洗滌。在每一種情況下含水相用20ml乙酸乙酯重提取兩次。合并的有機(jī)相用50ml飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。色譜純化粗產(chǎn)物(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯9∶1→4∶1)。
產(chǎn)率0.47g(理論的88.6％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.75(d，3H)，1.11(d，3H)，1.30-2.33(m，17H)，2.89(m，1H)，2.89和3.33(2d，2H)，3.82(s，1H)，5.12(m，1H)，6.94(d，1H)，7.35(d，2H)，7.62(d，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝476[M+H]+Rf＝0.14(異己烷/乙酸乙酯9∶1)B.藥理學(xué)活性的評(píng)價(jià)B-I.CETP-抑制試驗(yàn)B-I.1.CETP的獲得CETP由人的血漿通過(guò)差示離心和柱色譜以部分純化的形式獲得并用于該試驗(yàn)。為此，使用NaBr將人血漿調(diào)整到每ml 1.21g的密度并在4℃下在50000rmp下離心18h。底部組分(d＞1.21g/ml)用于Sephadex-Phenyl-Sepharose 4B(Pharmacia公司)柱，用0.15MNaCl/0.001M TrisHCl pH 7.4洗滌和之后用蒸餾水洗脫。收集CETP活性組分，以50mM乙酸鈉pH 4.5滲析并施加于CM-Sepharose柱(Pharmacia公司)。之后混合物使用線(xiàn)性梯度(0-1M NaCl)洗脫。收集的CETP組分用10mM TrisHCl pH 7.4滲析和之后進(jìn)一步通過(guò)色譜在Mono Q柱(Pharmacia)上純化。
B-I.2.CETP熒光試驗(yàn)CETP催化的脂質(zhì)體間的熒光膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定[根據(jù)Bisgaier等，J.Lipid Res.34，1625(1993)的步驟改進(jìn)]為了制備供體脂質(zhì)體，隨著在超聲波浴中輕輕的加溫在600μl的二烷中溶解1mg膽甾烯基-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省(indacene)-3-十二烷酸酯(膽甾烯基BODIPYFLC12，Molecular Probes公司)、15.35mg三油精和6.67mg磷脂酰膽堿并且在室溫下用超聲波作用非常緩慢地向63ml 50mM TrisHCl/150mMNaCl/2mM EDTA緩沖液pH 7.3中添加該溶液。之后懸浮液在Branson超聲浴中在大約50瓦下在N2氛下超聲破碎30min，溫度保持在大約20℃。
由溶解于1.2ml二烷和114ml以上緩沖液中的86mg油酸膽甾醇酯，20mg三油精和100mg磷脂酰膽堿通過(guò)在30分鐘50瓦(20℃)下的超聲作用類(lèi)似地獲得受體脂質(zhì)體。
B-I.2.1.富集CETP的CETP熒光試驗(yàn)為了試驗(yàn)，使用由1份以上緩沖液，1份供體脂質(zhì)體和2份受體脂質(zhì)體構(gòu)成的試驗(yàn)混合物。
用48μl富集的CETP組分(1-3μg)和2μl要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液處理50μl試驗(yàn)混合物，該CETP組分通過(guò)疏水色譜由人的血漿獲得，并且在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.2.人血漿的CETP熒光試驗(yàn)向42μl(86％v/v)人血漿(Sigma P9523)中添加6μl(12％v/v)供體脂質(zhì)體和1μl(2％v/v)要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液，并且混合物在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。
在510/520nm下的熒光改變(縫寬2.5nm)是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.3.活體外離體CETP熒光試驗(yàn)向80μl試驗(yàn)混合物中添加10μl緩沖液和2μl血清，并且混合物在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.3.放射性標(biāo)記的HDL的獲得
50ml新鮮的人EDTA血漿使用NaBr調(diào)整到1.12的密度并在4℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h。上層相用于獲得冷的LDL。下層相用3×4升PDB緩沖液(10mM TrisHCl，pH 7.4，0.15mM NaCl，1mM EDTA，0.02％NaN3)滲析。之后每10ml滲余物體積添加20μl3H-膽固醇(Dupont NET-725；在乙醇中溶解1μC/μl)并且混合物在37℃下在N2下培養(yǎng)72小時(shí)。
之后該批料使用NaBr調(diào)整到密度1.21并在20℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h。回收上層相并且通過(guò)梯度離心純化脂蛋白組分。為此，分離的、標(biāo)記的脂蛋白使用NaBr調(diào)整到1.26的密度。在離心管(SW 40轉(zhuǎn)子)中用4ml密度為1.21的溶液和4.5ml密度為1.063的溶液覆蓋4ml每一份的該溶液(PDB緩沖液和NaBr的密度溶液)并且之后在38000rpm和20℃下在SW 40中轉(zhuǎn)子離心。位于密度1.063和1.21之間的中間層，其包含標(biāo)記的HDL，在4℃下用3×100體積的PDB緩沖液滲析。
滲余物包含放射性標(biāo)記的3H-CE-HDL，其調(diào)整到大約5×106cmp/ml，用于該試驗(yàn)。
B-I.4.CETP-SPA試驗(yàn)為了試驗(yàn)CETP的活性，測(cè)定3H-膽固醇酯由人的HD脂蛋白到生物素化作用的LD脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，反應(yīng)通過(guò)添加鏈霉抗生物素蛋白-SPA珠子(Amersham公司)結(jié)束并且轉(zhuǎn)移的放射活性直接在液體閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。
在試驗(yàn)批料中，10μl HDL-3H-膽固醇酯(約50000cpm)在37℃下用10μl生物素-LDL(Amersham公司)在包含10μl CETP(1mg/ml)的50mM Hepes/0.15M NsCl/0.1％牛血清白蛋白/0.05％NaN3pH 7.4和3μl要試驗(yàn)的物質(zhì)(溶解于10％DMSO/1％RSA的溶液)中培養(yǎng)18小時(shí)。之后添加200μl SPA-鏈霉抗生物素蛋白珠子溶液(TRKQ 7005)，進(jìn)一步隨著振搖培養(yǎng)1h并且之后在閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。用10μl緩沖液，在4℃下的10μl CETP和在37℃下的10μl CETP的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)作為對(duì)照。
在使用CETP的對(duì)照批料中在37℃下轉(zhuǎn)移的活性看作100％轉(zhuǎn)移。該轉(zhuǎn)移減少到一半時(shí)的的物質(zhì)濃度規(guī)定為IC50值。
B-II.1.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠上活體外離體活性的測(cè)定為了試驗(yàn)CETP抑制活性，使用胃管給內(nèi)部喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠[Dinchuk等，BBA 1295-301(1995)]口服該物質(zhì)。為此，在開(kāi)始試驗(yàn)前一天雄性動(dòng)物隨意安排成具有等同數(shù)量動(dòng)物，通常n＝4的組。在施用該物質(zhì)前，由每一只鼠通過(guò)眶后靜脈叢(retroorbitalenVenenplexus)的穿刺采集用于測(cè)定它的血清中基本CETP活性的血(時(shí)間點(diǎn)T1)。之后使用胃管給動(dòng)物服用該試驗(yàn)物質(zhì)。在試驗(yàn)物質(zhì)施用后的規(guī)定時(shí)間，通過(guò)穿刺第二次(時(shí)間點(diǎn)T2)從動(dòng)物中取血，通常在施用物質(zhì)后16或24h，但是如合適這也可以在另一時(shí)間進(jìn)行。
為了能夠評(píng)估物質(zhì)的抑制活性，對(duì)每一時(shí)間，即16或18小時(shí)，使用動(dòng)物僅僅接受沒(méi)有物質(zhì)的制劑的相應(yīng)對(duì)照組。在對(duì)照動(dòng)物中，為了能夠測(cè)定經(jīng)過(guò)相應(yīng)的試驗(yàn)時(shí)間間隔(16或24h)沒(méi)有抑制劑的CETP活性的改變，在物質(zhì)處理的動(dòng)物中進(jìn)行每一動(dòng)物的二次血樣采集。
凝固結(jié)束后，血樣樣品離心并且用吸管除去血清。為了測(cè)定CETP活性，測(cè)定經(jīng)過(guò)4h的膽甾烯基酯(Cholesterylester)的運(yùn)輸。為此，通常在試驗(yàn)批料中使用2μl血清并且試驗(yàn)如在B-I.2.3.下描述的進(jìn)行。
對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)膮^(qū)別[pM CE/h(T2)-pMCE/h(T1)]并在組中求平均值。在時(shí)間點(diǎn)之一中減少了＞20％膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)被認(rèn)為是活性的。
B-II.2.在敘利亞金黃色倉(cāng)鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定內(nèi)部喂養(yǎng)并具有150-200g重量的雌性敘利亞金黃色倉(cāng)鼠(種BAYDSN)用于測(cè)定CETP抑制劑對(duì)于血清脂蛋白和血清甘油三酯的口服作用。每個(gè)籠子的六只動(dòng)物分成一組并且任意喂養(yǎng)和進(jìn)水馴化兩周。
就在試驗(yàn)開(kāi)始前和物質(zhì)服用后，通過(guò)靜脈叢的眶后穿刺取血并在室溫下培養(yǎng)30min和在30000g下離心20分鐘后用于獲得血清。該物質(zhì)溶解于20％Solutol/80％水并且通過(guò)胃管口服，對(duì)照動(dòng)物接受相同體積的溶劑而沒(méi)有試驗(yàn)物質(zhì)。
使用分析儀器COBAS INTEGRA 400 plus(來(lái)自Roche Diagnostics公司)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定甘油三酯，膽固醇總量，HDL膽固醇和LDL膽固醇。來(lái)自測(cè)定值，對(duì)于每一個(gè)參數(shù)，對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算由用物質(zhì)處理引起的百分比的改變并且每一組規(guī)定為具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值(n＝6或n＝12)。如果與用溶劑處理的組比較，物質(zhì)的影響是顯著的，加入通過(guò)t-試驗(yàn)測(cè)定的p-值(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.005)。
B-II.3.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定為了測(cè)定對(duì)于脂蛋白和甘油三酯的口服作用，使用胃管給轉(zhuǎn)基因小鼠[Dinchuk等，BBA，1295-1301(1995)]服用試驗(yàn)物質(zhì)。試驗(yàn)開(kāi)始前，為了測(cè)定血清中的膽固醇和甘油三酯由鼠的眶后抽血。對(duì)于倉(cāng)鼠如以上描述獲得的血清在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜并且隨后在6000g下離心。三天后，為了測(cè)定脂蛋白和甘油三酯再一次由鼠取血。測(cè)定的參數(shù)的改變表達(dá)為與開(kāi)始值比較的百分比的改變。
C.藥物組合物的實(shí)施的實(shí)施例本發(fā)明的化合物可以以下列方法轉(zhuǎn)化成藥物制劑片組合物100mg本發(fā)明的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(國(guó)產(chǎn))，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(來(lái)自BASF，Ludwigshafen，德國(guó))和2mg硬脂酸鎂。
片重量212mg。直徑8mm，彎曲半徑12mm。
生產(chǎn)本發(fā)明的化合物，乳糖和淀粉的混合物在水中和5％濃度的PVP溶液(m/m)造粒。干燥之后顆粒與硬脂酸鎂混合5分鐘。該混合物使用常規(guī)壓片機(jī)(對(duì)于片的形式參見(jiàn)以上)壓片。15kN的壓力用作壓片的指導(dǎo)值。
可以口服的懸浮液
組合物1000mg本發(fā)明的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg Rhodigel(來(lái)自FMC的黃原膠，賓夕法尼亞，美國(guó))和99g水。
10ml口服懸浮液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)Rhodigel懸浮于乙醇中，和向懸浮液中添加本發(fā)明的化合物。隨著攪拌添加水?；旌衔飻嚢璐蠹s6h直到Rhodigel溶脹完成。
可以口服的溶液組合物500mg本發(fā)明的化合物，2.5g聚山梨醇酯和97g聚乙二醇400。20g口服溶液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)隨著攪拌，本發(fā)明的化合物懸浮于聚乙二醇和聚山梨醇酯的混合物中，繼續(xù)攪拌直到本發(fā)明的化合物完全溶解。
體內(nèi)(i.v.)溶液以低于飽和溶解性的濃度，本發(fā)明的化合物溶解于生理可接受溶劑(例如等滲鹽水，葡萄糖溶液5％和/或PEG 400溶液30％)。溶液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾并裝入無(wú)菌的和無(wú)熱原的注射容器中。
具有式(Id)的化合物的試驗(yàn)部分A.實(shí)施例縮寫(xiě)和首字母縮拼詞CE膽固醇酯CETP 膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白DAST 二乙基氨基三氟化硫DCI 直接化學(xué)電離(在MS中)DDQ 2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌de非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亞砜d.Th 理論的(在產(chǎn)率中)EDTA 乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸
ee 對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量eq. 當(dāng)量ESI 電霧化電離(在MS中)h 小時(shí)HDL 高密度脂蛋白HPLC高壓-高效液相色譜LC/MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用LDL 低密度脂蛋白min 分鐘MS 質(zhì)譜NMR 核磁共振譜Rf保留指數(shù)(在薄層色譜中)Rt保留時(shí)間(在HPLC中)SPA 閃爍親近測(cè)定法TBAF四丁基氟化銨TBDMSOTf三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯TFA 三氟乙酸THF 四氫呋喃HPLC和LC/MS方法方法1A柱Chiralpak IA，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異己烷/1-丙醇97∶3；流速1.0ml/min；UV-檢測(cè)254nm。
方法1B柱Chiralpak AD，250mm×4.6mm，10μm；流動(dòng)相異己烷/1-丙醇97.5∶2.5；流速1.0ml/min；UV-檢測(cè)254nm。
方法2儀器具有DAD檢測(cè)的HP 1100；柱Kromasil RP-18，60mm×2mm，3.5μm；流動(dòng)相A5ml HClO4/l水，流動(dòng)相B乙腈；梯度0min 2％B→0.5min 2％B→4.5min 90％B→9min 90％B；流速0.75ml/min；溫度30℃；UV-檢測(cè)210nm。
方法3(LC/MS)MS儀器類(lèi)型Micromass ZQ；HPLC儀器類(lèi)型HP 1100系列；UV DAD；柱Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20mm×4mm；流動(dòng)相A1l水+0.5ml 50％濃度的甲酸，流動(dòng)相B1l乙腈+0.5ml 50％濃度的甲酸；梯度0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速0.0min 1ml/min→2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；爐50℃；UV-檢測(cè)210nm。
起始材料和中間體實(shí)施例1A2，4-二環(huán)戊基-7，7-二甲基-3-(4-三氟甲基苯甲?；?-4，6，7，8-四氫-1H-喹啉-5-酮 在600ml二異丙基醚中開(kāi)始加入16.8g(59.4mmol，1.0eq.)3-氨基-3-環(huán)戊基-1-(4-三氟甲基苯基)丙烯酮(根據(jù)WO 03/028727，實(shí)施例4制備)，并且添加9.16ml(118.9mmol，2.0eq.)三氟乙酸和8.3g(59.4mmol，1eq.)5，5-二甲基環(huán)己烷-1，3-二酮。在室溫下攪拌30min后，添加7.0g(71.3mmol，1.2eq.)環(huán)戊烷甲醛，并且之后混合物在回流下在水分離器上加熱15h。冷卻到室溫后，添加另一1.0g(10.2mmol，0.17eq.)環(huán)戊烷甲醛，混合物再一次在回流下加熱并且溶劑體積減少到大約500ml?；旌衔镌诨亓飨略谒蛛x器上再加熱20h。為了后處理，混合物冷卻后蒸發(fā)至干燥，并且殘余物通過(guò)色譜在硅膠(流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯4∶1)上預(yù)-純化。以該方式獲得的產(chǎn)物組分在少量二異丙基醚中吸收并在室溫下攪拌16h。用抽吸濾掉產(chǎn)生的沉淀，用冷的二異丙基醚洗滌并在高真空下除去溶劑殘余物。
產(chǎn)率3.8g(理論的13％)1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝1.14(s，3H)，1.16(s，3H)，1.21-2.00(m，16H)，2.20(m，1H)，2.28和2.51(2d，2H)，2.34(s，2H)，3.50(sept，1H)，3.83(d，1H)，5.91(s，1H)，7.66(d，2H)，7.78(d，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝486[M+H]+.
實(shí)施例2A2，4-二環(huán)戊基-7，7-二甲基-3-(4-三氟甲基苯甲酰基)-7，8-二氫-6H-喹啉-5-酮 在78ml二氯甲烷中溶解3.79g(7.8mmol)來(lái)自實(shí)施例1A的化合物，并且在0℃下分批添加1.95mg(8.6mmol，1.1eq.)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)。伴隨攪拌，混合物經(jīng)過(guò)3h暖到室溫?；旌衔镌谛D(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并且殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯9∶1，4∶1)。
產(chǎn)率3.53g(理論的93.6％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝1.10(d，3H)，1.17(d，3H)，1.35-1.97(m，16H)，2.51-2.71(m，3H)，2.94-3.15(m，3H)，7.75(d，2H)，7.93(m，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝484[M+H]+.
實(shí)施例3A[(5S)-2，4-二環(huán)戊基-5-羥基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基](4-三氟甲基苯基)甲酮
在340ml THF中開(kāi)始加入87mg(0.58mmol，0.08eq.)(1R，2S)-1-氨基茚滿(mǎn)-2-醇，并在室溫下添加4.76g(29.2mmol，4.0eq.)硼烷-N，N-二乙基苯胺配合物。氣體的釋放停止后，混合物冷卻到0℃并且添加溶解于25ml THF中的3.53g(7.3mmol，1eq.)來(lái)自實(shí)施例2A的化合物.伴隨攪拌，使混合物能夠經(jīng)過(guò)16h暖到室溫。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)混合物中添加20ml甲醇，其之后濃縮。殘余物在150ml水和150ml乙酸乙酯間分配。含水相在每一種情況下用100ml乙酸乙酯提取兩次。合并的有機(jī)相用50ml飽和氯化鈉溶液洗滌并用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯100∶0，之后4∶1)。
產(chǎn)率3.13g(理論的88.2％)對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量根據(jù)方法1A測(cè)定為93.5％ee。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝1.00(m，3H)，1.23(m，3H)，1.29-2.03(m，19H)，2.56(m，1H)，2.64-3.08(m，2H)，3.29(m，1H)，5.17(m，1H)，7.73(d，2H)，7.93(m，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝486[M+H]+.
實(shí)施例4A((5S)-5-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2，4-二環(huán)戊基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲酮 在氬下，在64ml無(wú)水甲苯中加入3.12g(6.43mmol)來(lái)自實(shí)施例3A的化合物。在室溫下，之后添加2.76g(25.7mmol，4eq.)2，6-盧剔啶，并且混合物冷卻到-18℃.向該溶液中滴加2.95ml(12.9mmol，2eq.)三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯。反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2h。為了后處理，添加飽和的氯化銨溶液(100ml)，并且混合物暖到室溫后用乙酸乙酯提取。含水相再用乙酸乙酯提取兩次，合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯9∶1)。
產(chǎn)率3.90g(定量)1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝0.08(s，3H)，0.18(s，3H)，0.86(s，9H)，0.91(s，3H)，1.24(s，3H)，1.28-2.06(m，18H)，2.47-3.23(m，3H)，3.32(m，1H)，5.20(m，1H)，7.73(d，2H)，7.81-8.03(m，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝600[M+H]+.
實(shí)施例5A(S)((5S)-5-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2，4-二環(huán)戊基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇 在0℃下，向3.9g(6.5mmol)來(lái)自實(shí)施例4A的化合物在65ml無(wú)水THF中的溶液中添加9.8ml 1M氫化鋁鋰(9.8mmol，1.5eq.)溶液。在0℃下再攪拌4小時(shí)。為了后處理，仔細(xì)添加120ml飽和的酒石酸鉀鈉溶液。氣體的釋放停止后，混合物用乙酸乙酯提取三次并且合并的有機(jī)相用飽和的氯化銨溶液和飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。殘余物色譜純化，導(dǎo)致了產(chǎn)物非對(duì)映異構(gòu)體的分離(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯95∶5)。
產(chǎn)率1.87g(理論的47.8％)
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝0.13(s，3H)，0.19(s，3H)，0.82-0.97(m，15H)，1.09-2.12(m，18H)，2.19(m，1H)，2.56(d，1H)，2.86-3.05(m，2H)，3.70(m，1H)，5.21(t，1H)，6.23(br.s，1H)，7.42(d，2H)，7.59(d，2H)ppm.
MS(DCI)m/z＝602[M+H]+Rf＝0.26(異己烷/乙酸乙酯9∶1)順式-非對(duì)映異構(gòu)體(R)((5S)-5-([叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2，4-二環(huán)戊基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇產(chǎn)率2.16g(理論的53.9％)Rf＝0.34(異己烷/乙酸乙酯9∶1)實(shí)施例6A(5S)-5-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2，4-二環(huán)戊基-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉 在-17℃下和在氬下，向1.78g(3.0mmol)來(lái)自實(shí)施例5A的化合物在29ml無(wú)水二氯甲烷中的溶液中添加0.59ml二乙基氨基三氟化硫(4.4mmol，1.5eq.)?；旌衔锢鋮s到-66℃并且之后經(jīng)過(guò)6h伴隨攪拌暖到0℃。反應(yīng)溶液再一次冷卻到-78℃，并再添加0.25ml二乙基氨基三氟化硫(1.9mmol，0.64eq.)。伴隨攪拌，之后混合物經(jīng)過(guò)10h暖到10℃。為了后處理，伴隨冰冷卻仔細(xì)添加40ml飽和碳酸氫鈉溶液?；旌衔锟偣灿靡宜嵋阴ヌ崛∪巍Ｖ蠛喜⒌挠袡C(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾通過(guò)色譜純化(流動(dòng)相環(huán)己烷/乙酸乙酯9∶1)。
產(chǎn)率1.67g(理論的93.3％)1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝0.13(s，3H)，0.19(s，3H)，0.90(3，9H)，0.93(s，3H)，1.21(s，3H)，1.58-2.15(m，17H)，2.51-3.05(m，4H)，3.70(m，1H)，5.21(t，1H)，6.92(d，1H)，7.38(d，2H)，7.62(d，2H)ppm.
HPLC(方法2)Rt＝6.30min.
MS(ESIpos)m/z＝604[M+H]+Rf＝0.68(異己烷/乙酸乙酯9∶1)實(shí)施的實(shí)施例實(shí)施例1(5S)-2，4-二環(huán)戊基-3-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-5-醇 在0℃下，向1.67g(2.8mmol)來(lái)自實(shí)施例6A的化合物在16ml無(wú)水THF的溶液中滴加11.0ml 1M四丁基氟化銨(11.0mmol，4.0eq.)在THF中的溶液。反應(yīng)混合物在冰浴中攪拌4h。為了后處理，混合物用100ml乙酸乙酯稀釋并在每一種情況下用100ml水和用50ml飽和的氯化鈉溶液洗滌。有機(jī)相通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。色譜純化粗產(chǎn)物(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯9∶1→4∶1)。
產(chǎn)率0.74g(理論的55.1％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝1.02(s，3H)，1.18(s，3H)，1.34-2.19(m，18H)，2.61-2.97(m，3H)，3.72(m，1H)，3.84(七重峰，1H)，5.14(q，1H)，6.96(d，1H)，7.34(d，2H)，7.61(d，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝490[M+H]+
Rf＝0.13(異己烷/乙酸乙酯9∶1)通過(guò)色譜進(jìn)行仍然存在于產(chǎn)物中非對(duì)映異構(gòu)體的進(jìn)一步分離[柱Chiralpak AD，250mm×20mm，5μm；流動(dòng)相異己烷/異丙醇97∶3；流速15ml/min]產(chǎn)率0.57g(理論的42.4％)HPLC(方法1B)Rt＝5.60min。
B.藥理學(xué)活性的評(píng)價(jià)B-I.CETP-抑制試驗(yàn)B-I.1.CETP的獲得CETP由人的血漿通過(guò)差示離心和柱色譜以部分純化的形式獲得并用于該試驗(yàn)。為此，使用NaBr將人血漿調(diào)整到每ml 1.21g的密度并在4℃下在50000rmp下離心18h。底部組分(d＞1.21g/ml)用于Sephadex-Phenyl-Sepharose 4B(Pharmacia公司)柱，用0.15MNaCl/0.001M TrisHCl pH 7.4洗滌和之后用蒸餾水洗脫。收集CETP活性組分，以50mM乙酸鈉pH 4.5滲析并施加于CM-Sepharose柱(Pharmacia公司)。之后混合物使用線(xiàn)性梯度(0-1M NaCl)洗脫。收集的CETP組分用10mM TrisHCl pH 7.4滲析和之后進(jìn)一步通過(guò)色譜在Mono Q柱(Pharmacia)上純化。
B-I.2.CETP熒光試驗(yàn)CETP催化的脂質(zhì)體間的熒光膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定[根據(jù)Bisgaier等，J.Lipid Res.34，1625(1993)的步驟改進(jìn)]為了制備供體脂質(zhì)體，隨著在超聲波浴中輕輕的加溫在600μl的二烷中溶解1mg膽甾烯基-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省(indacene)-3-十二烷酸酯(膽甾烯基BODIPYFLC12，Molecular Probes公司)、15.35mg三油精和6.67mg磷脂酰膽堿并且在室溫下用超聲波作用非常緩慢地向63ml 50mM TrisHCl/150mMNaCl/2mM EDTA緩沖液pH 7.3中添加該溶液。之后懸浮液在Branson超聲浴中在大約50瓦下在N2氛下超聲破碎30min，溫度保持在大約20℃。
由溶解于1.2ml二烷和114ml以上緩沖液中的86mg油酸膽甾醇酯，20mg三油精和100mg磷脂酰膽堿通過(guò)在30分鐘50瓦(20℃)下的超聲作用類(lèi)似地獲得受體脂質(zhì)體。
B-I.2.1.富集CETP的CETP熒光試驗(yàn)為了試驗(yàn)，使用由1份以上緩沖液，1份供體脂質(zhì)體和2份受體脂質(zhì)體構(gòu)成的試驗(yàn)混合物。
用48μl富集的CETP組分(1-3μg)和2μl要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液處理50μl試驗(yàn)混合物，該CETP組分通過(guò)疏水色譜由人的血漿獲得，并且在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.2.人血漿的CETP熒光試驗(yàn)向42μl(86％v/v)人血漿(Sigma P9523)中添加6μl(12％v/v)供體脂質(zhì)體和1μl(2％v/v)要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液，并且混合物在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。
在510/520nm下的熒光改變(縫寬2.5nm)是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.3.活體外離體CETP熒光試驗(yàn)向80μl試驗(yàn)混合物中添加10μl緩沖液和2μl血清，并且混合物在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.3.放射性標(biāo)記的HDL的獲得50ml新鮮的人EDTA血漿使用NaBr調(diào)整到1.12的密度并在4℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h。上層相用于獲得冷的LDL。下層相用3×4升PDB緩沖液(10mM TrisHCl，pH 7.4，0.15mM NaCl，1mM EDTA，0.02％NaN3)滲析。之后每10ml滲余物體積添加20μl3H-膽固醇(Dupont NET-725；在乙醇中溶解1μC/μl)并且混合物在37℃下在N2下培養(yǎng)72小時(shí)。
之后該批料使用NaBr調(diào)整到密度1.21并在20℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h?；厥丈蠈酉嗖⑶彝ㄟ^(guò)梯度離心純化脂蛋白組分。為此，分離的、標(biāo)記的脂蛋白使用NaBr調(diào)整到1.26的密度。在離心管(SW 40轉(zhuǎn)子)中用4ml密度為1.21的溶液和4.5ml密度為1.063的溶液覆蓋4ml每一份的該溶液(PDB緩沖液和NaBr的密度溶液)并且之后在38000rpm和20℃下在SW 40中轉(zhuǎn)子離心。位于密度1.063和1.21之間的中間層，其包含標(biāo)記的HDL，在4℃下用3×100體積的PDB緩沖液滲析。
滲余物包含放射性標(biāo)記的3H-CE-HDL，其調(diào)整到大約5×106cmp/ml，用于該試驗(yàn)。
B-I.4.CETP-SPA試驗(yàn)為了試驗(yàn)CETP的活性，測(cè)定3H-膽固醇酯由人的HD脂蛋白到生物素化作用的LD脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，反應(yīng)通過(guò)添加鏈霉抗生物素蛋白-SPA珠子(Amersham公司)結(jié)束并且轉(zhuǎn)移的放射活性直接在液體閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。
在試驗(yàn)批料中，10μl HDL-3H-膽固醇酯(約50000cpm)在37℃下用10μl生物素-LDL(Amersham公司)在包含10μl CETP(1mg/ml)的50mM Hepes/0.15M NaCl/0.1％牛血清白蛋白/0.05％NaN3pH 7.4和3μl要試驗(yàn)的物質(zhì)(溶解于10％DMSO/1％RSA的溶液)中培養(yǎng)18小時(shí)。之后添加200μl SPA-鏈霉抗生物素蛋白珠子溶液(TRKQ 7005)，進(jìn)一步隨著振搖培養(yǎng)1h并且之后在閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。用10μl緩沖液，在4℃下的10μl CETP和在37℃下的10μl CETP的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)作為對(duì)照。
在使用CETP的對(duì)照批料中在37℃下轉(zhuǎn)移的活性看作100％轉(zhuǎn)移。該轉(zhuǎn)移減少到一半時(shí)的的物質(zhì)濃度規(guī)定為IC50值。
B-II.1.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠上活體外離體活性的測(cè)定為了試驗(yàn)CETP抑制活性，使用胃管給內(nèi)部喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠[Dinchuk等，BBA 1295-301(1995)]口服該物質(zhì)。為此，在開(kāi)始試驗(yàn)前一天雄性動(dòng)物隨意安排成具有等同數(shù)量動(dòng)物，通常n＝4的組。在施用該物質(zhì)前，由每一只鼠通過(guò)眶后靜脈叢(retroorbitalenVenenplexus)的穿刺采集用于測(cè)定它的血清中基本CETP活性的血(時(shí)間點(diǎn)T1)。之后使用胃管給動(dòng)物服用該試驗(yàn)物質(zhì)。在試驗(yàn)物質(zhì)施用后的規(guī)定時(shí)間，通過(guò)穿刺第二次(時(shí)間點(diǎn)T2)從動(dòng)物中取血，通常在施用物質(zhì)后16或24h，但是如合適這也可以在另一時(shí)間進(jìn)行。
為了能夠評(píng)估物質(zhì)的抑制活性，對(duì)每一時(shí)間，即16或18小時(shí)，使用動(dòng)物僅僅接受沒(méi)有物質(zhì)的制劑的相應(yīng)對(duì)照組。在對(duì)照動(dòng)物中，為了能夠測(cè)定經(jīng)過(guò)相應(yīng)的試驗(yàn)時(shí)間間隔(16或24h)沒(méi)有抑制劑的CETP活性的改變，在物質(zhì)處理的動(dòng)物中進(jìn)行每一動(dòng)物的二次血樣采集。
凝固結(jié)束后，血樣樣品離心并且用吸管除去血清。為了測(cè)定CETP活性，測(cè)定經(jīng)過(guò)4h的膽甾烯基酯(Cholesterylester)的運(yùn)輸。為此，通常在試驗(yàn)批料中使用2μl血清并且試驗(yàn)如在B-I.2.3.下描述的進(jìn)行。
對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)膮^(qū)別[pM CE/h(T2)-pMCE/h(T1)]并在組中求平均值。在時(shí)間點(diǎn)之一中減少了＞20％膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)被認(rèn)為是活性的。
B-II.2.在敘利亞金黃色倉(cāng)鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定內(nèi)部喂養(yǎng)并具有150-200g重量的雌性敘利亞金黃色倉(cāng)鼠(種BAYDSN)用于測(cè)定CETP抑制劑對(duì)于血清脂蛋白和血清甘油三酯的口服作用。每個(gè)籠子的六只動(dòng)物分成一組并且任意喂養(yǎng)和進(jìn)水馴化兩周。
就在試驗(yàn)開(kāi)始前和物質(zhì)服用后，通過(guò)靜脈叢的眶后穿刺取血并在室溫下培養(yǎng)30min和在30000g下離心20分鐘后用于獲得血清。該物質(zhì)溶解于20％Solutol/80％水并且通過(guò)胃管口服，對(duì)照動(dòng)物接受相同體積的溶劑而沒(méi)有試驗(yàn)物質(zhì)。
使用分析儀器COBAS INTEGRA 400 plus(來(lái)自Roche Diagnostics公司)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定甘油三酯，膽固醇總量，HDL膽固醇和LDL膽固醇。來(lái)自測(cè)定值，對(duì)于每一個(gè)參數(shù)，對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算由用物質(zhì)處理引起的百分比的改變并且每一組規(guī)定為具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值(n＝6或n＝12)。如果與用溶劑處理的組比較，物質(zhì)的影響是顯著的，加入通過(guò)t-試驗(yàn)測(cè)定的p-值(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.005)。
B-II.3.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定為了測(cè)定對(duì)于脂蛋白和甘油三酯的口服作用，使用胃管給轉(zhuǎn)基因小鼠[Dinchuk等，BBA，1295-1301(1995)]服用試驗(yàn)物質(zhì)。試驗(yàn)開(kāi)始前，為了測(cè)定血清中的膽固醇和甘油三酯由鼠的眶后抽血。對(duì)于倉(cāng)鼠如以上描述獲得的血清在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜并且隨后在6000g下離心。三天后，為了測(cè)定脂蛋白和甘油三酯再一次由鼠取血。測(cè)定的參數(shù)的改變表達(dá)為與開(kāi)始值比較的百分比的改變。
C.藥物組合物的實(shí)施的實(shí)施例本發(fā)明的化合物可以以下列方法轉(zhuǎn)化成藥物制劑片組合物100mg本發(fā)明的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(國(guó)產(chǎn))，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(來(lái)自BASF，Ludwigshafen，德國(guó))和2mg硬脂酸鎂。
片重量212mg。直徑8mm，彎曲半徑12mm。
生產(chǎn)本發(fā)明的化合物，乳糖和淀粉的混合物在水中和5％濃度的PVP溶液(m/m)造粒。干燥之后顆粒與硬脂酸鎂混合5分鐘。該混合物使用常規(guī)壓片機(jī)(對(duì)于片的形式參見(jiàn)以上)壓片。15kN的壓力用作壓片的指導(dǎo)值。
可以口服的懸浮液組合物1000mg本發(fā)明的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg Rhodigel(來(lái)自FMC的黃原膠，賓夕法尼亞，美國(guó))和99g水。
10ml口服懸浮液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)Rhodigel懸浮于乙醇中，和向懸浮液中添加本發(fā)明的化合物。隨著攪拌添加水?；旌衔飻嚢璐蠹s6h直到Rhodigel溶脹完成。
可以口服的溶液組合物500mg本發(fā)明的化合物，2.5g聚山梨醇酯和97g聚乙二醇400。20g口服溶液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)隨著攪拌，本發(fā)明的化合物懸浮于聚乙二醇和聚山梨醇酯的混合物中，繼續(xù)攪拌直到本發(fā)明的化合物完全溶解。
體內(nèi)(i.v.)溶液以低于飽和溶解性的濃度，本發(fā)明的化合物溶解于生理可接受溶劑(例如等滲鹽水，葡萄糖溶液5％和/或PEG 400溶液30％)。溶液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾并裝入無(wú)菌的和無(wú)熱原的注射容器中。
具有式(Ie)的化合物的試驗(yàn)部分A.實(shí)施例縮寫(xiě)和首字母縮拼詞CE膽固醇酯CETP 膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白DAST 二甲基氨基三氟化硫DCI 直接化學(xué)電離(在MS中)DDQ 2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌de非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亞砜d.Th 理論的(在產(chǎn)率中)EDTA 乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸ee對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量eq. 當(dāng)量ESI 電霧化電離(在MS中)
h 小時(shí)HDL高密度脂蛋白HPLC 高壓-高效液相色譜LC/MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用LDL低密度脂蛋白min分鐘MS 質(zhì)譜NMR核磁共振譜Rf保留指數(shù)(在薄層色譜中)Rt保留時(shí)間(在HPLC中)SPA閃爍親近測(cè)定法TBAF 四丁基氟化銨TBDMSOTf 三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯TFA三氟乙酸THF四氫呋喃HPLC和LC/MS方法方法1A柱Chiralpak IA，250mm×4.6mm；流動(dòng)相異己烷/1-丙醇97∶3；流速1.0ml/min；UV-檢測(cè)254nm。
方法1B柱Chiralpak AD，250mm×4.6mm，10μm；流動(dòng)相異己烷/異丙醇97.5∶2.5；流速1.0ml/min；UV-檢測(cè)254nm。
方法1C柱Chiralpak AD，250mm×4.6mm，10μm；流動(dòng)相異己烷/異丙醇97.5∶2.5；流速1.5ml/min；UV-檢測(cè)254nm。
方法2儀器具有DAD檢測(cè)的HP 1100；柱Kromasil RP-18，60mm×2mm，3.5μm；流動(dòng)相A5ml HClO4/l水，流動(dòng)相B乙腈；梯度0min 2％B→0.5min 2％B→4.5min 90％B→9min 90％B；流速0.75ml/min；溫度30℃；UV-檢測(cè)210nm。
方法3(LC/MS)MS儀器類(lèi)型Micromass ZQ；HPLC儀器類(lèi)型HP 1100系列；UV DAD；柱Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20mm×4mm；流動(dòng)相A1l水+0.5ml 50％濃度的甲酸，流動(dòng)相B1l乙腈+0.5ml 50％濃度的甲酸；梯度0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速0.0min 1ml/min→2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；爐50℃；UV-檢測(cè)210nm。
起始材料和中間體實(shí)施例1A4-環(huán)己基-2-異丙基-7，7-二甲基-3-(4-三氟甲基)苯甲?；鵠-4，6，7，8-四氫喹啉-5(1H)-酮 在150ml二異丙基醚中開(kāi)始加入5.0g(19.4mmol，1.2eq.)3-氨基-3-異丙基-1-(4-三氟甲基苯基)丙烯酮(根據(jù)WO 03/028727，實(shí)施例2制備)，并且添加2.50ml(32.4mmol，2.0eq.)三氟乙酸和2.3g(16.2mmol，1eq.)5，5-二甲基環(huán)己烷-1，3-二酮。在室溫下攪拌10min后，添加2.7g(24.3mmol，1.5eq.)環(huán)己烷甲醛。之后混合物在回流下在水分離器上加熱18h。冷卻后，混合物在冰浴中攪拌30min，用抽吸濾掉獲得的沉淀，用冷的二異丙基醚洗滌并且在高真空下除去溶劑殘余物。
產(chǎn)率2.63g(理論的34.3％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.78-1.36(m，6H)，1.04(d，3H)，1.16(2s，6H)，1.29(d，3H)，1.28(d，3H)，1.46-1.67(m，5H)，2.32和2.49(2d，2H)，2.34(s，2H)，3.46(七重峰，1H)，3.75(d，1H)，5.89(s，1H)，7.65(d，2H)，7.77(d，2H)ppm.
MS(DCI)m/z＝474[M+H]+.
實(shí)施例2A4-環(huán)己基-2-異丙基-7，7-二甲基-3-[4-(三氟甲基)苯甲?；鵠-7，8-二氫喹啉-5(6H)-酮
在50ml二氯甲烷中溶解2.30g(4.9mmol)來(lái)自實(shí)施例1A的化合物，并且在0℃下分批添加1.10mg(4.9mmol，1eq.)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)?；旌衔镏笤?℃下攪拌1h并之后在室溫下18h?；旌衔镌谛D(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并且殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相環(huán)己烷/乙酸乙酯5∶1)。
產(chǎn)率2.16g(理論的94.2％)1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝1.00-1.89(m，10H)，1.08(d，3H)，1.11(s，3H)，1.14(d，3H)，1.17(s，3H)，2.48-2.69(m，3H)，3.09(s，2H)，3.27(m，1H)，7.75(d，2H)，7.94(m，2H)ppm.
MS(DCI)m/z＝472[M+H]+.
實(shí)施例3A[(5S)-4-環(huán)己基-5-羥基-2-異丙基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基][4-(三氟甲基)苯基]甲酮 在115ml THF中開(kāi)始加入55mg(0.37mmol，0.08eq.)(1R，2S)-1-氨基茚滿(mǎn)-2-醇，并在室溫下添加2.98g(18.3mmol，4.0eq.)硼烷-N，N-二乙基苯胺配合物。氣體的釋放停止后，混合物冷卻到0℃并且添加溶解于115ml THF中的2.16g(4.6mmol，1eq.)來(lái)自實(shí)施例2A的化合物。伴隨攪拌，使混合物能夠經(jīng)過(guò)18h暖到室溫。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)混合物中添加20ml甲醇，其之后蒸發(fā)至干燥。之后通過(guò)色譜純化粗產(chǎn)物(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯混合物)。
產(chǎn)率2.01g(理論的93.0％)對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量根據(jù)方法1A測(cè)定為88％ee。
對(duì)映異構(gòu)體通過(guò)在手性相上色譜分離(柱Chiralpak AD-H，250mm×20mm，20μm；流動(dòng)相異己烷/異丙醇97∶3；流速15ml/min)。
產(chǎn)率1.70(理論的78.5％)。
對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量根據(jù)方法1A測(cè)定為＞99％ee；Rt(方法1A)＝5.22min。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝0.88-2.12(m，26H)，2.50(七重峰，1H)，2.71(d，1H)，2.98(d，1H)，5.18(m，1H)，7.45-8.50(br.m，4H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝474[M+H]+.
實(shí)施例4A((5S)-5-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-環(huán)己基-2-異丙基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲酮 在氬下，在22ml無(wú)水甲苯中開(kāi)始加入2.82g(5.95mmol)來(lái)自實(shí)施例3A的化合物。在室溫下，之后添加2.55g(23.8mmol，4eq.)2，6-盧剔啶，并且混合物冷卻到-16℃。向該溶液中滴加溶解于7ml甲苯中的2.74ml(11.9mmol，2eq.)三氟甲烷磺酸叔-丁基二甲基甲硅烷基酯。15分鐘后，反應(yīng)混合物暖到0℃并且在該溫度下再攪拌80min。為了后處理，添加124ml0.1N鹽酸，并且混合物暖到室溫后用乙酸乙酯提取。有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液和飽和碳酸氫鈉溶液的1∶1混合物洗滌。合并的有機(jī)相用乙酸乙酯重提取兩次。合并的有機(jī)相通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。殘余物通過(guò)色譜純化(硅膠，流動(dòng)相異己烷/乙酸乙酯9∶1)。
產(chǎn)率3.17g(理論的90.7％)1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.14(s，3H)，0.19(s，3H)，0.86(s，9H)，0.65-1.83(m，24H)，1.96-2.07(m，1H)，2.47(m，1H)，2.63(m，1H)，3.10(m，1H)，5.25(m，1H)，7.43-8.54(br.m，4H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝588[M+H]+.
實(shí)施例5A(S)((5S)-5-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-環(huán)己基-2-異丙基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇 在0℃下，向3.17g(5.4mmol)來(lái)自實(shí)施例4A的化合物在75ml無(wú)水THF中的溶液中添加5.9ml 1M氫化鋁鋰(5.9mmol，1eq.)在THF中的溶液。伴隨攪拌，混合物經(jīng)過(guò)5h暖到室溫。為了后處理，仔細(xì)添加120ml飽和的酒石酸鉀鈉溶液。氣體的釋放停止后，混合物用乙酸乙酯提取四次，并且合并的有機(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。殘余物色譜純化，導(dǎo)致了產(chǎn)物非對(duì)映異構(gòu)體的分離(柱Chiralpak AD，500mm×40mm，20μm；流動(dòng)相異己烷/異丙醇97.5∶2.5；流速50ml/min；溫度24℃；UV-檢測(cè)254nm)。
產(chǎn)率0.95g(理論的29.8％)
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.20(br.s，6H)，0.76-2.03(m，30H)，1.02-2.34(m，14H)，2.17(m，1H)，2.43-3.10(m，3H)，3.36(m，1H)，5.26(m，1H)，6.66(br.s，1H)，7.32-7.65(m，4H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝590[M+H]+LC/MS(方法3)Rt＝3.03min.
HPLC(方法1B)Rt＝2.84min.
順式-非對(duì)映異構(gòu)體(R)((5S)-5-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-環(huán)己基-2-異丙基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-3-基)[4-(三氟甲基)苯基]甲醇產(chǎn)率1.25g(理論的39.2％)實(shí)施例6A(5S)-5-{[叔-丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-環(huán)己基-3-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-2-異丙基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉 在-60℃下和在氬下，向1.35g(2.3mmol)來(lái)自實(shí)施例5A的化合物在30ml無(wú)水甲苯中的溶液中滴加0.45ml二乙基氨基三氟化硫(3.4mmol，1.5eq.)。伴隨暖到-10℃，混合物攪拌3h。為了后處理，伴隨冰冷卻仔細(xì)添加40ml飽和碳酸氫鈉溶液?；旌衔锟偣灿靡宜嵋阴ヌ崛∪巍Ｖ蠛喜⒌挠袡C(jī)相用飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾通過(guò)硅膠純化(流動(dòng)相環(huán)己烷/乙酸乙酯9∶1)。
產(chǎn)率1.28g(理論的94.8％)
1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ＝0.20(br.s，6H)，0.71(d，3H)，0.91(s，9H)，0.77-2.06(m，21H)，2.60和3.03(2d，2H)，2.78(m，1H)，3.36(m，1H)，5.25(m，1H)，7.10-7.50(m，3H)，7.63(d，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝592[M+H]+.
實(shí)施的實(shí)施例實(shí)施例1(5S)-4-環(huán)己基-3-{(S)-氟[4-(三氟甲基)苯基]甲基}-2-異丙基-7，7-二甲基-5，6，7，8-四氫喹啉-5-醇 在0℃下，向1.28g(2.2mmol)來(lái)自實(shí)施例6A的化合物在25ml無(wú)水THF的溶液中滴加5.4ml 1M四丁基氯化銨(5.4mmol，2.5eq.)在THF中的溶液?；旌衔镌诒≈袛嚢?h。為了后處理，混合物用20ml乙酸乙酯稀釋并用20ml水洗滌。含水相在每一種情況下用20ml乙酸乙酯重提取兩次。合并的有機(jī)相用50ml飽和的氯化鈉溶液洗滌，通過(guò)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。色譜純化粗產(chǎn)物，導(dǎo)致了仍然存在的非對(duì)映異構(gòu)體的分離(柱Chiralpak AD-H，250mm×20mm，5μm；流動(dòng)相異己烷/異丙醇97∶3；流速25ml/min)。
產(chǎn)率0.67g(理論的65.3％)1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ＝0.60(d，3H)，1.03(s，3H)，1.12(d，3H)，1.17(s，3H)，1.08-1.51(m，4H)，1.67-2.14(m，9H)，2.61-2.94(m，3H)，3.52(m，1H)，5.14(m，1H)，7.33(d，2H)，7.37(d，1H)，7.61(d，2H)ppm.
MS(ESIpos)m/z＝478[M+H]+HPLC(方法1C)Rt＝4.33min.
B.藥理學(xué)活性的評(píng)價(jià)B-I.CETP-抑制試驗(yàn)B-I.1.CETP的獲得CETP由人的血漿通過(guò)差示離心和柱色譜以部分純化的形式獲得并用于該試驗(yàn)。為此，使用NaBr將人血漿調(diào)整到每ml 1.21g的密度并在4℃下在50000rmp下離心18h。底部組分(d＞1.21g/ml)用于Sephadex-Phenyl-Sepharose 4B(Pharmacia公司)柱，用0.15MNaCl/0.001M TrisHCl pH 7.4洗滌和之后用蒸餾水洗脫。收集CBTP活性組分，以50mM乙酸鈉pH 4.5滲析并施加于CM-Sepharose柱(Pharmacia公司)。之后混合物使用線(xiàn)性梯度(0-1M NaCl)洗脫。收集的CETP組分用10mM TrisHCl pH 7.4滲析和之后進(jìn)一步通過(guò)色譜在Mono Q柱(Pharmacia)上純化。
B-I.2.CETP熒光試驗(yàn)CETP催化的脂質(zhì)體間的熒光膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)的測(cè)定[根據(jù)Bisgaier等，J.Lipid Res.34，1625(1993)的步驟改進(jìn)]為了制備供體脂質(zhì)體，隨著在超聲波浴中輕輕的加溫在600μl的二烷中溶解1mg膽甾烯基-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-引達(dá)省(indacene)-3-十二烷酸酯(膽甾烯基BODIPYFLC12，Molecular Probes公司)、15.35mg三油精和6.67mg磷脂酰膽堿并且在室溫下用超聲波作用非常緩慢地向63ml 50mM TrisHCl/150mMNaCl/2mM EDTA緩沖液pH 7.3中添加該溶液。之后懸浮液在Branson超聲浴中在大約50瓦下在N2氛下超聲破碎30min，溫度保持在大約20℃。
由溶解于1.2ml二烷和114ml以上緩沖液中的86mg油酸膽甾醇酯，20mg三油精和100mg磷脂酰膽堿通過(guò)在30分鐘50瓦(20℃)下的超聲作用類(lèi)似地獲得受體脂質(zhì)體。
B-I.2.1.富集CETP的CETP熒光試驗(yàn)為了試驗(yàn)，使用由1份以上緩沖液，1份供體脂質(zhì)體和2份受體脂質(zhì)體構(gòu)成的試驗(yàn)混合物。
用48μl富集的CETP組分(1-3μg)和2μl要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液處理50μl試驗(yàn)混合物，該CETP組分通過(guò)疏水色譜由人的血漿獲得，并且在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.2.人血漿的CETP熒光試驗(yàn)向42μl(86％v/v)人血漿(Sigma P9523)中添加6μl(12％v/v)供體脂質(zhì)體和1μl(2％v/v)要檢查的物質(zhì)在DMSO中的溶液，并且混合物在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。
在510/520nm下的熒光改變(縫寬2.5nm)是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.2.3.活體外離體CETP熒光試驗(yàn)向80μl試驗(yàn)混合物中添加10μl緩沖液和2μl血清，并且混合物在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。
在485/535nm下的熒光改變是對(duì)CE轉(zhuǎn)運(yùn)的量度，與沒(méi)有物質(zhì)的對(duì)照批次比較測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制。
B-I.3.放射性標(biāo)記的HDL的獲得50ml新鮮的人EDTA血漿使用NaBr調(diào)整到1.12的密度并在4℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h。上層相用于獲得冷的LDL。下層相用3×4升PDB緩沖液(10mM TrisHCl，pH 7.4，0.15mM NaCl，1mM EDTA，0.02％NaN3)滲析。之后每10ml滲余物體積添加20μl3H-膽固醇(Dupont NET-725；在乙醇中溶解1μC/μl)并且混合物在37℃下在N2下培養(yǎng)72小時(shí)。
之后該批料使用NaBr調(diào)整到密度1.21并在20℃下在50000rpm下的Ty 65轉(zhuǎn)子中離心18h。回收上層相并且通過(guò)梯度離心純化脂蛋白組分。為此，分離的、標(biāo)記的脂蛋白使用NaBr調(diào)整到1.26的密度。在離心管(SW 40轉(zhuǎn)子)中用4ml密度為1.21的溶液和4.5ml密度為1.063的溶液覆蓋4ml每一份的該溶液(PDB緩沖液和NaBr的密度溶液)并且之后在38000rpm和20℃下在SW 40中轉(zhuǎn)子離心。位于密度1.063和1.21之間的中間層，其包含標(biāo)記的HDL，在4℃下用3×100體積的PDB緩沖液滲析。
滲余物包含放射性標(biāo)記的3H-CE-HDL，其調(diào)整到大約5×106cmp/ml，用于該試驗(yàn)。
B-I.4.CETP-SPA試驗(yàn)為了試驗(yàn)CETP的活性，測(cè)定3H-膽固醇酯由人的HD脂蛋白到生物素化作用的LD脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，反應(yīng)通過(guò)添加鏈霉抗生物素蛋白-SPA珠子(Amersham公司)結(jié)束并且轉(zhuǎn)移的放射活性直接在液體閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。
在試驗(yàn)批料中，10μl HDL-3H-膽固醇酯(約50000cpm)在37℃下用10μl生物素-LDL(Amersham公司)在包含10μl CETP(1mg/ml)的50mM Hepes/0.15M NaCl/0.1％牛血清白蛋白/0.05％NaN3pH 7.4和3μl要試驗(yàn)的物質(zhì)(溶解于10％DMSO/1％RSA的溶液)中培養(yǎng)18小時(shí)。之后添加200μl SPA-鏈霉抗生物素蛋白珠子溶液(TRKQ 7005)，進(jìn)一步隨著振搖培養(yǎng)1h并且之后在閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定。用10μl緩沖液，在4℃下的10μl CETP和在37℃下的10μl CETP的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)作為對(duì)照。
在使用CETP的對(duì)照批料中在37℃下轉(zhuǎn)移的活性看作100％轉(zhuǎn)移。該轉(zhuǎn)移減少到一半時(shí)的的物質(zhì)濃度規(guī)定為IC50值。
B-II.1.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠上活體外離體活性的測(cè)定為了試驗(yàn)CETP抑制活性，使用胃管給內(nèi)部喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠[Dinchuk等，BBA 1295-301(1995)]口服該物質(zhì)。為此，在開(kāi)始試驗(yàn)前一天雄性動(dòng)物隨意安排成具有等同數(shù)量動(dòng)物，通常n＝4的組。在施用該物質(zhì)前，由每一只鼠通過(guò)眶后靜脈叢(retroorbitalenVenenplexus)的穿刺采集用于測(cè)定它的血清中基本CETP活性的血(時(shí)間點(diǎn)T1)。之后使用胃管給動(dòng)物服用該試驗(yàn)物質(zhì)。在試驗(yàn)物質(zhì)施用后的規(guī)定時(shí)間，通過(guò)穿刺第二次(時(shí)間點(diǎn)T2)從動(dòng)物中取血，通常在施用物質(zhì)后16或24h，但是如合適這也可以在另一時(shí)間進(jìn)行。
為了能夠評(píng)估物質(zhì)的抑制活性，對(duì)每一時(shí)間，即16或18小時(shí)，使用動(dòng)物僅僅接受沒(méi)有物質(zhì)的制劑的相應(yīng)對(duì)照組。在對(duì)照動(dòng)物中，為了能夠測(cè)定經(jīng)過(guò)相應(yīng)的試驗(yàn)時(shí)間間隔(16或24h)沒(méi)有抑制劑的CETP活性的改變，在物質(zhì)處理的動(dòng)物中進(jìn)行每一動(dòng)物的二次血樣采集。
凝固結(jié)束后，血樣樣品離心并且用吸管除去血清。為了測(cè)定CETP活性，測(cè)定經(jīng)過(guò)4h的膽甾烯基酯(Cholesterylester)的運(yùn)輸。為此，通常在試驗(yàn)批料中使用2μl血清并且試驗(yàn)如在B-I.2.3.下描述的進(jìn)行。
對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)膮^(qū)別[pM CE/h(T2)-pMCE/h(T1)]并在組中求平均值。在時(shí)間點(diǎn)之一中減少了＞20％膽甾烯基酯的運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)被認(rèn)為是活性的。
B-II.2.在敘利亞金黃色倉(cāng)鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定內(nèi)部喂養(yǎng)并具有150-200g重量的雌性敘利亞金黃色倉(cāng)鼠(種BAYDSN)用于測(cè)定CETP抑制劑對(duì)于血清脂蛋白和血清甘油三酯的口服作用。每個(gè)籠子的六只動(dòng)物分成一組并且任意喂養(yǎng)和進(jìn)水馴化兩周。
就在試驗(yàn)開(kāi)始前和物質(zhì)服用后，通過(guò)靜脈叢的眶后穿刺取血并在室溫下培養(yǎng)30min和在30000g下離心20分鐘后用于獲得血清。該物質(zhì)溶解于20％Solutol/80％水并且通過(guò)胃管口服，對(duì)照動(dòng)物接受相同體積的溶劑而沒(méi)有試驗(yàn)物質(zhì)。
使用分析儀器COBAS INTEGRA 400 plus(來(lái)自Roche Diagnostics公司)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定甘油三酯，膽固醇總量，HDL膽固醇和LDL膽固醇。來(lái)自測(cè)定值，對(duì)于每一個(gè)參數(shù)，對(duì)于每一只動(dòng)物計(jì)算由用物質(zhì)處理引起的百分比的改變并且每一組規(guī)定為具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值(n＝6或n＝12)。如果與用溶劑處理的組比較，物質(zhì)的影響是顯著的，加入通過(guò)t-試驗(yàn)測(cè)定的p-值(*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.005)。
B-II.3.在轉(zhuǎn)基因hCETP小鼠中體內(nèi)活性的測(cè)定為了測(cè)定對(duì)于脂蛋白和甘油三酯的口服作用，使用胃管給轉(zhuǎn)基因小鼠[Dinchuk等，BBA，1295-1301(1995)]服用試驗(yàn)物質(zhì)。試驗(yàn)開(kāi)始前，為了測(cè)定血清中的膽固醇和甘油三酯由鼠的眶后抽血。對(duì)于倉(cāng)鼠如以上描述獲得的血清在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜并且隨后在6000g下離心。三天后，為了測(cè)定脂蛋白和甘油三酯再一次由鼠取血。測(cè)定的參數(shù)的改變表達(dá)為與開(kāi)始值比較的百分比的改變。
C.藥物組合物的實(shí)施的實(shí)施例本發(fā)明的化合物可以以下列方法轉(zhuǎn)化成藥物制劑片組合物100mg本發(fā)明的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(國(guó)產(chǎn))，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(來(lái)自BASF，Ludwigshafen，德國(guó))和2mg硬脂酸鎂。
片重量212mg。直徑8mm，彎曲半徑12mm。
生產(chǎn)本發(fā)明的化合物，乳糖和淀粉的混合物在水中和5％濃度的PVP溶液(m/m)造粒。干燥之后顆粒與硬脂酸鎂混合5分鐘。該混合物使用常規(guī)壓片機(jī)(對(duì)于片的形式參見(jiàn)以上)壓片。15kN的壓力用作壓片的指導(dǎo)值。
可以口服的懸浮液組合物1000mg本發(fā)明的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg Rhodigel(來(lái)自FMC的黃原膠，賓夕法尼亞，美國(guó))和99g水。
10ml口服懸浮液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)Rhodigel懸浮于乙醇中，和向懸浮液中添加本發(fā)明的化合物。隨著攪拌添加水?；旌衔飻嚢璐蠹s6h直到Rhodigel溶脹完成。
可以口服的溶液組合物
500mg本發(fā)明的化合物，2.5g聚山梨醇酯和97g聚乙二醇400。20g口服溶液對(duì)應(yīng)于具有100mg本發(fā)明的化合物的單劑量。
生產(chǎn)隨著攪拌，本發(fā)明的化合物懸浮于聚乙二醇和聚山梨醇酯的混合物中，繼續(xù)攪拌直到本發(fā)明的化合物完全溶解。
體內(nèi)(i.v.)溶液以低于飽和溶解性的濃度，本發(fā)明的化合物溶解于生理可接受溶劑(例如等滲鹽水，葡萄糖溶液5％和/或PEG 400溶液30％)。溶液經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾并裝入無(wú)菌的和無(wú)熱原的注射容器中。
權(quán)利要求
1.具有下式(I)的化合物 其中R1代表環(huán)己基或環(huán)戊基，R2和R3各自代表甲基或一起形成環(huán)丁烷，R4代表環(huán)戊基或異丙基，或其鹽，溶劑化物或鹽的溶劑化物。
2.具有下式(Ia)的化合物 或其鹽，溶劑化物或鹽的溶劑化物。
3.具有下式(Ib)的化合物 或其鹽，溶劑化物或鹽的溶劑化物。
4.具有下式(Ic)的化合物 或其鹽，溶劑化物或鹽的溶劑化物。
5.具有下式(Id)的化合物 或其鹽，溶劑化物或鹽的溶劑化物。
6.具有下式(Id)的化合物 或其鹽，溶劑化物或鹽的溶劑化物。
7.如權(quán)利要求1-6任何之一項(xiàng)中定義的用于疾病的治療和/或預(yù)防的具有式(I)的化合物。
8.如權(quán)利要求1-6任何之一項(xiàng)中定義的具有式(I)的化合物用于制備用于初級(jí)或中級(jí)防止冠心病疾病的藥物的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1-6任何之一項(xiàng)中定義的具有式(I)的化合物用于制備用于治療和/或防止低脂蛋白血癥，異常脂肪血癥，高甘油三酯血癥，高脂血癥，高膽固醇血癥，動(dòng)脈硬化，再狹窄，肥胖，糖尿病，中風(fēng)和阿爾茨海默病的藥物的應(yīng)用。
10.藥物，其包含權(quán)利要求1-6任何之一項(xiàng)中定義的具有式(I)的化合物和惰性無(wú)毒藥理學(xué)合適的助劑。
11.藥物，其包含權(quán)利要求1-6任何之一項(xiàng)中定義的具有式(I)的化合物和一種或多種進(jìn)一步的選自以下的活性化合物抗糖尿病藥，血小板聚集抑制劑，抗凝劑，鈣拮抗劑，血管緊張素A II拮抗劑，ACE抑制劑，β阻滯劑，磷酸二酯酶抑制劑，可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的刺激劑，cGMP增強(qiáng)劑，利尿藥，甲狀腺受體激動(dòng)劑，HMG-CoA還原酶抑制劑，角鯊烯合成抑制劑，角鯊烯環(huán)氧酶抑制劑，氧化角鯊烯環(huán)化酶抑制劑，ACAT抑制劑，MTP抑制劑，PPAR激動(dòng)劑，F(xiàn)ibrate，脂酶抑制劑，膽固醇吸收抑制劑，膽酸再吸收抑制劑，聚合膽酸吸收劑和脂蛋白拮抗劑。
12.權(quán)利要求10或11的藥物，其用于初級(jí)或中級(jí)預(yù)防冠心病疾病。
13.權(quán)利要求10或11的藥物，其用于治療和/或防止低脂蛋白血癥，異常脂肪血癥，高甘油三酯血癥，高脂血癥，高膽固醇血癥，動(dòng)脈硬化，再狹窄，肥胖，肥胖癥，糖尿病，中風(fēng)和阿爾茨海默病的藥物。
14.通過(guò)服用有效量的權(quán)利要求1-6任何之一項(xiàng)中定義的具有式(I)的化合物或權(quán)利要求10-13任何之一項(xiàng)中定義的藥物初級(jí)或中級(jí)防止人和動(dòng)物冠心病疾病的方法。
15.通過(guò)服用有效量的權(quán)利要求1-6任何之一項(xiàng)中定義的具有式(I)的化合物或權(quán)利要求10-13任何之一項(xiàng)中定義的藥物治療和/或防止人和動(dòng)物的低脂蛋白血癥，異常脂肪血癥，高甘油三酯血癥，高脂血癥，高膽固醇血癥，動(dòng)脈硬化，再狹窄，肥胖，糖尿病，中風(fēng)和阿爾茨海默病的方法。
16.制備如權(quán)利要求1中定義的具有式(I)的化合物的方法，特征在于具有式(II)的化合物，其中R1，R2，R3和R4各自如以上所定義，首先通過(guò)不對(duì)稱(chēng)還原轉(zhuǎn)化成具有式(III)的化合物，其之后[A]通過(guò)引入羥基保護(hù)基團(tuán)轉(zhuǎn)化成具有式(IV)的化合物，其中PG代表羥基保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選具有式-SiR1R2R3的基團(tuán)，其中R1，R2和R3是相同的或不同的和代表(C1-C4)-烷基，和之后通過(guò)非對(duì)映選擇性還原轉(zhuǎn)化成具有式(V)的化合物，其中PG如以上所定義，或[B]首先通過(guò)非對(duì)映選擇性還原產(chǎn)生具有式(IV)的化合物，其之后通過(guò)區(qū)域選擇性的引入羥基保護(hù)基團(tuán)PG轉(zhuǎn)化成具有式(V)的化合物，具有式(V)化合物之后使用氟化劑反應(yīng)產(chǎn)生具有式(VII)的化合物，其中PG如以上所定義，和之后通過(guò)常規(guī)方法去掉羥基保護(hù)基團(tuán)PG產(chǎn)生具有式(I)的化合物和任選具有式(I)的化合物用合適的(i)溶劑和/或(ii)堿或酸轉(zhuǎn)化成它的溶劑化物，鹽和/或鹽的溶劑化物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的具有通式(I)四氫喹啉的衍生物，其中R
文檔編號(hào)A61K31/47GK101080393SQ200580043488
公開(kāi)日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2005年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月18日
發(fā)明者H·比肖夫, H·吉倫-哈爾特維格, V·李, C·施梅克, M·圖特沃爾, M·武特克, A·瓦卡洛波洛斯, O·韋伯 申請(qǐng)人:拜耳醫(yī)藥保健股份公司