專利名稱：：與α-羥酸的聚合物連接的透明質酸的制作方法與(X-羥酸的聚合物連接的透明質酸發(fā)明領域本發(fā)明涉及包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品，其中已將所述透明質酸與a-羥酸的聚合物部分或全部連接或交聯(lián)。本發(fā)明還涉及該產(chǎn)品的制備、本發(fā)明所述產(chǎn)品在以下領域中的用途用于制備衛(wèi)生和外科物品的生物可降解塑性材料領域，制藥和化妝品領域；包括在這些領域中用所述產(chǎn)品制備的多種物品。背景人體最豐富的雜多糖是糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。糖胺聚糖是無支鏈的糖聚合物，由重復的二糖單元組成(僅硫酸角質素在糖的核心區(qū)是分支的)。所述二糖單元通常包含兩種修飾的糖一N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之一，作為第一糖單元。另一單元通常是糖醛酸，例如葡糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖醛酸(iduronate)。糖胺聚糖是負電分子，并且在溶液中(insolution)具有賦予高粘性的延伸構象。糖胺聚糖主要位于細胞表面上或胞外基質中。糖胺聚糖在溶液中還具有^^壓縮性，并因此是理想的生理潤滑液體，例如關節(jié)(joint)。糖胺聚糖的剛性為細胞提供結構的整體性并且提供細胞之間允許細胞遷移的通道。具有最高生理重要性的糖胺聚糖是乙酰透明質酸(hyaluronan)、碌b酸軟骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和硫酸角質素。多數(shù)糖胺聚糖通過特異的寡糖結構共價結合至蛋白聚糖核心蛋白。乙酰透明質酸與某些蛋白聚糖形成大聚集體(largeaggregate),但例外是游離糖鏈與蛋白聚糖形成非共價復合體。已鑒定乙酰透明質酸在人體中的許多功能(參見，LaurentT.C.andFraserJ.R.E.,1992，F(xiàn)ASEBJ.6:2397-2404;和TooleB.R,1991,"Proteoglycansandhyaluronaninmorphogenesisanddifferentiation."In:CellBiologyoftheExtracellularMatrix,pp.305-341,HayE.D.,ed.,Plenum,NewYork)。乙酰透明質酸存在于透明軟骨、滑膜關節(jié)液(synovialjointfluid)以及真皮和表皮皮膚組織中。還猜測乙酰透明質酸在許多生理功能中具有作用，例如粘附、發(fā)育、細胞運動性、癌、血管發(fā)生和愈傷。由于乙酰透明質酸獨特的物理和生物特性，將其使用在眼和關節(jié)外科中，并且正在其它醫(yī)學方法中對其進^S平估。術語"透明質酸"用于文獻中的意思是具有不同分子量的酸性多糖，其由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的殘基構成，其天然存在于細胞表面、脊推動物結締組織的基本胞外物質、關節(jié)的滑液、目艮內球液(endobulbarfluid)、人臍帶組織和雞冠(cocks，comb)中。術語"透明質酸，，事實上通常用來指具有不同分子量的帶有交替D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺殘基的全系列多糖，或甚至其降解的級分，并且因此看上去使用復數(shù)術語"透明質酸，，更加正確。然而該單數(shù)術語將仍然用在本說明書中；另夕卜，將頻繁地使用縮寫"HA(hyaluronicacid;透明質酸)"以代替此集合術語。HA在生物體中扮演重要的角色，作為許多組織的細胞的機械支持，例如皮膚、腱、肌肉和軟骨，其是胞間基質的主要成分。HA在生物過程中同樣扮演重要的角色，例如組織的潤濕和潤滑作用。HA可從上述天然組織中提取，盡管現(xiàn)今優(yōu)選通過微生物方法制備HA以最小化傳遞傳染劑(infectiousagent)的潛在風險，并且提高產(chǎn)品的均勻性、質量和可用性(WO03/0175902,Novozymes)。已將HA和它不同分子大小的級分和它們各自的鹽用作藥物，特別在治療關節(jié)病方面；作為天然器官和組織的輔助和/或替代物，特別在眼科學和整容手術方面；以及作為化妝品制劑中的試劑(agent)。也已開發(fā)乙酰透明質酸的產(chǎn)品用于整形外科學(orthopaedics)、風濕病學(rheumatology)和皮膚病學(dermatology)。HA還可用作用于衛(wèi)生和外科物品的多種聚合材料，例如聚氨酯、聚酯等的添加劑，其具有使這些材料生物相容的效果。通過將HA與多官能環(huán)氧化合物交聯(lián)來制備交聯(lián)的HA或其鹽，其制備公開于EP0161887Bl。US4,957,744中公開了HA與酯族醇的全部或部分交聯(lián)的酯，以及這些偏酯與無機或有機堿的鹽。US6673919B2(ChissoCorp.pub.Date06/01/2004)涉及通過O-乙?；饔?、烷氧化作用或將由透明質酸或其鹽和陽離子化合物的溶液組成的復合物交聯(lián)來化學修飾透明質酸或其鹽的方法。FR2707653(Vetoquinol)涉及生物相容的并且生物可降解的聚合物和分子，特別是含有活動的氫原子的生物活性分子之間的接合物；它的制備方法；和包含這種接合物的藥用組合物。本發(fā)明涉及關于透明質酸(HA)的化學接枝技術(chemicalgraftingtechnology),其使用由a-羥酸的重復單位構成的寡聚體和合成聚合物，例如聚(乳酸)，也稱作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立體共聚物(stereocopolymer)和共聚物，特別那些與乙醇酸的共聚物，以及與其它的共聚物，例如與經(jīng)由s-己內酯的羥基己酸、葡糖酸和化學^f，務飾的葡糖酸、蘋果酸的共聚物，與低分子量片段的共聚物，其能夠產(chǎn)生降解副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物是水溶性的并且能夠通過腎臟過濾消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它們在鏈末端具有一或兩個羧基，并且在一元酸的情況下它們提供疏水性。重要的是，所述方法學能夠用于通過接枝或交聯(lián)使HA衍生化，并且能夠將產(chǎn)品用于技術、生物醫(yī)學和藥用的應用。接枝的HA是生物可降解的、生物相容的和生物可再吸收的(bioresorbable)。發(fā)明概述用聚a-羥酸，例如乳酸或乙醇酸的寡聚體使HA衍生化，用于制備接枝的HA結構，其比HA本身更疏水。所得兩親性質在化妝品應用例如乳劑穩(wěn)定作用、皮膚保濕和緊致，以及膜形成中是理想的。來自這些接枝材料的水凝膠或納米化的膠態(tài)分散體也能夠用于組織增加、防止粘附、骨關節(jié)炎和眼科學。僅生物相容的代謝物將在接枝材料的生物降解后釋放。降解副產(chǎn)物，例如乳酸或乙醇酸，通過人體代謝并且完全消除，因而j吏接枝產(chǎn)品成為在人體內完全是生物可再吸收的。乳酸廣泛用于化妝品配方中，而聚(乳酸)(PLA)廣泛用于組織工程的生物醫(yī)學應用中，并且還用于藥物遞送的藥用應用，例如，使用PLA孩i球體和納米粒子。將聚(乳酸)(?；?acidchloride)形式)接枝到HA(四(正-丁基)銨或十六烷基三曱基銨鹽形式)。所得產(chǎn)品作為凝膠或納米化的膠態(tài)分散體獲得，并且通過對EDTA鈉或磷酸鹽緩沖液-DMSO，以及隨后對水和乙醇的透析來純化，任何將去除銨離子的透析體系均可能是有效的。冷凍干燥PLA-衍生化的HA產(chǎn)生海綿狀物(sponge)。PLA-HA不溶于水(盡管微團(micelles)的形成可能發(fā)生)。然而，其溶于1:1DMSO-水混合物。本發(fā)明第一個方面涉及包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品，其中所述透明質酸或其鹽部分或全部與a-羥酸的聚合物連接或交聯(lián)，所述a-羥酸的聚合物優(yōu)選聚(乳酸)，也稱作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立體共聚物和共聚物，特別那些與乙醇酸的共聚物，以及與其它的共聚物，例如與經(jīng)由e-己內酯的羥基己酸、葡糖酸和化學修飾的葡糖酸、蘋果酸的共聚物，與低分子量片段的共聚物，其能夠產(chǎn)生降解副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物是水溶性的并且能夠通過腎臟過濾消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它們在鏈末端具有一或兩個齊復基，并且在一元酸的情況下它們提供疏水性。第二方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含第一個方面中所限定的產(chǎn)品，和活性組分，優(yōu)選所述活性組分是藥理學活性劑。本發(fā)明的第三方面涉及藥用組合物，其包含有效量的第一個方面中所限定的產(chǎn)品，和可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。第四方面涉及藥用組合物，其包含有效量的第一個方面中所限定的產(chǎn)品作為媒介物，和藥理學活性劑。第五方面涉及化妝品，其包含有效量的第一個方面中所限定的產(chǎn)品作為活性組分。第六方面，本發(fā)明涉及衛(wèi)生、醫(yī)學或外科物品，其包含第一個方面中所限定的產(chǎn)品，優(yōu)選所述物品是外科海綿(surgicalsponge)、愈傷海綿(woundhealingsponge)或包含于急救繃帶(bandaid)或其它創(chuàng)傷敷裹材料中的部分。重要的方面涉及藥物膠嚢或微膠嚢(microcapsule)，其包含.第一個方面中所限定的產(chǎn)品。本發(fā)明另一個重要的方面涉及產(chǎn)生包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品的方法，其中所述透明質酸或其鹽部分或全部與a-羥酸的聚合物連接或交聯(lián)，該a-羥酸的聚合物優(yōu)選聚(乳酸)，也稱作聚交酯(polylactide)，和任何基于乳酸的聚合物、立體共聚物和共聚物，特別那些與乙醇酸、聚乙醇酸的共聚物，以及與其它的共聚物，例如與經(jīng)由e-己內酯(s-caprolactone)的羥基己酸、葡糖酸和化學修飾的葡糖酸、蘋果酸的共聚物，與低分子量片段的共聚物，其能夠產(chǎn)生降解副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物是水溶性的并且能夠通過腎臟過濾消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它們在鏈末端具有一或兩個羧基，并且在一元酸的情況下它們提供疏水性，所述方法包括以下步驟a)將透明質酸或其鹽與a-羥酸聚合物的單酰氯或二酰氯在有機溶劑中，優(yōu)選DMSO中反應。本發(fā)明最后的方面涉及方法，其為在眼科學中、在治療骨關節(jié)炎或癌癥中執(zhí)行程序(performingprocedure)的方法，處理創(chuàng)傷的方法，將藥理學活性劑皮月夫施用或透皮施用(dermalortransdermaladministration)于哺乳動物的方法,或皮膚施用化妝品的方法，改進，其包含^f吏用第一個方面中所限定的產(chǎn)品或第二、三或四的任何方面所限定的組合物。許多方面涉及第一個方面中所限定的產(chǎn)品或任何前述方面所限定的組合物的用途，其用于制備治療骨關節(jié)炎、癌癥的藥物，制備用于眼科治療的藥物,制備用于創(chuàng)傷處理的藥物，制備用于血管發(fā)生的藥物或制備保濕劑(moisturizer)。定義核酸構建體"核酸構建體，，在本文定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其從天然存在的基因分離，或將其修飾以含有核酸的片段，該片段以不存在于自然界的方式組合和并置(juxtapose)。當術語核酸構建體含有表達編碼序列所需的所有調控序列時，術語核酸構建體可與術語表達盒同義。術語"編碼序列"在本文中定義為，當將其置于下面提到的調控序列的控制之下時，轉錄成mRNA并且翻譯成目標酶(enzymeofinterest)的序列。編碼序列的邊界通常由核糖體結合位點和轉錄終止子序列決定，所述核糖體結合位點恰位于mRNA5'端開讀框的上游，而所述轉錄終止子序列恰位于mRNA3，端開讀框的下游。編碼序列能夠包括，-(旦不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術是本領域中公知的并且包括，舉例來i兌，從基因組DNA分離，從cDNA制備，或它們的組合。例如，能夠通過如下方法實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆核酸序列使用抗體篩選表達文庫以探測具有共享結構特征的克隆DNA片段或/>知的聚合酶鏈式反應(PCR)。參見，例如，Innisetal.,19卯，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢?吏用其它核酸擴增方法例如連才妻酶鏈式反應、連接活化轉錄和基于核酸序列的擴增?？寺》椒缮婕扒谐头蛛x所需的包含編碼多肽的核酸序列的核酸片段，將片段插入到載體分子中，和將該重組載體并入芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞中，其中所述核酸序列的克隆將被復制。所述核酸序列可以是基因組的、cDNA的、RNA的、半合成的、合成的來源，或它們的任意組合。分離的編碼酶的核酸序列可以按多種方式操作以提供酶的表達。將核酸序列插入構建體或載體之前對核酸序列進行操作是理想的或必要的，這取決于表達載體或芽孢桿菌屬(S"C/〃M)宿主細胞。使用克隆方法修飾核酸序列的技術是本領域中公知的。需理解的是還可使用本領域內公知的方法在宿主細胞體內操作該核酸序列。許多酶涉及透明質酸的生物合成。這些酶包括乙酰透明質酸合酶(hyaluronansynthase)、UDP-葡糖-6-脫氫酶、UDP-葡糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、葡糖-6-磷酸異構酶、己糖激酶、葡糖磷酸變位酶、酰胺轉移酶、變位酶和乙酰轉移酶。乙酰透明質酸合酶是透明質酸生產(chǎn)中的關鍵酶。"乙酰透明質酸合酶"在本文中定義為通過添加GlcUA和GlcNAc糖前體催化乙酰透明質酸鏈的延伸的合酶。鏈球菌乙酰透明質酸合酶、脊推動物乙酰透明質酸合酶和病毒乙酰透明質酸合酶的氨基酸序列與巴斯德氏菌屬(Pasteurella)乙酰透明質酸合酶截然不同，并且已提議將其分類為I組和II組乙酰透明質酸合酶，I組乙酰透明質酸合酶包括鏈球菌乙酰透明質酸合酶(DeAngelis,1999)。為了在芽孢桿菌屬宿主細胞中產(chǎn)生乙酰透明質酸，真核來源的乙酰透明質酸合酶，例如哺乳動物乙酰透明質酸合酶是較不優(yōu)選的。乙酰透明質酸合酶編碼序列可以是任何能夠在芽孢桿菌屬宿主細胞中表達的核酸序列。所述核酸序列可以是任何來源的。優(yōu)選的乙酰透明質酸合酶基因包括I組或II組中的任何基因，例如來自似馬鏈球菌(6^e/tococc^e《w/67Vm'&)、酉良腺鏈3求菌(&re/tococci^/;voge"e力、乳房纟逸5泉菌(S^eptococcusw6en's)和馬鏈王求菌獸瘋亞種(Sfreptococcz^e《w/swfep.zooep/dew/cz^s)的I組乙酰透明質酸合酶基因，或多殺巴斯德氏菌(尸os/ww^3mM/tocWa)的II組乙酰透明質酸合酶基因。通過構建體將乙酰透明質酸的前體糖供應于宿主細胞，該構建體優(yōu)選地將本發(fā)明的HA產(chǎn)生至培養(yǎng)基中，或通過由內源基因或非內源基因或內源或非內源基因的組合編碼將本發(fā)明的HA產(chǎn)生至芽孢桿菌屬宿主細胞中。所述前體糖可以是D-葡糖醛酸或N-乙酰-葡糖胺。在本發(fā)明的方法中，核酸構建體可以還包含一個或多個編碼乙酰透明質酸前體糖生物合成中的酶的基因?；蛘?，芽孢桿菌屬宿主細胞可以還包含一個或多個另一種核酸構建體，其包含一個或多個編碼前體糖生物合成中的酶的基因。乙酰透明質酸生產(chǎn)通過使用帶有編碼一個或多個基因的一個或多個核酸序列來改進，所述基因指導乙酰透明質酸前體糖合成途徑中的步驟。"指導乙酰透明質酸前體糖合成途徑中的步驟"的意思是該基因表達的蛋白在N-乙酰-葡糖胺或D-葡糖醛酸，或N-乙酰-葡糖胺和D-葡糖醛酸中任一個的前體糖的形成中是活性的。在提供前體糖的優(yōu)選方法中，通過培養(yǎng)具有重組構建體的宿主細胞來提供構建體用于改進具有乙酰透明質酸合酶的宿主細胞中的乙酰透明質酸生產(chǎn)，該重組構建體具有異源啟動子區(qū)，其與編碼基因的核酸序列可操作連接，所述基因指導乙酰透明質酸前體糖的合成途徑中的步驟。在優(yōu)選方法中，宿主細胞還包含重組構建體，其具有與乙酰透明質酸合酶可操作地連接的啟動子區(qū)，所述構建體可使用與涉及N-乙酰-葡糖胺生物合成的合酶的核酸序列相同或不同的啟動子區(qū)。在另一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞可以具有帶有啟動子區(qū)的重組構建體，所述啟動子區(qū)與編碼另一種基因的不同核酸序列可操作連接，所述另一種基因涉及乙酰透明質酸前體糖的合成。因此，本發(fā)明還涉及用于改進乙酰透明質酸產(chǎn)生的構建體，通過使用具有編碼基因的核酸序列的構建體，所述基因指導乙酰透明質酸前體糖的合成途徑中的步驟?？捎膳c編碼乙酰透明質酸合酶的核酸序列相同或不同的啟動子表達有關前體糖的核酸序列。用于產(chǎn)生透明質酸的前體糖的生物合成中涉及的基因包括UDP-葡糖-6-脫氫酶基因、UDP-葡糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因、葡糖-6-磷酸異構酶基因、己糖激酶基因、葡糖磷酸變位酶基因、酰胺轉移酶基因、變位酶基因和乙酰轉移酶基因。在含有乙酰透明質酸合酶的細胞中，可表達hasB、hasC和hasD中任何一種或兩種或多種的組合，或它們的同源物(homolog),分別如枯草芽孢桿菌(5ac///ustuaD、gtaB和gcaD,以及hasE，以增加可用于乙酰透明質酸合酶的前體糖的庫(pool)?？莶菅挎邨U菌基因組在Kunst,etal.,Nature390,249-256,"ThecompletegenomesequenceoftheGram-positivebacteriumBacillussubtilis"(1997年11月20日)中有所描述。在一些情況下，例如宿主細胞不具有天然的乙酰透明質酸合酶活性時，構建體可以包括hasA基因。編碼生物合成酶的核酸序列對于宿主細胞可以是天然的，而在其它情況下，可以使用異源序列。如果表達兩種或兩種以上基因，它們可以是在天然操縱子中彼此相連的基因，例如似馬鏈球菌HAS操縱子的基因，其包含hasA、hasB、hasC和hasD。在其它情況下，使用前體基因序列的一些組合可為理想的，而不包括操縱子的每個元件。使用天然存在于宿主細胞的一些基因和其它外源基因在其它情況下也可以是優(yōu)選的。該選擇將取決于所給出的宿主細胞中糖的可用庫，細胞調節(jié)過量產(chǎn)生而不干擾宿主細胞其它功能的能力，和舉例來說，取決于細胞的代謝需要和生長條件，以及可用的前體糖庫，理想的是通過如下方法增加N-乙酰-葡糖胺的產(chǎn)生表達編碼UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的核S殳序列，例如hasD基因、芽孢桿菌屬gcaD基因和它們的同源物?；蛘撸绑w糖可以是D-葡糖醛酸。在一個這樣的實施方案中，核酸序列編碼UDP-葡糖-6-脫氫酶。這些核酸序列包括芽孢桿菌屬tuaD基因、鏈球菌屬(5^eptococcw力的hasB基因和它們的同源物。所述核酸序列還可以編碼UDP-葡糖焦磷酸化酶，例如在芽孢桿菌屬中的gtaB基因、鏈球菌屬的hasC基因和它們的同源物。在本發(fā)明的方法中，UDP-葡糖-6-脫氫酶基因可以是hasB基因或tuaD基因；或它們的同源物。在本發(fā)明中，預想乙酰透明質酸合酶基因和編碼前體糖的一個或多個基因在相同啟動子的控制下?；蛘撸幋a前體糖的一個或多個基因在相同啟動子的控制下，但不同的啟動子驅動乙酰透明質酸合酶基因。其它替換方案是乙酰透明質酉吏合酶基因和每個編碼前體糖的基因在不同啟動子的控制下。在優(yōu)選的實施方案中，乙酰透明質酸合酶基因和編碼前體糖的一個或多個基因在相同啟動子的控制下。本發(fā)明還涉及核酸構建體，其包含分離的編碼乙酰透明質酸合酶操縱子的核酸序列，所述操縱子包含乙酰透明質酸合酶基因和UDP-葡糖-6-脫氫酶基因，和任選的一種或多種選自下組的基因UDP-葡糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因和葡糖-6-磷酸異構酶基因。在某些情況下，宿主細胞將具有帶有異源啟動子區(qū)的重組構建體，所述異源啟動子區(qū)可操作地與編碼基因的核酸序列連接，所述基因指導乙酰透明質酸前體糖合成途徑中的步驟，其可與重組構建體的乙酰透明質酸合酶的表達相協(xié)調(inconcertw池)。乙酰透明質酸合酶可由與編碼涉及前體生物合成的酶的核酸序列相同或不同的啟動子區(qū)表達。在另一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞可具有帶有啟動子區(qū)的重組構建體，該啟動子區(qū)與不同的核酸序列可操作的連接，所述核酸序列編碼涉及乙酰透明質酸前體糖合成的另一個基因。編碼涉及前體糖生物合成的酶的核酸序列可由與編碼乙酰透明質酸合酶的核酸序列相同或不同的啟動子表達。在之前的含義中，構建"人工操縱子"，其可模仿似馬鏈球菌操縱子而具有每個hasA、hasB、hasC和hasD或其同源物，或者，可以使用少于似馬鏈球菌操縱子中存在的全補體(fullcomplement)。人工操縱子還可以包含葡糖-6-磷酸異構酶基因(hasE)以及一個或多個選自下組的基因己糖激酶基因、葡糖磷酸變位酶基因、酰胺轉移酶基因、變位酶基因和乙酰轉移酶基因。在人工操縱子中，元件中的至少一個與元件中的另一個是異源的，例如啟動子區(qū)與編碼序列是異源的。在優(yōu)選實施方案中，核酸構建體包含hasA、tuaD和gtaB。在另外的優(yōu)選實施方案中，核酸構建體包含hasA、tuaD、gtaB和gcaD。在另外的優(yōu)選實施方案中，核酸構建體包含hasA和tuaD。在另外的優(yōu)選實施方案中，核酸構建體包含hasA。在另外的優(yōu)選實施方案中，核酸構建體包含hasA、tuaD、gtaB、gcaD和hasE。在另外的優(yōu)選實施方案中，核酸構建體包含hasA、hasB、hasC和hasD。在另外的優(yōu)選實施方案中，核酸構建體包含hasA、hasB、hasC、hasD和hasE。基于以上優(yōu)選實施方案，所提到的基因能夠用其同源物取代。在本發(fā)明所述方法中，核酸構建體包含與啟動子序列可操作連接的乙酰透明質酸合酶編碼序列，該啟動子序列對于乙酰透明質酸合酶編碼序列是外源的。所述啟動子序列可以是，例如，單一啟動子或串聯(lián)啟動子。"啟動子"在本文定義為參與結合RNA聚合酶以開始基因轉錄的核S交序列。"串聯(lián)啟動子"在本文定義為兩個或多個啟動子序列，每個均與編碼序列可操作連接并介導將編碼序列轉錄為mRNA。"可操作連接"在本文定義為這樣的結構，其中將調控序列，例如啟動子序列適當?shù)刂糜谂c編碼序列相關的位置，以使該調控序列指導由編碼序列編碼的多肽的產(chǎn)生。如較早所提到的，"編碼序列"在本文定義為當將其置于適當?shù)恼{控序列控制下時，其轉錄為mRNA并翻譯成多肽的核酸序列。編碼序列的邊界通常由核糖體結合位點和轉錄終止子序列決定，所述核糖體結合位點恰位于該mRNA5'端開讀框的上游，而所述轉錄終止子序列恰位于該mRNA3，端開讀框的下游。編碼序列能夠包括，但不限于，基因組DNA、cDNA、半合成的、合成的和重組的核酸序列。在優(yōu)選實施方案中，啟動子序列可以從細菌來源獲得。在更加優(yōu)選的實施方案中，啟動子序列可以從革蘭氏陽性細菌獲得，例如芽孢桿菌屬菌抹，例^口,5ac/〃wflgarfl(i/2erem1、p耆石威芽孑包4干菌(Bac/〃t^a/Aw/o_p/2z7i)、解5定4分芽孑包^f菌(S"c/〃wfl附y(tǒng)/o/z々wey^rc/e/w)、^豆芽孑包^干菌(萬ac/〃w厶wv/力、環(huán)^)犬芽孑包才干菌(5ac/〃wc,rcw/am1)、Sac/〃wsc/aww'/、7疑纟吉芽孑包牙干菌(S"c/〃附co"gt^3w)、堅強芽孢桿菌OBac/〃wy^ww)、杣爛芽孢桿菌("ac/〃w/awm》、遲緩芽孢桿菌(_6acW/ws/ewfw力、i也衣芽孑包4干菌(Bac/〃us1//c/zemybrmz's)、巨大芽孑包^干菌(5ac〃/wswegv^en'wm)、4豆小芽孑包4干菌(jB(3"7/mspwmz7w力、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(5ac〃/w^Wearo&ermop/n'/iw)、沐古草芽孑包4干菌或蘇云金芽孑包才干菌(^Sac〃/w/7mn'wg7'em7'力；或鏈霉菌屬菌抹，例如，淺青紫鏈霉菌(5^eptow，es//v/^"力或灰鼠鏈霉菌(5^ej9tow少c^附wh"w力；或,人革蘭氏陰性菌獲3尋，例如，大腸坤干菌(五.co/z')或fl單月包菌屬菌種CP5^wc/omcww用于指導本發(fā)明所述方法中核酸序列轉錄的合適啟動子的實例是從以下獲得的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌(5^eptomyc"coe/z'co/or)瓊脂糖酶基因(dagA)、遲緩芽孢桿菌或Bacz7/w堿性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌ot-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xy舊基因、蘇云金芽孢桿菌te"Anbmi亞種CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，原核卩-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroffetal.,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)。其它實例是spol噬菌體啟動子的啟動子和tac啟動子(DeBoeretal.,1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"inScientificAmerican,1980,242:74-94中；和在Sambrook,Fritsch,andManiatus;1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual:2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork中有所描述。啟動子還可以是"共有，，啟動子，其具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的TATAAT。共有啟動子可以從能夠在芽孢桿菌屬宿主細菌中發(fā)揮功能的任何啟動子獲得?？梢酝ㄟ^定位誘變完成"共有，，啟動子的構建以創(chuàng)造啟動子，該啟動子更加完美地符合枯草芽孢桿菌營養(yǎng)型(vegetative)"cjA型"啟動子"-io"和"-35"區(qū)的已確定的共有序列(Voskuiletal.,1995,MolecularMicrobiology17:271-279)。在優(yōu)選實施方案中，"共有"啟動子從得自以下的啟動子獲得大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、6ac!7/wsc/咖s"或遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xy舊基因、蘇云金芽孢桿菌fe"A〃'om;亞種CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，或原核卩-內酰胺酶基因spol細菌的噬菌體啟動子。在更優(yōu)選的實施方案中，"共有"啟動子從解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyQ)獲得。Widner，等在美國專利編號6,255,076和5,955,310中描述串聯(lián)啟動子和構建體以及用于在芽孢桿菌屬細胞中表達的方法，包括短的共有amyQ啟動子(也稱作scBAN)。其中還描述了cryIIIA穩(wěn)定子序列的用途，以及使用該序列的構建體，其用于改進在芽孢桿菌屬中的產(chǎn)生。串聯(lián)啟動子的每個啟動子序列可以是在所選芽孢桿菌屬細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可由編碼與該芽孢桿菌屬細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。每個啟動子序列對于編碼多肽的核酸序列可以是天然的或外源的，并且對于芽孢桿菌屬細胞可以是天然的或外源的。所述啟動子序列可以是相同的啟動子序列或不同的啟動子序列。串耳關啟動子的兩個或兩個以上啟動子序列可以同時啟動核酸序列的轉錄。或者，串聯(lián)啟動子的一個或多個啟動子序列可以在芽孢桿菌屬細胞的不同生長階段啟動核酸序列的轉錄。在優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因的amyQ啟動子。在另外的優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少"共有"啟動子，其具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的序列TATAAT。在另外的優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因的amyL啟動子。在另外的優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少cryIIIA啟動子或其部分(AgaisseandLereclus,1994,MolecularMicrobiology13:97-107》在更加優(yōu)選的實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少amyL啟動子和cryIIIA啟動子。在另外的更加優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少amyQ啟動子和cryIIIA啟動子。在另外的更加優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的序列TATAAT的"共有，，啟動子以及cryIIIA啟動子。在另外的更加優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的amyL啟動子。在另外的更加優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的amyQ啟動子。在另外的更加優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的"共有"啟動子，其具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的序列TATAAT。在另外的更加優(yōu)選實施方案中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的cryIIIA啟動子。"mRNA加工/穩(wěn)定序列"在本文定義為位于一個或多個啟動子序列下游和編碼序列上游的序列，該編碼序列與一個或多個啟動子序列中的每個可操作地連接，這樣可以將所有從每個啟動子序列合成的mRNA加工以產(chǎn)生mRNA轉錄物，在該轉錄物的5'端具有穩(wěn)定子(stablizer)序列。在mRNA轉錄物5'端的這種穩(wěn)定子序列的存在增加它們的半衰期(AgaisseandLereclus，1994,supra,Hueetal"1995，JournalofBacteriology177:3465-3471)。mRNA力口工/穩(wěn)定序列與細菌16S核糖體RNA的3，端互補。在優(yōu)選實施方案中，mRNA加工/穩(wěn)定序列產(chǎn)生基本上單一大小的轉錄物，在該轉錄物5'端具有穩(wěn)定序列。mRNA加工/穩(wěn)定序列優(yōu)選地是一種與細菌16S核糖體RNA的3，端互補的序列。參見，美國專利編號6,255,076和5,955,310。在更加優(yōu)選的實施方案中，mRNA加工/穩(wěn)定序列是蘇云金芽孢桿菌cryIIIAmRNA加工/穩(wěn)定序列，其公開于WO94/25612和AgaisseandLereclus,1994，同上，或其保留mRNA加工/穩(wěn)定功能的部分。在另外的更加優(yōu)選實施方案中，mRNA加工/穩(wěn)定序列是枯草芽孢桿菌SP82mRNA加工/穩(wěn)定序列，其公開于Hueetal.,1995，同上，或其保留mRNA加工/穩(wěn)定功能的部分。當將cryIIIA啟動子及其mRNA加工/穩(wěn)定序列用于本發(fā)明的方法中時，可以使用DNA片段，其含有公開于WO94/25612和AgaisseandLereclus,1994,同上，的序列或其保留啟動子和mRNA加工/穩(wěn)定功能的部分。此外，可以使用本領域公知的方法制備僅含有cryIIIA啟動子或僅含有cryIIIAmRNA加工/穩(wěn)定序列的DNA片段，以構建不同的串聯(lián)啟動子和mRNA加工/穩(wěn)定序列組合。在該實施方案中，cryIIIA啟動子及其mRNA加工/穩(wěn)定序列的上游。然后可將分離的核酸序列進一步進行操作以改進該核酸序列的表達，所述核酸序列編碼所需的涉及透明質酸產(chǎn)生的酶。可理解的是表達包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。使用克隆方法修飾核Sl序列的技術是本領域內公知的?？蓪幋a酶的核酸序列的核酸構建體與一個或多個調控序列可操作連接，該調控序列在與其相容的條件下能夠指導芽孢桿菌屬細胞中編碼序列的表達。術語"調控序列，，在本文中定義為包括對核酸序列的編碼序列表達是必需的或有利的所有成分。每種調控序列對于編碼酶的核酸序列可以是天然的或外源的。除了上述的啟動子序列之外，這些調控序列包括，但不限于，前導序列、信號序列和轉錄終止子。最少的情況下，調控序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯的停止信號。調控序列可以與接頭一起提供，所述接頭的目的是引入特異性限制位點，促進調控序列與編碼酶的核酸序列的編碼區(qū)的連接。調控序列還可以是合適的轉錄終止子序列，其是由芽孢桿菌屬細胞識別以終止轉錄的序列。終止子序列與編碼酶或操縱子最后的酶的核酸序列3'末端可操作連接。在所選芽孢桿菌屬細胞中有功能的任何終止子均可以在本發(fā)明中使用。調控序列還可以是合適的前導序列，其是mRNA非翻譯區(qū)，對于芽孢桿菌屬細胞的翻譯是重要的。前導序列與編碼酶的核目IL^列的5'末端可操作連接。在所選芽孢桿菌屬細胞中有功能的任何前導序列可以用于本發(fā)明中。調控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列，其能夠指導表達的多肽進入細胞的分泌途徑。信號肽編碼區(qū)對于多肽可以是天然的或可以得自外源。核酸序列編碼序列的5，端可以固有地(inherently)含有信號肽編碼區(qū)，其天然地在翻譯閱讀框之內與編碼所分泌多肽的編碼區(qū)片段連接?；蛘?，編碼序列的5，端可以含有信號肽編碼區(qū)，其對于編碼所分泌多肽的編碼序列部分是外源的。當編碼序列通常不含有信號肽編碼區(qū)時，所述外源信號肽編碼區(qū)可能是需要的。或者，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)，以獲得相對于通常與編碼序列連接的天然信號肽編碼區(qū)增強的多肽分泌。信號肽編碼區(qū)可以從芽孢桿菌屬菌種的淀粉酶或蛋白酶基因獲得。然而，能夠指導表達多肽進入所選芽孢桿菌屬細胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可以在本發(fā)明中使用。對于芽孢桿菌屬細胞有效的信號肽編碼區(qū)是獲得自以下基因的信號肽編碼區(qū)來自芽孢桿菌屬NCIB11837的產(chǎn)麥芽淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌p-內酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA基因。另夕卜的寸言號月太由SimonenandPalva，1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。調控序列還可以是前肽編碼區(qū)(propeptidecodingregion),其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽被認為是酶原(proenzyme)或多肽原(或在某些情況下是酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的，并且能夠通過催化或自催化切割來自該多肽原的前肽而轉化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)獲得。當信號肽和前肽區(qū)二者均存在于多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著多肽的氨基末端，而將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞生長調節(jié)多肽的表達。調節(jié)系統(tǒng)的實例是響應化學或物理刺激，包括調節(jié)化合物的存在而引起基因表達開啟或關閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp搡縱基因系統(tǒng)。生產(chǎn)在本發(fā)明的方法中，使用本領域已知的方法將宿主細胞培養(yǎng)在適于透明質酸產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如，可以通過在合適的培養(yǎng)基中以及允許涉及透明質酸合成的酶表達和透明質酸分離的條件下、在實驗室中或工業(yè)發(fā)酵罐中進行的搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。在包含碳源和氮源和無機鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領域已知的方法進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應商獲得，或可以根據(jù)已公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。分泌的透明質酸能夠直接從培養(yǎng)基中回收。所得透明質酸可以通過本領域已知的方法分離。例如，透明質酸可以從營養(yǎng)培養(yǎng)基中通過常規(guī)方法分離，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可以通過本領域已知的多種方法進一步純化分離的透明質酸，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和大小排組)、電泳方法(例如，制備等電聚焦)、差示溶解度(例如，石克酸4妄沉淀)或才是取(參見，例3口，ProteinPurification,J,C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。附1顯示本文所用不同化合物的結構式。圖2顯示聚(乳酸)和亞石克酰氯(thionylchloride)—起形成PLA酰氯的反應圖解。圖3顯示聚(乳酸)的IR光譜。圖4顯示透明質酸(質子形式)的IR光譜。圖5顯示實施例3的最終合成產(chǎn)品HA-PLA的IR光譜。圖6顯示實施例3的最終合成產(chǎn)品HA-PLA的13C光語。圖7顯示HA-TBA與PLA二酰氯形成HA-PLA-HA的反應圖解，如實施例4中所概述的。圖8顯示實施例4中乙醇洗滌的IR光錯，可能有HA-PLA-HA存在。圖9顯示實施例4中丙酮洗滌的IR光譜，可能有HA-PLA-HA存在。圖IO顯示實施例4中來自HA-CTA的終產(chǎn)品的IR光i普；HA-PLA-HA。圖11顯示實施例4中來自HA-CTB的終產(chǎn)品的IR光譜；HA-PLA-HA。圖12顯示實施例5中合成的HA-CTA的IR光譜。圖13顯示實施例6最終HA-PLA產(chǎn)品的5HNMR,該譜顯示殘余CTA的存在。圖14顯示在實施例7的透析之后，實施例6最終HA-PLA產(chǎn)品的'H畫R。發(fā)明詳述"透明質酸(hyaluronicacid)"在本文中定義為由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重復二糖單元組成的未硫酸化糖胺聚糖，其通過交替的J3_l，4和|3-1，3糖苷鍵連接到一起。透明質酸也稱作乙酰透明質酸(hyaluronan)、透明質酸鹽(hyaluronate)或HA。術語乙酰透明質酸和透明質酸在本文可以互換使用。雞冠是乙酰透明質酸重要的商業(yè)來源。微生物是可選的來源。美國專利No.4,801,539公開了用于制備透明質酸的發(fā)酵方法，其涉及獸瘟鏈球菌(5^eptococcuyzooepzWem/cw)菌抹，報道的產(chǎn)率是約3.6g透明質酸每升。歐洲專利No.EP0694616公開了使用改進的獸瘟鏈球菌菌抹的發(fā)酵方法，報道的產(chǎn)率是約3.5g透明質酸每升。如完整并入本文的WO03/054163(Novozymes)中所公開的，透明質酸或其鹽可以，例如在革蘭氏陽性芽孢桿菌屬宿主中重組地產(chǎn)生。已描述了乙酰透明質酸合酶來自于脊推動物、細菌病原體和藻病毒(DeAngdis，P.L,1999,Cell.Mol.LifeSd.56:670-682)。WO99/23227公開了來自似馬鏈球菌的I組透明質酸鹽合酶(hyaluronatesynthase)。WO99/51265和WO00/27437描述來自多殺巴斯德氏菌的II組透明質酸鹽合酶。Ferretti等公開了釀膿鏈球菌的乙酰透明質酸合酶操縱子，其由三個基因hasA、hasB和hasC組成，其分別編碼透明質酸鹽合酶、UDP葡糖脫氫酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98,4658-4663,2001)。WO99/51265描述具有似馬鏈球菌乙酰透明質酸合酶編碼區(qū)的核酸片段。由于重組芽孢桿菌屬細胞的乙酰透明質酸直接表達至培養(yǎng)基，可以使用筒單的方法從該培養(yǎng)基中分離乙酰透明質酸。首先，將芽孢桿菌屬細胞和細胞碎片從培養(yǎng)基中物理去除。如果需要，首先可將培養(yǎng)基稀釋以減少培養(yǎng)基的粘性。用于從培養(yǎng)基去除細胞的許多方法對于本領域那些技術人員是已知的，例如離心和微濾。如果需要，然后可將剩余的上清液，例如通過超濾來過濾以進行濃縮和從乙酰透明質酸去除小分子污染物。去除細胞和細胞碎片之后，通過已知機制從培養(yǎng)基簡單沉淀乙酰透明質酸。鹽、醇或鹽和醇的組合可以用于從濾液沉淀乙酰透明質酸。一旦變?yōu)槌恋砦?，能夠容易地將乙酰透明質酸通過物理方法從溶液中分離?？赏ㄟ^使用本領域已知的蒸發(fā)技術，例如冷凍干燥或噴霧干燥從濾液溶液干燥或濃縮乙酰透明質酸。本發(fā)明第一個方面涉及包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品，其中所述透明質酸或其鹽與a-羥酸聚合物部分或全部連接或交聯(lián)，所述a-羥酸聚合物優(yōu)選聚(乳酸)，也稱作聚交酯(polylactide),和任何基于乳酸的聚合物、立體共聚物和共聚物，特別是那些與乙醇酸的共聚物，以及與其它的共聚物，例如與經(jīng)由S-己內酯的羥基己酸(hydroxycaproicacid)、葡糖酸和化學+務飾的葡糖酸、蘋果酸的共聚物，與低分子量片段的共聚物，其能夠產(chǎn)生降解副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物是水溶性的并且能夠通過腎臟過濾消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它們在鏈末端具有一或兩個羧基，而且在一元酸的情況下它們提供疏水性。宿主細月包優(yōu)選實施方案涉及第一個方面的產(chǎn)品，其中所述透明質酸或其鹽是重組產(chǎn)生的，優(yōu)選通過革蘭氏陽性細菌或宿主細胞，更優(yōu)選通過芽孢桿菌屬細菌重組產(chǎn)生的。宿主細胞可以是適于重組產(chǎn)生透明質酸的任何芽孢桿菌屬細胞。芽孢桿菌屬宿主細胞可以是野生型芽孢桿菌屬細胞或其突變體。在本發(fā)明的實踐中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，Sac/〃w5flgaraAr/zem、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、i5a"7/wc/awW、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、)t山爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。特別適于重組表達的突變枯草芽孢桿菌細胞在WO98/22598有所描述。無被嚢的(non-encapsulating)芽孢桿菌屬細胞在本發(fā)明中是特別有用的。在優(yōu)選實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、Sa"7/wC/m//、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在更加優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在其它更加優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬細胞是Sa"7/wc/a^"細胞。在其它更加優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬細胞是遲緩芽孢桿菌細胞。在其它更加優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在其它更加優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬細胞是枯草芽孢桿菌細胞。在最優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬宿主細胞是枯草芽孢桿菌A164A5(參見，例如美國專利No.5，891,701)或枯草芽孢桿菌168A4。用本發(fā)明的核酸構建體轉化芽孢桿菌屬宿主細胞可以，例如，通過原生質體轉4匕(參見，例如ChangandCohen,1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，通過使用感受態(tài)細胞(參見，例如YoungandSpizizen，1961,JournalofBacteriology81:823-829,或DubnauandDavidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221),通過電穿孑L(參見，例如ShigekawaandDower,1988，Biotechniques6:742-75l)或通過接合(參見，例如KoehlerandThome,1987，JournalofBacteriology169:5271畫5278)來進行。分子量可以才艮據(jù)改進的^唑方法(BitterandMuir，1962，AnalBiochem.4:330-334)測定透明質酸的水平。此外，可以使用本領域的標準方法測定透明質酸的平均分子量，例如由Uenoetal.,1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975;Wyatt,1993,Anal.Chim.Acta272:1-40;和WyattTechnologies,1999，"LightScatteringUniversityDAWNCourseManual"and"DAWNEOSManual"WyattTechnologyCorporation,SantaBarbara,California戶斤述的那些方法。在優(yōu)選實施方案中，通過本發(fā)明方法獲得的透明質酸具有約10,000至約10,000,000Da的分子量。在更優(yōu)選的實施方案中，通過本發(fā)明方法獲得的透明質酸具有約25,000至約5,000,000Da的分子量。在最優(yōu)選的實施方案中，通過本發(fā)明方法獲得的透明質酸具有約50,000至約3,000,000Da的分子量。優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的產(chǎn)品，其中所述透明質酸或其鹽具有在300，000-3,000，000范圍；優(yōu)選在400,000和2,500,000范圍；更優(yōu)選在500,000和2，000，000范圍；并且最優(yōu)選在600,000和1，800,000范圍的分子量。鹽和交耳關的HA優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的產(chǎn)品，其包含透明質酸的無機鹽，優(yōu)選透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸銨、透明質酸鈣、透明質酸鎂、透明質酸鋅或透明質酸鈷。在下面的實施例中存在透明質酸鈉與聚(乳酸)單酰氯或二酰氯(poly(lacticacid)mono-ordi-acylchloride)的反應產(chǎn)生連4妻或交聯(lián)的HA-PLA或HA-PLA-HA產(chǎn)品，當與未處理的HA或PLA的標準光譜比較時，其在IR光語上顯示在1736cm-l的強峰，其對應于新近與HA連接以形成HA-PLA產(chǎn)品的聚(乳酸)片段的存在。因此，優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的產(chǎn)品，其中所述交聯(lián)的透明質酸或其鹽含有聚合a-羥酸的酯，優(yōu)選是聚(乳酸)的酯，也稱作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立體共聚物和共聚物，特別那些與乙醇酸的共聚物，以及與其它的共聚物，例如與經(jīng)由s-己內酯的羥基己酸、葡糖酸和化學修飾的葡糖酸、蘋果酸的共聚物，與低分子量片段的共聚物，其能夠產(chǎn)生降解副產(chǎn)物，所述降解副產(chǎn)物是水溶性的并且能夠通過腎臟過濾消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它們在鏈末端具有一或兩個g,并且在一元酸的情況下它們提供疏水性。含水量測定根據(jù)本發(fā)明的干產(chǎn)品粉末的水分含量是，在102oC±200將所述粉末干燥至恒重之后的重量損失，以百分數(shù)表示。將帶有磨口蓋的空玻璃稱量盤在烘箱中干燥，然后冷卻并且在靈敏度至少0.1mg的分析天平上稱量。將大約3g干產(chǎn)品粉末置于盤中并稱量。將裝有粉末的盤不加蓋置于烘箱中并且于1020C士20C的溫度干燥2小時；隨后將其置于干燥器中并冷卻至室溫然后將其再次稱量。將裝有粉末的盤不加蓋置于烘箱中再干燥1小時，然后如已經(jīng)描述的冷卻和稱量；將此重復直至重量保持恒定，即，直至兩次連續(xù)稱量的區(qū)別不多于0.5mg。然后將水分百分數(shù)的計算為(W2-W3)/(W2-Wl)xl00;其中Wl是空盤的重量，W2是裝有粉末的盤的重量，而W3是裝有干粉末的盤的重量。結果計算至2個小數(shù)位(2decimalplaces),并且此方法的重復性是約±0.1%。在優(yōu)選的實施方案中，將第一方面所述產(chǎn)品干燥，并且如本文所測定，其包含少于5。/。水分，優(yōu)選少于2%，并且最優(yōu)選少于1%水分。其它成分在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述產(chǎn)品還可包含其它成分，優(yōu)選一種或多種活性組分，優(yōu)選一種或多種藥理學活性物質，并且還優(yōu)選水溶性賦形劑，例如乳糖。可用于本發(fā)明中的活性組分或藥理學活性物質的非限定性實例包括蛋白質和/或肽藥物，例如，人生長激素、牛生長激素、豬生長激素、生長激素釋放激素/肽、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、骨形態(tài)形成性蛋白質(bonemorphogenicprotein)、干擾素或其衍生物、胰島素或其衍生物、心房肽III(atriopeptin-III)、單克隆抗體、腫瘤壞死因子、巨噬細胞活化因子、白細胞介素、腫瘤退化因子(tumordegeneratingfactor)、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、組織纖溶酶原;敫活4勿(tissueplasminigenactivator)、因子VII、因子VIII禾口尿5敫酶?？砂ㄋ苄再x形劑用于穩(wěn)定活性組分的目的，這種賦形劑可包括蛋白質，例如，白蛋白或明膠；氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和它們的鹽；糖例如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖和硫酸軟骨素；無機鹽例如磷酸鹽；表面活性劑例如TWEEN(ICI)、聚乙二醇，及其混合物。賦形劑或穩(wěn)定劑可以以產(chǎn)品重量的0.001至99%的量使用。本發(fā)明的幾個方面涉及各種組合物和藥物，其中包含有效量的如第一方面所限定的產(chǎn)品，和活性組分，優(yōu)選所述活性組分是藥理學活性劑；可藥用的載體(pharmaceuticallyacceptablevector)、U武形劑或稀萍奪劑，《尤選水〉容'性l!武形劑，并且最優(yōu)選乳糖。此外，本發(fā)明的多個方面涉及包含如第一方面所定義產(chǎn)品或如上多個方面和實施方案中所限定的組合物的物品，例如，化妝品、衛(wèi)生物品、醫(yī)學或外科物品。在本發(fā)明的最后方面涉及藥物膠囊或微膠嚢，其包含如第一方面所限定的產(chǎn)品或如本發(fā)明其它方面和實施方案所限定的組合物。產(chǎn)生方法本發(fā)明在另一方面提供產(chǎn)生包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品的方法，其中所述透明質酸或其鹽與a-羥酸的聚合物部分或全部連接或交聯(lián)，所述a-羥酸的聚合物優(yōu)選聚(乳酸)，也稱作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立體共聚物和共聚物，特別那些與乙醇酸的共聚物，以及與其它的共聚物，例如與經(jīng)由s-己內酯的羥基己酸、葡糖酸和化學修飾的葡糖酸、蘋果酸的共聚物，與低分子量片段的共聚物，其能夠產(chǎn)生降解副產(chǎn)物，所述降解副產(chǎn)物是水溶性的并且能夠通過腎臟過濾消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它們在鏈末端具有一或兩個羧基，并且在一元酸的情況下它們提供疏水性，所述方法包含步驟a)將透明質酸或其鹽與a-羥酸聚合物的單酰氯或二酰氯在有機溶劑，優(yōu)選在DMSO中反應。使用產(chǎn)品或組合物的方法本發(fā)明的不同方面涉及，例如在醫(yī)學領域使用第一方面的產(chǎn)品或使用本發(fā)明的組合物進行處理步驟的方法。一方面涉及在眼科學(ophtalmology)中執(zhí)行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。另一方面涉及在骨關節(jié)炎(osteoarthritis)治療中執(zhí)行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。另一方面涉及在癌治療中執(zhí)行程序的方法，其包括1吏用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。一方面涉及進行透皮或皮膚施用藥理學活性劑的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。另一方面涉及進行皮膚施用化妝品的方法，其包括使用如第一方面所限定的產(chǎn)品或本發(fā)明的組合物。實施例許多化學縮寫通過結構式在圖1中說明，例如四丁基銨(TBA)、十六烷基三曱基銨(CTA)、透明質酸(HA)和聚(乳酸)(PLA)。實施例1DMSO和S0C12蒸餾DMSO蒸餾將1.51DMSO引入2000ml圓底燒瓶中，并且伴以磁力攪拌將少量P205添加至DMSO，以分離(withdraw)水。隨后如下所述進4亍裝配來進行真空蒸餾將燒瓶與裝有可旋轉多收集器轉接器(multi-receiveradapter)的冷凝器相連，所述轉4妄器與一個100ml和兩個1000ml的燒弁瓦相連，乂人而允許獨立地收集3種餾分而不必中斷蒸餾。將燒瓶在真空下加熱至約75。C以進行蒸餾。將第一種小餾分收集在100ml圓底燒瓶中，并且稍后棄去。最終收集餾出的DMSO。柱頂部的溫度是42。C,并且真空是2mbar。超純商業(yè)DMSO能夠不經(jīng)蒸餾使用。SOCl2蒸餾將300ml亞硫酰氯S0C12引入500ml圓底燒瓶中，并且伴以磁力攪拌將50ml亞磷酸三苯酯(triphenylphosphite)逐滴添加以捕集(trap)氯和硫。重要的是在添加期間控制溫度，因為該過程是大量放熱的。當已添加了所有的亞磷酸三苯酯時，如下所述進行裝配來進行蒸餾將燒瓶與裝有可旋轉多收集器轉接器的冷凝器相連，所述轉接器與50ml、100ml和250ml的燒瓶相連，允許獨立地收集3種餾分而不必中斷蒸餾。將全部裝置包裹在鋁片(aluminumsheet)中以保護蒸餾的SOCl2免于光照。還將氯化鈣捕集器(trap)裝配至蒸餾裝置以防水。隨后將燒瓶加熱至105。C以蒸餾產(chǎn)品；柱頂部的溫度是72。C。實施例2PLA酰氯的制備反應流程示于圖2。將2.4454gPLA溶于新鮮蒸餾的SOCl2中，并且引入帶有;茲力攪拌的250ml圓底燒^f瓦，隨后將其裝配用于回流并且通過CaCl2捕集器防水。將燒并瓦加熱以回流(大約80。C)3小時。當反應結束時，將過量的SOCl2在真空下于60。C蒸餾出來。為了去除所有的SOCl2,將剩余的產(chǎn)品溶于曱苯并且將溶液在真空下于80。C再次蒸餾以去除溶劑。將此步驟重復3次。實施例3HA-PLA合成將CTA鹽形式的透明質酸(HA-CTA)和聚(乳酸)單酰氯(PLA-COCl)以PLA-COC1相對于HA-CTA為2:1的摩爾比率進行反應。將溶于50mlDMSO的2.03gPLA-C0C1逐滴添加至0.512gHA-CTA的70mlDMSO溶液中。添加之后，將該溶液在室溫混合過夜。使用回旋式蒸發(fā)器(rotavapomtor)以去除DMSO,將溶液濃縮直到獲得固體產(chǎn)品。將產(chǎn)品連續(xù)用乙醇和丙酮洗滌。終產(chǎn)品是不溶于水但在DMSO中溶脹的(swelled)。終產(chǎn)品(KBr盤(KBrdisk))的IR光譜示于圖5。其看起來像HA-H的光譜(示于圖4),除了對應于CK)鍵的處于1735cm-l的峰。然而，此峰的強度較大，并且屬于聚(乳酸)。PLA的IR光譜示于圖3。13CNMR看起來是用于表征終產(chǎn)品的更加有效的方法，因為HA的13CNMR光譜中所有的峰清楚地鑒定如下；D-葡糖醛酸的碳原子以"U，，標記，而N-乙酰-D-葡糖胺酸的那些以"N，，標記U6+174ppmN7^175ppmUl100或104ppmNl^100或104ppmN8今22ppmU2，3，4，554或83ppmN3,4,5^54或83ppmN2~>54.5ppmN6^60.5ppm終產(chǎn)品的13CNMR光譜(圖6)顯示所有HA、PLA(16,57和170ppm)和十六烷基三曱基銨(CTA)反荷離子(13，29,52ppm)的所有峰。蒸發(fā)DMSO以固化產(chǎn)品可以逐漸地使PLA和HA在空間上更靠近在一起，其隨后可導致更好的偶聯(lián)反應(couplingreaction)。HA和PLA的鏈長的不同可影響反應中的取代比率。實施例4HA-PLA-HA合成將DMSO中的PLA二酰氯與HA(TBA或CTA形式)于室溫混合1夜，如上所述。然后將溶液濃縮并通過在乙醇中沉淀來純4b產(chǎn)品，并且最終用丙酮洗滌。終產(chǎn)品不溶于水。將去除了這兩種溶劑的產(chǎn)品通過IR光諮分析，如圖8和9所示。兩個光譜呈現(xiàn)PLA和HA二者特有的峰。我們設想洗滌消除了一些與HA連接的PLA。來自HA-CTA和HA-TBA的終產(chǎn)品的IR光譜(圖10和ll)也看來像HA-H的光譜，除了對應于PLA的CO鍵的在1736cm-1的峰。實施例5HA-CTA合成將十六烷基三曱基溴化銨的溫溶液(40。C)逐滴添加到0.155gHA-Na的溫溶液(40。C)中。將白色沉淀濾出，用溫水洗滌以去除NaBr和過量十六烷基三曱基溴化銨并且冰凍干燥。溶于DMSO的終產(chǎn)品的IR光譜(圖12)顯示CTA的存在。實施例61:1摩爾比率的HA-PLA合成通常，將0.64g活化的乳酸寡聚體與1gHA-CTA在DMSO中在室溫過夜混合。將DMSO去除并且將沉淀用醚(ether)洗滌兩次，用乙醇洗滌三次，并且用丙酮洗滌兩次。最終將回收的產(chǎn)品在真空下干燥過夜。終產(chǎn)品的'HNMR(圖13)顯示殘余CTA的存在。實施例7HA-PLA透析將帶有殘余CTA的HA-PLA溶于磷酸鹽緩沖溶液(pH-7.4并且濃度=0.5M)中，該l^沖液以2/1體積比率與DMSO混合。將此溶液連續(xù)地相對水、DMSO、乙醇和水進行透析(截留(cut-off)^6000-8000)。在該處理之后，將溶液冷凍干燥，并且通過NMR分析最終的化合物(圖14)。圖8HA-PLA空白檢驗通過使HA和PLA反應，而不用SOCl2進行任何預先的寡聚體活化來進行空白檢驗。將20mlDMSO中含有271mgPLA的溶液逐滴添加至211mgHA溶于40mlDMSO的溶液中。將此溶液于室溫攪拌3小時，并且通過蒸發(fā)去除DMSO。獲得淺黃色固體。將此固體溶于DMSO過夜。出現(xiàn)沉淀。將這種不溶的部分從溶液分離并且用丙酮洗滌。將獲得的白色固體干燥并通過NMR分析。將丙酮緩慢地添加至剩余的溶液以產(chǎn)生新的沉淀。將這種沉淀收集、干燥并且也通過NMR分析。在NMR光譜上未見PLA的峰。這確認了當采用通過亞硫酰氯活化PLA時，PLA與HA化學連接。權利要求1.包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品，其中所述透明質酸或其鹽是與α-羥酸的聚合物，優(yōu)選聚(乳酸)部分或全部地連接或交聯(lián)的。2.根據(jù)權利要求l的產(chǎn)品，其中所述透明質酸或其鹽優(yōu)選通過革蘭氏陽性細菌，更優(yōu)選通過芽孢桿菌屬細菌重組產(chǎn)生。3.才艮據(jù)權利要求1或2的產(chǎn)品，其中所述透明質酸或其鹽具有的分子量在300,000-3,000,000的范圍；優(yōu)選在400,000-2,500,000的范圍；更優(yōu)選在500,000-2,000,000的范圍；并且最優(yōu)選在600,000-1,800,000的范圍。4.根據(jù)權利要求1-3中任一項的產(chǎn)品，其包含透明質酸的無機鹽，優(yōu)選透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸銨、透明質酸鈣、透明質酸鎂、透明質酸鋅或透明質酸鈷。5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的產(chǎn)品，其中所述連接的或交聯(lián)的透明質酸或其鹽包含聚合a-羥酸的酯，優(yōu)選聚(乳酸)的酯。6.根據(jù)權利要求1-5中任一項的產(chǎn)品，其為經(jīng)干燥的，并且如本文所測定包含少于5%水分，優(yōu)選少于2%,并且最優(yōu)選少于1°/。水分。7.根據(jù)權利要求1-6中任一項的產(chǎn)品，其還包含活性組分。8.根據(jù)權利要求7的產(chǎn)品，其中所述活性組分是藥理學活性物質。9.根據(jù)權利要求1-8中任一項的產(chǎn)品，其還包含水溶性賦形劑，優(yōu)選乳糖。10.組合物，其包含如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品和活性組分，優(yōu)選所述活性組分是藥理學活性劑。11.根據(jù)權利要求IO的組合物，其還包含水溶性賦形劑，優(yōu)選乳糖。12.藥用組合物，其包含有效量的如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品，連同可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。13.藥用組合物，其包含有效量的如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品作為媒介物，以及藥理學活性劑。14.化妝品，其包含有效量的如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品作為活性組分。15.衛(wèi)生、醫(yī)學或外科物品，其包含如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品；優(yōu)選所述物品是外科海綿、愈傷海綿，或包含于急救繃帶或其它創(chuàng)傷敷裹材料中的部分。16.藥物膠嚢或微膠嚢，其包含如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品。17.產(chǎn)生包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品的方法，其中所述透明質酸部分或全部地與a-羥酸的聚合物，優(yōu)選聚(乳酸)連接或交聯(lián)，該方法包含步驟a)將透明質酸或其鹽與a-羥酸聚合物的單酰氯或二酰氯在有機溶劑中，優(yōu)選在DMSO中反應。18.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述透明質酸或其鹽優(yōu)選通過革蘭氏陽性細菌，更優(yōu)選通過芽孢桿菌屬細菌重組產(chǎn)生。19.根據(jù)權利要求17或18的方法，其中所述透明質酸或其鹽具有的分子量在300,000-3，000,000的范圍；優(yōu)選在400,000-2,500，000的范圍；更優(yōu)選在500，000-2,000,000的范圍；并且最優(yōu)選在600,000-1，800,000的范圍。20.根據(jù)權利要求17-19中任一項的方法，其中所述產(chǎn)品包含透明質酸的無機鹽，優(yōu)選透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸銨、透明質酸鈣、透明質酸鎂、透明質酸鋅或透明質酸鈷。21.根據(jù)權利要求17-20中任一項的方法，其中所述連接的或交聯(lián)的透明質酸或其鹽包含聚合a-羥酸的酯，優(yōu)選聚(乳酸)的酯。22.在眼科學中執(zhí)行程序的方法中的改進，其包含使用如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物。23.在骨關節(jié)炎治療中執(zhí)行程序的方法中的改進，其包含使用如權利要求l-9任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物。24.在癌治療中執(zhí)行程序的方法中的改進，其包含使用如權利要求1-9任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物。25.在進行透皮施用藥理學活性劑的方法中的改進，其包含使用如權利要求l-9任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物。26.在進行皮膚施用藥理學活性劑的方法中的改進，其包含使用如權利要求l-9任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物。27.在進行皮膚施用化妝品的方法中的改進，其包含使用如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物。28.使用如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物的眼科學方法。29.治療骨關節(jié)炎的方法，其包含將有效量的如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物施用于哺乳動物，優(yōu)選所述施用是皮膚施用、透皮施用、口服施用或通過注射施用。30.處理創(chuàng)傷的方法，其包含將有效量的如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物施用于哺乳動物。31.如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物用于制備治療骨關節(jié)炎的藥物的用途。32.如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物用于制備眼科學治療的藥物的用途。33.如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物用于制備治療癌癥的藥物的用途。34.如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物用于制備處理創(chuàng)傷的藥物的用途。35.如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物用于制備用于血管發(fā)生的藥物的用途。36.如權利要求1-9中任一項所限定的產(chǎn)品或如權利要求10-13中任一項所限定的組合物用于制備保濕劑的用途。全文摘要本發(fā)明涉及包含透明質酸或其鹽的產(chǎn)品，其中已將所述透明質酸與α-羥酸的聚合物部分或全部連接或交聯(lián)。本發(fā)明還涉及該產(chǎn)品的制造、本發(fā)明所述產(chǎn)品在以下領域中的用途用于制備衛(wèi)生和外科物品的生物可降解塑性材料領域，制藥和化妝品領域；包括在這些領域中用該產(chǎn)品制造的多種物品。文檔編號A61K8/73GK101133102SQ200580048887公開日2008年2月27日申請日期2005年12月23日優(yōu)先權日2004年12月30日發(fā)明者勞倫特·普拉瓦塔,卡迪加·施瓦克-阿布德勞伊,米歇爾·維特申請人:諾維信生物聚合物公司