專利名稱：：用于hiv治療的化合物的制作方法用于HIV治療的化合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療人免疫缺陷病毒(HIV)的方法和藥物組合物，該病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因中具有至少一類明確定義的突變，其產(chǎn)生引物拯救(切除)表型。這類突變與特定的胸腺嘧啶核苷類似物突變(TAMs)有關(guān)，被稱作引物拯救(primerrescue)-相關(guān)突變。本發(fā)明的方法和藥物組合物使用核苷2',3'-二脫氧-3'-C-羥甲基胞嘧啶或體內(nèi)釋放該核苷的前藥。技術(shù)背景與其它HIV抗病毒劑，如蛋白酶抑制劑或非-核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑不同，核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)的給藥形式是藥理學(xué)非活性的，需要通過(guò)宿主細(xì)胞激酶磷酰化，產(chǎn)生活性三磷酸鹽代謝物。該三磷酸鹽形式類似天然存在的病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的脫氧核苷酸三磷酸鹽底物，與HIV-1RT竟?fàn)幗Y(jié)合并摻入到病毒DNA中。被批準(zhǔn)用于HIV治療的所有NRTIs，和專利或?qū)W術(shù)文獻(xiàn)中建議的絕大多數(shù)其它NRTIs,均缺少核苷的核糖部分上的3'-羥基官能團(tuán)。例如包括齊多夫定(AZT),司他夫定(d4T),拉米夫定(3TC),扎西他濱(ddC),阿巴卡韋(ABC),去羥肌苷(ddl)和替諾福韋(TNF)(后者通常以替諾福韋酯(tenofovirdisoproxilfumarate)前藥的形式纟會(huì)藥)。石舞酰4匕后，這種核苦或核苷酸類似物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶與新生DNA鏈共價(jià)鍵合，但核苷或核苷酸中缺少3，-0H官能團(tuán)可防止其它核苷酸的進(jìn)一步連接。這些NRTIs因此可終止病毒DNA鏈延長(zhǎng)，由此導(dǎo)致HIV復(fù)制的抑制(Mitsuya等人，1990,JacobMolina等人，1993,Reardon1993)。目前所有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(ART)的基礎(chǔ)均是使用NRTIs。然而，NRTIs僅僅能夠延遲HIV在血流中增殖，迄今為止，尚不能消滅患者中的HIV。HIV通過(guò)將其DNA插入到涉及人免疫學(xué)記憶的潛在宿主細(xì)胞中進(jìn)行操作。這種感染模式意味著患者需被迫終生服用HIV抗病毒劑來(lái)防止治療終止后反彈所致的HIV滴度。然而，實(shí)踐中，針對(duì)規(guī)定患者的特定HIV藥物的有效給藥時(shí)間明顯受到"逃避突變體"出現(xiàn)的限制。逃避突變體是一種含有不連續(xù)的突變蔟(discreteclusterofmutations)的病毒，其產(chǎn)生藥物抗性并使它在有藥物存在的情況下仍可增殖。逃避突變體在患者中出現(xiàn)是由患者所服用的特定抗病毒劑的選擇壓所導(dǎo)致。結(jié)果，藥物的有效給藥取決于逃逸突變體出現(xiàn)并增殖的速度。一直以來(lái)，給患者施用HIV抗病毒劑導(dǎo)致日益明顯地發(fā)現(xiàn)新HIV病例中的初次感染常常不是野生型HIV，而是具有已經(jīng)部分或越來(lái)越多地抗目前所用抗病毒劑的HIV林。換句話說(shuō)，在感染患者中原位產(chǎn)生的逃避突變體還可通過(guò)橫向或垂直傳播而傳染給初患者。這意味著甚至某些被歸為初始治療的患者也已經(jīng)感染了抗常規(guī)一線治療的病毒。多種因素導(dǎo)致藥物逃避突變體的選擇，包括總HIV庫(kù)(pool)大小，RT持續(xù)合成能力和病毒基因組復(fù)制中的失真，病毒適應(yīng)性和靶細(xì)胞的許多可用性。到90年代晚期，長(zhǎng)期使用基于齊多夫定(AZT)或司他夫定(d4T)組合的證據(jù)表明RT中的特定突變簇一直產(chǎn)生。這些突變簇現(xiàn)在被認(rèn)為是胸腺嘧啶核苷類似物突變(TAMs)的原型。TAMs的存在可提高選擇其它突變的可能性并導(dǎo)致在胸腺嘧啶核苷類似物家族中并不清楚的更高級(jí)的NRTI抗性表型的演變。這種表型現(xiàn)在被稱為核苷類似物突變(NAM)和多藥抗性(MDR)HIV。NRTI抗性的假說(shuō)AZT是第一種被廣泛使用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑，自然地成為第一個(gè)產(chǎn)生逃避突變體的(Larder等人1989)。然而，考慮到典型患者分離物中HIV基因組的大量突變，不可能使用具有特定TAM的重組RT酶在體外產(chǎn)生抗性表型。結(jié)果，不能直接闡明TAMs賦予抗性的機(jī)理。根據(jù)焦磷酸鹽供體所致的親核攻擊已預(yù)測(cè)了各種假設(shè)模型和TAM抗性機(jī)理的理論預(yù)測(cè)(Boyer等人，2002andMeyer等人，2002)。推測(cè)RT易位理論是了解TMA相關(guān)抗性機(jī)理的重要步驟。然而，因?yàn)镽T易位之前和之后的中間體是瞬時(shí)、短壽的，且不容易通過(guò)實(shí)驗(yàn)荻得，故直至2002年底對(duì)其仍知之甚少。RT易位理論的現(xiàn)代理解支持RT催化的DNA聚合以圖3舉例說(shuō)明的詳細(xì)級(jí)聯(lián)方式發(fā)生，參見(jiàn)Sarafianos等人(2003)。這些步驟是1)通過(guò)游離酶E結(jié)合DNA底物，使3'-引物末端處于P-位點(diǎn)(引物位點(diǎn))處。2)接近N-位點(diǎn)(dNTP位點(diǎn))的dNTP的結(jié)合形成"開(kāi)放的"三元復(fù)合物。3)"關(guān)閉的"三元復(fù)合物是通過(guò)酶構(gòu)象改變而形成的。4)3，-OH引物末端與dNTP的a磷酸鹽之間磷酸二酯鍵的形成伴有焦磷酸鹽(PPi)的釋放，從而在N-位點(diǎn)形成預(yù)易位的RT復(fù)合物。5)通過(guò)形成易位后的復(fù)合物使引物末端從N-位點(diǎn)易位到P-位點(diǎn)，所述易位后的復(fù)合物是下一次dNTP結(jié)合及DNA合成繼續(xù)的必要條件。如果使用DNA鏈終止劑核苷(NRTI)三磷酸鹽(通常是脫氧核糖部分上缺少3，-羥基官能團(tuán)的核苷類似物)，則它模擬其天然dNTP對(duì)應(yīng)物并結(jié)合RT。類似的化學(xué)加工之后，摻入的NRTI在聚合的N-位點(diǎn)處形成預(yù)易位復(fù)合物。這樣一來(lái)，由于在NRTI的脫氧核糖部分上缺少3，-羥基引物而終止了進(jìn)一步的DNA合成。而與野生型RT相比，TAM-相關(guān)RT突變運(yùn)用不同的核苷酸摻入機(jī)理。具體而言，新機(jī)理導(dǎo)致?lián)饺胍锬┒颂嶯RTI的釋放(切除)，廢除了NRTI的鏈終止活性。該新的機(jī)理取決于預(yù)易位狀態(tài)的復(fù)合物累積(N-位點(diǎn)處)和ATP或焦磷酸鹽供體的可利用性之間的相互作用，所述供體常常富含于感染位點(diǎn)，即正常淋巴細(xì)胞處。ATP或焦磷酸鹽通常不參與病毒DNA-聚合反應(yīng)，但表達(dá)TAM-相關(guān)抗性表型的RT結(jié)構(gòu)可幫助它們進(jìn)入到與新?lián)饺氲腘RTI相鄰的位點(diǎn)中。易位前和易位后的動(dòng)力學(xué)種類之間的平衡可提供確保引物末端自由接近N-位點(diǎn)的機(jī)理，并在摻入NRTI鏈終止劑和焦磷酸鹽釋放后，使焦磷酸鹽供體ATP同時(shí)結(jié)合于P-位點(diǎn)。此種情況下，ATP(或焦磷酸鹽)連接在DNA末端摻入的NRTI的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致經(jīng)由焦磷酸化除去NRTI。當(dāng)焦磷酸鹽供體是ATP時(shí)，NRTI作為二核苷四磷酸鹽產(chǎn)物釋放。圖4舉例說(shuō)明AZT-終止的DNA中的該"引物拯救"(得自ClinicCareOptionsTM)。現(xiàn)在認(rèn)為兩種不同的機(jī)理均涉及對(duì)NRTI的表型抗性(Sluis-Cremer等人，2000)。一種被稱作"引物拯救，，活性在上面描述。這里，通過(guò)ATP-依賴的或焦磷酸鹽-依賴的焦磷酸化除去引物3，末端的鏈終止核苷酸。然而，還有另一種被稱作"區(qū)別突變體(discriminativemutants)"的抗性表型。這些突變體的RT具有較高的區(qū)別NRTIs和天然dNTPs的能力。在這種情況下，該機(jī)理可產(chǎn)生能夠優(yōu)先選擇正確底物的RT(即，天然dNTP)，由此避免NRTI所致鏈終止并確保病毒基因組繁殖。HIV中突變的產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV具有迅速基因多樣化的潛在能力。這是一個(gè)低能耗過(guò)程導(dǎo)致其對(duì)生物體具有良好的適應(yīng)性。HIV所用復(fù)制機(jī)構(gòu)是一種特別的錯(cuò)誤傾向，產(chǎn)生大量突變且當(dāng)生物處于選擇壓之下時(shí)，具有導(dǎo)致突變累積的可能。通常，病毒復(fù)制產(chǎn)生的絕大多數(shù)突變會(huì)產(chǎn)生活性不太高的酶。這里，第二且特別是第三次突變的累積是不大可能的，這是因?yàn)榛钚圆惶叩耐蛔凅w群，必需在其中積累第二次突變，但其被更快速繁殖的野生型生物稀釋。然而，活性更高的病毒突變體可產(chǎn)生且通過(guò)兩種可能的途徑展開(kāi)。當(dāng)已經(jīng)存在于全部病毒總體中的高抗性變體迅速長(zhǎng)出時(shí)，呈現(xiàn)第一種途徑。更常見(jiàn)地，這是一種單點(diǎn)突變，其對(duì)選擇壓具有表型抗性。藥物逃避突變的例子包括被非-核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑奈韋拉平迅速誘導(dǎo)的K103。當(dāng)有選擇壓的情況下存在持續(xù)的病毒復(fù)制時(shí)，呈現(xiàn)第二種途徑。其可使突變漸近性累積，然后展開(kāi)。在這種情況下，突變累積的可能性與存在的病毒復(fù)制量有關(guān)。即，在較高病毒量下(例如>200,000個(gè)拷貝/ml),可出現(xiàn)雙倍突變的累積。然而，三倍突變的累積《艮少見(jiàn)且4又可由于復(fù)雜的治療方法而產(chǎn)生，所述復(fù)雜的治療方法通常包括若千不同藥物，即要求患者堅(jiān)持。因此，即使對(duì)于勤快的患者，也很難保證所有活性成分均以高于所需抑制濃度的水平在每天"24小時(shí)低谷水平"的整整24小時(shí)內(nèi)存在于血液中。這里，由于給藥中流失所致的藥物治療中任何一種選擇壓的臨時(shí)除去，一種或多種藥物的24小時(shí)低谷水平使得病毒不受控制的復(fù)制，都將產(chǎn)生并建立許多新的突變體。當(dāng)再次施加選4f壓時(shí)(即，復(fù)雜藥物療法的恢復(fù))，很少有新的突變體能夠按照與第一種途徑(如上所述)相似的方式展開(kāi)，所述新的突變體已經(jīng)累積了點(diǎn)突變，其產(chǎn)生更好的藥物抗性。上面的討論集中在與缺失或添加突變相反的點(diǎn)突變的累積上。然而，此處可應(yīng)用與三倍突變所述類似的方案。即，絕大多數(shù)缺失/添加突變最初均包括單一的核苷酸。如果改變?cè)诰幋a區(qū)內(nèi)發(fā)生且導(dǎo)致截短的和/或非活性蛋白，則具有完全改變所編碼蛋白下游氨基酸序列的作用。為了保護(hù)可讀框并通過(guò)單一氨基酸的缺失或添加改變最終的蛋白，必須使三個(gè)氨基酸缺失/添加。因?yàn)榉腔钚悦缚山档虷IV的生物活力，特別是如果受影響的酶是RT,則缺失/添加本身將不累積，但必須同時(shí)存在。換句話說(shuō)，三倍突變的等價(jià)物必須存在于單一事件中，其是十分不常見(jiàn)的(見(jiàn)Boyer等人(2004)JVirol78(18):9987-9997,其整體引入此處作為參考)。作為三倍突變體累積/引入過(guò)程的結(jié)果，直到最近才建立了RT中至少有3個(gè)突變的HIV病毒，其對(duì)已經(jīng)建立的多種藥物創(chuàng)造出了特別有效的抗性。例如，在美國(guó)，1992年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了聯(lián)合用藥(ddC和AZT)。然而，直到1995年9月，臨床試驗(yàn)還沒(méi)有顯示出AZT與ddC或ddl的聯(lián)合比單獨(dú)的AZT更有效。僅僅作為在其中運(yùn)用了多種藥物的聯(lián)合治療而已，但此種給藥方案不能有效保證各藥物適當(dāng)?shù)?4小時(shí)低谷水平，且已經(jīng)產(chǎn)生了今天西方世界已知的多抗性HIV病毒的特別成問(wèn)題的林系。引物拯救突變最初描述的TAM引物拯救突變體包括在RT上的氨基酸位置M41L，D67N,K70R，L210W,T215Y/F和K219Q/E處的一組6個(gè)藥物抗性表型范圍內(nèi)的多種變換(LarderandKemp,l989,Schinazi等人2000)。早期數(shù)據(jù)顯示用于演變多TAM引物拯救突變體的兩種不同的突變途徑，兩種均由未知因素產(chǎn)生。第一個(gè)途徑導(dǎo)致密碼子210(210W)處的氨基酸置換且優(yōu)先與密碼子41(41L;大于98。/。)和215(215Y;大于94%)處的突變以及密碼子67(67N)處的置換有關(guān)。第二個(gè)途徑在密碼子219(219K/E)處產(chǎn)生突變，其優(yōu)先與密碼子6:7(6N)和70(0R)(Yahi等人，1"9)處的突變有關(guān)。因此存在兩種表型模式(1)L210W,M41L,T215Y/F,士D67N,其對(duì)AZT和d4T具有高水平的病毒抗性，和(2)K219K/E,D67N,K70R,其對(duì)AZT和d4T具中等水平的病毒抗性。Marcelin等人(2004)概括了病毒性衰竭患者中TAM引物拯救-相關(guān)突變的優(yōu)勢(shì)(prevalence)。這里，研究了1098RT序列且如圖1和圖2所示產(chǎn)生兩種基因型模式。由于在治療之前已經(jīng)呈現(xiàn)出不同的基因背景時(shí)，當(dāng)結(jié)合藥理學(xué)中的個(gè)體差異應(yīng)用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的序列和組合物，不僅導(dǎo)致對(duì)AZT和d4T的病毒抗性，而且導(dǎo)致對(duì)其它NRTIs的病毒抗性。根據(jù)所呈現(xiàn)的突變模式，藥物抗性包括阿巴卡韋(ABC),去羥肌苷(ddl),替諾福韋(TNF),拉米夫定(3TC),恩曲他賓(FTC)和扎西他濱(ddC)。因此，引物拯救-相關(guān)TAMs的出現(xiàn)常常在更顯著抗HIV的基因型模式的進(jìn)一步演變中起重要作用。因此，防止多核苷抗性的其中一個(gè)步驟是研究開(kāi)發(fā)新的NRTI，其目的在于避免引物拯救相關(guān)TAMs的累積。引物拯救-相關(guān)TAM突變可與其它家族的逃避突變體伴隨發(fā)展，它們通常從聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法形成(也被稱作雞尾酒療法)。今天，雞尾酒"雙汰芝"(AZT+3TC)是最常使用的且被建議為治療自然HIV患者的一線治療方法。然而，它導(dǎo)致抗兩種藥物的逃避突變體。例如，Miller等人(1998)報(bào)道了在AZT+3TC聯(lián)合治療開(kāi)始后4-12周，選擇了具有M184V突變的3TC-抗性病毒。如期，附加的AZT-相關(guān)突變逐漸出現(xiàn)，產(chǎn)生M184V,M41L,D67N,K70R,L210W,T215Y/F和K219Q/E的特征性基因型模式，其目的經(jīng)常在經(jīng)歷治療的患者中發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，第H208,R211,和L214(Stu畫(huà)r等人2003)和G333位(Kemp等人1998)位的RT附加突變涉及AZT-3TC雙倍抗性，具體而言，使抗AZT的能力增加。因此，引物拯救相關(guān)TAMs的基因型背景已經(jīng)擴(kuò)展至包括Ml84V,M41L,D67N,K70R,H208Y,L210W,R211K,L214F,T215Y/F,K219Q/E和G333E內(nèi)的置換。通常在經(jīng)過(guò)治療的患者中見(jiàn)到的其它類型的突變是V118I和E44D/A。這些突變與先前接觸ddl和d4T十分相關(guān)。此外，它們常常與特異性TAM蔟包括M41L加T215Y/F或D67N加L210W的存在有關(guān)。結(jié)果是對(duì)胸腺嘧啶核苷類似物家族的引物拯救相關(guān)TAM抗性增加以及對(duì)AZT+3TC的雙倍抗性的不同作用(Montes等人2002,Girouard等人2003)。藥物逃避突變體的優(yōu)勢(shì)在治療過(guò)程中作為所用NRTIs數(shù)的函數(shù)而增加并形成展開(kāi)的TAMs或NAMs模式，其包含在M41L,E44D/A,D67N,K70R,V118I,M184V,H208Y,L210W,R211K,L214F,T215Y/F,K219Q/E和G333E內(nèi)的多種置換。該簇還常常耐受含有AZT-和d4T的聯(lián)合療法，并交叉抗整個(gè)種類的NRTIs。對(duì)胸腺嘧啶核苷類似物，特別是AZT,d4T和TNF的顯著抗性還可在RT指區(qū)中第67位(A67)具有氨基酸缺失的逃避突變體中發(fā)現(xiàn)，其常常與伴有TAM的T69G的氨基酸置換有關(guān)(見(jiàn)Imamichi等人2000和2001)。RT聚合活性的提高，其與該特定的基因型有關(guān)，導(dǎo)致更有效的焦磷?；?依賴性引物切除(上述)，使抗性增加。Boyer等人(2004)還觀察到與單獨(dú)的TAM相比，伴有TAM的促進(jìn)對(duì)AZT和TNF的引物拯救(切除)病毒抗性的能力增加。HIV與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法共同發(fā)展。當(dāng)雙倍和三倍-核苷類似物雞尾酒用于HIV的臨床管理，特別是治療初患者時(shí)，出現(xiàn)新的突變表型。復(fù)雜的治療方法，需要在一天的不同時(shí)間服用多種藥物，有些伴隨進(jìn)食，有些不需要進(jìn)食，對(duì)患者而言是個(gè)挑戰(zhàn)。不能準(zhǔn)確按照這些導(dǎo)致24小時(shí)低谷缺乏的給藥方法做，促進(jìn)了多種NRTI抗性HIV病毒的出現(xiàn)，主要是病毒獲得性NAMs或MDRs。例如，許多小組(例如Mas等人，2000)已經(jīng)觀察到與AZT使用有關(guān)的突變體T的S-XX病毒的出現(xiàn)。該突變體，在其RT的編碼區(qū)具有6-bp的插入，即指定氨基酸69和70的核酸之間。所得雙倍氨基酸插入復(fù)合物(通常是SS,SG或AG插入)不僅導(dǎo)致對(duì)AZT的病毒抗性，而且導(dǎo)致對(duì)NRTIs的幾乎整個(gè)集合，包括d4T,3TC,ddl,ddC和ABC,及TNF的病毒抗性。使用T69S+雙倍氨基酸插入可見(jiàn)到提高了的焦磷?；?依賴性引物拯救，特別是在有TAMs存在的情況下。該現(xiàn)象通常與"M41L/T215Y"或"M41L/L210W/R211K/L214F/T215Y"抗性表型有關(guān)且在多核苷抗性中起重要的表型作用(Meyer等人，2003)。另一類MDR在密碼子Q151M處具有氨基酸置換。在臨床中以相對(duì)較低的頻率觀察到該突變且常常與A62V,V乃I,FWL和F116Y的第二突變一起呈現(xiàn)。然而，它對(duì)各種NRTIs均具有顯著抗性。此外，已經(jīng)觀察到與TAMs，通常是"M41L,L210W和T215Y/F，或"D67N,K70R和K219K/E"基因型有關(guān)。它在使用AZT/ddl和AZT/ddC聯(lián)合方法治療的患者中出現(xiàn)。L74V經(jīng)常被ddl單一療法所選擇(Martin等人，19W)且顯示對(duì)ABC和3TC的交叉抗性。它對(duì)產(chǎn)生病毒逃避的作用取決于其它突變的存在?？剐匝芯勘砻鱈74V的頻率與TAM十分相關(guān)，通常在M41L,U10W和T215Y/F背景中(Marcelin等人，20(M)，盡管認(rèn)為L(zhǎng)MV突變?cè)诓《緩?fù)制中引起減小作用且使含有許多TAMs的AZT-抗性病毒再次敏感(St.Clair等人，1991)。HIV-lRT中L74V和M184V突變的組合是與對(duì)ABC和ddl的抗性有關(guān)的最常見(jiàn)模式(Harrigan等人，2000和Miller等人,2000)。雖然對(duì)ABC的高水平抗性通常需要多個(gè)突變，包括K65R,L74V,Y115F和M184V,但單一突變，M184V常常首先出現(xiàn)。該突變，現(xiàn)在被認(rèn)為是藥物逃避抗性的識(shí)別機(jī)理中的重要突變，導(dǎo)致ABC敏感性適度降低(Tisdale等人，1997)。CNA3005研究，其中總共5W名患者隨機(jī)接受AZT和3TC與ABC或ddl，顯示在AZT和3Tc加ABC臂中攜帶TAM的患者比例增加。到第48周，多達(dá)56%的患者具有至少一個(gè)引物拯救-相關(guān)TAM(lxTAM)，超過(guò)且高于迅速誘導(dǎo)的M184V突變(Melby等人，2001)，示例性地說(shuō)明了防止引物拯救-相關(guān)抗性出現(xiàn)的重要性。同樣，在3TC選擇壓下，具有67,70,215和219基因型模式的AZT-抗性病毒的體外傳代導(dǎo)致M184V突變的選擇并導(dǎo)致對(duì)ABC的交叉抗性(Tisdale等人1997)。這再次突出了治療引物拯救-相關(guān)TAM的預(yù)存在并防止引物拯救-相關(guān)突變體累積的概念是避免多核芬抗性發(fā)展的關(guān)鍵步驟。已經(jīng)越來(lái)越清楚地發(fā)現(xiàn)K65R突變可迅速出現(xiàn)在較高比例的接受TNF或ABC的患者中。Valer等人(2004)報(bào)道了在Madrid醫(yī)院中，K65R的優(yōu)勢(shì)從1997-2000間的<1%增加到2003年的7%和2004年前4個(gè)月的12%。K65R突變體的作用在有與對(duì)ABC,3TC,ddl和ddC的敏感性降低有關(guān)的其它突變存在的情況下惡化(Pankh等人，2003)。然而，引物拯救-相關(guān)TAM基因型的K65R的同時(shí)出現(xiàn)，雖然^艮少，但導(dǎo)致對(duì)TNF的引物拯救(切除)作用較之AZT更顯著(Naeger等人，2001)。據(jù)報(bào)道TNF對(duì)HIV-1是活性的，高達(dá)3xTAMs。除非TAM蔟包括M41L或L210W突變。目前還不清楚為什么TAMs可使K65R的某些作用逆轉(zhuǎn)，關(guān)于對(duì)TNF和ABC的l文感性，認(rèn)為它會(huì)阻礙引物切除突變體。最后，首次確定了T69D突變引起ddC抗性的作用。已經(jīng)報(bào)道過(guò)當(dāng)它與T215Y突變和其它引物拯救相關(guān)TAM基因型結(jié)合出現(xiàn)時(shí)，與對(duì)ddl的反應(yīng)降低有關(guān)。許多年來(lái)，WHO和DHHS(USDepartmentofHealthandHumanHealthService)建議使用一線抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法治療初患者，包括給予d4T或AZT結(jié)合3TC力口奈韋拉平或efavirenz(GuidelinesfortheUseofAntiviralRetroviralAgentsinHIV-1-InfectedAdultsandAdolescents,July142003andMarch232004)。然而，許多HIV-感染患者均經(jīng)歷了治療失敗，而最初他們經(jīng)歷了活性很高的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART),表明這些患者已經(jīng)感染了藥物逃避病毒。引物拯救-相關(guān)TAM抗性突變體繼續(xù)在藥物抗性的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此，研究開(kāi)發(fā)阻礙引物拯救相關(guān)TAM抗性突變體作用的藥物或治療方法可加強(qiáng)或延長(zhǎng)現(xiàn)有用于治療治療-初患者的NRTIs的使用，且可用于在搶救療法中治療攜帶引物拯救-相關(guān)抗性突變體的HIV感染群體。預(yù)防/抑制引物-拯救突變體的藥物策略《1物拯救和區(qū)別突變常常共同出現(xiàn)在相同的突變體基因型中，這主要是由于目前的治療策略。M184V突變是區(qū)別突變體家族的代表。然而，如果它與引物拯救-相關(guān)突變體如M41L,D67N,K70R,L210W,T215Y/F，和K219Q/E聯(lián)合出現(xiàn)，則它在對(duì)AZT和3TC的雙倍抗性中發(fā)揮作用(Miller等人，1998)。這些引物拯救和區(qū)別抗性基因型似乎與RT中突變的不同簇有關(guān)。例如，M41L,E44D/A,D67N,K70R,VI181,M184V,H208Y,L210W,R211K,L214F,T215Y/F,K219Q/E和G333E內(nèi)包含各種置換的AZT國(guó)相關(guān)突變，具有6-bp插入的MDRT69S突變和通常顯示出引物拯救突變體活性。另一方面，第65,74,89,151,和1S4位的突變可產(chǎn)生區(qū)別NRTIs和各dNTP對(duì)應(yīng)物的能力或它們可涉及引物-模板復(fù)合物的復(fù)位。在最近的文章"Designinganti-AIDSdrugstargetingthemajormechanismofHIV-1RTresistancetonucleosideanalogdrugs"(IJBCB36(2004)1706-1715,其整體引入此處作為參考)中，Sarafianos等人推斷引物拯救(切除)機(jī)制可僅在N-位點(diǎn)處的RT易位之前發(fā)生，還進(jìn)一步推斷它已變?yōu)镹RTI抗性的主要機(jī)理。在標(biāo)題為"StrategiesforInhibitionoftheExcisionReaction"(見(jiàn)第nil頁(yè))的章節(jié)中，他們提出三種方法來(lái)?yè)魯∵@種抗性4幾理1.使用阻礙ATP有效結(jié)合(P位點(diǎn)處)的新的抗病毒劑，推測(cè)在ATP-結(jié)合位點(diǎn)處或接近ATP-結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合，由此在不影響DNA合成向前反應(yīng)的情況下阻斷切除反應(yīng)。2.使用可阻斷DNA合成但不知什么原因抗切除的化合物，如目前NRTIs的borano-或硫-取代的oc-磷酸鹽變體。同樣，可對(duì)目前NRTIs的變體進(jìn)行基因工程改造，以不可切除的方式使擴(kuò)展/終止的模板/引物復(fù)位，正如3TC誘導(dǎo)的M1841/V的較差切除能力所示的。3.使用基于二核苷酸四磷酸鹽的抑制劑，從而在N-和P-位點(diǎn)提供二-配位基。這三種建議的阻止NRTI抗性的引物拯救機(jī)理均由于各種理論上的缺點(diǎn)而被批評(píng)。例如，在第一種方法中，正常RT功能不需要ATP結(jié)合。因此，通過(guò)竟?fàn)幓蜃钄鄟?lái)抑制ATP或焦磷酸鹽結(jié)合的對(duì)策不能阻止抗性的發(fā)展，這是因?yàn)椴《镜倪m應(yīng)性將不能被這種藥劑所危害。換句話說(shuō)，抗性突變?cè)跊](méi)有進(jìn)化代價(jià)的情況下出現(xiàn)。存在于正常淋巴細(xì)胞中的大量ATP還會(huì)挑戰(zhàn)該方法的合理性。在第二種建議的方法中，看起來(lái)borano-或硫-取代的a磷酸鹽類似物會(huì)選擇區(qū)別抗性突變體，正如使用3TC和FTC所見(jiàn)到的，且產(chǎn)生HIV抗性突變體。第三種建議的方法受到需要通過(guò)藥動(dòng)學(xué)將大量且高度帶電的四磷酸鹽二核苷酸種類攝取到靶細(xì)胞中所限。這將是一種嚴(yán)重的制藥和藥物遞送的湘匕戰(zhàn)。值得注意的是，各Serafaniano，s方法，包括方法l，其本身不是抗病毒的，但預(yù)料常規(guī)NRTI的共同給藥是基于現(xiàn)在這代NRTIs的變體。即，化合物缺少3-羥基官能團(tuán)且因此可作為強(qiáng)制性鏈終止劑。不同于上面討論的"經(jīng)典"NRTIs(即，缺少3'-羥基官能團(tuán)的那些)，Ohrm等人(JMedChem(2000)43,4516-4525，其整體引入此處作為參考)描述了4'-C-乙炔基HIV抑制劑oh式I這些化合物仍保留有3，-羥基官能團(tuán)，但仍然顯示抗HIV-1的活性，包括具有A62V,V75L,F77L,F116Y和Q151M突變的典型區(qū)別MDR抹。作用機(jī)理假設(shè)是與核苷磷?；っ傅挠H和性。然而，還觀察到這些化合物可作為DNA鏈終止劑發(fā)揮作用，這是由于它們的新戊醇特征和鄰位順4，取代基的嚴(yán)重空間阻礙，其導(dǎo)致3，-羥基的活性大大減小。Kodama等人(AntimicrobAgentsChemother(2001)1539-1546,其整體引入作為參考)描述了一組非常相似的化合物，其具有與所保留的3，-羥基官能團(tuán)相鄰的4'-C-乙炔基，并在具有附加HIV抗性抹的細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)它們進(jìn)行了測(cè)定。因?yàn)镵odama等人沒(méi)有制備它們化合物的三磷酸鹽，因此它們不能說(shuō)明作用機(jī)理，但可從各種依照情況的觀察推斷，該化合物的確可作為NRTIs發(fā)揮作用。Kodama等人隨后報(bào)道了(摘要388-T,20039thConferenceonRetrovirusesandOpportunisticInfections,其整體引入此處作為參考)在它們4-C-乙炔基核苷體外選^l奪壓下，發(fā)現(xiàn)了具有位于RT催化位點(diǎn)中的T165I和M184V突變的突^5皮抗性HIV。該突變體表型很清楚是區(qū)別類型的突變且很嚴(yán)重地交叉抗3TC。因此推斷了阻斷4-C-乙炔基核苷摻入的空間沖突。已經(jīng)使用3TC抑制機(jī)理建議且因此幾乎確定地代表了區(qū)別抗性機(jī)理。因此，Kodama化合物在處理促進(jìn)引物拯救(ATP或焦磷酸鹽介導(dǎo)的切除)的突變體方面提供指導(dǎo)似乎不太可能。Chen等人(Biochemistry(1993)32:6000-6002,其整體引入此處作為參考)對(duì)4M立具有疊氮基的一系列結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物進(jìn)行了擴(kuò)展性機(jī)理研究Chen證實(shí)了RT可有效摻入兩個(gè)連續(xù)的4'-疊氮基胸腺嘧啶核苷一磷酸鹽核苷酸，其終止鏈的延長(zhǎng)。此外，RT還能夠摻入第一個(gè)4，-疊氮基胸腺嘧啶核苷一磷酸鹽，接著摻入天然dNTP,然后摻入第二個(gè)4，-疊氮基胸腺嘧啶核苷的核苷酸，其也可導(dǎo)致鏈終止。應(yīng)注意這兩種機(jī)理全都導(dǎo)致4'-疊氮基胸腺嘧啶核苷一磷酸鹽存留于終止的DNA引物末端，其是目前NRTIs非常舊的抑制機(jī)理。細(xì)胞(即非-病毒)聚合酶a和fi各自均能夠摻入單一的4，-疊氮基核苷酸，但不能第二次摻入到宿主DNA的初生鏈中也是顯而易見(jiàn)的。這些細(xì)胞聚合酶然后利用其它天然的dNTPs使宿主DNA鏈延長(zhǎng)且永久性將NRTI核苷酸摻入到宿主DNA基因中。這些化合物還沒(méi)有在人類中實(shí)行，這是因?yàn)榧?xì)胞酶所致非-天然核苷酸的錯(cuò)誤摻入很明顯涉及致癌作用。同樣，終止了Kodama相應(yīng)4'-C-乙炔基化合物的制藥發(fā)展，依其描述是由于在高等生物中的嚴(yán)重毒性。EP341911描述了下式3'-C-羥甲基核苷的擴(kuò)大家族并建議它們主要抗皰疹病毒如CMV,也可抗逆轉(zhuǎn)錄病毒。WO92/06201還/^開(kāi)了一組類似的化合物和適應(yīng)4正。US5,612,319(其整體引入此處作為參考)公開(kāi)了2，-3，二脫氧-3，-0羥甲基胞嘧啶對(duì)野生型HIV-1IB和猿等價(jià)物，SIV-1，在HIV感染急性cynomolgus猴模型中的逆轉(zhuǎn)錄病毒活性。該公開(kāi)建議使用所述化合物作為暴露后的預(yù)防劑，特別是對(duì)針-刺損傷。暴露后預(yù)防意味著將活性成分立即給予人如醫(yī)療人員，他們本身在不知情的情況下被可能感染了HIV的注射器刺到。為了確保迅速治療可了解打擊的保健人員，用于進(jìn)行化學(xué)和生物學(xué)戰(zhàn)斗的解毒藥的自我給藥的彈簧式注射器是優(yōu)選的給藥途徑。暴露后預(yù)防的目的是防止建立本身的感染，而不是治療進(jìn)行的感染。本身，打算使用極高劑量的化合物進(jìn)行較短時(shí)間如24-48小時(shí)的治療。該公開(kāi)表明因?yàn)榻o藥的分散時(shí)間，短暫毒性是可接受的，因?yàn)槿匀徽趪L試預(yù)防不能治愈的疾病。US5,612,319中所述的暴露后預(yù)防方法從來(lái)沒(méi)有在人類中嘗試過(guò)-實(shí)際上，根本還沒(méi)有將2，-3，二脫氧-3，-。-羥曱基胞嘧啶給予人。1994年，當(dāng)US5,612,319申請(qǐng)遞交時(shí)，今天已知的多抗性HIV還沒(méi)有以任何令人信服的形式出現(xiàn)。今天的多抗性HIV具有從NRTI療法多年的選擇壓誘導(dǎo)并累積的引物拯救突變。換句話說(shuō)，這些專利授權(quán)時(shí)的HIV,特別是RT與今天的病毒在結(jié)構(gòu)和機(jī)理上有很大不同。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供一種治療HIV患者的方法，其中HIV的RT具有至少一式III個(gè)引物拯救突變，其通過(guò)ATP-或焦磷酸鹽-介導(dǎo)的切除將強(qiáng)制性鏈終止核苷或核苷酸磷酸酯從新生DNA鏈中切除。該方法包括給予患者有效量的2',3'-二脫氧-3'-羥曱基胞嘧啶或其鹽。本發(fā)明另一實(shí)施方案提供一種抑制HIV引物拯救突變體出現(xiàn)或繁殖的方法，所述突變體能夠通過(guò)ATP-依賴的或焦磷酸鹽依賴的切除才幾理除去摻入到HIV引物/模板復(fù)合物中的鏈-終止NRTI核苷酸。該方法包括同時(shí)或順序給予感染了HIV的個(gè)體有效量的2，,3，-二脫氧-3，-羥曱基胞嘧啶和至少一種誘導(dǎo)引物拯救突變體的鏈終止劑NRTI。本發(fā)明還提供了2',3'-二脫氧-3'-羥曱基胞嘧啶或其鹽在制備治療HIV感染的藥物中的用途，其中HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少一個(gè)突變，其通過(guò)ATP-或焦磷酸鹽-介導(dǎo)的切除將強(qiáng)制性鏈終止核苦或核苷酸磷酸酯從新生DNA鏈中切除。還提供了用于治療HIV感染的2',3'-二脫氧-3'-羥曱基胞嘧啶或其鹽，其中HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少一個(gè)突變，其通過(guò)ATP-或焦磷酸鹽-介導(dǎo)的切除將強(qiáng)制性鏈終止核苦或核苷酸磷酸酯從新生DNA鏈中切除。此外，還提供了作為活性成分的2',3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶或其鹽以及至少一種鏈終止劑NRTI在制備下述藥物種的應(yīng)用，所迷的藥物同時(shí)或順序給予所述活性成分抑制HIV突變體在感染了HIV的個(gè)體中出現(xiàn)或繁殖，其中所述突變體能夠通過(guò)ATP-依賴的或焦磷酸鹽依賴的切除機(jī)理除去摻入到HIV引物/模板復(fù)合物中的鏈-終止NRTI核苦酸。還提供了同時(shí)或順序給予下述活性成分，用于抑制HIV突變體在感染了HIV的個(gè)體中出現(xiàn)或繁殖，所述的活性成份為2，,3'-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶或其鹽以及至少一種鏈終止劑NRTI，其中上述突變體能夠除去摻入到HIV引物/模板復(fù)合物中的鏈-終止NRTI核苷酸，該除去通過(guò)ATP-依賴的或焦磷酸鹽依賴的切除機(jī)理促進(jìn)。在本發(fā)明的用途和方法中，必要時(shí)，2，,3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶可以其在體內(nèi)釋放2',3'-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶或其5，-一磷酸鹽的前藥形式使用。雖然不希望受到可能的機(jī)理的束縛，但仍認(rèn)為2',3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶被細(xì)胞酶磷?；上鄳?yīng)的5，-三磷酸鹽。多抗性HIV的嚴(yán)重突變的RT，特別是引物拯救-相關(guān)突變體RT，將該三磷酸鹽作為5，-(2，,3，-二脫氧-3，-C-羥甲基胞嘧啶)一磷酸鹽摻入到新生DNA《連中。常規(guī)NRTIs可起強(qiáng)制性鏈終止劑的作用，在N-位點(diǎn)終止DNA合成，且因此對(duì)多抗性HIV獨(dú)有的上述ATP-或焦磷酸鹽介導(dǎo)的引物拯救(切除)機(jī)理敏感。相反，在此處提出的證據(jù)表明5，-(2，,3，-二脫氧-3，-(3-羥甲基胞嘧啶)一磷酸鹽不能起強(qiáng)制性鏈終止劑的作用，而是可使其它殘基與5，-(2，,3，-二脫氧-3，-C-羥甲基胞嘧啶)一磷酸鹽的3'羥曱基官能團(tuán)共價(jià)連接。然后促進(jìn)RT經(jīng)歷必需的轉(zhuǎn)化改變，從而易位到P-位點(diǎn)中，進(jìn)行下一輪聚合。以下面提出的模板序列為基礎(chǔ)的初步證據(jù)表明這樣連4妄的末端殘基是天然核苷酸，而不是其它5'-(2',3，-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶)一磷酸鹽。重要地是，使用本發(fā)明方法獲得的及下面提出的證據(jù)表明最后摻入的，非-2'3'-二脫氧-3'-C-雍曱基胞嘧啶核苷酸不能通過(guò)突變的逆轉(zhuǎn)錄酶而進(jìn)一步加入核苷酸。即，鏈終止似乎發(fā)生在本發(fā)明NRTI之外的一個(gè)堿基上，而不是NRTI上。此外，在摻入本發(fā)明化合物之后，RT似乎成功易位到P-位點(diǎn)，以便接受下一個(gè)進(jìn)入的核苷酸。該證據(jù)表明本發(fā)明化合物，與引物拯救-相關(guān)的突變RT聯(lián)合，獲得鏈終止形式，其不受ATP-或焦磷酸鹽誘導(dǎo)的切除的作用。因此，請(qǐng)求保護(hù)的方法可有效治療對(duì)目前藥物方法不敏感的HIV感染。因此上面討論的抑制機(jī)理從根本上不同于Chen等人(如上所述)的4'-取代核苷的鏈終止機(jī)理，即使得若千核苷酸在摻入4-取代化合物后被摻入。首先Chen的機(jī)理可顯著提高"通讀"的危險(xiǎn)。即，DNA聚合酶繼續(xù)跟隨編碼鏈并繼續(xù)將編碼的殘基加入到標(biāo)準(zhǔn)終止密碼子之后，由此將異常核苷錯(cuò)摻到DNA鏈內(nèi)。雖然錯(cuò)摻了4，-取代的核苷，當(dāng)通過(guò)病毒聚合酶(即，RT)構(gòu)造病毒DNA鏈時(shí)，抗病毒功效丟失，這是因?yàn)橥ㄗx構(gòu)造可能仍然是有活力的。更重要地是，如果4'-取代的核苷被細(xì)胞(即宿主)聚合酶通讀，如Chen所述，所得構(gòu)造之后代表致畸原并使細(xì)胞損害和癌癥的危險(xiǎn)顯著增加。Chen化合物此外需要加入第二個(gè)4，-取代的核苷酸，或者與第一個(gè)錯(cuò)摻的4'-取代的核苷酸相鄰(即X-X)，或者被一個(gè)天然核苷酸間隔開(kāi)(即，X-N-X)。在實(shí)踐中，這意味著引物末端最后位置上的核苷酸是非-天然的(即，藥物)核苷酸。這是一種與典型NRTI(即，缺少3-羥基的那些)鏈終止的情況類似的情況。這里，NRTI核苷酸還停留于引物末端的最后位置上，正如上面所討論的，它對(duì)ATP或焦磷酸鹽介導(dǎo)的切除壽文感。需要Chen4，-取代核苷酸的多個(gè)單元，以便像有效的RT抑制劑那樣工作。因此，藥物的有效性取決于讀鏈的序列。例如，如果Chen化合物是胸腺嘧啶核苷類似物，如果讀鏈具有AA或A-N-A序列的話，則具有最好的親和性。這時(shí)，藥物將是有效的且可有效終止DNA合成。但是如果讀鏈的序列不含大量的AA或A-N-A序列，在給定濃度下Chen藥物將不太可能終止DNA合成。因?yàn)樵诨蚪M中AA雙聯(lián)體或A-N-A三聯(lián)體與單個(gè)的A相比要少得多，因此Chen藥物與其它不需要多個(gè)單元的NRTIs相比，不太有效。本發(fā)明治療或預(yù)防的多抗性HIV通常具有這樣的RT，即RT所具有包括下列至少一種的基因型模式(a)M41,土D67,L210和T215;(b)D67,K70和K219;(c)T69S-XX或(d)A67其中XX代表任意兩個(gè)天然氨基酸加入到RT序列中，A67代表密碼子67位上的氨基酸缺失。雖然，據(jù)信上面4個(gè)基因型模式代表了切除藥物逃逸表型的重要基和其他位點(diǎn)包括附加突變，在RT基因中常常包括至少3個(gè)突變。通常，但不絕對(duì)，蔟M41,±D67,L210和T215常常包括M41L,士D67NL210W和T215Y或T215F。任選地，上述簇還可在第E44,K70,VI18,H208,R21IK,L214,K219或G333位包括至少一個(gè)其它突變。上述簇還可在第T69,E203,L210,D218,H221,D223或L228位包括至少一個(gè)附加突變。通常，但不絕對(duì)，蔟D67,K70和K219包括D67N,K70R和K219QK219E。任選地，簇D67,K70和K219還可在第M41,E44,VI18,H208,L210,R211K,L214,T215,或G333位包括至少一個(gè)附加突變。此外，簇D67,K70和K219任選地還可在第T69,E203,L210,D218,H221,D223或L228位包括至少一個(gè)附加突變。通常，但不絕對(duì)，蔟T69S-XX還可在第M41,E44,D67,K70,V118,H208,L210，R211K,L214,T215,K219或G333位包括至少一個(gè)附加突變。任選地，簇T69S-XX還可在第A67,T69,E203,L210,D218,H221,D223或L228位包括至少一個(gè)附加突變。通常，但不絕對(duì)，蔟A67還可在第M41,E44,D67,K70,V118,H208,L210,R211K,L214,T215,K219或G333位包括至少一個(gè)附加突變。任選地，簇A67還可在第T69,T69S+XX,E203,L210，D218,H221，D223或L228位包括至少一個(gè)附加突變。任選地，逆轉(zhuǎn)錄酶還可在第K65,L74,M184或Q151位，特別是K65RL74V或M184V或Q151M位具有至少一個(gè)區(qū)別突變。通常，區(qū)別突變體(discriminativemutant)的簇可與第A62,V75，F(xiàn)77,Y115或F116位的至少一個(gè)附加突變相連?？捎杀景l(fā)明治療的HIV抹是多抗性HIV株，它的RT具有促進(jìn)的ATP-或焦磷酸鹽-介導(dǎo)的鏈終止NRTi核苷酸引物拯救(切除)的突變，且其是在先使用選自下列的至少一種抗病毒劑進(jìn)行治療而在患者內(nèi)引發(fā)的，所述的治療劑指齊多夫定(AZT,ZDV),司他夫定(d4T),扎西他濱(ddC),去羥肌苷(ddl),阿巴卡韋，(ABC),拉米夫定(3TC),恩曲他賓(FTC),阿德福韋(ADV),恩替卡韋(BMS200475)阿洛夫定(FLT),替諾福韋替諾福韋酯(TNF),amdoxavir(DAPD),D畫(huà)d4FC(DPC-817),-dOTC(SPD754),SPD-756,racivir,D-FDOC和GS7340?？蛇x擇性地，HIV林是在直接或間接從另一個(gè)體處接受了這種抗性或多抗性HIV林的患者中發(fā)現(xiàn)的那些，所述另一個(gè)體具有通過(guò)使用選自上述NRTI抗病毒劑列表的至少一種抗病毒劑持續(xù)治療而誘導(dǎo)的抗性或多抗性HIV抹。經(jīng)常地，與野生型相比，多抗性HIV抹在病毒RT中含有至少3個(gè)突變。因此，^艮明顯本發(fā)明的方法和組合物可用作目前抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，如HAART的補(bǔ)充，或在某些情況下可用作拯救或搶救療法。這通常是患者的早期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療歷史在該患者中誘導(dǎo)了多抗性HIV的情況?？蛇x擇性地，本發(fā)明的方法和組合物構(gòu)成了一線療法，通常在初次HIV感染即是由于已經(jīng)突變的多抗性株所致的患者中。下列抗病毒藥物常常誘導(dǎo)這種多抗性具有RT引物拯救突變的HIV林，其促進(jìn)鏈終止NRTI核苷酸的ATP-或焦磷酸鹽介導(dǎo)的切除，所述抗病毒藥指齊多夫定,拉米夫定或聯(lián)合劑型雙汰芝或Trizivir;拉米夫定，阿巴卡韋或聯(lián)合劑型Epzicom;替諾福韋，恩曲他賓或聯(lián)合劑型Tmvada。而這些藥物常常誘導(dǎo)這種多抗性HIV抹，該藥物列表不是唯一的。因此很明顯可給予2，,3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶，以預(yù)防一個(gè)或多個(gè)多抗性HIV抹的出現(xiàn)，所述HIV抹具有RT引物拯救突變，其促進(jìn)鏈終止NRTI核苷酸的ATP-或焦磷酸鹽-介導(dǎo)的切除。這種預(yù)防甚至在伴隨給予誘導(dǎo)這種突變的NTRI藥物時(shí)也可發(fā)生。本發(fā)明第三方面提供單位劑量形式或共同劑量形式的藥物組合物，包含2',3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶和至少一種鏈終止劑NRTI,其中使用NRTI持續(xù)給藥后，誘導(dǎo)HIVRT引物拯救突變，其促進(jìn)從引物/模板復(fù)合物的3'-末端將摻入的NRTI—磷酸鹽進(jìn)行ATP-依賴的或焦磷酸鹽-依賴的切除并使DNA合成恢復(fù)。本發(fā)明藥物組合物和本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括其中NRTI選自齊多夫定(AZT,ZDV),司他夫定(d4T),扎西他濱(ddC),去羥肌苷(ddl),阿巴卡韋，(ABC),拉米夫定(3TC),恩曲他賓(FTC),阿德福韋(ADV),恩替卡韋(BMS200475)阿洛夫定(FLT),替諾福韋替諾福韋酯(TNF),amdoxavir(DAPD),D-d4FC(DPC-817),-dOTC(SPD754),SPD誦756,racivir,D-FDOC和GS7340及其組合的那些。特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中NRTI選自齊多夫定，司他夫定，去羥肌苷，拉米夫定，阿巴卡韋，替諾福韋，恩曲他賓或其組合。與US5,612,319中^Hf的方法不同，以相對(duì)較低的劑量將2，,3'-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶給予患者，并預(yù)期持續(xù)且延遲的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。該規(guī)定的劑量治療方法可確保規(guī)定的藥物水平并避免毒性，與暴露后的預(yù)防治療不同，其中瞬時(shí)毒性是可接受的。US5,612,319表明用于人暴露后預(yù)防治療的劑量為約10-25mg/kg/天的2',3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶，且在猴子實(shí)驗(yàn)中使用30mg/kg/天。然而在本發(fā)明中，以少于1mg/kg/天，優(yōu)選0.05-0.5mg/kg/天，且最優(yōu)選少于O.lmg/kg/天給予2',3，-二脫氧-3，-C-羥甲基胞嘧啶。適宜劑量取決于適應(yīng)癥和患者，且可很容易通過(guò)常規(guī)動(dòng)物藥代謝和藥動(dòng)學(xué)(DMPK)或臨床試驗(yàn)和預(yù)測(cè)軟件確定。本發(fā)明的單位劑量或共同-劑量藥物組合物具有相應(yīng)量的2，,3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶，通常相對(duì)于60kg或乃kg的成年人衡量，且任選分成一次、兩次或三次，以適應(yīng)QD,BID或TID給藥方法。如果使用前藥，為解決額外量的前藥則要調(diào)高劑量，若考慮到提高生物可利用率可調(diào)低劑量。如果治療劑量為0.05-0.5mg/kg/天，那么每人每天的臨床QD劑量對(duì)于60kg的成年人而言為3mg-30mg，對(duì)于7Ag的成年人而言為3.75-37.5mg。本發(fā)明聯(lián)合劑量單位藥物組合物中附加常規(guī)NRTI的劑量和方法限制可利于QD,BID或TID給藥。共同-劑量形式包括單一包裝，它含有2',3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶或其前藥及上面定義的其它NRTI的硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝。該硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝可包括在一個(gè)硬質(zhì)泡沫塑料襯墊板上使用兩種組分的硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝(通常帶有標(biāo)記，以幫助正確給予適宜數(shù)量的片/膠嚢，例如，其中一種藥物2片，而另一種藥物l片?？蛇x擇性地，共同-劑量形式是具有許多封閉的硬質(zhì)泡沫塑料襯墊板的包裝，其中各藥物具有其自己的硬質(zhì)泡沫塑料村墊板。最新認(rèn)識(shí)到的原理，即在HIVRT情況下的2，3，-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶，其因突變通過(guò)焦磷酰催化途徑進(jìn)行鏈終止劑切除，是通過(guò)不同于鏈終止核苷的不同作用機(jī)理進(jìn)行的，可通過(guò)給予母化合物2'3，-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶，或通過(guò)給予體內(nèi)釋放2'3'-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧p定的前藥而實(shí)現(xiàn)。其中一組2'3，-二脫氧-3-C-羥甲基胞嘧。定的前藥使用石威修飾，如Mauldon等人BiorgMedChem6(l"8)5"-585中所示。典型的堿修飾前藥具有下式其中Rcon獨(dú)立地是H或常規(guī)的藥學(xué)可接受的酯;RS是-Q^O)R7,或酰胺-結(jié)合的L-氨基酸殘基；R6是H;或R5和R6共同限定亞安胺=018118';R7是C廣C6烷基，QrC3烷基環(huán)基；R8和118'獨(dú)立地是H,CrC6烷基，CG-C3烷基環(huán)基；R8是H且R8'是-NR9R9';R9和W獨(dú)立地是H,CrC6烷基，C。-C3烷基環(huán)基；或119和！19'與和它們相連的N原子共同限定々包和的5或6元環(huán)；n是1,2或3;常規(guī)的藥學(xué)可接受的酯包括烷基酯如乙?；?，丙?；?，丁?；挛祯；?，棕櫚酰基，硬脂酰基等和芳基酯如苯曱?；?。其它常規(guī)藥學(xué)可接受的酯包括氨基酸酯如L-纈氨?；?，L-異亮氨酸或L-苯丙氨酸。Mauldon中2，,3，-二脫氧J，-C-羥曱基的堿修飾前藥的例子包括亞胺:-N=CHNR,其中NR是N(CH3)2,N(iPr)2,N(Pr)2,N(CH2)4,N(CH2)5,N(CH2)6,N(CH2CH2)20其它Mauldon石威修飾的前藥包括胞嘧咬氮的酰胺其中Rcon是H或常規(guī)藥學(xué)可接受的酯，Ra是NH(Boc畫(huà)LValyl),NH曙BocL-Phe,L國(guó)valyl,L畫(huà)Phe;或Ra是C(=0)CH3,COPh,COC(CH3)3等石i/修飾的前藥如Mauldin可具有降低對(duì)細(xì)胞和生理學(xué)胞嘧，定脫氨基酶的敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但考慮到在人細(xì)胞中發(fā)生的許多葡萄糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，必須確保修飾的堿不被葡萄糖基轉(zhuǎn)移到天然核糖苷上并被摻入到具有致癌或可產(chǎn)生類似結(jié)果的人DNA中。用于本發(fā)明的2'3'-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶的優(yōu)選組是下式的3'和/或5'酯前藥<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中R和R'中的一個(gè)是具有部分結(jié)構(gòu)的前藥部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中R1是H或CrC18直鏈或支鏈烷基；R2是H或NHR3W是H或L-纈氨?；騆-異亮氨酰酯；且R和R'中的另一個(gè)是H或相同的前藥部分；或其藥學(xué)可接受的鹽。這些酯前藥或2,'3'-二脫氧-3-'C'羥曱基胞嘧啶中有許多是新化合物且形成本發(fā)明另一方面。本發(fā)明酯前藥的其中一個(gè)實(shí)施方案包括式V的化合物，其中W是C廣ds直鏈或支鏈烷基且W是H。代表性烷基部分包括限定酯的那些辛?；?C8，包括酮C),癸酰基(。10),月桂酰基(C!2),肉豆蔻?；?d4),棕櫚?；?C一，硬脂酰基(C^)或二十碳?；?C20)。優(yōu)選的烷基部分包括甲基(即乙?；?乙基，正-丙基，異-丙基，正-丁基，異-丁基，仲-丁基，叔-丁基(即pivolaloyl),正-戊基,l-曱基丁基,2,2-二曱基丁基,2-曱基戊基,2,2-二甲基丙基，正-己基等。該前藥可在R(即5，-0酯)或R，(即3，-0-酯)或兩處(雙3，，5，-0-酯)具有酯。為便于合成和分析，優(yōu)選，但不必須，3，和5'上的酯是相同的前藥部分。本發(fā)明酯前藥的其它實(shí)施方案包括其中R1是低級(jí)烷基，特別是曱基且R是NHRb，其中Rb是選自丙氨酸，纈氨酸.亮氨酸，t-亮氨酸，異亮氨酸和正亮氨酸的L-脂肪族氨基酸的殘基，特別是其中RZ是NH-L-纈氨酰基或NH-L-異亮氨?；哪切?。在該實(shí)施方案中，R1具有與L-乳酸相對(duì)應(yīng)的立體化學(xué)。該前藥可在R(即5'-0酉旨)或R，(即3，-0-酯)或兩處(雙3，,5，-0-酯)具有該酯前藥部分。為便于合成和分析，優(yōu)選，但不必須，3'和5'上的酯是相同的前藥部分。用于本發(fā)明中的其它酯前藥部分包括其中R是支鏈C3-Q烷基且!^是NH2的那些。R/側(cè)鏈優(yōu)選具有L-氨基酸如L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，或L-t-亮氨酸的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。該前藥可在R(即5，-0酯)或R，(即3，-0-酯)或兩處(雙3，,5，-0-酯)具有酯。為便于合成和分析，優(yōu)選，但不必須，3，和5'上的酯是相同的前藥部分。優(yōu)選的前藥包括5，-0-L-纈氨?；?2',3'-二脫氧-3，-C-羥甲基胞嘧啶；5'-0-L-異亮氨?；?2',3，-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶；5'-0-乙?；?2，-3，-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶；5'-0-丙?；?2，-3，-二脫氧-3-C-羥甲基胞嘧啶；5，-0-丁酰基-2，-3，-二脫氧-3-C-羥甲基胞嘧啶；5'-0-新戊?；?2，-3，-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶；2，-3，-二脫氧-3-C-(乙酰基-氧曱基)胞嘧啶；2，-3，-二脫氧-3-C-(丙酰基-氧曱基)胞嘧啶；2'-3，-二脫氧-3-C-(丁?；?氧甲基)胞嘧啶；2，-3'-二脫氧-3-C-(新戊酰基-氧甲基)胞嘧啶；2'-3'-二脫氧-3-C-(L-纈氨?；?氧曱基)胞嘧啶；2'-3，-二脫氧-3-C-(L-異亮氨酰基-氧甲基)胞嘧啶；5'-0-L-纈氨?；?2，,3，-二脫氧-3，-C-L-纈氨酰氧曱基胞嘧啶；5，-0-L-異亮氨?；?2，,3'-二脫氧-3，-C-L-異亮氨酰氧曱基胞嘧啶；5'-0-乙?；?2，-3，-二脫氧-3-C-乙酰氧曱基胞嘧啶；5，-0-丙?；?2，-3，-二脫氧-3-C-丙酰氧曱基胞嘧啶；5，-0-丁?；?2，-3，-二脫氧-3-C-丁酰氧曱基胞嘧啶；5，-0-新戊?；?2，-3，-二脫氧-3-C-新戊酰氧曱基胞嘧啶；及其藥學(xué)可接受的鹽。特別優(yōu)選的前藥包括5，-0-[2-8-(乙-纈氨酰氧)-丙酰基]-2，-3，-二脫氧-3-C-羥甲基胞嘧啶，2',3，-二脫氧-3，-C-[2-S-(L-纈氨酰氧)-丙?；鵠-氧曱基胞嘧啶；5，-0-戊?；?2'-3，-二脫氧-3-C-羥甲基胞嘧啶；2，,3，-二脫氧-3，-C-戊?；?氧甲基胞嘧啶;或5'-0-戊酰基-2，-3，-二脫氧-3-C-戊?；?氧曱基胞嘧啶；或其藥學(xué)可接受的鹽。雖然不希望受到理論的束縛，但是據(jù)信2，3，-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶，像其它核苷類似物一樣，被細(xì)胞激酶胞內(nèi)磷?；?，-一磷酸鹽，其依次被進(jìn)一步磷?；啥姿猁}和三磷酸鹽。二和三-磷?；っ竷A向于較之最初的一磷?；っ富钚愿撸貏e是在某些細(xì)胞類型中。換句話說(shuō)，一磷酰化理論上可以是一種限速步驟。因此，在某些情況下，可很容易以備用的-一磷酰化形式給予母化合物，從而確保迅速向前磷酰化成三磷酸鹽。然而，不能直接使高極性藥物如核苷一磷酸鹽通過(guò)細(xì)胞膜。然而，前藥處理可是前藥胞內(nèi)滲透，其原位水解成一磷酸鹽。其中一種這樣的方法是通過(guò)II期齊多夫定前藥福齊夫定替酯舉例說(shuō)明的，其將脂類石克醚接合物運(yùn)用到齊多夫定的磷酸酯。見(jiàn)，例如，GirardinJAIDS23227-235和專利US5756,711US5563257和EP545966。用于2'3'-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶的5'-—磷酸鹽的類似構(gòu)造是其中烷基通常是C8-C15in是O(巰基)l(亞硫?；?或2(磺?；?。優(yōu)選包括月桂基琉基和癸醚。在本發(fā)明中，2'3'-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶的前藥還包括胞內(nèi)釋放2'3'-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶-5-'0-磷酸鹽的5'-—磷酸鹽的前藥。本發(fā)明包括藥學(xué)可接受的鹽如有機(jī)酸，特別是羧酸的鹽，包括但不限于乙酸鹽，三氟乙酸鹽，乳酸鹽，葡萄糖酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，馬來(lái)酸鹽，蘋(píng)果酸鹽，泛酸鹽，羥乙基磺酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，門(mén)冬酸鹽，苯甲酸鹽，丁酸鹽，二葡萄糖酸鹽，環(huán)戊酸鹽，葡萄糖庚酸鹽，磷酸甘油鹽，草酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，延胡索酸鹽，煙酸鹽，棕櫚酸鹽，果膠酸鹽，3-苯丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，酒石酸鹽，乳糖酸鹽，pivolate，樟腦酸鹽，十一烷酸鹽和琥珀酸鹽。還包括有才幾石黃酸鹽如甲磺酸鹽，乙磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，苯磺酸鹽，對(duì)-氯-苯磺酸鹽和對(duì)-曱苯磺酸鹽?？山邮艿柠}還包括來(lái)源于無(wú)機(jī)酸的那些如鹽酸鹽，氪烷基一s—烷基_〇_溴酸鹽，氫》典酸鹽，碌u酸鹽，辟,酸氫鹽，半碌u酸鹽，好u氰酸鹽，過(guò)艱u酸鹽，磷酸鹽和磺酸鹽。本發(fā)明擴(kuò)展到體內(nèi)釋放2',3'-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶的水合物，溶劑化物，絡(luò)合物和其它物理形式的活性劑。盡管活性劑可單獨(dú)給藥，但優(yōu)選作為藥物制劑中的一部分。這種制劑包含2，,3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶活性劑以及一種或多種可接受的載體/賦型劑和任選的其它治療成分。載體必須是可接受的，是指與制劑的其它成分相容且對(duì)受體無(wú)害。制劑包括適于直腸，鼻，局部(包括口腔和舌下)，鞘或非腸道(包括皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)和真皮內(nèi))給藥的那些。優(yōu)選該制劑為口服給藥的制劑。制劑通常以單位劑量形式提供，例如，片劑和緩釋膠嚢，且可通過(guò)制藥領(lǐng)域熟知的任何方法制備。這類熟知的方法包括將2',3'-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶活性劑與載體結(jié)合的步驟。通常，制劑是通過(guò)均勻緊密地將活性劑與液體載體或精細(xì)分散的固體載體或兩者結(jié)合，然后如果需要使產(chǎn)品成型而制備的。本發(fā)明擴(kuò)展到制備藥物組合物的方法，包括將化合物2',3'-二脫氧-3'-C-輕曱基胞嘧啶或其藥學(xué)可接受的鹽與藥學(xué)可接受的載體或賦型劑混合或結(jié)合。如果藥物制劑的制備包括將藥物賦型劑與鹽形式活性成分密切混合，則常優(yōu)選使用非-堿性賦型劑，即酸性或中性賦型劑。本發(fā)明口服給藥的制劑可以離散單位如膠嚢、扁嚢劑或片劑的形式提供，各自含有預(yù)定量的活性劑?？蛇x擇性地，它們可以粉劑或顆粒劑；活性劑溶于含水液體或非水液體中的溶液或混懸液形式，或水包油或油包水乳液，大丸劑等形式提供。對(duì)于口服給藥的組合物(例如，片劑和膠嚢劑)，術(shù)語(yǔ)"適宜的載體"包括載體如普通賦型劑，例如粘合劑如糖漿，阿拉伯膠，明膠，山梨醇，黃芪膠，聚乙烯吡咯烷酮(Povidone)，甲基纖維素，以及纖維素，羧曱基纖維素鈉，羥丙基甲基纖維素，蔗糖和淀粉；填充劑和載體，例如玉米淀粉，明膠，乳糖，蔗糖，微晶纖維素，高呤土，甘露糖醇，磷酸二鉤，氯化鈉和藻酸；和潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂，硬脂酸鈉和其它硬脂酸金屬鹽，硬脂酸甘油酯，硬脂酸，硅氧烷流體，滑石粉，蠟，油和膠態(tài)二氧化硅。還可使用調(diào)味劑如薄荷，冬青油，櫻桃調(diào)味劑等。需要的話，可加入著色劑使劑型易于辨認(rèn)。還可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法將片劑包衣。片劑可通過(guò)壓制或模塑法制備，任選使用一種或多種輔助性成分。壓片可通過(guò)在合適的機(jī)器中壓制隨意流動(dòng)形式如粉末或顆粒狀的活性劑而制備，任選與粘合劑，潤(rùn)滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，表面活性劑或分散劑混合。模塑片可通過(guò)在合適的機(jī)器中，將惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物的混合物模塑成型而制備。片劑可任選被包衣或標(biāo)記，并配制成后可達(dá)到緩慢或控制釋放活性劑。適于口服給藥的其它制劑包括在調(diào)味基質(zhì)，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中包含活性劑的錠劑；在惰性基質(zhì)如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠中包含活性劑的軟錠劑；和在適宜的液體載體中包含活性劑的漱口劑。2，,3'-二脫氧-3-C-幾甲基胞嘧啶是通過(guò)常規(guī)的核苦化學(xué)過(guò)程，如US5,612,319,US5,473,063,SvanssonL.等人inJ.org.Chem(1991)Vol56:2993-2997和Bj。rsneM.等人inTetrahedron,Vol49:8637-8644(1993)中/>開(kāi)的那些合成的。堿-修飾的前藥，和某些常規(guī)的3，和5，酯的合成在Mauldin等人BiiorgMedChem6(1998)577-585中公開(kāi)。3，和5'酯的合成通常通過(guò)核苷(根據(jù)需要，使用常規(guī)的N-保護(hù)基團(tuán)而石成N-保護(hù)的)與前藥部分的酸反應(yīng)而進(jìn)行oR1聯(lián)合常規(guī)偶聯(lián)試劑或使用該酯的活化衍生物如酰基卣如?；龋一罨グ?，但不限于，曱酸和乙酸衍生的酸酐，從烷氧羰基卣如異丁氧羰基氯等衍生的酸肝，N-羥基琥珀酰亞胺衍生的酯，N-羥基鄰苯二曱酰亞胺衍生的酯，N-羥基苯并三唑衍生的酯，N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二曱酰胺衍生的酯，2,4,5-三氯苯基衍生的酯等。3，或5'位的區(qū)域選擇，對(duì)于包含單一前藥部分的那些化合物而言，是利用WO97/30051中所示的大批保護(hù)基團(tuán)，或使用Sanghvi等人Synthesis1994,1163,Sanghvi等人TettLettvol35p4697(1994)和Haly&SanghviNucleosides&NucleotidesVol151383(1996)中所示羥基保護(hù)基團(tuán)的差別可選擇對(duì)實(shí)現(xiàn)的。差別可選擇羥基保護(hù)基團(tuán)的許多對(duì)都是已知的，例如，Greene,"ProtectiveGroupsInOrganicSynthesis,"(JohnWiley&Sons,NewYork(1981))中公開(kāi)的O-保護(hù)基團(tuán)。羥基-保護(hù)基團(tuán)因此包括醚如曱醚或取代的曱醚，例如，甲氧基曱醚(MOM),千氧基甲醚，叔-丁氧基甲醚，2-曱氧基乙氧基曱醚(MEM),2，2,2-三氯乙氧基曱醚，雙(2-氯乙氧基)甲醚，2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基曱醚，四氬吡喃基(THP),3-溴四氫吡喃基，四氫噻喃基，4-曱氧基四氫吡喃基，4-曱氧基四氫噻喃基&S二氧化物，四氫呋喃基和四氫噻吩基。乙醚包括l-乙氧基乙醚，l-曱基-l-曱氧基乙醚，l-(異丙氧基)乙醚，2,2,2-三氯乙醚和2-(苯基硒基)乙醚。其它醚包括叔-丁醚，烯丙醚，肉桂醚，對(duì)-氯苯醚和千醚如未取代的卡醚，對(duì)-曱氧基千醚，鄰-硝基千醚，對(duì)-硝基千醚，對(duì)-卣千醚和對(duì)-氰基千醚。其它醚包括3-曱基-2-甲基吡啶基N-氧化物，二苯基甲醚，5-二苯并環(huán)庚醚，三苯基曱醚，a萘基二苯基曱醚,對(duì)-曱氧基-苯基二苯基曱醚，對(duì)(對(duì)'-溴苯曱酰曱氧基)苯基二苯基甲醚,9-蒽醚，9-(9-苯基)噸醚，9-(9-苯基-10-氧代)蒽醚(tntylone)和苯并異噻唑基二氧化物。甲硅烷醚包括三甲基曱硅烷醚(TMS),三乙基甲硅烷醚，異丙基二曱基曱硅烷醚，叔-丁基二曱基曱硅烷醚(TBDMS)，(三苯基曱基)二曱基曱硅烷醚，叔-丁基二苯基曱硅烷醚，甲基二異丙基甲硅烷醚，甲基二-叔-丁基曱硅烷醚，三千基曱硅烷醚，三-對(duì)-二苯曱基甲硅烷基，三異丙基曱硅烷醚和三苯基曱硅烷醚?？蛇x擇的羥基保護(hù)基團(tuán)包括酯，如甲酸酯，曱酸苯曱酰酯，乙酸酯，氯乙酸酯，二氯乙酸酯，三氯乙酸酯，三氟乙酸酯，甲氧基乙酸酯，三苯基曱氧基乙酸酯，苯氧基乙酸酯，對(duì)-氯苯氧基乙酸酯，2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯，2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四曱基丁基)苯氧基乙酸酯，2,4-雙(1,1-二曱基丙基)苯氧基乙酸酯，氯二苯基乙酸酯，對(duì)-(P)-苯基乙酸酯，3-苯基丙酸酯，3-苯曱酰基丙酸酯，異丁酸酯，一琥珀酸酯，4陽(yáng)氧代戊酸酯(levinulate),新戊酸酯，金剛烷二甲酸酯(adamantoate),巴豆酸酯，4-曱氧基巴豆酸酯，(E)-2-曱基-2-丁烯酸酯(甲基巴豆酸酯)和苯曱酸酯如未取代的，或鄰-(二溴曱基)-,鄰-(甲氧羰基)-,對(duì)-苯基-,2,4,6-三曱基-(5-曱基鄰苯二曱酸酯)或?qū)?(P)-苯曱酸酯,或a-萘甲酸酯。碳酸酯保護(hù)基團(tuán)包括曱基，乙基，2,2,2-三氯乙基，異丁基，乙烯基，烯丙基，肉桂基，對(duì)-硝苯基，芐基如未取代的，對(duì)-曱氧基，3,4-二甲氧基-,鄰-硝基或?qū)?硝芐基，或S-芐基硫代碳酸酯。各種羥基保護(hù)基團(tuán)包括N-苯基氨基曱酸酯，N-咪唑基氨基甲酸酯，硼酸酯，硝酸酯，N,N,N,N-四曱基磷酸二酰胺化物和2,4-二硝苯基次磺酸酯。Greene提供廣泛的反應(yīng)性表以幫助選擇區(qū)別性保護(hù)基團(tuán)的互補(bǔ)對(duì)。代表性的羥基保護(hù)基團(tuán)包括實(shí)施例中的那些，和醚如叔-丁基和其它低級(jí)烷基醚，如異丙基，乙基且特別是曱基，芐基和三苯曱基；四氫吡喃醚；取代的乙醚，例如，2,2,2-三氯乙醚;甲硅烷醚，例如，三甲基曱硅烷醚，叔-丁基二甲基曱硅烷醚和叔-丁基二苯基曱硅烷醚；和通過(guò)使羥基與羧酸反應(yīng)制備的酯，例如，乙酸酯，丙酸酯，苯甲酸酯等。如果需要，使用常規(guī)處理策略，如Greene,"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis"(JohnWiley&Sons,NewYork,1981)中所示，其引入作為參考，將前藥部分中的官能團(tuán)如NH,或核苷堿基保護(hù)和脫保護(hù)。N-保護(hù)基團(tuán)包括酰基如甲?；?，乙酰基，丙?；挛祯；?，叔-丁基乙?；?，2-氯乙?；?，2-溴乙?；?，三氟乙?；纫阴；?，鄰苯二甲?；?，鄰-硝基苯氧乙?；?，a-氯丁?；綍貂；?，4-氯苯甲酰基，4-溴苯曱?；?-硝基苯曱?；?；磺酰基如苯磺?；?，對(duì)-甲苯磺酰基等，形成氨基甲酸酯的基團(tuán)如千氧羰基，對(duì)-氯芐氧羰基，對(duì)-甲氧芐氧羰基，對(duì)-硝基千氧羰基，2-硝基芐氧羰基，對(duì)-溴芐氧羰基，3，4-二甲氧芐氧羰基，4-甲氧芐氧羰基，2-硝基-4,5-二甲氧芐氧羰基，3,4,5-三甲氧基芐氧羰基，1-(對(duì)-聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧羰基，a,oc-二曱基-3,5-二曱氧基芐氧羰基,二苯甲氧基羰基，叔-丁氧羰基，二異丙基曱氧羰基，異丙氧基羰基，乙氧羰基，曱氧羰基，烯丙氧基羰基,2,2,2-三氯乙氧基羰基，苯氧基羰基，4-硝基苯氧基羰基，藥基-9-曱氧基羰基，環(huán)戊氧基羰基，金剛烷氧基羰基，環(huán)己氧基羰基，苯基硫羰基等；烷基如千基，三苯曱基，芐氧甲基等；和曱硅烷基如三甲基曱硅烷基等。優(yōu)選的N-保護(hù)基團(tuán)包括曱?；?，乙?；?，苯曱?；挛祯；?，叔-丁基乙酰基，苯磺?；?，千基，叔-丁氧羰基(BOC)和千氧羰基(Cbz)。2，,3，-二脫氧-3，-C-羥曱基一磷酸鹽前藥的合成與US5756,711US5563257,EP545966和W095/32984類似進(jìn)行，對(duì)3'羥曱基官能團(tuán)進(jìn)行適當(dāng)保護(hù)。這種化合物的蓋侖制劑見(jiàn)W097/26867。附圖簡(jiǎn)述圖1是描述在源于病毒性衰竭患者的1086RT序列的M41L/L210W/T215Y背景中具有《|物拯救表型的TAM優(yōu)勢(shì)的圖；圖2是描述在源于病毒性衰竭患者的1098序列的D67N/K70R/L210W背景中具有引物拯救表型的TAM優(yōu)勢(shì)的圖；圖3是RT催化的DNA聚合的略圖；圖4是AZT-終止的引物末端上ATP-介導(dǎo)的引物拯救活性的略圖；圖5描述相對(duì)于常規(guī)NRTIs的抑制，2',3'-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶對(duì)具有引物拯救表型的典型TAM林的抑制；圖6描述相對(duì)于常規(guī)NRTIs,2，,3，-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶對(duì)具有引物拯救表型的M184V+TAMs的抑制；圖7描述相對(duì)于常規(guī)NRTIs，2',3，-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧啶對(duì)T69S+XX+TAMs的抑制；圖8描述相對(duì)于齊多夫定和拉米夫定的抑制，2',3'-二脫氧-3-C-羥曱基胞嘧咬對(duì)TAM林的抑制；圖9是描述以時(shí)間為函數(shù)的DNA合成圖，反映出摻入了2'3'-二脫氧-3，-C羥甲基胞嘧啶一磷酸鹽；圖10是描述殘余的3'-OH引物的圖，表明摻入2',3，-二脫氧-3'-0羥曱基胞嘧啶可限制進(jìn)一步的DNA合成；圖11是凝膠的放射自顯影圖，表明2',3，-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶一磷酸鹽誘導(dǎo)的鏈終止不同于ddC—磷酸鹽誘導(dǎo)的鏈終止的DNA。與使用本發(fā)明化合物產(chǎn)生的片段相比，ddC—磷酸鹽誘導(dǎo)的鏈終止的DNA片段在凝膠中的位置似乎更低。發(fā)明詳述現(xiàn)在僅通過(guò)實(shí)施例，參考所附實(shí)施例和附圖描述本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案禾p方面。實(shí)施例1PhenoSenseHIV測(cè)定法中2，,3，-二脫氧-3-C-羥曱基-胞嘧啶對(duì)TAM引物拯救-相關(guān)抗性HIV的活性2，,3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧咬對(duì)患者血漿樣品HIV-1分離物的敏感性是通過(guò)可商業(yè)獲得的PhenoSenseHIV測(cè)定法(Petr叩oulos,CJ等人,(2000)Antimicrob.AgentsChemother.44:920-928andperformedbyViroLogics,Inc所述)測(cè)定的，其中所述樣品具有典型的TMA引物拯救突變體抗性基因型。該測(cè)定法是通過(guò)擴(kuò)增患者血漿的HIVpol基因的蛋白酶(PR)-RT節(jié)段并將擴(kuò)增產(chǎn)物插入到來(lái)源于NL4-3分子克隆的修飾HIV-1載體中而進(jìn)行的。病毒原液是通過(guò)用重組病毒DNA載體和產(chǎn)生雙嗜性鼠白血病病毒包膜蛋白的表達(dá)載體共-轉(zhuǎn)染293細(xì)胞培養(yǎng)物而制備的。假型病毒顆粒采集自轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物并用于感染新鮮的293細(xì)胞培養(yǎng)物。重組病毒DNA在HIVenv基因區(qū)內(nèi)含有熒光素酶基因框，且熒光素酶在靶細(xì)胞中的產(chǎn)生取決于一輪病毒復(fù)制的完成。藥物敏感性是通過(guò)向細(xì)胞中加入一系列濃度的本發(fā)明化合物和對(duì)照化合物而測(cè)量的。抑制病毒復(fù)制的藥物以劑量-依賴性方式減少熒光素酶信號(hào)，提供藥物敏感性的定量測(cè)量。實(shí)施例la.表1概括了用于實(shí)驗(yàn)中的一簇重要的引物-拯救-相關(guān)TMA突變體，抗HIV且具有特征性TMA基因型，該基因型通常在涉及AZT的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法中出現(xiàn)。表1.引物拯救-相關(guān)TAM患者分離物20和21中的特征性基因型分離物號(hào)特征性引物拯救-相關(guān)TAM突變20M41L,D67N,K70R,VI181,L210W,R211K,T215F,K219Q和L228H21M41L,D67N,K70S,VI181,L210W,R211K,T215Y,K2歷和L228H結(jié)杲在圖5中描述。野生型HIV病毒用作對(duì)照。這里，患者分離物20和21林的抑制用與平行對(duì)照組相比，對(duì)治療藥物敏感性降低的變化以倍數(shù)表示。試驗(yàn)了下列抗病毒藥物AZT,3TC,TNF,ABC,d4T,FTC和本發(fā)明的化合物。清楚表明本發(fā)明的2，,3'-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶仍然保留有對(duì)具有TAM抹的活性。結(jié)果表明，相對(duì)于分離物20林，敏感性僅降低了1.0倍，相對(duì)于分離物21抹，敏感性的降低少于1.0倍。這意味著2',3'-二脫氧-3'-C-羥甲基胞嘧啶仍然保留有對(duì)患者的引物拯救-相關(guān)突變體HIVRT的活性，其功效水平與對(duì)野生型HIVRT的功效類似。比較起來(lái)，其它藥物，特別是AZT(敏感性降低了451倍)，還有3TC,TFN,ABC,d4T和FTC，與野生型相比，對(duì)來(lái)源于這些患者的病毒失去了功效。換句話說(shuō)，來(lái)源于這些患者的病毒顯示出抗性，即如圖5所示，對(duì)這些藥物的敏感性大大降低。值得注意的是，兩種患者分離物在密碼子215處帶有不同的氨基酸轉(zhuǎn)換，分離物20中為T(mén)到F，分離物21中為T(mén)到Y(jié)。這是引物拯救-相關(guān)TAM抗性突變體的代表性證明。實(shí)施例lb表2列出具有基因背景M184V的引物拯救-相關(guān)突變體HIV(區(qū)別突變體)，其通常通過(guò)非常普遍使用的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法AZT+3TC(雙汰芝)選擇。表2.TAM-引物拯救-相關(guān)患者分離物19的基因型改變分離物號(hào)特征性引物拯救-相關(guān)TAM突變19M41L,D67N,K70R,VI181,M184V,L210W,T215F,K219E和L228H如圖6所示，2',3'-二脫氧-3'-C-羥甲基胞嘧啶再次保留了對(duì)該抗性病毒的活性，表明與野生型HIV相比，敏感性差別僅為1.78倍。3TC和AZT均失去了活性且顯示對(duì)抗性病毒的功效降低(即，病毒敏感性顯著降低)(圖6)。實(shí)施例lc用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑連續(xù)供給患者導(dǎo)致出現(xiàn)MDR。在RT指區(qū)(fingerregion)中的氨基酸68與70之間具有6-bp插入的T69S突變常常與各種形式的TAMs結(jié)合見(jiàn)到且導(dǎo)致引物拯救活性提高。選擇一簇MDR(具有不同形式的氨基酸插入)以及TMA,如表3中所列。表3.引物拯救-相關(guān)患者分離物31,32和35中的基因型改變<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>如圖7所示，本發(fā)明化合物可抑制這些患者分離物，與目前用于常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法中的6種對(duì)照抗病毒劑相比，藥物敏感性的變化極小。注意到相對(duì)于患者分離物32和35觀察到對(duì)AZT的敏感性顯著(500-1000倍)降低，而本發(fā)明化合物分別顯示出2.79和4.29倍的改變。這與本發(fā)明化合物顯示出與常規(guī)NRTIs表示的專性DNA鏈終止劑相比不同的抑制機(jī)理一致。實(shí)施例ld分離物4代表又一區(qū)別突變體，其在由R211S和K219E處突變組成的非-必需TAM背景中具有K65R+M184V基因型。該分離物引起對(duì)阿巴卡韋，3TC和新近批準(zhǔn)的核普FTC的典型交叉抗性，但它仍然保留有對(duì)胸腺嘧啶核苷類似物，如AZT和d4T的敏感性。該分離物不具有典型的引物拯救突變，然而本發(fā)明的化合物仍然可抑制該病毒基因型，其FC值為3.88。該值可與胸腺嘧啶核苷類似物AZT(FC4.11)和d4T(FC二0.71)相比較，而相對(duì)于3TC(FO200),FTC(FO40)發(fā)現(xiàn)了顯著抗性，相對(duì)于ABC(FO9.0)發(fā)現(xiàn)了某種程度上的抗性。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了本發(fā)明化合物不僅對(duì)"引物拯救"突變體具有獨(dú)特性質(zhì)，而且能夠抑制來(lái)源于區(qū)別家族的HIV突變體。因此，這與3TC和FTC所用抑制機(jī)理以及上述Kodama4，-C-乙炔基化合物的可能機(jī)理形成對(duì)照，該可能機(jī)理中，M184V連同催化區(qū)中密碼子T165R的一個(gè)附加氨基酸改變導(dǎo)致對(duì)4-C-乙炔基核苦的交叉抗性(Kodama2002)。2，,3，-二脫氧-3-C-羥甲基-胞嘧啶對(duì)PBMC中引物拯救-相關(guān)抗性HIV的活性在PBMC培養(yǎng)物中測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)附加TAM引物拯救-相關(guān)抗性HIV分離物的抗病毒性質(zhì)。生產(chǎn)HIV-1的分離物并通過(guò)感染患者的PBMC與PHA-刺激的供體PBMC共同培養(yǎng)而擴(kuò)展至較高滴度(VirologyManualforACTGHIVLaboratories)。采集沒(méi)有細(xì)胞的上清液，測(cè)序，并在-70。C下等分貯藏，用于藥物敏感性測(cè)定。體外藥物敏感性測(cè)定法使用改進(jìn)的ACTG/DOD共有序列方法(VirologyManualforACTGHIVlaboratories)進(jìn)行。培養(yǎng)4小時(shí)后，在5。/oC02的濕潤(rùn)空氣中，37。C下，用病毒原液預(yù)感染PBMCs4小時(shí)。在培養(yǎng)基中將感染的細(xì)胞洗滌兩次，并吸量到微量滴定平板中，進(jìn)行八次連續(xù)藥物稀釋。各孔含有100,000個(gè)預(yù)感染的PBMC且所有藥物稀釋均使用細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行。選擇藥物稀釋以相對(duì)于各單一藥物跨越50。/。抑制濃度(IC5Q)。在各平板上共-培養(yǎng)含細(xì)胞和病毒的對(duì)照孔。在5%C02的濕潤(rùn)空氣中，37。C培養(yǎng)7天后，使用p24抗原測(cè)定法，測(cè)定上清液的病毒生長(zhǎng)(AbbottLaboratories,Chicago,USA)。計(jì)算與不含藥物的對(duì)照孔相比，病毒生長(zhǎng)的抑制百分比，并以和對(duì)照孔相比的改變倍數(shù)(化合物敏感性的降低)表示。對(duì)照化合物AZT與本發(fā)明化合物平行實(shí)驗(yàn)。選擇一簇代表性？I物拯救-相關(guān)突變病毒，其帶有有引物拯救-相關(guān)TAM抗性RT突變的重要特征。如表4所示，使用在第M41L,D67N,K70R,L210W,T215Y/F和K219Q/E位具有突變的林與或不與區(qū)別突變體Ml84V進(jìn)^亍各種才朱系組合。表4.9利卩患者分離物中的TAM引物拯救-相關(guān)基因型<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>抗性，F(xiàn)C值下降幾百倍。例外是分離物7086(FC=3.0)，其具有T215V氨基酸突變。FC值的完整報(bào)告在圖8中提供。這里，2，,3'-二脫氧-3'-(:-羥曱基胞嘧啶可抑制全部8種分離物，最高FC值僅為2.7。實(shí)施例32',3'-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶保有支持DNA合成的能力本發(fā)明化合物中3，-羥曱基的存在，原則上應(yīng)當(dāng)支持HIV-1RT催化的摻入和延長(zhǎng)到病毒核酸中。使用限速量的引物-模板(使用具有5，-TAACCTTGCGGCCGT-3，(SEQIDN0:1)序列的寡-DNA引物退火的16S和23S核糖體RNA,通常通過(guò)INNOVAGEN合成)。使用100(aM(55倍，IC50)2，-3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶-三磷酸鹽，6.0pMddC-三磷酸鹽(54倍，IC5QddCTP),20(aM脫氧胞嘧"定-三磷酸鹽(20倍，KmdCTP)或?qū)φ战M(1120)預(yù)培養(yǎng)。在所示時(shí)間點(diǎn)(O,10,30,60和120min),通過(guò)在第一輪DNA聚合過(guò)程中，70°C下RT滅活2分鐘而終止DNA聚合過(guò)程(圖9)。殘余量的引物-模板直接反映了第一輪反應(yīng)之后呈現(xiàn)的游離3，-OH引物末端的可利用率。為了測(cè)量，通過(guò)在有l(wèi)SOpM(l^倍，Km)dCTP和氚-標(biāo)記的dCTP存在的條件下加入新鮮RT而開(kāi)始新的聚合。其足以竟?fàn)幍谝惠咲NA聚合留下的殘余2'-;3，-二脫氧J，-C-羥甲基胞嘧啶TP和ddCTP的任意抑制作用。測(cè)量支持進(jìn)一步DNA聚合的殘余量引物-模板中引物末端的游離3，-OH的可利用率，并以預(yù)培養(yǎng)時(shí)間函數(shù)表示(圖10)。參考圖9&10,雖然ddCTP和2，3，-二脫氧-3，-C-羥甲基TP可提供相等的抑制水平，但它們各自支持第二輪HIVRT-催化的DNA聚合的能力形成鮮明對(duì)照。用強(qiáng)制性鏈終止劑如ddCTP預(yù)培養(yǎng)可引起鏈終止且與本發(fā)明化合物的三磷酸鹽相比，游離3-OH引物末端顯著減少。在10和30分鐘的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，與本發(fā)明化合物的三磷酸鹽相比，當(dāng)ddCTP存在時(shí)，少于一半量的殘余3-OH引物末端支持進(jìn)一步的DNA延長(zhǎng)，盡管在第一輪DNA聚合中使用了可比較量的TP化合物。這清楚表明將本發(fā)明化合物的TP纟參入到初生核酸中可為一些進(jìn)一步的DNA合成^是供連續(xù)的機(jī)會(huì)。DNA聚合必須包括酶與模板的結(jié)合，與適宜dNTP復(fù)合，磷酸-二酯形成，焦磷酸鹽釋放和酶從N-位點(diǎn)向P-位點(diǎn)易位，以進(jìn)4亍下一輪合成。因此，很明顯本發(fā)明化合物能夠被摻入并通過(guò)酶而易位到下一個(gè)位置，之后進(jìn)一步的延長(zhǎng)終止。實(shí)施例42',3，-二脫氧-3'-C-羥甲基胞嘧啶一磷酸鹽的摻入導(dǎo)致與ddC相比不同的鏈終止模式兩個(gè)脫氧胞嘧啶類似物，缺少3'-羥基官能團(tuán)的常規(guī)NRTIddC和本發(fā)明的化合物，經(jīng)過(guò)DNA鏈終止測(cè)定，其中DNA延長(zhǎng)是使用預(yù)退火成寡-DNA引物的M13mpl8單鏈DNA模板進(jìn)行的。(5，-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3，(SEQIDNO:2)正向引物序列購(gòu)自AmershamUK。M13mpl8單鏈RNA被退火成寡-DNA引物，其在含有10mMTrisHCl,pH7.9和100mMNaCl的緩沖液中終濃度為lmg/ml，-20°。等分貯藏。DNA聚合是使用該退火模板/引物進(jìn)行的，37。C培養(yǎng)HIV-1RT和天然dNTPs反應(yīng)25分鐘。加入含95%曱酰胺，20mMEDTA,0.05%BromophenolBlue和0.05%XyleneCyanolFF的終止〉容液而纟冬止反應(yīng)(購(gòu)自USB,UnitedStatesBiochemicalviaAmershamUK)。DNA產(chǎn)物變性之后，使延長(zhǎng)的DNA片段在8.0%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并使用放射自顯影法觀察。該測(cè)定包括陰性對(duì)照(天然dNTP)，雙陽(yáng)性ddCTP對(duì)照(ddCTP,8uM,源自SigmaChemical,St.Louis,Miss.,USA和從USBsequencekitUnitedStatesBiochemicalviaAmershamUK荻得的ddCTP)。使用各種分子比的本發(fā)明化合物的三磷酸鹽和天然dNTP。如上所述進(jìn)行反應(yīng)之后，以下列順序?qū)⒃醋愿鞣磻?yīng)的變性DNA片段上樣到8.0%聚丙烯酰胺凝膠上1-陰性對(duì)照2-第一陽(yáng)性對(duì)照8pMddCTP(購(gòu)自Sigma)3-20pM本發(fā)明TP，溶于200pMdNTP中4-30pM本發(fā)明TP，溶于300|uMdNTP中5-40pM本發(fā)明TP，溶于400pMdNTP中6-50(aM本發(fā)明TP，溶于500pMdNTP中7-20pM本發(fā)明TP,溶于80(liMdNTP中8-40(iM本發(fā)明TP,溶于80pMdNTP中9-空白(沒(méi)有上樣)10-第二陽(yáng)性對(duì)照ddCTP(源于USB序列試劑盒)為了避免其它可影響測(cè)定結(jié)果解釋的因素，如與聚丙烯酰胺凝膠有關(guān)的邊緣效應(yīng)，將一式兩份樣品上樣到凝膠中間。圖ll表示描述從凝膠中心部分獲得的放射自顯影結(jié)果的數(shù)碼相片1.陰性對(duì)照(dNTP):發(fā)現(xiàn)DNA聚合沒(méi)有中止。2.l"陽(yáng)性對(duì)照8nMddC-TP:導(dǎo)致預(yù)期的2'3'-二脫氧胞嘧夂位點(diǎn)處的鏈終止。3.20u本發(fā)明TP/200uMdNTP:導(dǎo)致2'3，-二脫氧胞嘧梵之后的位點(diǎn)處的4連終止。4.30uM本發(fā)明TP/300nMdNTP:與ddC-TP相比，導(dǎo)致2'3，-二脫氧胞嘧t定之后位點(diǎn)處的鏈終止。5.40uM本發(fā)明TP/400pMdNTP:與ddC-TP相比，導(dǎo)致2，3，-二脫氧胞嘧啶之后位點(diǎn)處的^T連終止。6.50uM本發(fā)明TP/500uMdNTP:沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性中止(鏈終止才莫式)，但認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)。7.20uM本發(fā)明TP/80uMdNTP:與ddC-TP和上述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)樣品相比，導(dǎo)致2，3，-二脫氧胞嘧啶之后位點(diǎn)處的更顯著的鏈終止效應(yīng)。8.40uM本發(fā)明TP/80uMdNTP:與ddC-TP和上述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)樣品相比，導(dǎo)致2，3，-二脫氧胞嘧啶之后位點(diǎn)處的更顯著的鏈終止效應(yīng)。9.空白(沒(méi)有上樣)10.2nd陽(yáng)性對(duì)照ddC-TP:導(dǎo)致預(yù)期的2'3，-二脫氧胞嘧，定位點(diǎn)處的鏈終止。除了6號(hào)樣品外，本發(fā)明化合物可在所有樣品中誘導(dǎo)^f連終止，所述6號(hào)樣品在500(aMdNTP中含有50pM本發(fā)明的TP。這種例外的原因還未可知，但可能在實(shí)驗(yàn)誤差之內(nèi)。有趣的是，由摻入2，,3'-二脫氧-3，-。-羥曱基胞嘧。定一磷酸鹽產(chǎn)生的DNA片段較之由兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照ddCTP終止的DNA片段(圖ll)產(chǎn)生的片段遷移得更緩慢。一式兩份進(jìn)行的反應(yīng)表示了一致的模式，其意味著本發(fā)明化合物被摻入到了新合成的DNA鏈中并在下一輪核苷酸摻入中形成了3',5'-磷酸二酯鍵。雖然觀察到了長(zhǎng)一個(gè)堿基的片段，但它不能被排除，所用模板序列也可發(fā)揮作用。實(shí)施例3清楚表明當(dāng)使用核糖體RNA模板時(shí)，與ddCTP預(yù)終止的3'-0H引物末端相比，由本發(fā)明化合物預(yù)終止的，3-OH引物末端更支持核苷酸摻入。該特征引起緩慢的電泳移動(dòng)性且意味著RT經(jīng)歷易位，從而開(kāi)始下一輪聚合。雖然不希望收到該機(jī)理的束縛，據(jù)信本發(fā)明化合物在抑制引物切除突變體方面代表了一種新的策略。即化合物被摻入到生長(zhǎng)中的病毒基因組中，同時(shí)保有使RT分子經(jīng)歷必需的轉(zhuǎn)化改變，從而進(jìn)行下一輪DNA合成。實(shí)施例3和4清楚證實(shí)本發(fā)明化合物具有這種性質(zhì)且因此能夠擊敗/抵抗引物拯救抗性機(jī)理，如實(shí)施例1和2中證實(shí)的。Sarafinano等人(2002和2003)提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持了引物拯救反應(yīng)可以僅在RT易位到下一個(gè)位置中前發(fā)生。即，預(yù)易位復(fù)合物是引物拯救突變體有效的必要條件。其中的實(shí)施例中提供的證據(jù)表明其并非本發(fā)明化合物和方法。實(shí)施例5釋放2',3，-二脫氧-3-'C-羥甲基胞嘧啶的酯前藥的制備化合物1的制備3，-MMTR/5，-TMBDS區(qū)別保護(hù)的化合物是按照Sanghvi等人Synthesis(1994)p1163&TetrahedronLettv35(1994)p4697&Nuclesoides&Nucleotidesvl5(1996)1383,TheUtoCconversionisshowninKozlov等人Nucleosides&Nucleotides,vl7(1998)2249所述作為相應(yīng)的尿苷制備的?；衔?的制備將化合物1(5.0g,6.7mmol)溶于80%乙酸(30mL)中并室溫?cái)嚢?4小時(shí)。蒸發(fā)該混合物并通過(guò)閃爍色譜，使用溶于CH2C12中的5-10%MeOH作為洗脫劑純化產(chǎn)物。產(chǎn)率2.1g(64。/。)。化合物3的制備室溫下，用氟化四丁銨處理化合物1(2.3g,3.06mmol)溶于THF(150mL)的溶液lh。加入碳酸氫鈉(sat,100mL)并用二氯曱烷(3x50mL)萃取該混合物。千燥有機(jī)層并蒸發(fā)。通過(guò)閃爍色譜純化殘余物，得到1.3g(82%)化合物3?；衔?的制備0°C下，將三乙胺(0.455g,4.5mmol)和氯甲酸乙酯(0.26g,2.4mmol)加入到Boc-纈氨酸(0.49g,2.25mmol)溶于THF(15mL)的溶液中。相同溫度下攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)，然后過(guò)濾到化合物2(0.72g,1.5mmol)和DMAP(0.55g,4.5mmol)溶于THF(15mL)的溶液中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過(guò)夜。將EtOAc加入到混合物中，用2%檸檬酸洗滌三次并用sat.NaHC03洗滌一次。在Na2S04上干燥有機(jī)層，過(guò)濾并蒸發(fā)。通過(guò)閃爍色譜，使用溶于CH2C12中的2-5%MeOH作為洗脫劑純化殘余物，得到O.35g(34。/。)化合物4?；衔?的制備室溫下，將^匕合物4(30mg,0.066mmol)溶于cone.HC1(1mL)中并攪拌5分鐘。將丙酮加入到該溶液中并使其蒸發(fā)。再次加入丙酮并使溶液蒸發(fā)，真空干燥得到18mg(69r。)化合物5?；衔?的制備將化合物4(0.35g,0.5mmol)溶于THF(20mL)中并加入1.0M氟化四丁銨溶于THF(0.5mL,0.5mmol)的溶液。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物2天。使該混合物蒸發(fā)并通過(guò)閃爍色語(yǔ)，使用溶于CH2Cl2中的5-10%MeOH作為洗脫劑純化，得到0.225g(98%)化合物6?；衔?的制備使用化合物6作為起始物質(zhì)，按照與化合物4相同的方式進(jìn)行合成?；衔?的制備0°C下，將化合物7(75mg,0.114mmol)溶于3mLMeOH中并加入cone.HC1(0.5mL)。0°C攪拌該混合物5分鐘，室溫?cái)嚢?分鐘，然后使其蒸發(fā)。將丙酮加入到殘余物中，并使其蒸發(fā)。加入CH2Cl2并使殘余物蒸發(fā)，真空干燥得到58mg(96%)化合物8?；衔?的制備0°C下，將氯甲酸乙酯(110mg,1.0mmol)加入到Boc-纈氨酸(220mg,1.0mmol)和三乙胺(200mg,2.0mmol)溶于THF(30mL)的溶液中，并攪拌混合物3小時(shí)。使溫度達(dá)到室溫并過(guò)濾該混合物。將濾液加入到化合#勿3(350mg,0.68mmol)和DMAP(244mg,2.0mmol)溶于THF(20mL)的溶液中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過(guò)夜，將乙酸乙酯(100mL)加入到該混合物中，并用檸檬酸(10%,2x30mL)和碳酸氫鈉(sat,30mL)洗滌。除去溶劑并在硅膠柱上分離產(chǎn)物，得到化合物9(220mg,45%)?；衔?0的制備將化合物9(200mg,0.28mmol)溶于分鐘。-使該混合物蒸發(fā)，用丙酮，乙腈和85mg(77Q/o)化合物10。化合物11的制備0。C下，將氯甲酸乙酯(IIOmg,1.0mmol)加入到溶于THF(30mL)的Boc-纈氨酰-乳酸(290mg,1.0mmol)和三乙胺(200mg,2.0mmol)的溶液中，并攪拌該混合物3小時(shí)。使溫度達(dá)到室溫。過(guò)濾該混合物并將濾液加入到化合物3(300mg,0.58mmol)和固AP(244mg，2.0mmol)溶于THF(20mL)的溶液中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物過(guò)夜，將乙酸乙酯(100mL)加入到混合物中，并用檸檬酸(IO%,2x30mL)和碳酸氬鈉(sat,30mL)洗滌。除去溶劑并在硅膠柱上分離產(chǎn)物，得到化合物11(250mg,38%)。化合物12的制備按照與化合物8相同的方式，從化合物11制備該化合物。化合物13的制備通過(guò)使用Boc-纈氨酰-乳酸作為起始物質(zhì)代替Boc-纈氨酸，按照與化合物4相同的方式，從化合物2制備該化合物?；衔?4的制備按照化合物10,從化合物13進(jìn)行合成。化合物15的制備將化合物1(1g,1.33mmol)溶于14mLofconc.HC1中并室溫?cái)嚢柙摶旌衔?分鐘，然后蒸發(fā)。用丙酮洗滌殘余物并過(guò)濾，得到334mg(90%)化合物15。3mLcone.HC1并室溫?fù)璋瓒颐严礈觳⒄婵崭稍?，得到化合?6的制備0。C下，將三乙胺(0.487g,4.82mmol)和氯甲酸乙酯(0.30g,2.77mmol)加入到Boc-纈氨酸-乳酸(0.77g,2.65mmol)溶于THF(30mL)的溶液中。相同溫度下攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)，然后過(guò)濾到化合物15(0.334g,1.20mmol)和DMAP(0.74g,6.0mmol)溶于THF(30mL)和DMF(30mL)的溶液中。室溫?cái)嚢柙摶旌衔镞^(guò)夜。將EtOAc加入到該混合物中，用2%檸檬酸洗滌三次并用sat.NaHC03洗滌一次。在Na2S04上干燥有機(jī)層，過(guò)濾并蒸發(fā)。通過(guò)閃爍色譜，使用溶于CH2Ch的2-5y。MeOH作為洗脫劑純化粗產(chǎn)物，僅得到65mg(8y。)化合物16。方案317<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>化合物17的制備按照化合物8所述，從化合物16進(jìn)行合成?；衔?8的制備0°C下，將戊酰氯(460mg,3.8mmol)加入到溶于THF(50mL)的戊酸(390mg,3.8mmol)和三乙胺(770mg,7.6mmol)的溶液中，并攪拌該混合物3小時(shí)，然后過(guò)濾。將濾液加入到化合物3(1.3g,2.53mmol)和DMAP(930mg,7.6mmol)溶于THF(50mL)的溶液中。室溫下攪拌該反應(yīng)混合物過(guò)夜。將檸檬酸(10%,50mL)加入到該混合物中，并用乙酸乙酯萃取(2x50mL)。用檸檬酸(IO%,30mL),然后用碳酸鈉(50mL)和鹽水(50mL)洗滌混合有機(jī)層。干燥之后，除去有機(jī)溶劑并在硅膠柱上分離殘余物，得到化合物18(850mg,56%)?；衔?9的制備0。C下，將化合物18(850mg,1.42mmol)溶于曱醇(10mL)中并將conc.HCl(1.5mL)加入到該溶液中。攪拌反應(yīng)混合物0.5h。將碳酸鈉(50mL)加入到該混合物中并用二氯曱烷(3x50mL)萃取。除去溶劑并在石圭膠柱上分離產(chǎn)物，得到化合物19(230mg,50%)?；衔?0的制備按照化合物9所述，從化合物19進(jìn)行合成?；衔?1的制備按照化合物8所述，從化合物20進(jìn)^于合成?；衔?2的制備按照化合物18所述，從化合物19進(jìn)行合成。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>化合物23的制備將化合物2(1.02g,2.1mmol)和DMAP(1.05g,8.61mmol)溶于THF(35mL)中并冷卻至-78°C。15分鐘內(nèi)加入戊酰氯(6x42^L,2.14mmol)。在低度下攪拌該混合物2小時(shí)，然后在沒(méi)有冷卻浴的情況下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾倒在5%檸檬酸中，然后用EtOAc萃取。用鹽水洗滌混合有機(jī)層，在Na2S04上干燥并蒸發(fā)，得到白色固體，使用溶于CH2Cl2中的0-6%MeoH作為洗脫劑，在硅膠柱上純化，得到0.31g(25%)化合物23。化合物24的制備將化合物23(0.35g,0.58mmol)溶于THF(20mL)中，加入1MTBAF溶于THF(0.58mL，0.58mmol)的溶液，并室溫?cái)嚢柙摶旌衔?0分鐘。蒸發(fā)溶劑并通過(guò)閃爍色譜，使用0-10%MeOH溶于CH2Cl2的溶液作為洗脫劑純化殘余物，得到166mg(92y。)化合物24。化合物25的制備按照化合物4所述，從化合物24進(jìn)行合成?；衔?6的制備按照化合物8所述，從化合物25進(jìn)行合成。實(shí)施例62'3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶從前藥的釋放確認(rèn)本發(fā)明前藥可完全轉(zhuǎn)化為活性的2，3，-二脫氧-3，-C-羥曱基胞嘧啶母化合物可通過(guò)監(jiān)測(cè)收集的人血漿，37C,用5uM前藥觀察母化合物的表觀來(lái)評(píng)價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例7前藥的生物可利用率通常將前藥在MQ級(jí)水中混合，3mg/ml并通過(guò)插管一式兩份口服給予大鼠。適宜劑量為5mg/kg。在適宜時(shí)間點(diǎn)采集血漿樣品，如t0,15&30分鐘，1,2,4和6小時(shí)。用質(zhì)譜測(cè)量血漿中的回收率(作為代謝物2',3，畫(huà)二脫氧畫(huà)3，醒C-羥甲基-fi畫(huà)D-eo^/2ropentofuranosyl胞嘧咬)，按照鈉力口合物m/z264(M+Na)+才企測(cè)。根據(jù)血漿濃度和時(shí)間將結(jié)果繪制成圖，且通常Cmax階數(shù)為3-5uM。按照常規(guī)方式計(jì)算絕對(duì)生物可利用率。/。F，即如W097/30051所示，參考母化合物體外給藥的清除率。因?yàn)榇笫笪幢籋IV感染，因此這種口服制劑的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性不能直接測(cè)量，但注意到在人H9細(xì)胞中，代謝物2',3，-二脫氧，3'-C-羥曱基-fi-D-eo^/zropento-furanosyl胞嘧咬的ED50通常約為0.01uM。這依次意味著使用這些前藥所見(jiàn)到的峰值血漿濃度階數(shù)是ED5o的幾百倍。其它藥物參數(shù)如AUC和清除率通常與使用QD或BID給藥獲得的超過(guò)ED5Q的24小時(shí)谷水平一致。文中引證的各篇專利和科學(xué)文獻(xiàn)在下面列出并整體引入此處作為參考。參者文獻(xiàn)BrigitteMontesandMichelSegondy(2002)PrevalenceofthemutationalpatternE44D/Aand/orVI181inthereversetranscriptase(RT)geneofHIV-1inrelationtotreatmentwithnucleosideanalogueRTinhibitors.JMedVirol.66(3):299畫(huà)303.BoyerPL,ImamichiT,SarafianosSG,ArnoldE,HughesSH(2004)EffectsoftheDelta67complexofmutationsinhumanimmunodeficiencyvirustype1reversetranscriptaseonnucleosideanalogexcision.JVirol.78(18):9987-9997.BoyerPL，SarafianosSG,ArnoldE,HughesSH(2002)Nucleosideanalogresistancecausedbyinsertionsinthefingersofhumanimmunodeficiencyvirustype1reversetranscriptaseinvolvesATP-med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-3'-C-羥曱基胞嘧啶。28.—種治療HIV患者的方法，其中HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少一個(gè)引物拯救突變，其通過(guò)ATP-或焦磷酸鹽-介導(dǎo)的切除將強(qiáng)制性鏈終止核苷或核苷酸磷酸酯從新生DNA鏈除去，該方法包括給予患者有效量的2，,3，-二脫氧-3'-羥甲基胞嘧啶或其在體內(nèi)釋放2',3，-二脫氧-3，-C-羥甲基胞嘧啶或其5'-—磷酸鹽的前藥或其鹽。29.—種抑制HIV引物拯救突變體出現(xiàn)或繁殖的方法，所述突變體能夠除去除去摻入到HIV引物/模板復(fù)合物中的鏈-終止NRTI核苷酸，其中該除去通過(guò)ATP-依賴的或焦磷酸鹽依賴的切除機(jī)理進(jìn)行，該方法包括同時(shí)或順序給予感染了HIV的個(gè)體有效量的2，,3，-二脫氧-3'-羥曱基胞嘧啶或其在體內(nèi)釋放2'，3'-二脫氧-3'-C-羥曱基胞嘧啶或其5'-—磷酸鹽的前藥或其鹽，以及至少一種誘導(dǎo)引物拯救突變體的鏈終止劑NRTI。30.2，,3，-二脫氧-3，-羥曱基胞嘧啶或其在體內(nèi)釋放2，,3，-二脫氧-3，-0羥甲基胞嘧啶或其5'-—磷酸鹽的前藥;或其鹽在治療HIV感染中的應(yīng)用，其中HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少一個(gè)突變，其通過(guò)ATP-或焦-舞酸鹽-介導(dǎo)的切除將強(qiáng)制性鏈終止核苷-或核苷酸磷酸酯被從新生DNA《連中切除。31.同時(shí)或順序給予下述活性成分，用于抑制HIV突變體在感染了HIV的個(gè)體中出現(xiàn)或繁殖，所述的作為活性成分為2',3，-二脫氧-3，-C-羥甲基胞嘧啶或其在體內(nèi)釋放2',3'-二脫氧-3，-C-羥甲基胞嘧啶或其5，-一磷酸鹽的前藥，或其鹽以及至少一種鏈終止劑NRTI,其中所述突變體能夠除去摻入到HIV引物/模板復(fù)合物中的鏈-終止NRTI核苦酸，該除去通過(guò)ATP-依賴的或焦磷酸鹽依賴的切除機(jī)理進(jìn)行。全文摘要特別提供2’，3’-二脫氧-3’-羥甲基胞嘧啶或其前藥或鹽在制備治療HIV感染的藥物中的用途，其中HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少一個(gè)突變，其通過(guò)ATP-或焦磷酸鹽-介導(dǎo)的切除將強(qiáng)制性鏈終止核苷或核苷酸磷酸酯從新生DNA鏈中切除。文檔編號(hào)A61P31/18GK101132795SQ200580048871公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2005年12月28日優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日發(fā)明者周曉雄,泓張申請(qǐng)人:梅迪弗股份公司