專利名稱：：聚合物-vonWillebrand因子偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到一種包含源于血漿的和/或重組的vonWillebrand因子的蛋白質(zhì)構(gòu)建體(VWF)或其生物活性衍生物，所述VWF或所述其生物活性衍生物結(jié)合于一種或多種生理學(xué)可接受的聚合物分子，其中蛋白質(zhì)構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期在哺乳動物尤其是人的血液中得以延長。進一步地，本發(fā)明涉及一種所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體與至少一種因子FVIII(FVIII)蛋白或其生物活性衍生物之間的復(fù)合體，其中所述FVIII蛋白或所述其生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期也在哺乳動物血液中得以延長。另外，本發(fā)明提供了含有所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體或所述復(fù)合體的藥物組合物、以及使用所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體或所述復(fù)合體來用于延長哺乳動物血液中VWF或FVm的體內(nèi)半衰期的方法，其中哺乳動物帶有與FVIII和VWF的至少一種功能性缺乏或者不足有關(guān)的出血病癥。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法。本發(fā)明的一個方面涉及一種含有源于血漿的和/或重組的VWF或者其生物活性衍生物的蛋白質(zhì)構(gòu)建體(下述也稱為"聚合物-VWF偶聯(lián)物")，所述VWF或所述其生物活性衍生物結(jié)合于一種或多種類型的生理學(xué)可接受的聚合物分子，其中所述VWF或者所述其生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期在哺乳動物血液中得以延長。本發(fā)明的另一個目的在于提供聚合物-vwf偶聯(lián)物，其遵循兩個基本的藥理學(xué)機制，并且呈現(xiàn)出具有介于所述兩種形態(tài)中間的特征的所述聚合物-vwf偶聯(lián)物的形式。一種形式穩(wěn)定地將偶聯(lián)的聚合物加載于vwf，并且將作為完整的分子在應(yīng)用于哺乳動物后隨著時間的過去被排除。另一種形式通過聚合物偶聯(lián)vwf的可逆性得以表征。在給藥于哺乳動物后，結(jié)合于vwf的聚合物分子將逐漸從vwf上釋放，并且未偶聯(lián)的vwf將作為藥理學(xué)功能試劑變得可用。該釋放特性將取決于偶聯(lián)化學(xué)，并且取決于組合物和結(jié)合于VWF的聚合物分子結(jié)構(gòu)。聚合物-VWF偶聯(lián)物既可單獨用于VWD治療，也可以與FVIII組合以穩(wěn)定FVIII而用于提高其半衰期或者提高二者的半衰期。當(dāng)單獨用于VWD治療時，偶聯(lián)物可以采用兩種形式中的一種。第一種形式是聚合物可釋放地結(jié)合于VWF。在這種方式下，當(dāng)聚合物釋放或者降解時，VWF變得有活性。第二種形式是結(jié)合于VWF的聚合物濃度不至于抑制VWF活性。當(dāng)制備出偶聯(lián)物以結(jié)合并穩(wěn)定fviii時，提供的結(jié)合于vwf的聚合物程度或水平不至于妨礙VWF的結(jié)合區(qū)域。從實施例中將會看到，在不抑制VWF和FVIII結(jié)合能力的情況下，可以實現(xiàn)令人滿意的聚合物偶聯(lián)于VWF。還可以控制或者改進聚合物偶聯(lián)程度以保持VWF活性，同時也保持VWF結(jié)合FVIII的能力。這種聚合物-VWF偶聯(lián)物形式提供了治療活性的VWF，同時也能穩(wěn)定FVin以提高半衰期。用于本發(fā)明的VWF和FVIII分子包括全長蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)前體、蛋白質(zhì)亞基或片段，和其功能性衍生物。至于vwf和Fvin或fviii，是指包括這種蛋白質(zhì)的全部潛在形式。在此使用的"生物活性衍生物"，包括任何具有與所述分子基本上相同功能的和/或生物特性(比如結(jié)合特性)的分子衍生物、和/或相同結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(比如肽骨架或基本聚合單元)的分子衍生物。用于本發(fā)明的VWF包括所有潛在形式，包括單體形式和多聚形式。尤其有用的一種VWF形式是至少兩個VWF的同型多聚體。VWF蛋白質(zhì)既可以是生物活性衍生物，而當(dāng)單獨作為FVIII穩(wěn)定劑使用時，VWF也可以是無生物活性的形式。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明也包括將各種形式的VWF組合使用。例如，用于本發(fā)明的組合物可以包括不同的多聚體、不同的衍生物、以及兼具生物活性衍生物和無生物活性衍生物。在最初的止血中，VWF在血小板和細(xì)胞外基質(zhì)特定組分(比如膠原)之間用作架橋。在該過程中，VWF的生物活性可以通過兩種不同的體外分析方法來測量(Turecek等，Semin.Thromb.Hemost.28:149-160，2002)。瑞斯托菌素輔助因子分析法是基于在VWF存在時新鮮的或者福爾馬林固定的血小板凝集而進行的，該血小板由抗生素瑞斯托菌素(ristocetin)誘導(dǎo)產(chǎn)生。血小板的凝集程度取決于VWF濃度，并且可以通過濁度測定法測量，例如通過使用集合度計(aggregometer)而進行(Weiss等，J.Clin.Invest.52:2708-2716，1973;Macfarlane等，Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308，1975)。第二種方法是基于ELISA技術(shù)的膠原結(jié)合分析(Brown和Bosak，Thromb.Res.43:303-311，1986;Favaloro，Thromb.Haemost.83:127-135，2000)。微量滴定板用I型或者III型膠原涂布。然而VWF結(jié)合于膠原表面，并且接著用酶標(biāo)記的多克隆抗體檢測。最后一步是底物反應(yīng)，其能夠用ELISA閱讀機進行光度測定監(jiān)控。在此使用的"源于血漿的VWF(pdVWF)"，包括血液中發(fā)現(xiàn)的所有形式蛋白質(zhì)，包括從哺乳動物中得到的成熟VWF，其具有體內(nèi)穩(wěn)定(例如結(jié)合)至少一個FVIII分子的特性。然而，本發(fā)明不限于成熟VWF。其中之一，所述pVWF的生物活性衍生物是含有前肽(pro-peptide)的前VWF。用于本發(fā)明的其它VWF形式包括蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其含有包括由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成的前體VWF分子(在先前VWF)的未成熟VWF，和/或前體分子的VWF前肽(前VWF)以及/或在前體分子的信號肽和前肽裂解時得到的成熟pdVWF。pdVWF的生物活性衍生物例子進一步包括前體藥物，其加工或轉(zhuǎn)變?yōu)樯飳W(xué)活性形式，或者生物學(xué)活性的諸如截短形式、缺失形式、替換形式、除前述形式之外的附加形式、成熟形式片段、嵌合形式、以及相比于天然形式的翻譯后修飾形式。用于本發(fā)明的pVWF也包括那些無生物活性的形式。這可以通過修飾成熟VWF或其它血液中發(fā)現(xiàn)的天然存在的形式來完成。用于本發(fā)明VWF的來源是哺乳動物，包括豬和人類模型在內(nèi)。在此使用的"重組VWF(rVWF)"，包括經(jīng)由DNA重組技術(shù)得到的VWF。一種有用的rVWF形式至少具有體內(nèi)穩(wěn)定(例如結(jié)合)至少一個FVIII分子的特性，并任選地具有藥理學(xué)可接受的糖基化模式。具體的例子包括無A2結(jié)構(gòu)域因而抗蛋白水解的VWF(Lankhof等，Thromb.Haemost.77:1008-1013,1997)、包含糖蛋白Ib結(jié)合結(jié)構(gòu)域和膠原及肝素結(jié)合位點的從纈氨酸449到天冬酰胺730的VWF片段(Pietu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.164:1339-1347，1989)。根據(jù)本
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已知的方法可以在缺乏VWF的哺乳動物中進行穩(wěn)定至少一種FVm分子的測定。例如，在下面實施例8描述到，用VWF經(jīng)由尾部靜脈進行靜脈治療缺乏VWF的小鼠，并且血漿中FVIII活性水平隨著時間而變。FVIII活性水平例如可以通過歐洲藥典公布的顯色分析法(Ph.Eur.，第三版，1997:2.7.4)測量。含有FVIII(FVIII:C)的樣品與凝血酶、活化凝血因子IX(FIXa)、磷脂和凝血因子X(FX)在含鈣緩沖液中混合。FVIII被凝血酶活化，接著形成與磷脂、FIXa和鈣離子的復(fù)合體。該復(fù)合體將FX活化成FXa，隨后裂解顯色的底物(例如(AcOH'CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA)。于405nm處測量釋放的對硝基苯胺(pNA)的時間過程。反應(yīng)的斜率與樣品中FVIII濃度成正比。本發(fā)明的rVWF可以通過本
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內(nèi)任何已知的方法來生產(chǎn)。Ginsburg等在公開日為1986年10月23日的WO86/06096和申請日為1990年7月23日的美國專利申請No.07/559,509中公開了一種具體的實施例，其包括了生產(chǎn)重組VWF的方法，現(xiàn)將其引入本發(fā)明作為參考。這可以包括本
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內(nèi)任何已知的下述方法(i)通過基因工程例如經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄和/或DNA擴增來生產(chǎn)重組DNA，(ii)通過轉(zhuǎn)染例如經(jīng)電穿孔法或者微量注射法，將重組DNA導(dǎo)入原核或者真核細(xì)胞，(iii)例如以連續(xù)的或分批的方式培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，(iv)例如組成型或在誘導(dǎo)下表達VWF，和(v)例如從培養(yǎng)基或通過收獲轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離所述VWF，以便(vi)例如經(jīng)由陰離子交換色譜法或者親和色譜法得到純化rVWF。通過在合適的原核或真核寄主系統(tǒng)表達，可以生產(chǎn)出rVWF，其特征在于生產(chǎn)藥理學(xué)可接受的VWF分子。真核細(xì)胞的例子是哺乳動物細(xì)胞，比如CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep和HepG2。不具體限制用于生產(chǎn)或分離根據(jù)本發(fā)明的VWF的試劑或者條件，并且可以使用本
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內(nèi)已知的任何系統(tǒng)或商品。在一種本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，通過如使用本
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內(nèi)在目前工藝水平中描述的方法制得rVWF。多種的載體可以用于rVWF的制備，并且可以選自真核和原核的表達載體。用于原核表達的載體例子包括質(zhì)粒，比如pRSET、pET，pBAD等，其中用于原核表達載體的啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。真核表達的載體例子包括(i)用于中酵母表達的有，載體比如pAO、pPIC、pYES、pMET，使用的啟動子比如是A0X1、GAP、GAL1、AUG1等；(ii)用于昆蟲細(xì)胞中表達的有，載體比如pMT、pAc5、pm、pMIB、pBAC等，使用的啟動子比如是PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等，和(iii)用于哺乳動物細(xì)胞中表達的有，載體比如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，以及由病毒系統(tǒng)比如牛痘病毒、腺病毒相關(guān)病毒、皰疹病毒、反向病毒等衍生的載體，使用的啟動子比如是CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和p-肌動蛋白((3-actin)。用于本發(fā)明的FVIII包括有生物學(xué)活性的形式，包括全長Fvm和任何具有在凝血FIX活化中作為輔助因子的衍生能力以及與VWF形成復(fù)合體能力的形式。根據(jù)本發(fā)明使用的FVm可以是源于血漿的FVIII(pdFVIII)或重組的FVIII(rFVIII)或者其生物活性衍生物?？梢酝ㄟ^本
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內(nèi)任何已知的方法來生產(chǎn)pdFVIII和rFVIII?？梢酝ㄟ^任何合適的方法純化pdFVin。美國專利No.5,470,954描述了一種有用的方法，將其引入本文作為參考?？梢酝ㄟ^任何合適的方法制備出rFVIII蛋白。這種rFVIII的例子包括巴克斯特保健公司(BaxterHealthcareCorporation)制造并銷售的RECOMBINATE禾口ADVATE;惠氏公司(WyethCorporation)制造并銷售的REFACTO—種缺失B結(jié)構(gòu)域的形式；以及拜耳公司制造并銷售的KOGENATE。將美國專利Nos.4,757,006、4,965,199和5,618,788中描述的所有rFVIII方法和實施例引入本文作為參考。在此使用的"生理學(xué)可接受的聚合物"，包括可溶于水溶液或者懸浮液的聚合物，并且在以藥學(xué)有效量給藥聚合物-VWF偶聯(lián)物時，對哺乳動物沒有負(fù)面影響(比如副作用)。根據(jù)本發(fā)明使用的生理學(xué)可接受的聚合物沒有具體限制。作為所述聚合物的典型特征是優(yōu)選具有從2到大約300個重復(fù)單元。這種聚合物的例子包括但不限于聚(烷撐二醇)比如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(乙氧基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯垸酮)，聚(羥垸基甲基丙烯酰胺)，聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)，多糖，聚(a-羥基酸)，聚乙烯醇，聚磷腈，聚惡唑啉，聚(N-丙烯酰嗎啉)，以及前述物質(zhì)的任意組合。生理學(xué)可接受的聚合物不限于特別的結(jié)構(gòu)，并且可以是線性的(例如烷氧基PEG或者雙官能PEG)、分枝的或者多臂的(例如分岔PEG或附著于多元醇核的PEG)、多枝的，或者具有可降解鍵的聚合物。此外，聚合物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以設(shè)置成許多不同模式，并且可以選自均聚物、交替共聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物，交替三聚體、無規(guī)三聚體和嵌段三聚體。這些聚合物也包括聚(環(huán)氧烷)聚合物、聚(馬來酸)、聚(外消旋丙氨酸)，比如羧甲基纖維素、葡聚糖、透明質(zhì)酸和幾丁質(zhì)，以及聚(甲基)丙烯酸酯。在本發(fā)明實施方式中，生理學(xué)可接受的聚合物是PEG和其衍生物。PEG側(cè)鏈可以是線性的、分枝的、分岔的，或者可以由多個臂組成的。根據(jù)本發(fā)明使用的PEG沒有具體限制。尤其有用的PEG的分子量在3,000-20,000的范圍。有數(shù)種在公知領(lǐng)域內(nèi)有用PEG分子，即從未申請專利的或者現(xiàn)在無專利保護的。其它有用的PEG分子例如是WO03/040211;US6,566,506;US6，864，350和US6，455，639公開的PEG。在本發(fā)明另一種實施方式中，生理學(xué)可接受的聚合物是聚唾液酸(PSA)和其衍生物?？梢酝ㄟ^US4,356,170描述的方法將PSA結(jié)合于VWF，在此引入本文以供參考。在本發(fā)明的一種具體實施方式中，多糖化合物可以是天然的多糖、天然多糖的衍生物或者天然的多糖衍生物。在聚合體鏈中，化合物的多糖部分具有5個以上、具體說至少10個、并且在另一種實施方式中為至少20~50個唾液酸殘基。切實可用的多糖化合物可以具有總共高達500個糖類殘基，但通常在聚合體鏈中具有少于300個殘基。通常情況下，在化合物中全部糖類殘基是唾液酸殘基。至少多糖化合物的聚唾液酸部分、以及在一種實施方式中的整個化合物是高度親水的。主要通過唾液酸單元的附屬羧基以及羥基使化合物具有親水性。糖單元可以含有其它官能團，比如胺、羥基或者硫酸酯基團，或者其組合。這些基團可以存在于天然糖類化合物上，或者導(dǎo)入衍生的多糖化合物。具體用于本發(fā)明的多糖化合物是細(xì)菌產(chǎn)生的多糖化合物。這些天然多糖的一些已知為糖脂。如果多糖化合物基本上無末端半乳糖單元(該單元易于被肝細(xì)胞和庫柏法細(xì)胞(Kupffercells)的半乳糖受體識別)，則尤其有利。VWF多聚體可以通過為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的任何各種技術(shù)以共價鍵聯(lián)結(jié)于多糖化合物。其例子包括通過在VWF或多糖中的任何一種上的羧基與另一種上的胺基之間的肽鍵連接，或者通過在一種物質(zhì)的羧基與另一種物質(zhì)的羥基之間的酯鍵連接。作為選擇之一，在一種物質(zhì)的氨基和另一種物質(zhì)的醛基之間可以形成席夫堿。其它的連接機制為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。多種實施例與美國專利No.5，846，951第7欄第15行至第8欄第5行相同，將其全部并入本文以引為參考。在此使用VWF結(jié)合于一種或多種生理學(xué)可接受的聚合物分子的方式包括任何合適的化學(xué)結(jié)合，比如共價結(jié)合或者非共價結(jié)合(比如離子性、疏水性、親合性、生物親和性交互作用)。通過使用雙官能團試劑并經(jīng)由間隔臂，還可以將聚合物偶聯(lián)于蛋白質(zhì)。另外，通過親和性交互作用可以將聚合物分子偶聯(lián)于VWF。例如，VWF可以生物素化(bebiotinylated)，并且親和素(avidin)或鏈親和素(strepavidin)共軛聚合物可以結(jié)合于VWF。另夕卜，多克隆或單克隆抗VWF抗體及其片段可以結(jié)合于聚合物，然后該復(fù)合體可以結(jié)合于VWF。也可以通過酶法將聚合物結(jié)合于VWF，例如US6,379,933所述的用多糖基轉(zhuǎn)移酶(polyglycosyltransferase)或者US20040132640Al所述的糖基PEG化(glycopegylation)轉(zhuǎn)化糖類，將其全部引入本發(fā)明作為參考。另一個途徑是在它們的生物機能基礎(chǔ)上，將聚合物結(jié)合于VWF，就像將PEG化膠原或膠原片段結(jié)合于VWF的A1和A3結(jié)構(gòu)域。為此目的，可以使用顯示出與VWF較強相互作用的I和II型膠原(例如來自人胎盤的膠原)。聚合物的結(jié)合可以是穩(wěn)定的，或者在體內(nèi)應(yīng)用蛋白質(zhì)構(gòu)建體后是可逆的。在此使用的"PEG化VWF"，包括結(jié)合于一個或多個PEG的VWF，并且在此使用的"PEG化(PEGylation)"包括將一個或多個PEG結(jié)合于VWF的過程。美國專利Nos.5,122,614和5,539,063公開了合適的PEG化方法，將所有PEG化方法并入本文以引為參考。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，生理學(xué)可接受的聚合物是PEG或PEG衍生物，其通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)己知的任何策略和方法以共價鍵連接于VWF。最通用的改性策略是，經(jīng)由賴氨酸殘基的氨基結(jié)合至少一種聚合物分子、經(jīng)由碳水化合物側(cè)鏈結(jié)合至少一種聚合物分子，經(jīng)由硫氫基結(jié)合至少一種聚合物分子、經(jīng)由天冬氨酸和谷氨酸的羧基結(jié)合至少一種聚合物分子、以及羥基結(jié)合至少一種聚合物分子和N-末端結(jié)合至少一種聚合物分子。在本發(fā)明的一種實施方式中，可以通過將所述聚合物分子共價偶聯(lián)于VWF的賴氨酸側(cè)鏈的氨基上而進行至少一種聚合物分子與VWF的結(jié)合。人類VWF含有108個游離的側(cè)鏈上有NH2基團的賴氨酸殘基，其易于結(jié)合于至少一種聚合物分子。VWF的賴氨酸殘基的例子如圖1A所示，其可以根據(jù)本發(fā)明以共價鍵連接聚合物分子?？梢砸怨矁r鍵連接VWF的賴氨酸殘基的合適PEG衍生物是，例如，帶有活性N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)的聚乙二醇，比如琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、琥珀酰亞胺基戊二酸酯或琥珀酰亞胺基丙酸酯，其與賴氨酸殘基在溫和條件下通過形成酰胺鍵而起反應(yīng)。其它活化PEG的例子是具有活性碳酸酯的PEG，所述活性碳酸酯如琥珀酰亞胺基碳酸酯(SC-PEG)和苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)(參見Roberts等，AdvancedDrugDeliveryReviews,54:459-476，2002，第463頁)。SC-PEG和BTC-PEG優(yōu)先與賴氨酸殘基反應(yīng)以形成氨基甲酸乙酯鍵，但已知也與組氨酸和酪氨酸殘基起反應(yīng)?？蛇x擇的方法是至少一種聚合物分子與形成氨基甲酸乙酯鍵的PEG碳酸酯結(jié)合，或者至少一種聚合物分子與形成仲胺的醛或酮結(jié)合，例如，在與氰基硼氫鈉發(fā)生還原之后進行。產(chǎn)生氨基甲酸乙酯連接的蛋白質(zhì)的其它PEG?；噭┌▽ο趸交妓狨?、三氯苯基碳酸酯和羰基咪唑。通過氯甲酸酯或者羰基咪唑與單甲氧基PEG(mPEG)上末端羥基基團發(fā)生反應(yīng)，制備出這些試劑(參見Roberts等，同上，第464頁)。另一個實施例涉及到所謂的"第二代"PEG化化學(xué)，其中mPEG-丙醛在酸性條件下可選擇用于N-末端a-胺(參見Roberts等，同上，第464頁)。可釋放的PEG試劑比如PEG馬來酸酐、mPEG苯基醚琥珀酰亞胺基碳酸酯和mPEG苯甲酰胺琥珀酰亞胺基碳酸酯，可以用于產(chǎn)生偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物在生理條件下釋放出"無標(biāo)記的"治療性蛋白，如同以上Roberts等在第469頁中的描述。在本發(fā)明的另一種實施方式中，VWF也可以經(jīng)由它的碳水化合物殘基與至少一種聚合物分子結(jié)合。例如，這可以通過碳水化合物鏈的適度氧化而進行，比如與Nal04反應(yīng)，從而形成醛功能，接著偶聯(lián)于PEG，比如PEG-酰肼。該工序的優(yōu)點是基于如下事實VWF的Al和A3環(huán)包含膠原結(jié)合位點并且因此是VWF的生物活性的臨界區(qū)域，其不包含碳水化合物殘基，并且不可能通過該工序進行修飾，如圖1B所示。圖中顯示了天門冬酰胺N-連接的GlcNAc和蘇氨酸或絲氨酸O-連接的GalNAc殘基的實施例，它們可以氧化并且接著被至少一種聚合物分子結(jié)合。由于VWF的碳水化合物在特定結(jié)構(gòu)域形成集簇的事實，通過使用該修飾工序，可以將VWF設(shè)置為直接結(jié)合至少一種聚合物分子。當(dāng)VWF是所要求的治療性活性形式時，聚合物與碳水化合物殘基的結(jié)合尤其有利。這可以通過巳知的方法，經(jīng)聚合物與N-連接的殘基或O-連接的殘基進行選擇性反應(yīng)而增強。例如，葡萄糖氧化酶可用于氧化VWF上的碳水化合物殘基，以產(chǎn)生多個反應(yīng)性醛基，該醛基可以與PEG酰肼起反應(yīng)而產(chǎn)生腙鍵，或者與PEG胺起反應(yīng)而產(chǎn)生可逆的席夫堿(參見Roberts等，同上，第467頁)。在特定條件下，通過高碘酸鹽氧化作用轉(zhuǎn)化為乙醛酰衍生物，使VWF的N-末端絲氨酸或蘇氨酸可以用于位點特異性結(jié)合(參見Roberts等，同上，第467頁)。本發(fā)明的另一種實施方式是至少一種聚合物分子經(jīng)硫氫基結(jié)合于VWF。人類VWF具有177個游離SH基團，其可以通過例如PEG馬來酰亞胺進行修飾，形成穩(wěn)定的硫化物。使用例如PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺、或者PEG-正吡啶基二硫化物也可以進行半胱氨酸殘基的PEG化(參見Roberts等，同上，第466頁)。根據(jù)其多個功能，VWF分子具有幾個針對特定受體或配體的結(jié)合位點(Girma等，Thromb.Haemost.74:156-60，1995)。一個重要的結(jié)合位點是FVIII結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其位于成熟亞基的N-末端(氨基酸1-272)。該表位可以通過與游離FVIII—起孵育并形成FVIII/VWF復(fù)合體而得到保護。隨后復(fù)合體進行化學(xué)修飾(例如PEG化或聚唾液酸化)，并且聚合物偶聯(lián)的具有游離FVIII結(jié)合位點的VWF與FVIII分離(例如用0.3MCaCl2或者2MNaCl通過大小排阻色譜法而分離)。類似地，VWF可以結(jié)合于帶有固定化FVIII的親和樹脂。隨后VWF與聚合物(例如聚乙二醇或聚唾液酸衍生物)進行化學(xué)偶聯(lián)，并且以間歇方式或者通過使用色譜柱從該基體上洗脫(例如在高濃度鹽比如0.3MCaCl2或2MNaCl的條件下進行)。VWF的FVin結(jié)合表位與肝素結(jié)合位點幾乎相同。因此，在化學(xué)修飾工序期間，可以通過VWF與肝素的結(jié)合或與帶有固定化肝素的親和樹脂的結(jié)合而使FVIII結(jié)合位點被阻斷并受保護。在此使用的術(shù)語"因子VIII結(jié)合位點保護劑"，是指任何結(jié)合于VWF分子上FVIII結(jié)合結(jié)構(gòu)域或表位的試劑。因子VIII結(jié)合位點保護劑可以選自凝血因子FVIII、FVIII的衍生物、肝素和肝素衍生物。本發(fā)明的目的在于相比于未連接在至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子的VWF的體內(nèi)半衰期，提高了VWF或其生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期。在本發(fā)明的一種實施方式中，VWF的體內(nèi)半衰期延長至至少兩倍，而另一種實施方式中，體內(nèi)半衰期提高到至少三倍。在再一種實施方式中，通過結(jié)合至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子而將體內(nèi)半衰期增加到5倍。通過在FVIII缺乏的小鼠中測量VWF藥物動力學(xué)，可以評價VWF半衰期的提高或延長，如同下述實施例7的描述。簡言之，將FVIII缺乏的小鼠用預(yù)混有FVIII的VWF經(jīng)由尾部靜脈進行大劑量注射(bolusinjection)處理，并且在不同時點測量血漿樣品VWF抗原水平。經(jīng)由ELISA分析，可以測量VWF抗原和FVIII抗原。本發(fā)明的另一個目的涉及一種復(fù)合體，其由至少一種聚合物-VWF偶聯(lián)物與至少一種FVIII分子形成，其中FVIII的體內(nèi)半衰期由聚合物-VWF偶聯(lián)物而在哺乳動物血液中得以延長。相比于與未連接在至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子的VWF形成復(fù)合體的FVIII的體內(nèi)半衰期，聚合物-VWF偶聯(lián)物與FVIII的結(jié)合延長了或者增加了所述FVIII的體內(nèi)半衰期。在本發(fā)明的一種實施方式中，F(xiàn)VIII的體內(nèi)半衰期延長至至少1.5倍，而在另一種實施方式中延長至至少2倍，在再一種實施方式中延長至至少3倍，并且在還有一種實施方式中延長至至少5倍。本發(fā)明的聚合物-VWF偶聯(lián)物可以用于治療甲型血友病和/或VWD，或者這兩種疾病的亞型。就VWD而言，聚合物-VWF偶聯(lián)物的用途類似于當(dāng)前正規(guī)或非正規(guī)治療的使用含VWF濃縮物的代替療法，也分別稱作預(yù)防性方案或者隨需治療。聚合物-VWF偶聯(lián)物也可以用作甲型血友病預(yù)防的輔助療法。在該治療環(huán)境下，聚合物-VWF偶聯(lián)物將按時給藥，并且，與當(dāng)前用于甲型血友病正規(guī)治療所用相同的FVIII濃縮物的單獨給藥將照常進行，無論該FVIII是源于血漿的還是重組的FVIII，然而，由于聚合物-VWF偶聯(lián)物的延長半衰期能力，其治療時限會延長。在本發(fā)明的一種實施方式中，預(yù)防甲型血友病和VWD，以及治療甲型血友病和VWD的急性出血，聚合物-VWF偶聯(lián)物將與FVm—起給藥，或者呈與FVIII的復(fù)合體形式給藥于甲型血友病或VWD病人。這種情況下，抑制內(nèi)部或外部出血需要通過提高其它的低血漿VWF和/或FVIII水平到治療有效的水平而立即實現(xiàn)。聚合物-VWF偶聯(lián)物還可以用于免疫耐受性治療以根除抑制性抗體，該抗體已發(fā)展為對抗FVIII,臨床上亦稱抑制劑血友病(inhibitorhemophilia)，或者對抗VWF。在這種環(huán)境下，將超生理學(xué)水平的和超藥理學(xué)水平的FVIII給藥于己產(chǎn)生抗FVIII或VWF的抑制劑的病人。對于接受了所述制劑的病人循環(huán)系統(tǒng)中，聚合物-VWF偶聯(lián)物通常比非偶聯(lián)的VWF具有更高康復(fù)性并且更長持久性，通過聚合物-VWF偶聯(lián)物的應(yīng)用使這種治療形式得到促進。按照目前治療水平并且根據(jù)國際準(zhǔn)則和規(guī)則，注入的FVIII的藥物動力學(xué)得到認(rèn)可，并且被接受為有效代用品的有效性標(biāo)志。這是基于如下有充分根據(jù)的設(shè)想注入的FVIII產(chǎn)品已經(jīng)通過對功能活性的標(biāo)準(zhǔn)化測試得到表征，其在血流中被檢測到，并且正如所料起著X復(fù)合酶(tenase)復(fù)合體的輔助因子的作用，該X復(fù)合酶復(fù)合體通過結(jié)合于FIXa和磷脂而成為凝血因子X的活化復(fù)合體。(Eloedi等，Thromb.Res.21:695-700，1981)。因此動物模型中任何藥物動力學(xué)分析都將預(yù)示對于用FVIII產(chǎn)品治療的病人的預(yù)期功效。為測定FIX輔助因子活性，將FVIII或FVIIIa樣品(FVIII用凝血酶完全活化)添加到制得的FIXa、FX、磷脂和CaCl2混合物中。該反應(yīng)混合物在37°C下保溫，使得復(fù)合體形成并且接著產(chǎn)生FXa。以高達20分鐘的時間間隔抽取子樣品，并且添加至顯色底物，該底物被FXa選擇地分解。在孵育15分鐘后，通過加入乙酸終止反應(yīng)。在ELISA閱讀機上測量吸光度(A4()5)，該值與FXa濃度成正比，畫出其對混合反應(yīng)中孵育時間的曲線。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種延長哺乳動物血液中FVIII的體內(nèi)半衰期的方法，該哺乳動物帶有與FVIII和VWF的至少一種功能性缺乏或者不足有關(guān)的出血病癥，該方法包括下述步驟a)提供至少一種如上所限定的蛋白質(zhì)構(gòu)建體；b)提供至少一種如上所限定的FVIII;以及c)形成所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體與所述FVIII的復(fù)合體。上述方法的一種實施方式中，步驟(c)的復(fù)合體通過例如混合蛋白質(zhì)構(gòu)建體和所述FVIII在"體外"(即在哺乳動物的身體外)被形成，然后將如此形成的復(fù)合體以有效量給藥于帶有所述出血病癥的哺乳動物。在上述方法另一種實施方式中，在將蛋白質(zhì)構(gòu)建體以有效量給藥于所述哺乳動物時，步驟(c)的復(fù)合體在體內(nèi)(即在哺乳動物身體內(nèi))被形成，于帶有所述出血病癥的哺乳動物血液中所存在的蛋白質(zhì)構(gòu)建體與內(nèi)源性FVIII間。在上述方法另一種實施方式中，在將蛋白質(zhì)構(gòu)建體以有效量給藥于所述哺乳動物時，步驟(c)的復(fù)合體在"體內(nèi)"被形成于帶有所述出血病癥的哺乳動物血液中所存在的蛋白質(zhì)構(gòu)建體與外源性Fvm間。外源性Fvm可以以有效量與所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體同時給藥，或者順序給藥，即在給藥所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體前后進行給藥。在此使用的"內(nèi)源性Fvnr，包括來源于所述哺乳動物的Fvm。也包括轉(zhuǎn)化基因或者任何其它存在于所述哺乳動物的外來DNA轉(zhuǎn)錄的FVIII。這里使用的"外源性Fvm"，包括并非來源于所述哺乳動物的Fvm，其包括上述的pdFvm和rFvm，和形成如上限定的復(fù)合體后從哺乳動物身上分離、并再給藥于哺乳動物的pdFvm，以及給藥于哺乳動物的rFVin，所述哺乳動物DNA已經(jīng)被用于生產(chǎn)所述rFVIII。在此使用的"有效量"，包括適合于治療如上所述帶有出血病癥的哺乳動物的劑量；例如，對于人來說，優(yōu)選范圍為每針注劑51,000IU，更優(yōu)選每針注劑10250IU的范圍。對給藥方式不作具體限制，并且在一種實施方式中，蛋白質(zhì)構(gòu)建體或者本發(fā)明的復(fù)合體可以注射給藥，比如靜脈注射、肌肉注射、或者腹腔內(nèi)注射。本發(fā)明的目的也在于治療與所使用的FVIII和VWF的至少一種功能性缺乏或不足有關(guān)的出血病癥，包括其成因選自由如下原因所構(gòu)成的出血病癥FVIII和/或VWF的體內(nèi)半衰期縮短、FVIII和/或VWF的結(jié)合特性改變、FVIII和/或VWF的遺傳缺陷、以及FVIII和/或VWF的表達降低。在本發(fā)明的一種實施方式中，出血病癥選自甲型血友病、VWD、或者其它與VWF功能降低或VWF與其它分子交互作用降低有關(guān)的疾病。進一步地，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其含有有效量的如上所限定的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，或者有效量的如上所限定的復(fù)合體。該藥物組合物可以進一步包含藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑、鹽、緩沖液、或者賦形劑。該藥物組合物可以用于治療如上限定的出血病癥。本發(fā)明的藥物組合物可以是溶液或凍干制品。有許多已知的形成蛋白質(zhì)(特別是VWF和FVIII)的穩(wěn)定溶液的方法。例如，美國專利Nos.6,586,573;5,565,427;5,763,401;5,733,873;4，877，608;5,605,884禾B5,328,694?？梢詫@些溶液進行任何合適的凍干工藝處理，例如，US6,586,573描述的工藝，在此引入本文以供參考。本發(fā)明包括其它合適形式的聚合物-VWF-偶聯(lián)物，其可以呈單獨形式或呈與FVIII組合的形式。本文附圖為圖1A和1B顯示了VWF結(jié)構(gòu)示意圖/用于偶聯(lián)的耙位點實施例。圖1A中灰色點顯示了可以被至少一種聚合物分子結(jié)合的VWF的賴氨酸殘基，而圖1B顯示了可以被至少一種聚合物分子結(jié)合的VWF中碳水化合物殘基。圖2顯示了VWD小鼠體內(nèi)聚合物-VWF偶聯(lián)物相比于未偶聯(lián)VWF的藥物動力學(xué)。圖3顯示了血友病小鼠體內(nèi)聚合物-VWF偶聯(lián)物相比于未偶聯(lián)VWF的藥物動力學(xué)。圖4顯示了用rVWF或PEG-rVWF治療的VWD小鼠體內(nèi)FVIII藥物動力學(xué)。圖5顯示了血友病小鼠體內(nèi)在用藥與聚合物-VWF-偶聯(lián)物復(fù)合的rFVIII和與VWF復(fù)合的rFVin以后rFVIII的恢復(fù)情況。圖6顯示了血友病小鼠體內(nèi)在用藥與聚合物-VWF偶聯(lián)物復(fù)合的rFVIII和與VWF復(fù)合的rFVIII以后VWF的恢復(fù)情況。圖7顯示了FVIIIxVWF雙重剔除小鼠體內(nèi)的rFVIII和PEG-rVWF藥物動力學(xué)。圖8顯示了雜交小鼠體內(nèi)的rFVIII和PEG-rVWF藥物動力學(xué)。圖9顯示了小鼠血漿中VWF:Ag的提高(賴氨酸和碳水化合物偶聯(lián))。圖10顯示了生物分子相互作用研究結(jié)果(左圖)以及PEG偶聯(lián)的rVWF相比未偶聯(lián)rVWF與FVIII的結(jié)合能力對比情況(右圖)。圖11顯示了在聚合物偶聯(lián)后通過SDS-PAGE測量的VWF質(zhì)量提高。圖12顯示了在聚合物偶聯(lián)后通過瓊脂糖電泳測量的VWF質(zhì)量提高以分析VWF多聚體。圖13顯示了在用藥與聚合物-VWF-偶聯(lián)物復(fù)合的rFVIII(具有PEG化賴氨酸殘基的rVWF)以及與rVWF復(fù)合的rFVIII后，F(xiàn)VIII-K.O.小鼠體內(nèi)的rFVIII藥物動力學(xué)。圖14顯示了在用藥與聚合物-VWF偶聯(lián)物復(fù)合的rFVIII(具有PEG化賴氨酸殘基的rVWF)以及與rVWF復(fù)合的rFVni后，F(xiàn)VIII-K.O.小鼠體內(nèi)的rVWF藥物動力學(xué)。圖15顯示了組合使用ELISA和顯色分析(ECA)，來測定PEG偶聯(lián)的rVWF相比未偶聯(lián)的rVWF的FVIII結(jié)合能力。圖16顯示了釆用表面胞質(zhì)基因共振技術(shù)來測定PEG偶聯(lián)的rVWF的FVIII結(jié)合能力。圖17顯示了在實施例13中描述的在聚合物偶聯(lián)后通過SDS-PAGE測量的VWF質(zhì)量提高。圖18顯示了組合使用ELISA和顯色分析(ECA)，來測定弗林蛋白酶(ftirin)熟化的rVWF相比pdVWF和非治療性rVWF的FVIII結(jié)合能力。圖19顯示了使用表面胞質(zhì)基因共振技術(shù)，來測定弗林蛋白酶熟化的rVWF相比pdVWF和非治療性rVWF的FVIII結(jié)合能力情況。圖20顯示了在還原條件下rVWF-聚唾液酸偶聯(lián)物和rVWF的等電點聚焦模式。圖21顯示了缺乏VWF的小鼠體內(nèi)的rVWF-聚唾液酸偶聯(lián)物和rVWF藥物動力學(xué)。圖22顯示了缺乏VWF的小鼠體內(nèi)在用藥rVWF-聚唾液酸偶聯(lián)物或rVWF后的小鼠FVIII活性的時程。圖23顯示了FVIII缺乏的小鼠體內(nèi)的PEG-rVWF(分枝PEG20KSG)禾卩rVWF藥物動力學(xué)。圖24顯示了FVIII缺乏的小鼠體內(nèi)rFVIII與PEG-rVWF(分枝PEG20KSG)或rVWF共注射時的藥物動力學(xué)。圖25顯示了FVIII缺乏的小鼠體內(nèi)的rFVIII與不同量的PEG-rVWF(分枝PEG20KSG)共注射時的藥物動力學(xué)。圖26顯示了FVIII缺乏的小鼠體內(nèi)PEG-rVWF#A(5mgPEG/mg蛋白質(zhì))、PEG-rVWF紐(20mgPEG/mg蛋白質(zhì))和天然rVWF的藥物動力學(xué)。圖27顯示了FVIII缺乏的小鼠體內(nèi)rFVin與PEG-rVWF#A(5mgPEG/mg蛋白質(zhì))、PEG-rVWF#B(20mgPEG/mg蛋白質(zhì))或天然rVWF共注射時的藥物動力學(xué)。具體實施例方式以下用實施例進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明作任何限制。實施例實施例1:通過碳水化合物殘基的修飾來制備聚合物-VWF偶聯(lián)物為經(jīng)由碳水化合物殘基制備聚合物-VWF偶聯(lián)物(圖1B)，在20mM、pH6.0醋酸鈉緩沖液中制備出rVWF溶液(終濃度500|ig/ml)，并且添加NaI04(終濃度5mM)用以氧化碳水化合物殘基。氧化反應(yīng)于4°C下進行20min，然后添加亞硫酸氫鈉(終濃度5mM)以停止反應(yīng)。隨后添加mPEG-酰肼(鏈長3kD)(終濃度10mM)，并且VWF的PEG化反應(yīng)在室溫下進行l(wèi)h。然后通過大小排阻色譜法(size-exclusionchromatography)提純PEG化VWF。將反應(yīng)混合物施加到裝滿SephacrylS-300HR(Amersham公司)的色譜柱(尺寸26mmx840mm)上，并且通過使用20mM含有5%海藻糖和150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液，將PEG化VWF與試劑分離。洗脫空隙體積中的經(jīng)修飾的VWF，通過測量VWF抗原水平和OD280nm予以指示。把含有組分的VWF直接施加于填滿EMDTMAE650M(默克公司)的陰離子樹脂交換柱(尺寸10mmx108mm)上，用于進一步純化。然后用20mM含有5%海藻糖和1000mMNaCl的HEPES緩沖液洗脫PEG化VWF。實施例2:用mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯使VWF中的賴氨酸殘基PEG化為使VWF經(jīng)由賴氨酸殘基PEG化(圖1A)，在20mM含有5。/。蔗糖和150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液中制備出rVWF溶液(終濃度500)ag/ml)，并且加入mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸麼(鏈長5kD)(終濃度10mM)。在室溫下VWF進行1h的PEG化反應(yīng)。隨后通過大小排阻色譜法提純PEG化VWF。將反應(yīng)混合物施加到填滿SephacrylS-300HR(Amersham公司)的色譜柱上，并且通過與用于PEG化反應(yīng)相同的緩沖系統(tǒng)分離PEG化VWF。洗脫空隙體積中的VWF，通過測量VWF抗原水平和OD280nm予以指示。把含有組分的VWF直接施加于填滿EMDTMAE650M(默克公司)的陰離子樹脂交換柱(尺寸26mmx840mm)上，用于進一步純化。然后用20mM含有5%蔗糖和1000mMNaCl的HEPES緩沖液洗脫PEG化VWF。實施例3:用mPEG對硝基苯基碳酸酯使VWF中的賴氨酸殘基PEG化為使VWF用mPEG對硝基苯基碳酸酯進行PEG化，在20mM含有5%蔗糖和150mMNaCl、pH7.6的HEPES緩沖液中制備出源于血漿的VWF溶液(終濃度500pg/ml)，并且加入mPEG對硝基苯基碳酸酯(鏈長2kD)(終濃度10mM)。在室溫下VWF進行2h的PEG化反應(yīng)。隨后通過大小排阻色譜法提純PEG化VWF。將反應(yīng)混合物施加到填滿SephacrylS-300HR(Amersham公司)的色譜柱上，并且通過與用于PEG化反應(yīng)相同的緩沖系統(tǒng)分離PEG化VWF。洗脫空隙體積中的VWF，通過測量VWF抗原水平和OD280nm予以指示。實施例4:用mPEG馬來酰亞胺使VWF中的硫氫基殘基PEG化為使VWF用mPEG馬來酰亞胺經(jīng)由游離SH(硫氫基)殘基進行PEG化，在20mM含有4%甘露糖和1%海藻糖以及150mMNaCl、pH7.6的HEPES緩沖液中制備出rVWF溶液(終濃度500ng/ml)，并且加入mPEG馬來酰亞胺(鏈長10kD)(終濃度10mM)。在室溫下VWF進行2h的PEG化反應(yīng)。隨后通過大小排阻色譜法提純PEG化VWF。將反應(yīng)混合物施加到填滿SephacrylS-300HR(Amersham公司)的色譜柱上，并且通過與用于PEG化反應(yīng)相同的緩沖系統(tǒng)分離PEG化VWF。洗脫空隙體積中的經(jīng)修飾的VWF，通過測量VWF抗原水平和OD280nm予以指示。實施例5:葡聚糖偶聯(lián)VWF在20mM、pH6.0醋酸鈉緩沖液中制備出6mg/ml的葡聚糖(MW40kD)溶液，并且添加Nal04(終濃度10mM)以產(chǎn)生游離醛基。氧化反應(yīng)于4。C下避光進行1h，然后添加亞硫酸氫鈉(終濃度5mM)以停止反應(yīng)。在O.lM含有0.15MNaCl、pH7.2的磷酸鈉緩沖液(PBS緩沖液)中透析活化的葡聚糖。然后將2.4ml該活化的葡聚糖溶液添加至10ml的rVWF溶液(濃度0.6mg/mlPBS緩沖液)中。將5ml氰基硼氫鈉溶液(64mg/mlPBS緩沖液)是添加至該混合物，并且在室溫下避光保溫過夜。然后添加3ml的1.0M、pH7.2TRIS-HC1溶液，以封閉殘留的醛基并且在室溫下保溫1h，并且用20mM含有5。/。蔗糖、pH7.4的HEPES緩沖液透析。然后通過將混合物施加到填滿SephacrylS-300HR的色譜柱(尺寸50mmx860mm)上，將葡聚糖偶聯(lián)的rVWF衍生物進一步通過大小排阻色譜法提純(緩沖液20mMHEPES，5%蔗糖，pH7.4)。洗脫空隙體積中的rVWF衍生物，通過測量rVWF衍生物抗原水平和OD280nm予以指示。過使用100kD再生纖維素膜(Millipore公司)的超濾法對這些組分進行收集和濃縮。實施例6:VWD小鼠中的藥物動力學(xué)將Denis等詳述的缺乏VWF的小鼠(PNAS95:9524-9529，1998)用作類似重度III型VWD的人VWD模型。5個小鼠組經(jīng)由尾部靜脈接受了PEG-rVWF(鏈長3kD，根據(jù)實施例1進行PEG化rVWF)或者作為對照的天然rVWF的大劑量注射，注射劑量為40UVWF:Ag/kg體重，rVWF單位是基于PEG化后可檢測的VWF(ELISA)。在注射(對照組5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、10h禾卩24h)后，使PEG-rVWF組麻醉5min、30min、lh、2h、6h、10h禾tl24h，由心臟穿刺制備出檸檬酸血漿。得到血漿VWF抗原水平。該實驗結(jié)果如圖2所示。以典型的雙相方式從循環(huán)系統(tǒng)消除天然的rVWF，如在文獻中的描述(Lenting等、J.Biol.Chem.279:12102-12109，2004)，并且在600min和1440min、即10h禾卩24h之間低于檢測極限。相反，在注射PEG化rVWF后，PEG化rVWF由初始的每毫升血漿0U增加到10h時大約每毫升血漿0.6U，并且甚至在注射24h后仍然出現(xiàn)基本上大約每毫升0.4U的較高水平，在10h和24h之間平穩(wěn)下降，這顯示出非常長的PEG化rVWF持久性?？蓽y量的VWF隨時間的逐漸提高顯示出與VWF偶聯(lián)的聚合物PEG的偶聯(lián)可逆性，在VWF從聚合物上釋放后變得可測量。該模型中PEG-VWF較長的循環(huán)時間表明，該制品可以用于VWD預(yù)防性治療。實施例7:FVIII-K.O.小鼠中的藥物動力學(xué)使用Bi等詳述的FVIII缺乏的小鼠(Nat.GeneU0:119-121,1995)作為重度甲型血友病人的模型。5個小鼠組經(jīng)由尾部靜脈接受了PEG-rVWF(鏈長3kD，根據(jù)實施例1進行rVWF的PEG化)或者天然rVWF的大劑量注射(13ml/kg)，其中PEG-rVWF和天然rVWF都與rFVIII進行預(yù)混，達到3UFVIII/ml和3UVWF:Ag/ml。注射產(chǎn)物后5min和6h，在麻醉后從各個組通過心臟穿刺制備出檸檬酸血漿。對照組用緩沖液處理，并且在注射5min后放血。測量血漿樣品的VWF抗原水平。實驗結(jié)果如圖3所示。曲線顯示出一種一種典型的rVWF消除情況，rVWF下降到接近存在于FVIII缺乏的小鼠體內(nèi)的VWF基準(zhǔn)水平，反之在用藥PEG化rVWF后，其水平在6h觀察期內(nèi)得到提高。這再次顯示出與VWF偶聯(lián)的聚合物PEG的偶聯(lián)可逆性，VWF從聚合物上釋放后變得可測量，并且甚至用藥360min(6h)后仍持續(xù)提高。實施例8:VWD小鼠體內(nèi)FVIII的增加將Denis等詳述的vonWillebrand缺乏的小鼠(PNAS95:9524-9529，1998)用作類似重度III型VWD的人VWD模型。使用在20mM含150mMNaCl和5%蔗糖、pH7.4的HEPES中PEG-rVWF(鏈長5kD，根據(jù)實施例2使rVWF進行PEG化)或者天然rVWF，對4-5組小鼠經(jīng)由尾部靜脈進行靜脈注射治療。對照組用緩沖液處理。(基于ELISA的PEG-rVWF劑量為18UVWF:Ag/kg，2700ng/kg，天然rVWF的劑量2400|ag/kg)。每個小鼠接受的體積劑量為10ml/kg。在注射PEG-rVWF后的時間點(5min、1h、3h、6h、10h、24h禾B48h)或者天然的rVWF(5min、15min、30min、1h、2h、6h、24h和32h)，使4-5組小鼠麻醉，由心臟穿刺制備出擰檬酸血漿，并且測量血漿中FVIII活性水平(固有顯色分析(chromogenicinhouseassay))。在注射15分鐘后，將對照組放血。實驗結(jié)果如圖4所示。rVWF注射的結(jié)果是小鼠內(nèi)源性FVIII增加。曲線下方面積(AUC)在用藥PEG化rVWF后是8.0U'h/ml，與此相比在用藥rVWF后僅僅為3.3U*h/ml。這顯示PEG化rVWF基本上有更長的循環(huán)時間。該結(jié)果表明，PEG化VWF可以用于VWD二期FVIII不足的預(yù)防性治療。實施例9:FVIII-K.O.小鼠體內(nèi)rFVIII和VWF的恢復(fù)使用Bi等詳述的FVIII缺乏的小鼠(Nat.Genet.10:119-121,1995)用作重度甲型血友病人的模型。5組小鼠經(jīng)由尾部靜脈接受了PEG-rVWF(HZ-PEG，3K，經(jīng)由碳水化合物偶聯(lián))或者天然rVWF的大劑量注射，其中PEG-rVWF和天然rVWF都與rFVIII進行預(yù)混，達到3UFVIII/ml。注射后5min和6h，在麻醉后從各個組通過心臟穿刺制備出檸檬酸血漿。測量血漿樣品中FVIII活性和VWF抗原恢復(fù)水平。實驗結(jié)果如圖5和圖6所示。對于與rFVIII共注射而得到的兩種制品而言，相比于未處理的rVWF，PEG化rVWF誘導(dǎo)出更高的恢復(fù)性。對于PEG化rVWF，VWF水平隨時間增加，而在360min內(nèi)，正常的rVWF差不多完全消除。該結(jié)果表明，與FVin復(fù)合的PEG化VWF可以用于甲型血友病的緊急治療，其有益于增加FVIII循環(huán)時間。實施例10:FVIIIxVWF雙重剔除小鼠體內(nèi)FVIII半衰期的提高通過FVIII缺乏的小鼠與缺乏VWF的小鼠進行雜交育種，得到了FVIIIxVWF雙重剔除小鼠。這些小鼠患有FVin不足和VWF不足，因此提供了用于研究動物模型體內(nèi)FVIII-VWF相互作用的理想模型。使用在20mM含150mMNaCl和5%蔗糖、pH7.4的HEPES中的PEG-rVWF(鏈長5kD，根據(jù)實施例2，通過用mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯修飾賴氨酸殘基而使rVWF進行PEG化)，或者天然rVWFSS-PEG、或者天然rVWF，將它們每個都與rFVIII預(yù)混，達到9UFVIII/ml和9UVWF抗原/ml并且0.67UVWF:RCo/ml，然后分別經(jīng)由尾部靜脈使5組FVIIIxVWF雙重剔除小鼠(FVIII缺乏的小鼠與缺乏VWF的小鼠進行雜交)接受大劑量注射(11ml/kg)。根據(jù)公開的內(nèi)容(Ingerslev，Scand.J.Clin.Invest.47:143-149,1987)，通過使用ELISA方法測量VWF抗原值。根據(jù)Macfarlane等(Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308，1975)測量功能性VWF:RCo活性，該活性反映了在最初的止血過程中血小板對VWF的結(jié)合特性。注射后5min、3h、6h、10h和24h，在麻醉后從各個組通過心臟穿刺制備出檸檬酸血漿。測量血漿樣品中FVIII活性和VWF抗原水平。使用MicroMathScientist程序(MicromathResearch,SaintLuis，MO，US)計算出FVIII和VWF的半衰期，該程序使用了一種從藥物動力學(xué)程序庫中取得的分隔式模型(compartmentmodel)。對于與rVWF或PEG化rVWF共注射的FVIII半衰期，從1.88h提高至2.58h，曲線下面積(AUC)由4.3增加到7.3U'h/ml。VWF的半衰期從3.1增加至10.4，曲線下方面積由5.7增加22.8。結(jié)果如圖7和圖8所示，數(shù)據(jù)顯示，PEG-VWF可以用于急性和預(yù)防性甲型血友病和VWD治療，其優(yōu)點是具有較長的VWD和FVIII循環(huán)時間。實施例11:小鼠血槳中PEG化的可逆性驗證用VWF缺乏的血漿通過體外實驗證明了PEG化的可逆性。由缺乏VWF的小鼠(Denis等，PNAS95:9524-9529，1998)通過在4°C下1100xg離心15min，得到了檸檬酸血漿。將4體積小鼠血漿與l體積根據(jù)實施例l制備出的PEG化rVWF(經(jīng)由碳水化合物偶聯(lián)的PEG)或?qū)嵤├?制備出的PEG化rVWF(經(jīng)由賴氨酸殘基偶聯(lián)的PEG)混合，并且在37°C保溫48h。未PEG化rVWF用作兩種實驗的對照。在混合后即刻抽取子樣品和在1h、5.5h、24和48h后抽取子樣品，并且通過使用夾心ELISA系統(tǒng)由冷凍樣品分析VWF抗原含量。多克隆抗VWF抗體(DAKO公司)用于涂布96孔ELISA板，并且分析羊抗兔-IgG-HRP偶聯(lián)物(AXELL公司)用于檢測結(jié)合的因子VWF。隨時間的過去，也測量來自體內(nèi)血漿樣品中VWF抗原的增加量，證明聚乙二醇與VWF偶聯(lián)的可逆性(圖9)。實施例12:PEG化VWF制品的FVIII結(jié)合能力測定使用BIACORE3000儀(BIACORE，Uppsala，瑞典)，通過表面胞質(zhì)基因共振實驗(Karlsson和Faelt，J.Immunol.Methods,200:121-33,1997)，比較不同的PEG化rVWF制品的FVIII結(jié)合能力。一般來講，將配體固定于傳感器芯片，并且通過表面胞質(zhì)基因共振測定其它組分與配體的結(jié)合。通過使用該技術(shù)，測量接近芯片表面的溶液折射率的變化。檢測在芯片表面上的結(jié)合組分的濃度變化，其作為信號在隨機共振單元(RU)得到表達。在結(jié)合于固定化配體的蛋白質(zhì)質(zhì)量和觀察的RU之間有線性關(guān)系。采用7000-9000RU和25°C下NHS/EDC化學(xué)方法，在25°C下將PEG化VWF制品固定于81八(:011￡1^1傳感器芯片的葡聚糖表面。在流速15nl/min下使用10mM含有150mMNaCl、3mMEDTA和0.005%表面活性劑P20、pH7.4的HEPES緩沖液(HBS緩沖液，BIACORE公司)。測量與不同含量的商品FVIII產(chǎn)品(ADVATE，BaxterAG,維也納，奧地利)的結(jié)合，如10圖所示。該圖顯示了PEG化rVWF制品的FVIII結(jié)合能力，該PEG化rVWF是根據(jù)實施例4用mPEG馬來酰亞胺5000修飾而制備得到的。不同的PEG化rVWF制品的BIACORE實驗結(jié)果如表1所示。在該表中，PEG化rVWF制品的不同F(xiàn)VIII結(jié)合能力是以未PEG化參照制品的RU值百分比給出的，RU值的最高水平參考范圍為10-20IUFVIII/ml(顯色分析)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實施例13:在聚合物偶聯(lián)后VWF質(zhì)量提高根據(jù)實施例2，使用mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(鏈長5kD)在不同的濃度(1mM、2.5mM、5mM、7.5mM和10mM)將rVWF進行PEG化。用兩種不同的方法SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法和VWF多聚體分析法，分析了PEG化VWF物種。使用3-8M梯度凝膠(TrisAcetatGel/Bio-Rad公司)，在還原條件下進行SDS凝膠電泳法。根據(jù)Ruggeri和Zimmerman(Blood，57:1140-43，1981)的方法，使用1.6%瓊脂糖凝膠進行VWF多聚體分析法。根據(jù)Aihara等的方法(Thromb.Haemost.，55:263-67，1986)，進行VWF-多聚體目測。SDS凝膠電泳法(圖11)顯示了由成熟VWF(下條帶)和前VWF(上條帶)組成的rVWF制品，以及通過使用不同的試劑濃度在PEG化后的分子量增加。另外，PEG化(根據(jù)實施例2進行PEG化)后由人血清白蛋白(HSA)制品的分子量遷移顯示為參照制品。實驗表明，HSA的分子量從66,000Da轉(zhuǎn)變?yōu)?90,000Da，顯示出PEG化工序的效果。圖12顯示了不同試劑濃度下PEG化前后rVWF的多聚模式。這清楚地顯示了隨試劑濃度增加的不同多聚體的分子量變寬并轉(zhuǎn)變?yōu)楦?。實施?4:用mPEG琥珀酰亞胺基戊二酸酯使VWF中的賴氨酸殘基PEG化為使VWF經(jīng)由賴氨酸殘基PEG化(圖1A)，在20mM含有5%蔗糖和150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液中制備出rVWF溶液(終濃度500|ag/ml)，并且加入mPEG琥珀酰亞胺基戊二酸酯(鏈長5kD)(終濃度200mgPEG琥珀酰亞胺基戊二酸酯/mg蛋白質(zhì))。然后用0.1MNaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.4。在室溫下使VWF進行PEG化1h，并且按照在實施例2中描述的方法進行純化。實施例15:FVIII-K.O.小鼠體內(nèi)FVIII半衰期的提高將Bi等詳述的FVIII缺乏的小鼠(Nat.Genet.，10:119-121，1995)用作重度甲型血友病人的模型。5組小鼠經(jīng)由尾部靜脈接受了根據(jù)實施例2制備的PEG-rVWF(SS-PEG，5K)或者天然rVWF的大劑量注射(10ml/kg)，其中PEG-rVWF和天然rVWF都與重組FVIII進行預(yù)混，達到10UFVIII/ml和10UVWF/ml。注射后5min、3、9禾卩24h，在麻醉后從各個組通過心臟穿刺制備出擰檬酸血漿。測量血漿樣品中FVIII活性和VWF抗原恢復(fù)水平。該結(jié)果如圖13和圖14所示。對于FVIII，半衰期從1.8h(當(dāng)天然的rVWF存在時)增加至3.9h(當(dāng)與PEG-rVWF一起用藥時)，曲線下方面積(AUC)從4.1增加到7.8U*h。對于VWF，半衰期從3.2增加至13.6h，AUC從7.7增加到32.1U*h，大約為四倍。實施例16:通過不同的方法測定SS-PEG化VWF制品的FVin結(jié)合能力改進Bendetowicz等(Blood，92:529-538，1998)所述的方法，通過組合使用ELISA和顯色分析系統(tǒng)(ECA)，測量不同PEG化rVWF-制品的FVIII結(jié)合能力。微量滴定板用200Hi在50mmol/L、pH9.6的Na2C03/NaHC03中含2.6|ng/ml抗VWF的多克隆抗體涂布，接著在各個步驟后用PBS-吐溫(Tween)緩沖液(100mMNa2HP04/KH2P04,150mMNaCl，pH7.6，和0.05%吐溫20)洗板。將該板在37。C下，用PBS-吐溫緩沖液中的0.1%干牛乳/2mM苯甲脒封閉lh。用0.2U/mlrFVIII(ADVATE，BaxterAG，維也納，奧地利)在37°C下將含量增加的VWF預(yù)孵育25min，并且將100pl這種混合物加至板上。在孵育后，通過FVIII顯色分析(Technoclone，維也納，奧地利)，測量結(jié)合于所捕獲的VWF的FVIII含量。FVIII結(jié)合能力可以表示為于405nm(dA405)處在1min內(nèi)測量的吸光度變化。圖15顯示出依賴VWF劑量的FVIII結(jié)合于兩種PEG化VWF制品的情況，這兩種制品都用mPEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)修飾。以相對于未修飾的起始VWF制品的百分比計算出經(jīng)修飾的VWF制品的FVIII結(jié)合能力，并且發(fā)現(xiàn)PEG-SS-rVWF-l是20%，而PEG-SS-rVWF-2是50%。圖16顯示了按照實施例12中描述的表面胞質(zhì)基因共振方法測量時，兩種PEG-SS-rVWF制品的FVIII結(jié)合能力。計算的結(jié)合能力分別是25%和45%。圖17顯示，rVWF分子進行PEG-SS偶聯(lián)后，通過SDS-PAGE測量的分子質(zhì)量有適當(dāng)?shù)脑黾?。實施?7:用分枝PEG馬來酰亞胺使VWF的硫氫基基團發(fā)生PEG化為使VWF經(jīng)由游離SH殘基用分枝PEG馬來酰亞胺進行PEG化，在20mM含有3%海藻糖和150mMNaCl、pH7.6的HEPES緩沖液中制備出重組VWF溶液(終濃度500pg/ml)。然后添加由NOF公司(NOFEurope,Grobbendonk,比利時)提供的分枝mPEG馬來酰亞胺(鏈長20kD)(終濃度10mM)。在輕輕攪拌下，VWF進行室溫下2h的PEG化反應(yīng)。隨后使用由再生纖維素(Millipore公司)組成的100kD膜，通過超濾/滲濾(UF/DF)將PEG化rVWF與試劑分離。實施例18:用mPEG酰肼/EDC使VWF中的羧基PEG化根據(jù)實施例23制備出弗林蛋白酶熟化的rVWF并純化。制品用50mM、pH6.2的磷酸鹽緩沖液透析，并且稀釋至濃度400ng/ml。然后加入鏈長5kD的mPEG酰肼(mPEGHz)(濃度60mgmPEGHz/mgVWF)。將30)xl新制備的500mM1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙37基)碳二亞胺(EDC)溶液添加到lml含有VWF的混合物中，在輕輕振蕩下室溫孵育5h。使用100kD膜(再生纖維素/Millipore公司)，在20mMHEPES緩沖液(150mMNaCl，pH7.4)中通過UF/DF將試劑與PEG化rVWF分離。實施例19:用聚唾液酸修飾VWF中的賴氨酸殘基按照Fernandes和Gregoriadis(Biochim.Biophys.Acta.，1341:26-34，1997)以及Jennings和Lugowski(J.ImmunoI.，127:1011-1018，1981)描述的方法，用聚唾液酸(多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸，CA)修飾賴氨酸殘基。將含有O.lMNal04的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸溶液(濃度20mg/ml)在室溫下避光攪拌15min以氧化CA。每毫升活化CA溶液加入2ml乙二醇，并且在室溫下避光進一步攪拌30min。將溶液在0.05M、pH7.2的磷酸鈉緩沖液中避光透析過夜。隨后將該溶液等分添加至rVWF的0.05M磷酸鈉溶液(400pg/ml)，使終濃度為每mgVWF有50mg活化CA。將該混合物在室溫下避光攪拌30分鐘。添加NaCNBH3(1mg/mgrVWF)，并且在輕輕振蕩下將混合物室溫下避光保溫18h。加入1M、pH7.2的Tris水溶液(50pl每mgNaCNBHa)，并且攪拌lh以終止反應(yīng)。使用100kD膜(再生纖維素/Millipore公司)，通過UF/DF將游離的試劑與rVWF-聚唾液酸偶聯(lián)物分離。按照在實施例16中描述的方法，測定該制品的FVIII結(jié)合能力。通過由還原條件下等電點聚焦(IEF)檢測的等電點(PI)遷移，顯示rVWF與聚唾液酸的偶聯(lián)。圖20顯示了根據(jù)實施例在與聚唾液酸偶聯(lián)前后的VWF制品對比情況。根據(jù)廠商(AmershamBioscience公司)的說明，使用AmpholinePAGplate系統(tǒng)(pH3.5-9.5)。通過與聚唾液酸的偶聯(lián)導(dǎo)入酸基，帶來了一個單一的經(jīng)修飾的rVWF的酸性條帶。按照在實施例16中描述的方法，通過使用ECA測試，測定出FVIII結(jié)合能力是54%。使用表面胞質(zhì)基因共振方法(實施例12)，測定出FVni結(jié)合能力是70。/。。實施例20:在剪切應(yīng)力條件下的PEG化按照Sakariassen等(J.Lab.Clin.Med.102:522-535，1983)描述的方法制造灌注腔(perfusionchamber)，并且用于在剪切應(yīng)力條件下rVWF的PEG化。在20mM含有3%海藻糖、pH7.4的HEPES中制備出rVWF溶液(500pg/ml)。然后加入mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(終濃度5mM)，用0.1MNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，并且立即裝入灌注系統(tǒng)。然后通過使用蠕動泵，在Sakariassen等描述的灌注條件(J.Lab.Clin.Med.，102:522-535，1983)下，在室溫下以2500sec"的剪切速率進行PEG化。實施例21:制備pdVWF根據(jù)對Thorell和Blomback(Thromb.Res.,35:431-450,1984)所述方法的改進，進行pdVWF制備。為制備pdVWF，在20-30°C下，將1.5kg冷沉物溶解于61水中。攪拌1h后，通過離心除去纖連蛋白沉淀物。每升上清液中加入8gNaCl，將溶液升溫至室溫，并且加入SD-原液試劑(終濃度為1%吐溫80+0.18%乙?；一鶖Q檬酸酯)用于病毒滅活。在EMD-TMAEFractogel650M柱(XK50/180)上進一步純化溶液，該柱已用0.2MNaCl、0.02M醋酸鈉，pH6.5(洗滌緩沖液)預(yù)平衡。在用20個柱體積的洗滌緩沖液洗柱后，用0.5MNaCl、0.02M檸檬酸鈉、pH6.9洗脫VWF。為沉淀VWF,加入甘氨酸(終濃度1M)和NaCl(終濃度3M)。將沉淀物溶于緩沖液，并且施加到SephacrylS-400HR(Amersham公司)柱上用于最后的純化，該柱巳用0.3MCaCl2、0.15MNaCl、20mMHEPES，pH7.4平衡。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實施例22:用PEGSS使DdVWF中的賴氨酸殘基PEG化根據(jù)實施例21制備出pdVWF，并且用20mM、pH7.4的HEPES緩沖液(含有150mMNaCl和3。/。蔗糖)稀釋至終濃度400iag/ml。然后加入mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(鏈長5kD)(濃度10mgPEGSS5000/mgVWF),并且在室溫下使pdVWF進行PEG化1h。然后使用100kD由再生纖維素(Millipore公司)組成的膜，通過UF/DF將試劑與PEG化VWF分離。實施例23:弗林蛋白酶熟化和純化經(jīng)弗林蛋白酶熟化的rVWF按照Schlokat等(Biotechnol.Appl.Biochem.，24:257-267，1996)描述的方法，將143kg源于rFVra發(fā)酵和凈化過程的流過抗FVIII抗體柱的流通組分，用弗林蛋白酶處理以除去前肽，并且進行無菌過濾。該工藝是基于早期的工作(Fischer等，F(xiàn)EBSLett.，375:259-262，1995;Fischer等，PCT/AT98/00034[WO98/38219]，1-33，1998,18-2-1998;以及Kaersgaard和Barington，J.chromatogr.B715:357-367，1998)。在用水稀釋4倍至16mS/cm后，將633kg稀溶液施加到XK50/15EMD-TMAE-Fraktogel650M柱(300mlgel;默克公司；#K14540281)上，該柱已用lOmMTris、100mMNaAc、86mMNaCl、pH6.5的mS/cm(平衡緩沖液)平衡。用平衡緩沖液洗柱，并且用100mMNaAc、250mMNaCl、100mM甘氨酸、3mMCaCl2洗脫。在SartocleanGF(0.8&0.65n)和SartobranP(0.45&0.2上過濾4506gTMAE洗脫液，稀釋1.5倍至29mS/cm，并且和經(jīng)由MustangQ過濾器(#IH18770932)泵出以除去DNA。在22+/-2°C下用SD處理60min并用水稀釋2倍至16mS/cm后，將溶液施加于Amicon70/29UNOsphereS柱(600ml凝膠；Bio-Rad公司，#7896C)上，該柱已用TMAE步驟中的平衡緩沖液平衡。用平衡緩沖液洗柱，并且用TMAE步驟中的洗脫緩沖液洗脫。使用30kDa0.1m2由再生纖維素組成的膜(Hydrosart#01080217，Sartorius公司)，通過超濾將3223gUNO-S洗脫液濃縮15倍。通過大小排阻色譜法在XK50/86.5Superose6PrepGrade柱上對201g濃縮物進行最后純化，該柱已用100mMNaAc、500mMNaCl，pH7.0(1698ml凝膠;GEHealthcare#17-0489-01)平衡。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實施例24:經(jīng)弗林蛋白酶熟化的rVWF的PEG化根據(jù)實施例23制備出經(jīng)弗林蛋白酶熟化的VWF，并且用20mM、pH7.4的HEPES緩沖液(含有150mMNaCl和3%蔗糖)透析。然后用20mM、pH7.4的HEPES緩沖液(含有150mMNaCl并且和3%蔗糖)將溶液稀釋至終濃度300pg/ml。然后加入mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(鏈長5kD)(濃度25mgPEGSS5000/mgVWF)，并且在室溫下使經(jīng)弗林蛋白酶熟化的VWF進行PEG化1h。然后使用100kD由再生纖維素(Millipore公司)組成的膜，通過UF/DF將試劑與PEG化VWF分離。實施例25:經(jīng)弗林蛋白酶熟化的rVWF的體外表征按照在實施例12和圖15中描述的方法，分別通過表面胞質(zhì)基因共振技術(shù)和ECA，測定經(jīng)弗林蛋白酶熟化的rVWF的FVIII結(jié)合能力。該結(jié)果與根據(jù)實施例21制備的無白蛋白的源于血漿的VWF制品相比較。如圖18和圖19所示，將經(jīng)弗林蛋白酶熟化的rVWF的FVIII結(jié)合能力與源于血漿的參照制品相比較。實施例26:VWF與聚唾液酸通過與戊二醛交聯(lián)相偶聯(lián)為使用戊二醛作為交聯(lián)試劑使rVWF與聚唾液酸(多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸)偶聯(lián)(Migneault等，Biotechniques37:790-796，2004)，制備出4ml多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸(濃度20mg/ml)在20mMHEPES緩沖液(150mMNaCl，pH7.4)中的溶液，并且通過添加0.1MNaOH將pH調(diào)節(jié)至7.4。加入戊二醛，使終濃度為0.01%。隨后以100pl等分加入1ml20mMHEPES緩沖液(150mMNaCl，pH7.4)中的rVWF溶液(400|ag/ml)，并且將混合物在輕輕振蕩下保溫lh。然后透析混合物，加入海藻糖(終濃度3%)，并且使rVWF-聚唾液酸偶聯(lián)物通過超濾進行濃縮。實施例27:VWF-K.O.小鼠體內(nèi)VWF半衰期的提高將Denis等詳述的缺乏VWF的小鼠(PNAS95:9524-9529,1998)用作人VWD的動物模型。5組小鼠經(jīng)由尾部靜脈接受根據(jù)實施例19制備出的rVWF-聚唾液酸偶聯(lián)物或天然rVWF的大劑量注射(10ml/kg)，以達到100UVWF:Ag/kg。注射后5min、1、3、6、9和21h，在麻醉后從各個組通過心臟穿刺制備出檸檬酸血漿。測量血漿樣品中VWF抗原恢復(fù)情況和內(nèi)源性小鼠FVIII活性水平。該結(jié)果如圖21和圖22所示。使用MicroMathScientist程序(MicromathResearch,SaintLuis，MO,US)計算出VWF的半衰期，該程序使用了一種從藥物動力學(xué)程序庫取得的分隔式模型(compartmentmodel)。通過扣除基線的梯形模型計算出曲線下方面積，用作FVIII活性。[103]分別地，VWF半衰期從1.3h(天然rVWF)增加到2.4h(rVWF-聚唾液酸偶聯(lián)物)，F(xiàn)VIII的AUC從3.3U'hr/ml增加到5.3U'hr/ml。實施例28:mPEG丙醛與賴氨酸基團通過還原性胺化而偶聯(lián)在0.05M、pH7.2磷酸鈉緩沖液中制備出rVWF溶液(400ng/ml)，并且加入mPEG丙醛(鏈長5kDa)使終濃度為10mgmPEG丙醛/mgVWF。將該混合物攪拌30分鐘。添加NaCNBH3(lmg/mgrVWF)，并且在輕輕振蕩下將混合物室溫保溫15h。加入1M、pH7.2的Tris水溶液(50|il/mgNaCNBH3)，并且攪拌1h以終止反應(yīng)。隨后使用100kD的膜(再生纖維素/Millipore公司)，通過超濾/滲濾將PEG化rVWF與試劑分離。實施例29:VWF的N-末端PEG化按照Lee等描述的方法(Pharm.Res.，20:818-825,2003)進行rVWF的N-末端PEG化。在50mM醋酸鈉緩沖液，pH5.5中制備出rVWF溶液(終濃度500pg/ml)，并且加入mPEG丙醛(鏈長5kD)(濃度10mgmPEG丙醛/mgVWF)。當(dāng)存在2mMNaCNBH3作為還原劑時，在室溫下進行PEG化24h。隨后使用100kD的膜(再生纖維素/Millipore公司)，通過超濾/滲濾將PEG化rVWF與試劑分離。實施例30:rVWF中的賴氨酸殘基和SH殘基的順序PEG化根據(jù)實施例2的方法，使rVWF經(jīng)由賴氨酸殘基與mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(鏈長5kD)進行PEG化。在室溫下進行PEG化反應(yīng)lh，并且使用100kD膜(再生纖維素/Millipore公司)，在20mM含有5%蔗糖、pH7.4的HEPES緩沖液中，通過UF/DF將游離的試劑與rvWF的PEG偶聯(lián)物分離。然后用0.1MNaOH將溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.6，并且加入mPEG馬來酰亞胺(鏈長5kD/終濃度10mM)用于游離氫硫基的PEG化。在輕輕振蕩下，進行室溫PEG化2h。然后使用100kD的膜(再生纖維素/Millipore公司)，再次將試劑與反應(yīng)混合物分離。實施例31:碳水化合物殘基的酶催化氧化和與PEG-Hz的后繼PEG化[107]使用來自Dac(y"wwcfc"^wVfey(Sigma公司)的半乳糖氧化酶，按照Avigad等描述的方法(J.Biol.Chem.，237:2736-43，1962)，進行rVWF中碳水化合物殘基的酶催化氧化(Wilchek和Bayer，Meth.Enzymol.，138;429-442，1987)，以產(chǎn)生醛基。用50mM、pH7.2磷酸鹽緩沖液透析所得到溶液，并且稀釋至VWF濃度為400|ag/ml。然后加入鏈長5kD的mPEG酰肼(mPEGHz)(終濃度40mgmPEG-Hz/mgVWF)。在室溫下將混合物輕輕振蕩保溫3h。使用100kD膜(再生纖維素/Millipore公司)，在20mM含有5%蔗糖的HEPES緩沖液(150mMNaCl，pH7.4)中通過UF/DF將試劑與PEG化rVWF分離。實施例32:FVIII結(jié)合位點被rFVIII封閉的rVWF的PEG化為制備具有未修飾的FVIII結(jié)合位點的PEG化rVWF，制備出3ml在50mMHEPES緩沖液(50mMHEPES，150mMNaCl，2%海藻糖，pH7.4)中含有rFVIII(200U/ml)和rVWF(40UVWF:Ag/ml)的溶液，并且在37°C下保溫1h。將混合物冷卻至室溫，并且加入PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(PEG-SS/鏈長5kD)(終濃度1mgPEG-SS/UVWF:Ag)，并且在輕輕振蕩下保溫1h。然后在輕輕振蕩下加入CaCl2，使終濃度為400mM。將該溶液施加到填滿SephacrylS-400HR(Amersham公司)的色譜柱(2.6x80cm)上，并通過大小排阻色譜法將具有游離的FVIII結(jié)合位點的PEG化rVWF與rFVIII分離(洗脫緩沖液:50mMHEPES緩沖液，400mMCaCl2，pH7.4)。實施例33:FVIII結(jié)合位點被肝素封閉的rVWF的PEG化制備出5ml在50mM、pH7.4的HEPES緩沖液中的rVWF溶液(300pg/ml)，并且加到2ml在相同的緩沖液中的肝素-瓊脂糖凝膠CL-6B(AmershamBioscience公司)懸浮液中。將該混合物在輕輕振蕩下保溫2h，并且將VWF結(jié)合于凝膠(deRomeuf和Mazurier，Thromb.Hamost.69:436-440,1993)，接著將mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(200mg/mgVWF)加到混合物中，并且在輕輕振蕩下室溫進行PEG化1h。用等體積的含有2MNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液稀釋混合物。通過過濾將凝膠與上清液分離。然后用2mlHEPES緩沖液，pH7.4(20mMHEPES，lMNaCl)洗滌凝膠3次，并且合并上清液和洗液。接著通過超濾濃縮含有PEG化VWF的溶液，并且使用lOOkD由再生纖維素(Millipore公司)組成的膜，在20mM、pH7.4的HEPES緩沖液(150mMNaCl，3%蔗糖)中進行滲濾。通過使用Biacore技術(shù)或者ECA測試，得到的產(chǎn)物顯示出充分的FVIII結(jié)合能力(該測試系統(tǒng)在申請日為2005年4月4日、申請序列號為60/668,378的美國專利申請中得到描述)。實施例34:VWF與透明質(zhì)酸偶聯(lián)使用購自Sigma公司的透明質(zhì)酸(C53747)，通過還原性胺化反應(yīng)進行賴氨酸殘基的透明質(zhì)酸(HA)修飾。將HA溶于新制備的O.lMNal04溶液，使終濃度為5mgHA/ml。然后在輕輕攪拌下避光進行氧化反應(yīng)15min。在每毫升氧化的HA溶液中加入2ml乙二醇以停止反應(yīng)，并且進一步在室溫下避光攪拌30min。將溶液在0.05M、pH7.2的磷酸鈉緩沖液中于4。C下避光透析過夜。隨后將該溶液等分添加至rVWF在0.05M、pH7.2磷酸鈉緩沖液的溶液(40UVWF:Ag/ml)中，使終濃度為每mg蛋白質(zhì)有50mg活化HA。將該混合物在室溫下避光攪拌120min。添加NaCNBH3(lmg/mg蛋白質(zhì))，并且在輕輕振蕩下將混合物室溫下避光保溫18h。然后在每毫升混合物中加入100pl的1M、pH7.2的Tris緩沖液，并且攪拌lh以終止反應(yīng)。使用100kD膜(再生纖維素/Millipore公司)，通過UF/DF將游離的試劑與rVWF-HA偶聯(lián)物分離。實施例35:PSA偶聯(lián)的VWF的體外生物化學(xué)表征根據(jù)實施例19將rVWF聚唾液酸化。除該實施例描述的參數(shù)比如等電點聚焦(圖20)之外，根據(jù)實施例16的通過ECA-測試(54y。)和根據(jù)實施例12通過表面胞質(zhì)基因共振(70%)測定的FVIII結(jié)合能力，計算出比率VWF:RCo/VWF:Ag。通過使用商品分析系統(tǒng)(AsserachromvWF，羅氏公司，巴塞爾，瑞士)，測定VWF抗原水平。根據(jù)Macfarlane等描述的方法(Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308，1975)，通過瑞斯托菌素輔因子分析測定制品的功能活性。計算的rVWF起始原料的比率0.39在聚唾液酸化后降低至0.13。實施例36:rVWF經(jīng)由賴氨酸殘基與分枝PEG偶聯(lián)根據(jù)實施例23，制備出成熟rVWF溶于20mM含有0.5%蔗糖、150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液的溶液(35UVWF:Ag/ml)。然后在輕輕攪拌下，將NOF公司(NOFEurope,Grobbendonk，比利時)提供的分枝mPEG琥珀酰亞胺基戊二酸酯(PE-SG/鏈長20kD)加入該溶液(5mgPEG-SG/mg蛋白質(zhì))，并且通過逐滴滴加0.5MNaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.4。然后在輕輕攪拌下室溫進行PEG化1h。隨后將反應(yīng)混合物施加到在20mM含有0.5%蔗糖、150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液中平衡過的離子交換層析樹脂(FractogelEMDTMAE650M)上。然后用20CV平衡緩沖液洗柱以除去過量的試劑，并且用洗脫緩沖液(20mMHEPES，0.5MNaCl，0.5%蔗糖，pH7.4)洗脫PEG化rVWF。使用由再生纖維素組成的膜通過超濾/滲濾，并且使用由20mM含0.5%蔗糖、150mMNaCl、pH7.4的HEPES組成的緩沖系統(tǒng)通過截流100kD的分子量來濃縮洗脫液。相比rVWF起始原料(VWF:RCo/VWF:Ag比率0.89)，得到的PEG化衍生物顯示出稍微減小的VWF:RCo/VWF:Ag的比率，為0.79。另夕卜，PEG化rVWF起始原料的FVIII結(jié)合能力通過ECA測試(實施例16)測得為83%。實施例37:FVIII-K.O.小鼠體內(nèi)偶聯(lián)于分枝PEG的VWF的藥物動力學(xué)[113]將FVIII缺乏的小鼠(Bi等，Nat.Genet，10:119-121，1995)用作重度甲型血友病人的模型。5組小鼠經(jīng)由尾部靜脈接受了PEG-rVWF(分枝PEG，SG)與rFVIII的混合物或者天然rVWF與rFVm的混合物的大劑量注射(10ml/kg)，達到30UFVIII/ml和25UVWF/ml。注射后5min、3、9、24禾卩32h，在麻醉后從各個組通過心臟穿刺制備出檸檬酸血漿。測量血漿樣品中FVIII活性和VWF抗原恢復(fù)水平。VWF和FVIII的消除曲線如圖23和圖24所示。VWF半衰期從1.4h增加到9.7h，VWF的AUC由11.8U*h/ml增加到49.2U'h/ml。對于FVIII，半衰期從1.2h(當(dāng)天然的rVWF存在時)增加至4.4h(當(dāng)與PEG-rVWF—起用藥時)，曲線下方面積(AUC)從12.1增加到30.5U*h/ml。實施例38:FVIII-K.O.小鼠體內(nèi)與不同量PEG-VWF混合的FVIII藥物動力學(xué)的比較[114]5組FVIII缺乏的K.O.小鼠經(jīng)由尾部靜脈接受PEG-rVWF(具有25mg分枝PEG-SG20000/mg蛋白質(zhì)的PEG化賴氨酸殘基)與rFVIII的不同混合物(A:20IUPEG-rVWF/ml+20IUFVIII/ml;B:10IUPEG-rVWF/ml+20IUFVIII/ml;C:3IUPEG-rVWF/ml+20IUFVIII/ml)的大劑量注射(10ml/kg)。對于PEG化rVWF，計算出3摩爾PEG/摩爾賴氨酸的比率。比較在不同的PEG-rVWF/rFVIII混合物中相同量(基于單位)的PEG-rVWF與rFVIII,可以計算出下述的PEG/FVin比率3:1(A);1.5:1(B);0.45:1(C)。注射后5min、1、3、9和24h，在麻醉后從各個組通過心臟穿刺制備出檸檬酸血漿。發(fā)現(xiàn)FVIII半衰期(A:2.1h，B:2.0h，C:2.5h)禾HAUC(A:18.9，B:14.5禾卩C:13.2U'hr/ml)沒有相應(yīng)的差異。對于FVIII，消除曲線如圖25所示。實施例39:比較使用不同PEG化程度的PEG-VWF制品的藥物動力學(xué)通過FVIII缺乏的小鼠與缺乏VWF的小鼠進行雜交育種，得到了FVIIIxVWF雙重剔除小鼠。這些小鼠同時患FVIII不足和VWF不足。5組FVIIIxVWF雙重剔除小鼠經(jīng)由尾部靜脈，注射天然rVWF/rFVIII(100/150IU/kg)的混合物或者PEG化rVWF#A與rFVIII(100/150IU/kg)的混合物或者PEG化rVWF#B與rFVIII(150/150IU/kg)的混合物。根據(jù)實施例24制備出PEG-rVWF#A(5mgPEG-SS5000/mg蛋白質(zhì))和PEG-rVWF#B(20mgPEG-SS5000/mg蛋白質(zhì))。計算出制品存A的2.5摩爾PEG/摩爾賴氨酸的比率和制品弁B的10摩爾PEG/摩爾賴氨酸的比率。樣品用藥后5min、1、3、9和24h，制備出檸檬酸血漿樣品。測量血漿VWF:Ag水平和FVIII活性，并且表示為血漿水平最大值的百分比，通常在注射5min以后達到最大值。VWF和FVIII的消除曲線分別如圖26和圖27所示。PEG-rVWF#A和和弁B的半衰期分別是6.3h和8.1h。計算出天然的rVWF半衰期為2.0h。兩種PEG化rVWF的標(biāo)準(zhǔn)化AUC(%最大值xh)從360%、(天然的rVWF)增加到901%、(#A)和1064%'h(#B)。與天然的VWF相比較，共注射rFVIII的循環(huán)時間通過PEG化rVWF而得到提高。當(dāng)存在天然的rVWF時，F(xiàn)VIII半衰期是0.8h，并且當(dāng)分別與PEG化rVWF#A和弁B—起注射時，分別增加到1.5和1.8h。而FVIII的AUC是214、370和358%、。實施例40:VWF二聚體的PEG化VWF在20mM含有0.5。/。蔗糖、150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液中制備出VWF二聚體溶液(58IUVWF:Ag/ml)，該二聚體由重組CHO細(xì)胞株系(BaxterBioscience公司)條件培養(yǎng)基純化。然后在輕輕攪拌下，將NOF公司提供的分枝mPEG琥珀酰亞胺基戊二酸酯(PE-SG/鏈長20kD)加入該溶液(5mgPEG-SG/mg蛋白質(zhì))，并且通過逐滴滴加0.5MNaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.4。然后在輕輕攪拌下室溫進行PEG化1h。隨后將反應(yīng)混合物施加到在20mM含有0.5%庶糖、150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液中平衡過的離子交換層析樹脂(FractogelEMDTMAE650M)上。然后用20CV平衡緩沖液洗柱以除去過量的試劑，并且用洗脫緩沖液(20mMHEPES，0.5MNaCl，0.5%蔗糖，pH7.4)洗脫PEG化rVWF二聚體。使用由再生纖維素(Millipore公司)組成的膜通過超濾/滲濾，并且使用由20mM含150mMNaCl、0.5%蔗糖、pH7.4的HEPES組成的緩沖系統(tǒng)通過100kD的分子量截留來濃縮洗脫液。實施例41:低多聚體rVWF的PEG化和體外表征根據(jù)實施例23純化成熟的rVWF。純化步驟包括在20mM含150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液中進行的離子交換層析步驟和最后在Superose6上的膠濾步驟，洗脫空隙體積中的高多聚體rVWF(17聚體)。根據(jù)Ruggeri和Zimmerman(Blood，57:1140-43，1981)的方法，使用1.0。/。瓊脂糖凝膠進行VWF多聚體分析。從副產(chǎn)組分得到了低多聚體rVWF制品(6聚體)，其以更長的滯留時間洗脫。通過添加0.5%蔗糖，pH7.4使該組分穩(wěn)定，.然后使用mPEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(PEG-SS)使低多聚體rVWF進行PEG化。在輕輕攪拌下，將PEG-SS加入該溶液(5mgPEG-SS/mg蛋白)，并且通過由逐滴滴加0.5MNaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.4。然后在輕輕攪拌下室溫進行PEG化1h。隨后使用再生纖維素組成的膜通過超濾/滲濾，并且使用由20mM含150mMNaCl、0.5%蔗糖、pH7.4的HEPES組成的緩沖系統(tǒng)通過進行100kD分子量的截留，除去過量的試劑。根據(jù)實施例16通過ECA分析測定的FVIII結(jié)合能力由起始原料的49Q/。稍微降低到PEG化制品的34%。測量的低多聚體rVWF的VWF:RCo/VWF:Ag的比率為0.02，這不受PEG化步驟的影響。實施例42:具有可逆性封閉的FVIII結(jié)合表位(用FVIII和肝素封閉)的VWF的衍生化[118]用肝素Hy-perD(Bio-Sepra公司)充滿色譜柱(15mmx148mm)，并且用由20mM含68mMNaCl、0.5。/。蔗糖、pH7.4的HEPES組成的平衡緩沖液平衡。然后用水稀釋成熟rVWF溶于20mM含有150mMNaCl、0.5蔗糖的HEPES中的溶液(48IUVWF:Ag/ml)，使電導(dǎo)率為7-8mS/cm，并且用線性流速1.5cm/min將其施加到柱上。隨后將由NOF公司(NOFEurope,Grobbendonk，比利時)提供的分枝mPEG琥珀酰亞胺基戊二酸酯(鏈長20kD)呈新鮮狀溶于15ml平衡緩沖液，使終濃度為5mgPEG-SG/mg結(jié)合蛋白質(zhì)。然后將該試劑溶液泵到柱上，并且在靜止條件下進行PEG化2小時。然后用含有0.05%賴氨酸的10CV平衡緩沖液洗柱。然后用由20mM含有1MNaCl、0.5%蔗糖、pH7.4的HEPES組成的緩沖液洗脫FVIII結(jié)合表位得到保護的PEG化rVWF。最后，使用100kD由再生纖維素(Millipore公司)組成的膜，在20mM、pH7.4(150mMNaCl，0.5%蔗糖)的HEPES緩沖液中，通過超濾/滲濾濃縮該溶液。得到的衍生物顯示出VWF:RCo/VWF:Ag的比率為0.48，其和rVWF起始原料的(比率0.47)相同。與在實施例中36描述的rVWF與分枝PEG-SG20000進行PEG化的步驟相反，F(xiàn)Vin結(jié)合能力不受FVIII表位封閉的PEG化步驟的影響，如同通過ECA測試(實施例16)的測量結(jié)果。實施例43:VWF經(jīng)由賴氨酸殘基與可降解的PEG偶聯(lián)根據(jù)實施例23純化成熟rVWF。然后制備出rVWF(40UVWF:Ag/ml)溶于20mM含有0.5%蔗糖、150mMNaCl、pH7.4的HEPES緩沖液的溶液。然后在輕輕攪拌下，將mPEG-(羧甲基)-3-羥基丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(鏈長5kD)加入該溶液(5mgPEG-試劑/mg蛋白質(zhì))進行PEG化，并且通過逐滴滴加0.5MNaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.4。然后在輕輕攪拌下室溫進行PEG化反應(yīng)1h。隨后，使用由再生纖維素組成的膜通過超濾/滲濾，并且使用由20mM含150mMNaCl、0.5%蔗糖、pH7.4的HEPES組成的緩沖系統(tǒng)通過100kD的分子量截留，來將過量的試劑與PEG化rVWF分離。權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，含有(a)一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；以及(b)至少一種結(jié)合于所述VWF分子的生理學(xué)可接受的聚合物分子；所述構(gòu)建體具有結(jié)合至少一種凝血因子(FVIII)分子或FVIII的生物活性衍生物的能力，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加。2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比增加到至少大約1.5倍。3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比增加到至少大約2倍。4.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子結(jié)合于所述VWF或所述VWF的生物活性衍生物的碳水化合物殘基。5.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子結(jié)合于所述VWF或所述VWF的生物活性衍生物的賴氨酸殘基。6.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子選自由聚(垸撐二醇)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥垸基甲基丙烯酰胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(a-輕基酸)、聚乙烯醇、聚磷腈、聚惡唑啉和聚(N-丙烯酰嗎啉)所構(gòu)成的組。7.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子是聚乙二醇(PEG)或者其衍生物。8.如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子是聚唾液酸(PSA)或其衍生物。9.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，包含在所述構(gòu)建體中的所述VWF在VWF的最初止血中保持生物活性，所述生物活性包括結(jié)合于血小板上和胞外基質(zhì)組分上的受體，所述組分包括膠原。10.—種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，含有(a)—種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；以及(b)至少一種結(jié)合于所述VWF分子的生理學(xué)可接受的聚合物分子；所述構(gòu)建體具有結(jié)合至少一種Fvm分子或Fvm的生物活性衍生物的能力，其中結(jié)合于所述構(gòu)建體的所述FVIII分子的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子的體內(nèi)半衰期相比有增加。11.如權(quán)利要求io所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的所述Fvm分子的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合于所述構(gòu)建體的Fvm分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少大約1.5倍。12.如權(quán)利要求io所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的所述Fvm分子的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少大約2倍。13.如權(quán)利要求1或10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述VWF或所述其生物活性衍生物是重組產(chǎn)物。14.一種復(fù)合體，包含如權(quán)利要求1或10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體和至少一種FVIII分子或其生物活性衍生物。15.如權(quán)利要求14所述的復(fù)合體，其特征在于，所述FVIII分子或其生物活性衍生物是重組產(chǎn)物。16.—種用于延長哺乳動物血液中FVIII或其生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期的方法，所述哺乳動物具有與FVIII功能性缺乏或不足有關(guān)的出血病癥，所述方法包括下述步驟(a)將最初劑量的至少一種如權(quán)利要求1或IO所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體給藥于所述哺乳動物；以及(b)將最初劑量的至少一種Fvm分子或其生物活性衍生物給藥于所述哺乳動物。17.—種用于延長哺乳動物血液中FVIII或其生物活性衍生物以及VWF或其生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期的方法，所述哺乳動物具有與FVIII和VWF的至少一種功能性缺乏有關(guān)的出血病癥，所述方法包括下述步驟(a)將最初劑量的至少一種如權(quán)利要求1或IO所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體給藥于所述哺乳動物；以及(b)將最初劑量的至少一種FVIII分子或其生物活性衍生物給藥于所述哺乳動物。18.—種用于延長哺乳動物血液中凝血因子VIII(Fvm)或其生物活性衍生物以及VWF或其生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期的方法，所述哺乳動物具有與FVIII和VWF的至少一種功能性缺乏或不足有關(guān)的出血病癥，所述方法包括下述步驟(a)提供至少一種如權(quán)利要求1或IO所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體；(b)提供至少一種FVIII分子或其生物活性衍生物；以及(C)形成所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體與所述FVIII分子或其生物活性衍生物的復(fù)合體。19.一種用于延長哺乳動物血液中凝血因子VIII(Fvm)或其生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期的方法，所述哺乳動物具有與FVIII功能性缺乏有關(guān)的出血病癥，或者具有與FVIII功能缺乏或不足有關(guān)的機能障礙，包括下述步驟(a)提供至少一種如權(quán)利要求1或10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體；(b)提供至少一種Fvm分子或其生物活性衍生物；以及(c)形成所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體與所述Fvni分子或其生物活性衍生物的復(fù)合體。20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于，將步驟(c)的復(fù)合體給藥于所述哺乳動物。21.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于，至少一種FVIII分子或其生物活性衍生物與所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體同時給藥。22.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于，至少一種FVIII分子或其生物活性衍生物在給藥所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體之前或之后順序地給藥。23.—種藥物組合物，包括有效量的如權(quán)利要求1、2、3或6所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，以及一種或多種選自藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑、鹽、緩沖劑和賦形劑的化合物。24.—種藥物組合物，其包括有效量的如權(quán)利要求10、11或12所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，以及一種或多種選自由藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑、鹽、緩沖劑和賦形劑所組成的組的化合物。25.—種復(fù)合體，其包括(a)蛋白質(zhì)構(gòu)建體，它含有；(i)一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；和(ii)至少一種結(jié)合于所述VWF分子的生理學(xué)可接受的聚合物分子；以及(b)至少一種結(jié)合于所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物；其中所述復(fù)合體的體內(nèi)半衰期同結(jié)合于VWF的FVin的體內(nèi)半衰期相比有增加。26.如權(quán)利要求25所述的復(fù)合體，其特征在于，所述復(fù)合體的體內(nèi)半衰期同結(jié)合于VWF的FVIII的體內(nèi)半衰期相比增加到至少大約1.5倍。27.如權(quán)利要求25所述的復(fù)合體，其特征在于，所述復(fù)合體的體內(nèi)半衰期同結(jié)合于VWF的FVIII的體內(nèi)半衰期相比增加到至少大約2倍。28.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至-少一個碳水化合物殘基的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)氧化所述VWF分子上的碳水化合物殘基；c)使所述碳水化合物殘基與含有酰肼基團的PEG試劑接觸；以及d)使所述試劑PEG酰肼共價結(jié)合于所述VWF上的至少一個碳水化合物殘基，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，使用化學(xué)氧化劑進行所述步驟(b)的氧化。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)氧化劑是Na104。31.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，使用酶促氧化劑進行所述步驟(b)的氧化。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述酶促氧化劑是半乳糖氧化酶。33.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由線性烷氧基PEG、線性雙官能團PEG、分枝PEG、多臂PEG、分岔PEG、附著于多元醇核的PEG、具有穩(wěn)定鍵的PEG、具有可降解鍵的PEG和具有可水解鍵的PEG所構(gòu)成的組。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑具有選自由均聚物、交替共聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規(guī)三聚體和嵌段三聚體所組成的組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。35.—種通過如權(quán)利要求28所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。36.如權(quán)利要求35所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比增加到至少大約1.5倍。37.如權(quán)利要求35所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比增加到至少大約2倍。38.如權(quán)利要求35所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少大約1.5倍。39.如權(quán)利要求35所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或Fvm的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述Fvm分子或所述Fvm的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少大約2倍。40.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，以大約0.1大約200mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。41.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，以大約1.0大約25mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。42.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個伯氨基團的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使所述VWF分子上所述伯氨基團與PEG試劑接觸；以及c)使所述PEG試劑共價結(jié)合于所述VWF上的所述伯氨基團，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。43.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述伯氨基團包含于所述VWF分子的賴氨酸殘基上。44.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述伯氨基團包含于所述VWF分子的N-末端上。45.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由N-羥基琥珀酰亞胺酯、PEG碳酸酯、含羧基的PEG衍生物和含有醛基的PEG衍生物所構(gòu)成的組。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述試劑為選自由PEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、PEG-琥珀酰亞胺基戊二酸酯、PEG琥珀酰亞胺基丁酸酯、PEG-琥珀酰亞胺基己酸酯、可降解PEG試劑和可水解PEG試劑所組成的組的N-羥基琥珀酰亞胺酯類。47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述試劑是PEG的對硝基苯基碳酸酯或PEG的琥珀酰亞胺基碳酸酯。48.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述試劑選自含有羧基的PEG衍生物，使用水溶性碳二亞胺可以將所述PEG衍生物所含的羧基偶聯(lián)于伯氨基團。49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述試劑是PEG丙醛，通過還原性胺化作用可以將其偶聯(lián)于伯氨基團。50.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和通過還原性胺化作用共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個伯氨基團的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使含有醛基的PEG試劑與所述VWF分子上的賴氨酸殘基接觸，從而在溶液中形成席夫堿；c)使所述溶液與還原劑接觸以形成仲酰胺鍵；以及d)使所述PEG試劑共價結(jié)合于所述VWF分子，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一個凝血因子(FVm)分子或FVIII的生物活性衍生物。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，還原劑是NaCNBH3。52.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述伯氨基團是所述VWF分子上的N-末端氨基，并且將所述N-末端氨基選擇性地PEG化。53.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由線性垸氧基PEG、線性雙官能團PEG、分枝PEG、多臂PEG、分岔PEG、附著于多元醇核的PEG、具有穩(wěn)定鍵的PEG、具有可降解鍵的PEG和具有可水解鍵的PEG所構(gòu)成的組。54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑具有選自由均聚物、交替共聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規(guī)三聚體和嵌段三聚體所組成的組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。55.—種通過如權(quán)利要求50所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。56.如權(quán)利要求55所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。57.如權(quán)利要求55所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。58.如權(quán)利要求55所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。59.如權(quán)利要求55所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。60.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，以大約0.1大約200mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。61.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，以大約L0大約25mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。62.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個賴氨酸殘基的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使含有醛基的PEG試劑與所述VWF分子上的賴氨酸殘基接觸，從而在溶液中形成席夫堿；c)使所述溶液與反應(yīng)劑接觸以形成仲酰胺鍵；以及d)使所述PEG試劑共價結(jié)合于所述VWF分子，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一個凝血因子(Fvm)分子或Fvm的生物活性衍生物。63.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個游離的或生成的硫氫基的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使含有馬來酰亞胺基團的PEG試劑與所述VWF分子上的硫氫基接觸；以及c)使所述PEG試劑共價結(jié)合于所述VWF分子上的至少一個硫氫基，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一個凝血因子(FVin)分子或FVIII的生物活性衍生物。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由線性垸氧基PEG、線性雙官能團PEG、分枝PEG、多臂PEG、分岔PEG、附著于多元醇核的PEG、多枝PEG、具有穩(wěn)定鍵的PEG、具有可降解鍵的PEG和具有可水解鍵的PEG所構(gòu)成的組。65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑具有選自由均聚物、交替共聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無則三聚體和嵌段三聚體所組成的組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。66.—種通過如權(quán)利要求63所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。67.如權(quán)利要求66所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。68.如權(quán)利要求66所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。69.如權(quán)利要求66所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或fviii的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述fviii分子或所述fviii的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。70.如權(quán)利要求66所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。71.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，以大約0.1大約200mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，以大約1.0大約25mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。73.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個羧基的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使所述VWF分子上羧基與含有氨基的PEG試劑和水溶性碳二亞胺接觸，以形成酰胺鍵；以及c)使所述PEG部分共價結(jié)合于所述VWF，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。74.如權(quán)利要求73所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由線性垸氧基PEG、線性雙官能團PEG、分枝PEG、多臂PEG、分岔PEG、附著于多元醇核的PEG、多枝PEG、具有穩(wěn)定鍵的PEG、具有可降解鍵的PEG和具有可水解鍵的PEG所構(gòu)成的組。75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑具有選自由均聚物、交替共聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規(guī)三聚體和嵌段三聚體所組成的組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。76.—種通過如權(quán)利要求73所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。77.如權(quán)利要求76所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。78.如權(quán)利要求76所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。79.如權(quán)利要求76所述的構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVm分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。80.如權(quán)利要求76所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或fviii的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述fviii分子或所述fviii的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。81.如權(quán)利要求73所述的方法，其特征在于，以大約0.1大約200mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。82.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，以大約1.0大約25mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。83.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子的PEG部分，所述PEG部分未結(jié)合于所述VWF分子的FVin結(jié)合位點，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使所述VWF分子上的FVIII結(jié)合位點與因子Vin結(jié)合位點保護劑接觸，從而形成具有受保護的FVIII結(jié)合位點的VWF分子；c)使步驟(b)中所述VWF分子上的活性部位與PEG試劑接觸；d)使所述PEG試劑共價結(jié)合于所述VWF分子；以及e)使所述FVIII結(jié)合位點保護劑與所述VWF分子分離，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種凝血因子(FVIII)分子或FVIII的生物活性衍生物。84.如權(quán)利要求83所述的方法，其特征在于，所述因子VIII結(jié)合位點保護劑包含于親和柱上。85.如權(quán)利要求83所述的方法，其特征在于，所述因子VIII結(jié)合位點保護劑選自由因子VIII、FVIII衍生物、肝素和肝素衍生物所構(gòu)成的組。86.如權(quán)利要求83所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由線性垸氧基PEG、線性雙官能團PEG、分枝PEG、多臂PEG、分岔PEG、附著于多元醇核的PEG、多枝PEG、具有穩(wěn)定鍵的PEG、具有可降解鍵的PEG和具有可水解鍵的PEG所構(gòu)成的組。87.如權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑具有選自由均聚物、交替共聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規(guī)三聚體和嵌段三聚體所組成的組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。88.—種通過如權(quán)利要求83所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。89.如權(quán)利要求88所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。90.如權(quán)利要求88所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。91.如權(quán)利要求88所述的構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVin分子或所述FVin的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。92.如權(quán)利要求88所述的構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVni分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。93.如權(quán)利要求83所述的方法，其特征在于，以大約0.1大約200mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。94.如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，以大約1.0大約25mgPEG/mgVWF蛋白質(zhì)比率提供所述PEG試劑。95.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個賴氨酸殘基的聚唾液酸(PSA)部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使含有醛基的PEG試劑與PSA接觸，從而在溶液中形成席夫堿；c)使所述溶液與還原劑接觸以形成仲酰胺鍵；以及d)使所述PSA共價結(jié)合于所述VWF上的至少一個賴氨酸殘基，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。96.如權(quán)利要求95所述的方法，其特征在于，所述還原劑是NaCNBH3。97.—種根據(jù)如權(quán)利要求95所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。98.如權(quán)利要求97所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。99.如權(quán)利要求97所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。100.如權(quán)利要求97所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。101.如權(quán)利要求97所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。102.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價交聯(lián)于所述VWF分子的聚唾液酸(PSA)部分，所述方法包括-a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使所述VWF分子與含有PSA和戊二醛的溶液接觸；以及c)使所述PSA共價結(jié)合于所述VWF，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。103.—種通過如權(quán)利要求102所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。104.如權(quán)利要求103所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。105.如權(quán)利要求103所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。106.如權(quán)利要求103所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或Fvm的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述Fvm分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。107.如權(quán)利要求103所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或Fvm的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述Fvni分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。108.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個碳水化合物殘基的PSA部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)氧化所述VWF分子上的碳水化合物殘基；c)使所述碳水化合物殘基與含有酰肼基團的PSA試劑接觸；以及d)使所述PSA試劑共價結(jié)合于所述VWF上的至少一個碳水化合物殘基，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。109.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，使用酶促氧化劑進行所述步驟(b)的氧化。110.如權(quán)利要求109所述的方法，其特征在于，所述酶促氧化劑是半乳糖氧化酶。111.一種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個賴氨酸殘基的透明質(zhì)酸(HA)部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使HA溶液與氧化劑接觸以形成活化的HA;c)使所述VWF分子與所述活化HA接觸，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種因子FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。112.—種通過如權(quán)利要求111所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。113.如權(quán)利要求112所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。114.如權(quán)利要求112所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。115.如權(quán)利要求112所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。116.如權(quán)利要求112所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。117.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子上至少一個碳水化合物基團的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使所述VWF分子上的碳水化合物基團與氧化酶接觸，從而在所述VWF上形成氧化的碳水化物部分；c)使所述VWF上的所述氧化的碳水化物部分與含有酰肼基團的PEG試劑接觸；以及d)使所述PEG部分共價結(jié)合于所述VWF，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。118.—種通過如權(quán)利要求U7所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。119.如權(quán)利要求U8所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。120.如權(quán)利要求U8所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。121.如權(quán)利要求118所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。122.如權(quán)利要求U8所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。123.—種用于形成蛋白質(zhì)構(gòu)建體的方法，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體含有VWF分子和共價結(jié)合于所述VWF分子的PEG部分，所述方法包括a)提供一種VWF分子，其選自由源于血漿的vonWillebrand因子(VWF)、重組VWF、VWF的生物活性衍生物、及它們的二聚體和多聚體所組成的組；b)使所述VWF分子與PEG試劑接觸以形成溶液；c)將所述溶液置于灌注腔，通過使用蠕動泵在所述VWF分子上產(chǎn)生剪切應(yīng)力；以及d)使所述PEG試劑共價結(jié)合于所述VWF，從而形式所述構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比有增加，并且其中所述構(gòu)建體能夠結(jié)合至少一種FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物。124.如權(quán)利要求123所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由N-羥基琥珀酰亞胺酯、PEG碳酸酯、含羧基的PEG衍生物和含有氨基的PEG衍生物所構(gòu)成的組。125.如權(quán)利要求123所述的方法，其特征在于，所述PEG試劑選自由PEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、PEG-琥珀酰亞胺基戊二酸酯、PEG琥珀酰亞胺基丁酸酯、PEG-琥珀酰亞胺基己酸酯、經(jīng)由易于水解的酯鍵或者酰胺鍵而連接的可水解的PEG、mPEG-(羧甲基)-3-羥基丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、PEG-對硝基苯基碳酸酯、以及PEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯所組成的組。126.—種通過如權(quán)利要求123所述的方法制備的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。127.如權(quán)利要求126所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。128.如權(quán)利要求126所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體的體內(nèi)半衰期同VWF分子的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。129.如權(quán)利要求126所述的構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少1.5倍。130.如權(quán)利要求126所述的構(gòu)建體，其特征在于，結(jié)合于所述構(gòu)建體的FVIII分子或FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期同未結(jié)合所述構(gòu)建體的所述FVIII分子或所述FVIII的生物活性衍生物的體內(nèi)半衰期相比，增加到至少2倍。131.如權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子結(jié)合于所述VWF或所述VWF的生物活性衍生物的碳水化合物殘基。132.如權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子結(jié)合于所述VWF或所述VWF的生物活性衍生物的賴氨酸殘基。133.如權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子選自由聚(烷撐二醇)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(羥烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(a-羥基酸)、聚乙烯醇、聚磷腈、聚惡唑啉，以及聚(N-丙烯酰嗎啉)所構(gòu)成的組。134.如權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。135.如權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子是聚唾液酸(PSA)或其衍生物。136.如權(quán)利要求IO所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，包含在所述構(gòu)建體中的所述VWF在VWF的最初止血中保持生物活性，所述生物活性包括結(jié)合于血小板上和胞外基質(zhì)組分上的受體，所述組分包括膠原。137.如權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子選自由聚(烷撐二醇)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡硌垸酮)、聚(羥垸基甲基丙烯酰胺)、聚(羥垸基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(a-羥基酸)、聚乙烯醇、聚磷腈、聚惡唑啉、以及聚(N-丙烯酰嗎啉)所構(gòu)成的組。138.如權(quán)利要求25所述的復(fù)合體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。139.如權(quán)利要求26所述的復(fù)合體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。140.如權(quán)利要求26所述的復(fù)合體，其特征在于，所述生理學(xué)可接受的聚合物分子是聚唾液酸(PSA)或其衍生物。全文摘要本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體(也稱為聚合物-VWF偶聯(lián)物)，其包含血漿的和/或重組的vonWillebrand因子(VWF)，所述VWF結(jié)合于至少一種生理學(xué)可接受的聚合物分子，而且還涉及一種所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體與至少一種凝血因子Ⅷ(FⅧ)蛋白質(zhì)的復(fù)合體。該生理學(xué)可接受的聚合物分子例如可以是聚乙二醇(PEG)或聚唾液酸(PSA)。本發(fā)明進一步涉及到一種用于延長哺乳動物血液中VWF或FⅧ的體內(nèi)半衰期的方法，其中哺乳動物具有與FⅧ或VWF中的至少一種功能性缺乏或不足有關(guān)的出血病癥。文檔編號A61K47/48GK101163506SQ200580044598公開日2008年4月16日申請日期2005年12月23日優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日發(fā)明者于爾根·西克曼,弗里德里·沙伊夫林格爾,皮特·圖雷切克申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司