專利名稱：：用于免疫分析的甲基苯丙胺衍生物和結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及用于確定生物樣品中的藥物濫用的免疫分析方法的領(lǐng)域，尤其是，涉及用于確定苯丙胺類藥物的免疫分析方法，更尤其涉及可因此使用的曱基苯丙胺衍生物和結(jié)合物。
背景技術(shù)：
：通常稱作"迷幻類藥物"的一類違法設(shè)計師藥物的使用和濫用近年來已顯著增加。這些化合物是特征在于具有稠合亞曱基二氧基苯基環(huán)體系的苯丙胺的衍生物，包括MDA(3,4-亞曱基二氧基苯丙胺)，MDMA,還稱作"迷幻劑"(3,4-亞甲基二氧基-N-曱基苯丙胺)，MDEA,還稱作"Eve"(3,4-亞甲基二氧基-N-乙基苯丙胺)，BDB(3,4-亞甲基二氧基苯基-2-丁胺)，和MBDB(3,4-亞曱基二氧基苯基-N-曱基丁胺)。迄今，用于檢測迷幻類藥物的方法主要涉及原先開發(fā)用于檢測苯丙胺和/或曱基苯丙胺的免疫分析。通過這些分析對迷幻類藥物的檢測依賴于可在苯丙胺和/或甲基苯丙胺抗體之間同時存在的有限相互反應性。通過這種分析得到的實際結(jié)果仍不能表明亞曱基二氧基(MD)類衍生物的何種特定物質(zhì)或成分存在于樣品中。一般來說，苯丙胺和曱基苯丙胺免疫分析對迷幻類藥物是相對不敏感的，和無-特定性的。這些分析具有特別有限的對MDEA衍生物的識別。本發(fā)明涉及這些和其它問題的改善，其中涉及使用常規(guī)苯丙胺和/或甲基苯丙胺免疫分析用于檢測亞曱基二氧基類，或迷幻類藥物成分。在用于藥物濫用的測試中，免疫分析，尤其竟爭性結(jié)合免疫分析已被證實是尤其有利的。在竟爭性結(jié)合免疫分析中，生物樣品中的分析物與標記試劑，或分析物類似物，或示蹤劑竟爭該分物和分析物類似物所特定的抗體上的有限數(shù)目的受體結(jié)合位。酶如P-半乳糖苷酶和過氧化酶，熒光分子如熒光素化合物，放射性化合物如1251,和微顆粒是常用作示蹤劑的標記物質(zhì)。分析物在樣品中的濃度決定結(jié)合至抗體上的分析物類似物的量。分析物類似物的結(jié)合量與分析物在樣品中的濃度成反比，因為分析物和分析物類似物分別以其相應的濃度結(jié)合至抗體上。游離或結(jié)合分析物類似物的量可隨后通過適合所用特殊標簽的方法而確定。目前流行的是基于^1顆粒在溶液中的動力學相互作用(通過透光度的變化而度量)的自動分析。在不存在樣品藥物的情況下，游離抗體結(jié)合至藥物-微顆粒結(jié)合物上，導致形成顆粒聚集體。隨著聚集作用在不存在樣品藥物的情況下進行，吸光率增加。如果樣品包含所討論的藥物，藥物與顆粒-結(jié)合藥物衍生物竟爭游離抗體。結(jié)合至樣品藥物上的抗體不再可用于促進顆粒聚集，和隨后顆粒晶格形成得到抑制。樣品藥物的存在消除了吸光率的增加，這與藥物在樣品中的濃度成比例。樣品藥物含量相對藥物的已知的截斷值濃度所得的值而測定。苯丙胺類藥物分析的一個問題在于，已有技術(shù)方法不提供足夠的與抗體的交叉反應性和置換作用使得以足夠的靈敏度測定樣品中所有的苯丙胺類分析物，尤其苯丙胺，曱基苯丙胺，3,4-亞甲基二氧基苯丙胺(MDA),3,4-亞曱基二氧基-N-曱基苯丙胺(MDMA),和3,4-亞甲基二氧基-N-乙基苯丙胺(MDEA)。本發(fā)明的甲基苯丙胺衍生物通過提供與曱基苯丙胺抗體的所需交叉反應性和置換作用而克服這些問題，靈敏地測定苯丙胺，曱基苯丙胺，和迷幻類化合物。本發(fā)明所克服的另一問題在于，半抗原通過甲基苯丙胺半抗原上的游離氨基基團而不必要地共軛。本發(fā)明衍生物避免了該問題。U.S.專利5,135,863(1992年8月4日授予Hu等人)描述了包含通過石克醇鍵結(jié)合至苯丙胺或曱基苯丙胺類似物上的標簽的結(jié)合物。該結(jié)合物進一步包含在間-或?qū)?位上鍵接至苯環(huán)的連接劑，和苯丙胺氮未被保護。U.S.專利申請2001/0051158(2001年12月13曰出版，Owens等人)描述了免疫化學半抗原，它們是曱基苯丙胺的間位衍生物。甲基苯丙胺半抗原上的游離氨基基團未被保護。發(fā)明概述苯丙胺半抗原的氮上的保護基團的曱基苯丙胺衍生物。這些化合物具有結(jié)構(gòu)其中Ri是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑，R2是離去基團，和R3是保護基團。本發(fā)明還涉及具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物其中Ri是包含2-l5個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或孩i顆粒。本發(fā)明進一步涉及用于確定樣品中的甲苯丙胺的免疫分析，包括步驟(a)將被懷疑包含曱基苯丙胺的樣品與對甲基苯丙胺特定的抗體和具有以下結(jié)構(gòu)的標記分析物類似物結(jié)合、^/NH其中Ri是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒，這樣甲基苯丙胺和分析物類似物竟爭性地結(jié)合至抗體上，和(b)確定結(jié)合或未鍵接至抗體上的標記類似物量的作為對樣品中的甲基苯丙胺的度量。另外，本發(fā)明包括一種用于確定樣品中的甲基苯丙胺的試驗盒，包含(a)對甲基苯丙胺特定的抗體和(b)具有以下結(jié)構(gòu)的標記分析物類似物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>ZNH其中R4是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒。本發(fā)明優(yōu)選的化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的4-{[4-(3-{(3)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙?；?-氨基]-丙基)-苯氧基)-丁?；被鵠-曱基)-苯甲酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>如果結(jié)合至氨基右旋糖酐上，隨后去保護N-三氟乙酸酯基團，該化合物提供一種結(jié)合物，它在用于免疫分析(其中它與游離曱基苯丙胺竟爭用于結(jié)合至被固定在微顆粒上的曱基苯丙胺-特定抗體)時提供與相應苯丙胺-氨基右旋糖酐-抗體體系擬合良好的標準曲線。附圖的簡要描述圖1是示意圖，顯示例如描述于實施例1和2化合物1的合成。圖2和3是示意圖，顯示例如描述于實施例3至8的化合物8的合成。圖4是示意圖，顯示例如描述于實施例9和10的化合物10的合成。圖5是示意圖，顯示本發(fā)明化合物與BSA的配合和氮的去保護，得到例如描述于實施例11的化合物11。圖6是示意圖，顯示本發(fā)明化合物與氨基右旋糖酐的配合，隨后去保護N-三氟乙酸酯基團，得到化合物12例如描述于實施例16。圖7是示意圖，顯示例如描述于實施例12的化合物15的合成。圖8是示意圖，顯示例如描述于實施例13的化合物17的合成。圖9是示意圖，顯示例如描述于實施例14的化合物18的合成。圖10是示意圖，顯示例如描述于實施例15的化合物19的合成。圖ll是使用本發(fā)明的氨基右旋糖酐結(jié)合物12與甲基苯丙胺抗體-涂覆顆粒生成的劑量響應曲線。圖12是使用本發(fā)明氨基右旋糖酐結(jié)合物12與N-乙基苯丙胺抗體-涂覆顆粒生成的劑量響應曲線。發(fā)明詳述在該描述和在所附權(quán)利要求書中，要理解以下定義。術(shù)語"半抗原"是指部分或不完全抗原。半抗原是不能刺激抗體形成但與抗體反應的無蛋白質(zhì)的物質(zhì)，最低分子量物質(zhì)。苯丙胺，甲基苯丙胺，亞甲基二氧基曱基苯丙胺，和其它苯丙胺類化合物是半抗原。術(shù)語"活化半抗原"是指例如，通過連接攜帶反應性部分的連接基團而具有可得反應位的半抗原，所述基團可用于將半抗原連接至載體，免疫原，標簽，示蹤劑或其它部分。術(shù)語"分析物"是指其存在或量要被確定的任何物質(zhì)或物質(zhì)組。本文所用的術(shù)語分析物包括術(shù)語"抗原"(是指可結(jié)合至抗體上的任何化合物)。本文所用的術(shù)語"苯丙胺"和"苯丙胺類藥物"是指苯丙胺，曱基苯丙胺，亞曱基二氧基苯基烷基胺的苯丙胺類似物，還稱作"設(shè)計師"苯丙胺，如，亞曱基二氧基甲基苯丙胺(MDMA，還稱作迷幻)，和這些藥物的代謝物。術(shù)語"衍生物"是指通過一種或多種化學反應由母化合物制成的化學化合物或分子。術(shù)語"結(jié)合物"是指由兩個部分結(jié)合在一起而形成的任何物質(zhì)。按照本發(fā)明的代表性結(jié)合物包括通過小分子和大分子結(jié)合在一起而形成的那些，如蛋白質(zhì)。術(shù)語結(jié)合物包括術(shù)語"免疫原"。本文所用的"連接基團"或"連接劑"是指連接兩種或多種子結(jié)構(gòu)的化學結(jié)構(gòu)的一部分如半抗原，載體，免疫原，標簽，示蹤劑或其它連接劑。連接基團具有至少l條在子結(jié)構(gòu)之間延伸的除氫之外的原子(或其它單價原子)的不間斷鏈。連接基團的原子和連接基團內(nèi)的鏈的原子本身通過化學鍵連接。連接劑可以是直或支，飽和或不飽和，碳鏈。它們也可包括一個或多個在鏈內(nèi)或在鏈末端上的雜原子。"雜原子"是指除碳之外的選自氧，氮和硫的原子。連接基團也可包括環(huán)狀或芳族基團作為鏈的一部分或作為鏈中的一個原子上的取代基。連接基團或連接劑中的原子的數(shù)目通過計算除氫之外的原子而確定。連接基團內(nèi)的鏈中的原子數(shù)通過沿著所連接的子結(jié)構(gòu)之間的最短路徑計算除氬之外的原子的數(shù)目而確定。連接基團可用于活化，如，在半抗原上提供可得位用于合成半抗原與標簽或載體的結(jié)合物。術(shù)語"烷基基團"是指任何直，支化，環(huán)狀，無環(huán)，飽和或不飽和碳鏈。代表性烷基基團包括烷烴，烯烴，烷炔，環(huán)烷烴，環(huán)烯烴，環(huán)烷炔，芳基，和類似物，和其組合。詞語"視需要取代的"是指一個或多個取代基在烷基基團上的可有可無的連接。術(shù)語"離去基團"是指可被與其反應的試劑替代的底物的任何化學部分。合適的離去基團包括，但不限于，卣化物，甲磺酸鹽，甲苯磺酸鹽，烷氧基，季銨鹽，和類似物。按照目前優(yōu)選實施方案的優(yōu)選離去基團由活化酯，如，三氟乙氧基酯，N-羥基琥珀酰亞胺酯，p-硝基苯基酯，五氟苯基酯，咪唑基酯，和N-羥基苯并三唑基酯提供，這樣連接到羰基碳上的酯的含氧部分在反應過程中被替換。術(shù)語"保護基團"是指連接到反應性原子或中心以改變其常規(guī)的反應性的任何部分。合適的保護基團包括但不限于描述于題為有機合成中的保護基團，第三版，TheodoraW.Greene和PeterG.M.Wuts(JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork,1999)的專著中的那些。用于胺的氮的各種保護基團是本領(lǐng)域已知的，其中三氟乙酰基是目前優(yōu)選的氮保護基團。其它優(yōu)選的保護基團的例子包括t-Boc(叔丁基氧基羰基)和CBZ(千基氧基羰基)。術(shù)語"分析物類似物"是指可用于竟爭性免疫分析的任何物質(zhì)或物質(zhì)組，其性質(zhì)在與抗體的結(jié)合親合性方面類似于分析物。代表性分析物類似物包括藥物和其異構(gòu)體，藥物衍生物，荷爾蒙，多肽，核苷酸，和類似物。詞語"檢測分析物"是指一般用于確定分析物，和尤其用于確定的苯丙胺藥物的任何定量，半定量，或定性方法，以及至所有的其它方法。例如，僅檢測苯丙胺藥物在樣品中的存在或不存在的方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如提供藥物在樣品中的量或濃度數(shù)據(jù)的方法。術(shù)語檢測，確定，識別，和類似術(shù)語在本文中同義使用，且都在本發(fā)明范圍內(nèi)。"標簽"，"檢測器分子"，或"示蹤劑"是產(chǎn)生，或可被誘導以產(chǎn)生，可檢測信號的任何分子。標簽可結(jié)合至分析物，免疫原，抗體，或至另一分子如受體或可結(jié)合至受體如配體，尤其半抗原上的分子上。標簽的無-限定性例子包括放射性同位素，酶，酶鏈段，酶底物，酶抑制劑，共酶，催化劑，熒光團，染料，化學發(fā)光劑，發(fā)光劑，敏化劑，非^茲或i茲顆粒，固體載體，脂質(zhì)體，配體，和受體。術(shù)語"試劑盒，"或"試驗盒，"是指用于進行分析的材料的組件。試劑可被提供在同一或不同容器中的包裝組合中，取決于其相互反應性和穩(wěn)定性，和為液體或凍干形式。被提供在盒中的試劑的量和比例可選擇成提供用于特定場合的最佳結(jié)果。體現(xiàn)本發(fā)明特征的試劑盒包含對苯丙胺化合物所特定的抗體。盒可進一步包含分析物的配體和校正和控制材料。試劑可保持液體形式或可^^凍干。詞語"校正和控制材料"是指包含已知內(nèi)的所要測定的分析物的任何標準或參考材料。被懷疑包含分析物和相應校正材料的樣品在類似癥狀下分析。分析物濃度通過將未已知的試樣所得的結(jié)果與標準所得的結(jié)果比較而計算。這通常通過構(gòu)建校正或劑量響應曲線而進行。本發(fā)明化合物是具有在苯環(huán)上的間位取代的烷基或烷氧基連接劑和在氮上的保護基團的甲基苯丙胺衍生物。這些化合物具有結(jié)構(gòu)其中R!是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑，R2是離去基團，和R3是保護基團。衍生物在氮上攜帶保護基團。這種保護基團使得衍生物的活性酯部分與，通常，載體化合物的胺容易反應形成穩(wěn)定的酰胺^:而不影響衍生物自身的胺。保護基團隨后被適宜地去除以提供對應于游離藥物的胺的所需未保護胺部分。在本發(fā)明實施方案中，R3是三氟乙酰基。在本發(fā)明另一實施方案中，R2是多糖或微顆粒，優(yōu)選氨基右旋糖酐。本發(fā)明還涉及具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>.NH其中Ri是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒，優(yōu)選氨基右旋糖酐。另外，本發(fā)明涉及具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物[i^右旋糖肝本發(fā)明進一步涉及用于確定樣品中的曱苯丙胺的免疫分析，包括步驟:(a)被懷疑包含曱基苯丙胺的樣品與對曱基苯丙胺特定的抗體和具有以下結(jié)構(gòu)的標記分析物類似物o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>、>/NH其中R!是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒，優(yōu)選氨基右旋糖酐合并，這樣甲基苯丙胺和分析物類似物竟爭性地結(jié)合至抗體上，和(b)確定結(jié)合或未鍵接至抗體上的標記類似物的量作為對樣品中的曱基苯丙胺的度量。另外，本發(fā)明包括用于確定樣品中的甲基苯丙胺的試驗盒，包含(a)對曱基苯丙胺特定的抗體和(b)具有以下結(jié)構(gòu)的標記分析物類似物o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>zNH其中Ri是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒，優(yōu)選氨基右旋糖酐。本發(fā)明優(yōu)選的化合物是具有以下結(jié)構(gòu)的4-{[4-(3-{(8)-2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙?；?-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁?；被鵠-曱基}_苯甲酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯O如果結(jié)合至載體分子如氨基右旋糖酐上，隨后去保護N-三氟乙酸酯基團，那么這種化合物提供一種結(jié)合物，它在用于免疫分析方法(其中結(jié)合物與游離甲基苯丙胺竟爭用于結(jié)合至被固定在微顆粒上的甲基苯丙胺-特定抗體)時提供與相應苯丙胺-氨基右旋糖肝-抗體體系具有良好相互關(guān)系的標準曲線。該組合還提供與所需(高相互反應性)和非所需(低相互反應性)分析物的合適的相互反應性。如果在低取代比率下結(jié)合至牛血清白蛋白上，這種化合物還提供一種適用于篩選甲基苯丙胺抗體的結(jié)合物。連接基團的取代位和醚鍵也被發(fā)現(xiàn)有利地調(diào)節(jié)抗體對衍生物結(jié)合物的親合性，而氨基曱基苯曱酸酯部分的使用也有助于更容易表征該衍生物(較大UV吸光率)以及增加衍生物的固體性質(zhì)(不同于膠體或液體)。完全意外地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明衍生物優(yōu)選通過至少兩種響應在結(jié)構(gòu)上不同于該新型衍生物的免疫原而培養(yǎng)的抗體而識別。一種差異是取代的位置，它在兩種免疫原的對位，但在結(jié)合物的間位。另一差異是用于免疫原的連接劑不具有象結(jié)合物那樣來自苯環(huán)的氧原子。最后，免疫原中的氮被鍵接至曱基基團上，而本發(fā)明結(jié)合物中的氮被鍵接至乙基基團上。具體實施方案在以下實施例，黑體字號是指附圖中的相應結(jié)構(gòu)。閃蒸色譜在硅膠60(230-400網(wǎng)孔，EMScience)上進行。薄層色譜在珪膠板(0.25mm,EMScience,Cat弁5717-5)上進行和在紫外燈下觀察。溶劑得自J.T.BakerCompany,除非另有所述。乙酸乙酯(EtOAc)，己烷(Hex)曱醇(MeOH),和二氯曱烷(012(^2)作為原樣用于色譜和反應處理劑。無水CH2Cl2通過在氬和在回流下在氫化4丐上煮淬而得到。無水四氫呋喃(THF)通過在氬和在回流下在鈉-二苯酮上煮沸而得到。無水二曱基甲酰胺(DMF)和無水二甲基亞砜(DMSO)在Sure/SealTM瓶中得自AldrichChemicalCompany。試劑和化學品得自Sigma隱AldrichChemicalCompany或FlukaChemicals,除非另有所述。質(zhì)子核》茲共振光譜(^H-NMR)在配有Sun/Sparc工作站的VarianGemini2000(200MHz)上得到。光學旋轉(zhuǎn)在PerkinElmer341旋光計上進行。3N高氯酸通過稀釋70。/。高氯酸(11.7N)而制備。液體色譜質(zhì)譜(LC-MS)和高性能液體色譜光譜(HPLC)在配有二極管排列檢測器和季泵的AgilentHPllOOLC/MS體系上得到。對于LC-MS光譜/分析，色譜物流在柱后被輸出到MSD檢測器。除非另有所述，所用的分析柱是配有Phenomenexguardmodule(KJO-4282)的Vydac218TP54分析柱(300A，5m)。除非另有所述，使用在0.iy。TFA-H2O(A)中的0.1。/oTFA-MeCN(C)使用在(A)中的溶劑梯度5。/。(0min)至100。/。(20min)至5%(25min)(C)進行操作。實施例l合成化合物1，[(S)-2-(3-曱氧基-苯基)-l-曱基-乙基]-((S)-l-苯基-乙基)-胺將6.0g(0,0365mol)3-曱氧基苯基丙酮(TransWorldChem.)和4.47g(0.0369mol)S-(-)-oc-苯基乙基胺(Fluka)在100ml苯(Acros)中的溶液用6.0g4埃分子篩處理和加熱回流3小時。將混合物過濾和在減壓下濃縮。將殘余物溶解在IOOml無水乙醇(Aldrich)中，放入包含2.4gRaney鎳(在1120中的50%淤漿)的500mlParr瓶和在50psi下氫化24hrs。將催化劑濾過CELITE并將濾液在減壓下濃縮。殘余物通過在800g硅膠上的閃蒸色譜使用3%曱醇-CH2Cl2作為洗脫劑而純化，得到5.0g產(chǎn)物作為淺黃色油。iH-NMR(CDCl3)相容;LC-MS:tR11.4min,結(jié)果M+H270,2;[a]D-36.6。(589nm,c=l,CHC13)。實施例2合成化合物2,(S)-2-(3-曱氧基-苯基)-l-曱基-乙基胺向500mlParr瓶中裝入550mg10。/。Pd/C和5.0g(0.0186mol)化合物l在IOOml曱醇中的溶液并在50psi下氫化48小時。將催化劑濾過CELITE并將濾液在減壓下濃縮成黃色油。通過在硅膠短柱(4cmW,5cmH)上的閃蒸色譜使用10%曱醇-CH2Cl2進行純化以去除殘余催化劑，得到2.84g黃色油。將它溶解在CH2Cl2中和過濾以去除殘余硅膠，隨后在減壓下濃縮和在高真空下抽吸過夜，得到2.5g黃色油。^-NMR(CDCl3)相容;LC-MS:tR8.05min(ChiralcelOD國RH，DaicelChemicalIndustries;梯度5%(在0min)至85。/。(在17.5min時)O.l%TFA/乙腈，在O.l%TFA/水中；0.5mL/min流速),結(jié)果M+H166.1，單峰;HPLC:tR30.0min(d-異構(gòu)體)，33.7min(l-異構(gòu)體)，比率/1=97.2/2.8在200nm(CrownpakCR(+)，DaicelChemicalIndustries;等度lml/min含水高氯酸pH1.35(~0.2%)，包含5%MeOH);[oc]D+31.7。(589nm,c=l,CHC13)。實施例3合成化合物3,2,2,2-三氟-^[(3)-2-(3-甲氧基-苯基)-1-甲基-乙基]-乙酰胺將2.4g(0.0145mol)化合物2在24ml吡啶(Aldrich)中的溶液在氬下冷卻至-20。C和用3.2ml三氟乙酸酐在36ml醚(E.M.Science)中的溶液處理和在-20。C下攪拌15min。將混合物用3x100ml乙酸乙酯提取。將合并的乙酸乙酯提取物用2x150ml飽和鹽水溶液洗滌，在無水Na2S04上干燥和在減壓下濃縮，得到3.79g黃色固體。^-NMR(CDCl3)相容。實施例4合成化合物4，2,2,2-三氟-N-[(S)-2-(3-羥基-苯基)-l-甲基-乙基]-乙酰胺將包含3.77g(0.0144mol)化合物3和70.0g(0.6057mol)吡啶'HCl的壓力容器用氬清洗和在210。C下加熱45min。固體熔化和變得均相。將反應混合物冷卻，使它凝固。將固體溶解在H2O中和倒入400ml冰水中。將它用5x250mlCH2Cl2提取。將CH2Cl2提取物合并，在無水Na2S04上干燥和在減壓下濃縮，隨后在高真空下抽吸過夜，得到3.34g黃色油。^-NMR(CDCl3)相容;LC-MS相容。在另一操作中，320mg化合物3和5.94g吡咬鹽酸鹽在壓力容器中進行類似反應，在類似處理之后，得到213mg化合物4，具有:^-NMR相容;LC-MS:tR11.4min,結(jié)果M+H248.1,M+Na270丄實施例5合成化合物5，4-{3-[(8)-2-(2,2,2-三氟-乙?；被?-丙基]-苯氧基}-將1.08g(0.027mol)NaH(在礦物油中的6(P/。分散體)和10ml無水DMF(Aldnch)的混合物在氬下用在5分鐘內(nèi)滴加的在33ml無水DMF(Aldrich)中的3.3g(0.0133mol)化合物4處理。將混合物在環(huán)境溫度下攪拌IOmm,隨后用3.4ml(0.0238mol)乙基-4-溴丁酸鹽(Fluka)處理和在室溫下攪拌過夜。將混合物倒入250ml1M磷酸鉀緩沖劑pH7,隨后用2x250ml乙酸乙酯提取。將有機提取合并和用2x150ml1M磷酸鉀緩沖劑pH7洗滌，在無水Na2S04上干燥和在減壓下濃縮。將殘余物通過在250g硅膠上的閃蒸色譜使用30%EtOAc-己烷作為洗脫劑而純化，得到淺黃色油，放置結(jié)晶得到3.9g白色固體。iH-NMR(CDCl3)相容;LC-MS:tR15.7min,結(jié)果M+H362.1，M+H20379.1，M+Na384.1。實施例6合成化合物6，4-(3-{(3)-2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙?；?-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁酸乙基酯將3.8g(0.0105mol)化合物5在72ml無水DMF(Aldrich)中的溶液在氬下用9.5m1(0.1526mol)捵曱烷和l1.74g(0.0507mol)氧化銀(I)處理和在40。C下攪拌過夜。將混合物濾過CELITE,將濾餅用450ml乙酸乙酯洗滌，并將濾液再次過濾以去除白色沉淀物。將濾液用2x250mlHbO洗滌。將H20洗滌物合并和用200ml乙酸乙酯提取。將有機提取合并，在無水Na2S04上干燥，在減壓下濃縮和在高真空下抽吸過夜，得到3.84g淺黃色油。^-NMR(CDCl3)相容，2:1比率的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。實施例7合成化合物7，4-(3-((S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙?；?-氨基]-丙基卜苯氧基)-丁酸將3.8g(0,0101mol)化合物6在50ml蒸餾THF中的溶液用50ml3N高氯酸(由得自Aldrich的70。/。高氯酸制備)處理和在50。C下加熱4hrs。將混合物冷卻和用2x200ml乙酸乙酯提取。將有機提取合并，用4x200mlH20，2x200ml飽和鹽水溶液洗滌，在無水Na2S04上干燥，在減壓下濃縮和在高真空下抽吸過夜，得到3.5g淺黃色油。iH-NMR(CDCl3)相容，2:1比率的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。實施例8合成化合物8,4-(3-((S)-2-[(2,2-二曱基-丙酰基)-甲基-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯將3.5g(O.OlOlmol)化合物7在220ml無水CH2Cl2中的溶液在氬下用1.4g(0.0122mol)NHS和2.4g(0.0125mol)EDC(Sigma)處理和在室溫下攪拌過夜。將混合物用200ml0.1NHC1,2x200mlH20,2x200ml飽和NaHC03溶液，200ml飽和鹽水溶液洗滌，在無水Na2S04上干燥和在減壓下濃縮，得到4.42g透明油。^-NMR(CDCl3)相容，3:2比率的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。實施例9合成化合物9，4-{[4-(3-{(S)-2-[甲基-(2,2,2-三氟-乙?；?-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁?；被鵠-曱基}-苯甲酸將1.6g(0.0106mol)4-氨甲苯酸在60ml1120和120ml蒸餾THF中的混合物用10mlINNaOH處理。將所得溶液用4.4g(O.Olmol)化合物8在120ml蒸餾TH中的溶液處理。反應隨后用4ml1NNaOH(—次加入lml)處理以保持pH9。反應在室溫下攪拌l小時。THF在減壓下去除并將含水殘余物用2NHCl中和至pH6。將它用2x250ml乙酸乙酯提取。將有機提取合并，在無水Na2S04上干燥和在減壓下濃縮，得到4.65g白色固體。iH-NMR(CDCl3)相容，3:2比率旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。實施例IO合成化合物10,4-{[4-(3-{(S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙酰基)-氨基]-丙基}-苯氧基)-丁?；被鵠-曱基}-苯曱酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯將l.Og(0.002mol)化合物9在100ml無水CH2Cl2中的溶液在氬下用300mg(0.0026mol)NHS和480mg(0.0025mol)EDC(Sigma)處理和在室溫下攪拌過夜。將混合物用100ml0.1NHCl，2xl00mlH2O,2x100ml飽和NaHCCb溶液，100ml飽和鹽水溶液洗滌，在無水Na2S04上干燥和在減壓下濃縮，得到1.13g白色無定形固體。H-NMR(CDCl3)相容，3:2比率旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體；LC-MS:tR14.5min,結(jié)果M+H578.2，M+Na600.2;[a]D+15.7。(589nm，c=l，CHC13)。實施例ll合成化合物11,去保護4-(3-((S)-2-[(2,2-二曱基-丙酰基)-曱基-氨基]-丙基卜苯氧基)-丁酸2,5-二氧代-吡咯烷-l-基酯結(jié)合物與BSA將1.0g牛血清白蛋白(BSA;PentexFractionV;MilesInc.,Kankakee,IL,USA)在16ml50mM磷酸鉀(KPi)pH7.5中的溶液在冰浴中冷卻和用慢慢滴加的22mlDMSO處理。在加入完成之后，滴加13.4mg化合物8在2mlDMSO中的溶液并在攪拌下時反應達到室溫。按照類似方式另外制備100mgBSA在1.6ml50mMKPipH7.5和2.4mlDMSO中的參考樣品，但不加入半抗原。在攪拌過夜之后，將反應和參考樣品分別轉(zhuǎn)移至滲析管線(SpectraPor7;10,000分子量截斷值)和針對60%DMSO-50mMKPi,pH7.5(兩次，在室溫下/4h每次;在室溫下一次性過夜)隨后順序針對40y。至20y。至10y。DMSO-50mMKPi,pH7.5,隨后針對50mMKPipH7.5透析。繼續(xù)針對50mM碳酸鉀(四次變化)在室溫下4天以去保護三氟乙?；鶊F，隨后針對50mMKPipH7.5在4。C在幾天內(nèi)(六次變化)進行滲析。回收滲余物，得到結(jié)合物ll作為灰色溶液(68ml)，以及參考BSA。使用參考BSA[蛋白質(zhì)濃度，UV]的CoomassieBlue蛋白質(zhì)分析得到標準曲線，顯示結(jié)合物11為14.0mg/ml蛋白質(zhì)。實施例12合成化合物15,[2-(3-{(S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙?；?-氨基]-丙基}-苯氧基)-乙基]-曱酰胺酸叔丁基酯化合物13，2,2,2-三氟-N-[(S)-2-(3-甲氧基-苯基)-l-曱基-乙基]-N-曱基-乙酰胺。將384mg化合物3在10ml無水二曱基甲酰胺(DMF)中的溶液在氬下用1.33ml碘甲烷和1.64g氧化銀(I)處理和在40。C下攪拌過夜。將混合物濾過CELITE并將濾餅用乙酸乙酯洗滌。將濾液再次過濾以去除白色沉淀物。將濾液用2x50mlH2O洗滌。將含水洗滌物合并和用50ml乙酸乙酯提取。將乙酸乙酯部分合并，在無水碌u酸鈉上干燥，和在減壓下濃縮，得到330mg黃色油。將它在50g硅膠上使用CH2Cl2作為洗脫劑進行色譜處理，得到220mg產(chǎn)物，化合物13,作為淺黃色油。LC-MS:tR15.4min,結(jié)果M+H276.0,M+Na298.0?；衔?4，2,2,2-三氟-^[(3)-2-(3-羥基-苯基)-1-曱基-乙基]->1-甲基-乙酰胺。將220mg化合物13和3.87g吡啶鹽酸鹽的混合物在210。C下在壓力容器中加熱l小時。將所得熔體冷卻和溶解在水中。將它用5x50mlCH2Cl2提取，將合并的CH2Cl2提取在無水硫酸鈉上干燥和在減壓下濃縮，得到IOOmg化合物14作為黃色油。LC-MS:tR12.9mm,結(jié)果M+H262.0,M+Na284.0?；衔?5。將25mg化合物14在10ml千丙酮中的溶液用2-(BOC-氨基)乙基溴在lml無水DMF,77mg無水碳酸鉀，和催化量18-冠-6中的溶液處理。將混合物在60。C下加熱過夜。將混合物冷卻和用CH2Cl2稀釋，用&0洗滌3次，在無水疏酸鈉，和在減壓下濃縮至包含化合物15的紅色油。LC-MS:tR16.5min,結(jié)果M+Na427.1。實施例13合成化合物17化合物15用三氟乙酸處理和在室溫下攪拌2hrs。將混合物在減壓下濃縮，得到胺化合物16。將聯(lián)苯-二-羧酸NHS酯，化合物20(Ghoshal等人，U.S.專利6,794,496),在無水THF中的溶液在氬下用1當量化合物16在無水THF中的溶液處理，同時滴加2當量三乙基胺。將混合物在室溫下攪拌過夜?；旌衔镌跍p壓下濃縮。通過色譜純化，得到化合物17。實施例14合成化合物18將對苯二曱酸二(N-羥基琥珀酰亞胺)酯化合物21(Ghoshal等人，歐洲專利申請1,148,339)在無水THF中的溶液在氬下用用1當量化合物16在無水THF中的溶液處理，同時滴加2當量三乙基胺?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜?；旌衔镌跍p壓下濃縮。通過色譜純化，得到化合物18。實施例15合成化合物19將4-異硫代氰酸根合苯曱酰氯，化合物22(Ghoshal等人，U.S.專利6,794,496)，在無水THF中的溶液在氬下用冰浴冷卻和用1當量化合物16在無水THF中的溶液處理，同時滴加2當量三乙基胺。混合物在室溫下攪拌過夜。混合物在減壓下濃縮。通過色譜純化，得到化合物19。實施例16使用具有曱基苯丙胺抗體的本發(fā)明結(jié)合物的分析曱基苯丙胺-氨基右旋糖酐結(jié)合物，化合物12制備如下:將90mg氨基右旋糖酐溶解在5mlDMSO中。將10mg化合物10溶解在lmlDMSO中和滴加至聚合物載體的溶液和在室溫下攪拌過夜。將混合物放入10,000MW截斷值滲析管線(PierceSnake皮膚頂)和在室溫下在1升80%DMSO中透析過夜。將它隨后在室溫下使用在1升60。/。DMSO，1升40。/。DMSO，l升20y。DMSO，4升去離子水中的遞減梯度，透析每次至少3hr。將它隨后用1升100mMK2CO3(用KOH調(diào)節(jié)至pH13)透析2天，其中4次改變緩沖劑。最終滲析步驟包括4升去離子水至少2天，4次改變。將結(jié)合物隨后凍千。隨后制備包含0.125昭/ml曱基苯丙胺結(jié)合物12,144mM哌嗪-l,4-二(2-乙烷磺酸)二鈉鹽，31mM哌。秦-l,4-二(2-乙烷磺酸)，0.1%(w/v)BSA，0.09。/。(w/v)疊氮化鈉，和1.5。/。(w/v)聚丙烯酸的結(jié)合物試劑，pH7.1?？贵w-微顆粒試劑制備如下:將100ml50mg/ml對甲基苯丙胺特定的單克隆抗體在室溫下用在50mMMES緩沖劑，pH6.5中的100ml1%0.201mm膠乳顆粒培養(yǎng)過夜。將顆粒用在50mMMES緩沖劑，pH6.5中的IOml100mg/mlBSA阻斷2小時。膠乳用50mMMOPS緩沖劑，pH7.1，使用切線流動過濾體系洗滌。該抗體相應描述于U.S.5,501,987(第3欄，結(jié)構(gòu)2，其中蛋白質(zhì)是牛甲狀球蛋白)中的免疫原而培養(yǎng)。隨后制備包含0.1%固體抗體-涂覆微顆粒，25mM3-嗎啉代丙烷磺酸，25mM3-嗎啉代丙烷磺酸，鈉鹽，0.1%(w/v)BSA，和0.09。/。(w/v)疊氮化鈉的微顆粒試劑，pH7.1。分析在Roche/Hitachi917分析器上進行。將IOml樣品吸移到比色杯中和隨后立即加入180ml結(jié)合物試劑(Rl)。將混合物培養(yǎng)90秒，和將80ml微顆粒試劑(R2)加入比色杯。反應混合物在37。C下培養(yǎng)約8min，在此過程中在505nm下監(jiān)控顆粒凝聚反應?；谠赗2加入之后的2-點端測量而"i殳計標準曲線。%相互反應性在免疫分析中確定。標準曲線可使用已知量的目標分析物曱基苯丙胺而確立。已知量的各種苯丙胺有關(guān)的藥物作為樣品在免疫分析中被分析，和這些藥物的表觀濃度由標準曲線產(chǎn)生。將藥物的表觀濃度除以實際的濃度并乘以IOO,得到該藥物的％相互反應性。如此生成的標準(劑量響應)曲線在圖ll中給出。曱基苯丙胺-涂覆顆粒與結(jié)合物12的相互反應性在下表中給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>這些結(jié)果顯示出不僅對d-曱基苯丙胺而且對迷幻類化合物如MDMA和MBDB的良好的相互反應性。與普通千擾性化合物如麻黃堿，假麻黃堿，芬特明，和酪胺的相互反應性是最小的，即，低于1%。實施例17使用具有N-乙基苯丙胺抗體的本發(fā)明結(jié)合物的分析結(jié)合物試劑如實施例16所述而制備?？贵w-涂覆微顆粒如實施例16所述使用描述于U.S.2004/0077021的單克隆抗體NEAMP48.2而制備。微顆粒試劑隨后如實施例16所述而制備。分析在Roche/Hitachi917分析器上如實施例16所述而進行。%相互反應性在免疫分析中確定。標準曲線使用已知量的目標分析物亞曱基二氧基乙基苯丙胺(MDEA)而確立。已知量的各種苯丙胺有關(guān)的藥物作為樣品在免疫分析中分析，和這些藥物的表觀濃度由標準曲線生成。藥物的表觀濃度除以實際的濃度并乘以IOO,得到該藥物的％相互反應性。如此生成的標準(劑量響應)曲線在圖12中給出?？贵w-涂覆顆粒與結(jié)合物12的相互反應性在下表中給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>這些結(jié)果顯示出不僅對亞曱基二氧基乙基苯丙胺的良好的相互反應性而且對d-曱基苯丙胺和對迷幻類化合物如MDMA和MBDB的相互反應性。同時，基本上沒有與普通千擾性化合物如麻黃堿，假麻黃堿，芬特明，和酪胺的相互反應性。權(quán)利要求1.一種具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物其中R1是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑，R2是離去基團，和R3是保護基團。2.權(quán)利要求l的化合物，其中R3是三氟乙酰基。3.權(quán)利要求l的化合物，其中R2是多糖或微顆粒。4.權(quán)利要求3的化合物，其中R2是氨基右旋糖酐。5.化合物4-([4-(3-((S)-2-[曱基-(2,2,2-三氟-乙?；?-氨基]-丙基卜苯氧基)-丁?；被鵠-曱基}-苯曱酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯，具有結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.—種具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中Ri是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒。7.權(quán)利要求6的化合物，其中R2是氨基右旋糖酐。8.具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物嚴基右旋糖酐9.一種用于確定樣品中的曱基苯丙胺的免疫分析，包括步驟:(a)將被懷疑包含甲基苯丙胺的樣品與對曱基苯丙胺特定的抗體和具有以下結(jié)構(gòu)的標記分析物類似物合并<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>^"^一zNH其中R4是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒，這樣甲基苯丙胺和分析物類似物竟爭性地結(jié)合至抗體上，和(b)確定結(jié)合或未鍵接至抗體上的標記類似物的量作為對樣品中的曱基苯丙胺的度量。10.權(quán)利要求9的免疫分析，其中R2是氨基右旋糖酐。11.一種用于確定樣品中的甲基苯丙胺的試驗盒，包含(a)對甲基苯丙胺特定的抗體和(b)具有以下結(jié)構(gòu)的標記分析物類似物其中Ri是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒。12.權(quán)利要求11的試驗盒，其中R2是氨基右旋糖酐。全文摘要具有在苯環(huán)上的間位取代的烷基連接劑和在甲基苯丙胺半抗原的氮上的保護基團的甲基苯丙胺衍生物的化合物。這些化合物具有結(jié)構(gòu)(I)，其中R1是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑，R2是離去基團，和R3是保護基團。下式化合物(II)，其中R1是包含2-15個碳原子和0-6個雜原子的烷基連接劑和R2是多糖或微顆粒。用于確定樣品中的甲苯丙胺的免疫分析和用于確定樣品中的甲基苯丙胺的試驗盒。文檔編號A61K31/16GK101119963SQ200580048108公開日2008年2月6日申請日期2005年12月15日優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日發(fā)明者R·A·許,S·S·維托恩申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司