專利名稱：：RNAi抑制CTGF用于治療眼科疾病的制作方法RNAi抑制CTGF用于治療目f^疾病發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可抑制眼科疾病中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)的干擾性RNA組合物領(lǐng)域。發(fā)明背景大多數(shù)眼科疾病都與細(xì)胞過程有關(guān)，這些過程包括細(xì)胞增殖、存活、遷移、分化和血管發(fā)生。CTGF是這些細(xì)胞過程的一種分泌的細(xì)胞因子和主J^h體。具體地，已知CTGF主要通過增加膠原蛋白I和纖連蛋白的沉積來(lái)增加細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。CTGF的it^達(dá)被認(rèn)為是硬皮病、纖維增生疾病、痣痕形成等疾病的主要病因因素，這些疾病中存在細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度積累.在小梁網(wǎng)(TM)區(qū)域的細(xì)胞外基質(zhì)物質(zhì)的過度積累是很多類型青光眼的標(biāo)志，這種增加被認(rèn)為增加了對(duì)水性流出物的阻力，從而導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高。于2003年11月13日以WO03/092584公布并轉(zhuǎn)讓給Alcon公司的Fleenor等人的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2003/012521描述在青光眼TM細(xì)胞中CTGFmRNA較正常TM細(xì)胞中有所增加。因此，可以認(rèn)為CTGF在小梁網(wǎng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生中發(fā)揮作用。黃斑變性是負(fù)責(zé)高精度視覺的中夾視網(wǎng)膜部分(被稱作黃斑區(qū))中感光細(xì)胞的喪失。黃斑變性與視網(wǎng)膜色素上皮和血管脈絡(luò)膜之間膜中細(xì)胞外基質(zhì)成分的異常沉積有關(guān)。這種碎屑狀物質(zhì)被稱作脈絡(luò)膜小疣。眼底鏡檢查可以觀察到脈絡(luò)膜小疣。正常眼睛的黃斑區(qū)沒有脈絡(luò)膜小疣，而在視網(wǎng)膜周圍可能富含脈絡(luò)膜小疣。如杲黃斑視力沒有任何損失而在黃斑區(qū)出現(xiàn)軟的脈絡(luò)膜小疣，可以認(rèn)為是AMD的早期。除了其他一些眼科疾病，脈絡(luò)膜新血管形成還經(jīng)常發(fā)生在黃斑變性中，并且與脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的過量產(chǎn)生和纖維血管性視網(wǎng)膜下膜的形成有關(guān)。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖和血管生成因子的產(chǎn)生似乎實(shí)現(xiàn)脈絡(luò)膜新血管的形成。糖尿病性視網(wǎng)膜病變是一種糖尿病中發(fā)生在由毛細(xì)血管基底膜增厚和毛細(xì)血管周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間缺乏接觸引起的的眼科疾病。周細(xì)胞的喪失增加了毛細(xì)血管的滲漏，導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障的破壞?；さ募?xì)胞增殖有關(guān)。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖和遷移在這種眼科疾病中很常見。與增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變有關(guān)的膜包括細(xì)胞外基質(zhì)成分如I型、n型和iv型膠原蛋白，纖粘蛋白，而且這些膜會(huì)變得逐漸纖維化。創(chuàng)傷愈合疾病可以通過激活炎癥細(xì)胞、釋放生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子、眼細(xì)胞的增殖和分化、毛細(xì)血管通透性的增加、基Ji膜基質(zhì)成分的改變、細(xì)胞外JJt的沉積增加、纖維化、新血管形成和組織重塑，導(dǎo)致嚴(yán)重的目fUa織損傷。因此，CTGF的it^達(dá)被認(rèn)為是這些目醋疾病的主要病因因素。目前的治療手段沒有直^i"對(duì)這些疾病的發(fā)病機(jī)制。發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠耙向CTGFmRNA并干擾CTGFmRNA表達(dá)的千擾RNA。發(fā)明的這種干擾RNA可用于治療CTGF相關(guān)的目科疾病如青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和異常創(chuàng)傷愈合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是提供了減弱受試者眼中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的方法。該方法包括對(duì)受試者的眼施用組合物，該組合物包含有效量的干擾RNA如19-49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈(ds)siRNA或單鏈(ss)siRNA和可藥用的栽體。雙鏈siRNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列和至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。此外，在生理?xiàng)l件下，反義序列與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l(人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子DNA的有義鏈序列，Genebank參考號(hào)為NMJ)01901)的mRNA的一部分雜交，并且具有至少19個(gè)核苷酸的與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。施用這種組合物可以減弱受試者眼中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)。單鏈siRNA具有19-49個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，在生理?xiàng)l件下能與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、卯l、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的一部分雜交，并且具有能與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的雜交部分至少接近完全互補(bǔ)的區(qū)域。本發(fā)明的實(shí)施方案中，雙鏈干擾RNA的反義鏈被設(shè)計(jì)為靶向?qū)?yīng)于SEQIDNO:1的mRNA起始于或包含379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是提供了在需要其的受試者中治療結(jié)締組織生長(zhǎng)因子有關(guān)的眼科疾病的方法.該方法包括對(duì)受試者的眼施用包含有效量的19-49個(gè)核苷酸的干擾RNA和可藥用載體的組合物，這種干擾RNA包含有義鏈、反義鏈和至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全連續(xù)的互補(bǔ)區(qū)域。反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的一部分雜交，并且具有至少19個(gè)核苷酸的能與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。以此治療結(jié)締組織生長(zhǎng)因子有關(guān)的眼科疾病。附圖簡(jiǎn)述圖1A顯示SITOXTM數(shù)據(jù)，與圖IB的數(shù)據(jù)一起證明小梁網(wǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不是PHit的。以SITOXTM(Dharmacon)轉(zhuǎn)染對(duì)照轉(zhuǎn)染GTM3細(xì)胞。24小時(shí)后用錐蟲藍(lán)排除法實(shí)驗(yàn)確定SITOX培養(yǎng)物中剩余的活細(xì)胞數(shù)量，以此反映相對(duì)轉(zhuǎn)染效率?？招臈l形無(wú)轉(zhuǎn)染；實(shí)心條形用SITOXTM。圖IB顯示GTM3細(xì)胞^LV的siRNA的SIGLO圖像，與圖1A的數(shù)據(jù)一起證明轉(zhuǎn)染效率不是限速的。用LIPOFECTAMINE2000TM將SIGLOsiRNA轉(zhuǎn)染至GTM3細(xì)胞。24小時(shí)后用熒光顯微術(shù)檢測(cè)SIGLOsiRNA的^L^(紅色不規(guī)則形狀)'用DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲咮)鑒定單個(gè)的細(xì)胞核(藍(lán)色圓形區(qū)域)，DAPI是雙鏈DNA的染料.如圖1A數(shù)據(jù)和圖IB圖像所示，幾乎所有細(xì)胞或死亡(SITOXTM)或發(fā)出熒光(SIGLO)。圖2A是一個(gè)示意圖，顯示CTGF基因的外顯子(方盒)和內(nèi)含子(線條)結(jié)構(gòu)，以及siRNASl，S2，S3和QPCR引物/^^針組Ql和Q2相對(duì)于GenebankCTGF序列NMJ)01卯1的位置，以SEQIDNO:1提供序列NM_001901。在例1中提供了siRNA和引物/探針組的序列。圖2B顯示用外顯子5的引物/探針組Q2對(duì)CTGFmRNA進(jìn)行QPCR擴(kuò)增。用SI和S4的siRNA，未檢測(cè)到CTGFmRNA水平的明顯下調(diào)。圖2C顯示用跨越外顯子4/5的引物/探針組Ql對(duì)CTGFmRNA進(jìn)行QPCR。每種siRNA都能觀察到CTGFmRNA的下調(diào)，而用S2siRNA觀察到~90%的下調(diào)。圖3顯示用不同濃度的S2siRNA檢測(cè)CTGFmRNA水平下調(diào)的滴定研究。用引物/探針組Ql通過QPCR擴(kuò)增對(duì)CTGFmRNA的下調(diào)進(jìn)行估計(jì)。如實(shí)施例l所述，用O,1,3，10，30和100nMS2siRNA處理GTM3細(xì)胞，24小時(shí)后可觀察到IC鄰為2,5nM,發(fā)明詳述RNA干擾被稱作"RNAi，，，是一種以小的單鏈或雙鏈RNA分子實(shí)現(xiàn)降低目的基因的表達(dá)的方法.干擾RNA包括雙鏈或單鏈的小干擾RNA(dssiRNA或sssiRNA)、微型RNA(miRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)等等。不希望被理論束蜂，RNA干擾似乎發(fā)生在體內(nèi)，雙鏈RNA前g切割成長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸的小RNA。切割是由RNAeIII-RNA解旋酶切丁酶完成的。siRNA的有義鏈，即有與目的mRNA序列完全相同序列的鏈被除去，留下與目的mRNA序列互補(bǔ)的"反義鏈"來(lái)降低mRNA的表達(dá)。siRNA的反義鏈似乎引導(dǎo)被稱作RISC(RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的蛋白復(fù)合體到達(dá)mRNA，然后RISC的Argonaute蛋白對(duì)mRNA進(jìn)行切割，從而降低該mRNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。干擾RNA具有催化活性，亞化學(xué)劑量的mRNA相關(guān)的干擾RNA就能降低mRNA的表達(dá)。mRNA表達(dá)的降低也可通過轉(zhuǎn)錄和翻譯的機(jī)制發(fā)生。本發(fā)明涉;ME眼科疾病中干擾RNA在抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的用途。依照本發(fā)明，眼的組織，特別是眼的小梁網(wǎng)細(xì)胞，進(jìn)行siRNA沉默，外源提供的siRNA實(shí)現(xiàn)沉默。此外本發(fā)明的方面已經(jīng)確定，在使用基于PCR的方法來(lái)確定siRNA下調(diào)功效時(shí)，PCR的擴(kuò)增引物應(yīng)該i殳計(jì)成包括siRNA靶定序列，以精確測(cè)定沉默。除非另外表明，在此引用的核酸序列都以5，到3，方向書寫。在此使用的術(shù)語(yǔ)"核酸"是指DNA或RNA、或它們的修飾形式，包含DNA中存在的嘌呤或嘧咬4^(腺嘌呤"A"、胞嘧咬"C"、鳥嘌呤"G"和胸腺嘧咬"T"),或RNA中存在的噪呤或嘧咬M(腺噪呤"A"、胞嘧咬"C"、鳥嘌呤"G"和尿嘧啶"U，，)。在此提供的干擾RNA可以包括"T，，威基，特別是在3，末端，雖然在RNA中并不天然存在"T"絲。"核酸"包括術(shù)語(yǔ)"絲苷酸"和"多核苷酸，，，可以指單鏈分子或是雙鏈分子。雙鏈分子是在A和T堿基、C和G威基、A和11>5^之間按Watson-Crick威基配對(duì)原則形成的。雙鏈分子的兩M之間可以部分、基本上或完全相互互補(bǔ)，并會(huì)形成雙鏈體雜交分子，成鍵的強(qiáng)度依賴于磁基序列的性質(zhì)和互補(bǔ)程度。已知編碼mRNA的DNA的有義鏈或反義鏈序列，就能容易地確定mRNA的序列，例如，SEQIDNO:1提供了對(duì)應(yīng)于結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA的DNA有義鏈序列。由"U，，殘基替代了"T，，堿基，mRNA序列與DNA的有義鏈完全一樣。因此，可由SEQIDNO:1得知結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的mRNA序列。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA:ncbi.nlm.nih.gov的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnology)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供了人類結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的信使RNA對(duì)應(yīng)的DNA序列，參考號(hào)為NM—OOl卯l，如下以SEQIDNO:1提供。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的編碼序列為從146到1195位核香酸。SEQIDNO:1:1tccagtgscggsgccgcccggccgacagccccgagscgacagcccggcgcgtcccggtcc61ccacctccgaccaccgccagcgctccaggccccgcgctccccgctcgccgccaccgcgcc121ctccgctccgcccgcagtgccaaccatgaccgccgccagtatgggccccgtccgcgtcgc181cttcgtggtcctcctcgccctctgcagccggc卿ccgtcggccagaactgcagcgggcc241gtgccggtgcccggacgsgccggcgccgcgctgcccggcgggcgtgsgcctcgtgctggs301cggctgcggctgctgccgcgtctgcgccaagcagctgggcg3gctgtgc3ccgagcgcga361cccctgcgscccgcaca3gggcctcttctgtgacttcggctccccggcca3ccgcaag3t421cggcgtgtgcaccgccaaagatggtgctccctgcatcttcggtggtacggtgtaccgcag481cggsgagtccttccag3gcagctgcasgtaccagtgcacgtgcctggacggggcggtggg541ctgcatgcccctgtgcagcatggacgttcgtctgcccagccctgactgcoccttcccgag601g3gggtca3gctgcccggga33tgctgcgaggsgtgggtgtgtg3cg3gcccaaggaccs661aaccgtggttgggcctgccctcgc^gcttaccgactggaagacacgtttggcccagaccc721a3ctatg3ttag3gcca3ctgcctgjgtccsgsccacagsgtggsgcgcctgttcca3g3c781ctgtgggatgggcatctccacccgggttaccaatgacaacgcctcctgcaggctagagaa841gcagagccgcctgtgcatggtcaggccttgcgaagctgacctggaagaga.acattaagaa901gggcaaaaagtgcatccgtactcccaaaatctccaagcctatcaagtttgagctttctgg961ctgcaccagoatgaagacataccgagctaaattctgtggagtatgtaccgacggccgatg1021ctgcaccccccacagaaccaccaccctgccggtggagttcaagtgccctgacggcgaggt1081catgaagaagaacatgatgttcatcaagacctgtgcctgccattacaactgtcccggaga1141caatg3c3tctttgaatcgctgtactacsggaagatgtacggsgacatggcatgaagcca1201gagagtgagagacattaactcattagactggaacttgaactgattcacatctcatttttc1261cgtaaaaatgatttcagtagcacaagttatttaaat卿ttttctaactgggggaaaag1321attcccacccaattcaaaacattgtgccatgtcaaacaaatagtctatcttccccagaca1381ctggtttgaagaatgttaagacttgacagtggaactacattagtacacagcaccagaatg1441tatattaaggtgtggct加ggagcsgtgggagggtaccagcag33aggttagtatcatc1501agstagctettatacgagtastatgcctgctatttg33gtgt33ttg3g33gg朋a3ttt1561tagcgtgctc3ctg3cctgcctgtagcccc3gtg3c3gctsggatgtgcattctccagcc16213tca3gag3ctg3gtcaagttgttccttaagtcagaacagcagactcagctotgacattc1681tgattcgastgacactgttcaggaatcgga3tcctgtcgatt3g3ctggacagcttgtgg1741caagtgaatttcctgtaacsagccsgattttttaaaattt3tattgt3aatattgtgtgt1801gtgtgtgtgtgtgtstatatatatatatatgtacagttatctaagtt33tttaaagttgt1861ttgtgcctttttatttttgtttttaatgctUgatatttcaatgttagcctcaatttctg1921ascaccataggtagastgtaaagcttgtctg3tcgttcaa3gcatga抑t。gstacttat19813tgg33attctctcagstag33tg3cagtccgtcasaacagattgtttgc3aagggg3gg2041catcagtgtccttggcaggctgatttctaggtaggaaatgtggtagctcacgctcacttt2101taatgaacaaatggcctttattasaaactgagtgactctatatagctgatcag微tc2161acctggaagcatttgtttctactttgatatgactgt加cggacagttta卿tgag2221agtgtgaccaaaagttacatgtttgcacctttctagttgaaaataaagtata訓(xùn)ct228133a3333333a的33cgac3gcsscggasttc.上述CTGFmRNA序列的等同物是它的備選剪切形式、等位基因形式或同源物。同源物是與SEQIDNO:1同源的來(lái)自另一哺乳動(dòng)物物種的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA。與SEQIDNO:1相關(guān)的CTGF核^列是GeneBank檢索號(hào)AK092280,AK125220，AY395801，AY550024，BT019794,BT019795,CR541759,M92934,U14750和X78947的序列，和U.S.5,585,270的SEQIDNO:1，在此引用作為參考。mRNA表達(dá)的減弱在此使用的短語(yǔ)"mRNA表達(dá)的減弱"是指相對(duì)于具有亂序的對(duì)照RNA，在細(xì)胞內(nèi)施以一定量的干擾RNA使細(xì)胞中乾基因的全長(zhǎng)mRNA轉(zhuǎn)錄物水平降低，從而mRNA翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)減少。mRNA表達(dá)的降低通常稱作mRNA"下調(diào)"(knock-down)。此處的實(shí)施方案預(yù)計(jì)可以使表達(dá)量的下調(diào)在50%到100%之間，包括50%和100%。然而，本發(fā)明的目的并不必須要達(dá)到這種下調(diào)水平。而且，兩組干擾RNA單獨(dú)施用時(shí)對(duì)下調(diào)的影響是4艮微小的，但同時(shí)施用可以顯著更有效。在一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)的dssiRNA有效下調(diào)，下調(diào)量至少高達(dá)70%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多的dssiRNA—起有效下調(diào)，下調(diào)量至少高達(dá)70%。下調(diào)的檢測(cè)通常是用定量聚合SI^式反應(yīng)(QPCR)擴(kuò)增測(cè)量mRNA水平，或用蛋白質(zhì)印跡或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量蛋白質(zhì)水平。分析蛋白質(zhì)水平提供了對(duì)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA和翻譯抑制的估測(cè)。檢測(cè)下調(diào)的其它技術(shù)包括RNA溶液雜交、核酸酴床護(hù)、Northern雜交、反轉(zhuǎn)錄、用微陣列進(jìn)行基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、抗體結(jié)合、放射免疫測(cè)定和熒光活化細(xì)胞分析。還有一種檢測(cè)方法是過表達(dá)能誘導(dǎo)CTGF的回加入CTGFsiRNA，然后用上述任一方法檢測(cè)CTGFmRNA/蛋白質(zhì)的下調(diào)。通it^察人類或哺乳動(dòng)物中眼科疾病的好轉(zhuǎn)，也可以得到CTGF^L抑制的結(jié)論。例如，在老年性黃斑變性中，視覺喪失的減緩或逆轉(zhuǎn)顯示CTGF被抑制，青光眼病人中CTGFmRNA的沉默導(dǎo)致眼內(nèi)壓下降，延緩或阻止進(jìn)行性青光眼受試者的癥狀的發(fā)作。發(fā)明實(shí)施方案的千擾RNA以催化方式進(jìn)行，即，干擾RNA能夠以亞化學(xué)劑量實(shí)現(xiàn)目的mRNA的抑制。與反義療法相比，發(fā)揮治療效果需要的干擾RNA明顯更少。雙鏈干擾RNA:在此使用的雙鏈干擾RNA(也被稱作dssiRNA)有有義核苷酸序列和反義核苷酸序列，有義和反義核酸序列包含由至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。干擾RNA的長(zhǎng)度包括19至49個(gè)核苷酸，可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。dssiRNA的反義鏈在生理?xiàng)l件下可與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的一部分雜交，具有至少19個(gè)核苷酸的能與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。siRNA的反義鏈?zhǔn)莝iRNA的活性引導(dǎo)劑，因?yàn)榉戳x鏈結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)的RISC復(fù)合體上，引導(dǎo)結(jié)合復(fù)合體特異地結(jié)合到mRNA的與反義RNA的序列互補(bǔ)的序列上，從而使結(jié)合復(fù)合體對(duì)mRNA的切割得以發(fā)生。選擇siRNA的把序列"技術(shù)由Tuschl，T.etal，"ThesiRNAUserguide"提供，2004年5月6日^i丁，可從RockefellerUniversity網(wǎng)站獲得，或通it^Ambion公司的網(wǎng)站的Technicalbulletin#506，"siRNADesignGuideHnes"，獲得，使用搜索參數(shù)"最小35%,最大55%G/C含量，，從Invitrogen乂>司網(wǎng)站獲得，和通過Dharmacon7>司網(wǎng)站獲得。目的序列可以定位在編碼區(qū)或mRNA的5，或3，非翻譯區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，CTGF的DNA粑序列在SEQIDNO:1的1488到1506位核苷酸5，-ggttagtatcatcagatag-3，SEQIDNO:18.nt1488。本發(fā)明中靶向SEQIDNO:18的相應(yīng)mRNA序列并在每條鏈上各有一個(gè)3，UU突出端的的雙鏈siRNA是5'-gguu3guaucauc3gau3gUU-3，SEQIDNO:253'畫UUccaaucauaguagucuauc-5，SEQIDNO:26.。3，突出端可以有許多"U，，殘基，例如，在2，3，4,5和6之間并且包括2，3，4，5和6個(gè)的"U，，殘基數(shù)目。5，末端同樣有核苷酸的5，突出端。本發(fā)明的靶向SEQIDNO:18的相應(yīng)mRNA序列并在每條鏈上各有一個(gè)3，TT突出端的的雙鏈siRNA是5，-gguuagu3iicauc3g3U3gTT-3'SEQIDNO:273'-TTccaaucauaguagucuauc-5，SEQIDNO:28.雙鏈siRNA的兩^^可以通過發(fā)夾環(huán)連起來(lái)形成如下的單鏈siRNA:5'-gguuaguaucaucag3uagUUNNN\N3'-UUccaaucauaguagucuaucNNNNN/SEQIDNO:29.N是核苷酸A、T、C、G、U、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的修飾形式。核苷酸N的數(shù)量在3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-ll之間，并且包括3、23、5、15、7、13、4、9或9、11個(gè)，或核苷酸N的數(shù)量是9個(gè)。表1列舉了SEQIDNO:1的CTGFDNA目的序列的實(shí)例，本發(fā)明中這些siRNA是按如上所闡明方式從SEQIDNO:l設(shè)計(jì)的。表1siRNA的CTGF把序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如上實(shí)例所引用的，M域技術(shù)人員能夠利用表1所提供的乾序列信息，參考SEQIDNO:1中的序列位置，并加入或者缺失與SEQIDNO:1互補(bǔ)或接近互補(bǔ)的核苷酸，設(shè)計(jì)出比表l中提供的序列更長(zhǎng)或更短的干擾RNA。由ds或sssiRNA指導(dǎo)的對(duì)靶RNA的切割反應(yīng)具有高度的特異性。通常，含有與靶mRNA的部分相同的有義核苷酸序列和與有義鏈完全互補(bǔ)的反義部分的siRNA是抑制CTGFmRNA的實(shí)施方案。然而，在本發(fā)明的具體實(shí)踐中并不要求siRNA的反義鏈與靶mRNA有100%的序列互補(bǔ)性。因此，本發(fā)明考慮到了可以由遺傳突變、菌林多態(tài)性或進(jìn)化分歧而產(chǎn)生的序列變異。例如，相對(duì)于把序列有插入、缺失或單點(diǎn)突變的siRNA序列都是有抑制效果的。siRNA的反義序列具有至少19個(gè)核苷酸與mRNA把序列接近完全連續(xù)互補(bǔ)。在此使用的"接近完全"是指siRNA的反義序列與把mRNA的至少一部分"基本上互補(bǔ)"，siRNA的有義序列與粑mRNA至少一部分"W上同一"。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的"同一性"是指通過匹配序列之間的核普酸順序所確定的核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，與靶mRNA序列具有80%和80%到100%互補(bǔ)性的反義RNA被認(rèn)為具有接近完全的互補(bǔ)性，并且可以在本發(fā)明中使用."完全"連續(xù)互補(bǔ)性是指相鄰堿基對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick威基配對(duì)。"至少接近完全"連續(xù)互補(bǔ)包括在此使用的"完全"互補(bǔ)。設(shè)計(jì)用于確定同一性或互補(bǔ)性的計(jì)算機(jī)方法來(lái)提供核酸序列的最大程度的匹配，如BLASTP和BLASTN(Altschul，S.F.，etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)，以及FASTA。SEQIDNO:1的乾序列可以在mRNA的5，或3，非翻譯區(qū)和mRNA的編碼區(qū)中。雙鏈干擾RNA的一條或兩^:可以具有1到6個(gè)核苷酸的3，突出端，這些核苷酸可以是核糖核苷酸，或脫氧核糖核苷酸，或其混合物。突出端的核苷酸不是威基配對(duì)的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，干擾dsRNA包含TT或UU的3，突出端。雙鏈siRNA的有義鏈和反義鏈可以為如上所述的由兩條單鏈組成的雙鏈體形式，或可以是單個(gè)分子，其中互補(bǔ)區(qū)域堿基配對(duì)并通過發(fā)夾或環(huán)共價(jià)連接形成單鏈。認(rèn)為發(fā)夾在細(xì)胞內(nèi)被稱作切丁酶的蛋白質(zhì)切割，以形成由兩個(gè)單個(gè)的威基配對(duì)的RNA分子組成的干擾RNA。干擾RNA可以因一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、替換或修飾而有別于天然存在的RNA。非核苷酸物質(zhì)可以結(jié)合到干擾RNA的5，端、3，端，或內(nèi)部。設(shè)計(jì)這種修飾通常是為了增加干擾RNA對(duì)核酸酶的抗性，增強(qiáng)細(xì)胞的攝入，增強(qiáng)細(xì)胞乾向，有助追蹤干擾RNA，或進(jìn)一步增加穩(wěn)定性。例如，干擾RNA可以在突出端包含嘌呤核苷酸。例如，通過吡咯烷將膽固醇連接到siRNA分子的有義鏈的3，末端，也能使siRNA穩(wěn)定。其他的修飾包括例如3，端生物素分子、已知具有細(xì)胞穿透性質(zhì)的肽、毫微粒、擬肽、熒光染料，或樹狀聚體。核苷酸可以在分子的^部分上、糖部分上或磷酸部分上修飾并^本發(fā)明的實(shí)施方案中發(fā)揮作用。修飾包括如用烷基、烷氧基、氨基、脫氮雜、囟、羥基、硫幾基或其組合取代。核苷酸可以3皮有更高穩(wěn)定性的類似物所置換，如用2，脫氣-T置換U,或具有糖修飾，如用2，#^或2，甲基、2，甲緣乙基，或2，-0，4，-C亞曱基橋取代2，羥基。核苷酸的嘌呤或嘧啶類似物的實(shí)例包括黃噪呤、次黃噪呤、氮雜噪呤、甲減基腺噪呤、7-脫氮雜-腺苷、O-和N-修飾的核苷酸。核苷酸的磷酸基團(tuán)可以用氮或硫(硫代鱗酸)取代磷脧基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)氧進(jìn)行^務(wù)飾，在反義siRNA上可以有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的一部分不互補(bǔ)的區(qū)域。不互補(bǔ)區(qū)域可以在互補(bǔ)區(qū)域的3，端、5，端、或兩端。千擾RNA可以由合成產(chǎn)生，如體外轉(zhuǎn)錄、siRNA表達(dá)栽體、或PCR表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)染siRNA良好發(fā)揮功能的干擾RNA也作為體內(nèi)表達(dá)的siRNA良好發(fā)揮功能。干擾RNA能夠利用受保護(hù)的核糖核苷亞磷跣胺和常規(guī)DNA/RNA合成儀進(jìn)行化學(xué)合成，也可從商業(yè)供應(yīng)商如AmbionInc.(Austin,Texas)、Invitrogen(Carlsbad,CA)或Dharmacon(Lafayette，Colo"USA)處H得。干擾RNA能用如溶劑提取或樹脂，沉淀，電泳，層析，或這些方法的組合進(jìn)行純化。備選地，可以使用幾乎不經(jīng)純化的干擾RNA，以避免樣品處理過程中的損失。干擾RNA可以從重組質(zhì)粒表達(dá)提供給受試者，這些質(zhì)粒利用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如U6或HIRNApolIII啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、SP6、T3或T7啟動(dòng)子，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，Invivogen(SanDiego，CA)的psiRNATM允許在細(xì)胞內(nèi)從RNApolIII啟動(dòng)子產(chǎn)生siRNA。用重組質(zhì)粒表達(dá)的干擾RNA可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離。表達(dá)干擾RNA的病毒栽體可來(lái)自腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒、棒狀病毒、鼠白血病病毒)、皰滲病毒等等，使用上述啟動(dòng)子，如用于質(zhì)粒的啟動(dòng)子。病毒栽體的選擇、栽體表達(dá)干擾RNA的方法、遞送病毒栽體的方法都在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)。干擾RNA的表達(dá)也可通過使用SILENCEREXPRESSTM(Ambion，Austin,Texas)通it^達(dá)盒(SECs)提供，該表達(dá)盒具有由PCR產(chǎn)生的人HI、人U6或小鼠U6啟動(dòng)子。沉默表達(dá)盒是包含啟動(dòng)子和發(fā)夾siRNA模板側(cè)翼終止序列的PCR產(chǎn)物。發(fā)夾siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，從PCR產(chǎn)物表達(dá)，并誘導(dǎo)特異的沉默。生理?xiàng)l件下的雜交"雜交"是這樣的技術(shù)，其中允許單鏈核酸(DNA或RNA)相互作用，從而那些有互補(bǔ)或接近互補(bǔ)的^序列的核酸形成稱作雜合物的以氬鍵連接的復(fù)^。雜U應(yīng)是靈敏的，并具有選擇性，當(dāng)鑒定樣品中以低濃度存在時(shí)的特定目的序列.雜交的特異性(如嚴(yán)格性)是由體外預(yù)雜交和雜交液中的鹽或甲耽胺的濃度，和雜交溫度控制的，并且是本領(lǐng)域中已知的。具體地，通過降低鹽濃度、提高甲跣胺的濃度，或升高雜交溫度，可以提高嚴(yán)格性.例如，高嚴(yán)格逸務(wù)泮可以在37'C到42t:,約50%的甲跣胺下發(fā)生，低嚴(yán)格性條件可以在約30'C到35'C,約35%到25%的甲酰胺下發(fā)生，在Sambrook,J,，1989，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約上提供了雜交嚴(yán)格條件的實(shí)例。嚴(yán)格雜交條件的另外的實(shí)例包括400mMNaCl，40mMPIPESPH6.4,lmMEDTA，50。C或70。C12-16小時(shí)，然后洗滌，或在1XSSC中70。C雜交或1XSSC，50%甲酰胺中50'C雜交，然后0.3XSSC中7(TC洗滌，或在4XSSC中70'C雜交或4XSSC，50%甲酰胺中50。C雜交，然后1XSSC中67。C洗滌。雜交的溫度比雜合物的解鏈溫度(Tm)低約5到10°C，當(dāng)雜合物的長(zhǎng)度在19到49個(gè)4對(duì)之間時(shí)，用下面的公式計(jì)算解鏈溫度Tm。C-81,5+16.6(logn)Na+l)+0.41(。/oG+CH600/N),其中N是雜合物的>5^數(shù)，[Na+是雜交緩沖液中鈉離子的濃度。本發(fā)明的實(shí)施方案中，在體外高度嚴(yán)旨ft下能與CTGFmRNA雜交的干擾RNA的反義鏈在體內(nèi)生理?xiàng)l件下也能特異性結(jié)合。在高度嚴(yán)^件下不與核酸雜交的相關(guān)核酸的鑒定或分離在降低的嚴(yán)格性條件下進(jìn)行。單鏈干擾RNA:如上所引，干擾RNA最終以單鏈形式發(fā)揮作用。發(fā)現(xiàn)sssiRNA實(shí)現(xiàn)mRNA的沉默，雖然比雙鏈RNA效率要低。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案也提供了sssiRNA的施用，其中單鏈siRNA在生理?xiàng)l件下可與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的一部分雜交，具有能與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的雜交部分的至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。單鏈siRNA的長(zhǎng)度為關(guān)于如上所引雙鏈siRNA的19-49個(gè)核苷酸。單鏈siRNA具有5，磷酸或在原位或在體內(nèi)在5，位磷酸化。術(shù)語(yǔ)"5，砩酸化，，用于描述如具有通過酯鍵連接5，糖的C5羥基的磷酸基團(tuán)的多核苷酸或寡核苷酸(如，5，核糖或脫氧核糖，或它們的類似物)。單鏈siRNA可以有單-,雙-，或三-個(gè)磷酸基團(tuán)。單鏈siRNA可通過化學(xué)合成，或如雙鏈siRNA通過栽體產(chǎn)生'5，磷酸基團(tuán)可以經(jīng)激酶加入，或5，磷酸可以是核酸酶對(duì)RNA的切割產(chǎn)生.遞送如雙鏈siRNA那樣進(jìn)行.在一個(gè)實(shí)施方案中，施用具有受保護(hù)的末端和核酸酶抗性修飾的單鏈siRNA用于沉默。單鏈siRNA可以干燥保存或溶于水溶液中。為保持穩(wěn)定，溶液可含有緩沖劑或鹽，以抑制退火或用于穩(wěn)定。發(fā)夾干擾RNA:發(fā)夾干擾RNA是單鏈的，在一a內(nèi)既有有義鏈和反義鏈。為了通過DNA載體表達(dá)，對(duì)應(yīng)于有義siRNA序列的至少19個(gè)核苷酸的相應(yīng)DNA寡核香酸通過短的間隔區(qū)連接到它的反向互補(bǔ)反義序列上。如果所選的表達(dá)載體需要，可以增加3，末端T，，以及形成限制性位點(diǎn)的核苷酸。所產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物自身折疊形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。施用方式干擾RNA可通過眼組織注射直接遞送到眼，如眼周、結(jié)膜、sub-Tenons、前房?jī)?nèi)、玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜下、目鋒后的、或小管內(nèi)注射；或利用導(dǎo)管或其它放置裝置直接應(yīng)用于眼，所述裝置如視網(wǎng)膜丸劑、眼內(nèi)插入物、栓劑，或包含多孔的、非多孔的或^狀物質(zhì)的;tiA物；通過在局部眼滴劑或軟骨劑；或通過盲管中的緩釋裝置，或通過tiLA臨近鞏膜(經(jīng)鞏膜)或眼內(nèi)的緩釋裝置來(lái)遞送。眼內(nèi)注射可以通過角膜到達(dá)前房，使得藥劑到達(dá)小梁網(wǎng)。小管內(nèi)注射可以1靜脈收集通道，排空施萊姆管或i^施萊姆管。受試者需要眼科疾病治療或有發(fā)生眼科疾病危險(xiǎn)的受試者是指有與情況危險(xiǎn)的人或其他哺乳動(dòng)物。這些眼科疾病可以包括例如青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和創(chuàng)傷愈合，和有疤痕過度產(chǎn)生、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、纖維增殖的狀況。與這些疾病相關(guān)的眼結(jié)構(gòu)可以包括例如視網(wǎng)膜，脈絡(luò)膜，晶狀體，角膜，小梁網(wǎng)，視桿，視錐，神經(jīng)節(jié)，黃斑，虹膜，鞏膜，眼房，玻璃體腔，睫狀體，^1#經(jīng)盤，視盤，或視網(wǎng)膜中凹。制劑和劑量藥物包含按重量計(jì)高達(dá)99n/。的本發(fā)明的干擾RNA或其鹽，其與生理學(xué)可接受的眼科栽體媒介如水，緩沖劑、鹽水、甘氨酸、透明質(zhì)酸、甘露醇等等混合在一起.本發(fā)明中干擾RNA以溶液劑、混懸劑或乳劑施用。以下是在本發(fā)明體現(xiàn)的可能的制劑的實(shí)例.<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明實(shí)施方案中干擾RNA的有效量包含眼部或近眼部從200pM到100nM，或從lnM到50nM，或從5nM到約25nM的細(xì)胞間濃度。根據(jù)熟練臨床醫(yī)生的常規(guī)判斷，每天一到四次遞送局部組合物到眼表面。制劑的PH值是約pH4-9，或pH4.5到pH7.4。雖然精確的方案交由臨床醫(yī)生去判斷，干擾RNA可以每天一到四次在每只眼中滴一滴或由臨床醫(yī)生指導(dǎo)。制劑的有效量依賴于如受試者的年齡，種族，性別等因素，或眼科疾病的嚴(yán)重程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，干擾RNA以治療劑量局部遞送到眼，到達(dá)小梁網(wǎng)，視網(wǎng)膜或視神經(jīng)頭，從而改善CTGF相關(guān)的疾病進(jìn)程。可接受的載體眼科可接受栽體是指那些至多、幾乎不或不導(dǎo)致眼刺激的那些載體，其如需要可拔J^適的防腐作用，并以均勻的劑量遞送本發(fā)明的一種或多種干擾RNA。用于施用本發(fā)明實(shí)施方案的干擾RNA的可接受栽體包括MinisTransIT-TKOsiRNA轉(zhuǎn)染試劑(MinisCorporation,Madison,Wisconsin)、LIPOFECTIN、lipofectamine、OLIGOFECTAMINE(Invitrogen，Carlsbad,CA)、CELLFECTIN、DHARMAFECTTM(Dharmacon，Chicago,IL)或聚陽(yáng)離子如^Jl氨酸、脂質(zhì)體或脂溶物質(zhì)如膽固醇。脂質(zhì)體是由標(biāo)準(zhǔn)的囊泡形成脂質(zhì)和固醇類如膽固醇所形成的，可以包括把分子，如與內(nèi)皮細(xì)lfe^面抗原有結(jié)合親和力的單克隆抗體。另外，脂質(zhì)體可以是聚乙二醇化的脂質(zhì)體。對(duì)于眼科遞送，干擾RNA可以與B^可接受的防腐劑、共溶劑、表面活性劑、增稠劑、滲透促進(jìn)劑、緩沖劑、氯化鈉、或水形成一種水性的無(wú)菌眼科混懸劑或溶液劑。目M"溶液制劑可以通過將抑制劑溶解在生理學(xué)可接受的等滲水性緩沖液中制備.另外，眼科溶液劑可以包括眼科可接受的表面活性劑以促進(jìn)抑制劑的溶解。在本發(fā)明的組合物中可以加入粘性助劑(buildingagents),如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等，以提高化合物的滯留。為了制備無(wú)菌的眼科軟骨制劑，干擾RNA在適當(dāng)?shù)妮d體如礦物油、液體羊毛脂或白礦脂中和防腐劑組合在一起。無(wú)菌眼科劍歐制劑可以根據(jù)本領(lǐng)域其他眼科制劑的方法，將干擾RNA懸浮在從如CARBOPOL-940(BFGoodrich，Charlotte,NC)等的組合制備的親水基質(zhì)中制備。如VISCOAT(AlconLaboratories,Inc"FortWorth,TX)可以用于眼內(nèi)注射。當(dāng)干擾RNA在眼中的滲透力不夠時(shí)，本發(fā)明的其他組合物可以含有滲透促進(jìn)劑如crem印hor和TWEEN⑧80(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯，SigmaAldrich，St丄ouis，MO)。試劑盒本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包括用于減弱細(xì)胞中CTGFmRNA表達(dá)的試劑的試劑盒。該試劑盒含有DNA模板，它有兩種不同的啟動(dòng)子如T7啟動(dòng)子，T3啟動(dòng)子或SP6啟動(dòng)子，每個(gè)都能有效連接編碼對(duì)應(yīng)于干擾RNA的兩條互補(bǔ)單鏈RNA的核苷酸序列。RNA從DNA模板轉(zhuǎn)錄出來(lái)，退火形成雙鏈RNA,其有效減弱乾mRNA的表達(dá)。該試劑盒任選含有用于從DNA模板擴(kuò)增DNA序列的擴(kuò)增引物，和用于合成RNA的核苷三磷酸(如ATP,GTP，CTP和UTP)。任選地，試劑盒含有兩種RNA聚合酶，每個(gè)都能和DNA模板上的啟動(dòng)子結(jié)合，和實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子有效連接的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，用于純化單鏈RNA的純化柱，如大小排阻層析柱，一種或多種緩沖液，如使單鏈RNA退火以產(chǎn)生雙鏈RNA的緩沖液，和用于純化雙鏈RNA的RNA酶A或RNA酶T。實(shí)施例1用于沉默小梁網(wǎng)細(xì)胞中CTGF的干擾RNA及檢測(cè)沉默的標(biāo)準(zhǔn)本發(fā)明檢測(cè)了在人小梁網(wǎng)(TM)細(xì)胞中，CTGF干擾RNA對(duì)內(nèi)源性CTGF表達(dá)水平的下調(diào)能力.本發(fā)明也提供了在使用QPCR引物測(cè)量時(shí)，測(cè)定干擾RNA對(duì)mRNA水平功效的標(biāo)準(zhǔn).以l:l(w/v)的比例，用CTGF干擾RNA的標(biāo)準(zhǔn)體外濃度(100nM)和LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen，Carlsbad,California),轉(zhuǎn)染名為GTM3或HTM-3(參見Pang,I.H.etal.，1994，Curr.EyeRes.13:51-63)的轉(zhuǎn)化的人TM細(xì)胞系。使用商業(yè)設(shè)計(jì)的未知序列干擾RNA庫(kù)(siGENOMESMARTPOOL⑧CTGF干擾RNA(在此稱作siRNAS4)，Dharmacon，Lafayette,Colorado)來(lái)耙定CTGF。亂序和核纖層蛋白A/CsiRNA(Dharmacon)用作對(duì)照。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果是，與亂序干擾RNA對(duì)照比較，用核纖層蛋白A/C干擾RNA下調(diào)核纖層蛋白A/C的效率接近卯。/。。最初的研究表明，使用siGENOMESMARTPOOL⑧CTGFsiRNAM國(guó)012633-00畫0020(siRNAS4)時(shí)，用針對(duì)外顯子5中的CTGFmRNA3，UTR的引物/探針組Q2，CTGF的下調(diào)效率約20%到30%。Q2是來(lái)自ABI(AppliedBiosystemsFosterCity，CA)的QRCRTAQMAN⑧引物/探針組，為了確定CTGFsiRNA效率低下的原因，測(cè)量了幾個(gè)變量。測(cè)試CTGF干擾RNA的劑量反應(yīng)以確定是否使用了次最優(yōu)的干擾RNA濃度或次最優(yōu)的干擾RNA:脂質(zhì)比例。得到的數(shù)據(jù)表明低的CTGFmRNA下調(diào)與所使用的干擾RNA濃度或干擾RNA:脂質(zhì)比例無(wú)關(guān)?？紤]到細(xì)胞攝入對(duì)siRNA活性的重要性和轉(zhuǎn)染TM細(xì)胞的固有困難，在上述條件下測(cè)量了TM細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。由SITOXTM(Dharmacon)遞送到細(xì)M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡或用SIGLOTM(Dharmacon)檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)熒光測(cè)量的細(xì)胞熒光來(lái)反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率.在兩種情形下，幾乎所有細(xì)胞不是死亡(圖1A;s汀oxTM)就是發(fā)熒光的(圖ib;siglo),表明轉(zhuǎn)染效率幾乎是定量的，并JLfc這個(gè)過程中不是fflil步驟.更進(jìn)一步地，結(jié)合兩個(gè)不同的稱作Q2和Q1(ABI，Applied股osystemsFosterCity,CA)的QPCRTAQMAN⑧引物/探針組，檢測(cè)了AmbionInc.(Austin，Texas)的另外三種稱作siRNASl、S2和S3的單獨(dú)的CTGFsiRNA序列。AmbionsiRNA的把序列如下，對(duì)于CTGF的核苷酸(nts)使用GenBank參考號(hào)NM一001卯1中Sl的把標(biāo)(nts379-397):gggcctcttctgtgacttcSEQIDNO:2S2的乾標(biāo)(nts901-919):gggcaaaaagtgcatccgtSEQIDNO:5S3的把標(biāo)(ntsl488國(guó)1506):ggttagtatcatcagatagSEQIDNO:18上面每條乾序列的每M上都有3，TT突出端的雙鏈siRNA為siRNASI:5'-gggccucuucugugacuucTT-33'-Ttcccggagaagacacug3ag-5'SEQIDNO:30SEQIDNO:31siRNAS2:5，-gggcaaaaagugc3uccguTT-3'3'-TTcccguuuuuc3cguaggca-5'siRNAS3:SEQIDNO:32SEQIDNO:335'-gguuagu3UC3ucagauagTT-33'-TTccaaucauaguagucuauc-5'SEQIDNO:28SEQ，DNO:27QPCRQl引物是ABIASSAYONDEMANDTM的專有序列hs00170014一ml(AppliedbioSystems)。QPCRQ2正向引物具有序列5，畫CAGCTCTGACATTCTGATTCGAA-3，SEQIDNO:34Q2反向引物具有序列5，-TGCCACAAGCTGTCCAGTCT-3，SEQIDNO:35Q2探針具有序列5，-AATCGACAGGATTCCGATTCCTGAACAGTG-3，SEQIDNO:36并且在5，末端有FAM基團(tuán)(6l基熒光素)，在3，末端有TAMRA基團(tuán)(AppliedbioSystems)。圖2A中顯示了引物/探針組相對(duì)于各個(gè)siRNA的siRNA把位點(diǎn)的位置。圖2A示意圖也顯示了CTGF基因外顯子(盒)和內(nèi)含子(線)的結(jié)構(gòu)，和siRNASI、S2、S3和QPCR引物/探針組Ql和Q2對(duì)應(yīng)于GenBankCTGF序列NMJ)Ol卯l(以SEQIDNO:l換一供)的位置.圖2B顯示用外顯子5引物/^4{"組Q2和siRNASl-S4進(jìn)行CTGFmRNA的QPCR擴(kuò)增，當(dāng)使用SI和S4siRNA時(shí)，Q2引物/探針組沒有檢測(cè)到CTGFmRNA水平的顯著下調(diào).證明通過siRNAS2和S3的下調(diào)。相對(duì)于SIsiRNA的靶標(biāo)，引物/探針組Q2更接近于S2和S3siRNA的靶標(biāo)。圖2C顯示用跨越外顯子4/5的引物/探針組Ql進(jìn)行CTGFmRNA的QPCR擴(kuò)增。證明每個(gè)siRNA都能使CTGFmRNA下調(diào)，用Ql引物/探針組檢測(cè)時(shí)，用S2siRNA觀察到約卯。/o的下調(diào)。引物/^^針組Ql在證明siRNA下調(diào)時(shí)似乎比Q2引物/^4f組更有效。圖2B和圖2C的數(shù)據(jù)表明用針對(duì)3，-UTR的引物/探針組Q2擴(kuò)增的特定區(qū)域可以相對(duì)穩(wěn)定，因此估測(cè)CTGFmRNA被把定siRNA切割和降解的選擇較少。因此，在QPCR的擴(kuò)增區(qū)域位于siRNA靶定區(qū)域以外的特定情況下，siRNA的功效可能被低估了。為了降低非特異性脫耙效應(yīng)，測(cè)量了抑制CTGFmRNA表達(dá)的最低可以s股NA濃度。用引物/探針組Ql通過QPCR估測(cè)CTGFmRNA的下調(diào)。圖3顯示GTM3細(xì)胞中CTGFS2siRNA的劑量反應(yīng)。用0、1、3、10、30和100nM劑量范圍的S2siRNA處理GTM3細(xì)胞24小時(shí)后，觀察到IC50為2,5nM。數(shù)據(jù)用GraphPadPrism4軟件(GraphPadSoftware，Inc.,sanDiego，CA)，使用可變斜率、S形劑量反應(yīng)算法、最大約束100%進(jìn)行擬合。這個(gè)實(shí)施例的結(jié)果證明i)小梁網(wǎng)細(xì)胞進(jìn)行siRNA沉默，ii)在此引用的所有siRNA都實(shí)現(xiàn)一定程度的沉默，和iii)當(dāng)使用基于PCR的方法確定siRNA下調(diào)功效時(shí)，PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)成包括siRNA耙序列以使沉默檢測(cè)最優(yōu)化，已經(jīng)表明RISC內(nèi)切核酸酶對(duì)牝mRNA的切割發(fā)生在靠近siRNA靶序列中心(Elbashir，S.M.，etal.，2001,GenesDev15:188-200)并且由ArgonauteRNA酶H活性完成(Liu，J.，etalScience305:1437-1441)。然而，似乎不能保證剩余mRNA的徹底降解。Argonaute切割后剩下穩(wěn)定的mRNA片段，用QPCR擴(kuò)增這些片段任一種，都可以低估在此顯示的siRNA功效。本發(fā)明提供了一個(gè)實(shí)施方案，其中QPCR引物組包括siRNA乾序列，以保證最佳的siRNA效率讀出。在此所引的參考文獻(xiàn)，在能對(duì)在此闡述過的提供示范性步驟或其他細(xì)節(jié)的補(bǔ)充的程度上，都特別引入作為參考。根據(jù)^^開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，可以對(duì)本文公開的實(shí)施方案進(jìn)行明顯的修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。根據(jù)^/>開，可以進(jìn)行和實(shí)施根據(jù)本公開的所有實(shí)施方案而不用過度實(shí)驗(yàn)。在;*^>開和其等同實(shí)施方案中給出了本發(fā)明的完整范圍。本說(shuō)明書不應(yīng)被解釋為不當(dāng)?shù)乜s小本發(fā)明應(yīng)有的完蒼床護(hù)范圍。除非另外i兌明，在此使用的術(shù)語(yǔ)"一個(gè)，，是指"一個(gè)"，"至少一個(gè)，，或"一個(gè)或多個(gè)"。權(quán)利要求1.減弱受試者眼中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)的方法，其包括對(duì)受試者的眼施用包含有效量的長(zhǎng)度為19到49個(gè)核苷酸的干擾RNA和可藥用載體的組合物，該干擾RNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列，和至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1的mRNA的一部分雜交，并且具有至少19個(gè)核苷酸的與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1的mRNA的雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域，其中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)被減弱。2.權(quán)利要求l的方法，其中受試者具有結(jié)締組織生長(zhǎng)因子相關(guān)的眼科疾病。3.權(quán)利要求l的方法，其中受試者處于患結(jié)締組織生長(zhǎng)因子相關(guān)的眼科疾病的危險(xiǎn)中。4.權(quán)利要求2的方法，其中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子相關(guān)的眼科疾病是青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或創(chuàng)傷愈合。5.權(quán)利要求l的方法，其中反義序列具有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的至少21到23個(gè)核苷酸的區(qū)域，并包含有義和反義序列的每條序列的3，末端的額外的TT序列。6.權(quán)利要求l的方法，其中有義核苷酸序列和反義核苷酸序列通過環(huán)狀核苷M列連接。7.權(quán)利要求l的方法，其中通過局部、玻璃體內(nèi)或經(jīng)鞏膜途徑施用所述組合物。8.權(quán)利要求1的方法，其中反義序列設(shè)計(jì)成靶定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。9.權(quán)利要求1的方法，其中反:JUf列設(shè)計(jì)成靶定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、901或1488位核普酸的核苷酸序列。10.權(quán)利要求1的方法，其中反義序列設(shè)計(jì)成靶定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的包含379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。11.權(quán)利要求1的方法，其中反義序列設(shè)計(jì)成靶定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的包含379、卯l或1488位核苷酸的核苷酸序列。12.權(quán)利要求l的方法，其中反義序列包含3，-TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。13.權(quán)利要求l的方法，其中反5L^列包含3，-TTcccggagaagacacugaag-5，SE(JIDNO:31。14.權(quán)利要求l的方法，其中反5Uf列包含3，-TTccaaucauagimgucuauc-5，SEQIDNO:28。15.權(quán)利要求l的方法，其中干擾RNA包含5，-gggccucuucugugacuucTT-3'SEQIDNO:30和3，-TTcccggagaagacacugaag-5，SEQIDNO:31。16.權(quán)利要求l的方法，其中干擾RNA包含5，-gggcaaaaagugcauccguTT-3，SEQIDNO:32和3，-TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。17.權(quán)利要求l的方法，其中干擾RNA包含5'國(guó)gguuaguaucaucagauagTT國(guó)3'SEQIDNO:27和3,-TTccaaucauaguagucuauc誦5，SEQIDNO:28。18.權(quán)利要求1的方法，其還包括對(duì)受試者的眼施用另一種干擾RNA，其長(zhǎng)度為19到49個(gè)核苷酸，并且包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列，和至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全互補(bǔ)的區(qū)域；其中該另一種干擾RNA的反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的另一部分雜交，并且該反義序列具有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的另一雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的至少19個(gè)核苷酸的區(qū)域。19.減弱受試者眼中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的方法，其包括對(duì)受試者的目Mfe用包含有效量的長(zhǎng)度為19到49個(gè)核苷酸的單鏈干擾RNA和可藥用載體的組合物；其中該單鏈干擾RNA在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、卯l、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的一部分雜交，并且該干擾RNA具有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的雜交部分至少接近完全互補(bǔ)的區(qū)域，其中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)被減弱。20.組合物在生產(chǎn)治療需要其的受試者的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子相關(guān)的目|1#疾病的藥物中的用途，該組合物包含有效量的長(zhǎng)度為19到49個(gè)核苷酸的千擾RNA和可藥用栽體，該千擾RNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列，和至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中反5C^列在生理^Hf下與對(duì)應(yīng)于SEQEDNO:1的mRNA的一部分雜交，并且具有至少19個(gè)核苷酸的與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。21.權(quán)利要求20的用途，其中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子相關(guān)的眼科疾病是青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、增殖性玻璃,網(wǎng)膜病變或異常的創(chuàng)傷愈合。22.權(quán)利要求20的用途，其中反義序列具有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的至少21到23個(gè)核苷酸的區(qū)域，并包含有義和反義序列的每條序列的3，末端的額外的TT序列。23.權(quán)利要求20的用途，其中有義核苷酸序列和反義核苷酸序列通過環(huán)狀核苷酸序列連接。24.權(quán)利要求20的用途，其中通過局部、玻璃體內(nèi)或經(jīng)鞏膜途徑施用所述組合物。25.權(quán)利要求20的用途，其中反義序列設(shè)計(jì)成耙定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、卯l、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。26.權(quán)利要求20的用途，其中反義序列設(shè)計(jì)成靶定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、卯l或1488位核苦酸的核苷酸序列。27.權(quán)利要求20的用途，其中反義序列設(shè)計(jì)成靶定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的包含379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的核苷酸序列。28.權(quán)利要求20的用途，其中反^列設(shè)計(jì)成靶定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的包含379、卯l或1488位核苷酸的核苷酸序列。29.權(quán)利要求20的用途，其中反5C^列包含3，畫TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。30.權(quán)利要求20的用途，其中反義序列包含3，畫TTcccggagaagacacugaag-5，SEQIDNO:31。31.權(quán)利要求20的用途，其中反義序列包含3，-TTcccguagucuauc-5"SEQIDNO:28。32.權(quán)利要求20的用途，其中干擾RNA包含5'誦gggccucuucugugacuucTT誦3'SEQIDNO:30和3，-TTcccggagaagacacugaag誦5，SEQIDNO:31。33.權(quán)利要求20的用途，其中干擾RNA包含5'-gggcaaaaagugcauccguTT-3，SEQIDNO:32和3，-TTcccguuuuucacguaggca-5，SEQIDNO:33。34.權(quán)利要求20的用途，其中干擾RNA包含5，-gguuaguaucaucagauagTT-3，SEQIDNO:27和3，-TTccaaucauaguagucuauc-5，SEQIDNO:28.35.權(quán)利要求20的用途，其中組合物還包含另一種干擾RNA，其長(zhǎng)度為19到49個(gè)核苷酸，并且包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列，和至少19個(gè)核苷酸的至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中該另一種干擾RNA的反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的另一部分雜交，并且該反義序列具有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的另一雜交部分至少接近完全連續(xù)互補(bǔ)的至少19個(gè)核苷酸的區(qū)域。36.組合物在生產(chǎn)治療需要其的受試者中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子相關(guān)的BM"疾病的藥物中的用途，該組合物包含有效量的長(zhǎng)度為19到49個(gè)核苷酸的單鏈干擾RNA和可藥用栽體；其中該單鏈干擾RNA在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的mRNA的起始于379、691、801、901、932、937、969、986、1119、1170、1201、1346、1473、1478、1481、1488、1626、1660或1666位核苷酸的一部分雜交，并且該干擾RNA具有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l的mRNA的雜交部分至少接近完全互補(bǔ)的區(qū)域。全文摘要提供了RNA干擾技術(shù)用于抑制與CTGF表達(dá)有關(guān)的眼科疾病中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)。與異常CTGF表達(dá)有關(guān)的眼科疾病包括青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和創(chuàng)傷愈合。通過施用本發(fā)明的干擾RNA來(lái)治療這些疾病。文檔編號(hào)A61K48/00GK101160138SQ200580047923公開日2008年4月9日申請(qǐng)日期2005年12月19日優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日發(fā)明者A·R·謝帕德,彭玉豪申請(qǐng)人:愛爾康公司