專利名稱：：調(diào)節(jié)生物活性的雙特異性結(jié)合劑的制作方法調(diào)節(jié)生物活性的雙特異性結(jié)合劑相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2005年2月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/655,836的優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容納入本文作為參考。關(guān)于在聯(lián)邦政府支持下進(jìn)行研發(fā)的發(fā)明權(quán)利聲明無(wú)在光盤(pán)上提交的附錄"序列表"、表格或計(jì)算機(jī)程序清單參考資料。無(wú)
背景技術(shù)：
：許多疾病和失調(diào)是由細(xì)胞表面受體的活化(如通過(guò)與受體特異性配體結(jié)合)使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)不適當(dāng)或過(guò)度活化而引起的。參與疾病和失調(diào)如癌癥和自身免疫病的發(fā)生或進(jìn)展的受體，已成為開(kāi)發(fā)減少或防止受體活化的治療劑的主要靶點(diǎn)。靶受體的例子包括例如表皮生長(zhǎng)因子受體("EGFR")、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體("IGF1-R")和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體("PDGFR")，它們?cè)谠S多疾病中傾向于過(guò)量表達(dá)或異常活化，例如在大多數(shù)常見(jiàn)的實(shí)體瘤，包括非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，以及許多自身免疫病，如重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。受體活化導(dǎo)致自磷酸化，從而驅(qū)動(dòng)導(dǎo)致疾病進(jìn)展的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。用受體抑制劑進(jìn)行的開(kāi)創(chuàng)性研究已明確證明通過(guò)防止與疾病相關(guān)的受體活化，可改變?cè)摷膊〉陌l(fā)展。但是，通常，造成疾病的受體在除了患病細(xì)胞或組織以外的許多不同細(xì)胞和組織上表達(dá)。雖然臨床上可以使用受體抑制劑，如靶向ErbB2("HER-2")的賀賽汀@，新的挑戰(zhàn)包括鑒定將有效靶向患病細(xì)胞或組織而不靶向未患病細(xì)胞和組織的治療劑。將藥物特異性靶向患病細(xì)胞的一種方法是采用雙特異性結(jié)合劑，本文中有時(shí)稱為"bsBA"。雙特異性結(jié)合劑包含兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，各自能特異性識(shí)別和結(jié)合不同分子(為方便起見(jiàn)，各結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的分子可以稱為該結(jié)合結(jié)構(gòu)域的"配體")。已試驗(yàn)了雙特異性結(jié)合劑一段時(shí)間，如SchmidtM.等，"對(duì)ErbB-2和EGF受體特異的二價(jià)單鏈抗體-毒素"(Abivalentsinglechain-toxinspecificforErbB畫(huà)2andtheEGFreceptor),Int.J.Cancer,65(4):538-46(1996)，LuD.等，"用完全人重組雙特異性抗體同時(shí)阻斷癌細(xì)胞中的表皮生長(zhǎng)因子受體和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑"(Simultaneousblockadeofboththeepidermalgrowthfactorreceptorandtheinsulin-likegrowthfactorreceptorsignalingpathwaysincancercellwithafullyhumanrecombinantbispecificantibody)JBiolChem.279(4):2856-65(2004)和FrancoisC.等，"抗小鼠IL-2-Rcx和p鏈的抗體協(xié)同作用以消除T-細(xì)胞體外增殖和延遲型體內(nèi)超敏反應(yīng)"(AntibodiesdirectedatmouseIL-2-RalphaandbetachainactinsynergytoabolishT-cellproliferationinvitroanddelayedtypehypersensitivityreactioninvivo)TransplInt.9(1):46-50(1996)。因?yàn)閎sBA常常采用抗體作為一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所以bsBA有時(shí)屬于稱為免疫治療的藥物類型。不幸的是，可用作bsBA的耙點(diǎn)的分子有限。僅有相對(duì)一小部分分子在患病細(xì)胞而非正常細(xì)胞上表達(dá)，因此可用這些分子使藥物僅靶向患病細(xì)胞。又有一些分子在患病細(xì)胞上表達(dá)得比正常細(xì)胞上更多。這些分子可以允許將藥物優(yōu)先遞送到患病細(xì)胞而非正常細(xì)胞，這取決于與正常細(xì)胞相比，該分子在患病細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的程度。然而，即使靶細(xì)胞上靶分子大量過(guò)量表達(dá)，由于藥物與表達(dá)該靶分子的正常細(xì)胞結(jié)合，遞送靶向治療劑常常伴有副作用。例如，作為FDA-批準(zhǔn)的免疫治療劑賀賽?、喟尹c(diǎn)的HER2(erbB2)受體過(guò)量表達(dá)，比非癌細(xì)胞中HER2受體的表達(dá)高約10-100倍。然而，由于賀賽汀與正常細(xì)胞結(jié)合，一定百分?jǐn)?shù)的患者產(chǎn)生了心律失常和其它副作用。因此，需要通過(guò)開(kāi)發(fā)結(jié)合耙細(xì)胞而不結(jié)合非靶細(xì)胞的能力提高的bsBA來(lái)增加免疫治療劑的治療窗。發(fā)明概述本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)靶細(xì)胞上耙分子的一種或多種生物活性的方法。該方法包括提供一種雙特異性結(jié)合劑，所述雙特異性結(jié)合劑具有與所述細(xì)胞表面上第一靶分子的Kd至少為1(T7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與所述細(xì)胞表面上第二耙分子的親和力比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中所述第一和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同；以及使所述雙特異性結(jié)合劑在允許第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合第一和第二靶分子的條件下接觸所述靶細(xì)胞，其中所述第一和第二靶分子的結(jié)合調(diào)節(jié)所述靶分子的一種或多種生物活性。一些實(shí)施方式中，所述雙特異性結(jié)合劑包含兩種抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。一些實(shí)施方式中，所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。一些實(shí)施方式中，所述第一靶分子是腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。一些實(shí)施方式中，所述第一靶分子是選自EGFR或ErbB2的酪氨酸激酶受體。一些實(shí)施方式中，所述第二靶分子是ErbB3(HER3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。在一些實(shí)施方式中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d為1(T8-1(T12M。在一些實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ诙蟹肿拥腒d比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少20倍。在另一組實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在具有靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞的生物體中調(diào)節(jié)靶細(xì)胞上靶分子的一種或多種生物活性的方法，其中，所述靶細(xì)胞在其外部具有第一靶分子并在其外表面具有第二靶分子，且其中，(i)所述第一和第二靶分子不共享共有配體，(ii)所述第一靶分子在所述靶細(xì)胞表面上的豐度比也攜帶第二靶分子的非靶細(xì)胞表面上的豐度高至少10倍，和(iii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同。所述方法包括提供一種雙特異性結(jié)合劑，所述雙特異性結(jié)合劑具有與第一耙分子的Kd至少為10—7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與第二靶分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和使所述雙特異性結(jié)合劑在允許第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合第一和第二靶分子的條件下接觸所述靶細(xì)胞，其中所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述結(jié)合分別調(diào)節(jié)所述第一和所述第二耙分子的一種或多種生物活性。一些實(shí)施方式中，所述雙特異性結(jié)合劑包含兩種抗體。在這些實(shí)施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。一些實(shí)施方式中，所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。第一耙分子可以是腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。第一靶分子可以是選自EGFR和ErbB2的酪氨酸激酶受體。一些實(shí)施方式中，第二靶分子是ErbB3(HER3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。一些實(shí)施方式中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d為10-8-l(T12M。一些實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ诙曳肿拥腒d比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少20倍，而在其它實(shí)施方式中，它比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少50倍。一些實(shí)施方式中，所述生物活性的調(diào)節(jié)涉及降低酪氨酸激酶受體的活性。在另一組實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種雙特異性結(jié)合劑(bsBA),其包含與靶細(xì)胞上第一靶分子的Kd至少為10'7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與靶細(xì)胞上第二靶分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，(i)所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，(U)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同，和(iii)所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)結(jié)合所述第一和所述第二靶分子時(shí)分別調(diào)節(jié)所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。一些實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少50倍，而在其它實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低IOO倍或更多倍。一些實(shí)施方式中，所述bsBA包含兩種抗體。在這些實(shí)施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。一些實(shí)施方式中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。一些實(shí)施方式中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合選自EGFR或ErbB2的酪氨酸激酶受體。一些實(shí)施方式中，第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合ErbB3(HER3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。一些實(shí)施方式中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合EGFR，而所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合ErbB3(HER3)。一些實(shí)施方式中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd為1(T8-1(T12M。一些實(shí)施方式中，所述第一靶分子在靶細(xì)胞上的表達(dá)比其在正常細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)度至少10倍。再在另一組實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種含有(a)雙特異性結(jié)合劑(bsBA)和(b)藥學(xué)上可接受的載體的組合物，所述雙特異性結(jié)合劑包含與靶細(xì)胞上第一靶分子的Kd至少為1(T7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與耙細(xì)胞上第二耙分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少I(mǎi)O倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，且其中，(i)所述第一耙分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同，和(ii)所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)結(jié)合所述第一和所述第二耙分子時(shí)分別調(diào)節(jié)所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。一些實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少50倍，而在一些實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低100倍或更多倍。在一些實(shí)施方式中，所述bsBA包含兩種抗體。在這些實(shí)施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。一些實(shí)施方式中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。在一些實(shí)施方式中，所述第一靶分子在靶細(xì)胞上的表達(dá)比其在正常細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)度至少10倍。再在另一組實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了雙特異性結(jié)合劑(bsBA)在藥物制造中的應(yīng)用，所述雙特異性結(jié)合劑包含與靶細(xì)胞上第一靶分子的Kd至少為10^M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與靶細(xì)胞上第二靶分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有一種生物活性，該活性可相同或不同，且所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)結(jié)合所述第一和所述第二靶分子時(shí)分別調(diào)節(jié)所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。在一些實(shí)施方式中，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少50倍，而在其它實(shí)施方式中，它比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低IOO倍或更多倍。在一些實(shí)施方式中，所述bsBA包含兩種抗體。在這些實(shí)施方式中的一些中，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。一些實(shí)施方式中，所述被第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的靶分子獨(dú)立選自腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體，前提是第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域不結(jié)合相同的腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。在一些實(shí)施方式中，所述第一耙分子在耙細(xì)胞上的表達(dá)比其在正常細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)度至少I(mǎi)O倍。在一些實(shí)施方式中，所述藥物用于抑制癌細(xì)胞增殖。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了用于在293T細(xì)胞中表達(dá)C225-A5雙特異性抗體的兩種表達(dá)質(zhì)粒A5CH/pSTH和C225Ck/pSTZ。圖2顯示了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)得到的C225-A5雙特異性抗體與A431癌細(xì)胞的結(jié)合。將A431細(xì)胞與1ug/mLC225-A5—起或不與抗體一起在冰上培育30分鐘，用AlexaFluor488標(biāo)記的抗-人IgG抗體檢測(cè)并在FACSCalibur儀中量化。圖3顯示了雙特異性抗體濃度對(duì)AKT磷酸化的影響。對(duì)以高親和力結(jié)合EGFR而以低親和力結(jié)合ErbB3的C225-A5雙特異性抗體進(jìn)行劑量反應(yīng)試驗(yàn)。將A431細(xì)胞與遞升濃度的C225-A5雙特異性抗體一起培育30分鐘，然后用調(diào)蛋白剌激5分鐘。然后用洗滌劑裂解腫瘤細(xì)胞并分析其AKT磷酸化。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為細(xì)胞裂解產(chǎn)物中AKT磷酸化的比例與抗體濃度的繪圖。該比例代表用抗體微陣列測(cè)定的樣品中磷酸化AKT的量占總AKT的量的比值。發(fā)明詳述概述目前免疫治療劑的一個(gè)問(wèn)題是它們既結(jié)合于正常細(xì)胞又結(jié)合于患病細(xì)胞的傾向引起了不良副作用。因此，科學(xué)界的一個(gè)目標(biāo)是開(kāi)發(fā)結(jié)合于靶細(xì)胞(如患病細(xì)胞)而不結(jié)合非靶細(xì)胞(即正常細(xì)胞)的能力得到改進(jìn)的免疫治療劑。本發(fā)明提供了組合物和方法，用于提高一類免疫治療劑結(jié)合靶細(xì)胞的特異性。意外的是，現(xiàn)在己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)控制稱為雙特異性結(jié)合劑("bsBA")的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力的差異來(lái)提高bsBA免疫治療劑靶向患病細(xì)胞的特異性。因此，本發(fā)明的bsBA可用于提高或降低靶細(xì)胞上靶分子的生物活性，從而改進(jìn)其調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生物活性而降低對(duì)非靶細(xì)胞相應(yīng)活性的影響(如果有)的能力。顧名思義，bsBA具有兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，各自對(duì)不同的靶分子特異。通常用第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域使bsBA靶向選擇的細(xì)胞，有時(shí)稱為"靶細(xì)胞"。第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合于耙細(xì)胞上的第二靶分子。第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其靶分子的結(jié)合旨在調(diào)節(jié)特定生物作用(即提高或抑制該生物活性)。本領(lǐng)域已知能夠以不同方式調(diào)節(jié)生物活性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其靶分子的結(jié)合常常能抑制生物活性。例如，如果結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的分子是細(xì)胞因子受體的一部分，那么結(jié)合結(jié)構(gòu)域與該受體的結(jié)合可阻斷細(xì)胞因子到達(dá)該受體，從而抑制此結(jié)合誘導(dǎo)的生物活性。類似地，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與受體的結(jié)合可防止該受體形成異質(zhì)二聚體，而異質(zhì)二聚體的形成是完全活化某些細(xì)胞因子受體如白介素("IL")-2受體所必需的?；蛘?，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可改變受體的構(gòu)象，以使其不能結(jié)合其天然配體并從而被活化。相反，可選擇結(jié)合結(jié)構(gòu)域以能通過(guò)結(jié)合受體來(lái)提高生物活性。例如，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與受體的結(jié)合可模擬天然配體對(duì)受體的作用，從而此結(jié)合激活了受體，或者結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可誘導(dǎo)構(gòu)象改變，使低親和力受體變?yōu)槠涮烊慌潴w的高親和力受體。由于本發(fā)明的bsBA具有兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此可對(duì)它們進(jìn)行選擇以實(shí)現(xiàn)所需效果。例如，可選擇都抑制酪氨酸激酶受體生物活性的結(jié)構(gòu)域?；蛘撸蛇x擇一個(gè)將抑制激酶受體的生物活性而另一個(gè)增強(qiáng)或激活需要其活性的另一種受體。能夠選擇對(duì)靶細(xì)胞上靶分子的活性具有所需效果的結(jié)合結(jié)構(gòu)域提高了本發(fā)明方法的適用性。盡管本發(fā)明的bsBA的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域都用來(lái)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生物活性，但本發(fā)明所述bsBA的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可使bsBA耙向耙細(xì)胞，而第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要用于誘導(dǎo)對(duì)靶細(xì)胞的作用。因此，為了方便區(qū)分這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，本文中有時(shí)將第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域稱為"耙向結(jié)構(gòu)域"，而本文中有時(shí)將第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域稱為"效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域"。類似地，為了方便區(qū)分這兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的分子，有時(shí)將效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的靶分子稱為"效應(yīng)器耙分子"，而術(shù)語(yǔ)"靶分子"本身指靶向結(jié)構(gòu)域的靶點(diǎn)。以前一般用與各相應(yīng)靶分子具有最高可用親和力的結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建bsBA。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，一個(gè)結(jié)構(gòu)域不可能與另一結(jié)構(gòu)域?qū)ο鄳?yīng)靶點(diǎn)具有完全相同的親和力，因此，兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力通常有差異。然而，這種差異一般不大，對(duì)結(jié)合的試劑作用可能顯著或不顯著。但是，在本發(fā)明方法和組合物中，選擇與其配體的結(jié)合親和力比效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與其配體的親和力高至少一個(gè)數(shù)量級(jí)的靶向結(jié)構(gòu)域。即靶向結(jié)構(gòu)域與它識(shí)別和結(jié)合的分子的親和力比效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與它識(shí)別和結(jié)合的分子的親和力高至少I(mǎi)O倍或更多。在一些實(shí)施方式中，耙向結(jié)構(gòu)域與其配體的親和力比效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域高至少15倍，在其它情況下高20倍或更多，在其它實(shí)施方式中，高25倍或更多，在一些實(shí)施方式中，它的親和力比效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與其靶的親和力高30倍、40倍、50倍、甚至100倍或更高，更優(yōu)選較高的親和力。由于本發(fā)明bsBA的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力至少相差一個(gè)數(shù)量級(jí)，所以本文偶爾將bsBA稱為"高-低(hi-lo)"bsBA。相對(duì)于現(xiàn)有雙特異性分子，耙點(diǎn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)器結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合親和力的有意和顯著差異提供了意外和以前未識(shí)別的優(yōu)點(diǎn)。如上所述，以前已知的雙特異性物質(zhì)具有與靶配體的親和力盡可能高的結(jié)合部分。但是，與本發(fā)明組合物和方法相比，具有親和力相似的結(jié)合部分的雙特異性分子受限于它們可靶向的分子和它們可應(yīng)用的情況。通過(guò)參照假想范例，可理解本發(fā)明的一些優(yōu)點(diǎn)。考慮具有兩種受體A和B的癌細(xì)胞的情況，受體A在癌細(xì)胞上過(guò)量表達(dá)(與正常細(xì)胞相比)，受體B在正常細(xì)胞上表達(dá)的拷貝數(shù)與癌細(xì)胞上表達(dá)的基本相同。具有對(duì)兩種受體的親和力大約相等的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性結(jié)合劑對(duì)癌細(xì)胞和正常非癌細(xì)胞的作用傾向于基本相等。具體說(shuō)，在獲得高濃度bsBA的情況下尤其如此，因?yàn)閎sBA傾向于通過(guò)單價(jià)結(jié)合使兩種受體飽和。相反，本發(fā)明bsBA具有耙向受體A的較高親和力靶向結(jié)構(gòu)域和靶向受體B的較低親和力效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，并且與受體A的親和力比受體B高10倍、20倍、30倍、或甚至更多倍，因此本發(fā)明bsBA優(yōu)先結(jié)合于癌細(xì)胞，并且通過(guò)正常的動(dòng)力學(xué)相互作用，本發(fā)明bsBA將結(jié)合于更大量的癌細(xì)胞(與正常細(xì)胞相比)。因此，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域不會(huì)不加選擇地結(jié)合于攜帶受體B的細(xì)胞(包括大量正常細(xì)胞)，而是被選擇性遞送至癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明能夠更有選擇地將效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域靶向耙細(xì)胞。而且，親和力較高的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與受體A的結(jié)合使親和力較低的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域接近細(xì)胞表面，在接近細(xì)胞表面的地方它才能夠與受體B相互作用一段時(shí)間。這使效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合受體B，即使如果以"游離形式"(freestanding)、單價(jià)(或"一價(jià)")實(shí)體提供效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域時(shí)，它與受體B相對(duì)低的親和力通?？赡懿蛔阋允蛊渚S持在受體上。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，抗體或其它配體的解離常數(shù)("Kd")由配體的k結(jié)合k解離確定。即，Kd代表抗體或其它配體結(jié)合于靶分子的時(shí)間和抗體或其它配體不結(jié)合的時(shí)間之間的平衡。因此，親和力低的結(jié)合結(jié)構(gòu)域常常具有低親和力，因?yàn)樗浅A向于與其靶分子解離。在平衡期間，布朗運(yùn)動(dòng)、液體流動(dòng)或其它動(dòng)力學(xué)作用力作用于結(jié)合結(jié)構(gòu)域分子可使未栓牢的結(jié)合結(jié)構(gòu)域脫離其靶分子。bsBA的高親和力結(jié)構(gòu)域栓住低親和力結(jié)構(gòu)域有助于維持低親和力結(jié)構(gòu)域接近其靶受體，從而有助于增加低親和力結(jié)構(gòu)域能夠在任何時(shí)間點(diǎn)上結(jié)合其靶分子的概率。由于在此假想情況下本發(fā)明bsBA的低親和力結(jié)構(gòu)域的耙分子是受體激酶，這有助于提高bsBA結(jié)合于靶受體激酶的能力，從而增加它們對(duì)耙細(xì)胞的生物學(xué)作用。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明bsBA的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合于通常不與相同配體結(jié)合的靶分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，一些配體如白介素IL-2被兩條不同的受體鏈結(jié)合，結(jié)合有IL-2的這兩條鏈然后相互作用形成有完全生物活性的單元。雖然指向這兩條受體鏈的bsBA可因此防止這種受體的完全活化，但此bsBA的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)然指向同一受體。此外，雖然靶向相同受體兩條鏈的bsBA會(huì)千擾由該受體介導(dǎo)的生物活性，但靶向兩種不同受體的bsBA可調(diào)節(jié)這兩種受體的生物活性。據(jù)信，對(duì)兩種受體活性的影響會(huì)立即提供比干擾僅其中一種的活性更加有力的對(duì)靶細(xì)胞的影響。最后，bsBA與通過(guò)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的這兩個(gè)靶分子之間形成的三聚體具有額外優(yōu)點(diǎn)使靶分子緊密地互相結(jié)合和防止通常它們通過(guò)細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層擴(kuò)散。相信bsBA使不同受體交聯(lián)本身有助于bsBA對(duì)耙細(xì)胞的細(xì)胞毒作用或細(xì)胞抑制效應(yīng)。在一組實(shí)施方式中，bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域結(jié)合于優(yōu)先在與疾病或失調(diào)相關(guān)的靶細(xì)胞(如乳腺癌細(xì)胞)上表達(dá)或過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞表面受體，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合于在耙細(xì)胞和非靶細(xì)胞上不加選擇地或普遍表達(dá)的細(xì)胞表面受體。本發(fā)明bsBA可靶向的示范性細(xì)胞表面受體在下文中描述。在優(yōu)選實(shí)施方式中，使靶向結(jié)構(gòu)域結(jié)合的分子在耙細(xì)胞上表達(dá)的水平高于該分子被效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合的水平。因此，本發(fā)明bsBA和方法特別可用于提高效應(yīng)器分子特異性遞送至含有靶分子的細(xì)胞，所述靶分子會(huì)被常規(guī)抗體或雙特異性試劑或二者不加選擇地結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，與另一種不同癌癥類型的細(xì)胞相比，不同的癌細(xì)胞可過(guò)量表達(dá)不同的抗原或不同程度地過(guò)量表達(dá)相同抗原。因此，在設(shè)計(jì)本發(fā)明bsBA中，考慮到實(shí)施者可選擇耙向結(jié)構(gòu)域，該耙向結(jié)構(gòu)域能靶向在具體bsBA靶向的具體細(xì)胞上過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞表面受體。在一些實(shí)施方式中，bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域結(jié)合于第一細(xì)胞表面受體，該受體優(yōu)先在與疾病或失調(diào)相關(guān)的靶細(xì)胞(如癌細(xì)胞)上表達(dá)或過(guò)量表達(dá)，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合于與正常細(xì)胞相比、在患病細(xì)胞(如癌細(xì)胞)上過(guò)量表達(dá)的第二細(xì)胞表面受體，但第二細(xì)胞表面受體的表達(dá)水平低于第一細(xì)胞表面受體。在這些實(shí)施方式中，第一和第二細(xì)胞表面受體表達(dá)水平的差異再一次改進(jìn)了效應(yīng)器分子向含有靶分子的細(xì)胞的特異性遞送。如背景部分所述，即使HER2在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的水平是正常細(xì)胞上表達(dá)水平的約10-100倍，但仍然觀察到患者中免疫治療劑賀賽汀@與正常細(xì)胞結(jié)合引起的一些副作用。因此，即使靶分子大量過(guò)量表達(dá)也不一定足以保持高親和力結(jié)合劑不與正常細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生副作用。相反，本發(fā)明bsBA中選擇的靶向結(jié)構(gòu)域與其靶分子的親和力比效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與其靶分子的親和力高至少10倍、常常高更多倍。靶向結(jié)構(gòu)域與其靶分子的解離常數(shù)優(yōu)選為1(T8-1(T12M。選擇耙分子是因?yàn)樗淮嬖谟谡＜?xì)胞上，或者因?yàn)榕c正常細(xì)胞相比它在癌細(xì)胞上高度過(guò)量表達(dá)，優(yōu)選比正常細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)量至少20倍，甚至更優(yōu)選100倍。如上所述，由于靶向結(jié)構(gòu)域與靶分子的親和力高，它傾向于使bsBA優(yōu)先結(jié)合于耙細(xì)胞。因此，預(yù)計(jì)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域可耙向正常細(xì)胞上表達(dá)的耙分子，仍能實(shí)現(xiàn)選擇性結(jié)合，提供大于常規(guī)bsBA的治療窗。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，具體說(shuō)，癌細(xì)胞傾向于上調(diào)許多正常蛋白的表達(dá)，包括具有維持正常細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用的許多蛋白。因此，即使通常認(rèn)為不是癌或腫瘤抗原的蛋白質(zhì)在癌細(xì)胞上也傾向于上調(diào)。例如，與正常細(xì)胞相比，不認(rèn)為是腫瘤抗原的胰島素受體在腫瘤細(xì)胞中常常上調(diào)3-5倍(參見(jiàn)例如Milazzo等，CancerRes.52(14):3924-30(1992》。又例如，與正常細(xì)胞相比，ErbB3受體在一些癌細(xì)胞上有些過(guò)量表達(dá)。然而，當(dāng)耙向結(jié)構(gòu)域指向過(guò)量表達(dá)程度更高的耙分子時(shí)，ErbB3受體可用作bsBA的效應(yīng)器靶分子。實(shí)施例公開(kāi)了本發(fā)明示范性bsBA，其中靶向結(jié)構(gòu)域指向EGFR，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域靶向ErbB3。需要靶向結(jié)構(gòu)域指向在靶細(xì)胞上過(guò)量表達(dá)的靶分子(如癌抗原)，而效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域指向表達(dá)水平低于靶向結(jié)構(gòu)域的靶分子的分子(如受體激酶)。雖然僅需要靶分子的表達(dá)水平高于效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域靶向的分子，通常，靶分子表達(dá)和效應(yīng)器分子表達(dá)之間的顯著性差異是有利的，因?yàn)樵赽sBA濃度低于靶向結(jié)構(gòu)域的Kd時(shí)可使效應(yīng)器分子飽和。通常，靶向結(jié)構(gòu)域的靶分子的過(guò)量表達(dá)水平比非靶細(xì)胞上該分子的表達(dá)水平優(yōu)選高10倍、20倍、50倍、IOO倍或更多倍，更優(yōu)選較高水平。通常，還優(yōu)選效應(yīng)器分子表達(dá)水平等于非靶細(xì)胞上的表達(dá)水平，或者，如果效應(yīng)器分子過(guò)量表達(dá)，它的過(guò)量表達(dá)水平是非耙細(xì)胞的2-5倍。換句話說(shuō)，相對(duì)于效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合的分子，革巴向分子表達(dá)(或過(guò)量表達(dá))水平優(yōu)選較高。當(dāng)靶細(xì)胞是患病細(xì)胞如癌細(xì)胞時(shí)，相對(duì)于與癌細(xì)胞起源的組織類型相同的正常細(xì)胞上相同分子的表達(dá)來(lái)衡量靶分子的表達(dá)水平。即，如果該患病細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞，就相對(duì)于正常乳腺細(xì)胞衡量表達(dá)水平，而相對(duì)于正常卵巢細(xì)胞上的表達(dá)水平衡量卵巢癌細(xì)胞中分子的表達(dá)水平。通常，采用細(xì)胞群體，測(cè)定表達(dá)水平的平均值(如每個(gè)細(xì)胞上表達(dá)的分子數(shù))。而且，在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，選擇具有可通過(guò)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其生物活性的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域識(shí)別和結(jié)合的細(xì)胞表面抗原。例如，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域靶向的細(xì)胞表面抗原可以是細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子受體，用結(jié)構(gòu)域阻斷所述抗原將有助于使靶細(xì)胞恢復(fù)正常表型。用這種方法，baBA的治療效果可超過(guò)單獨(dú)使用單個(gè)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的效果。例如，當(dāng)采用上述示例性bsBA時(shí)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各阻斷不同的細(xì)胞因子受體。預(yù)計(jì)受體的阻斷將導(dǎo)致被受體活化的通路下調(diào)，降低細(xì)胞的增殖速率。如上所述，也知道抗體可用作細(xì)胞因子受體等的激動(dòng)劑；g卩，它們的作用能提高耙分子活性。因此，根據(jù)實(shí)施者選擇的靶分子和結(jié)合劑，本發(fā)明bsBA的一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可抑制其耙分子的活性，而另一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可增強(qiáng)其耙分子的活性。在其它實(shí)施方式中，選擇的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒁种破涓髯缘姆肿拥幕钚裕谄渌鼘?shí)施方式中，選擇的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒃鰪?qiáng)它們各自的靶分子的活性，所述靶分子可以是相同或不同的。能夠選擇提高或降低效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的靶分子活性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閷?shí)施者提供了設(shè)計(jì)有效用于一系列情況的bsBA的相當(dāng)大的彈性。為了說(shuō)明在實(shí)施者看來(lái)可通過(guò)明智地選擇結(jié)合劑而提高或降低耙分子的活性，本文中有時(shí)將bsBA對(duì)靶分子的作用稱為"調(diào)節(jié)"靶分子的活性。例如，一些癌癥由編碼用作酪氨酸激酶的受體的基因突變引起，導(dǎo)致受體變成組成性活化或過(guò)量表達(dá)，以致于細(xì)胞比具有正常受體或具有以正常量表達(dá)的受體的情況下增殖得更多。為了降低此受體活性，在此范例中，實(shí)施者可選擇結(jié)合劑，其中已知該結(jié)合劑能通過(guò)結(jié)合而改變組成性活化受體的構(gòu)象以降低其活性，或者在過(guò)量表達(dá)受體的情況下，僅阻斷它與其天然配體的結(jié)合，從而防止過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致的靶細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不適當(dāng)增加。相反，如果耙分子是需要提高其活性的分子，實(shí)施者可選擇已知其結(jié)合能用作該活性的激動(dòng)劑的結(jié)合劑。使用具有一個(gè)高親和力結(jié)合結(jié)構(gòu)域的bsBA足以特異性結(jié)合感興趣的細(xì)胞。研究證明，含有指向一個(gè)靶分子的兩個(gè)高親和力結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合劑的親和力僅約為含有同一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一價(jià)結(jié)合劑的親和力的3倍。Nielsen,U.等，CancerRes.60(22):6434-40(2000)。單位結(jié)合劑的Kd通常為納摩爾濃度。由于治療劑的給予量一般高到微摩爾濃度，它是結(jié)合劑Kd的一千倍，所以相對(duì)于高親和力靶向結(jié)構(gòu)域的Kd，高濃度的結(jié)合劑預(yù)期可允許結(jié)合劑與攜帶耙分子的耙細(xì)胞結(jié)合。因此，預(yù)期本發(fā)明bsBA的高親和力靶向結(jié)構(gòu)域能在給藥條件下提供bsBA的特異性結(jié)合。預(yù)計(jì)實(shí)施者可選擇耙向結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的靶分子的適當(dāng)組合。雖然以下描述了許多優(yōu)選的靶分子和效應(yīng)器靶分子，但列舉出一些優(yōu)選的靶分子和效應(yīng)器靶分子可能是有幫助的。一些優(yōu)選的耙分子是EGFR和ErbB2。一些優(yōu)選的效應(yīng)器耙分子是ErbB3、ErbB4、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)受體1-4中的任何一種、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1-R)、胰島素受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)受體a和p、或C-KIT。本領(lǐng)域已知這些分子，在隨后的章節(jié)中用SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)中的參比號(hào)碼標(biāo)識(shí)各分子。定義以S國(guó)際單位制聯(lián)合會(huì)(SI)接受的形式表示單位、前綴和符號(hào)。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另有說(shuō)明，核酸從左至右是5，至3'取向；氨基酸序列從左至右是氨基至羧基取向。本文提供的標(biāo)題并不限制本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓绞剑鼈兛蓞⒖颊麄€(gè)說(shuō)明書(shū)。因此，以下所定義的術(shù)語(yǔ)更全面的定義需參照整個(gè)說(shuō)明書(shū)。本文未限定的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的通常含義。一般根據(jù)解離常數(shù)或"Kd"說(shuō)明結(jié)合劑的"親和力"。有用的結(jié)合劑的Kd—般是納摩爾濃度級(jí)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，Kd為10—SM的抗體的親和力是Kd為10^M的抗體的10倍，是Ka為10^M的抗體的親和力的IOO倍。因此，親和力較高的物質(zhì)的Kd數(shù)值較小(即數(shù)值10-8小于1(T6)。"抗體"以完整的免疫球蛋白或以許多通過(guò)各種肽酶消化而產(chǎn)生的充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在絞鏈區(qū)的二硫鍵之下消化抗體從而產(chǎn)生Fab的二聚體F(ab)'2，F(xiàn)ab本身是通過(guò)二硫鍵與VH-CH結(jié)合的輕鏈。F(ab)'2在溫和條件下可被還原，絞鏈區(qū)中的二硫鍵被打斷從而將F(ab)'2二聚體轉(zhuǎn)變成Fab'單體。Fab'單體實(shí)質(zhì)上是帶有部分絞鏈區(qū)的Fab(參見(jiàn)W.E.Paul編的《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology),RavenPress,N.Y.(1993)，以了解關(guān)于這些片段及其它抗體片段更詳細(xì)的描述)。盡管已經(jīng)根據(jù)對(duì)完整抗體的消化定義了各種抗體片段，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，可通過(guò)化學(xué)方法或利用重組DNA法從頭合成這種Fab'片段。為了方便敘述，除非文中另有說(shuō)明，本文所用術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整抗體、通過(guò)修飾完整抗體而產(chǎn)生或用重組DNA方法從頭合成的保留了抗原識(shí)別和結(jié)合能力的抗體片段、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體模擬物。抗體可以是IgM、IgG(如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"指包含完整抗體的一部分(通常是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū))的分子?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；螺旋-穩(wěn)定的抗體(參見(jiàn)例如，Amdt等，JMolBiol312:221-228(2001);雙抗體(見(jiàn)下)；單鏈Fv("scFv"，參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,888,773);二硫鍵穩(wěn)定的抗體("dsFv"，參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,747，654)和結(jié)構(gòu)域抗體("dAb"，參見(jiàn)例如，Holt等，TrendsBiotech21(11):484-490(2003)，Ghahroudi等，F(xiàn)EBSLett.414:521-526(1997)，Lauwereys等，EMBOJ17:3512-3520(1998)，Reiter等，J.Mol.Biol.290:685-698(1999)，Davies和Riechmann，Biotechnology，13:475-479(2001))。術(shù)語(yǔ)"雙抗體"指具有兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含可變重鏈結(jié)構(gòu)域(Vh)，其在同一多肽鏈(VH-VL)中連接于可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)。采用太短以致于不能使同一鏈上這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，強(qiáng)迫這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)。以下文獻(xiàn)中更全面地描述了雙抗體，例如，EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)。免疫球蛋白一般含有重鏈和輕鏈。重鏈和輕鏈各自含有恒定區(qū)和可變區(qū)(這些區(qū)域也稱為"結(jié)構(gòu)域")。輕鏈和重鏈可變區(qū)含有由三個(gè)高變區(qū)(也稱為"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR")間隔開(kāi)的"構(gòu)架"區(qū)。已限定了構(gòu)架區(qū)和CDR的區(qū)域。參見(jiàn)，Kabat和Wu，同上。不同輕鏈或重鏈的構(gòu)架區(qū)序列在物種內(nèi)相對(duì)保守?？贵w的構(gòu)架區(qū)，即組成性輕鏈和重鏈的構(gòu)架區(qū)組合，用于在三維空間中定位和排列CDR。CDR主要負(fù)責(zé)結(jié)合于抗原表位。各鏈的CDR—般稱為CDR1、CDR2和CDR3(從N末端開(kāi)始依次編號(hào))，一般也用具體CDR所在鏈識(shí)別。因此，VHCDR3位于發(fā)現(xiàn)它的抗體重鏈的可變區(qū)中，而VlCDR1是發(fā)現(xiàn)它的抗體輕鏈的可變區(qū)的CDR1。提到"VH"時(shí)或"V!;'指免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，包括Fv、scFv、dAb、dsFv或Fab。提到"VL;'時(shí)或"VL"指免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv、dAb或Fab。術(shù)語(yǔ)"單鏈Fv"或"scFv"指?jìng)鹘y(tǒng)雙鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域連接在一起形成一條鏈的抗體。任選地，將接頭(通常是肽)插入兩條鏈之間以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼郫B并產(chǎn)生活性結(jié)合位點(diǎn)。"雙特異性結(jié)合劑"或"bsBA"是能夠同時(shí)特異性結(jié)合一種以上類型的靶分子的結(jié)合分子。"結(jié)合劑"是能夠特異性結(jié)合靶分子的任何分子，包括抗體、抗體片段、適體、肽(如，Williams等，JBiolChem266:5182-5190(1991))和抗體模擬物，如可由第十種纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的模擬物(參見(jiàn)例如，Xu，L.，等，ChemBiol.9(8):933-42(2002)，Koide等，JMolBiol284:1141-1151，Skerra，JMolRecognit13:167-187(2000)，Main等，Cell,71:671-678(1992)和Dickinson等，JMolBiol，236:1079-1092(1994》，可包括天然蛋白質(zhì)和經(jīng)修飾或工程改造包含非天然殘基的蛋白質(zhì)。在一組略為次優(yōu)選的實(shí)施方式中，bsBA的一種或兩種結(jié)合結(jié)構(gòu)域的"結(jié)合劑"可以是某受體的天然配體或者是該天然配體的保留了特異性結(jié)合該受體能力的片段(例如，IL-13可用作結(jié)合IL-13受體的結(jié)合劑)。"適體"通常指一種序列確定的寡核苷酸或所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保持了特異性結(jié)合于耙分子的特性。因此，本文所用"適體"指一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸序列。從結(jié)構(gòu)上說(shuō)，本發(fā)明適體是特異性結(jié)合的寡核苷酸。寡核苷酸不僅包括具有常規(guī)堿基、糖殘基和核苷酸間連接的寡核苷酸，也包括這三部分中任一部分或所有部分被修飾的寡核苷酸。納入本文作參考的美國(guó)專利號(hào)5,756,291描述了適體、制備和測(cè)試適體的方法，及其應(yīng)用。本文所用"靶分子"指由本發(fā)明雙特異性結(jié)合劑的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的分子。本文所用術(shù)語(yǔ)"第一靶分子"和"第二靶分子"指兩種不同分子種類的分子，而不是相同分子種類的兩種分子。這種分子種類可以是(例如)兩種不同的受體酪氨酸激酶(如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體)。一些細(xì)胞因子受體和其它受體由稱為"鏈"的亞基組成，在一些情況下一旦該受體的配體結(jié)合于這些鏈之一后通過(guò)征集鏈?zhǔn)惯@些受體完全活化。如本文所用，認(rèn)為具體受體(如IL-2受體)的所有鏈都來(lái)自相同的分子種類；因此，如果給定受體的鏈?zhǔn)潜景l(fā)明bsBA的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的"第一靶分子"，"第二靶分子"不可能是同一受體的第二條鏈。本文所用"生物活性"指耙分子進(jìn)行的確定的已知活性。最常見(jiàn)的，被本發(fā)明bsBA靶向的分子的生物活性是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，本說(shuō)明書(shū)靠后一部分列舉了許多生長(zhǎng)因子受體，作為可以是耙分子的分子。這些受體一般具有細(xì)胞胞外表面上的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有酪氨酸激酶酶活性的胞漿結(jié)構(gòu)域。酪氨酸激酶活性一般由配體與配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合而激活。然后，受體激酶活性啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，這些靶分子的生物活性是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，靶分子的生物活性最終會(huì)影響靶分子所在細(xì)胞。例如，通過(guò)活化過(guò)量表達(dá)生長(zhǎng)因子受體的癌細(xì)胞中的該受體而啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能增加該細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而抑制該受體的活性可能抑制或減慢其增殖。因此，本文所用術(shù)語(yǔ)"生物活性"也可更寬泛地與細(xì)胞活性聯(lián)用，與靶分子活性形成對(duì)比。在具體上下文中會(huì)明確指出其含義。出于本發(fā)明目的，可通過(guò)以下方式確定細(xì)胞表面上的給定分子是否具有生物活性?？蓪y帶細(xì)胞表面分子的人細(xì)胞培養(yǎng)物分開(kāi)形成兩份單獨(dú)培養(yǎng)物。使第一組培養(yǎng)物接觸特異性結(jié)合于細(xì)胞表面分子并且預(yù)計(jì)能阻斷任何天然配體與該分子結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另一組培養(yǎng)物不接觸該結(jié)構(gòu)域。然后在其它條件完全相同的情況下培養(yǎng)這兩組培養(yǎng)物。出于本發(fā)明目的，如果結(jié)合劑與該分子結(jié)合沒(méi)有引發(fā)細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力、凋亡、激活下游激酶、轉(zhuǎn)錄激活、表面粘附或在軟瓊脂中產(chǎn)生集落的能力出現(xiàn)可觀察到的差異，則認(rèn)為該靶分子沒(méi)有"生物活性"。可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測(cè)定這些培養(yǎng)物在這些方面是否存在差別，下面會(huì)更加詳細(xì)地討論其中一些試驗(yàn)。本文所用生物活性的"調(diào)節(jié)"指按實(shí)施者所需提高或抑制靶分子的生物活性。例如，如果靶分子是認(rèn)為能增加癌細(xì)胞增殖的受體(如ErbB3受體)，那么實(shí)施者可能想用結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合于受體來(lái)抑制受體活性，阻斷該受體的天然配體與該受體結(jié)合。這些靶分子常常是與天然配體結(jié)合后用作酪氨酸激酶的受體。相反，如果靶分子的生物活性是實(shí)施者想要增加的一種活性，那么實(shí)施者可以(例如)用本領(lǐng)域已知抗體作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域，用作該耙分子的激動(dòng)劑。結(jié)果應(yīng)有利于治療的疾病或病癥；如治療惡性腫瘤和一些自身免疫病，所需作用通常是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)凋亡，或者可能是誘導(dǎo)某種細(xì)胞類型(如治療自身免疫病的T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)增殖。應(yīng)理解，細(xì)胞表面受體具有特異性結(jié)合于這些受體的配體。因此，對(duì)于給定的受體，術(shù)語(yǔ)"天然配體"指在正常生理過(guò)程中結(jié)合于該受體的分子。例如，白介素("IL")-13是IL-13受體的天然配體，IL-2是IL-2受體的天然配體，表皮生長(zhǎng)因子是EGF受體的天然配體，等等。術(shù)語(yǔ)"有效量"或"有效……的量"或"治療有效量"包括足以產(chǎn)生所需結(jié)果的藥物劑量，所需結(jié)果是例如抑制至少50%的細(xì)胞蛋白質(zhì)合成或殺傷細(xì)胞。"效應(yīng)器分子"定義為可用于在與結(jié)合分子如本發(fā)明bsBA的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域接觸時(shí)，通過(guò)(例如)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷酸化、誘導(dǎo)增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡而調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的細(xì)胞表面受體。"Kd"是以下反應(yīng)類型的反向速率常數(shù)和正向速率常數(shù)之比A+B=AB平衡時(shí)，平衡常數(shù)(K)等于反應(yīng)物濃度除以產(chǎn)物濃度的結(jié)果，具有濃度單位。K^(濃度AX濃度B)/(濃度AB)與例如具有兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的完整免疫球蛋白G分子相反，"一價(jià)結(jié)合劑"和"一價(jià)結(jié)合組合物"定義為具有一個(gè)結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合分子。一價(jià)結(jié)合劑一般是形成雙特異性抗體的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的分離片段，如scFv、Fab'、單結(jié)構(gòu)域抗體等。"耙細(xì)胞"是本發(fā)明雙特異性抗體結(jié)合劑以其高親和力靶向結(jié)構(gòu)域優(yōu)先結(jié)合的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"接觸"包括布置上具有直接物理聯(lián)系。本領(lǐng)域通常理解，細(xì)胞以含有脂質(zhì)雙層的質(zhì)膜(通常稱為"細(xì)胞膜")為界，各種蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、離子通道和細(xì)胞因子受體位于質(zhì)膜中。通常參見(jiàn)Alberts等，MolecularBiologyoftheCell,GarlandPublishing,Inc.,紐約(第3版，1994)，第10章?？梢哉J(rèn)為細(xì)胞膜具有面向胞漿或細(xì)胞內(nèi)部的表面和面向細(xì)胞外部或胞外空間的表面?？缒さ鞍壮３Ｊ莾捎H性分子，即它們具有疏水性區(qū)域和親水性區(qū)域。通過(guò)膜的區(qū)域是疏水性區(qū)域，并且與包括雙層的脂質(zhì)分子的疏水尾相互作用。親水性區(qū)域接觸膜的胞槳側(cè)或胞外側(cè)的水?？缒さ鞍椎目缒そY(jié)構(gòu)域是a螺旋或多條P鏈。參見(jiàn)例如Lodish等，MolecularCellBiology,W.E.Freeman&Co.，紐約(第4版，2000),第3早。"細(xì)胞因子"是一種細(xì)胞群體釋放的作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于同一細(xì)胞群體(自分泌)或另一細(xì)胞群體(旁分泌)的蛋白質(zhì)的總稱。所述細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨?；松L(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體生成素(LH);肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤(pán)催乳素；腫瘤壞死因子(X和(3;米勒管抑制物；小鼠促性腺素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);整聯(lián)蛋白；血栓形成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-p;血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-a和TGF-P;胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)如IGF-I和IGF-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);成骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素-a、-|3和-"集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)如IL-1、IL隱la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL9、IL-ll、IL-12;以及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL，也稱為"青灰因子")。除非另有說(shuō)明，本文提到抗體重鏈或輕鏈的氨基酸位置指采用"Kabat和Wu"系統(tǒng)的氨基酸編號(hào)。參見(jiàn)Kabat，E.等，《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列》(S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest)，U.S.GovernmentPrintingOffice，NIH出版號(hào)91-3242(1991)，納入本文作參考(在本文中Kabat和Wu的數(shù)據(jù)庫(kù)和編號(hào)系統(tǒng)也稱為"Kabat"系統(tǒng)和編號(hào))。Kabat和Wu數(shù)據(jù)庫(kù)是本領(lǐng)域中最廣泛采用的抗體氨基酸殘基編號(hào)系統(tǒng)，現(xiàn)在該數(shù)據(jù)庫(kù)太大以致于不能方便地印刷?，F(xiàn)在該數(shù)據(jù)庫(kù)以在線訂閱服務(wù)來(lái)維持，可通過(guò)輸入"11://"然后是'4111111皿0.1511^.11稱丄￡111/"找到。給定的重鏈或輕鏈的殘基以Kabat和Wu系統(tǒng)編碼的殘基編號(hào)不一定對(duì)應(yīng)于從該鏈氨基末端計(jì)算出編號(hào)術(shù)語(yǔ)"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"包括摻入蛋白質(zhì)、多肽或肽(總稱為"肽")的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另有限制，氨基酸可包括與天然存在的氨基酸作用方式相似的天然氨基酸類似物。當(dāng)描述蛋白質(zhì)時(shí)，"保守取代"指基本上不改變蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)的氨基酸組成改變。因此，具體氨基酸序列的"保守修飾的變異"指對(duì)蛋白質(zhì)活性來(lái)說(shuō)不重要的氨基酸的氨基酸取代或用具有相似特性的其它氨基酸進(jìn)行氨基酸取代(如酸性、堿性、帶正電或帶負(fù)電、極性或非極性等)，以致即使取代了重要氨基酸也不顯著改變活性。本領(lǐng)域熟知提供功能上相似的氨基酸的保守取代表。以下表A中的六組各自含有互為保守取代的氨基酸表A1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。也參見(jiàn)，Creighton，Proteins,W.H.FreemanandCompany,紐約(1984)。提到抗原時(shí)，術(shù)語(yǔ)"選擇性反應(yīng)"和"選擇性結(jié)合"指整個(gè)或部分抗體優(yōu)先與攜帶該抗原的細(xì)胞或組織結(jié)合，而不與缺少該抗原的細(xì)胞或組織結(jié)合。當(dāng)然應(yīng)了解，在分子與非靶細(xì)胞或組織之間可發(fā)生某種程度的非特異性相互作用。然而，可通過(guò)由抗原的特異性識(shí)別來(lái)介導(dǎo)而區(qū)分出選擇性反應(yīng)。雖然選擇性反應(yīng)抗體結(jié)合抗原，但它們的結(jié)合可能是低親和力結(jié)合。另一方面，特異性結(jié)合導(dǎo)致抗體和攜帶該抗原的細(xì)胞之間比結(jié)合抗體與缺少該抗原的細(xì)胞之間的結(jié)合得強(qiáng)得多。與缺少某靶抗原或標(biāo)記的細(xì)胞或組織相比，特異性結(jié)合一般導(dǎo)致與攜帶該靶抗原或標(biāo)記的細(xì)胞或組織結(jié)合的抗體量(每單位時(shí)間)多2倍、優(yōu)選多5倍、更優(yōu)選多10倍、最優(yōu)選多100倍。在這種條件下特異性結(jié)合于蛋白質(zhì)需要根據(jù)其對(duì)具體蛋白的特異性而選擇的抗體。多種免疫測(cè)定形式適合用于選擇與具體蛋白有特異性免疫反應(yīng)性的抗體。例如，固相ELISA免疫測(cè)定通常用于選擇與某蛋白有特異性免疫反應(yīng)性的單克隆抗體。參見(jiàn)Harlow和Lane，《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies,ALaboratoryManual),ColdSpringHarborPublications,紐約(1988)，其中描述了可用于測(cè)定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件。術(shù)語(yǔ)"免疫反應(yīng)條件"包括以下條件針對(duì)具體表位產(chǎn)生的抗體結(jié)合于該表位的程度可檢測(cè)性高于與基本上所有其它表位結(jié)合的程度、和/或基本排除與基本上所有其它表位的結(jié)合。免疫反應(yīng)條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的形式，一般是免疫測(cè)定方案中所用條件或體內(nèi)所處條件。參見(jiàn)Harlow和Lane，同上，其中描述了免疫測(cè)定形式和條件。用于本發(fā)明方法的免疫反應(yīng)條件優(yōu)選為"生理?xiàng)l件"，包括活哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一般條件(如溫度、滲透壓、pH)。雖然了解一些器官可處于極端條件下，但生物體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境通常約為pH7(即pH6.0-pH8.0，更一般是pH6.5-7.5)，含有水作為主要溶劑，并存在于0'C以上和5(TC以下的溫度中。滲透壓在支持細(xì)胞存活和增殖的范圍內(nèi)。將bsBA偶聯(lián)于治療劑或標(biāo)記雖然bsBA與其配體的結(jié)合本身可通過(guò)(例如)阻斷細(xì)胞因子接觸其受體來(lái)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生物活性，但可通過(guò)將治療劑偶聯(lián)于bsBA來(lái)增強(qiáng)bsBA對(duì)生物活性的作用。因此，在一些實(shí)施方式中，使bsBA衍生化，以引入允許連接治療劑的官能團(tuán)?？墒筨sBA衍生化，以引入(例如)以酰肼、肼、伯胺或仲胺基團(tuán)為末端的側(cè)鏈。可通過(guò)(例如)席夫堿(Schiffsbase)連接、腙或酰腙鍵、或酰肼接頭偶聯(lián)治療劑(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,474,765和5,762,918，特別將各文獻(xiàn)納入本文作參考)。本領(lǐng)域熟知許多適合用于將治療劑與本發(fā)明bsBA偶聯(lián)的化學(xué)方法，如Hermanson，G.，《生物偶聯(lián)技術(shù)》(BioconjugateTechniques),AcademicPress,加利福尼亞州圣地亞哥(1996)所述。治療劑可選自例如抗腫瘤劑、抗代謝劑、放射性物質(zhì)、細(xì)胞毒劑或化療劑。細(xì)胞毒劑包括抗癌劑，例如吉西他濱；甲氨蝶呤；5-FU;FUDR;FdUMP;羥基脲；多西他賽；discodermolide;大環(huán)內(nèi)酯類；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春堿；長(zhǎng)春瑞濱；meta-pac;伊立替康；SN-38;10-OH喜樹(shù)堿；拓?fù)涮婵?；依托泊甙；多柔比星；黃酮吡醇；順鉑；卡鉑；博來(lái)霉素；絲裂霉素C;普卡霉素；卡培他濱；阿糖胞苷；2-氯-2'脫氧腺苷；米托蒽醌；米托唑胺；噴司他丁和雷替曲塞。還可修飾或標(biāo)記本發(fā)明bsBA以有利于診斷或治療應(yīng)用。例如，可檢測(cè)性標(biāo)記如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、重金屬標(biāo)記或其它標(biāo)記可偶聯(lián)于本發(fā)明bsBA。bsBA的單標(biāo)記、雙標(biāo)記或多標(biāo)記可能是有利的。例如，bsBA可以是通過(guò)以下方式雙標(biāo)記的放射性碘化一個(gè)或多個(gè)殘基并且通過(guò)螯合基團(tuán)將(例如fV與含胺-側(cè)鏈或反應(yīng)性基團(tuán)偶聯(lián)。此組合標(biāo)記可用于特殊診斷需要，如鑒定廣泛散布的小腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊。放射性標(biāo)記本發(fā)明bsBA的放射性同位素包括可偶聯(lián)或連接于bsBA殘基的任何放射性同位素。放射性同位素可選自發(fā)射P或Y射線的放射性同位素，或者，可修飾肽物質(zhì)使其含有(例如)可共價(jià)連接于該類似物的賴氨酸殘基的螯合基團(tuán)。然后可修飾該螯合基團(tuán)，使其含有各種放射性同位素，如鎵、銦、锝、鐿、錸或鉈(如125I、67Ga、川Iti、"m丁c、169Yb、186^)?？捎抿匣鶊F(tuán)將可檢測(cè)標(biāo)記或其它分子間接偶聯(lián)于本發(fā)明bsBA。例如，可通過(guò)防止埃德曼降解的異硫氰酸酯卩-丙氨酸或合適的非a-氨基酸接頭將雙功能穩(wěn)定螯合劑連接于一個(gè)或多個(gè)末端或內(nèi)部氨基酸反應(yīng)性基團(tuán)。本領(lǐng)域已知的螯合基團(tuán)的例子包括例如，亞氨基羧基(ininocarboxylic)反應(yīng)性基團(tuán)和聚氨基聚羧基反應(yīng)性基團(tuán)、DTPA(N,N-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]甘氨酸)和DOTA(l,4,7,10-四氮雜環(huán)十二垸-1，4,7,10-四乙酸)。在癌癥診斷和治療方面，可用本發(fā)明bsBA制備診斷和成像組合物，以及將bsBA用于診斷和成像方法(如體內(nèi)和體外診斷方法)的試劑盒。例如，可用診斷有效量的連接于體內(nèi)診斷成像劑的bsBA使血管化腫瘤成像，所述bsBA至少包含結(jié)合于腫瘤細(xì)胞、腫瘤血管或腫瘤基質(zhì)的可及(accessible)組分的第一結(jié)合分子。在疾病或失調(diào)是癌癥的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過(guò)以下方式在癌癥治療前進(jìn)行預(yù)成像(a)給予動(dòng)物或患者診斷有效量的包含可檢測(cè)標(biāo)記的本發(fā)明bsBA的藥物組合物，所述bsBA具有以高親和力結(jié)合于高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞特征性受體、或者結(jié)合于腫瘤血管或腫瘤基質(zhì)的第一結(jié)合分子，和以低至少一個(gè)數(shù)量級(jí)的親和力與第二普遍表達(dá)的受體(如ErbB3或ErbB4)結(jié)合的第二結(jié)合分子；和(b)然后檢測(cè)結(jié)合于腫瘤細(xì)胞、腫瘤血管或腫瘤基質(zhì)的可檢測(cè)標(biāo)記的bsBA;從而獲得腫瘤、腫瘤血管和/或腫瘤基質(zhì)的圖像。不希望受限于理論，bsBA可通過(guò)與天然配體競(jìng)爭(zhēng)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合而降低、阻斷或抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在這種情況下，bsBA通過(guò)阻斷配體結(jié)合后誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而起作用。bsBA也可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體的內(nèi)在化/下調(diào)而起作用。內(nèi)在化/下調(diào)引起的細(xì)胞表面受體數(shù)量減少導(dǎo)致活化受體減少，這降低或防止了沿這些受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。最后，在需要受體二聚化進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下，bsBA可通過(guò)防止兩種細(xì)胞表面受體二聚化而起作用。選擇用作靶點(diǎn)和效應(yīng)器的細(xì)胞標(biāo)記用于靶向bsBA的細(xì)胞標(biāo)記在靶細(xì)胞上的表達(dá)水平一般高于非靶細(xì)胞，或者不在非靶細(xì)胞上表達(dá)。例如，與非靶細(xì)胞相比，靶標(biāo)記可在具體癌癥中高度過(guò)量表達(dá)，或者在非癌性細(xì)胞上不表達(dá)。優(yōu)選地，靶標(biāo)記參與涉及所需生物效應(yīng)的細(xì)胞的生物功能。用作效應(yīng)器的細(xì)胞標(biāo)記一般參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或趨化因子受體，在給定病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)這些效應(yīng)器是有利的。由于本發(fā)明高-低bsBA提供的選擇性，bsBA效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合的標(biāo)記的表達(dá)不需要被限定于靶細(xì)胞，也可以在生物的其它細(xì)胞上表達(dá)。測(cè)定Kd可用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定bsBA的結(jié)合分子的結(jié)合親和力，如納入本文作參考的美國(guó)專利號(hào)6,703,020所述?？赏ㄟ^(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定bsBA的第一和第二結(jié)合分子與其相應(yīng)靶受體的結(jié)合親和力以及bsBA-受體復(fù)合物的脫離速率。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)的一個(gè)例子是放射性免疫試驗(yàn)，該試驗(yàn)包括在遞增量的未標(biāo)記受體的存在下，將(例如？H或1251標(biāo)記的一種或兩種受體與感興趣的bsBA—起孵育，并檢測(cè)結(jié)合于標(biāo)記受體的bsBA。可通過(guò)(例如)Scatchard圖分析從數(shù)據(jù)中確定感興趣bsBA與具體受體的親和力和結(jié)合脫離速率。也可用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Kd，如Nielsen等(CancerRes.60(22):6434-40(2000))所述。實(shí)施例中列出了用于測(cè)定Kd的示范性試驗(yàn)。I在優(yōu)選方法中，通過(guò)用BIAcore表面等離振子共振系統(tǒng)(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)測(cè)定的結(jié)合和解離速率常數(shù)來(lái)確定bsAb的受體結(jié)合親和力。一般通過(guò)將合適量(如500共振單位)的bsBA固定在生物傳感器芯片(BIAcore)上測(cè)定bsBA與配體分子的親和力。一般在PBS中通過(guò)以下方法測(cè)定bsBA的結(jié)合和解離速率將25嗎/ml的bsBA注射到芯片表面上5分鐘，然后用緩沖溶液在芯片上沖洗5分鐘使結(jié)合劑質(zhì)解離?？捎?例如)BIAevaluation2.1軟件(BIAcore)分析結(jié)合動(dòng)力學(xué)。出于測(cè)定具體bsBA是否屬于本發(fā)明范圍的目的，在形成bsBA后測(cè)定bsBA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力(與將其置入bsBA中之前單獨(dú)測(cè)定結(jié)構(gòu)域的親和力相反)，以便測(cè)定結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相對(duì)親和力。測(cè)定所需生物學(xué)作用優(yōu)選首先在體外測(cè)定本發(fā)明bsBA的所需治療或預(yù)防活性。例如，可用于證明bsBA的治療或預(yù)防用途的體外試驗(yàn)包括bsBA對(duì)細(xì)胞系或患者組織樣品的作用?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)測(cè)定bsBA對(duì)細(xì)胞系和/或組織樣品的作用，包括例如細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞活力試驗(yàn)、蛋白質(zhì)磷酸化試驗(yàn)、蛋白激酶活性試驗(yàn)、凋亡試驗(yàn)和蛋白質(zhì)合成抑制研究等。可用抗體微陣列測(cè)定對(duì)蛋白通路中多種蛋白的作用。如Nielsen等(ProcNatlAcadSciUSA.，100(16):9330-5.(2003))("Nielsen2003")所述。然后在開(kāi)始人類臨床試驗(yàn)之前，測(cè)定bsBA在非人動(dòng)物體內(nèi)的功效。產(chǎn)生一價(jià)結(jié)合組合物當(dāng)通過(guò)化學(xué)交聯(lián)產(chǎn)生bsBA時(shí)，非交聯(lián)片段本身是一價(jià)結(jié)合片段。在遺傳連接(即重組表達(dá))的bsBA的情況下，可通過(guò)將單獨(dú)的結(jié)合蛋白克隆入可以表達(dá)和分離單價(jià)結(jié)合蛋白的表達(dá)載體中產(chǎn)生單價(jià)結(jié)合組合物。然后，可如上所述測(cè)定這種一價(jià)結(jié)合組合物的親和力。測(cè)定等效Kd可通過(guò)上述方法、用一價(jià)結(jié)合組合物測(cè)定等效Kd。比較bsBA和一價(jià)結(jié)合組合物的結(jié)合可對(duì)一價(jià)結(jié)合組合物和bsBA進(jìn)行生物活性試驗(yàn)，例如以評(píng)價(jià)其作為治療劑的有效性并比較bsBA的有效性。本領(lǐng)域已知這種試驗(yàn)并取決于靶抗原。例子包括用調(diào)蛋白或其它生長(zhǎng)因子活化后用ELISA或免疫印跡測(cè)定AKT磷酸化，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)(如WO89/06692所述)；或凋亡試驗(yàn)。為了測(cè)定磷酸化，可用標(biāo)準(zhǔn)的免疫印跡測(cè)定結(jié)合分子對(duì)(例如)效應(yīng)器分子本身或下游激酶活化的作用，或可采用抗體試驗(yàn)，如Nielsen2003(同上)所詳述。為了測(cè)定凋亡，可在體外用標(biāo)準(zhǔn)電泳或檢測(cè)凋亡細(xì)胞中DNA缺口的TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記)試驗(yàn)檢測(cè)DNA片段化。一旦細(xì)胞被固定，可用哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)原位檢測(cè)DNA鏈斷裂，TdT以不依賴模板的方式使標(biāo)記的核苷酸共價(jià)結(jié)合于這些DNA片段的3'-羥基端。可用各種化學(xué)和生物試劑監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力和增殖。例如，細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記的抗體或基于熒光的細(xì)胞活力和增殖試驗(yàn)如氣標(biāo)記的胸苷試驗(yàn)、臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)、ATCCBioproductsTMMTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，弗吉尼亞州馬納薩斯)、或€^丁^1"-811^@細(xì)胞活力試驗(yàn)(？1"01^§&，威斯康星州麥迪遜)。采用bsBA結(jié)合生長(zhǎng)因子受體本發(fā)明bsBA的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域可結(jié)合許多分子。在一系列重要的實(shí)施方式中，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合細(xì)胞表面上的生長(zhǎng)因子受體，如酪氨酸激酶受體。已知許多重要的生長(zhǎng)因子受體和其配體(如屬于表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族的受體和配體)的過(guò)量表達(dá)或不適當(dāng)活化與疾病和失調(diào)如癌癥和自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)或造成了這些疾病和失調(diào)。人們認(rèn)為，這些生長(zhǎng)因子以自分泌和/或旁分泌方式起作用，以刺激患病細(xì)胞的存活、增殖或遷移。生長(zhǎng)因子與其受體結(jié)合導(dǎo)致該受體通過(guò)(例如)受體二聚化而活化，這導(dǎo)致受體自磷酸化，然后通過(guò)一系列不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。干擾這些細(xì)胞中生長(zhǎng)因子的結(jié)合活性或酪氨酸激酶受體的活化可恢復(fù)非癌表型或降低患病細(xì)胞的增殖速率。即受體與本發(fā)明bsBA接觸能阻斷配體如生長(zhǎng)因子與其細(xì)胞表面受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)。bsBA通過(guò)防止或減少配體與受體結(jié)合，或通過(guò)防止或降低配體誘導(dǎo)的受體二聚化而防止或降低信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化?？膳cbsBA效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合以產(chǎn)生本發(fā)明方法中的有用結(jié)果的示范性酪氨酸激酶受體(括號(hào)中顯示了替代名稱)包括ALK(間變性淋巴瘤激酶)，間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)中表達(dá)為嵌合NPM-ALK蛋白的一部分的酪氨酸激酶受體；盤(pán)蛋白結(jié)構(gòu)域受體(DDR)，通過(guò)與凝集素盤(pán)蛋白I同源的獨(dú)特胞外結(jié)構(gòu)域區(qū)分的受體酪氨酸激酶(盤(pán)蛋白受體酪氨酸激酶)(酪氨酸-蛋白激酶CAK)(細(xì)胞粘附激酶)(TRKE)(蛋白酪氨酸激酶RTK6)(CD167a抗原)；盤(pán)蛋白結(jié)構(gòu)域受體2前體(受體蛋白-酪氨酸激酶TKT)(酪氨酸-蛋白激酶TYROIO)(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶，受體相關(guān)3);表皮生長(zhǎng)因子受體(受體蛋白-酪氨酸激酶ErbB-l);受體蛋白-酪氨酸激酶erbB-2(pl85erbB2)(NEU原癌基因)(C-erbB-2);受體蛋白-酪氨酸激酶erbB-3前體(c-erbB3)(酪氨酸激酶型細(xì)胞表面受體)；受體蛋白-酪氨酸激酶erbB-4(pl80erbB4)(酪氨酸激酶型細(xì)胞表面受體)；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體l(FGFR-I)(bFGF-R)(Fms樣酪氨酸激酶-2)(c-fgr);FL細(xì)胞因子受體(酪氨酸-蛋白激酶受體FLT3)(干細(xì)胞酪氨酸激酶l)(STK-l)(CD135抗原)；肥大細(xì)胞/干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(SCFR;K原癌基因酪氨酸-蛋白激酶Kit)(C-Kit)(CD117抗原)；白細(xì)胞酪氨酸激酶受體(蛋白酪氨酸激酶-l);肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Met原癌基因酪氨酸激酶)(c-met)(HGF受體)(HGF-SF受體)；蛋白-酪氨酸磷酸酶-n(R-PTP-ri)(HPTPn)(J型蛋白-酪氨酸磷酸酶受體)(密度提高的磷酸酶-l)(DEP-l)(CD148抗原)；原癌基因酪氨酸-蛋白激酶受體ret(C-ret);酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體RORl(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶，受體相關(guān)1);酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體R0R2(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶，受體相關(guān)2);酪氨酸-蛋白激酶受體Tie-l;促血管生成素1受體(酪氨酸-蛋白激酶受體TIE-2)(酪氨酸-蛋白激酶受體TEK)(P140TEK)(內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞激酶)(CD202b抗原)；高親和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(TRK1轉(zhuǎn)化酪氨酸激酶蛋白)(pl40-TrkA)(Trk-A);BDNF/NT-3生長(zhǎng)因子受體(TrkB酪氨酸激酶)(GP145-TrkB)(Trk-B);NT-3生長(zhǎng)因子受體(TrkC酪氨酸激酶)(GP145-TrkC)(Trk-C);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體l(VEGFR-l)(血管通透性因子受體)(酪氨酸-蛋白激酶受體FLT)(Flt-l)(酪氨酸-蛋白激酶FRT)(Fms樣酪氨酸激酶1);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)(激酶插入結(jié)構(gòu)域受體)(蛋白-酪氨酸激酶受體Flk-l);禾口血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3前體(EC2.7丄112)(VEGFR-3)(酪氨酸-蛋白激酶受體FLT4)。以下討論描述了關(guān)于尤其可用于與效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合的酪氨酸激酶受體，以及可用本發(fā)明方法調(diào)節(jié)的其它受體家族的更具體信息。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)/ErbB受體一次跨膜的酪氨酸激酶受體EGFR/ErbB家族由四個(gè)成員組成表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。鑒定了能結(jié)合并激活ErbB受體的許多配體，它們都是不同基因的產(chǎn)物。這些受體和配體在正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起到關(guān)鍵作用。異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或ErbB受體蛋白活化不受調(diào)節(jié)與許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)?？稍诟鞣N上皮來(lái)源的實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)功能障礙的ErbB受體通路介導(dǎo)的不受控制的細(xì)胞增殖，數(shù)據(jù)將腫瘤ErbB受體表達(dá)、過(guò)量表達(dá)和/或調(diào)節(jié)異常與晚期疾病、轉(zhuǎn)移性表型、化療耐藥性和總體預(yù)后較差相關(guān)聯(lián)。而且，數(shù)據(jù)也表明，ErbB受體涉及腫瘤入侵增加、抑制細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附增加和新生血管發(fā)生。具體說(shuō)，在更具侵襲性的乳腺癌、膀胱癌、肺癌和胃癌等癌癥中觀察到EGFR表達(dá)增力[](Modjtahedi和Dean，Int.J.Oncol.4:277-296，(1994))。人ErbB2過(guò)量表達(dá)與乳腺癌和卵巢癌(Slamon等，Science235:177-182(1987)和Slamon等，Science244:707-712(1989))以及胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌和膀胱癌相關(guān)。ErbB3水平顯著提高與某些人乳房腫瘤細(xì)胞系相關(guān)，這說(shuō)明與ErbBl和ErbB2相似，ErbB3在人惡性腫瘤中起作用。具體說(shuō)，發(fā)現(xiàn)ErbB3在乳腺癌(Lemoine等，Br.J.Cancer66:1116-1121，1992)、胃腸癌(Poller等，J.Pathol.168:275-280，1992;Rajkumer等，J.Pathol.170:271-278，1993;和Sanidas等，Int丄Cancer54:935-940，1993)和胰腺癌(Lemoine等，J.Pathol.168:269-273，1992和Friess等，ClinicalCancerResearch1:1413-1420，1995)中過(guò)量表達(dá)。最后，ErbB4表達(dá)增加也與人類癌癥如上皮來(lái)源的癌(包括乳腺癌)緊密相關(guān)。在許多情況下，在配體誘導(dǎo)受體異質(zhì)二聚化后發(fā)生蛋白受體ErbB家族介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。異質(zhì)二聚化后發(fā)生的"受體串話(cross-talking)"導(dǎo)致ErbB受體激酶結(jié)構(gòu)域激活和ErbB受體交叉磷酸化，已知受體串話在(例如)EGFR和ErbB2、ErbB2和ErbB3以及ErbB2和ErbB4之間發(fā)生(參見(jiàn)例如，Wada等，Cell61:1339-1347(1990);Plowman等，Nature336:473-475(1993);Carraway和Cantley，Cell78:5-8(1994);Riese等，Oncogene12:345-353(1996);Kokai等，Cell58:287-292(1989);Stern等，EMBOJ.7:995-1001(1988);禾PKing等，Oncogene4:13-18(1989))。其中一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合ErbB2而另一個(gè)結(jié)合ErbB3的BsBA不是十分優(yōu)選的。用于制備本發(fā)明bsBA的優(yōu)選結(jié)合分子參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,183,884、5,480,968、5,968,511、5,977,322和6,512,097;Kraus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9193-9197(1989);歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?44,961Al;禾卩Kraus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2900-2904(1993)，各自納入本文作參考。治療方法的實(shí)施方式包括癌癥以及除了癌癥以外的疾病，如免疫病、神經(jīng)病如神經(jīng)纖維瘤病和周?chē)窠?jīng)病、以及心臟病如心臟肥大。胰島素受體(IR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-R)胰島素受體和IGF-1受體是緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們是開(kāi)發(fā)兩種主要疾病(糖尿病和癌癥)的新型治療劑的重要靶點(diǎn)。糖尿病是越來(lái)越重要的全球健康問(wèn)題。它是世界衛(wèi)生組織分類為流行病的唯一一種非感染性疾病。全球糖尿病發(fā)病率為2-3%，在美國(guó)和其它西方國(guó)家提高到6%。越來(lái)越多的證據(jù)證明，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)在某些癌癥和牛皮癬中起重要作用。通過(guò)這些受體下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與以下發(fā)病機(jī)理有關(guān)，例如，腎母細(xì)胞瘤發(fā)生(Wilm'stumorigenesis)、肝母細(xì)胞瘤、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腺皮質(zhì)癌、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、前列腺癌和肺癌，它們對(duì)放療和化療有抗性。胰島素和IGF受體與ErbB受體家族緊密相關(guān)。胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)參與維持身體許多細(xì)胞的正常功能。腫瘤細(xì)胞通常表達(dá)IGF-II受體，該受體可用作自分泌生長(zhǎng)因子；偶爾甚至到達(dá)靶組織并引起腫瘤誘導(dǎo)的低血糖癥。在許多癌癥中通常過(guò)量表達(dá)IGF-I受體，許多最近的研究鑒定到從影響癌細(xì)胞增殖、粘附、遷移和細(xì)胞死亡的IGF-I受體開(kāi)始的新信號(hào)傳導(dǎo)途徑；對(duì)癌細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移很重要的功能(參見(jiàn)例如，LeRo他等，CancerLett.195:127-137(2003))。仍未將IGF-I受體看作癌癥治療劑的可能耙點(diǎn)，因?yàn)樵S多正常細(xì)胞也表達(dá)此受體?？茖W(xué)證據(jù)說(shuō)明，IGF-I受體抑制影響了與細(xì)胞增殖或腫瘤發(fā)生相關(guān)的多種胞內(nèi)信號(hào)，并提供了解釋IGF-I受體抑制如何使腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療或其它抗癌劑更敏感的可能機(jī)制。也許最重要的是，抑制IGF-I受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在多發(fā)性骨髓瘤和其它惡性血液腫瘤的臨床相關(guān)小鼠模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)患者存活期和提高化療的抗腫瘤作用。因此，應(yīng)理解，以低親和力結(jié)合分子結(jié)合于IGF-I受體的bsBA將克服優(yōu)先靶向IGF-I受體的現(xiàn)有技術(shù)治療劑的缺陷(即通過(guò)避免非靶、未患病細(xì)胞的IGF-I受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制)。在這種情況下，bsBA的高親和力結(jié)合分子優(yōu)選結(jié)合于使bsBA特異性靶向患病細(xì)胞(如需要抑制IGF-I受體受過(guò)度刺激的細(xì)胞)的細(xì)胞表面受體。一旦優(yōu)先靶向患病細(xì)胞后，bsBA的低親和力結(jié)合分子可結(jié)合于IGF-I并抑制與疾病相關(guān)的不適當(dāng)?shù)募?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。晚期乳腺癌患者的治療方案常常包括釆用細(xì)胞毒性化療。IGF-I受體是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵因子，它在晚期乳腺癌中常常過(guò)量表達(dá)，代表了這些癌癥中的主要靶點(diǎn)。也注意到，用抗-HER2/neu受體單克隆抗體(曲妥珠單抗，也稱為賀賽汀@)(它能抑制過(guò)量表達(dá)ErbB2的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng))治療乳腺癌的患者，通常會(huì)產(chǎn)生對(duì)該抗體的抗性。觀察到活化細(xì)胞存活信號(hào)的胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)千擾了曲妥珠單抗的生長(zhǎng)抑制作用。用本發(fā)明bsBA通過(guò)IGF-I受體而阻斷、降低或抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，可以恢復(fù)曲妥珠單抗誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用(參見(jiàn)例如，Lu等，J.Natl.CancerInst.93:1852-1857，2001)。因此，本發(fā)明bsBA的一個(gè)可能用途是靶向IGF-I受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以防止或延遲對(duì)曲妥珠單抗或者其它現(xiàn)有或未來(lái)的抗癌治療劑產(chǎn)生抗性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)非典型畸胎樣/桿狀腫瘤(ATT/RhT)屬于預(yù)后最差和可能致死的兒科惡性腫瘤。迄今仍不能解釋它們對(duì)細(xì)胞抑制藥物和放療的顯著抗性。IGF-I受體在細(xì)胞存活、增殖、轉(zhuǎn)化和調(diào)節(jié)凋亡中起到重要作用。IGF-I受體保護(hù)癌細(xì)胞免受各種抗癌藥和射線誘導(dǎo)的凋亡，但當(dāng)該受體被抑制劑如反義方案、顯性負(fù)突變體或形成三螺旋而阻礙時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)大量凋亡，導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。靶向IGF-I受體的本發(fā)明bsBA可用于防止或降低通過(guò)活化IGF-I受體發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而治療疾病如癌癥。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-和雌激素受體(ER)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的串話導(dǎo)致協(xié)同生長(zhǎng)。雌激素通過(guò)誘導(dǎo)IGF-I受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和胰島素受體底物(IRS)-I和IRS-2的表達(dá)而增強(qiáng)了IGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。雌激素誘導(dǎo)IGF-I受體和IRS表達(dá)導(dǎo)致IGF-I刺激后IRS-I的酪氨酸磷酸化增加，然后是促分裂原活化的蛋白激酶活化增加。這說(shuō)明，IGF-I受體活化參與了雌激素-介導(dǎo)的生長(zhǎng)和乳腺癌發(fā)病(參見(jiàn)例如，Lee等，Mol.Endocrinol.13:787-796，1999)。因此，耙向IGF-I受體的本發(fā)明bsBA可用于防止或降低通過(guò)活化IGF-I受體而發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而治療雌激素-誘導(dǎo)的乳腺癌。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是缺氧和癌基因突變誘導(dǎo)的多功能細(xì)胞因子。VEGF是在胚胎發(fā)生中產(chǎn)生和維持血管網(wǎng)絡(luò)的主要刺激物。它用作強(qiáng)效滲透性誘導(dǎo)劑、內(nèi)皮細(xì)胞趨化齊U、內(nèi)皮存活因子和內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(Thomas，J.Biol.Chem.271:603-606，1996;禾口Neufeld等，F(xiàn)ASEBJ.13:9-22，1999)。VEGF是在許多生理和病理過(guò)程中驅(qū)動(dòng)新生血管發(fā)生或血管生成的重要因子，這些生理和病理過(guò)程包括傷口愈合(Frank等，1995;Burke等，1995)、糖尿病性視網(wǎng)膜病(Alon等，1995;Malecaze等，1994)、牛皮癬(Detmar等，1994)、動(dòng)脈粥樣硬化(Inoue等，1998)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Harada等，1998;Nagashima等，1999)和實(shí)體瘤生長(zhǎng)(Plate等，1994;Claffey等，1996)。多種細(xì)胞和組織都產(chǎn)生VEGF。VEGF二聚體以高親和力結(jié)合于兩種良好表征的受體VEGFRl(FLT-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)，它們?cè)趦?nèi)皮細(xì)胞上選擇性表達(dá)(Flt-l和Flk-l是小鼠類似物)。VEGF與VEGFRl和VEGFR2結(jié)合的Kd分別為15-100pM和400-800pM(Terman等，1994)。最近鑒定到的第三種細(xì)胞表面蛋白一神經(jīng)氈蛋白-1也以高親和力結(jié)合VEGF(如Soker等，Cell.92(6):735-45(1998))。VEGFRl和VEGFR2是III型受體酪氨酸激酶(RTKIII)家族的成員，該家族的特征是七個(gè)胞外IgG-樣重復(fù)、一次跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)分裂的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(Mustonen和Alitalo，JCellBiol129:895-898(1995))。直到最近，認(rèn)為VEGFRl和VEGFR2幾乎僅在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)(同前)。最近的研究證明，VEGF、VEGFRl和VEGFR2各自是血管生成、新生血管發(fā)生和胚胎發(fā)育所必需的。VEGFRl對(duì)VEGF的親和力高于VEGFR2，但它的酪氨酸激酶活性較低。相信VEGF二聚體與VEGF受體結(jié)合能誘導(dǎo)受體二聚化。然后，受體二聚化引起特定酪氨酸殘基的自身轉(zhuǎn)磷酸化，這導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。仍不太清楚VEGF-誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中再下游的胞內(nèi)事件，但許多研究小組證明，在VEGF活化VEGFR2后產(chǎn)生一氧化氮(NO)(Kroll和Waltenberger，BiochemBiophysResCommun.252(3):743-6(1998))。也已證明，VEGF活化VEGFR2而非VEGFRl能激活Src和Ras-MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括MAP激酶、ERK1禾tl2(Kroll和Waltenberger,JBiolChem.272(51):32521-7(1997))。用于制備本發(fā)明bsBA的優(yōu)選結(jié)合分子參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,840,301、5,874,542、6,703,020和WO99/40118，各自納入本文作參考。用于制備bsBA的優(yōu)選結(jié)合分子是單克隆抗體2C3(ATCCPTA1595)。抗VEGF受體的RNA適體、反義分子和核酶也可用作bsBA中的結(jié)合分子。優(yōu)選的RNA反義分子、適體和核酶參見(jiàn)例如，Saleh等，CancerRes.56(2):393-401(1996);Cheng等，ProcNatlAcadSciUSA.93(16):8502-7(1996);Ke等，IntJOncol.12(6):1391-6(1998);和Parry等，NucleicAcidsRes.27(13):2569-77(1999);各自納入本文作參考。使用本發(fā)明的組合物和方法尤其可用于患有以下疾病或處于發(fā)生以下疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的動(dòng)物和患者(如人患者)任何形式的血管化腫瘤；黃斑變性，包括與年齡相關(guān)的黃斑變性；關(guān)節(jié)炎，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；糖尿病性視網(wǎng)膜病和其它視網(wǎng)膜??；甲狀腺增生，包括格雷夫斯病；血管瘤；新生血管性青光眼和牛皮癬，這些疾病與VEGF受體的不適當(dāng)或過(guò)度活化相關(guān)。使用本發(fā)明的組合物和方法還可用于治療患有以下疾病或處于發(fā)生以下疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的動(dòng)物和患者動(dòng)靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤和血管再狹窄，包括血管成形術(shù)后再狹窄，也與VEGF受體的不適當(dāng)或過(guò)度活化相關(guān)的疾病。所考慮的治療方法和應(yīng)用的其它靶點(diǎn)是患有以下VEGF受體相關(guān)性疾病或處于發(fā)生這種疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的動(dòng)物和患者血管纖維瘤、皮炎、子宮內(nèi)膜異位、血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、炎性疾病和失調(diào)、化膿性肉芽腫、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘附。上述治療組并未窮舉可用本發(fā)明bsBA治療的疾病。納入本文作為參考的美國(guó)專利號(hào)5,712,291公開(kāi)了當(dāng)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域指向VEGF受體之一時(shí)可用本發(fā)明bsBA有效治療的許多其它疾病的鑒定方法。而且，可用具有結(jié)合VEGFR的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明bsBA治療的其它疾病可參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利號(hào)6,703,020，納入本文作參考。腫瘤壞死因子受體(TNFR)腫瘤壞死因子(TNF)a和(3是通過(guò)TNF受體調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過(guò)程(包括保護(hù)免受感染以及誘導(dǎo)休克和炎性疾病)的細(xì)胞因子。TNF分子屬于"TNF-配體"超家族，與其受體或反配體('TNF-受體"超家族)一起起作用。迄今為止，鑒定了TNF配體超家族的九個(gè)成員，表征了TNF受體超家族的十個(gè)成員。這些配體包括TNF-、淋巴毒素-(LT-，也稱為T(mén)NF-p)、LT-P(在復(fù)合型異質(zhì)三聚體LT-2-(3中發(fā)現(xiàn))、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-lBBL、OX40L和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)。TNF受體超家族包括p55TNF受體、p75TNF受體、TNF受體相關(guān)蛋白、FAS抗原或APO-I、CD40、CD27、CD30、4-lBB、OX40、低親和p75和NGF-受體(參見(jiàn)例如，A.Meager，Biologicals22:291-295，1994)。活化的T細(xì)胞使TNF-配體超家族的許多成員得以表達(dá)，說(shuō)明它們是T細(xì)胞與實(shí)現(xiàn)細(xì)胞個(gè)體發(fā)生和功能的其它細(xì)胞類型相互作用所必需的。(Meager1994，同上)。對(duì)TNF受體家族幾個(gè)成員的必要功能的深入了解獲自鑒定和產(chǎn)生了消除這些蛋白表達(dá)的突變。例如，F(xiàn)AS抗原和其配體中天然產(chǎn)生的突變引起淋巴組織增生病(參見(jiàn)例如，Watanabe-Fukunaga等，Nature356:314，1992)，可能反映出程序化細(xì)胞死亡失敗。CD40配體的突變引起X-聯(lián)鎖免疫缺陷疾病，特征是血漿中高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G，表明錯(cuò)誤的T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞活化(參見(jiàn)例如，R.C.Allen等，Science259:990，1993)。低親和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的耙向突變引起一種疾病，其特征是外圍結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤的感受創(chuàng)新(sensoryinnovation)(參見(jiàn)例如，Lee等，Ce歸:737，1992)。TNFR配體TNF和LT-能夠結(jié)合于兩種TNF受體(55-和75-kdTNF受體)。TNF和LT-(通過(guò)它們的受體)引發(fā)的大量生物學(xué)作用包括移植腫瘤的出血性壞死、細(xì)胞毒性、在內(nèi)毒素性休克中的作用、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、增殖和抗病毒反應(yīng)、以及保護(hù)免受電離輻射的有害作用。TNF和LT-參與了多種疾病的發(fā)病機(jī)理，包括內(nèi)毒素性休克、腦型瘧、腫瘤、自身免疫病、AIDS和移植物-宿主排斥(Beutler和VonHuffel，Science264:667-668，1994)。p55受體中的突變引起對(duì)微生物感染的易感性增加。另一種TNFR，TNF-相關(guān)性凋亡誘導(dǎo)配體或"TRAIL"在許多人組織中表達(dá)(如脾、肺、前列腺、胸腺、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血淋巴細(xì)胞、胎盤(pán)、腎)。據(jù)證明，TRAIL獨(dú)立于FAS配體起作用，并快速激活凋亡，其激活凋亡的時(shí)間范圍類似于Fas/Apo-lL死亡信號(hào)途徑，但比TNF-誘導(dǎo)的凋亡快得多。已知腫瘤壞死因子(TNF)家族配體屬于最多效的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)許多細(xì)胞應(yīng)答，包括細(xì)胞毒性、抗病毒活性、免疫調(diào)節(jié)活性和幾種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。對(duì)TNF-家族配體的細(xì)胞應(yīng)答不僅包括正常生理應(yīng)答，還包括與凋亡增加或凋亡抑制相關(guān)的疾病。凋亡-程序性細(xì)胞死亡是參與清除免疫系統(tǒng)的外周T淋巴細(xì)胞的生理機(jī)制，其失調(diào)可導(dǎo)致許多不同的病理過(guò)程。與細(xì)胞存活增加或凋亡抑制相關(guān)的疾病包括癌癥、自身免疫病、病毒感染、炎癥、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。與凋亡增加相關(guān)的疾病包括AIDS、神經(jīng)變性疾病、骨髓發(fā)育異常綜合征、局部缺血傷口、毒素誘導(dǎo)的肝病、感染性休克、惡病質(zhì)和食欲缺乏。可制備本發(fā)明bsBA，使兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中至少一個(gè)特異性結(jié)合于TNFR。那么，這種bsBA可通過(guò)活化TNFR如結(jié)合TNFR，而促進(jìn)凋亡以及防止或降低不適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長(zhǎng)(如在癌癥的情況下)，從而可用于治療以下疾病的方法中癌癥、自身免疫病、病毒感染、炎癥、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。在優(yōu)選實(shí)施方式中，bsBA的結(jié)合分子之一結(jié)合于TNFR，第二結(jié)合分子結(jié)合于已知在耙細(xì)胞上表達(dá)的第二受體(如第二不同的TNFR，或疾病特異性受體)。在癌癥的情況下，優(yōu)選的第二受體是ErbB家族的受體，如ErbB2。優(yōu)選的是，結(jié)合TNFR的bsBA結(jié)合分子的親和力比第二結(jié)合分子對(duì)其受體的親合力低?；蛘?，可制備本發(fā)明bsBA，以使bsBA的兩個(gè)結(jié)合分子中至少一個(gè)特異性結(jié)合于TNFR，(例如)通過(guò)阻斷配體與TNFR結(jié)合防止和減少了TNFR活化。那么，這種bsBA可通過(guò)(例如)防止和減少配體與TNFR結(jié)合而防止和減少TNFR活化，從而防止或減少凋亡，從而用于治療以下疾病的方法中AIDS、神經(jīng)變性疾病、骨髓發(fā)育異常綜合征、局部缺血傷口、毒素誘導(dǎo)的肝病、感染性休克、惡病質(zhì)和食欲缺乏。優(yōu)選地，用兩種結(jié)合分子中至少一種特異性結(jié)合于TNFR的bsBA治療顯示出凋亡增加的疾病(如局部缺血傷口)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域指向靶細(xì)胞上表達(dá)的抗原或第二受體(即除了TNFR以外的受體)，它用于使bsBA耙向耙細(xì)胞。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)信號(hào)傳導(dǎo)途徑是正常發(fā)育和傷口愈合的重要部分。FGF通過(guò)細(xì)胞表面受體產(chǎn)生其作用，其是酪氨酸激酶家族成員。在人類中鑒定了4種不同的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)(FGFR1-FGFR4)。FGFR在二聚化后通過(guò)自磷酸化而活化。在硫酸乙酰肝素的存在下配體結(jié)合后發(fā)生二聚化，導(dǎo)致FGFR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中幾個(gè)酪氨酸殘基磷酸化。FGFR的磷酸化激活激酶活性并導(dǎo)致MAPK、PD激酶和Statl/3通路激活。FGFR基因中的突變一般產(chǎn)生獲能(gain-of-function)突變，造成由于受體被不適當(dāng)活化引起的疾病或失調(diào)。FGFR突變與幾種發(fā)育失調(diào)相關(guān)，包括例如發(fā)否綜合征、杰-韋綜合征(Jackson-WeissSyndrome)、克魯宗綜合征、阿佩爾綜合征、Beare-StevensonCutisGyrata綜合征、塞-科綜合征、軟骨發(fā)育不全、侏儒性發(fā)育不良、軟骨發(fā)育不良、Muenke綜合征以及嚴(yán)重性軟骨發(fā)育不全伴發(fā)發(fā)育遲緩和黑棘皮病(SADDAN)的發(fā)育異常。通過(guò)免疫組化與正常組織比較時(shí)也發(fā)現(xiàn)FGFR在許多腫瘤樣品中過(guò)量表達(dá)。例如，在原發(fā)性結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中鑒定到FGFR過(guò)量表達(dá)。FGF分子用作促分裂原因子、新生血管發(fā)生因子和抗凋亡因子，并可能參與了癌癥發(fā)生?？芍苽浔景l(fā)明bsBA，以使bsBA的兩個(gè)結(jié)合分子中至少一個(gè)特異性結(jié)合于FGFR，(例如)通過(guò)阻斷配體與FGFR結(jié)合或者防止或減少FGFR二聚化而防止和減少FGFR的活化。那么，這種bsBA可用于通過(guò)防止或減少FGFR活化而治療以下疾病的方法中發(fā)否綜合征、杰-韋綜合征、克魯宗綜合征、阿佩爾綜合征、Beare-StevensonCutisGyrata綜合征、塞-科綜合征、軟骨發(fā)育不全、侏儒性發(fā)育不良、軟骨發(fā)育不良、Muenke綜合征以及嚴(yán)重性軟骨發(fā)育不全伴發(fā)發(fā)育遲緩和黑棘皮病(SADDAN)的發(fā)育異常、原發(fā)性結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。在優(yōu)選實(shí)施方式中，bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域指向靶細(xì)胞上表達(dá)的第二受體(即除FGFR以外的受體)，該耙向結(jié)構(gòu)域用于使bsBA靶向靶細(xì)胞。血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)PDGFR家族能活化下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，這些酶刺激結(jié)締組織細(xì)胞如血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)、少突膠質(zhì)細(xì)胞(包裹神經(jīng)纖維的組織的細(xì)胞)和軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)。PDGFp受體是指導(dǎo)VSMC分化所必需的。PDGFR通路的過(guò)量表達(dá)與多種嚴(yán)重疾病(包括動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥)相關(guān)，這些疾病與PDGFR的不適當(dāng)活化或活化增加有關(guān)?；蛘撸赡苄枰龠M(jìn)PDGFR活化，以促進(jìn)骨、牙周組織、韌帶和軟骨的修復(fù)?？芍苽浔景l(fā)明bsBA，以使bsBA的兩個(gè)結(jié)合分子中至少一個(gè)特異性結(jié)合于PDGFR，(例如)通過(guò)阻斷配體與PDGFR結(jié)合而防止和減少PDGFR活化。那么，這種bsBA可用于通過(guò)防止或減少PDGFR活化而治療以下疾病的方法中如動(dòng)脈硬化和癌癥。在優(yōu)選實(shí)施方式中，bsBA的第二結(jié)合分子指向靶細(xì)胞上表達(dá)的第二受體(即除了PDGFR以外的受體)，它用于使bsBA靶向靶細(xì)胞。優(yōu)選地，結(jié)合PDGFR的bsBA結(jié)合分子的親和力比第二分子與其受體的親和力低?；蛘撸芍苽浔景l(fā)明bsBA,以使bsBA的兩個(gè)結(jié)合分子中至少一個(gè)特異性結(jié)合于并活化PDGFR。那么，此種bsBA可用于通過(guò)活化PDGFR而促進(jìn)骨、牙周組織、韌帶和軟骨的修復(fù)的方法。在優(yōu)選實(shí)施方式中，bsBA的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合PDGFR，靶向結(jié)構(gòu)域結(jié)合于已知在耙細(xì)胞上表達(dá)的抗原或第二受體(如第二不同的PDGFR，或骨-、牙周組織-、韌帶-或軟骨-特異性受體)。C-Kit受體(也稱為青灰因子受體)C-Kit原癌基因是黑色素細(xì)胞發(fā)育和增殖中重要的跨膜酪氨酸激酶類型的受體。原癌基因C-Kit編碼的跨膜酪氨酸激酶受體與血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF/CSF-1(c-fms)受體亞家族有關(guān)。發(fā)現(xiàn)C-Kit在胚胎黑色素母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化中起核心作用。黑色素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和人黑色素瘤的進(jìn)展與缺少C-Kit原癌基因表達(dá)有關(guān)。在腫瘤生長(zhǎng)和人黑色素瘤侵入期間，C-Kit原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體的表達(dá)逐漸降低?？芍苽浔景l(fā)明bsBA，以使bsBA的兩個(gè)結(jié)合分子中至少一個(gè)特異性結(jié)合于和活化C-Kit受體。那么，此種bsBA可用于治療(例如)黑色素瘤的方法中。在優(yōu)選實(shí)施方式中，bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域指向耙細(xì)胞上表達(dá)的抗原或第二受體(即除了C-Kit受體以外的受體)，它用于使bsBA耙向耙細(xì)胞。Fc受體(FcR)Fc受體是抗原-抗體復(fù)合物或聚集的免疫球蛋白的特異性細(xì)胞表面受體，其結(jié)合免疫球蛋白分子Fc部分中的位點(diǎn)，并可能對(duì)具體免疫球蛋白類型具有特異性。在B細(xì)胞、K細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜伊紅粒細(xì)胞上，以及在一些發(fā)育階段的T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)FcR;在K細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上的FcR結(jié)合于與抗原結(jié)合的調(diào)理抗體并引發(fā)抗原的吞噬作用。已知人FcR與自身免疫病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性血小板生成性紫癜、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎和甲狀腺相關(guān)性眼病)和對(duì)過(guò)敏原的過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。FcR的天然抑制負(fù)責(zé)維持外周耐受，從而防止發(fā)生自身免疫和自身免疫病。相反，F(xiàn)cR活化的缺陷產(chǎn)生保護(hù)性表型，將自身免疫與自身免疫病分開(kāi)?？芍苽浔景l(fā)明bsBA，以使bsBA的兩個(gè)結(jié)合分子中至少一個(gè)特異性結(jié)合于FcR，(例如)通過(guò)阻斷FcR與免疫細(xì)胞上的Ig分子結(jié)合而防止和減少FcR的活化。那么，此種bsBA可用于治療以下疾病的方法中例如，自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼痛、自身免疫性血小板生成性紫癜、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎和甲狀腺相關(guān)性眼病。bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域一般指向靶細(xì)胞上表達(dá)的抗原或第二受體(即除FcR以外的受體)，它用于使bsBA耙向耙細(xì)胞。用bsBA結(jié)合細(xì)胞因子受體在一組重要的實(shí)施方式中，可用靶向結(jié)構(gòu)域或效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域或者這兩者結(jié)合細(xì)胞表面上的細(xì)胞因子受體?？砂葱枧cbsBA的靶向結(jié)構(gòu)域或效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合以產(chǎn)生本發(fā)明方法的有用結(jié)果的示范性細(xì)胞因子受體(括號(hào)中顯示了可選名稱)包括細(xì)胞因子受體共同含有的y鏈(y-c)(白介素-2受體y鏈)(il-2ry鏈)(p64)(cd132抗原)；白介素-10受體a鏈(IL-10r-A)(IL-10r1);白介素-10受體p鏈(IL-10R-B)(IL-10R2)(n型細(xì)胞因子受體CRF2-4);白介素-12受體p-l鏈(IL-12R-(31)(白介素-12受體p)(IL-12受體(3組分)(IL-12RB1);白介素-12受體P-2鏈(IL-12受體P-2)(IL-12R-P2);白介素-13受體a-l鏈(IL-13R-a-l)(IL-13RA-l)(CD213al抗原)；白介素-13受體a-2鏈(白介素-13結(jié)合蛋白)；白介素-17受體(IL-17受體)；白介素-17B受體(IL-17B受體)(IL-17受體同源物l)(IL-17Rhl)(IL17Rhl)(細(xì)胞因子受體CRL4)(UNQ2501/PRO19612);白介素21受體前體(IL-21R);白介素-1受體，I型(IL-lR-l)(IL-lR-a)(P80)(抗原CD121a);白介素-1受體，II型(IL-lR-2)(IL-lR-[3)(抗原CDwl21b);白介素-1受體拮抗性蛋白(IL-lra)(IRAP)(ILl抑制物)(IL-1RN)(ICIL-1RA);白介素-2受體a鏈(IL-2受體a亞基)(P55)(TAC抗原)(CD25抗原)；白介素-2受體|3鏈(IL-2受體)(P70-75)(高親和力IL-2受體(3亞基)(CD122抗原)；白介素-3受體a鏈(IL-3R-a)(CD123抗原)；白介素-4受體a鏈(IL-4R-a)(CD124抗原)；白介素-5受體a鏈(IL-5R-a)(CD125抗原)；白介素-6受體a鏈(IL-6R-a)(IL-6Rl)(CD126抗原)；白介素-6受體(3鏈(IL-6R-p)(白介素6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物)(膜糖蛋白130)(gpl30)(制瘤素M受體)(CDwl30)(CD130抗原)；白介素-7受體a鏈(IL-7R-a)(CDwl27)(CD127抗原)；高親和力白介素-8受體A(IL-8RA)(IL-8受體1型)(CXCR-l)(CDwl28a);高親和力白介素-8受體B(IL-8RB)(CXCR-2)(GRO/MGSA受體)(IL-8受體2型)(CDwl28b);白介素-9受體(IL-9R);白介素-18受體l(ILl受體-相關(guān)蛋白)(IL-lRrp);白介素-1受體-樣1前體(ST2蛋白)；白介素-1受體-樣2(IL-lRrp2)(白介素-l受體相關(guān)蛋白2)(ILlR-rp2);Toll樣受體1(Toll/白介素-l受體-樣)(TIL);Toll樣受體2(Toll/白介素1受體樣蛋白4);Toll樣受體5(Toll/白介素-l受體樣蛋白3);CX3C趨化因子受體1(C-X3-CCKR-I)(CX3CRl)(Fractalkine受體)(GPR13)(V28)(P趨化因子受體樣l)(CMK-BRL-l)(CMKBLRl);C-X-C趨化因子受體3型(CXC-R3)(CXCR-3)(CKR-L2)(CD183抗原)；C-X-C趨化因子受體4型(CXC-R4)(CXCR-4)(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1受體)(SDF-I受體)(融蛋白)(白細(xì)胞衍生的七次跨膜結(jié)構(gòu)域受體)(LESTR)(LCR1)(FB22)(NPYRL)(HM89)(CD184抗原)；C-X-C趨化因子受體5型(CXC-R5)(CXCR-5)(伯基特淋巴瘤受體1)(單核細(xì)胞衍生的受體15)(MDR15);C-X-C趨化因子受體6型(CXC-R6)(CXCR-6)(G蛋白偶聯(lián)受體bonzo)(G蛋白偶聯(lián)受體STRL33);趨化因子結(jié)合蛋白2(趨化因子-結(jié)合蛋白D6)(C-C趨化因子受體D6)(趨化因子受體CCR-9)(CC-趨化因子受體CCR10);C-C趨化因子受體1型(C-CCKR-1)(CC-CKR-1)(CCR-1)(CCR1)(巨噬細(xì)胞炎性蛋白-la受體)(MIP-la-R)(RANTES-R)(HM145)(LD78受體)；C-C趨化因子受體2型(C-CCKR-2)(CC-CKR-2)(CCR-2)(CCR2)(單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白1受體)(MCP-1-R);C-C趨化因子受體3型(C-CCKR-3)(CC-CKR-3)(CCR-3)(CCR3)(CKR3)(嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白受體)；C-C趨化因子受體4型(C-CCKR-4)(CC-CKR-4)(CCR-4)(CCR4)(K5-5);C-C趨化因子受體5型(C-CCKR-5)(CC-CKR-5)(CCR-5)(CCR5)(HIV-I融合共同受體)(CHEMR13)(CD195抗原)；C-C趨化因子受體6型(C-CCKR-6)(CC-CKR-6)(CCR-6)(LARC受體)(GPR-CY4)(GPRCY4)(趨化因子受體樣3)(CKR-L3)(DRY6);C-C趨化因子受體7型前體(C-CCKR-7)(CC-CKR-7)(CCR-7)(MIP-3p受體)(EBV誘導(dǎo)的G蛋白偶聯(lián)受體1)(EBI1)(BLR2);C-C趨化因子受體8型(C-CCKR-8)(CC-CKR-8)(CCR-8)(GPR-CY6)(GPRCY6)(趨化因子受體樣1)(CKR-Ll)(TERl)(CMKBRL2)(CC-趨化因子受體CHEMR1);C-C趨化因子受體9型(C-CCKR-9)(CC-CKR-9)(CCR-9)(GPR-9-6);C-C趨化因子受體10型(C-CCKR-10)(CC-CKR-10)(CCR-10)(G-蛋白偶聯(lián)受體2);C-C趨化因子受體11型(C-CCKR-11)(CC-CKR-11)(CCR-11)(趨化因子受體樣1)(CCRL1)(CCXCKR);趨化因子受體樣1(G-蛋白偶聯(lián)受體DEZ)(G蛋白偶聯(lián)受體ChemR23)，趨化因子受體樣2(IL8-相關(guān)受體DRY12)(流動(dòng)誘導(dǎo)的內(nèi)皮G蛋白偶聯(lián)受體)(FEG-1)(G蛋白偶聯(lián)受體GPR30)(GPCR-BR);趨化因子X(jué)C受體1(XC趨化因子受體l)(淋巴細(xì)胞趨化蛋白受體乂G蛋白偶聯(lián)受體5)。用bsBA結(jié)合腫瘤相關(guān)性抗原在一組特別重要的實(shí)施方式中，bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域結(jié)合于腫瘤相關(guān)性抗原。顧名思義，腫瘤相關(guān)性抗原(TAA)—般是具體腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原，但這些抗原一般不在正常細(xì)胞中表達(dá)。TAA常常是僅在生物發(fā)育的特定階段上(如胎兒發(fā)育期間)在細(xì)胞中正常表達(dá)的抗原和在生物目前的發(fā)育階段中不適當(dāng)表達(dá)的抗原，或者是在現(xiàn)在表達(dá)該抗原的器官的正常組織或細(xì)胞中不表達(dá)的抗原。本領(lǐng)域已知許多TAA，包括MART-1、癌胚抗原("CEA")、gp100、MAGE-1、HER-2和LewisY抗原，以及(例如)美國(guó)專利號(hào)5,922,566和6,020,478以及WO2004/016643A2中鑒定的抗原。適合用本發(fā)明bsBA靶向的其它腫瘤相關(guān)性抗原包括-造血分化抗原--通常與分化群(CD)分組相關(guān)的糖蛋白，如CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD45、CD52和CD147;-細(xì)胞表面分化抗原，包括糖蛋白，如癌胚抗原(CEA，Swiss-Prot編號(hào)P06731)，唾液酸Tn糖蛋白(TAG-72)，多態(tài)性上皮粘蛋白(PEM)，上皮細(xì)胞粘附分子(Ep-CAM)，MUC-1，A33，G250，E-鈣粘著蛋A，前列腺特異性膜抗原(PSMA，Swiss-Prot編號(hào)Q04609)和前列腺特異性抗原(PSA)，糖脂，如神經(jīng)節(jié)苷脂，如GD2、GD3、GM2)和糖，如血型相關(guān)抗原，包括LEY和LEb(LEY是"LewisY"，也稱為"CD174";它是在糖脂和糖蛋白的2型血型寡糖上發(fā)現(xiàn)的二巖藻糖基化四糖)；-生長(zhǎng)因子受體，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR，ErbBl，Swiss-Prot編號(hào)P00533)和其突變形式EGFRvIII、ErbB2(HER-2/neu，Swiss-Prot編號(hào)P04626)、ErbB3(HER-3，Swiss-Prot編號(hào)P21860)和IL-2受體。-新生血管發(fā)生和基質(zhì)抗原，包括成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、腱生蛋白和整聯(lián)蛋白；和-Frizzled受體家族(如Fz-2)在一些實(shí)施方式中，bsBA的靶向結(jié)構(gòu)域靶向結(jié)合TAA，而效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合于生長(zhǎng)因子受體。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，靶向結(jié)構(gòu)域靶向選自下組的分子CEA(Swiss-Prot編號(hào)P06731)、ErbB2(Swiss陽(yáng)Prot編號(hào)P04626)、EGFR(Swiss-Prot編號(hào)P00533)、LewisY、MUC-l(Swiss-Prot編號(hào)P15941)、EpCAM(mAb17-1A(依決洛單抗，Panorex,GlaxoWellcomeGmbH)的耙點(diǎn))、CA125(Swiss-Prot編號(hào)Q96RK2)、PSMA(Swiss-Prot編號(hào)Q04609)、TAG72抗體的耙點(diǎn)、CD20(Swiss-Prot編號(hào)PI1836)、CD19(Swiss-Prot編號(hào)P15391)、CD22(Swiss-Prot編號(hào)P20273)和CD36(Swiss-Prot編號(hào)P16671)。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合于選自下組的分子ErbB3(Swiss-Prot編號(hào)P21860)、ErbB4(Swiss-Prot編號(hào)Q15303)、FGF受體l-4(Swiss-Prot編號(hào)P22455、P11362、P21802、P22607)、HGF受體(Swiss-Prot編號(hào)P08581)、IGFl誦R(Swiss-Prot編號(hào)P08069)、胰島素受體(Swiss-Prot編號(hào)P06213)、PDGF受體a和|3(Swiss-Prot編號(hào)分別為P16234、P09619)或C-KIT(Swiss-Prot編號(hào)P10721)。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶向結(jié)構(gòu)域結(jié)合于上一自然段所述分子，效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域結(jié)合于本自然段所述分子。適體可如納入本文作參考的美國(guó)專利號(hào)5,756,291所述，制備結(jié)合分子之一或二者是適體的BsBA。通常通過(guò)"SELEX"("配體通過(guò)指數(shù)富集進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化"的縮寫(xiě))法制備適體。這是重復(fù)的過(guò)程，用于鑒定所選擇分子靶點(diǎn)的適體。一開(kāi)始，產(chǎn)生一個(gè)大的核酸分子"文庫(kù)"。在選擇步驟中，分離與感興趣耙點(diǎn)親和力最大的分子。使此核苷酸序列文庫(kù)暴露于細(xì)胞表面蛋白，孵育一段時(shí)間。洗掉文庫(kù)中與耙點(diǎn)親和力弱或無(wú)親和力的分子，從靶點(diǎn)上純化掉靶點(diǎn)結(jié)合分子(其中是親和力最高的適體)，用于SELEX方法的后續(xù)步驟。用酶學(xué)方法拷貝或"擴(kuò)增"捕獲的純化序列，產(chǎn)生新的分子文庫(kù)，該文庫(kù)中大量富集了可結(jié)合靶點(diǎn)的分子。用富集的文庫(kù)啟動(dòng)新一輪選擇、劃分和擴(kuò)增。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行5-15個(gè)循環(huán)后，該分子文庫(kù)從1015個(gè)獨(dú)特序列減少到與感興趣細(xì)胞表面蛋白緊密結(jié)合的少量序列。然后，分離混合物中的單個(gè)分子，測(cè)定它們的核苷酸序列，并測(cè)定它們的結(jié)合親和力特性(主要是與抗體的結(jié)合親和力)。還常常提純適體，以清除不產(chǎn)生耙點(diǎn)結(jié)合或適體結(jié)構(gòu)的核苷酸。截短至其核心結(jié)合結(jié)構(gòu)域的適體的長(zhǎng)度一般為15-60個(gè)核苷酸?？赏ㄟ^(guò)核苷酸接頭或化學(xué)交聯(lián)連接兩種適體，形成雙特異性適體，或者類似地，可將一種適體連接于抗體或抗體片段，形成嵌合抗體-DNA分子。通過(guò)化學(xué)交聯(lián)產(chǎn)生雙特異性BA可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)偶聯(lián)方法連接雙特異性阻斷劑如雙特異性抗體的兩種結(jié)合分子，如Hermanson，同上所述。在一些實(shí)施方式中，用化學(xué)連接連接bsBA的這兩種結(jié)合分子。用化學(xué)連接制備的現(xiàn)有雙特異性抗體的一個(gè)例子見(jiàn)Brennan等，(Science,229:81(1985))，也可用于制備本發(fā)明bsBA。蛋白酶水解切割完整抗體，產(chǎn)生F(ab')2片段。在二巰基絡(luò)合劑亞砷酸鈉的存在下還原這些片段，以穩(wěn)定鄰近的二巰基并防止形成分子間二硫鍵。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后，再通過(guò)巰基乙胺還原將Fab'-TNB衍生物之一轉(zhuǎn)化為Fab'-硫醇，將其與等摩爾量的其它Fab'-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。另一優(yōu)選的化學(xué)連接采用雙馬來(lái)酰亞氨基己垸或雙馬來(lái)酰亞氨基乙烷來(lái)交聯(lián)。也可用重組方法制備含有-SH基團(tuán)用于交聯(lián)的抗體片段(如Shalaby等，J.Exp.Med.，175:217-225(1992))，以避免蛋白酶水解切割全長(zhǎng)抗體。通過(guò)重組或合成技術(shù)產(chǎn)生bsBA也可用重組技術(shù)制備BsBA?？赏ㄟ^(guò)任何合適方法制備編碼bsBA的核酸序列，這些方法包括例如，克隆合適序列或通過(guò)以下方法直接化學(xué)合成例如Narang等，Meth.Enzymol.68:90-99(1979)的磷酸三酉旨法；Brown等，Meth.Enzymol.68:109-151(1979)的磷酸二酯法；Beaucage等，Tetra.Lett.22:1859-1862(1981)的二乙基亞磷酰胺法；Beaucage和Caruthers，Tetra.Letts.22(20):1859-1862(1981)所述的固相亞磷酰胺三酯法，如采用自動(dòng)化合成儀，例如Needham-VanDevanter等，Nucl.AcidsRes.12:6159-6168(1984)所述；以及，美國(guó)專利號(hào)4，458，066的固體支持物法?；瘜W(xué)合成產(chǎn)生單鏈寡核苷酸?？赏ㄟ^(guò)與互補(bǔ)序列雜交，或用此單鏈為引物以DNA聚合酶聚合，將它轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，雖然化學(xué)合成DNA僅限于約IOO個(gè)堿基的序列，但可通過(guò)連接較短序列獲得較長(zhǎng)序列。在優(yōu)選實(shí)施方式中，用克隆技術(shù)制備編碼bsBA的核酸序列。合適的克隆和測(cè)序技術(shù)的例子以及足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行許多克隆操作的說(shuō)明參見(jiàn)Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)(第二版)，1-3巻，ColdSpringHarborLaboratory(1989》，Berger和Kimmel(編)，《分子克隆技術(shù)指南》(GUIDETOMOLECULARCLONINGTECHNIQUES),AcademicPress,Inc.,SanDiegoCA(而))，或Ausubel等(編)，《新編分子生物學(xué)指南》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),GreenePublishingandJohnWiley&Sons,Inc.,(1987，1995增干U)(Ausubel))。生物試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備的生產(chǎn)商提供的產(chǎn)品信息也提供有用信息。這些生產(chǎn)商包括SIGMA化學(xué)品公司(密蘇里州圣路易斯)、R&D系統(tǒng)(明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯)、PharmaciaAmersham(新澤西州皮斯卡塔市)、CLONTECHLaboratories,Inc.(PaloAlto，CA)、ChemGeneCorp.、Aldrich化學(xué)品公司(威斯康星州密爾沃基)、GlenResearch,Inc.、GIBCOBRLLifeTechnologies,Inc.(馬里蘭州蓋瑟斯堡)、FlukaChemica-BiochemikaAnalytika(FlukaChemieAG，Buchs，瑞士)、Invitrogen(加利福尼亞州圣地亞哥)和AppliedBiosystems(加利福尼亞州福斯特城)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多其它商業(yè)來(lái)源。一旦克隆了編碼bsBA的核酸后，可以在重組工程改造的細(xì)胞如細(xì)菌、植物、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所需蛋白。預(yù)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，許多表達(dá)系統(tǒng)可用于表達(dá)蛋白質(zhì)，包括大腸桿菌(Eco//)、其它細(xì)菌宿主、酵母和各種更高級(jí)的真核細(xì)胞如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤細(xì)胞系。不再贅述已知用于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白的各種方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可對(duì)編碼bsBA的核酸進(jìn)行修飾，而不降低其生物活性。可進(jìn)行一些修飾以幫助克隆、表達(dá)或?qū)蟹肿訐饺肴诤系鞍?。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些修飾，包括例如終止密碼子，在氨基末端加入甲硫氨酸以提供啟動(dòng)位點(diǎn)，在兩個(gè)末端各加入其它氨基酸以產(chǎn)生方便定位的限制性位點(diǎn)。除了重組方法以外，也可用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)構(gòu)建整個(gè)或部分bsBA?？赏ㄟ^(guò)以下方法固相合成長(zhǎng)度少于約50個(gè)氨基酸的本發(fā)明多肽將該序列的C-末端氨基酸連接于不溶性支持物，然后依次加入該序列中其余的氨基酸。固相合成技術(shù)見(jiàn)Barany和Merrifield，《肽分析、合成、生物學(xué)》(ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology),第2巻"肽合成中的特殊方法"(SpecialMethodsinPeptideSynthesis),部分A，3-284頁(yè)；Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156(1963)和Stewart等，《固相肽合成》(SolidPhasePeptideSynthesis),第二版，PierceChem.Co.，Rockford，111(1984)?？赏ㄟ^(guò)縮合較短片段的氨基和羧基末端來(lái)合成較長(zhǎng)的蛋白。通過(guò)活化羧基末端(如采用偶聯(lián)試劑N,N，-二環(huán)己基碳二亞胺)形成肽鍵的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一旦表達(dá)后，可根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法純化重組bsBA，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析等(通常參見(jiàn)R.Scopes,《蛋白質(zhì)純化》(ProteinPurification),Springer-Verlag，紐約(1982))。藥用中優(yōu)選均一性至少約為90-95%的基本上純的組合物，最優(yōu)選均一性為98-99%或更高的組合物。一旦部分純化或純化至所需均一性后，如果打算用于治療性目的，該多肽應(yīng)基本不含內(nèi)毒素。已經(jīng)描述和熟知由細(xì)菌如大腸桿菌表達(dá)單鏈抗體和/或再折疊成合適活性形式(包括單鏈抗體)的方法，可將它們施用于本發(fā)明bsBA，尤其是采用抗體的方法。參見(jiàn)Buchner等，Anal.Biochem.205:263-270(1992);Pluckthun，Biotechnology9:545(1991);Huse等，Science246:1275(1989)和Ward等，Nature341:544(1989)，將所有文獻(xiàn)納入本文作參考。大腸桿菌或其它細(xì)菌的功能性異源蛋白常常分離自包含體，并且需要用強(qiáng)變性劑溶解和后續(xù)再折疊。在溶解步驟期間，如本領(lǐng)域所熟知，必須存在還原劑以分離二硫鍵。含有還原劑的示范性緩沖液是0.1MTrispH8，6M胍，2mMEDTA，0.3MDTE(二硫赤蘚糖醇)?？稍谶€原形式和氧化形式的低分子量巰基試劑的存在下再氧化二硫鍵，如納入本文作參考的Saxena等，Biochemistry9:5015-5021(1970)所述，尤其是Buchner等，同上所述。一般通過(guò)將變性和還原的蛋白質(zhì)稀釋(如100倍)到再折疊緩沖液中完成復(fù)性。示范性緩沖液是0.1MTris，pH8.0，0.5Ml-精氨酸，8mM氧化性谷胱甘肽(GSSG)和2mMEDTA。作為對(duì)雙鏈抗體純化方法的修改，獨(dú)立地溶解和還原重鏈和輕鏈區(qū)，然后在再折疊溶液中混合。當(dāng)一種蛋白比另一種蛋白摩爾過(guò)量不超過(guò)5倍時(shí)，以此摩爾比混合的兩種蛋白獲得優(yōu)選產(chǎn)率。氧化還原改組完成后，需要將過(guò)量的氧化性谷胱甘肽或其它氧化性低分子量化合物加入再折疊溶液?；贐sBA的治療應(yīng)用本發(fā)明還涉及基于bsBA的治療，該治療包括將本發(fā)明bsBA給予動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人類患者，以治療一種或多種所述疾病或失調(diào)。本發(fā)明治療性化合物包括但不限于本發(fā)明bsBA。本發(fā)明bsBA可用于治療、抑制或預(yù)防與細(xì)胞表面受體的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的本文所述疾病和失調(diào)。治療和/或預(yù)防與細(xì)胞表面受體的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病和失調(diào)包括但不限于緩解與這些疾病和失調(diào)相關(guān)的癥狀。可在本領(lǐng)域所知或本文所述藥學(xué)上可接受的組合物中提供本發(fā)明bsBA。通過(guò)本文提供的內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道如何將本發(fā)明bsBA用于診斷、監(jiān)測(cè)或治療目的而無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明bsBA可單獨(dú)給予或與其它類型治療(如放療、化療、激素治療、免疫治療和抗腫瘤劑)聯(lián)合給予。基于bsBA的治療/預(yù)防組合物及其給藥本發(fā)明提供了通過(guò)給予對(duì)象有效量的本發(fā)明bsBA，優(yōu)選本發(fā)明雙特異性抗體來(lái)治療、抑制和預(yù)防的方法。在優(yōu)選方面，bsBA是基本純化的(如基本不含限制其作用或產(chǎn)生不良副作用的物質(zhì))。對(duì)象優(yōu)選為動(dòng)物，包括但不限于諸如牛、豬、馬、雞、貓和狗等動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。已知各種遞送系統(tǒng)可用于給予本發(fā)明bsBA，如包裹入脂質(zhì)體、微顆粒、微膠囊中，能夠表達(dá)bsBA的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的胞吞作用(參見(jiàn)例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262:4429-4432，1987)，構(gòu)建核酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的一部分等。引入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口腔途徑。可通過(guò)任何方便途徑給予bsBA，例如通過(guò)輸注或推注、通過(guò)上皮或粘膜皮膚內(nèi)層(如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并且可以與其它生物活性物質(zhì)一起給予。給藥可以是全身給予或局部給予。此外，可能需要通過(guò)任何合適途徑將本發(fā)明bsBA引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這些途徑包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；借助(例如)連接于貯存庫(kù)如Ommaya貯存庫(kù)的心室內(nèi)導(dǎo)管可能有助于心室內(nèi)注射。也可采用肺部給藥，如采用吸入器或噴霧器，以及含有霧化劑的制劑。在具體實(shí)施方式中，可能需要將本發(fā)明bsBA局部給予需要治療的部位；這可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)，例如但不限于在手術(shù)期間局部輸注、局部施用如術(shù)后與傷口敷料聯(lián)用、注射、導(dǎo)管方式、栓劑方式或植入方式，所述植入物是多孔性材料、非多孔性材料或明膠材料，包括膜如唾液酸膜(sialasticmembrane)或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)給予本發(fā)明bsBA如抗體時(shí)，必須注意采用bsBA不吸附的材料。在另一實(shí)施方式中，可在囊泡，具體是脂質(zhì)體中遞送bsBA(參見(jiàn)Langer，Science249:1527-1533，1990;和Treat等，《感染性疾病和癌癥治療中的脂質(zhì)體》(LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer),Lopez-Berestein禾口Fidler(編)，Liss，紐約，353-365頁(yè)，1989)。在又一實(shí)施方式中，可在控釋系統(tǒng)中遞送bsBA。在一個(gè)實(shí)施方式中，可采用藥泵(參見(jiàn)Langer，同上；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201，(1987);Buchwald等，Surgery88:507，1980;Saudek等，N.Engl.J.Med.321:574，1989)。在另一實(shí)施方式中，可采用聚合材料(參見(jiàn)《控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》(MedicalApplicationsofControlledRelease),Langer和Wise(編)，CRCPres.，BocaRaton，F(xiàn)la.(1974);《控制的藥物生物利用度、藥物產(chǎn)品設(shè)計(jì)和性能》(ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance),Smolen和Ball(編)，Wiley,紐約(1984);Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983);也參見(jiàn)Levy等，Science228:190(1985);During等，Ann.Neurol.25:351(1989);Howard等，J.Neurosurg.71:105(1989))。在又一實(shí)施方式中，可將控釋系統(tǒng)安置在治療靶點(diǎn)(如患病的身體器官，如腦、肺、腎、肝、卵巢、睪丸、結(jié)腸、胰、乳腺和皮膚)附近，因此僅需要全身劑量的一部分(參見(jiàn)例如，Goodson，《控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》(MedicalApplicationsofControlledRelease),同上，第2巻，115-138頁(yè))。Langer的綜述(Science249:1527-1533(19%))討論了其它控釋系統(tǒng)。本發(fā)明也以藥物組合物提供了bsBA。這種組合物包含治療有效量的bsBA和藥學(xué)上可接受的載體。在具體實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"指經(jīng)聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)、或列于美國(guó)藥典或其它普遍認(rèn)可的藥典中可用于動(dòng)物(更具體是人)。術(shù)語(yǔ)"載體"指與治療劑一起給予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體。這種藥物載體可以是無(wú)菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。在靜脈內(nèi)給予藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液體載體，尤其用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物也可含有少量濕潤(rùn)劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可取溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋制劑等形式?？蓪⒃摻M合物制成含有傳統(tǒng)的粘合劑和載體如三甘油酯的栓劑?？诜苿┛砂瑯?biāo)準(zhǔn)載體如藥品級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的例子見(jiàn)《雷明頓藥物科學(xué)和實(shí)踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy),A.R.Gennaro編，LippincottWilliams禾口Wilkins，賓西法尼亞州費(fèi)城(第20版，2003)。這種組合物含有治療有效量的化合物和合適量的載體以提供適合給予患者的形式，其中化合物優(yōu)選為純化形式。該制劑應(yīng)適合給藥方式。在優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)常規(guī)方法將組合物制成適合靜脈內(nèi)給予人的藥物組合物。靜脈內(nèi)給藥的組合物一般是無(wú)菌等滲水性緩沖液的溶液。需要時(shí)，組合物也可包含增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。通常，分別提供這些成分或?qū)⑦@些成分混合在單位劑型中，例如，成為說(shuō)明活性物質(zhì)含量的密封容器如安瓿或藥囊中的凍干粉末或無(wú)水濃縮物。當(dāng)通過(guò)輸注給予組合物時(shí)，可用含有無(wú)菌藥品級(jí)水或鹽水的輸注瓶分散該組合物。當(dāng)通過(guò)注射給予組合物時(shí)，可提供含有用于注射的無(wú)菌水或鹽水的安瓿，以便在給藥前混合這些成分。制成藥物組合物時(shí)，bsBA可制成中性形式或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與陰離子如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子形成的鹽，和與陽(yáng)離子如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸或普魯卡因的陽(yáng)離子形成的鹽。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定能有效治療、抑制或預(yù)防與細(xì)胞表面受體的異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病或失調(diào)的本發(fā)明bsBA的量。此外，可任選地用體外試驗(yàn)幫助鑒定最優(yōu)劑量范圍。用于制劑的準(zhǔn)確劑量也取決于給藥途徑和疾病或失調(diào)的嚴(yán)重程度，并且應(yīng)該根據(jù)實(shí)踐者的判斷和各患者的具體情況決定?？蓮难苌泽w外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線外推有效劑量。對(duì)于bsBA，給予患者的劑量一般為0.1-100mg/kg患者體重。給予患者的劑量?jī)?yōu)選為0.1-20mg/kg患者體重，更優(yōu)選1-10mg/kg患者體重。通常，由于對(duì)外來(lái)多肽的免疫應(yīng)答，人抗體在人體內(nèi)的半衰期比其它物種的抗體長(zhǎng)。因此，衍生自人抗體的bsBA的給藥劑量可以較少，給藥頻率較低。而且，通過(guò)修飾如脂化提高抗體的攝取量和組織穿透性，從而可降低給予本發(fā)明bsBA的劑量和頻率。試劑盒本發(fā)明還包括試劑盒，用于在體內(nèi)或生物樣品中檢測(cè)表達(dá)或過(guò)量表達(dá)靶分子的細(xì)胞。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該試劑盒包括雙特異性scFv抗體靶向的bsBA。根據(jù)應(yīng)用，可用接頭或螯合劑或二者使抗體官能化，以偶聯(lián)于效應(yīng)器(如放射性部分、脂質(zhì)體、細(xì)胞毒素、另一種抗體等)，如本文所述。該試劑盒還任選地包括用于檢測(cè)bsBA的緩沖液和組合物。該試劑盒也可包括說(shuō)明材料，說(shuō)明抗體用于檢測(cè)(如)癌細(xì)胞的用途、和/或說(shuō)明抗體與官能化試劑的組合或說(shuō)明官能化抗體在成像和/或治療應(yīng)用中的用途。在某些實(shí)施方式中，提供了用接頭和/或螯合劑(在一個(gè)容器中)官能化的bsBA以及一種或多種效應(yīng)器如細(xì)胞毒素、放射性標(biāo)記(在第二個(gè)容器中)，從而可分別給予這兩種組分(如預(yù)先靶向方法)，或者可在臨用前給予這兩種組分。某些說(shuō)明性材料提供了推薦的劑量方案、禁忌癥(counterindication)等。說(shuō)明性材料一般包括手寫(xiě)或印刷的材料，本發(fā)明也考慮了能夠儲(chǔ)存這些說(shuō)明材料并將它們傳達(dá)給最終用戶的任何媒體。這種媒體包括但不限于電子存儲(chǔ)媒體(如磁盤(pán)、磁帶、盒式磁帶、芯片)、光學(xué)媒體(如CDROM)等或提供說(shuō)明書(shū)的互聯(lián)網(wǎng)址。本發(fā)明也提供包括一個(gè)或多個(gè)容器的藥包或藥盒，所述容器中充滿了本發(fā)明藥物組合物的一種或多種成分。任選與這種容器相聯(lián)系的是由管理藥物或生物制品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所頒發(fā)形式的通知，該通知反映了政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)以人用產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)、使用或銷售。實(shí)施例實(shí)施例1雙抗體和(scFv)2雙抗體的產(chǎn)生參見(jiàn)例如EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))。用接頭由抗體片段(通常由兩個(gè)scFv)構(gòu)建雙抗體，所述接頭太短，以致于不能在相同鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行配對(duì)；強(qiáng)迫結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)?；蛘?，可用遺傳編碼的接頭連接兩條scFv(共價(jià)連接這兩個(gè)分子)，從而形成(ScFv)2，即二價(jià)抗體。實(shí)施例2可用不同類型的"二聚化結(jié)構(gòu)域"使兩個(gè)抗體片段異質(zhì)二聚化。例如，用遺傳方法通過(guò)絞鏈區(qū)將雙特異性/二價(jià)雙抗體與IgG的CH(3)結(jié)構(gòu)域N末端融合(Lu等，JImmunolMethods,2003-08;279(1-2):219-32)，產(chǎn)生稱為"雙-雙抗體"的構(gòu)建物。結(jié)果是絞鏈區(qū)與CH(3)結(jié)構(gòu)域之間二聚化產(chǎn)生四價(jià)雙抗體二聚體。也可通過(guò)將單鏈Fv(scFv)與抗原結(jié)合特異性不同的Fab片段的輕鏈或重鏈的C末端遺傳融合，從而用抗體的天然CH1結(jié)構(gòu)域使兩個(gè)抗體片段異質(zhì)二聚化(Lu等，ImmunolMethods,267(2):213-26(2002》。也可采用IgG重鏈和輕鏈之間的天然二聚化機(jī)制。兩條特異性不同的單鏈Fv(scFv)可與人k鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(C(L))和人重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(C(H1))融合，形成兩條多肽，分別為(scFv)(l)-C(L)和(scFv)(2)-C(H1)-C(H2)-C(H3)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共表達(dá)兩條多肽導(dǎo)致形成具有雙特異性的共價(jià)連接的IgG樣異質(zhì)-四聚體Bs(scFv)(4)-IgG(Zuo等，ProteinEng.13(5):361-7(2000)，Lu等，J.BiolChem.23;279(4):2856-65(2004))。也可通過(guò)二聚化結(jié)構(gòu)域中的非共價(jià)相互作用強(qiáng)迫兩個(gè)抗體片段之間形成異質(zhì)二聚體，如采用形成異質(zhì)二聚體的亮氨酸拉鏈Fos和Jun，當(dāng)它們分別與兩種不同的Fab'片段融合時(shí)介導(dǎo)形成雙特異性F(ab，)2(Tso等，JHematother.4(5):389-94(1995))。實(shí)施例3測(cè)定合適的靶標(biāo)記和效應(yīng)器標(biāo)記可用許多方式確定合適的靶標(biāo)記，這些方式是例如耙組織和非耙組織的mRNA分布型分析，以鑒定靶組織中過(guò)量表達(dá)的靶分子；或通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法如耙細(xì)胞和非靶細(xì)胞的2D電泳來(lái)比較蛋白質(zhì)表達(dá)水平，然后通過(guò)質(zhì)譜鑒定。例如，mRNA分布型分析一般采用Affymetrix微陣列，如Cao等所述進(jìn)行(BMCGenomics.27;5(1):26(2004))，比較由靶組織和非靶組織(如腫瘤和鄰近的正常組織)產(chǎn)生的cRNA。在蛋白質(zhì)組學(xué)方法中，一般是裂解或勻漿靶細(xì)胞和非耙細(xì)胞，然后進(jìn)行二維電泳。然后將蛋白質(zhì)固定在凝膠中，染色觀察。來(lái)自靶細(xì)胞和非耙細(xì)胞的凝膠圖像分析可顯示差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。然后，可通過(guò)剪下蛋白質(zhì)點(diǎn)、在凝膠中用胰蛋白酶消化和質(zhì)譜分析鑒定這些點(diǎn)。該過(guò)程參見(jiàn)例如，VanGreevenbroek等，45，1148-54(2004)?？梢栽S多方式鑒定合適的效應(yīng)器標(biāo)記，如用推定的磷酸化位點(diǎn)鑒定受體。蛋白質(zhì)或DNA序列可獲自GenBank或其它公共數(shù)據(jù)庫(kù)，可用公眾可用的搜索引擎預(yù)測(cè)可能的磷酸化位點(diǎn)，如ScanSite(通過(guò)輸入"http:〃"，然后是"scansite.mit.edu/"在線搜索)或NetPhos(通過(guò)輸入"www."，然后是"cbs.dtu.dk/services/NetPhos/"找到該網(wǎng)頁(yè))。含有磷酸化位點(diǎn)的受體更可能是良好的效應(yīng)器標(biāo)記，因?yàn)檫@些受體常常參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蛘?，可通過(guò)將靶細(xì)胞與細(xì)胞標(biāo)記的抗體相接觸、然后如上所述測(cè)定所需生物活性來(lái)鑒定合適的效應(yīng)器標(biāo)記。實(shí)施例4:測(cè)定一價(jià)和二價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榱藴y(cè)定結(jié)合結(jié)構(gòu)域或雙特異性結(jié)合分子的一價(jià)親和力，如上所述產(chǎn)生bsBA。為通過(guò)表面等離振子共振測(cè)定結(jié)合動(dòng)力學(xué)，可按照廠商(BIAcore)說(shuō)明書(shū)用鹽酸N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化生物傳感器芯片用于共價(jià)偶聯(lián)受體。然后，(例如)注入10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)來(lái)偶聯(lián)該標(biāo)記，以獲得理想的固定材料反應(yīng)單位(RU)低于400的信號(hào)。為了測(cè)定動(dòng)力學(xué)，在25。C下，將用PBS/吐溫緩沖液(0.05。/。吐溫-20的磷酸鹽緩沖鹽水溶液)兩倍連續(xù)稀釋的一價(jià)或雙特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域注射到抗原芯片上，所用流速為20pl/分鐘。然后將解離數(shù)據(jù)擬合成單位點(diǎn)模型，獲得k^，可計(jì)算各結(jié)合曲線的假一階速率常數(shù)(ks)，并作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)作圖，獲得k結(jié)合+As.e。然后，可通過(guò)k解離/k結(jié)合計(jì)算SPR測(cè)定的平衡解離常數(shù)Kd。必須對(duì)密度不同(如100、200和400RU)的幾種表面進(jìn)行上述測(cè)定，以確定不存在實(shí)驗(yàn)假象，如解離bsBA的再結(jié)合。或者，也可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定它們的親和力，如Nielsen等(CancerRes.60(22):6434-40(2000))所述。實(shí)施例5:在細(xì)胞中測(cè)定效應(yīng)器功能可通過(guò)將培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的靶細(xì)胞與不同濃度的效應(yīng)器結(jié)合結(jié)構(gòu)域接觸例如30分鐘，測(cè)定結(jié)合結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)器功能。此時(shí)，在一些情況下用外源性生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞以促進(jìn)該分子想要改變的生物作用。通過(guò)如下方法制備6孔或12孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)的處理細(xì)胞的抽提物在冰上使細(xì)胞在含有蛋白酶抑制劑(lmMPMSF，1pg/mL亮抑肽酶，1|ig/mL胃蛋白酶抑制劑)的裂解緩沖液(20mMTris(pH7.5)，150mMNaCl，lmMEDTA，lmMEGTA，1%TritonX陽(yáng)100，0.5%NP40，10mM卩-甘油磷酸酯，10mMNaF，1mMNa3V0》中通過(guò)27G針頭5次。裂解前，用冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。然后，通過(guò)(例如)用磷酸化特異性抗體進(jìn)行免疫印跡來(lái)分析裂解物用7.5%SDS-PAGE預(yù)澆鑄凝膠(Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)電泳分析全細(xì)胞蛋白質(zhì)抽提物(50嗎總蛋白質(zhì)/泳道)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，與檢測(cè)該標(biāo)記的活化或下游相關(guān)蛋白的抗體一起孵育。或者，可通過(guò)抗體微陣列分析裂解物，如Nielsen等(ProcNatlAcadSciUSA，100(16):9330-5(2003))所述。也可通過(guò)所需生物功能的其它讀出方法，如細(xì)胞增殖試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)合結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)器功能?？稍诤蠨MEM和5%FCS和不同濃度的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的96孔板中以5X10V孔接種靶細(xì)胞。72小時(shí)后，裂解細(xì)胞，可根據(jù)廠商說(shuō)明通過(guò)CellTiter-Glo發(fā)光細(xì)胞活力試驗(yàn)(Promega，Madison，WI)測(cè)定ATP量?？蓪⒁种瞥潭茸鳛闈舛葘?duì)數(shù)的函數(shù)對(duì)磷酸化和增殖試驗(yàn)的結(jié)果作圖，通過(guò)擬合到下述等式測(cè)定效應(yīng)器和靶向結(jié)構(gòu)域的IC50:^(頂部-底部)y=肽部+1+loL。gEC50-X實(shí)施例6:測(cè)定BsBA為了測(cè)定bsBA阻斷、降低或抑制ErbB受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，將癌細(xì)胞如A431(雌激素依賴性乳腺癌細(xì)胞系，國(guó)立生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)登錄GDS121)與各種濃度的bsBA—起孵育30分鐘，然后用生長(zhǎng)因子(如調(diào)蛋白或EGF)刺激細(xì)胞長(zhǎng)達(dá)兩小時(shí)。然后用Triton緩沖液裂解細(xì)胞，再超聲處理。然后，通過(guò)免疫印跡或采用對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化敏感的抗體微陣列來(lái)分析裂解物中的磷酸化改變(參見(jiàn)例如Nielsen等，2003，PNAS100:9330)。BsBA可用于抑制表達(dá)合適抗原的癌生長(zhǎng)?？赏ㄟ^(guò)將小分子藥物與bsBA偶聯(lián)來(lái)加強(qiáng)bsBA的作用。藥物可以是(例如)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒劑，如化療劑或酪氨酸激酶抑制劑，如格列衛(wèi)，伊馬替尼甲磺酸鹽)。實(shí)施例7:ErbBBsBA計(jì)算機(jī)模擬A431細(xì)胞中調(diào)蛋白(HRG)-誘導(dǎo)的ERK和AKT活化顯示，如果bsBA的ErbB受體結(jié)合分子之一與其受體的親和力低于其它ErbB結(jié)合分子與其受體的親和力，則這種ErbBbsBA最有效。如果本發(fā)明bsBA的低親和力結(jié)合分子涉及ErbB3或ErbB4，bsBA的高親和力結(jié)合分子涉及另一種ErbB受體(如ErbBl或ErbB2)，那么相信bsBA是通過(guò)將ErbB3或ErbB4螯合成由ErbB3或ErbB4受體、bsBA和ErbBl或ErbB2受體組成的三聚體復(fù)合物(即ErbB3/4:bsBA:ErbBl/2)而降低、阻斷或抑制ErbB受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。bsBA的結(jié)合分子也可涉及ErbB3和ErbB4。相信這種bsBA能抑制這些ErbB受體與ErbBl或ErbB2的二聚化。因?yàn)镋rbB3或ErbB4與ErbBl或ErbB2的二聚化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，所以bsBA通過(guò)阻斷二聚體形成而有效阻斷、減少或抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此bsBA的低親和力結(jié)合分子優(yōu)選結(jié)合于ErbB3?？芍苽鋌sBA的結(jié)合分子，以使它們結(jié)合于ErbBl和ErbB2，從而交聯(lián)這兩種受體。此bsBA通過(guò)減少、防止或抑制ErbBl和ErbB2與ErbB3或ErbB4的二聚化起作用，如上所述，ErbBl和ErbB2與ErbB3或ErbB4的二聚化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。優(yōu)選地，此bsBA的低親和力結(jié)合分子優(yōu)選結(jié)合于ErbBl。示范性bsBA包括結(jié)合于ErbB3的低親和力結(jié)合分子和(結(jié)合于)EGFR、ErbB2或ErbB4的高(親和力)結(jié)合分子。BsBA也可用于將細(xì)胞毒劑或化療劑定位于表達(dá)ErbB受體的細(xì)胞。這些物質(zhì)具有各自對(duì)不同ErbB受體特異的兩種結(jié)合分子，和偶聯(lián)于bsBA的細(xì)胞毒劑或化療劑(如皂草毒蛋白、抗-干擾素-oc、長(zhǎng)春花屬生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。BsBA可制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab')2或(Fv)2雙特異性抗體)、雙抗體或制備成具有兩個(gè)不同結(jié)合分子的適體。用ErbB受體家族測(cè)定該模型。用EGF或HRG刺激ErbB受體使導(dǎo)致ERK和AKT磷酸化的通路被同時(shí)激活，在信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)內(nèi)的各個(gè)水平串話。分析的靈敏度使我們能夠?qū)⒃撃Ｐ洼敵龅牟淮_定性分?jǐn)偟侥Ｐ洼斎胫胁淮_定性的不同來(lái)源。由于腫瘤細(xì)胞的特征是受體表達(dá)水平不同，當(dāng)HRG是配體時(shí)，我們將ErbB3和ErbB4鑒定為非常靈敏的耙點(diǎn)。通常，當(dāng)bsBA的結(jié)合分子是抗體或其片段時(shí)，可用生化方法良好表征這些結(jié)合分子，因?yàn)椴浑y測(cè)定它們的解離常數(shù)或者甚至是結(jié)合和解離速率。同樣，不難用數(shù)學(xué)模型描述抗體作用機(jī)制，可在計(jì)算機(jī)上測(cè)定采用已知抗體作為抑制劑的效果。采用我們的計(jì)算機(jī)模型，我們測(cè)試了采用雙特異性抗體(即具有兩個(gè)不同的結(jié)合分子的抗體，其中各結(jié)合區(qū)結(jié)合不同的ErbB受體)阻斷ErbB細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的想法。計(jì)算機(jī)結(jié)果證實(shí)，對(duì)兩種不同的ErbB受體具有結(jié)合特異性并且對(duì)一種ErbB受體的結(jié)合親和力大于對(duì)另一種ErbB受體的結(jié)合親和力的抗體，能理想地阻斷或防止通過(guò)ErbB通路的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。采用計(jì)算機(jī)方法，我們比較了靶向兩種不同的ErbB受體的雙特異性抗體在ErbB受體表達(dá)有差異(表l)的三種不同細(xì)胞系中阻斷或防止ErbB信號(hào)傳導(dǎo)途徑活化的能力與僅靶向一種ErbB受體的常規(guī)抑制劑的能力。用計(jì)算機(jī)對(duì)雙特異性抗體以及現(xiàn)有治療性單特異性抗體在各細(xì)胞系中的信號(hào)抑制建模。我們的模型預(yù)計(jì)，對(duì)兩種不同的ErbB受體親和力不同的雙特異性抗體對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制比傳統(tǒng)的單受體抑制劑介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制高得多。我們的計(jì)算機(jī)建模產(chǎn)生的數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。根據(jù)腫瘤中存在的受體比例，預(yù)計(jì)具有高親和力結(jié)合分子和低親和力結(jié)合分子的不同bsAb是比單特異性抗體或兩個(gè)結(jié)合分子以相同結(jié)合親和力結(jié)合于各自抗原的雙特異性抗體強(qiáng)得多的抑制劑。表1:ErbB受體在不同細(xì)胞系上的受體表達(dá)概況<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表2:BsBA與傳統(tǒng)單特異性受體抑制劑的抑制作用的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>我們將抗ErbBl(高親和力)和ErbB3或ErbB4(低親和力)的雙特異性抗體鑒定為在所有刺激條件下防止由于ErbB通路活化進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最有效阻斷劑。在所有刺激條件下，ErbBl-ErbB2bsAb作為ErbB細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑也相當(dāng)有效。當(dāng)HRG用作激活劑時(shí)，ErbB3-ErbB4或ErbB2-ErbB3/4bsAb是非常有效的ErbB途徑阻斷劑。因此，優(yōu)選的bsBA是阻斷試劑的至少一個(gè)特征是能夠靶向ErbB3或ErbB4受體(采用低親和結(jié)合分子)的bsBA。實(shí)際上，借助于計(jì)算機(jī)模型，我們已經(jīng)鑒定了ErbB3/4具有強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。ErbB3/4與其本身交聯(lián)，或與更典型的癌抗原如ErbBl或ErbB2交聯(lián)，其作用機(jī)制是通過(guò)同時(shí)抑制兩種受體或螯合二受體而抑制ErbB3/4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。與采用bsBA而非傳統(tǒng)單特異性阻斷劑如單特異性抗體相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)之一是雙特異性阻斷劑形成穩(wěn)定的三聚體(即ErbB受體-雙特異性阻斷劑-ErbB受體)。因此，bsBA的效率比傳統(tǒng)單受體抑制劑高得多，如表2所示。通過(guò)結(jié)合于兩種不同的ErbB受體，本發(fā)明bsBA通過(guò)與相同或不同的ErbB受體相互作用而螯合ErbB受體。bsBA形成非常穩(wěn)定(不可逆)的三聚體復(fù)合物，它能防止、降低或抑制結(jié)合的ErbB受體的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。bsBA與ErbBl、ErbB2、ErbB3或ErbB4的初始結(jié)合步驟可以是可逆步驟，與其余ErbB受體的第二結(jié)合步驟導(dǎo)致形成非常穩(wěn)定的三聚體。或者，bsBA與ErbBl、ErbB2、ErbB3或ErbB4的第一結(jié)合步驟可以是不可逆步驟，第二結(jié)合步驟可以是可逆步驟，從而允許bsBA形成多種不同的三聚體復(fù)合物。ErbB受體:bsBA:ErbB受體三聚體的形成產(chǎn)生不可誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)合物。而且，通過(guò)螯合ErbBl、ErbB2、ErbB3禾卩ErbB4，bsBA防止、減少或抑制這些ErbB受體與相同或不同ErbB受體的二聚化。優(yōu)選的是，bsBA與ErbBl或ErbB2的親和力較高，與ErbB3或ErbB4的親和力較低。形成不完全的bsBA-ErbB受體二聚物(bsBA的兩個(gè)結(jié)合分子中僅有一個(gè)參與結(jié)合)不產(chǎn)生妨礙細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)合物；只有形成了三聚體復(fù)合物(即ErbB受體:bsBA:ErbB受體)才能阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而且，bsBA結(jié)合的兩個(gè)ErbB受體之間不可能形成三聚體。bsBA的其它特征包括一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠通過(guò)與天然配體如HRG競(jìng)爭(zhēng)ErbB受體而減少、阻斷或抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)證明，在阻斷細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，ErbB3-ErbB4bsBA比單特異性ErbB3或ErbB4抑制劑更有效。僅針對(duì)ErbB3或ErbB4的單特異性抑制劑不能像ErbB3-ErbB4bsBA那樣有效地抑制AKT磷酸化，主要是由于ErbB3和ErbB4的細(xì)胞表面表達(dá)水平高。僅當(dāng)同時(shí)采用ErbB3和ErbB4單特異性抑制劑時(shí)才能防止AKT磷酸化。我們的計(jì)算機(jī)分析還證實(shí)了bsBA結(jié)合ErbB2和ErbB3受體的有效性。當(dāng)用細(xì)胞被HRG刺激時(shí)ErbB2-ErbB3bsBA在阻止細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面比單特異性ErbB2或ErbB3抑制劑更加有效。在缺少三聚體形成穩(wěn)定作用時(shí)ErbB2-ErbB3bsBA三聚體復(fù)合物的功效被降低。如果bsBA的兩種結(jié)合分子與它們的受體的結(jié)合親和力相等，則ErbB2-ErbB3bsBA三聚體在阻斷AKT磷酸化方面將不太有效。因?yàn)閎sBA在未結(jié)合狀態(tài)或僅與一種ErbB受體形成二聚體復(fù)合物時(shí)不具有任何抑制作用，所以抑制劑濃度增加，以致于用bsBA飽和了ErbB受體，導(dǎo)致bsBA的抑制效果降低?？赏ㄟ^(guò)提供對(duì)ErbB2的親和力提高的bsBA逆轉(zhuǎn)此作用，從而bsBA對(duì)ErbB2的結(jié)合親和力大于ErbB3或ErbB4(即KdErbB2>KdErbB3或ErbB4)。上述bsBA在HRG占優(yōu)勢(shì)的(dominanted)方案中特別有效。通常，與僅靶向一種受體的ErbB受體抑制劑相比，bsBA在低得多的劑量下有效。例如，當(dāng)濃度為0.1nM時(shí)，本發(fā)明的ErbB2/ErbB3bsBA促進(jìn)對(duì)AKT磷酸化的抑帝ij，而具有與bsBA具有相同Kd的ErbB2或ErbB3單特異性抑制劑在濃度為0.1nM時(shí)則不同樣有效。本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式是bsBA，其中bsBA的一個(gè)結(jié)合分子具有與ErbBl的結(jié)合特異性(高親和力結(jié)合)、另一個(gè)結(jié)合分子具有與ErbB3或ErbB4的結(jié)合特異性(低親和力結(jié)合)。通常，腫瘤細(xì)胞表達(dá)大量ErbBl(即常常大于100,000個(gè)受體/細(xì)胞)，而ErbB3和ErbB4的受體表達(dá)范圍是5,000-20,000個(gè)受體/細(xì)胞。拮抗配體結(jié)合的bsBA成功抑制了受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，即使受體表達(dá)水平相差I(lǐng)O倍以上。我們的計(jì)算機(jī)分析證實(shí)了雙特異性ErbBl/ErbB3和ErbBl/ErbB4bsBA的有效性。對(duì)于ErbBl，bsBA如雙特異性scFV抗體可與天然ErbBl配體競(jìng)爭(zhēng)相同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這使得bsBA在EGF或TGF-a占優(yōu)勢(shì)的方案中非常有效。在HRG占優(yōu)勢(shì)的方案中，抑制ErbB3受體抑制了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)我們對(duì)ErbB細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分析，我們將ErbBl結(jié)合分子鑒定為具有低解離常數(shù)KD<lnM的高親和結(jié)合位點(diǎn)，但其結(jié)合不是不可逆結(jié)合。ErbB3和ErbB4受體的表達(dá)水平比ErbBl受體低得多。因?yàn)閎sBA結(jié)合于ErbBl和ErbB3/ErbB4受體，并且因?yàn)閎sBA對(duì)豐度更高的ErbBl受體具有較高親和力，所以bsBA在比常規(guī)單特異性ErbB抑制劑低得多的濃度下可有效阻斷ErbBl與ErbB3或ErbB4的二聚化介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。bsBA對(duì)ErbBl的高親和力導(dǎo)致低bsBA濃度下的高有效性。我們的方法利用計(jì)算機(jī)建模鑒定用于交聯(lián)的最優(yōu)受體以及兩種結(jié)合分子的所需親和力。bsBA的兩種結(jié)合分子的不同親和力將bsBA有效耙向受體如ErbB3，所述受體被認(rèn)為不是癌細(xì)胞特異的。將ErbB3與更典型的癌抗原如ErbBl交聯(lián)提供了特異性靶向癌細(xì)胞和在這些細(xì)胞中調(diào)節(jié)ErbB3受體活性的方式。采用我們的計(jì)算機(jī)模型，我們了解到bsBA的兩種結(jié)合分子具有不同親和力的必要性。親和力差異有助于bsBA三聚體復(fù)合物的穩(wěn)定。通常，與失活或活性較低的結(jié)合分子相比，bsBA的活性結(jié)合分子應(yīng)該具有較低的親和力。如果bsBA的兩種結(jié)合分子都失活或活性較低，那么靶向表達(dá)較高的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體或較強(qiáng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的結(jié)合分子應(yīng)該具有較高的親和力。對(duì)耙向的受體之一的親和力有差異導(dǎo)致以下結(jié)果如果給予bsBA的濃度高于較高親和力相互作用(如ErbBl)的Kd，但低于較低親和力相互作用(如ErbB3)的Kd，bsBA僅應(yīng)該聚集在表達(dá)親和力相互作用較高的抗原的細(xì)胞上。bsBA的另一端可用于與這些細(xì)胞上的低親和力抗原相互作用，以干擾其生物功能(如ErbB3;阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))。哪一種受體是低親和力相互作用或高親和力相互作用取決于受體具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度(作為耙點(diǎn)的重要性)和bsBA的作用方式。實(shí)施例8該實(shí)施例描述了具有上述特征的示例性抗-EGFR/ErbB3bsBA的產(chǎn)生。#柳膽細(xì)胞系。小鼠雜交瘤細(xì)胞系225、293T細(xì)胞系和人乳腺癌乳腺癌細(xì)胞系A(chǔ)431獲自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(Manassas，VA)。所有細(xì)胞系培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清或低IgG胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)，或如上所述并添加有2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100pg/mL鏈霉素的不含CD293血清的培養(yǎng)基(Invitrogen)("生長(zhǎng)培養(yǎng)基")。V、/貧恭五G尸i拔沐游克蘑用RNAeasy試劑盒(QIAGEN)按照制造商的描述從細(xì)胞系A(chǔ)TCCNo.HB-8508中提取RNA。第一鏈cDNA采用cDNA合成試劑盒(AmershamBiosciencesCorp.,Piscataway，NJ)按照制造商的描述用該試劑盒中提供的RT-引物一pd(N)6合成。C225抗體的重鏈用以下小鼠引物的混合物從cDNA擴(kuò)增TDNO:l);IDNO:2);VH3:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGAAGGAGTC(SEQIDNO:3);rDNO:4);IDNO:5);VH6:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTC(SEQIDNO:6);VH7:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC(SEQIDNO:7);EDNO:8);V股CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGAKGTSVAGCTTCAGGAGTC(SEQIDNO:9);VH10:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC(SEQIDNO:10);IDNO:11);VH12:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGRTGGAGTC(SEQIDNO:12);VH13:IDNO:13);VII14:IDNO:14);VH15:CTAGCTAGCGGGGCCATGGCCCARGTTACTCTGAAAGAGT(SEQIDNO:i5);.THl-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC(SEQIDNO:16);JH2-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCC(SEQIDNO:17);JH3-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACAGTGACCAGAGTCCC(SEQIDNO:18);JH4-mGAP:cctggtttcccagaaccgetctgcgcgccgCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC(SEQIDNO:19).然后采用下述引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二次PCR:Hind3-C225-VH-5'(5'-CTAGCTAGCGGGAAGCTTCAGGTACAACTGCAGGAGTCA-3，(SEQIDNO:20))禾口C225陽(yáng)VH陽(yáng)3，(5，-AGAGGAAACGGTGACCGTGGT-3，(SEQIDNO:21))。C225抗體的輕鏈用以下引物的混合物從cDNA擴(kuò)增VK1:VK2:VK3:TATTCGTCGACGGAAAATGTGC丁CACCCAGTC(SEQIDNO:24);VK4:TATTCGTCGACGGAYATTGTGATGACACAGTC(SEQIDNO:25);VK5:TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACACAGAC(SEQIDNO:26);VK6:TATTCGTCGACGGAYATTGTGCTSACYCARTC(SEQIDNO:27);VK7:TATTCGTCGACGGACATCCAGATGACYCARTC(SEQBDNO:竭；VK8:TATTCGTCGACGCAAATTGTTCTCACCCAGTC(SEQIDNO:29);JK1/2:TTTCTCGTGCGGCCGCACGTTTKATTTCCAGCTTGG(SEQIDNO:30);JK4:TTTCTCGTGCGGCCGCACGTTTTATTTCCAACTTTG(SEQIDNO:3";JK5:TTTCTCGTGCGGCCGCACGTTTCAGCTCCAGCTTGG(SEQIDNO:32》.然后采用下述引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二次PCR:C225-VH-Link-VL-UP(ACCACGC225陽(yáng)VL-Xho-His6-Notl(CCCGCCTGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTG34))。所有PCR采用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法和儀器進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用QIAquick按照制造商的說(shuō)明純化，將純化的重鏈和輕鏈產(chǎn)物各100ng混合并在沒(méi)有引物時(shí)進(jìn)行7輪PCR然后與引物Ncol-C225(CAGCCGGCCATGGCCcaggtacaactgcaggagtc(SEQIDNO:35》和C225-Xhol-3,(GATCTCGAGCTTGGTCCCAGC(SEQIDNO:36》一起再進(jìn)行25輪PCR以將它們裝配成scFvC225。用QIAquick按照制造商的描述從瓊脂糖凝膠純化約750bp的條帶，然后用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)也按照制造商的描述進(jìn)行克隆。用標(biāo)準(zhǔn)方法將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株XL1并用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。用以下引物從獲自人白細(xì)胞(按上述方法獲得)的cDNA克隆Ck(kIDNO:37》和Ck-Apal-3'(CGCGGGCCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC(SEQIDNO:38))。用以下引物克隆CH(重鏈恒定區(qū))5，-CHl-Yl(CCAAGAGCACCTCTGGGG(SEQIDNO:39))和HuIgG-Xho-Xba-3克隆產(chǎn)物用作第二次PCR的模板，第二次PCR采用以下引物5'-NotlNhelCHl(gtggcggccgetageaceaagggcccateggtcttccccctggcaccctectecaagageacetctgggg(SEQIDNO:41))和HuIgG-Xho陽(yáng)Xba-3，產(chǎn)物用QIAquick純化試劑盒(Qiagen)按照制造商推薦的方法純化，然后用TOPOTA克隆試劑盒克隆，最終的構(gòu)建物通過(guò)DNA測(cè)序檢驗(yàn)。然后將CH產(chǎn)物亞克隆入pSecTaq2AHygro載體(Invitrogen)的Notl和Xhol位點(diǎn)之間以制造CH/pSecTaq2AHygro(CH/pSTH)，并將Ck亞克隆入pSecTaq2A載體的Xhol和Apal位點(diǎn)之間以制造Ck/pSecTaq2A(Ck/pSTZ)。最后，將A5抗-ErbB3scFv(由加州大學(xué)舊金山分校的JamesMarks博士惠贈(zèng))亞克隆入CH/pSTH構(gòu)建物的Sfil和Notl位點(diǎn)之間以形成A5CH/pSTH，并將C225scFv亞克隆入CK/pSTZ的Sfil和Xhol位點(diǎn)之間以形成C225Ck/pSTZ。置資6"6游表送瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。293T細(xì)胞系用FuGeneTM轉(zhuǎn)染試劑(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)按照制造商的描述用A5CH/pSTH和C225Ck/pSTZ共轉(zhuǎn)染(在DMEM中用超低IgGFBS轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染1天后換成不含CD293血清的培養(yǎng)基)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，然后在ProteinG(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford，IL)上按照制造商推薦的方法純化以形成C225-A5Ig-scFv融合物。絲錄會(huì)游魔《微^e督將A431細(xì)胞與1ug/mLC225-A5Ig-scFv融合物一起在冰上培育30分鐘，然后用洗滌緩沖液(磷酸緩沖鹽水、2%FBS、0.1%疊氮化物)洗滌兩次，用AlexaFluor488(Invitrogen)標(biāo)記的抗-人IgG抗體檢測(cè)其結(jié)合并在FACSCalibur儀(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes,NJ)上量化。顏u膽長(zhǎng)鮮遂，ir錄艦?zāi)_劍為進(jìn)行抗體的劑量-反應(yīng)試驗(yàn)，將A431細(xì)胞與不同量的C225-A5Ig-scFv融合物儀器在DMEM(無(wú)血清)上培育30分鐘，然后用50ng/mL調(diào)蛋白-p(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN)或50ng/mLEGF(PeproTech，Inc.,RockyHill，NJ)刺激細(xì)胞5分鐘。細(xì)胞用裂解緩沖液(20mMTris，pH7.4;150mMNaCl;2mMEDTA;1mMEGTA;1mMNaF;lOmM卩-甘油磷酸；1%TritonX-100;蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis，MO);lmM原釩酸鈉；50pM苯胂；10bpV和100ug/mlDNA酶)裂解，按照Nielsen等，ProcNatlAcadSciUSA100(16):9330-9335(2003)的描述用抗體微陣列試驗(yàn)測(cè)定生長(zhǎng)因子刺激的AKT磷酸化有無(wú)減少。AKT抗體獲自CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。實(shí)施例9該實(shí)施例描述了具有上述特征的示例性抗-EGFR/ErbB3bsBA的測(cè)試結(jié)果。錄菜通過(guò)共轉(zhuǎn)染兩種表達(dá)質(zhì)粒A5CH/pSTH和C225Ck/pSTZ(描述于圖ll)在293T細(xì)胞中表達(dá)雙特異性抗體C225-A5Ig-scFv融合物。從上清液中純化表達(dá)的C225-A5Ig-scFv融合物并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)其與癌細(xì)胞系A(chǔ)431的結(jié)合。A431細(xì)胞過(guò)表達(dá)EGF受體，且正如所料，C225-A5Ig-scFv融合物與這些細(xì)胞良好結(jié)合，如圖2所示。隨后在癌細(xì)胞系A(chǔ)431中檢測(cè)表達(dá)的C225-A5-Ig-scFv對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的的AKT磷酸化抑制。細(xì)胞與不同濃度的C225-A5Ig-scFv融合物一起預(yù)培育30分鐘，然后用調(diào)蛋白(HRG)或EGF刺激5分鐘。再用含有洗滌劑的緩沖液裂解以檢測(cè)AKT的磷酸化。結(jié)果如圖3所示。C225-A5Ig-scFv融合物在對(duì)EGF的反應(yīng)中抑制了AKT的磷酸化，其IC5o約為2nM。調(diào)蛋白是導(dǎo)致包括AKT在內(nèi)的一些胞內(nèi)激酶活化的ErbB3受體的配體。盡管抗-ErbB3抗體A5的親和力相對(duì)較低(約700nM)，C225-A5Ig-scFv融合物抑制調(diào)蛋白誘導(dǎo)的活化作用，其IC5o約為0.2nM。這證明，"高-低"雙特異性試劑(即對(duì)第一抗體具有高親和力而對(duì)第二抗體具有低親和力的試劑)可非常有力地抑制抗體所靶向的激酶的活性。應(yīng)理解，本文所述實(shí)施例和實(shí)施方式僅為了說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)它們作出各種修改和改變，這些修改和改變應(yīng)包括在本申請(qǐng)的構(gòu)思和范圍以及所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。將本文引用的所有發(fā)表物、專利和專利申請(qǐng)全文納入本文作參考用于所有目的。權(quán)利要求1.一種調(diào)節(jié)靶細(xì)胞上靶分子的一種或多種生物活性的方法，所述方法包括(a)提供一種雙特異性結(jié)合劑，所述雙特異性結(jié)合劑具有與所述細(xì)胞表面上第一靶分子的解離常數(shù)(“Kd”)至少為10-7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與所述細(xì)胞表面上第二靶分子的親和力比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中所述第一和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同；和(b)在允許第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合第一和第二靶分子的條件下使所述雙特異性結(jié)合劑與所述靶細(xì)胞接觸，其中所述第一和第二靶分子的結(jié)合調(diào)節(jié)所述靶分子的一種或多種生物活性。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述雙特異性結(jié)合劑包含兩種抗體。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是受體酪氨酸激酶。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二靶分子選自ErbB3、ErbB4、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、IGF1-R、PDGF、受體a和卩以及C-KIT。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d為1(T8-10-12M。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ诙蟹肿拥腒d比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少20倍。10.—種在具有耙細(xì)胞和非靶細(xì)胞的生物體中調(diào)節(jié)靶細(xì)胞上靶分子的一種或多種生物活性的方法，其中，所述靶細(xì)胞在其外部具有第一靶分子并在其外表面具有第二靶分子，且其中，(i)所述第一和第二靶分子不共享共有配體，(ii)所述第一靶分子在所述耙細(xì)胞表面上的豐度比也攜帶第二靶分子的非靶細(xì)胞表面上的豐度高至少10倍，和(iii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，所述方法包括(a)提供一種雙特異性結(jié)合劑，所述雙特異性結(jié)合劑具有與第一靶分子的Kd至少為10—7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與第二靶分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少I(mǎi)O倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)在允許第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別結(jié)合第一和第二耙分子的條件下使所述雙特異性結(jié)合劑與所述耙細(xì)胞接觸，其中所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述結(jié)合分別調(diào)節(jié)所述第一和所述第二靶分子的一種或多種生物活性。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述雙特異性結(jié)合劑包含兩種抗體。12.如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。13.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。14.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。15.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第一靶分子是受體酪氨酸激酶。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述第二靶分子是ErbB3(HER3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。17.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d為1(T8-1(T12M。18.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ诙蟹肿拥腒d比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少20倍。19.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ诙蟹肿拥腒d比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少50倍。20.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)是降低受體酪氨酸激酶的活性。21.—種雙特異性結(jié)合劑(bsBA)，其包含與靶細(xì)胞上第一靶分子的Kd至少為10—7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與耙細(xì)胞上第二耙分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少I(mǎi)O倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，(i)所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，(ii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且(iii)所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)其結(jié)合所述第一和所述第二靶分子時(shí)分別調(diào)節(jié)所述第一和第二耙分子的一種或多種生物活性。22.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少50倍。23.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低100倍或更多倍。24.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。25.如權(quán)利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。26.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。27.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合受體酪氨酸激酶。28.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合ErbB3(HER3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或(3、C-KIT、或ErbB4。29.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合EGFR，而所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合ErbB3(HER3)。30.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd為1(T8-1(T12M。31.如權(quán)利要求21所述的bsBA，其特征在于，所述第一耙分子在耙細(xì)胞上的表達(dá)比其在正常細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)度至少10倍。32.—種組合物，含有(a)雙特異性結(jié)合劑(bsBA)和(b)藥學(xué)上可接受的載體，所述雙特異性結(jié)合劑包含與靶細(xì)胞上第一靶分子的Kd至少為10—〒M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與耙細(xì)胞上第二靶分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一和第二耙分子不具有相同的天然配體，其中，(i)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且(ii)所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)其結(jié)合所述第一和所述第二靶分子時(shí)分別調(diào)節(jié)所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少50倍。34.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低100倍或更多倍。35.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。37.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子受體或受體酪氨酸激酶。38.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述第一靶分子在靶細(xì)胞上的表達(dá)比在也帶有第二靶分子的非靶細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)度至少10倍。39.—種雙特異性結(jié)合劑(bsBA)在藥物制造中的應(yīng)用，所述雙特異性結(jié)合劑包含與耙細(xì)胞上第一耙分子的Kd至少為1(T7M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與靶細(xì)胞上第二靶分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一和第二耙分子不具有相同的天然配體，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)其結(jié)合所述第一和所述第二靶分子時(shí)分別調(diào)節(jié)所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。40.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少50倍。41.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低100倍或更多倍。42.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。43.如權(quán)利要求42所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。44.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述被第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的靶分子獨(dú)立選自腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體，前提是第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域不結(jié)合相同的腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體或生長(zhǎng)因子受體。45.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物用于抑制癌細(xì)胞增殖。46.如權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其特征在于，所述第一靶分子在靶細(xì)胞上的表達(dá)比在也帶有第二靶分子的非靶細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)度至少10倍，或者更多倍。47.—種試劑盒，其裝有-(a)容器，禾口(b)雙特異性結(jié)合劑(bsBA)，其包含與靶細(xì)胞上第一靶分子的Kd至少為10^M的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與靶細(xì)胞上第二靶分子的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝话蟹肿拥腒d低至少10倍的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，(i)所述第一和第二靶分子不具有相同的天然配體，(ii)所述第一靶分子和所述第二靶分子各具有生物活性，所述活性相同或不同，且(iii)所述第一和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)其結(jié)合所述第一和所述第二靶分子時(shí)分別調(diào)節(jié)所述第一和第二靶分子的一種或多種生物活性。48.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低至少50倍。49.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd比所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd低100倍或更多倍。50.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述bsBA包含兩種抗體。51.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體是雙抗體、直接連接或通過(guò)接頭連接的兩條單鏈Fv、二硫鍵穩(wěn)定的Fv或其組合。52.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤相關(guān)性抗原、細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子受體或受體酪氨酸激酶。53.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合ErbB3(HER3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-l受體(IGF1-R)、FGF受體1-4中的任何一種、HGF受體、胰島素受體、PDGF受體a或p、C-KIT、或ErbB4。54.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合EGFR，而所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合ErbB3(HER3)。55.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Kd為10-8-l(T12M。56.如權(quán)利要求47所述的試劑盒，其特征在于，所述第一靶分子在靶細(xì)胞上的表達(dá)比其在正常細(xì)胞上的表達(dá)過(guò)度至少10倍。全文摘要描述了提高雙特異性結(jié)合組合物特異性結(jié)合能力的方法。所述雙特異性結(jié)合組合物能夠通過(guò)靶細(xì)胞表面標(biāo)記的親和力高的靶向結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合第二細(xì)胞表面標(biāo)記的親和力低的靶向結(jié)構(gòu)域靶向細(xì)胞，其中，各結(jié)構(gòu)域與其各自的細(xì)胞表面標(biāo)記的結(jié)合根據(jù)需要提高或降低了各自的細(xì)胞表面標(biāo)記的生物活性。本發(fā)明還提供了雙特異性結(jié)合劑在所述方法中的應(yīng)用以及它們?cè)谠噭┲械膽?yīng)用。文檔編號(hào)A61K39/395GK101163501SQ200580049292公開(kāi)日2008年4月16日申請(qǐng)日期2005年5月5日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者B·M-·舍貝爾,U·B·尼爾森申請(qǐng)人:梅里麥克制藥股份有限公司