專利名稱：：使用成骨細(xì)胞與生物基質(zhì)的混合物的成骨用組成物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物的成骨用組成物及其制備方法，尤其涉及一種用于骨缺陷或者所需區(qū)域成骨移植的使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物的成骨用組成物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：根據(jù)世界健康組織(WorldHealthOrganization,WHO)的報(bào)道，超過(guò)半數(shù)的65歲以上老人遭受慢性骨病的痛苦，并且與骨質(zhì)疏松有關(guān)的骨折發(fā)生數(shù)量是過(guò)去十年的2倍。這些數(shù)據(jù)與40%的50歲及50歲以上的女性相似。在美國(guó)，每年大概有560萬(wàn)人經(jīng)歷骨折，其中的310萬(wàn)人進(jìn)行外科手術(shù)。根據(jù)國(guó)際醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)(MedicalDataInternational,MDI)的統(tǒng)計(jì)報(bào)道，1995年共實(shí)施了426,000例骨移植手術(shù)。全球一年用于骨移植的費(fèi)用大約為8億美元。僅僅1995年一年，骨移植包括58%的自體移植，34%的異體移植及8%的合成材料移植。通常，簡(jiǎn)單的(封閉的)骨折用石膏固定幾個(gè)星期就可以完全愈合，但是嚴(yán)重的骨折或者骨缺陷需要骨移植。然而，自體移植的缺點(diǎn)是在骨接受區(qū)域會(huì)引起強(qiáng)烈的疼痛，在骨移植手術(shù)后需要很長(zhǎng)一段時(shí)間恢復(fù)，并且保護(hù)用于骨移植的供體部位是十分困難的。同時(shí)，異體移植也要經(jīng)歷致命的缺點(diǎn)，例如滅菌過(guò)程造成的骨強(qiáng)度變?nèi)?，出現(xiàn)移植排異反應(yīng)，被傳染性疾病傳染，例如乙型肝炎和艾滋病。另外一種骨移植可用方法，在具有生物活性的金屬或者非生物活性的陶制材料上涂一層在整形外科手術(shù)中廣泛應(yīng)用的支撐材料，但是由于一些問(wèn)題在骨移植中應(yīng)用金屬是十分困難的，例如金屬的腐蝕性問(wèn)題，覆蓋金屬陶瓷表面，骨及被移植部位表面劇烈形成纖維性組織。至于骨形成因素，盡管從1952年Urist和Mclean公布成骨蛋白對(duì)骨形成的影響以來(lái)有大量關(guān)于不同因素的研究，但是其生產(chǎn)過(guò)程是非常復(fù)雜和昂貴的，并且低效，這導(dǎo)致了低產(chǎn)以及最終有限的臨床應(yīng)用。同時(shí)，骨髓注射是基于Huggins(1931),Friedenstein(1973),和Ashton(1980)聲明的技術(shù)，其中來(lái)自骨髓的骨原細(xì)胞促進(jìn)并推動(dòng)骨形成。骨髓注射在治療骨折時(shí)通常單獨(dú)使用，但也在骨移植中使用。與其它骨移植技術(shù)不同，這種骨髓注射供體不需切開(kāi)皮膚，十分有利于保護(hù)供體，沒(méi)有并發(fā)癥或其它不利影響。其后，盡管大量臨床應(yīng)用病例獲得好結(jié)果被報(bào)道，骨髓注射的缺點(diǎn)是不具有健全的理論基礎(chǔ)，獲得的相當(dāng)一部分結(jié)果間不具有一致性，從一個(gè)位置收集的骨髓數(shù)量是有限的，骨髓中的骨原細(xì)胞的數(shù)量是相當(dāng)有限的。這樣，一種新的骨形成和移植方法，通過(guò)培養(yǎng)、擴(kuò)增骨原細(xì)胞獲得足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞與生物基質(zhì)混合，將獲得的混合物注射到成骨區(qū)域，這是一種高效的方法，有重大優(yōu)勢(shì)和有益效果，與傳統(tǒng)自體移植或異體移植和骨髓注射相比，這種骨再生治療方法在組織工程學(xué)領(lǐng)域獲得了大量關(guān)注。因此，基于上述由移植或者傳統(tǒng)骨移植技術(shù)帶來(lái)的問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)方法，通過(guò)向骨結(jié)合的部位注射成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物，無(wú)臨床移植排異，通過(guò)注射適于一定程度的組成物可以獲得有效、快速的骨結(jié)合，以致減輕由于注射的成骨細(xì)胞從骨結(jié)合區(qū)域逃逸而造成的非必要區(qū)域骨組織形成及成骨細(xì)胞通過(guò)血流增生的問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題是由于注射成骨細(xì)胞懸浮液而造成的。
發(fā)明內(nèi)容與本發(fā)明的一個(gè)方面一致，上述及其它目的通過(guò)提供一種制備用于骨結(jié)合的組成物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括從骨組織中分離成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium)或者a隱MEM(MinimumEssentialMedium,AlphaModification)中培養(yǎng)/增生分離的成骨細(xì)胞及其前提細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液；及將獲得的成骨細(xì)胞懸浮液與生物基質(zhì)混合制備成骨細(xì)胞治療劑。其中，治療劑的制備步驟進(jìn)一步包括將成骨細(xì)胞混合溶液與凝血?jiǎng)┗旌?，所述成骨?xì)胞懸浮液混有生物基質(zhì)。其中，混合步驟包括成骨細(xì)胞混合溶液與IO至100IU/mL的作為凝血?jiǎng)┑哪富旌?；含有凝血酶的混合溶液與20至100mg/mL的作為凝血?jiǎng)┑难w蛋白原混合。其中，生物基質(zhì)^J交原蛋白、羥磷灰石或者二者的混合物。其中，膠原蛋白向成骨細(xì)胞懸浮液中的加量為67A/g/mL至20mg/mL，羥磷灰石向成骨細(xì)胞懸浮液中的加量為30Aig/mL至3.4mg/mL。膠原蛋白與成骨細(xì)胞懸浮液混合前用中和溶液中和至中性pH值。在向骨細(xì)胞與生物基質(zhì)的混合溶液中加入前，凍干凝血酶要先溶解于液體DMEM或者a-MEM中，磷酸鹽離子(PO-)作為骨礦物質(zhì)成分加入，在培養(yǎng)基質(zhì)中磷酸鹽離子(po43-)的加量是凝血酶的兩倍。然后，在向獲得的成骨細(xì)胞混合溶液中加入前，凍干血纖蛋白要先溶解于液體DMEM或者a-MEM中，鉤離子(Ca2+)作為骨礦物質(zhì)成分加入，在培養(yǎng)基質(zhì)中鈣離子(Ca2+)的加量是血纖蛋白的兩倍。與本發(fā)明的另一方面相一致，提供了一種用上述方法制備的用于骨形成的組成物，該組成物使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物。與現(xiàn)有^^支術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)與一種用于骨結(jié)合的使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物的組成物及其制備方法相一致，如上所述，通過(guò)向骨結(jié)合部位注射成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物，能夠完成骨形成，無(wú)臨床移植排異，通過(guò)注射適于一定程度的組成物可以獲得有效、快速的骨結(jié)合，以致減輕由于注射的成骨細(xì)胞從骨結(jié)合區(qū)域逃逸而造成的非必要區(qū)域骨組織形成以及成骨細(xì)胞通過(guò)血流增生的問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題是由于注射成骨細(xì)胞懸浮液而造成的。圖l是骨形成速率曲線圖；圖2是用本發(fā)明所述的成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物制備成骨組成物的工藝流程圖；圖3是向免疫缺陷鼠皮下注射由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑的照片；圖4是移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑4周后的免疫缺陷鼠照片；圖5是移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑4周后的移植體照片；圖6是移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑4周后的免疫缺陷鼠放射自顯影圖；圖7是移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑8周后，能證確認(rèn)骨形成的蘇木精-曙紅染色組織切片圖；圖8是移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑8周后，能證確認(rèn)骨形成的Masson三色法染色組織切片圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明一種使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物制備用于骨形成的組成物的方法將參考附圖做進(jìn)一步詳細(xì)描述。為了克服傳統(tǒng)治療方法治療骨相關(guān)錯(cuò)亂和疾病的不足，例如移植和骨移植，通過(guò)培育成骨細(xì)胞，自體成骨細(xì)胞移植技術(shù)作為最后的治療方法在受損部位無(wú)副作用，與傳統(tǒng)治療方法的改進(jìn)共同發(fā)展。然而，為了獲得更快的骨結(jié)合，需要將成骨細(xì)胞與基質(zhì)混合來(lái)治療多種病變，因此，僅僅注射由成骨細(xì)胞構(gòu)成的液體成骨細(xì)胞懸浮液可能治療多種骨疾病，沒(méi)有獲得治療的益處?？梢赃@樣說(shuō)，由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物制成的成骨細(xì)胞治療劑是一種更先進(jìn)的基于細(xì)胞治療的注射液體成骨細(xì)胞懸浮液方法的方式。傳統(tǒng)的液體成骨細(xì)胞懸浮液注射方法，包括單獨(dú)移植成骨細(xì)胞，僅僅可以治療有限類型的骨缺陷，并且要遭受一些由于注入的成骨細(xì)胞從骨形成位點(diǎn)逃逸，骨組織在非必要區(qū)域形成，及經(jīng)過(guò)血流在其它位點(diǎn)增生的相關(guān)問(wèn)題。相反地，本發(fā)明由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物制成的成骨細(xì)胞治療劑，可以快速有效地治療較大范圍的骨缺陷和嚴(yán)重的骨疾病。骨由骨細(xì)胞和大量細(xì)胞間骨基質(zhì)組成，大部分骨基質(zhì)由35%的由膠原蛋白如圖l所示，骨是生物合成物質(zhì)，由礦物質(zhì)、膠原蛋白、水份、非膠原蛋白、液體、血管成分和細(xì)胞組成，按照含量由高至低排列。無(wú)機(jī)物質(zhì)在骨成分中占有最大比例，與地質(zhì)礦物質(zhì)羥磷灰石(hydroxyapatite,HA)相似。骨磷灰石一般缺鈣和羥基，其被大量雜質(zhì)替代，包括碳酸鹽及鎂、鉀、硼，磷酸鹽和檸檬酸鹽，其中最大量的是碳酸鹽。骨礦物質(zhì)中的碳酸鹽含量隨著骨成熟而增長(zhǎng)。碳酸鹽替代了羥基或者磷酸鹽基團(tuán)，或被骨磷灰石表面吸附。骨中含量第二高的成分是膠原蛋白，主要是I型膠原蛋白。膠原蛋白給與骨彈性和靈活性，提供了基質(zhì)構(gòu)造方向。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，成骨細(xì)胞與生物基質(zhì)混合，得到的混合物注射到患骨病區(qū)域，膠原蛋白和羥磷灰石都是骨成分，混合后注射到病灶。因此，可以首先獲得骨的物理特性，從而實(shí)現(xiàn)快速骨形成和充分的礦質(zhì)化骨骼?；旌铣晒羌?xì)胞和骨基質(zhì)的主要成分-生物基質(zhì)，一個(gè)最關(guān)鍵的因素是穩(wěn)定性。為了保證基質(zhì)中的足夠數(shù)量細(xì)胞，細(xì)胞存活率應(yīng)該提高。另外，在實(shí)施移植后，提高細(xì)胞的移入速率也是十分重要的。圖2是工藝流程圖，解釋了用本發(fā)明所述的成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物制備成骨組成物的方法。根據(jù)圖2，用本發(fā)明所述的制備成骨組成物的方法包括/人骨組織中分離成骨細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium)或者a-MEM(MinimumEssentialMedium,AlphaModification)中培養(yǎng)/增生分離的成骨細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液(S100);獲得的成骨細(xì)胞懸浮液與生物基質(zhì)混合，制備成骨細(xì)胞治療劑(S200)。其中，成骨細(xì)胞懸浮液中的成骨細(xì)胞數(shù)量根據(jù)病灶的大小和位置差別顯著。特別地，成骨細(xì)胞的適合范圍是106至1.2xl07個(gè)，更大數(shù)量的細(xì)胞也可以用。其中，治療劑的制備步驟(S200)進(jìn)一步包括在成骨細(xì)胞懸浮液中混合生物基質(zhì)，成骨細(xì)胞/生物基質(zhì)混合液與凝血?jiǎng)┗旌掀渲?，混合步驟包括成骨細(xì)胞/生物基質(zhì)混合液與10至100IU/mL的作為凝血?jiǎng)┑哪?S220)混合；含有凝血酶的混合溶液與20至100mg/mL的作為凝血?jiǎng)┑难w蛋白原(S230)混合。其中，生物基質(zhì)、膠原蛋白、羥磷灰石或其混合物被使用。當(dāng)膠原蛋白和羥磷灰石的混合物作為生物基質(zhì)^f吏用時(shí)，67戰(zhàn)/mL至20mg/mL的月交原蛋白與30戰(zhàn)/mL至3.4mg/mL的羥磷灰石混合。其中，當(dāng)膠原蛋白在培養(yǎng)成骨細(xì)胞過(guò)程中作為用于涂覆培養(yǎng)瓶的涂覆材料時(shí)，膠原蛋白的最小濃度是導(dǎo)致細(xì)胞分化和增生的最適合培養(yǎng)濃度。當(dāng)這時(shí)應(yīng)用的膠原蛋白濃度是作為基質(zhì)成分應(yīng)用時(shí)，可以確認(rèn)注射由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)相互混合而成的組成物，在成骨細(xì)胞表達(dá)膠原蛋白前被注射的膠原蛋白成分，形成基本基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致細(xì)胞分化和快速礦質(zhì)化，接下來(lái)導(dǎo)致用最小量膠原蛋白的快速成骨。其中，膠原蛋白作為單獨(dú)的基質(zhì)使用，等于或大于3mg/mL(0.3%)的膠原蛋白濃度在預(yù)定條件下導(dǎo)致凝膠化，進(jìn)而形成基質(zhì)。相反地，最大濃度20mg/mL的膠原蛋白導(dǎo)致流動(dòng)性的急劇下降，成骨細(xì)胞不均勻分布于膠原蛋白基質(zhì)，這樣用膠原蛋白作為細(xì)胞基質(zhì)是困難的。進(jìn)一步，羥磷灰石在基質(zhì)混合物中促進(jìn)礦化，應(yīng)該加入一定濃度的幾磷灰質(zhì)。羥磷灰質(zhì)在細(xì)胞基質(zhì)混合物中占據(jù)一定空間，過(guò)量的羥磷灰質(zhì)由于空間限制會(huì)抑制細(xì)胞分化。因此，在本發(fā)明中，羥磷灰質(zhì)應(yīng)用最小濃度，羥磷灰質(zhì)在基質(zhì)成分中作為礦化核，并且是促進(jìn)礦化的最適濃度。另一方面，在與成骨細(xì)胞懸浮液混合前，膠原蛋白用中和溶液中和至中性pH值。另外，在向骨細(xì)胞與生物基質(zhì)的混合溶液中加入前，凍干凝血酶要先溶解于液體DMEM或者a-MEM中，加入磷酸鹽離子(PO,),在培養(yǎng)基質(zhì)中磷酸鹽離子(po43-)的加量是凝血酶的兩倍。然后，在向獲得的成骨細(xì)胞混合溶液中加入前，凍干血纖蛋白原要先溶解于液體DMEM或者a-MEM中，加入鈣離子(Ca2+),在培養(yǎng)基質(zhì)中鈣離子(Ca2+)的加量是血纖蛋白的兩倍。其中，磷酸鹽離子和鈣離子對(duì)成骨細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒素作用，并且可以補(bǔ)充骨礦物質(zhì)成分。凝血酶作為凝血?jiǎng)┰诨旌先芤褐械幕旌蠞舛葹镮O至IOOIU/mL，血纖蛋白原作為凝血?jiǎng)┰诤心傅幕旌先芤褐械暮繛?0至100mg/mL。其中，凝血酶的濃度決定了血纖維蛋白的聚合時(shí)間。因此，血纖蛋白的聚合時(shí)間可以根據(jù)凝血酶的濃度由4小時(shí)減少至3秒。本發(fā)明所述組成物中凝血酶的應(yīng)用濃度是阻止成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合成分從為了成骨注射的病灶區(qū)域滲漏，向病灶區(qū)域注射的組成物導(dǎo)致快速聚合，成骨細(xì)胞形成適合骨形成的血纖蛋白孔基質(zhì)。本發(fā)明實(shí)施例所述一種使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物制成的組成物對(duì)成骨的影響將參考附圖做進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例l首先，從相關(guān)組織中分離成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在DMEM或a-MEM中培養(yǎng)及增生4個(gè)星期，制備由DMEM或a-MEM組成的成骨細(xì)胞懸浮液。生物基質(zhì)混合入其中，準(zhǔn)備膠原蛋白。然后，得到的成骨細(xì)胞懸浮液與膠原蛋白混合，制成lmL成骨組成物。實(shí)施例2從相關(guān)組織中分離成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在DMEM或a-MEM中培養(yǎng)及增生4個(gè)星期，制備由DMEM或a-MEM組成的成骨細(xì)胞懸浮液。準(zhǔn)備生物基質(zhì)、膠原蛋白、羥磷灰石。在成骨細(xì)胞懸浮液中加入1/10的羥磷灰石并混合均勻。生物基質(zhì)混合入其中，準(zhǔn)備2/5體積的膠原蛋白。成骨細(xì)胞與膠原蛋白混合制成lmL成骨組成物。實(shí)施例3從相關(guān)組織中分離成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在DMEM或a-MEM中培養(yǎng)及增生4個(gè)星期，制備由DMEM或a-MEM組成的成骨細(xì)胞懸浮液。準(zhǔn)備生物基質(zhì)、膠原蛋白、羥磷灰石。在成骨細(xì)胞懸浮液中加入2/5體積的膠原蛋白和1/10體積的羥磷灰石并混合均勻。生物基質(zhì)混合入其中，組成成骨細(xì)胞治療劑。在室溫制備醫(yī)學(xué)級(jí)血纖蛋白膠后，向裝有凍干血纖蛋白的試劑瓶中加適量液體DMEM或者a-MEM溶解血纖蛋白原。另外，向裝有凍干凝血酶的試劑瓶中加適量液體DMEM或者a國(guó)MEM溶解凝血蛋白。然后，取1/10體積溶解的凝血酶，加入混有生物基質(zhì)的液體成骨細(xì)胞懸浮液，>'昆合均勻。與凝血酶和生物基質(zhì)混合的成骨細(xì)胞懸浮液與等量的溶解纖維蛋白原混合，制成lmL成骨組成物。實(shí)施例4從相關(guān)組織中分離成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在DMEM或a-MEM中培養(yǎng)及增生4個(gè)星期，制備由DMEM或a-MEM組成的成骨細(xì)胞懸浮液。準(zhǔn)備生物基質(zhì)、膠原蛋白、羥磷灰石。在成骨細(xì)胞懸浮液中加入2/5體積的膠原蛋白和1/10體積的羥磷灰石并混合均勻，制成混有生物基質(zhì)的成骨細(xì)胞治療劑。在室溫制備醫(yī)學(xué)lljk纖蛋白膠后，向裝有凍干血纖蛋白的試劑瓶中加適量液體DMEM或者a-MEM溶解血纖蛋白原。另夕卜，向裝有凍干凝血酶的試劑瓶中加適量液體DMEM或者a-MEM溶解凝血蛋白。這時(shí)，液體DMEM或者a-MEM中加入磷酸鹽離子(PO-)，至濃度為2mg/mL。另外，向裝有凍干凝血酶的試劑瓶中加適量液體DMEM或者a-MEM溶解凝血蛋白。這時(shí)，液體DMEM或者a-MEM中加入4丐離子(Ca2+)，至濃度為4mg/mL。這里使用的磷酸鹽離子(PO-)和鉤離子(Ca2+)的量是適中量，對(duì)成骨細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒作用，并且作為培養(yǎng)溶液的添加劑補(bǔ)充骨礦物質(zhì)成分。然后，取1/10體積溶解的凝血酶，加入混有生物基質(zhì)的液體成骨細(xì)胞懸浮液，混合均勻。含有凝血酶和生物基質(zhì)的成骨細(xì)胞懸浮液與等量的溶解纖維蛋白原混合，制成lmL成骨組成物。結(jié)論15只免疫缺陷鼠分成6組(三只一組)。然后，用由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物制成的成骨細(xì)胞治療劑進(jìn)行注射，通過(guò)皮下注射到棵鼠的肩胛骨。每只免疫缺陷鼠皮下注射lmL成骨細(xì)胞治療劑。注射4周和8周后記錄結(jié)果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表l表示含有相同生物基質(zhì)成分但不同成骨細(xì)胞數(shù)量的成骨細(xì)胞治療劑分別移植到免疫缺陷鼠，成骨細(xì)胞治療劑是成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>移植成骨細(xì)胞治療劑8周后見(jiàn)表l,獲得的成骨結(jié)果見(jiàn)表2表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3表示含有不同生物基質(zhì)成分的成骨細(xì)胞治療劑分別移植到免疫缺陷鼠，成骨細(xì)胞治療劑是成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>這里，成骨等級(jí)依次分為優(yōu)、好、一般和差。移植成骨細(xì)胞治療劑8周后見(jiàn)表3,獲得的成骨結(jié)果見(jiàn)表4。圖3是向免疫缺陷鼠皮下注射由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑的照片；圖4是移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑4周后的免疫缺陷鼠照片(觀察點(diǎn)畫線圈中的凸出部分)；圖5是向免疫缺陷鼠注射由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑4周后的成骨移植體照片，確認(rèn)在移植體周圍形成了血管。圖6是移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑4周后的免疫缺陷鼠放射自顯影圖，可以觀察到在脊柱周圍形成了新骨，如點(diǎn)畫線的圓圈。圖7是向免疫缺陷鼠移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑8周后，能證確認(rèn)骨形成的蘇木精-曙紅染色組織切片圖?？梢钥闯?，類骨質(zhì)(見(jiàn)黑箭頭)可以被觀察到，成骨細(xì)胞分布至腔隙(見(jiàn)白箭頭)可以被確認(rèn)。圖8是向免疫缺陷鼠移植由成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)組成的成骨細(xì)胞治療劑8周后，能確認(rèn)骨形成的Masson三色法染色組織切片圖，可以確認(rèn)成骨發(fā)生與膠原蛋白相關(guān)，沿著預(yù)定的形式，這表明在血管在基質(zhì)間滲透。因而，與本發(fā)明一致，提供了一種成骨方法，通過(guò)向成骨部位注射成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物，無(wú)臨床排異反應(yīng)，通過(guò)注射一定量的組成物獲得高效和快速的成骨。遵循本發(fā)明，用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合制成的成骨組成物，及其制備方法，如上所述，使骨形成，通過(guò)向成骨部位注射成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物，無(wú)臨床排異反應(yīng)，通過(guò)注射一定量的組成物獲得高效和快速的成骨，以致減輕由于注射的成骨細(xì)胞從骨結(jié)合區(qū)域逃逸而造成的非必要區(qū)域骨組織形成及成骨細(xì)胞通過(guò)血流增生的問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題是由于注射成骨細(xì)胞懸浮液而造成的。以上公開(kāi)的僅為本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思的的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物制備成骨組成物的方法，其特征在于，包括從骨組織中分離成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)或者α-MEM(MinimumEssentialMedium，AlphaModification)中培養(yǎng)/增生分離的成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液；及將獲得的成骨細(xì)胞懸浮液與生物基質(zhì)混合制備成骨細(xì)胞治療劑。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述，其特征在于，治療劑的制備步驟進(jìn)一步包括將成骨細(xì)胞混合溶液與凝血?jiǎng)┗旌?，所述成骨?xì)胞懸浮液中混有生物基質(zhì)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述，其特征在于，混合步驟包括成骨細(xì)胞混合溶液與10至100IU/mL的作為凝血?jiǎng)┑哪富旌?；含有凝血酶的混合溶液與20至100mg/mL的作為凝血?jiǎng)┑难w蛋白原混合。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述，其特征在于，生物基質(zhì)是膠原蛋白、羥磷灰石或者其混合物。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述，其特征在于，膠原蛋白向成骨細(xì)胞懸浮液中的加量為67Aig/mL至20mg/mL,羥磷灰石向成骨細(xì)胞懸浮液中的加量為30i^g/mL至3.4mg/mL。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述，其特征在于，膠原蛋白與成骨細(xì)胞懸浮液混合前用中和;容液中和至中性pH值。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述，其特征在于，在向骨細(xì)胞與生物基質(zhì)的混合溶液中加入前，凍干凝血酶要先溶解于液體DMEM或者a-MEM中，磷酸鹽離子(P043-)作為骨礦物質(zhì)成分加入，在培養(yǎng)基質(zhì)中磷酸鹽離子(P043-)的加量是凝血酶的兩倍；及在向獲得的成骨細(xì)胞混合溶液中加入前，凍干血纖蛋白要先溶解于液體DMEM或者a-MEM中，4丐離子(Ca2+)作為骨礦物質(zhì)成分加入，在培養(yǎng)基質(zhì)中鈣離子(Ca2+)的加量是血纖蛋白的兩倍。8、一種用權(quán)利要求1所述方法制備的使用成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)混合物制成的成骨組成物。全文摘要本發(fā)明提供了一種使用成骨細(xì)胞與生物基質(zhì)的混合物的成骨用組成物及其制造方法，此方法包括從骨組織中分離成骨細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)或者α-MEM(MinimumEssentialMedium，AlphaModification)中培養(yǎng)/增生分離的成骨細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液；及將獲得的成骨細(xì)胞懸浮液與生物基質(zhì)混合制備成骨細(xì)胞治療劑。遵循本發(fā)明，實(shí)現(xiàn)了一種成骨方法，通過(guò)向成骨部位注射成骨細(xì)胞和生物基質(zhì)的混合物，無(wú)臨床排異反應(yīng)，通過(guò)注射一定量的組成物獲得高效和快速的成骨，以致減輕由于注射的成骨細(xì)胞從骨結(jié)合區(qū)域逃逸而造成的非必要區(qū)域骨組織形成及成骨細(xì)胞通過(guò)血流增生的問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題是由于注射成骨細(xì)胞懸浮液而造成的。文檔編號(hào)A61K35/28GK101227915SQ200580049966公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2005年6月27日優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日發(fā)明者張?jiān)诘?張晶皓,樸炫信,李璽邦,鄭修真,高暢權(quán)申請(qǐng)人:世源世龍股份有限公司