專利名稱：用于治療變態(tài)反應和腫瘤細胞增殖的反義寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及針對特異性細胞受體的、單獨或組合的反義寡核苷酸的用途，以便抑制全身性炎癥(包括與哮喘和變態(tài)反應相關的炎癥)和嗜酸性粒細胞增多癥。本發(fā)明還涉及反義寡核苷酸抑制腫瘤細胞增殖如癌癥的用途。
背景技術：
反義寡核苷酸是一類新的藥物。一般來說，反義指小的合成寡核苷酸的用途，所述寡核苷酸與存在于人DNA或RNA中的寡核苷酸具有相同組成。反義寡核苷酸設計為它們所靶向基因的一部分的互補序列，以便能夠附著于該序列并抑制基因表達。通過反義寡核苷酸與特異性信使RNA(mRNA)有義靶按照Watson-Crick堿基配對的雜交使基因表達受到抑制，在Watson-Crick堿基配對中，腺嘌呤和胸腺嘧啶(在mRNA中為尿嘧啶)或鳥嘌呤和胞嘧啶通過氫鍵鍵合相互作用。兩種機制可解釋這些作用，第一種機制是損害被靶向mRNA翻譯的雜交，第二種機制是誘導降解mRNA的RNA酶H或類似酶。該策略的主要優(yōu)勢在于作用的特異性以及較少的副作用和毒性，尤其是在施用于作用位點時(局部治療)。該治療策略可潛在地應用于一般認為一種或幾種基因的過表達引起疾病發(fā)生或遷延的任何疾病。因此，已有眾多反義寡核苷酸用作癌癥和病毒性疾病治療劑的研究。
反義寡核苷酸可用于抑制白介素(IL)-6受體表達，由此抑制急性炎癥介導物白介素-6對細胞的作用。已進行了幾個研究來評價反義寡核苷酸是否可用于抑制涉及炎癥(包括但不限于與哮喘相關的炎癥和與特應性疾病和變態(tài)反應相關的炎癥)的細胞或癌細胞上的其它受體。
哮喘是一種侵襲5-10％人群的疾病，在最近的25年中發(fā)病率已加倍。尤其在病毒感染氣管(細支氣管炎)后的嬰兒、兒童和職業(yè)誘發(fā)性哮喘中注意到這種增加。變應原經常引發(fā)與哮喘相關的復發(fā)性呼吸問題，但哮喘的確切病因尚不知曉。然而，一般認為病毒之類的因子涉及存在于哮喘患者氣管中的異常炎癥的永續(xù)性，因此涉及病情的遷延。
為此，現時推薦的哮喘一線治療是有效的抗炎藥物，例如含皮質類固醇和抗白細胞三烯的藥物。盡管該治療在許多患者中有效，但一些患者對皮質類固醇有抗性。該藥物還是具有長期副作用的有效免疫抑制劑，未表明其有效預防變態(tài)反應或哮喘。抗白細胞三烯在變態(tài)反應和哮喘中有一些作用，但不如皮質類固醇有效。
幾種炎癥介導物在哮喘患者氣管中的炎癥出現和永續(xù)性方面起作用。一些介導物或者通過嗜酸性粒細胞的趨化性(趨化因子RANTES、嗜酸性粒細胞趨化因子1、2、3、MCP-3、4，它們主要通過稱為CCR3的受體在哮喘性炎癥中起作用)或者通過內皮細胞作用(IL-4、-13)吸引炎性細胞進入氣管。其它介導物引起氣管中炎性細胞的致敏和存活增加(IL-3、-4、-5、GM-CSF)。這些介導物因此或者由嗜酸性粒細胞的特異性趨化因子構成，或者由T輔助淋巴細胞2型表型的細胞因子(Th2IL-3、-4、-5、-6、-9、-10、-13和GM-CSF)構成(John AE.和Lukacs NW.，2003 Sarcoidosis Vase Diffuse Lung Dis.，20180-189；Blease等，2003，Expert Opin Emerg Drugs.871-81)。業(yè)已表明，當氣管中的這些炎癥介導物減少時，哮喘和全身性呼吸道炎癥改善。
變態(tài)反應是一種對引起不需要的免疫應答的變應原的超敏反應。變態(tài)反應是一種極為普遍的疾病，例如侵襲約30％人群的特應性鼻炎和結膜炎。變態(tài)反應的特征在于異常的IgE產生和對變應原的炎癥。在IgE和變應原存在的情況下，效應細胞如肥大細胞脫粒并釋放炎性介導物，導致哮喘中可見的相同炎性細胞的募集。在變應性鼻炎(即枯草熱)、變應性結膜炎、鼻息肉病、慢性竇炎和濕疹如特應性皮炎中，人們發(fā)現炎性介導物如同哮喘中存在的炎性介導物一樣過量。IL-4和IL-13是生產IgE和誘導Th2表型細胞所必需的(BarnesPJ.，2003，Cytokine Growth Factor Rev.14511-522；Schuh等，2003，Cytokine Growth Factor Rev.2003，14503-510)。特應性疾病是通過接觸變應原發(fā)生的變應疾病的總稱，尤其是在具有易于對變應原敏化的遺傳傾向性的個體中。具有這些誘病因素的個體容易對食源性抗原和吸入物出現異常免疫應答。變應疾病的一些具體實例為支氣管哮喘、特應性皮炎、風疹、變應性鼻炎、變應性結膜炎和變應性胃腸炎。
腫瘤是一種不可控和進行性的異常組織生長。惡性腫瘤經常以癌癥為特征。癌癥在人類中是第二致死病因，是以永生化細胞的異常增殖為特征的100多種疾病的總稱。涉及這些細胞的持久性和增加的機制之一是釋放通過受體起作用并導致細胞增殖的生長因子。在這些生長因子中，已表明GM-CSF是幾種腫瘤細胞的重要生長因子。最近，趨化因子受體CCR3被表征為由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和毛細胞白血病(HCL)患者回收的惡性B淋巴細胞，(Trentin等，2004，Blood，104，502-508)。實際上，已發(fā)現表皮生長因子受體(EGFR)通過CCR-3趨化因子受體的反式激活作用是引起支氣管上皮細胞中MAP激酶活化和細胞因子產生的關鍵途徑(Adachi等，2004，Biochem.Biophys.Res.Commun.320，292-396)。通過阻斷生長因子和/或趨化因子的受體來抑制癌細胞增殖可能在某些癌癥的治療中很重要。
嗜酸性粒細胞是一類白細胞。它們是具有核和胞質的粒性白細胞，所述核通常具有兩個通過染色質細線連接的葉，所述胞質包含尺寸均一并可由曙紅染色的成層(course)圓粒。嗜酸性粒細胞增多癥的特征在于嗜酸性粒細胞的數量增加，經常與變態(tài)反應、哮喘和感染相關。
針對編碼受體的特異性核酸序列的寡核苷酸用于抑制炎性反應的某些用途是已知的。Renzi的PCT申請?zhí)朩O 99/66037描述了用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥的反義寡核苷酸。具體地說，Renzi的寡核苷酸針對的核酸序列編碼CCR3受體、IL-4和IL-3受體的共同亞基或IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同亞基。其中還公開了一種鑒別為107A(5′-GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3′)的反義寡核苷酸，其針對IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基。
對于潛在的臨床用途，反義寡核苷酸應當表現出抗血清和細胞核酸酶降解的穩(wěn)定性，顯示出與血清和細胞蛋白的低非特異性結合，具有增強的靶mRNA序列識別，表現出細胞膜透過性，并在與互補mRNA復合時激發(fā)細胞核酸酶。文件已充分證明，含天然糖(D-核糖和D-2-脫氧核糖)和磷酸二酯(PO)鍵的寡核苷酸被血清和胞內核酸酶快速降解，這限制了其作為有效治療劑的用途。業(yè)已描述了對寡核苷酸的化學策略性修飾，以便提升其作為治療劑的穩(wěn)定性和效力。主要的化學改變包括糖部分、堿基部分的修飾和/或核苷酸間磷酸二酯鍵的修飾或替代。迄今為止，最廣泛研究的類似物是磷酸二酯主鏈中的其中一個非橋接氧原子被硫取代的硫代磷酸酯(PS)寡脫氧核苷酸(Eckstein F.，1985，Ann.Rev.Biochem.，54367-402)。已開發(fā)出幾種反義寡核苷酸生產方法，并用于體外和體內研究(Goodchild J.，2004，Curr.Opin.Mol.Ther.，2004，6120-128；Urban E.和R.Noe CR.，2003，Farmaco.58243-258)。
最近，Renzi等描述了2′，6′-二氨基嘌呤(DAP)及其類似物在抗炎組合物核分子中的用途(PCT申請?zhí)朩O 03/004511 A2)。在該文獻中還描述了相比于無DAP的寡核苷酸體內生理效力增加和毒性降低的核分子的制備。Renzi等進一步教導DAP置換具體用于制備針對肺部/呼吸系統(tǒng)疾病的寡核苷酸，所述疾病例如為囊性纖維化、哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病、嗜酸性粒細胞性支氣管炎、變態(tài)反應、變應性鼻炎、肺纖維化、成人呼吸窘迫綜合癥、竇炎、呼吸道合胞體病毒或其它病毒性呼吸道感染以及癌癥。
應當需要具有另外的反義寡核苷酸，其針對Th2細胞因子的至少一種特異性共同受體或介導物(其吸引響應Th2細胞因子的細胞)的受體，以便抑制在哮喘或變態(tài)反應中存在的炎性反應，以及抑制腫瘤細胞增殖。
還應當高度需要具有另外的反義寡核苷酸，其針對受體編碼核酸序列，以便通過抑制這些受體使這些寡核苷酸可用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥。
發(fā)明概述本發(fā)明提供反義寡核苷酸的用途，所述反義寡核苷酸針對細胞受體的至少一種共同亞基(例如IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基)或趨化因子受體CCR3，以便治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
在另一方面，本發(fā)明提供針對IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，以便通過抑制這些受體使所述反義寡核苷酸可用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
本發(fā)明還提供針對趨化因子CCR3受體的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，以便通過抑制該受體使所述反義寡核苷酸可用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
本發(fā)明還提供治療有效量的組合物，其包含至少一種針對IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基或CCR3受體的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
本發(fā)明還提供治療有效量的組合物，其包含兩種各自針對IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基或CCR3受體的編碼核酸序列的反義寡核苷酸，用于改善在治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種中的作用。
按照另一方面，本發(fā)明提供一種方法，用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、全身性炎癥和癌癥中的至少一種，所述方法包括給予一種或多種針對細胞受體的至少一種共同亞基(例如IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基)或CCR3受體的反義寡核苷酸。
本發(fā)明試圖提供任何前述的反義寡核苷酸以及以已知方式修飾的化學修飾反義寡核苷酸，其在機體內具有改進的穩(wěn)定性，同時表現出提升的有效性和降低的毒性。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的反義寡核苷酸。所述寡核苷酸針對編碼受體的核酸序列，所述受體選自CCR3趨化因子受體以及IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基，具有選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列。
按照本發(fā)明的另一方面，提供至少一種寡核苷酸用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的用途。優(yōu)選地，使用含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14兩個序列的寡核苷酸。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的藥物組合物，其包含至少一種寡核苷酸連同藥物可接受的載體。優(yōu)選地，所述至少一種寡核苷酸含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14兩者。
按照本發(fā)明的另一方面，提供所述藥物組合物用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的用途。
按照本發(fā)明的另一方面，提供一種治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的方法，所述方法包括以下步驟給予有效量的(i)至少一種寡核苷酸或(ii)含至少一種寡核苷酸連同藥物可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明在此還涉及對反義寡核苷酸的修飾，所述修飾不顯著地不利影響反義寡核苷酸降低靶蛋白活性或抑制靶蛋白表達的能力，但其可增強該能力。
附圖簡述本發(fā)明優(yōu)選實施方案的這些特征和其它特征在以下的詳述中將變得更明顯，在詳述中參考附圖，其中

圖1A顯示了由獼猴IL-3、IL-5和GM-CSF受體基因共同β鏈的PCR擴增獲得的3個克隆與人TOP004補體序列周圍的對應人、黑猩猩、豬、大鼠和小鼠直系同源物的序列比對。
圖1B顯示了在克隆的獼猴、人、黑猩猩、豬、大鼠和小鼠共同β鏈DNA序列中TOP004補體節(jié)段周圍的翻譯區(qū)的預測氨基酸序列。
圖2A顯示了與未處理的細胞相比，通過改變獼猴PBMC中的TOP004濃度降低β鏈(βc)mRNA表達的情況。
圖2B顯示了與未處理的細胞相比，通過改變獼猴PBMC中的TOP005濃度降低CCR3 mRNA表達的情況。
圖3A顯示了與未處理的細胞相比，獼猴PBMC中的不同TOP004濃度降低β鏈(βc)細胞表面蛋白表達的情況。
圖3B顯示了與未處理的細胞相比，獼猴PBMC中的不同TOP005濃度降低CCR3細胞表面蛋白表達的情況。
圖4A顯示了與未處理的細胞相比，通過改變獼猴PBMC中的ASM8濃度降低β鏈(βc)mRNA表達的情況。
圖4B顯示了與未處理的細胞相比，通過改變獼猴PBMC中的ASM8濃度降低CCR3 mRNA表達的情況。
圖5顯示了寡核苷酸對HL60分化細胞中的CCR3 mRNA表達的作用。與對G3PDH表達無作用的對照和有義寡核苷酸相比時，針對CCR3的反義寡核苷酸A86顯示出降低CCR3 mRNA表達。
圖6顯示了在寡核苷酸處理的HL-60 c1-15細胞中的鈣動員測定。與對照和有義寡核苷酸處理的細胞相比，在A86處理細胞中響應于嗜酸性粒細胞趨化因子的動員下降。
圖7顯示了寡核苷酸作用于純化人嗜酸性粒細胞對嗜酸性粒細胞趨化因子的趨化反應的情況。將A86處理的嗜酸性粒細胞的相對趨化反應與對照和有義寡核苷酸處理的細胞對比。
圖8顯示了響應于嗜酸性粒細胞趨化因子的寡核苷酸處理嗜酸性粒細胞中的鈣動員測定。對比A86處理的嗜酸性粒細胞和對照或有義寡核苷酸處理的細胞中的鈣動員。
圖9顯示了TOP005對CCR3的細胞表面表達的作用，以Eol-1和U937細胞中相對于對照的表達百分率來表示。
圖10顯示了TOP005對人PBMC中的mRNA表達的作用。顯示G3PDH和CCR3表達的凝膠示于條圖上。CCR3 mRNA表達對G3PDH的比率相對于對照標準化，示于底部。
圖11A顯示了調節(jié)107A處理的TF-1細胞中的β鏈(βc)mRNA表達，使用RT-PCR以檢測β鏈(βc)mRNA表達或對照G3PDH mRNA表達。
圖11B和11C顯示了有義寡核苷酸和107A處理對TF-1細胞的細胞表面上β鏈表達的作用，其通過FACS分析測定。
圖11D顯示了TOP004在mRNA和蛋白水平上對U937細胞中的共同β鏈表達的作用。
圖12顯示了在GM-CSF、IL-3或IL-5存在下107A處理的TF-1細胞的增殖。
圖13A顯示了107A對嗜酸性粒細胞存活率的調節(jié)，其使用錐蟲藍染色排除測定來評價。
圖13B顯示了107A對嗜酸性粒細胞存活率的調節(jié)，其通過使用Annexin-V-FITC和碘化丙啶方案的流式細胞術分析來評價。
圖14顯示了使用DEAE陰離子交換層析的ASM8單個產物(TOP004和TOP005)的洗脫譜。
圖15顯示了用CH3COOH處理3小時并進行堿裂解后，通過DEAE陰離子交換層析分級分離后的ASM8洗脫譜。
圖16顯示了用CH3COOH處理6小時并進行堿裂解后，通過DEAE陰離子交換層析分級分離后的ASM8洗脫譜。
圖17A1、17A2、17B1和17B2顯示了在不同溫度下儲存并隨后使用DEAE陰離子交換層析洗脫后，ASM8的化學穩(wěn)定性。
圖18顯示了在1×PBS中TOP004和TOP005的解鏈曲線。
圖19顯示了基于1×PBS中TOP004和TOP005的解鏈曲線擬合結果的熱力學總結。
圖20A和20B顯示了在用高劑量ASM8處理后1天，在猴血漿中的TOP004和TOP005及其代謝物的濃度。
圖21A和21B顯示了在用高劑量ASM8處理后14天，在猴血漿中的TOP004和TOP005及其代謝物的濃度。
發(fā)明詳述幾種炎癥介導物在哮喘患者氣管中的炎癥出現和永續(xù)性方面起作用。一些介導物通過嗜酸性粒細胞的趨化作用吸引炎性細胞進入氣管。這些趨化因子中有許多主要通過CCR3受體在哮喘或變應性炎癥中起作用。其它介導物在氣管或皮膚中引起炎性細胞致敏和存活率增加，例如IL-3、IL-5和GM-CSF。業(yè)已表明，當氣管中的這些炎癥介導物減少時哮喘改善。
此外，釋放通過受體起作用并導致細胞增殖的炎癥介導物和/或生長因子，可引起特征為永生化細胞異常增殖的癌癥。其中，已表明GM-CSF是幾種腫瘤細胞的重要生長因子。趨化因子受體CCR3表征為由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和毛細胞白血病(HCL)患者回收的惡性B淋巴細胞，(Trentin等，2004，Blood，104，502-508)。實際上，已發(fā)現EGFR通過CCR-3的反式激活作用是引起支氣管上皮細胞中MAP激酶活化和細胞因子產生的關鍵途徑(Adachi等，2004，Biochem.Biophys.Res.Commun.320，292-396)。通過阻斷生長因子受體或趨化因子受體CCR3來抑制癌細胞的增殖和轉移可能在某些癌癥的治療中很重要。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種鑒別為828(5′-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3′，(SEQ ID NO.1))并針對CCR3趨化因子受體的新反義寡核苷酸。本文公開的實例表明，828有效降低或阻斷人細胞系中的CCR3 mRNA表達。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供基于先前公開的107A和上述828的新反義寡核苷酸TOP004和TOP005。同107A一樣，TOP004(5′-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3′(SEQ ID NO.13)，其中X代表腺苷殘基的DAP修飾)是19聚體，針對IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈的 mRNA。同828一樣，TOP005(5′-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3′(SEQ ID NO.14)，其中X代表腺苷殘基的DAP修飾)是21聚體，針對趨化因子受體CCR3的mRNA。含TOP004和TOP005這二者的組合物被鑒別為ASM8的一部分。
如本文所公開的，TOP004和TOP005在非人靈長類動物系統(tǒng)中具有活性，因此驗證獼猴對安全性評價的用途。圖1顯示了獼猴共同β鏈基因的測序。與TOP 004互補的獼猴β鏈序列顯示出顯著同源性。獼猴和人β鏈序列之間非常高度的同一性提示，TOP004在獼猴中可能有功能活性。TOP 004和TOP 005在猴外周血單核細胞中阻斷或降低共同β鏈和CCR3表達的有效性示于圖2、3和4。結果表明，針對人基因靶的TOP004和TOP005在獼猴外周血單核細胞(PBMC)中均有效降低其對應靶的表達。含TOP004和TOP005這二者的ASM8顯著抑制共同β鏈表達和CCR3受體，在較低濃度時程度較高或者程度相同。因此，TOP004和TOP005一起在阻斷β鏈和CCR3 mRNA表達方面表現出協(xié)同作用。而且，在表7和8中，分析取自ASM8處理猴的氣管樣品的mRNA表達水平。靶基因的表達對炎性細胞因子(IL-4和TNF-α)的mRNA水平標準化。在ASM8處理的動物中，即便在給予ASM8后約24小時，βc-亞基和CCR3 mRNA對IL-4 mRNA的相對表達分別下降達29％和24％，相對于TNF-α的表達分別下降達30％和24％。
在圖5-10中，測試針對CCR3 mRNA的反義寡核苷酸(包括A86和TOP005)在人細胞和細胞系中的效力。當通過半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(“RT-PCR”)評價時，反義寡核苷酸引起CCR3 mRNA表達抑制。此外，使用FACS分析表明，CCR3蛋白的細胞表面表達同樣受到反義寡核苷酸處理的抑制。而且，通過用嗜酸性粒細胞趨化因子刺激后抑制純化的嗜酸性粒細胞中的鈣(Ca++)動員，證實CCR3的功能性抑制。另外，在趨化性測定中，所述寡核苷酸抑制嗜酸性粒細胞趨化性達55％。
在圖11-13中，107A和TOP004反義寡核苷酸用于處理各種細胞。與107A溫育的TF-1細胞顯示降低的β鏈mRNA表達。107A還在IL-3、IL-5或GM-CSF存在下抑制TF-1細胞增殖。而且，107A以劑量依賴性方式降低IL-5對嗜酸性粒細胞的抗凋亡作用。與TOP004溫育的U937細胞在mRNA和蛋白水平上顯示降低的共同β鏈表達。因此，反義107A和TOP004在阻斷β鏈mRNA、蛋白表達方面高度有效，在阻斷人細胞培養(yǎng)物中相關的細胞反應方面有功能。
在圖14-17B2中，通過在改變的條件下洗脫組合物顯示了ASM8的穩(wěn)定性。使用基于DEAE陰離子交換高效液相層析(HPLC)的分級分離系統(tǒng)洗脫ASM8，以評價ASM8及其降解產物在不同溫度儲存后的完整性。ASM8組分在-20℃、4℃、30℃或40℃儲存達2個月時不經歷任何可檢測的降解。
在圖18-19中，所提供的ASM8的解鏈曲線和熱力學總結表明，兩條寡核苷酸鏈在溶液中不顯著相互作用。
在圖20-21中，檢測ASM8寡核苷酸組分及其初級代謝物(n-1)在猴血漿樣品中的濃度。在非臨床毒性實驗中收集樣品，其中動物通過吸入處理連續(xù)14天。
因此提供針對IL-3、IL-5和GM-CSF的共同β亞基和CCR3受體并因此針對其編碼核酸的反義寡核苷酸。還提供包含所述寡核苷酸和藥物可接受載體的藥物組合物。描述了所述寡核苷酸的用途和包含給予所述寡核苷酸的方法，用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
術語“核酸”和“核酸分子”在本文可互換使用，指由核苷酸(即核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或這兩者)組成的分子。該術語包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的單體和多聚物，其中在多聚物情況下核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸經5′-3′鍵而連接在一起。但是，鍵可以包括核酸合成領域已知的任何鍵，包括例如含5′-2′鍵的核酸。用于核酸分子的核苷酸可以是天然的，或者可以是能與天然堿基對形成堿基配對關系的合成產生的類似物。能形成堿基配對關系的非天然堿基的實例包括但不限于氮雜和脫氮嘧啶類似物、氮雜和脫氮嘌呤類似物以及其它雜環(huán)堿基類似物，其中嘌呤和嘧啶環(huán)的一個或多個碳原子和氮原子已經被雜原子如氧、硫、硒、磷等取代。
本文所用術語“核酸主鏈”指連接分子中核苷酸的化學部分的結構。這可以包括由任何方式的化學連接核苷酸形成的結構。本文所用的修飾主鏈包括對核苷酸間化學鍵的修飾，以及可用于增強穩(wěn)定性和親合性的其它修飾，如對糖結構的修飾。例如可以使用脫氧核糖的[α]-異頭物，其中堿基相對于天然[β]-異頭物是反向的。在一個優(yōu)選實施方案中，糖基的2′-OH可以改變成2′-O-烷基或2′-O-烷基-n(O-烷基)，其提供了對降解的抗性而不影響親合性。
本文使用的術語“寡核苷酸”指含約1到約100個核苷酸、更優(yōu)選1到80個核苷酸，甚至更優(yōu)選約4到約35個核苷酸的核酸分子。
本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還包括siRNA(小干擾RNA)和由于RNAi(RNA干擾)方法而含有它們的RISC(RNA誘導的沉默復合物)。RNA干擾(RNAi)方法最近已有描述，被認為是抑制靶基因表達的新工具。幾年前就已經知曉，RNAi基于低等真核生物中的古老抗病毒防御機制。它由雙鏈RNA誘導，雙鏈RNA被加工成21-23 nt的小干擾RNA(siRNA)，其在RISC復合物幫助下與單鏈形式靶mRNA雜交后引起同源的內源mRNA降解。RNAi的工作方式仍未完全闡明，但其已在廣泛的真核生物物種如線蟲、蠅、植物、真菌和哺乳動物中用作產生功能喪失表型的首選方法。
本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物還包括核酶以及單鏈或雙鏈的RNA或DNA的短核苷酸序列，其可以摻入如上所述的化學修飾，能體外和/或體內抑制基因轉錄和/或翻譯。
術語“修飾的寡核苷酸”和“修飾的核酸分子”包括例如已通過插入或缺失1個或多個堿基而被修飾但對其活性沒有顯著不利作用的反義寡核苷酸化合物。具體地說，一般可在與它們針對的基因具有100％互補性的寡核苷酸末端實施堿基的加入或缺失，而不顯著喪失抑制活性。可實施這樣的修飾，以便增加寡核苷酸活性或提供增強的寡核苷酸穩(wěn)定性。另外，還可在本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物中實施1個或多個堿基的置換，而對活性沒有不利作用，例如用另一個嘌呤(腺嘌呤、鳥嘌呤)置換嘌呤，以及用嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)置換嘧啶。本文使用的修飾的寡核苷酸和修飾的核酸分子還包括含寡核苷酸在內的核酸，其在所有或任意的核酸堿基、糖部分、核苷間磷酸鍵的天然分子結構的分子水平上具有一個或多個化學修飾，以及包括具有附加取代基(如二胺、膽甾基或其它親脂性基團)的分子，或在這些位點的修飾的組合。核苷間磷酸酯鍵可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯氨基磷酸酯(phosphoranidate)、橋聯亞甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯硫代磷酸酯和/或砜核苷間鍵，或3′-3′、2′-5′或5′-5′鍵，以及這些相似鍵的組合(產生混合的主鏈修飾的寡核苷酸)。修飾可以在寡核苷酸分子的內部(單個的或重復的)或在末端，并且可以包括加到核苷間磷酸酯鍵的分子上，如膽甾基、在氨基之間具有不同數目碳殘基的二胺化合物以及末端核糖、脫氧核糖和磷酸酯修飾，所述修飾切割或交聯到相對鏈或締合的酶或其它蛋白。親電基團如核糖二醛可以與這種蛋白的賴氨酰殘基的ε-氨基共價連接。親核基團如束縛至寡聚物的n-乙基馬來酰亞胺可共價連接到mRNA的5′端或另一個親電位點。術語修飾的寡核苷酸還包括含有糖部分修飾的寡核苷酸，例如2′-取代的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體，任何它們通過5′-3′鍵連接在一起。修飾的寡核苷酸還可以由PNA或嗎啉代修飾的主鏈組成，其中序列的靶特異性得以保持。術語修飾的寡核苷酸還包括如本文定義的寡核苷酸化合物，其形式不顯著地不利影響反義寡核苷酸降低靶蛋白活性或抑制靶蛋白表達的能力，但其可增強該活性。
修飾的寡核苷酸還包括基于阿糖核苷酸或修飾的阿糖核苷酸殘基或由其構建的寡核苷酸，包括但不限于基于β-阿拉伯呋喃糖及其類似物的反義寡核苷酸構建物。阿糖核苷酸是核糖核苷酸的立體異構體，差別僅在于糖環(huán)2′-位的構型。Damha等(1)的PCT申請?zhí)朩O99/67378公開了阿糖核酸(ANA)寡聚物及其類似物，它們通過結合互補信使RNA提升了對基因表達的序列特異性抑制，該文獻通過引用整體結合到本文中。Dahma等進一步教導了糖被修飾的寡核苷酸，其與其靶RNA序列形成雙鏈體，產生RNA酶H的底物。具體地說，公開了包括β-D-阿糖核苷酸和2′-脫氧-2′-氟代-β-D-阿糖核苷的寡聚物。也是Dahma等(2)的PCT申請?zhí)朩O 02/20773公開了用于以序列特異性方式抑制基因轉錄和表達的寡核苷酸嵌合體，該文獻通過引用整體結合到本文中。具體地說，Dahma等(2)教導了由阿糖核苷酸構建的反義寡核苷酸，其位于一系列長度可變的脫氧核糖核苷酸殘基的側翼。如此構建的反義寡核苷酸用于雜交和誘導切割互補RNA。也是Dahma等(3)的PCT申請?zhí)朩O 03/037909公開了具有內部無環(huán)連接殘基的寡核苷酸，該文獻通過引用整體結合到本文中。用無環(huán)連接基團制備的反義寡核苷酸用于阻止或削弱目標靶核酸如RNA的功能。也是Dahma等(4)的PCT申請?zhí)朩O 03/064441公開了具有糖被修飾的核苷和2′-脫氧核苷的交替節(jié)段、并還具有糖被修飾的核苷酸和2′-脫氧核苷酸的交替節(jié)段的寡核苷酸，該文獻通過引用整體結合到本文中。公開了具有這些交替節(jié)段的反義寡核苷酸，用于阻止或削弱目標靶核酸如RNA的功能。
術語“基本抗核酸酶的”指與天然或未修飾的核酸相比抗核酸酶降解的核酸。本發(fā)明的修飾核酸的核酸酶降解抗性是其未修飾對應物的至少1.25倍，更優(yōu)選是其未修飾對應物抗性的至少2倍，甚至更優(yōu)選是其未修飾對應物抗性的至少5倍，最優(yōu)選是其未修飾對應物抗性的至少10倍。這種基本抗核酸酶的核酸包括但不限于具有修飾主鏈的核酸，所述修飾主鏈如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、乙基磷酸三酯、2′-O-甲基硫代磷酸酯、2′-O-甲基-對-乙氧基核糖核苷酸、2′-O-烷基、2′-O-烷基-n(O-烷基)、3′-O-烷基、3′-O-烷基-n(O-烷基)、2′-氟、2′-脫氧-赤戊呋喃糖基、2′-O-甲基核糖核苷、氨基甲酸甲酯、碳酸甲酯、反向堿基(如反向T)或這些主鏈的嵌合形式。
本文使用的術語“CCR3受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的反義寡核苷酸”各自指分別靶向序列的寡核苷酸，所述序列影響CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的表達和/或活性。這些寡核苷酸包括但不限于CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈、DNA編碼序列、DNA啟動子序列、DNA增強子序列、mRNA編碼序列等。
如上所述，本發(fā)明的一個實施方案提供靶向序列的反義寡核苷酸，該序列影響CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的表達和/或活性。在一個實施方案中，所述反義寡核苷酸可包含這些序列的片段或變體，本領域技術人員會理解，所述片段或變體可改變寡核苷酸組成和/或長度，但保持或增加寡核苷酸下調基因表達的活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供至少兩個反義寡核苷酸的組合，所述兩個反義寡核苷酸來自鑒別為SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14的序列。
本文所用術語“處理”、“治療”、“療法”等一般表示獲得期望的藥理和/或生理作用。這種作用可以是預防性的，即完全或部分預防疾病或其癥狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全治愈疾病和/或減輕疾病引起的不利作用。本文所用“處理”涵蓋對如先前定義的對象中疾病的任何處理，所述對象尤其是人，包括(a)預防對象發(fā)生疾病，所述對象可能容易發(fā)生該疾病但仍未診斷為具有該疾??；(b)抑制疾病，即停止其發(fā)展；或(c)緩解疾病，即引起疾病消退。
術語“藥物可接受的”在本文中用于載體、表面活性劑和組合物時表示可接受用于治療患者對象的物質，所述物質無毒或對于通過本文所述任何途徑給予來說不是不可接受的。
本發(fā)明一般涉及通過給予治療有效量的本發(fā)明反義寡核苷酸化合物而治療對象，所述化合物包括siRNA、核酶、單鏈或雙鏈的短核苷酸序列，包括可與靶核酸互補或可任選地如上所述修飾的RNA和/或DNA；具有所述RNA寡核苷酸的至少一部分的RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸能與RNA雜交形成寡核苷酸-RNA雙鏈體；或嵌合寡核苷酸，它們將下調或抑制內源性基因體內表達。
所述“治療有效”量指無毒性但足以提供期望治療效果的反義寡核苷酸化合物的量。在此情況下，該劑量的反義寡核苷酸化合物有效緩解、改善、或預防待治療病癥或疾病(如與變態(tài)反應、哮喘、炎性疾病如炎性呼吸道疾病相關的疾病)的癥狀。
本文使用的術語“變態(tài)反應”描述了機體對物質的任何不期望的免疫應答，機體對所述物質已變成超敏性的。
本發(fā)明的制劑優(yōu)選直接給予作用部位，因此優(yōu)選是局部制劑，包括但不限于口服、頰內、肺內、直腸、子宮內、腫瘤內、經鼻、鞘內、可吸入、透皮、皮內、腔內、離子導入、經眼、陰道、關節(jié)內、經耳、經粘膜、直腸、緩釋或腸溶包衣制劑。不限于任何前述制劑，本發(fā)明的制劑還可為顱內、肌內、皮下、血管內、腺體內、器官內、淋巴內、腹膜內、靜脈內和可植入制劑。用于制劑的載體可以是例如固體和/或液體載體。
對于應適于與本發(fā)明的寡核苷酸化合物組合，以使組合物/制劑適于給予來治療呼吸系統(tǒng)疾病的其它載體，可以參考“Remington′sPharmaceutical Sciences”，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985。
任選地，當前描述的寡核苷酸可與各種生理載體分子配制。當前描述的寡核苷酸還可與增強其進入靶細胞的能力的分子復合。這種分子的實例包括但不限于糖、聚胺、氨基酸、肽、脂質和對細胞生長不可或缺的分子。例如，寡核苷酸可與脂質組合，產生的寡核苷酸/脂質乳濁液或脂質體懸浮液尤其可有效增加寡核苷酸的體內半壽期。
本文提供的藥物組合物可包含上述反義寡核苷酸化合物和一種或多種藥物可接受的表面活性劑。增強本發(fā)明的反義寡核苷酸吸收的適宜表面活性劑或表面活性劑成分先前已描述于美國申請公開第2003/0087845號，該申請中關于表面活性劑的內容結合到本文中。該申請?zhí)岢?，合適的表面活性劑“...包括合成和天然以及全長和截短形式的表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、表面活性蛋白E、二飽和磷脂酰膽堿(除了二棕櫚酰以外)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、泛醌、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、棕櫚酰溶血磷脂酰膽堿、脫氫表雄酮、多萜醇、硫苷脂酸(sulfatidic acid)、甘油-3-磷酸、磷酸二羥基丙酮、甘油、甘油-3-磷酸膽堿、二羥基丙酮、棕櫚酸、胞嘧啶二磷酸(CDP)二?；视?、CDP膽堿、膽堿、磷酸膽堿；以及天然和人工片狀體，它們是以下表面活性劑成分的天然載體溶媒ω-3脂肪酸、多烯酸(polyenicacid)、多烯酸(polyenoic acid)、卵磷脂、棕櫚酸、環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷的非離子性嵌段共聚物、單體和多聚體形式的聚氧丙烯、單體和多聚體形式的聚氧乙烯、具有右旋糖酐和/或烷?；鶄孺湹木?乙烯胺)、Brij35TM、Triton X-100TM和合成表面活性劑ALECTM、ExosurfTM、SurvanTM和AtovaquoneTM等。這些表面活性劑可作為制劑中的單一表面活性劑或多組分表面活性劑的一部分使用，或作為對反義寡核苷酸的5′和/或3′末端的共價結合添加物使用?！北景l(fā)明組合物的反義組分可包含在脂質顆粒或囊泡(如脂質體或微晶)中的藥用制劑中。如美國專利6,025,339所述，脂質顆粒可以是任何合適的結構，如單層或多層，只要所述反義寡核苷酸包含于其中。帶正電的脂質如乙基硫酸N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基銨或“DOTAP”，對于這樣的顆粒和囊泡是特別優(yōu)選的。這種脂質顆粒的制備是公知的。參見例如Janoff等的美國專利第4,880,635號、Kurono等的4,906,477號、Wallach的4,911,928號、Wallach的4,917,951號、Allen等的4,920,016號、Wheatley等的4,921,757號；等等。
本發(fā)明的組合物可以用運輸反義寡核苷酸化合物到期望部位如肺的任意方式給予。本文公開的反義化合物可通過任何合適的方式給予患者的肺，但優(yōu)選通過氣溶膠吸入給予，所述氣溶膠由包含反義化合物的可呼吸顆粒組成。
本發(fā)明的組合物可以作為包含可呼吸大小的顆粒的制劑給予呼吸系統(tǒng)，例如顆粒大小小到足以在吸入時通過鼻、口和咽喉并穿過肺的支氣管和肺泡。一般來說，可呼吸顆粒大小范圍在約0.5到10微米之間。包含在氣溶膠中的不可呼吸大小的顆粒傾向于沉積在咽喉并被吞咽，因此氣溶膠中不可呼吸顆粒的量優(yōu)選最少化。對于經鼻給予，優(yōu)選10-500微米(μM)范圍的顆粒大小，以確保保留在鼻腔中。
可以通過將反義化合物與合適的溶媒如無菌無熱源水或磷酸緩沖鹽水混合，制備用于產生氣溶膠的活性化合物(反義寡核苷酸化合物)的液體藥物組合物。
含反義化合物的固體顆粒組合物可以任選含有用于輔助形成氣溶膠的分散劑以及其它治療性化合物。合適的分散劑是乳糖，它可以與反義化合物以任意合適的比例混合，如1∶1的重量比。
反義組合物可以抗支氣管收縮、抗變態(tài)反應和/或抗炎有效量給予，該量取決于待治療疾病的程度、患者對象的身體狀況、具體制劑、給藥途徑、向對象給藥的時間安排等。一般來說，期望寡核苷酸細胞內濃度是0.05-50μM，或更具體的0.2-5μM。對于向哺乳動物患者如人給藥，一般使用約0.001、0.01、0.1或1mg/Kg直至約50或100mg/Kg或更多的劑量。但是，也考慮了其它劑量。根據活性化合物在任何具體制劑中的溶解性，每日劑量可以分成一個或幾個單位劑量給予。
含反義化合物的液體顆粒的氣溶膠可通過任意合適的手段產生，如用噴霧器。噴霧器是通過使壓縮氣體(通常是空氣或氧氣)加速通過狹窄的文丘里噴嘴或者經超聲攪動的方式，將活性成分的溶液或懸液轉化成治療性氣溶膠霧的商品裝置。用于噴霧器的合適制劑包含在液體載體中的活性反義寡核苷酸成分，其量可達制劑的40％(重量/重量)，優(yōu)選少于制劑的20％(重量/重量)。載體一般是水或稀的醇水溶液，優(yōu)選通過加入例如氯化鈉而與體液等滲。任選的添加劑包括防腐劑如羥基苯甲酸甲酯(如果制劑不是無菌制備的話)、抗氧化劑、抗細菌劑、調味劑、揮發(fā)性油、緩沖劑和乳化劑以及其它的制劑表面活性劑。
包含活性寡核苷酸化合物和藥物可接受表面活性劑的固體顆粒氣溶膠同樣可用任何固體顆粒藥物氣溶膠發(fā)生器產生。用于向對象給予固體顆粒藥物的氣溶膠發(fā)生器產生可呼吸的顆粒(如上所釋)，并以適于人給藥的速率產生一定體積的氣溶膠，其中含預定計量的藥物劑量?；钚怨押塑账岢煞忠话阏贾苿┑?.1-100重量/重量。第二類示例性氣溶膠發(fā)生器包括計量劑量吸入器。計量劑量吸入器是加壓氣溶膠分散器，一般含有活性成分在液化推進劑中的懸液或溶液制劑。使用時這些裝置通過適用于遞送計量體積(一般為10-150μL)的閥門釋放制劑，以產生含活性成分的細顆粒噴霧。合適的推進劑包括某些氯氟碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或氫氟烷及其混合物。制劑還可以含有一種或多種助溶劑(如乙醇)、乳化劑和其它制劑表面活性劑(如油酸或失水山梨醇三油酸酯)、抗氧化劑和合適的調味劑。
無論是由固體還是液體顆粒形成的氣溶膠，都可通過氣溶膠發(fā)生器以約1-150升/分鐘的速率產生。
在本發(fā)明的再一方面，提供一種制品，它包括包裝材料，包裝材料內含有藥物可接受的反義寡核苷酸組合物，該組合物治療學有效地治療與變態(tài)反應、哮喘、鼻炎和炎癥疾病相關的病癥。在一個實施方案中，組合物包含可有效抑制CCR3趨化因子受體基因或IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈基因的反義寡核苷酸化合物，所述寡核苷酸化合物與該基因至少50％互補。在另一方面，組合物包含至少兩種反義寡核苷酸化合物，反義寡核苷酸化合物各自能下調CCR3趨化因子受體和IL-3/IL-5/GM-CSF受體基因的共同β鏈，每種反義寡核苷酸化合物的存在濃度使得反義寡核苷酸化合物單獨使用時實際上不能有效下調所針對基因，而反義寡核苷酸化合物的組合有效下調反義寡核苷酸所針對基因中的至少一種。
在一個實施方案中，制品的包裝材料包含標簽，它指示組合物可用于治療炎癥呼吸系統(tǒng)疾病，并可另外包括所述疾病是變態(tài)反應、鼻炎和哮喘之一的說明。
在另一個實施方案中，制品的包裝材料包含標簽，它指示組合物可用于治療炎性呼吸系統(tǒng)疾病，并可另外包括所述疾病是變態(tài)反應、哮喘、嗜酸性粒細胞增多癥、支氣管炎、鼻炎或竇炎之一的說明。
對于本發(fā)明目的，包裝材料可以是包裝本發(fā)明的含核苷酸組合物的任何適宜材料，包括瓶或其它容器(塑料或玻璃)、紙盒、管或其它保護性包裝材料。人們將會意識到，包裝可以根據寡核苷酸組合物的性質而變化，例如液體制劑可以不同于氣溶膠制劑的形式包裝。
參考實施例將更容易理解本發(fā)明，給出這些實施例是為了闡述以下的本發(fā)明，而不是限制其范圍。就這些實施例而言，使用以下的方法和材料。
實施例材料和方法材料實驗使用以下的材料和試劑RPMI 1640(Wisent，目錄號10040CV)；FBS(胎牛血清，Wisent，目錄號80150)；青霉素-鏈霉素(GIBCO，目錄號15140-122)；HEPES(Wisent，目錄號26060CI)；L-谷氨酰胺(Gibco，目錄號25030-081)；丙酮酸鈉(Wisent，目錄號25000-Ci)；無菌PBS(GIBCO，目錄號25030-081)；Hanks平衡鹽溶液(HBSS，cellgro，目錄號20021-cv)；RT-PCR試劑盒的Superscript首鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen，目錄號11904-018)；dNTP(Invitrogen，目錄號10297-018；oligo(dT)12-18(Invitrogen，目錄號11904-018)；Qiagen RNAeasy Mini Kit(Qiagen，目錄號74106)；Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，目錄號28704)；Qiagen PCR提取試劑盒(Qiagen，目錄號28104)；β-巰基乙醇(Sigma，目錄號M-6250)；99％乙醇(Commercial alcohols Inc.，Brampton，Ontario，Canada)；QiaVac 24 Manifold(Qiagen，目錄號19403)；一次性Vacconnectors(Qiagen，目錄號19407)；DNase I試劑盒(Fermentas；目錄號ENO521)；RiboGreen定量試劑(Invitrogen-IMolecular probes，目錄號R-11490)；Taq PCR核心試劑盒(Qiagen，目錄號201223)；Hema-3染色套裝(Fisher scientific Co.目錄號122-911，批號999901)；Alamar Blue(Biosource，目錄號DAL1100)；人CCR3引物對(R&D systems，目錄號RDP-209-025)；人GAPE5H引物對(R&Dsystems，目錄號RDP-39-025)；Ficoll(Amersham Biosciences；目錄號17-1440-03)；抗-CD16(嗜酸性粒細胞純化試劑盒，Miltenyi Biotec，Auburn，CA，目錄號130-045-701)；rhEotaxin(Biosource，目錄號PMC1434)；趨化室和膜(NeuroProbe，Nucleopore-Neuroprobe，CabinJohn，MD)；人血清白蛋白(SIGMA；目錄號)；抗人IL-3/IL-5/GM-CSF受體β鏈(小鼠單克隆IgG2b；Santa Cruz Biotechnology，目錄號sc-457)；抗小鼠IgG2b(山羊單克隆，Alexa Fluor 488，Molecular Probes，目錄號A-21141)；抗人CCR3抗體(大鼠單克隆，IgG2a，R&D，目錄號MAB 155)；抗大鼠IgG(山羊單克隆，Alexa Fluor 633，Molecular Probes，目錄號A-21094)；rhGM-CSF(R&D systems，目錄號215-GM-005)；rhIL-3(R&D systems，目錄號203-IL-010)；rhIL-5(R&D systems，目錄號205-IL-005)；rhIL-2(R&D systems，目錄號202-IL-010)；TOP004-(n-1)(Biosource，在3′末端少一個核苷酸的寡核苷酸)；TOP005-(n-1)(Biosource，在3′末端少一個核苷酸的寡核苷酸)；TOP004-TP(Biosource，模板探針)；TOP004-(n-1-TP-T)(BiosourceBiosource，模板探針)；LP(Biosource，連接探針)；TOP005-TP(Biosource)；TOP004-(n-1-LP-A，Biosource)；Reacti-Bind中性抗生物素蛋白包被的高結合量平板(Pierce，目錄號15508)；T4 DNA連接酶5 U/mL(Roche，目錄號799 009)；抗DIG-AP抗體(Roche，目錄號1093274)；SuperBlock Blocking Buffer in PBS(Pierce，目錄號37515)；磷酸甲基傘形酯(methylumbellyferyl phosphate)堿性磷酸酶底物(Molecular Probes，目錄號M-6491)；含ASM8的猴血漿樣品；MW96板清洗器(Beckman Coulter)；96-孔大容量聚丙烯板(Nunc)；EppendorfResearch Brand的微量移液器；黑色不透明96-孔板(Costar，目錄號3915)。
反義寡核苷酸合成和序列鑒別用Gene Assembler-PlusTM(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)合成寡核苷酸，硫代磷酸酯化，并通過HPLC純化。TOP005用于圖5-7中闡述的實驗，所述實驗用cGMP寡核苷酸實施。反義序列和鑒別描述于表1。
表1
細胞和細胞培養(yǎng)使用以下的細胞系TF-1(人紅白血病細胞系，ATCC#CRL-2003)；EOL-1(人急性骨髓“嗜酸性”白血病細胞系；DSMZ#ACC386)和U937(人組織細胞淋巴瘤細胞系；ATCC#CRL-1593.2)。EOL-1和U937在具有2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mM Hepes、1mM丙酮酸鈉、10％FBS、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL的RPMI 1640中培養(yǎng)。TF-1培養(yǎng)使用相同培養(yǎng)基，只是以2ng/mL加入rhGM-CSF。
HL-60克隆15細胞培養(yǎng)和分化如Tiffany等，1998，J.Immunol 1601385-1392所述，將HL-60克隆15分化為嗜酸性粒細胞。簡單地講，早幼粒細胞細胞系HL-60于37℃和5％CO2中保持在具有L-谷氨酰胺、補加10％熱失活FBS和25mM N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-羥基丙磺酸](Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的RPMI 1640，pH 7.6中。通過用0.5μM丁酸(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)處理細胞至少5天，誘導細胞分化為嗜酸性粒細胞樣表型。在細胞分化后使用FACS分析評價IL-3/IL-5/GM-CSF受體的共同β鏈的存在情況。
細胞生存和反義處理使用Alamar Blue測試按照生產商的方法系統(tǒng)地測定細胞生存。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集EOL-1、TF-1、HL-60或U937細胞，用3×HBSS清洗，以1×106細胞/mL重懸浮在無血清的RPMI培養(yǎng)基中。一式三份將1×106細胞與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細管中溫育5分鐘。然后將各個反應物轉移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育5小時，用于mRNA定量，或溫育12小時，用于蛋白分析。加入RPMI/FBS 20％至10％FBS的終濃度，細胞于37℃、5％CO2中溫育過夜。離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細胞，用1×HBSS清洗。納入對照實驗，其由沒有反義寡核苷酸或存在錯配寡核苷酸的細胞處理組成。
人嗜酸性粒細胞的純化通過Ficoll-Hypaque梯度(1.077g/mL，350g，30分鐘)離心全血，獲得棕黃層，由此獲得粒細胞分離級分。用抗CD16包被的免疫磁性微珠于4℃使用磁性細胞分揀系統(tǒng)Miltenyi Biotec(Auburn，CA)通過負選擇進一步純化人嗜酸性粒細胞。通過Giemsa染色估計嗜酸性粒細胞群的純度一般為92％-100％。
人和獼猴PBMC的純化獼猴的新鮮血得自ITR Laboratories Canada Inc。通過對正常供體的EDTA K3血液進行Ficoll-Hypaque密度梯度離心，分離PBMC。將PBMC以2×106細胞/mL/孔接種在12孔平板中的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補加10％熱失活FBS、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL。細胞生存使用Alamar Blue評價，一般為85％-95％。
人PBMC和嗜酸性粒細胞轉染通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集人PBMC，用3×HBSS清洗，以2×106細胞/mL重懸浮在含10μg/mL PHA的RPMI培養(yǎng)基5％血清中。以一式三份將2×106細胞與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細管中溫育5分鐘。然后將各個反應物轉移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育過夜，用于mRNA定量，或溫育48小時或48小時以下(在指明時)，用于蛋白分析。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細胞，用1×HBSS清洗。納入對照實驗，其由在沒有反義寡核苷酸或存在錯配寡核苷酸的細胞處理組成。
通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集純化的人嗜酸性粒細胞，用3×HBSS清洗，以2.5×106細胞/mL重懸浮在2ng/mL rhGM-CSF或rhIL-5的RPMI培養(yǎng)基10％血清中過夜。第二天，用HBSS清洗細胞兩次，以2.5×106細胞/mL重懸浮在RPMI培養(yǎng)基5％血清中，一式三份與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細管中溫育5分鐘。然后將各個反應物轉移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育過夜，用于mRNA定量，或溫育48小時或48小時以下(在指明時)，用于蛋白分析。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細胞，用1×HBSS清洗。納入對照實驗，其由在沒有反義寡核苷酸或存在錯配寡核苷酸的細胞處理組成。
猴PBMC轉染通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集獼猴PBMC，用3×HBSS清洗，以2×106細胞/mL重懸浮在RPMI培養(yǎng)基5％血清和10μg/mLPHA(或10ng/mL rhIL-2，在指明時)中。以一式三份將2×106細胞與精確濃度的反義物(0-20μM)在無菌細管中溫育5分鐘。然后將各個反應物轉移到12孔平板中，于37℃、5％CO2中溫育過夜，用于mRNA定量，或溫育48小時或48小時以下(在指明時)，用于蛋白分析。通過離心(5分鐘、1500RPM，室溫)收集細胞，用1×HBSS清洗。納入對照實驗，其由在沒有反義寡核苷酸或存在錯配寡核苷酸的細胞處理組成。
流式細胞術分析計數細胞，并以1×106細胞/mL重懸浮。于20-25℃以400×g離心細胞3分鐘，廢棄上清液。此后，將細胞沉淀重懸浮在50μL FACS緩沖液(1×PBS，pH7.2-7.4；0.5％人白蛋白；2.5％人血清)中，37℃溫育30分鐘。不廢棄上清液，將一抗直接加入管中并混合。于4℃避光溫育1小時，(抗人CCR-3抗體以1μg/0.5×106細胞使用?？谷斯餐骆溡?μg/0.5×106細胞使用)。用2mL FACS緩沖液清洗，以400×g離心3分鐘，廢棄上清液。對于同種型對照，用300μL FACSFix(1×PBS，pH 7.2-7.4；4％多聚甲醛)重懸浮細胞沉淀，于4℃避光保持。
為標記CCR3和共同β鏈，用50μL FACS緩沖液重懸浮細胞沉淀，并加入二抗，(抗大鼠IgG2a Alexa Fluor 633以1μg/0.5×106細胞使用?？剐∈驣gG2b Alexa Fluor 488以2μg/0.5×106細胞使用)。4℃避光溫育1小時。用2mL FACS緩沖液清洗，以400×g離心3分鐘，并廢棄上清液。用300μL FACSFix固定標記細胞，于4℃避光保持。數據在BD biosciences FACS calibur中分析，用Cell Quest程序處理。
鈣動員測定嗜酸性粒細胞以1×107細胞/mL重懸浮在含10％FBS的RPMI1640中，通過與5M Fura-2AM(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)于室溫在黑暗中溫育30分鐘而負載。細胞(1×106細胞/mL)清洗3次，重懸浮在鹽水緩沖液(138mM NaCl、6mM KCl、1mM CaCl2、10mMHepes、5mM葡萄糖和1％BSA，pH 7.4)中。然后將各2mL的細胞懸浮液轉移至石英比色皿，將石英比色皿置于發(fā)光分光光度計LS50B(Perkin-Elmer，Beaconsfield，UK)中。通過記錄在趨化因子作用下于340和380nm順序激發(fā)后于510nm發(fā)射的熒光比率，檢測細胞的Ca2+動員。
趨化性測定使用具有5mm孔的無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(Nucleopore-Neuroprobe)，在48孔(NeuroProbe，Cabin John，MD)室中評價體外趨化性。對照或反義物處理的嗜酸性粒細胞以1×106細胞/mL懸浮在含0.25％BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基中。上層孔和下層孔分別含50μL和31μL細胞懸浮液，后一懸浮液補加優(yōu)化濃度的嗜酸性粒細胞趨化因子(80ng/mL)。在于37℃、5％CO2中溫育1小時后，記數存在于下層孔中的遷移細胞。在沒有嗜酸性粒細胞趨化因子的情況下測定自發(fā)遷移，并計算入結果中。
猴反義物處理和毒性研究該方法由ITR Laboratories Canada Inc.的動物關懷委員會(ACC)回顧和評價。所有動物都按照Canadian Council on Animal Care出版的現行“Guide to the Care and Use of Experimental Animals”和NIH出版物“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”概述的原則照料。
在連續(xù)14天內通過每日一次吸入接觸，給予由兩種寡核苷酸(TOP 004和TOP 005)的1∶1混合物組成的ASM8，在此期間研究所述ASM8的毒性，以表征其單個寡核苷酸組分的毒代動力學模式。還評價14天恢復期后ASM8的任何作用的可逆性。還評價14天吸入接觸ASM8后的任何系統(tǒng)性超敏狀況(可通過皮內注射(ID)檢測)。
溶媒對照制品是USP注射級0.9％氯化鈉溶液，按原樣使用。通過混合TOP 004和TOP 005與USP注射級0.9％氯化鈉溶液，以獲得1∶1混合物，制備用于氣溶膠化的測試制品(ASM8)的液體制劑。目標劑量的溶液濃度基于純寡核苷酸。因此，將根據純度調整的校正系數應用于測試制品組分的稱重和分配。對于TOP 004，校正系數是1.15，對于TOP 005，校正系數是1.24。在14天接觸期開始前，稱出每個每日接觸所需要的各相應寡核苷酸的量，混合(以粉末形式)在設計用于每日接觸的小瓶中，于-80℃冷凍儲存。在每日接觸時，由冷凍儲存中取出正確的小瓶，將內容物溶解在鹽水溶媒中，通過無菌0.2μm濾器過濾，制劑僅用于當天的接觸。
每組的動物數目和處理陳述于以下的表2和3
表2
體重范圍在第1天處理時為2-4kg年齡范圍在第1天處理時為青年表3ASM8接觸濃度和劑量水平(4)
(1)基于估計的2.5kg體重。
(2)溶媒對照動物接觸由溶媒溶液產生的氣溶膠，其氣溶膠濃度就質量而言一般被認為等于高劑量組產生的氣溶膠濃度。
(3)目標劑量和氣溶膠濃度基于測試制品的絕對純度，該絕對純度通過在劑量溶液配制過程中使用純度的合適校正系數獲得。
(4)使用下式DL＝Ec×RMV×T/BW估測接觸期當中獲得的劑量水平，其中DL＝獲得的劑量水平(mg/kg/天)Ec＝傳遞給動物的實際濃度(mg/L空氣)
RMV＝按照Bide等，2000，J.App.Toxicol.，20，273-290的公式估測的分鐘體積(mL/min)，該公式詳細為RMV(L)＝0.499×W(kg)0.809T＝時間，每日接觸的持續(xù)時間(分鐘)BW＝接觸期當中的平均體重(kg)假定此估測的所獲劑量100％沉積在呼吸道中。
對所有動物進行生命觀測，包括死亡率、臨床檢查、體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查、臨床病理、血漿水平測定、超敏檢驗。
在處理期結束時，麻醉動物，并進行解剖病理學檢驗、驗尸、器官重量檢驗、組織病理學檢驗。
在給予ASM8后24小時，使用半定量RT-PCR檢測對高劑量處理獼猴氣管樣品的共同β鏈和CCR3 mRNA表達是否存在任何的ASM8抑制作用。
用于猴血漿中的寡核苷酸檢測的HL-ELISA在給藥前的第1天和第14天、給藥后的0.5、1、3、6和24小時由各只動物收集猴血樣(各約1mL)。血樣于4℃離心，以產生血漿，分離血漿，在干冰上冷凍，直至使用雜交/連接ELISA定量測定對TOP004和TOP005(以及近似的n-1-代謝物)濃度進行測定分析。
通過連續(xù)稀釋猴血漿樣品制備寡核苷酸的標準曲線溶液。通常標準曲線的工作范圍是125nM至0.007629nM。適當稀釋血漿樣品，用于檢測標準曲線的線性范圍，制備一個以上稀釋度用于精確檢測。
將各個標準品或血漿樣品等份(200μL)分在96孔聚丙烯板中，其中將200μL適宜的模板探針溶液加至200μL血漿樣品中，37℃溫育60分鐘。以一式兩份將150μL轉移至NeutrAvidin包被的板，于37℃溫育30分鐘。使用板清洗器用清洗緩沖液清洗該板4次(每次200μL)。加入150μL連接探針溶液，之后于室溫溫育120分鐘。在溫育后，使用板清洗器用清洗緩沖液度清洗樣品2次(每次200μL)，之后使用板清洗器用ddH2O清洗3次(200μL)。加入150μL 1∶2000抗DIG-AP稀釋液(在Super block，Peirce中)，之后于室溫溫育30分鐘。使用板清洗器用清洗緩沖液清洗樣品4次(200μL)。然后加入150μL10μM MUP試劑，接著室溫溫育60分鐘。讀取355ex/485em的熒光。
用于HL-ELISA的溶液模板探針溶液(0.05μM模板探針、60mM Na2HPO4pH 7.4、0.9MNaCl、0.24％Tween-20)；10×連接緩沖液(0.8248M Tris-Cl pH 7.5，0.0828 M MgCl2、1.93％DTT)；ATP 100mM溶液(在水中制備，用NaOH調節(jié)至pH 7±0.5)；連接探針溶液(在1×連接緩沖液中的0.067μM寡核苷酸、0.025單位/mL T4 DNA連接酶、0.05mM ATP)；清洗緩沖液(25mM Tris-Cl pH 7.2、0.15M NaCl、0.1％Tween)。
猴氣管勻漿和RNA提取使用Polytron PT 1200(Brinkmann Instruments)勻漿猴氣管，使用Qiagen RNAeasy小型試劑盒(Qiagen，Mississauga ON，Canada)提取總RNA，接著進行DNA酶I消化。使用Ribogreen熒光測定(InvitrogenCorporation，Burlington ON，Canada)定量總RNA。使用SuperscriptTMIIRT試劑盒(Invitrogen Corporation，Burlington ON，Canada)，使用首鏈cDNA合成由1-2μg RNA制備cDNA。
RNA提取、逆轉錄和聚合酶鏈反應按照Qiagen RNAeasy小型試劑盒方法，使用Qiagen的QiaVac 24歧管由細胞沉淀提取RNA，按照Fermentas方法用DNA酶I處理RNA。使用RiboGreen試劑按照生產商的方法定量RNA。或者，使用分光光度計定量RNA。使用Invitrogen的RT-PCR試劑盒的Superscript首鏈合成系統(tǒng)以20μL總反應體積進行首鏈cDNA制備。簡單地講，首先于65℃使1-2.5μgRNA和0.5mM的每種dNTP、0.5μg oligo(dT)12-18變性5分鐘，于冰上冷凍至少1分鐘。混合物42℃溫育2分鐘，加入第二種預混合物，其含有1×首鏈緩沖液、10mMDTT、40單位RNaseOUT和40單位Superscript II RT。反應物于42℃溫育10分鐘，于50℃溫育1小時，通過于70℃加熱15分鐘失活。用在1×PCR緩沖液(10×Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、15mM MgCl2；pH 8.7)中的優(yōu)化量cDNA(對于CCR3為100-250ng，對于G3PDH為1-10ng)、0.2mM每種dNTP、8.5pmol每種PCR引物和2.5單位Taq DNA聚合酶以總反應體積50μL進行PCR。將混合物于94℃加熱5分鐘，接著進行30-35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃溫育1分鐘、60℃溫育45秒以及72℃溫育45秒。補充延伸于72℃進行10分鐘。在溴化乙錠存在下通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。使用Total Lab軟件(背景扣除采用滾球法；Ultra Lum Inc.，Model UC4800)進行PCR產物的定量。PCR引物是人CCR3引物對(R&D systems，目錄號RDP-209-025)；人GAPDH引物對(R&D systems，目錄號RDP-39-025)和示于表4的引物。系統(tǒng)性地納入對照實驗，其由對非RT-RNA進行的PCR組成。
表4.
寡核苷酸化學降解為在分析前誘導TOP 004和TOP 005降解(以便確保分辨完整分子和降解產物)，進行以下處理*脫嘌呤將ASM8以0.5mg/mL終濃度重懸浮在30％CH3COOH中，于室溫溫育3、4或6小時。通過加入5體積水終止反應，將混合物置于-20℃，然后在Speed-Vac中凍干，以去除乙酸。
*切割將脫嘌呤的寡核苷酸重懸浮在0.2M NaOH(0.5mg/mL)中，于50℃溫育1小時，儲存在-20℃或通過HPLC分析。
TOP004和TOP005的HPLC分級分離稱重ASM8，以0.5mg/mL的濃度(0.25mg/mL TOP004和0.25mg/mL TOP005)溶解在PBS中，HPLC梯度參數示于下表5。
表5.HPLC梯度參數
用聯結Waters 2487 Dualλ吸光度檢測器并配有在線脫氣器、烘箱和1500系列手動注射器Reodyne 7725i的Waters 1500系列二元HPLC泵進行HPLC分離。寡核苷酸混合物在Waters Protein Pak DEAE5PW陰離子交換柱(0.5cm×75cm)上分級分離，保持在60℃，通過260nm的UV吸收檢測。寡核苷酸混合物(體積＝25μL)在水中上柱(緩沖液A水(MilliQ級))，通過逐漸增加緩沖液B(1M LiClO4，(0.22μm過濾))的比例使液相的離子強度增加，由固相(柱)洗脫寡核苷酸，由此進行洗脫。
在測定條件下，62.5μg的TOP 004或TOP 005中的任一個于260nm產生的可檢測變化都＞0.15吸光度單位(AU)。
寡核苷酸儲存將等份的ASM8(0.5mg/mL)的PBS溶液于-20℃、4℃、30℃和40℃溫育2個月。在第4周和第8周時建立ASM8的HPLC譜。對照條件定義為任意儲存時間前(即時間0)的ASM8 HPLC譜。HPLC系統(tǒng)由Waters的BreezeTM(V 3.30)軟件驅動。
寡核苷酸解鏈曲線和熱力學總結表TOP 004和TOP 005以在1×PBS(以及其它緩沖系統(tǒng))中的等摩爾濃度混合?？偣押塑账釢舛仍诩s1.2-8.7mM的范圍內。使用帶有Tm附件的Beckman DU640分光光度計進行標準UV熱變性法。在10-90℃的每個溫度檢測260nm的吸光度變化。使用MELTWINTM3.5軟件擬合解鏈曲線，以測定熱力學參數。產生解鏈曲線和熱力學總表的屏幕圖像。
實施例1針對CCR3受體的反義寡核苷酸的效力分析幾種針對CCR3趨化因子受體的反義寡核苷酸抑制受體mRNA表達和抑制受體功能的能力。在Eol-1和U937細胞系中進行CCR3反義初級篩選。這些細胞在上述正常細胞培養(yǎng)條件下表達CCR3mRNA。表6顯示了針對人CCR3趨化因子受體的反義寡核苷酸。
參看表6，針對CCR3受體的反義寡核苷酸828(8285′-GTTACTACTTCCACCTGCCTG-3′SEQ ID NO.1)有效抑制受體的mRNA表達，如表6中所示。
寡核苷酸828針對CCR3基因，在外顯子1末端后的48個堿基處開始，21個堿基長。對828進行BLAST檢索，除了針對CCR3受體以外，下一個最接近的同源性報告為低于72％的同源性。對獲得兩個互補序列的完全結合來說，這被看作是無意義的同源性。使用錯配寡核苷酸(SEQ ID NO.32)評價828的特異性。錯配對CCR3mRNA或在這些實驗中用作內標的看家基因G3PDH沒有作用。因此，反義寡核苷酸828是特異性的。
表6
實施例2兩個DAP取代的寡核苷酸在猴外周血單核細胞(PBMC)中的效力如上所述，通過用DAP置換腺苷修飾反義寡核苷酸107A和828，以分別產生反義寡核苷酸TOP004和TOP005。同107A一樣，TOP004(5′-GGGTCTGCXGCGGGXTGGT-3′(SEQ ID NO.13)，其中X代表腺苷殘基的DAP修飾)是19聚體，針對IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈。同828一樣，TOP005(5′-GTTXCTXCTTCCXCCTGCCTG-3′(SEQ ID NO.14))是21聚體，針對趨化因子受體CCR3。
測試TOP004和TOP005這二者單獨的和組合的效力。ASM8是部分含TOP004和TOP005這二者的組合物。在猴外周血單核細胞(PBMC)中進行效力研究，以驗證該物種研究由ASM8藥理學活性產生的毒性作用潛力的用途。
為使ASM8在獼猴中有效，其與其靶序列必須存在足夠的同源性。獼猴β鏈序列不能由公開的數據庫獲得，因此克隆并測序包含TOP004序列區(qū)的節(jié)段。但是，可在相關的體外系統(tǒng)中直接評價靈長類物種間的TOP004活性。具體地說，外周血單核細胞(PBMC)制備物是測試TOP004功能性的合適系統(tǒng)，因為在大部分單核白細胞亞群(T和B細胞、單核細胞和巨噬細胞)上發(fā)現了共同β鏈。
僅可獲得獼猴CCR3受體編碼區(qū)的序列信息；在公開的數據庫中不能獲得TOP005結合區(qū)的序列信息。TOP005靶序列在人基因外顯子1末端后的48個堿基處開始；此內含子跨越超過20kbp，使其克隆和測序變得很冗長。文獻中的報告已表明，內含子序列中的某些節(jié)段在人和猴之間是保守的(Rahman等，2004.Genomics.8376-84)。進化研究也表明，在分類群(人、鯨和海豹)間存在同源內含子序列的節(jié)段，發(fā)現這些節(jié)段更經常地鄰近內含子-外顯子接合處(HareMP和Palumbi SR.，2003 Mol Biol Evol.20，969-978.)。在PBMC制備物中測試TOP005在猴中的功能性，其中在T和B細胞亞群上存在CCR3受體表達。
獼猴共同β鏈的測序人、黑猩猩、豬、小鼠和大鼠的IL3/IL-5/GM-CSF受體基因的共同β鏈的分析揭示，在脊椎動物間有高度的基因序列相似性。設計用于克隆PCR的引物序列。引物序列來源于在人、黑猩猩、豬、小鼠和大鼠中高度保守的核苷酸序列，它們在共同β鏈基因的TOP004寡核苷酸區(qū)周圍。表2顯示了不同的引物。這些引物用于擴增獼猴PBMC cDNA的特異性產物。獲得幾種PCR產物，這取決于使用的引物組。使用嵌套PCR循環(huán)評價獲得產物的特異性?？寺〔y序陽性擴增子。
圖1A顯示了得自獼猴TOP004區(qū)的PCR擴增的3個克隆(分別為SEQ ID NO.25、26和27)的序列，其與人序列(SEQ ID NO.28)和黑猩猩(SEQ ID NO.33)、豬(SEQ ID NO.34)、大鼠(SEQ ID NO.35)和小鼠(SEQ ID NO.36)核苷酸序列中的相應區(qū)比對。非同源核苷酸用小寫字母顯示，而保守區(qū)用大寫字母表示。TOP004區(qū)標下劃線。與TOP004區(qū)互補的獼猴β鏈序列在全部3個測序克隆中都顯示出顯著同源性(19個堿基中有18個相同)。在第6位發(fā)現差異(由TOP 004的5′末端開始)，其中“A”和“G”同時存在(“A”是預期堿基)。圖1B顯示了由克隆的獼猴(SEQ ID NO.37)和人(SEQ ID NO.38)、黑猩猩(emb.AADA01213660)(SEQ ID NO.39)、豬(U94688.1)(SEQ IDNO.40)、小鼠(NM_007780.1)(SEQ ID NO.41)和大鼠(NM_133555.1)(SEQ ID NO.42)的已知核苷酸序列預測的蛋白序列的比對。在第6位(由TOP 004的5′末端開始，其中“A”和“G”同時存在)存在的核苷酸差異對應于公開數據庫中可獲得的蛋白序列的共同β鏈中的谷氨酰胺(Q)或賴氨酸(K)密碼子的第二個堿基。圖1B中提供的數據表明，高度進化物種在TOP004互補區(qū)中含有谷氨酰胺殘基(在人、黑猩猩、豬中的箭頭)。谷氨酰胺由兩個密碼子CAA或CAG編碼。在低等物種(小鼠和大鼠)中，谷氨酰胺被賴氨酸殘基取代。賴氨酸由兩個密碼子AAA或AAG編碼。在任一種情況下，第2位的腺苷都是保守的。因此，腺苷殘基是有功能的猴序列的可能候選物，因為其存在于其它高等脊椎動物中。但是，不能排除GM-CSFβ鏈多態(tài)性。Freeburn等公開了β鏈受體的胞質內區(qū)中的幾個突變，其可能是易感白血病的原因，(Freeburn等，1997，Exp.Hematol.，25306-311)。圖1A中給出的測序數據表明，鳥苷殘基可存在于第6位，第6位由標下劃線的TOP004序列的5′末端開始。在此情況下，密碼子將為CGG，蛋白序列將在該位置包含精氨酸(R)殘基。該位置的堿性堿基(H、K或R)使人聯想到低等脊椎動物，不可能是靈長類動物的情況。
盡管有這種差異，但猴和人β鏈序列之間非常高度的同一性提示，TOP004在獼猴中有功能。
TOP004和TOP005在獼猴PBMC中的效力在獼猴PBMC中分別單獨地測試TOP004和TOP005選擇性降低β鏈和CCR3表達的能力。將純化的猴PBMC與不同濃度的TOP004和TOP005溫育。
參看圖2A和2B，條圖A和條圖B中給出了對由猴獲得的10個以上血樣進行的實驗結果。條圖顯示用TOP004(A)和TOP005(B)降低猴PBMC中的β鏈和CCR3 mRNA表達。抑制是TOP004和TOP005特異性的，不是因為RNA降解或細胞存活喪失，以內標為證(對應于G3PDH mRNA的451-bp產物和細胞存活檢驗)。根據RT-PCR檢測，TOP004特異性地降低初級猴PBMC中的共同β鏈表達(圖2A)。10-15μM濃度獲得最大效力，其中大部分觀察到＞50％的抑制。TOP004對猴β鏈的抑制證實了在人和猴β鏈mRNA序列之間顯示出非常高度的同一性的測序數據(圖1A)。同樣，根據RT-PCR檢測，TOP005轉染入猴PBMC中降低了CCR3 mRNA的表達(圖2B)。TOP005對CCR3 mRNA表達的最大抑制在低于β鏈所用濃度(10-15μM)的反義寡核苷酸濃度(0.05-2.5μM)獲得。
據RT-PCR檢測，mRNA表達抑制還在蛋白水平上得到流式細胞術(FACS)的確證。在不同濃度的TOP004或TOP005存在下，猴PBMC在生長培養(yǎng)基中溫育36小時。如上所述進行流式細胞術定量。參看圖3A和3B，條圖顯示了分別在TOP004和TOP005存在下獼猴PBMC中的β鏈和CCR3細胞表面表達。所述圖表明，在用TOP004或TOP005處理后，觀察到在7.5μM和0.5μM時表達β鏈和CCR3的細胞百分率分別獲得30％以上的下降。
還測試了以1∶1比率組合(ASM8)的TOP004和TOP005在獼猴PBMC中分別選擇性降低β鏈和CCR3表達的能力。猴PBMC在不同濃度的ASM8存在下溫育過夜，然后通過RT-PCR評價β鏈和CCR3的表達。參看圖4A和4B，顯示了5個以上得自猴的血液的條圖，代表在ASM8存在下獼猴PBMC中的β鏈和CCR3表達。在2.5-5μM的ASM8濃度范圍觀察到顯著的β鏈抑制(圖4A)，這低于單獨的TOP004獲得最大抑制的最佳濃度范圍(10-15μM(圖2A))。這些結果表明，相比于單獨的TOP004，TOP004和TOP005反義寡核苷酸的組合在阻斷β鏈表達方面提供了增強效力和ASM8的協(xié)同作用。同樣，根據RT-PCR的檢測，將ASM8轉染入猴PBMC中降低了CCR3 mRNA表達(圖4B)。TOP005對CCR3 mRNA表達的最大抑制在低于β鏈所用濃度(2.5-5μM)的反義寡核苷酸濃度(0.05-5μM)獲得。ASM8對CCR3抑制的作用明顯不是濃度依賴性的，該結果可能反映出對CCR3來說獲得最大抑制(穩(wěn)定值)的濃度低于β鏈所用濃度。
總之，獼猴共同β鏈測序表明了非常高度的同一性(含TOP004序列的19個堿基中的至少18個堿基相同)。預期與人基因的此高度同源性足以使TOP004與猴β鏈mRNA雜交，以誘導反義活性，由此降低其表達。
將TOP004轉染入純化的獼猴PBMC中，以評價其下調猴β鏈表達的能力。TOP004有效降低β鏈mRNA表達，據RT-PCR檢測達30-70％。
同樣，將TOP005轉染入獼猴PBMC中，通過半定量RT-PCR測定CCR3表達水平。結果表明，TOP005以30％-85％的范圍內下調獼猴CCR3表達。
同樣，根據流式細胞儀檢測，在猴PMBC中TOP004或TOP005的轉染于0.5μM(＞30％)時誘導β鏈或CCR3陽性的細胞數特異性降低。
還將ASM8轉染入純化的猴PBMC中，以評價組合處理(TOP004和TOP005)下調猴β鏈和CCR3 mRNA表達的效力。在這些條件下，根據RT-PCR檢測，在低至0.1-0.5μM的ASM8濃度時，ASM8顯著降低β鏈和CCR3的表達。這也提示，獼猴是在其中檢驗由于ASM8藥理學活性引起的潛在毒性作用的適宜物種。
實施例3針對CCR3的反義寡核苷酸在人細胞和細胞系中的作用實施進一步的實驗，以評價A86和TOP005在HL-60分化的嗜酸性粒細胞樣細胞(Lee Tiffany等，J.Immunol 1998，1601385-92)、U937和Eol-1細胞以及外周血單核細胞(PBMC)中抑制CCR3 mRNA表達的能力。還研究了A86和TOP005在HL-60細胞和純化的人外周血嗜酸性粒細胞這二者中抑制嗜酸性粒細胞遷移和鈣動員的能力。A86是反義寡核苷酸(5′CTG GGC CAT CAG TGC TCT G3′(SEQID NO.29)，對應于CCR3編碼區(qū)(外顯子7)的87-105核苷酸序列。如早前所論述，TOP005是828，但全部3個腺苷都被2，6-二氨基嘌呤取代(5′GTT XCT XCT TCC XCC TGC CTG 3′(SEQ ID NO.14))。828互補序列在外顯子1末端后的48個堿基處開始，21個堿基長?；パa有義寡核苷酸(5′CAG AGC ACT GAT GGC CCA G3′(SEQ IDNO.30))和錯配寡核苷酸(5′CGT GGC ACT CAG TGT CCT G3′(SEQID NO.31))用作A86的對照。錯配寡核苷酸(5′CCT TTG ACC TGCCAA TGC TCT 3′(SEQ ID NO.32))用作828/TOP005的對照。
A86反義寡核苷酸在HL-60克隆15來源的嗜酸性粒細胞中對CCR3mRNA表達的作用已知丁酸處理可誘導HL-60細胞的克隆15變體分化為具有外周血嗜酸性粒細胞的多種特征的細胞(Lee Tiffany等，J.Immunol 1998，1601385-92)。使用相同的分化方法，我們證實CCR3 mRNA在分化的HL-60細胞中的表達。然后進行RT-PCR，以檢驗合成寡核苷酸在分化為嗜酸性粒細胞的HL-60細胞中調節(jié)CCR3受體編碼mRNA表達的能力。在用10μM A86處理細胞后，使用內標G3PDH通過半定量PCR評價CCR3 mRNA?？俁NA分離自如上所述新鮮收集的細胞。參看圖5，顯示了針對CCR3的反義寡核苷酸在HL60分化細胞中對CCR3 mRNA表達的作用。與有義寡核苷酸和錯配寡核苷酸相反，反義寡核苷酸顯著抑制CCR3 mRNA表達。在有義寡核苷酸和錯配寡核苷酸處理的細胞中CCR3 mRNA表達明顯不同于在未處理細胞中獲得的CCR3 mRNA表達。而且，所有寡核苷酸在所使用的濃度都不影響G3PDH mRNA表達。因此，在此實驗中使用的反義寡核苷酸A86能夠特異性地抑制CCR3 mRNA的表達。
A86對CCR3蛋白細胞表面表達的作用進一步研究了CCR3 mRNA降低是否能反映出CCR3細胞表面蛋白密度的降低。就此而言，進行流式細胞術分析來評價用寡核苷酸處理后HL-60衍生的嗜酸性粒細胞上的CCR3受體表達。在丁酸處理后，表達CCR3受體的HL-60衍生的嗜酸性粒細胞的百分率為40％。當用有義和錯配寡核苷酸(10μM)處理時，陽性細胞的百分率稍微且不顯著地下降；陽性細胞的百分率分別為35％和38％。但是，在A86處理細胞上的CCR3受體密度顯著降低(陽性細胞為26％，相比之下在未處理細胞中為40％)。10μM的A86能夠降低CCR3細胞表面表達達65％。較高濃度的A86的作用更顯著。具體地說，使用20和30μM的A86，結果表明CCR3細胞表面表達分別降低達75％和85％。CCR3的反義寡核苷酸A86能夠以劑量依賴性方式抑制CCR3細胞表面表達。
A86對HL-60細胞中嗜酸性粒細胞趨化因子誘導的鈣動員的作用當趨化因子刺激表達其特異性受體的白細胞時，通常觀察到快速的瞬時鈣流動。這種鈣動員可通過Fura-2AM載荷細胞實時跟蹤，是受體活化的便利檢測方法。趨化因子嗜酸性粒細胞趨化因子是CCR3受體的特異性配體，在連接至受體時誘導快速鈣流動和白細胞趨化性。參看圖6，顯示了A86對CCR3活化的作用。與對照和有義寡核苷酸相比，A86處理細胞中響應于嗜酸性粒細胞趨化因子的鈣動員下降。以10μM濃度的A86寡核苷酸處理細胞。用有義寡核苷酸處理的細胞能夠響應于嗜酸性粒細胞趨化因子，未處理的細胞也是如此。在這些情況下，嗜酸性粒細胞趨化因子誘導胞內Ca++濃度增加。但是，在A86處理的細胞中，嗜酸性粒細胞趨化因子誘導少得多的Ca++動員。本文給出的結果表明，A86在HL-60細胞系中有效干擾CCR3受體活化。
用反義寡核苷酸處理純化的人嗜酸性粒細胞抑制純化的人嗜酸性粒細胞對嗜酸性粒細胞趨化因子的響應參看圖7，顯示了反義寡核苷酸對純化的人嗜酸性粒細胞對嗜酸性粒細胞趨化因子的趨化反應的作用。將純化的人嗜酸性粒細胞與10μM濃度的反義寡核苷酸(方塊)或有義寡核苷酸(圓形)在補加5％FCS和IL-5(1.5ng/mL)的RPMI 1640中溫育過夜。對照細胞(三角形)在無ODNS的相同條件下溫育。數據來自代表3個樣本的單個實驗，以每5個高倍視野中三份平行遷移細胞測定的遷移細胞平均數±SD給出。針對CCR3的反義寡核苷酸抑制嗜酸性粒細胞遷移，當嗜酸性粒細胞趨化因子濃度增加時這種抑制更顯著。在80ng/mL嗜酸性粒細胞趨化因子時，嗜酸性粒細胞遷移降低達55.6％。
圖8顯示了反義寡核苷酸處理的嗜酸性粒細胞中的鈣動員。當用A86(10μM)處理嗜酸性粒細胞時，與對照和有義寡核苷酸相比，嗜酸性粒細胞趨化因子誘導的Ca++動員也被抑制。
本文給出的結果表明，A86通過下調CCR3受體有效干擾嗜酸性粒細胞對嗜酸性粒細胞趨化因子的趨化性。
TOP005的效力使用TOP005進行相似的實驗。選擇TOP005是因為828的效力、表明828與已知基因沒有同源性的該序列BLAST評價結果、828與TOP004沒有雜交(以DNA軟件進行的實驗)及其長度(當混合在一起并通過陰離子交換HPLC分離時允許由TOP004分化)。
圖9表明了TOP005對CCR3的細胞表面表達的作用。在Eol-1和U937細胞中評價TOP005的效力。在用TOP005處理后36小時通過流式細胞術評價CCR3表達。結果以Eol-1和U937細胞中相對于對照的表達百分率表示。圖9中的條圖表明，TOP005抑制U937和Eol-1細胞表面上的CCR3蛋白表達。
圖10A和10B顯示了TOP005對人外周血單核細胞(PBMC)中的CCR3 mRNA表達的作用。人PBMC或者是新鮮分離的，或者在人IL-2中培養(yǎng)(10ng/mL，24小時)。然后使它們接觸TOP005，培養(yǎng)18小時。在圖10A中，顯示G3PDH和CCR3表達的凝膠示于頂部。CCR3mRNA表達對G3PDHL的比率相對于對照標準化，示于底部。參看圖10B，條圖表明，TOP005在低至1μM濃度的劑量有效降低PBMCCCR3 mRNA表達。
因此，反義寡核苷酸A86和TOP005可在Eol-1細胞(人嗜酸性粒細胞細胞系)、分化為嗜酸性粒細胞的HL-60細胞和U937細胞中抑制CCR3 mRNA表達。用這些寡核苷酸抑制CCR3還降低HL-60分化細胞和人嗜酸性粒細胞這二者中的鈣動員，以及降低嗜酸性粒細胞對嗜酸性粒細胞趨化因子的趨化性。對應的有義寡核苷酸和錯配寡核苷酸均不能影響對嗜酸性粒細胞趨化因子的響應。
實施例4TOP004降低IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈亞基表達以及人細胞系中的相關細胞應答的效力進行進一步的實驗，以檢驗107A和TOP004對IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β鏈亞基表達的作用。
TF-1和U937細胞中的β鏈mRNA表達的調節(jié)參看圖11A、11B和11C，顯示了TF-1細胞中的β鏈mRNA表達的調節(jié)。TF-1細胞用107A反義寡核苷酸處理12小時。參看圖11A，進行RT-PCR來檢測TF-1細胞中的β鏈mRNA和G3PDH mRNA表達。細胞如下處理泳道1對照未處理的；泳道2有義寡核苷酸(10μM)；泳道3107A(10μM)；泳道4，錯配寡核苷酸(10μM)。在非飽和條件下使用半定量RT-PCR評價β鏈和G3PDH(用作對照)mRNA的表達。用107A(10μM)處理幾乎完全抑制TF-1(圖11A)和U937處理細胞(數據未顯示)中的β鏈表達。107A的抑制是特異性的，不是由于RNA降解或細胞存活喪失，以內標為證(對應于G3PDH mRNA的450-bp產物)(圖11A)。相反，在未處理的對照細胞或有義或錯配寡核苷酸處理的細胞中，β鏈mRNA表達不受抑制(圖11A)。因此，107A活性對于抑制β鏈mRNA的表達是特異性和有效的。
參看圖11B和11C，顯示了有義寡核苷酸和107A處理對TF-1細胞的細胞表面上的β鏈表達的作用，如FACS分析測定。圖11B顯示了未處理對照(PC)對有義寡核苷酸處理的(S-ODN)，在這里NC代表陰性對照。圖11C顯示了107A(以5、10和20μM的變化濃度)處理36小時的細胞中的細胞表面表達。反義寡核苷酸抑制細胞β鏈蛋白表達的能力在107A處理細胞表面上產生對應較低密度的β鏈亞基。使用針對GM-CSF/IL-3/IL-5受體的共同β鏈蛋白的單克隆抗體(MAb)，與FACS分析一起檢測TF-1細胞上的β鏈蛋白的細胞表面表達。未處理的TF-1細胞的β鏈表達水平非常高，不受有義寡核苷酸處理影響。但是，增加107A濃度(5、10和20μM)以劑量依賴性方式顯著降低β鏈表達水平(在FACS分析中測試陽性的細胞百分率由69.9％降低至27.8％)。
圖11D顯示了TOP004處理后在U937細胞中共同β鏈表達的抑制。U937細胞在漸增濃度的TOP004(0.01、0.1、1和10μM)存在下在無血清培養(yǎng)基中溫育12小時(之后進行RT-PCR)和48小時(之后進行FACS分析)。共同β鏈mRNA或蛋白抑制的百分率通過與獲自未處理細胞的值進行對比來確定。實驗平行進行3次，數據表示為平均值±SE。圖11D中給出的結果表明，TOP004反義寡核苷酸含DAP殘基并與107A反義寡核苷酸同源，在mRNA和蛋白水平上有效抑制共同β鏈。而且，發(fā)現少量的TOP004(例如1μM)足以敲減β鏈mRNA以及對應的蛋白。因此，該數據有利于DAP化學物質的效力及其在如上所述的藥理學組合物中的用途。
細胞存活和功能研究參看圖12，顯示了在GM-CSF、IL-3或IL-5存在下用107A反義寡核苷酸處理的TF-1細胞的增殖情況。細胞與107A(10μM)在含1ng/mL GM-CSF或3ng/mL IL-3或3ng/mL IL-5的無血清培養(yǎng)基中溫育5小時。2天后終止溫育，通過Alamar Blue測定(n＝3)檢測細胞增殖。結果表示為吸光度(570-595)的平均值±SD。
TF-1細胞需要細胞因子GM-CSF、IL-3或IL-5來增殖，對這些細胞因子的生物反應涉及β鏈信號轉導途徑。預期抑制β鏈蛋白的細胞表面表達抑制TF-1細胞增殖，即便在這些細胞因子存在的情況下。107A(10μM)在IL-3、IL-5或GM-CSF存在下引起TF-1細胞的生長抑制。這些結果表明，107A對β鏈細胞表面蛋白表達的抑制有效抑制對全部3種細胞因子的細胞生物反應。
嗜酸性粒細胞表達GM-CSF、IL-3和IL-5受體，在炎癥和變態(tài)反應中起關鍵作用。嗜酸性粒細胞需要GM-CSF、IL-3以及尤其是IL-5用于其分化、活化和存活(Oddera等，1998，Lung.176237-247；Ohnishi等，1993，J.Allergy Clin.Immunol.，92607-615)。研究了靶向β鏈mRNA的反義寡核苷酸抑制響應IL-5的嗜酸性粒細胞存活的能力。參看圖13A和13B，顯示了107A對嗜酸性粒細胞存活的調節(jié)。
參看圖13A，將純化的人嗜酸性粒細胞在補加5％FBS和1.5ng/mL IL-5的RPMI培養(yǎng)基中與指定濃度(10、15和20μM)的107A溫育過夜。使用錐蟲藍染色排除測定評價嗜酸性粒細胞存活。結果是3個實驗的平均結果。用指定濃度的107A處理以劑量依賴性方式顯著降低嗜酸性粒細胞存活達對照水平的35％±12％(10μM)、43％±2％(15μM)和54％±7％(20μM)(p＜0.01)。嗜酸性粒細胞存活未受到作為對照的20μM濃度有義寡核苷酸處理的影響。因此，即便在含特異性細胞因子IL-5的培養(yǎng)基存在下，靶向β鏈的107A也抑制嗜酸性粒細胞存活。
參看圖13B，在有或沒有107A(15μM)的情況下，將純化的人嗜酸性粒細胞在補加5％FBS和2ng/mL IL-5的RPMI培養(yǎng)基中溫育48小時。如材料和方法中所述，使用Annexin-V-FITC和碘化丙錠方法通過流式細胞術分析評價嗜酸性粒細胞存活。
當用107A處理嗜酸性粒細胞時，其存活降低達64％，41％歸因于凋亡。相反，在未處理細胞和用有義寡核苷酸處理的細胞中，死亡細胞的百分率較低。
因此，根據RT-PCR和FACS的檢測，107A反義寡核苷酸在mRNA和蛋白水平上特異性抑制TF-1細胞和初級嗜酸性粒細胞中的共同β鏈表達。在使用的實驗條件下，在20μM濃度觀察到對測試的細胞系統(tǒng)獲得最大效力。在107A存在時，TF-1細胞的增殖下降，無論是IL-3、IL-5還是GM-CSF用作營養(yǎng)因子。此結果表明了107A反義寡核苷酸對β鏈的特異性和效力。
在IL-5存在下嗜酸性粒細胞存活受到107A抑制，似乎凋亡是這種抑制作用的結果。嗜酸性粒細胞在變應性炎癥中起關鍵作用，需要GM-CSF、IL-3和IL-5用于其分化、活化和存活(Adachi等，1995，Am.J.Respir.Grit.Care Med.151618-623和Oddera等，1998，Lung.176237-247)。在哮喘中，嗜酸性粒細胞累積和存活被認為是炎癥和上皮組織損傷的重要引發(fā)因素，因為它們釋放毒性產物，包括嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(Walsh等，1997，Clin.Exp.Allergy 27482-487)。
實施例5
氣管樣品中的ASM8靶基因的mRNA分析進行進一步的實驗來分析獼猴氣管樣品中ASM8針對的靶基因(β鏈亞基和CCR3)的mRNA水平。在第15天(最后1劑后1天)，在處死第1組(對照)和第4組(高劑量組；目標劑量水平2.5mg/kg/天)的全部極期動物后，立即收集氣管樣品，并在液氮中快速冷凍。通過RT-PCR分析冷凍的氣管樣品的靶mRNA水平。
使用經驗證的半定量RT-PCR法測定猴氣管樣品的目標基因表達水平(βc-亞基和CCR3)。對對照和高劑量ASM8處理動物的氣管提取物進行βc-亞基和CCR3-特異性PCR擴增(表7)。
表7.RT-PCR樣品分析結果
備注陰影值代表未納入平均值計算的逸出值。
盡管甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)通常在RT-PCR反應分析中用作內標，但觀測肺和氣管的溫和細胞浸潤物(其通常與其它反義寡核苷酸一起在沉積部位被觀測到)。因此，由于細胞浸潤物有助于βc-亞基和CCR3的檢測水平(即表達βc-亞基和CCR3的免疫細胞)，所以G3PDH不被認為是在此情況下用作內標的最合適基因。代之以將靶基因的表達對炎性細胞因子即IL-4和TNF-α的mRNA水平標準化。結果表明，在ASM8處理的動物中(表8)，即便在給予ASM8后約24小時，βc-亞基和CCR3 mRNA對IL-4 mRNA的相對表達分別降低達29％和24％，相對于TNF-α的表達分別降低達30％和24％。
因此，盡管猴氣管組織復雜以及ASM8給藥至獲得組織樣品過去了24小時，但相對于炎性細胞因子IL-4和TNF-α，ASM8處理顯著抑制βc-亞基和CCR3 mRNA的表達。
實施例6ASM8的儲存穩(wěn)定性進行穩(wěn)定性測試，以評價在不同儲存溫度下ASM8(TOP004和TOP005)的寡核苷酸組分的完整性。該信息對確定ASM8的最優(yōu)儲存、復測和儲存期條件很重要。
毛細管凝膠電泳(CGE)和高效(壓)液相層析(HPLC)已廣泛用于反義寡核苷酸的化學分析。由于ASM8有兩種寡核苷酸組成，所以測試系統(tǒng)必須提供足夠分開的兩種單獨的反義分子。因此，將描述以下內容1)基于陰離子交換層析的方法以分離ASM8組分(TOP004和TOP005)及其降解產物，和2)儲存溫度對ASM8組分穩(wěn)定性的作用(圖14-16)。
對ASM8稱重，并以0.5mg/mL濃度溶解在PBS中(0.25mg/mLTOP004和0.25mg/mL TOP005)。[TOP004的純度因子是1.15(即1.15g粉末含1g活性分子)；TOP005的純度因子是1.24即1.24g粉末含1g活性分子)。]為在分析前誘導TOP004和TOP005降解(以便確保分辨出完整分子的降解產物)，進行以下處理·脫嘌呤將ASM8以0.5mg/mL終濃度重懸浮在30％CH3COOH中，于室溫溫育3、4或6小時。通過加入5體積水終止反應，將混合物置于-20℃，然后在Speed-Vac中凍干，以去除乙酸。
·切割將脫嘌呤的寡核苷酸重懸浮在0.2M NaOH(0.5mg/mL)中，于50℃溫育1小時，儲存在-20℃或通過HPLC分析。
將等份的ASM8(0.5mg/mL)的PBS溶液于-20℃、4℃、30℃和40℃溫育2個月。在第4周和第8周時建立ASM8的HPLC譜。對照條件定義為任意儲存時間前(即時間0)的ASM8 HPLC譜。HPLC系統(tǒng)由Waters的Breeze(V 3.30)軟件驅動(圖17A1、17A2、17B1和17B2)。
用聯結Waters 2487 Dualλ吸光度檢測器并配有在線脫氣器、烘箱和1500系列手動注射器Reodyne 7725i的Waters 1500系列二元HPLC泵進行HPLC分離。
寡核苷酸混合物在Waters Protein Pak DEAE 5PW陰離子交換柱(0.5cm×75cm)上分級分離，保持在60℃，通過260nm的UV吸收檢測。寡核苷酸混合物(體積＝25μL)在水(緩沖液A)中上柱，通過逐漸增加緩沖液B(1M LiClO4)的比例使液相(表9)的離子強度增加，由固相(柱)洗脫寡核苷酸，由此進行洗脫。
在測定條件下，62.5μg的TOP004或TOP005中的任一個于260nm產生的可檢測變化都＞0.15吸光度單位(AU)。
圖14中的層析圖顯示了在DEAE陰離子交換層析中ASM8(TOP004和TOP005)的單個產物的洗脫譜。25μL體積的新鮮制備的ASM8(0.5mg/mL)在DEAE陰離子交換柱上分級分離。在上述梯度條件下，TOP004洗脫早于TOP005；這與TOP004比TOP005少兩個核苷酸并具有較少的帶負電殘基相一致。TOP004寡核苷酸在81.3分鐘洗脫下來，占260nm吸收的總材料的48.0％。TOP005在86.8分鐘洗脫下來，占260nm吸收的總材料的49.3％。
為了證實TOP004、TOP005和ASM8降解產物之間足夠分離，進行ASM8的兩步化學降解。切割步驟保持不變，但脫嘌呤步驟的溫育期進行3-6小時。參看圖15，ASM8(0.5mg/mL)用CH3COOH處理3小時，進行堿裂解(如上所述)，然后通過DEAE陰離子交換層析分級分離。TOP004寡核苷酸在81.5分鐘洗脫下來，占260nm吸收的總材料的32.4％。TOP005產物在86.9分鐘洗脫下來，占總材料的28.0％。較小峰代表ASM8的降解產物。參看圖16，ASM8(0.5mg/mL)用CH3COOH處理6小時，如上所述進行堿裂解，然后通過DEAE陰離子交換層析分級分離。在260nm檢測下，TOP004寡核苷酸在82.2分鐘洗脫下來，TOP005在86.7分鐘洗脫下來。通過增加脫嘌呤時間，TOP004的比例降低至20.6％，TOP005的比例降低至14.5％。在這些實驗條件下TOP005的降解程度似乎稍高。如圖15和16中的層析圖可見，增加脫嘌呤時間增加了ASM8的降解。
參看圖17A1、17A2、17B1和17B2，評價不同儲存溫度下ASM8的化學穩(wěn)定性。ASM8(0.5mg/mL的PBS溶液)于-20℃、4℃、30℃或40℃溫育4周(圖17A1和17A2)和8周(圖17B1和17B2)，并通過DEAE陰離子交換層析分析。在該實驗中測試的各種儲存溫度不影響ASM8組分的洗脫譜。在ASM8儲存長達2個月的任一個溫度都未觀察到ASM8的顯著降解。
上文業(yè)已描述了ASM8的基于DEAE陰離子交換HPLC的分離方法。因為該產物的性質，優(yōu)選ASM8組分(TOP004和TOP005寡核苷酸)的足夠分離。在所述梯度條件下，TOP004的保留時間比TOP005的保留時間早5分鐘，兩個峰幾乎沒有重疊。
該方法還能夠檢測ASM8的降解產物。可通過此HPLC法評價在不同溫度、濕度和光照條件下的ASM8的化學穩(wěn)定性。
ASM8在PBS中的制劑是化學穩(wěn)定的，在一系列溫度下儲存達2個月后通過HPLC法未檢測到顯著的降解產物。
實施例7ASM8的熱力學評價進行進一步的實驗，以確保在使用熱力學評價時兩條寡核苷酸鏈TOP004和TOP005在溶液中不相互作用。
TOP 004和TOP 005以在1×PBS(以及其它緩沖系統(tǒng))中以等摩爾濃度混合?？偣押塑账釢舛仍诩s1.2-8.7μM的范圍內。使用帶有Tm附件的Beckman DU640分光光度計進行標準UV熱變性法。在10-90℃的每個溫度檢測260 nm的吸光度變化。使用MELTWINTM3.5軟件擬合解鏈曲線，以測定熱力學參數。產生解鏈曲線和熱力學總結表的屏幕圖像。
參看圖18，顯示了在1×PBS中的TOP004和TOP005的解鏈曲線。圖19是基于TOP004和TOP005在1×PBS中的解鏈曲線擬合結果的熱力學總結。結果表明，在溫度增加時，寡核苷酸組合/條件沒有一個在解鏈譜中產生顯著躍遷(吸光度的突升)。這表明，測試的寡核苷酸混合物在測試緩沖條件下不形成顯著的二級結構相互作用。
實施例8ASM8在獼猴中的毒性該實施例顯示了由TOP004和TOP005的1∶1混合物組成的ASM8的毒性。還顯示了在連續(xù)14天內通過每日一次吸入接觸給予獼猴時，其各個寡核苷酸組分的毒代動力學模式。此外，14天吸入接觸ASM8未激發(fā)可通過皮內注射(ID)檢測的系統(tǒng)性超敏狀況。
表10.估計達到的劑量
表11.總體接觸的氣溶膠濃度
進行死亡率、臨床征兆、體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查和臨床病理學的全面評價。在接觸的第1天和最后1天以及恢復期結束時得到系列血樣，在完結時收集組織，用于測定個體寡核苷酸含量。另外，在第25天時，對設計用于恢復期的動物皮內注射(ID)給予ASM8，以評價潛在的系統(tǒng)性超敏性。所有動物都在接觸14天后(第15天)或14天恢復期后(第29天)實施安樂死，進行全尸檢，并由每只動物收集一套完整組織。組織病理學評價由高劑量和對照組動物的全部組織以及低劑量組和恢復動物的呼吸道組織的顯微鏡檢查組成。
ASM8制劑易于氣溶膠化，產生的接觸氣溶膠始終穩(wěn)定并可呼吸，組間質量中位直徑(MMAD)和幾何標準偏差(GSD)值分別在1.7-1.8μm和2.12-2.22之間。對于組2-4，獲得的估計達到劑量分別接近0.05、0.22和2.5mg/kg/天的目標，表7-8。
沒有死亡，猴對劑量良好耐受。對體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查或臨床病理學和超敏測試沒有影響，揭示ASM8給藥無作用。在尸檢后，器官重量檢測未產生毒性證據。所有器官的外觀檢查揭示，在ASM8處理動物中只是腎臟有灰白變色。但是，由于沒有已證實的微觀變化、臨床病理學觀察結果或器官重量變化以及在恢復14天后未觀察到變色的事實，所以認為該觀察結果的生物學和毒物學意義不明確。
TOP004和TOP005的血漿水平以及其近似的(n-1)代謝物在血漿中非常低，低和中劑量組在定量限度以下。對于高劑量組(2.5mg/kg/天)，TOP004和TOP005濃度通常在給藥后0.5小時的最早取樣時間或1小時時間點時最大。在大部分給藥后時間點，TOP004的平均濃度類似于TOP005的濃度，圖20A和圖20B。
如圖21A和圖21B所示，重復地每日給予達14天，血漿中的任一種寡核苷酸組分(或其n-1代謝物)都沒有累積。血漿濃度沒有一致性差異。循環(huán)寡核苷酸的顯著性百分率以TOP004和TOP005這二者的近似n-1代謝物給出，盡管所述百分率往往稍低于TOP004。對于兩種寡核苷酸及其n-1代謝物，在24小時收集期內明顯由血室(血漿)中清除出去。在終末期處死時(最后1劑ASM8吸入后1天)，在高劑量動物氣管中檢測到可感知量的ASM8的完整寡核苷酸組分(TOP004和TOP005)。在14天恢復期結束時(第29天)，TOP004及其n-1代謝物的水平相對于第15天時已消除，經檢測稍微高于測定的檢測限度。相反，在恢復期處死時間點時TOP005或其代謝物不可定量。這些結果提示，TOP004具有高于TOP005的組織穩(wěn)定性。
在除呼吸道以外的任何器官中都未觀察到處理相關的微觀變化。按照4點評分，呼吸道中觀察到的所有變化都被評為最低(最小)。對肺觀察到的變化包括以0.22或2.5mg/kg/天給藥的動物中的泡沫狀肺泡巨噬細胞、2.5mg/kg/天給藥的動物中的肺泡內粒細胞炎癥、2.5mg/kg/天給藥的2只動物中的灶性出血和1只動物中的病灶性細支氣管組織轉化；對鼻腔觀察到的變化包括2.5mg/kg/天給藥的6只動物中有2只的鼻中隔扁平上皮出現病灶性侵蝕，伴有急性炎癥，并在1只猴中出現炎癥滲出液；對支氣管淋巴結觀察到的變化包括2.5mg/kg/天給藥的動物中有泡沫狀巨噬細胞。在中和高劑量動物中觀察到的變化的嚴重性較小，在肺實質中不伴有局部損傷或細胞浸潤的證據。炎癥細胞稀少，僅在少量ASM8高劑量動物中觀察到，變化的分布與測試物的吸入相一致。灶性出血非常小，被解讀成可能是偶然的。因此，報告的變化一般與和吸入測試物的吞噬作用和清除相關的正常肺部機制相一致。撤消處理14天導致持續(xù)存在若干泡沫狀肺泡巨噬細胞，在兩只ASM高劑量動物中有1只無炎癥。此觀察結果與病灶的逐漸退化相一致，表明肺實質沒有進行性或遷延性變化。
在14天恢復期后沒有處理作用于鼻組織的證據。關于高劑量動物中的支氣管淋巴結觀察結果，髓竇中的泡沫狀巨噬細胞與通過由肺進行淋巴引流清除測試材料相一致。沒有實質損傷的證據，淋巴結似乎未處于活性狀態(tài)中。
總之，以達2.5mg/kg/天的估計達到劑量連續(xù)14天吸入ASM8被良好耐受，對體重、食物消耗、心電圖、檢眼鏡檢查或臨床病理學參數沒有影響，超敏測試揭示ASM8給藥無作用。大部分最小組織形態(tài)學變化有許多在肺(0.22和2.5mg/kg/天)以及鼻腔和支氣管淋巴結(2.5mg/kg/天)中觀察到。這些變化在恢復14天后嚴重性下降或消失。
盡管本文已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但本領域技術人員會理解，可對這些實施方案進行改變，而不背離本發(fā)明的精神或所附權利要求書的范圍。
序列表<110>Topigen Pharmaceutique Inc.
<120>用于治療變態(tài)反應和腫瘤細胞增殖的反義寡核苷酸<130>13424-10PCT<140>
<141>
<150>US 60/623,206<151>October 29，2004<160>42<170>Patentln version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gttactactt ccacctgcct g21<210>2<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2tggaaaagcg acacctacct g 21<210>3<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3cccttttcct ggaaaagcga ca 22<210>4<211>21
<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4ctcccttttc ctggaaaagc g21<210>5<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5tccacctccc ttttcctgga 20<210>6<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6cctccttgtt ccacctccc t 21<210>7<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7acccattggcat attgctcatt t 21<210>8<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>8tccttgcaat tagtgctgc t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9
tcgtgcagtt cttctttttc a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>10cagactagct tctcagtttt g 21<210>11<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11tgctaattta gtgaagtcct t 21<210>12<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>12cttctccctg aaaatctctt ct 22<210>13<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n是2，6-二氨基嘌呤-2′-脫氧核糖核苷<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n是2，6-二氨基嘌呤-2′-脫氧核糖核苷<400>13gggtctgcng cgggntggt19
<210>14<211>21<211>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
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<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>n是2，6-二氨基嘌呤-2′-脫氧核糖核苷<400>14gttnctnctt ccncctgcct g21<210>15<211>17<212>DNA<213>引物<400>15atggtgctgg cccaggg 17<210>16<211>18<212>DNA<213>引物<400>16ccagggagat ggtgctgg18<210>17<211>21<212>DNA<213>引物
<400>17ccgcttgtag accacctcaa c 21<210>18<211>22<212>DNA<213>引物<400>18ccttggctga acagagacga tg 22<210>19<211>21<212>DNA<213>引物<400>19tgctctgtga aaaagccgat g 21<210>20<211>21<212>DNA<213>引物<400>20accaaaagtg acagtcctgg c 21<210>21<211>22<212>DNA<213>引物<400>21aagtcagggt ttgagggcta tg 22<210>22<211>21<212>DNA<213>引物<400>22caagggggca gagacaggta g 21
<210>23<211>20<212>DNA<213>引物<400>23accacagtcc atgccatcac20<210>24<211>21<212>DNA<213>引物<400>24tccaccaccc ctgttgctgt a 21<210>25<211>150<212>DNA<213>獼猴(Cynomolgus Monkey)<220>
<221>misc_feature<222>(133)..(133)<223>n是a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(142)..(143)<223>n是a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(147)..(147)<223>n是a、c、g或t<400>25ggcagaagaa accatcccgc tgcrgaccct acgctgctac aatgactaca ccagccacat 60cacctgcagg tgggcggaca cccaggatgc ccagcggctt gtcaacgtga ccctcagtcg 120ccgggtgaat gangaccctc cnnagcnagt 150<210>26<211>150
<212>DNA<213>獼猴(Cynomolgus Monkey)<220>
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<210>33<211>132<212>DNA<213>黑猩猩<400>33cttgtcagaa accatcccgc tgcagaccct gcgctgctac aacgactaca ccagccacat 60cacctgcagg tgggcagaca cccaggatgc ccagcggctc gtcaacgtga ccctcattcg 120ccgggtgaat ga 132<210>34<211>132<212>DNA<213>豬<400>34ctcagaggac accgtcccgc tgcagaccct gcgctgctac aatgactaca ccagccgcat 60cgtgtgcagc tgggcggcgg aggcggccgc tgagcagctc atcaatgtga ccctccatcg 120ccatcgcagg tt 132<210>35<211>132<212>DNA<213>大鼠<400>35ggcagaagaa actgtccctc tgaagactct gcagtgctac aacgactata tcgagcgcat 60catctgcagc tgggccgaca cggaggacgc ccaggggctc gttaacctga ccctctatca 120ctggctagac aa 132<210>36<211>132<212>DNA<213>小鼠<400>36ggcagaagaa acggtccctc tgaagactct gcagtgctac aatgactaca ccaaccacat 60
catctgcagc tgggcggaca cagaggatgc ccaggggcta atcaacatga ccctctatca 120ccagctagag aa 132<210>37<211>12<212>PRT<213>獼猴(Cynomolgus Monkey)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>Xaa為Gln或Arg<400>37Ala Glu Glu Thr Ile Pro Leu Xaa Thr Leu Arg Cys1 5 10<210>38<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>38Ala Glu Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr Leu Arg Cys1 5 10<211>39<211>12<212>PRT<213>黑猩猩<400>39Leu Ser Glu Thr Ile Pro Leu Gln Thr Leu Arg Cys1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>豬
<400>40Set Glu Asp Thr Val Pro Leu Gln Thr Leu Arg Cys1 5 10<210>41<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>41Ala Glu Glu Thr Val Pro Leu Lys Thr Leu Gln Cys1 5 10<210>42<211>12<212>PRT<213>大鼠<400>42Ala Glu Glu Thr Val Pro Leu Lys Thr Leu Gln Cys1 5 10
權利要求
1.一種用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的反義寡核苷酸，所述寡核苷酸針對編碼蛋白的核酸序列，所述蛋白選自CCR3趨化因子受體和IL-3、IL-5與GM-CSF受體的共同β亞基，以及能夠接觸IL-3、IL-5和GM-CSF受體的共同β亞基的其它蛋白，其中所述寡核苷酸是以下中的一種(i)選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列，和(ii)選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列的修飾寡核苷酸。
2.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.1的序列。
3.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.13的序列。
4.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有包含SEQID NO.14的序列。
5.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預防哮喘。
6.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預防變態(tài)反應。
7.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預防嗜酸性粒細胞增多癥。
8.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預防全身性炎癥。
9.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸用于治療和/或預防癌癥。
10.權利要求1的反義寡核苷酸，其中所述癌癥是白血病。
11.權利要求1定義的至少一種反義寡核苷酸的用途，所述反義寡核苷酸用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
12.權利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
13.權利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
14.權利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
15.權利要求11的用途，其中所述至少一種反義寡核苷酸為至少兩種反義寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
16.權利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預防哮喘。
17.權利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預防變態(tài)反應。
18.權利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預防嗜酸性粒細胞增多癥。
19.權利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預防全身性炎癥。
20.權利要求11的用途，其中所述至少一種寡核苷酸用于治療和/或預防癌癥。
21.權利要求11的用途，其中所述癌癥是白血病。
22.一種用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的藥物組合物，所述組合物包含至少一種權利要求1定義的反義寡核苷酸以及藥物可接受的載體。
23.權利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
24.權利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
25.權利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
26.權利要求22的藥物組合物，其中所述至少一種反義寡核苷酸為至少兩種反義寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列。
27.權利要求22-26中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是局部藥物組合物。
28.權利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防哮喘。
29.權利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防變態(tài)反應。
30.權利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防嗜酸性粒細胞增多癥。
31.權利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防全身性炎癥。
32.權利要求22的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防癌癥。
33.權利要求22的藥物組合物，其中所述癌癥是白血病。
34.權利要求22-27中任一項的藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種。
35.權利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防哮喘。
36.權利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防變態(tài)反應。
37.權利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防嗜酸性粒細胞增多癥。
38.權利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防全身性炎癥。
39.權利要求34的用途，其中所述藥物組合物用于治療和/或預防癌癥。
40.權利要求34的用途，其中所述癌癥是白血病。
41.一種治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的方法，所述方法包含給予有效量的至少一種權利要求1定義的反義寡核苷酸的步驟。
42.權利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
43.權利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
44.權利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
45.權利要求41的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸為至少兩種反義寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
46.權利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預防哮喘。
47.權利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預防變態(tài)反應。
48.權利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預防嗜酸性粒細胞增多癥。
49.權利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預防全身性炎癥。
50.權利要求41的方法，其中所述方法用于治療和/或預防癌癥。
51.權利要求41的方法，其中所述癌癥是白血病。
52.一種治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的方法，所述方法包含給予有效量的權利要求22-27中任一項定義的藥物組合物的步驟。
53.權利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預防哮喘。
54.權利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預防變態(tài)反應。
55.權利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預防嗜酸性粒細胞增多癥。
56.權利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預防全身性炎癥。
57.權利要求52的方法，其中所述方法用于治療和/或預防癌癥。
58.權利要求52的方法，其中所述癌癥是白血病。
59.權利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產藥物的用途，所述藥物用于治療哮喘。
60.權利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產藥物的用途，所述藥物用于治療變態(tài)反應。
61.權利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產藥物的用途，所述藥物用于治療嗜酸性粒細胞增多癥。
62.權利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產藥物的用途，所述藥物用于治療全身性炎癥。
63.權利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產藥物的用途，所述藥物用于治療癌癥。
64.權利要求1的至少一種反義寡核苷酸用于生產藥物的用途，所述藥物用于治療白血病。
65.權利要求59-64中任一項的用途，其中所述至少一種寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.1的序列。
66.權利要求59-64中任一項的用途，其中所述至少一種寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.13的序列。
67.權利要求59-64中任一項的用途，其中所述至少一種寡核苷酸具有包含SEQ ID NO.14的序列。
68.權利要求59-64中任一項的用途，其中所述至少一種寡核苷酸為至少兩種寡核苷酸，它們分別具有包含SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療和/或預防哮喘、變態(tài)反應、嗜酸性粒細胞增多癥、全身性炎癥和癌癥中的至少一種的反義寡核苷酸。所述寡核苷酸針對編碼受體的核酸序列，所述受體選自CCR3受體以及IL－3、IL－5和GM－CSF受體的共同亞基。
文檔編號A61K31/711GK101087623SQ200580044861
公開日2007年12月12日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權日2004年10月29日
發(fā)明者K·澤姆祖米, P·倫齊 申請人:托皮根藥品公司