專利名稱：轉(zhuǎn)錄組修飾劑和化學(xué)療法或放射療法對抗癌癥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將轉(zhuǎn)錄組修飾劑(transcriptome-modifying agents)用于輔 助治療惡性腫瘤，其通過阻止惡性腫瘤細(xì)胞識別這樣的基因改變而進行， 所述基因改變是對抗細(xì)胞刺激和經(jīng)受化學(xué)療法或放射療法仍舊存活所必 需的，更具體地本發(fā)明涉及抑制DNA甲基化和組蛋白脫乙酰作用的機制 的轉(zhuǎn)錄組修飾劑的組合使用，更具體地本發(fā)明涉及通過包括肼屈嗪和丙戊 酸或其任一種鹽如丙戊酸鎂的治療試劑盒的方式以與化學(xué)治療或放射治 療聯(lián)合輔助癌癥治療的組合應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥或惡性腫瘤可以被分類為實體瘤的或造血系統(tǒng)瘤。第一種的實例 特別包括癌癥如乳腺癌，頭頸癌，結(jié)腸和直腸癌。造血類型的實例包括白 血病和淋巴瘤。在細(xì)胞核內(nèi)的DNA排列在染色質(zhì)上，并且具有一些等級 順序。染色質(zhì)的組成單元是核小體，其由已知為組蛋白的八聚體核蛋白組 成，并且在其上纏繞著DNA。 DNA在核小體內(nèi)的排列和包裝對于基因調(diào) 節(jié)起重要作用。組蛋白的共價修飾，如乙?；?，對于染色質(zhì)調(diào)節(jié)和基因表 達(dá)起基石出作用(C7zo 五/z'zoA7cfo ZJ， 5oeWtoe/ CF: ^cfwmces c/ rawa"" 謂o赫"g朋d /z訓(xùn)朋^'酒se依染色i重餅〃乂類疾瘋^游遂展」.C醉 Op/"Ge"dDev (遺傳發(fā)育學(xué)的現(xiàn)代觀點)2M《WJ朋-")。
目前，癌癥仍舊是世界范圍的嚴(yán)重健康問題，根據(jù)國際癌癥研究協(xié)會 (International Cancer Research Agency)和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization),該疾病的發(fā)病率正在急劇增加，估計在2000年有一千萬的 新病例，在接下來的20多年里將達(dá)到1500萬(Mg"og"a MA FeA/e Amsso ZX. T7 e恥r/cf Ca"cer i epoW 6wrcfe" o/or"/ cawcer f^"i^;^",
艱if^7/7^^虜i^游力資;).五^/Ca"cwiVev.(歐洲癌癥預(yù)防雜志)2WM; "P-W).。另一個方面，在最近數(shù)年中，患有最常見癌癥如肺癌，前列腺 癌和乳腺癌的患者的存活已經(jīng)在穩(wěn)步增加。在1974年，達(dá)到5年的存活
是50°/。，而在992-999年間，這一數(shù)字增加到63% (Jewa/4 7; ￡， S識we/51」，！H而n. AC, G/z—or ￡乂 7Tmw M/
盡管在治療方式上的進展已經(jīng)取得了在存活上的較小程度的成功，但 是該結(jié)果仍舊是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前，化學(xué)療法和外科手術(shù)和放射療法仍舊 是基本的治療基礎(chǔ)，因為絕大多數(shù)癌癥患者需要這種形式的治療。
近年來，在癌癥的分子基礎(chǔ)上產(chǎn)生的大量知識容許設(shè)計新形式的治療 方法，其通常涉及阻止癌基因的功能或重新激活抑制基因的表達(dá)。這些嘗 試的實例是使用針對一些癌基因受體，如EGFR， HER2等的單克隆抗體。 在抑制基因的情形中， 一些治療上的嘗試是使用具有針對p53的功能產(chǎn)物 的編碼基因的重組腺病毒(//^w/Wo" 7T^ D//. Ge"Wca//_y ZjosW
^scOTeo^"d^ve/o; me"t Oi"i^游遺傳基鄉(xiāng)游治^V與傳統(tǒng)^"激發(fā)觀浙發(fā) ,游浙欽絲*差_#^ M / 7Tz^f分^治勸.M05，' ":W6-507)。
一般說來，我們可以將這種新形式的癌癥稱為單基因產(chǎn)物或單基因治 療方法。然而，這種方法具有一些缺陷，因為惡性腫瘤細(xì)胞基因組具有極 大的適應(yīng)性并且因為癌癥的發(fā)展涉及多個步驟，因此不存在導(dǎo)致惡性腫瘤 表型發(fā)展的單基因改變。這意味著，盡管阻止或恢復(fù)基因或其產(chǎn)物可以產(chǎn) 生重要的抗腫瘤效果，所述效果卻是無法支持的，因為惡性腫瘤細(xì)胞最終 一定會發(fā)展針對所述療法的抗性，其原因在于所述惡性腫瘤細(xì)胞將增加或 減少基因的表達(dá)，這可以適應(yīng)由所述療法產(chǎn)生的影響(i ow 5t&"k/"
尸Ze&wsk(尺M丄/"e"e (7《乂 5"tog/z'a"o iVE， GVm6wg GS1，
M似.爿w C7/"尸"Ao/,(美國臨床病理學(xué)雜志)2M4;
目前，眾所周知的是惡性腫瘤細(xì)胞具有多種缺陷，即突變，缺失，重 復(fù)，擴增以及外遺傳改變，后者主要由于染色質(zhì)修飾而成為穩(wěn)定的功能改 變，兩種更重要的改變是DNA申基化和組蛋白乙?；Ｍ膺z傳改變必須 在某一特定狀態(tài)并且以完美的功能平衡作用以維持"惡性動態(tài)平衡"。這
一概念是非常重要的，因為惡性細(xì)胞所有的缺陷不是簡單的綜合，其與這 樣的事實是一致的，即由所述基因編碼的蛋白在復(fù)合物的網(wǎng)絡(luò)和表現(xiàn)出對 正反饋和負(fù)反饋的控制的相互作用功能中具有多重作用。此外，盡管在腫 瘤發(fā)生中存在的多個步驟的過程，細(xì)胞應(yīng)該維持在皆來自致癌途徑和抑制 基因的陽性信號和陰性信號之間的穩(wěn)態(tài)，以確保增殖和細(xì)胞死亡的過程根
據(jù)惡性狀態(tài)動力學(xué)發(fā)生Z6. C"w匿」必/Wo" to owcoge腦-Ae JcMfe to/ o/謹(jǐn)匿 對蘑基茵游瞢,蘑,游爿cMfes治勸-
5"c/e"c (科學(xué))2M々297f557S」.'W-0。
除了惡性細(xì)胞的總的基因表達(dá)的固有的復(fù)雜性，當(dāng)試圖作為外源刺激 的結(jié)果，特別是來自化學(xué)療法或放射療法的影響而調(diào)節(jié)基因表達(dá)時，描述 要復(fù)雜得多。化學(xué)療法和放射療法在基因轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生立即的改變，并且這 些改變不僅發(fā)生在主要與致癌過程相關(guān)的那些基因中，還發(fā)生在不直接參 與的基因中，如參與代謝、轉(zhuǎn)運等的那些基因中。(J/aoMz'-/ama/ZM4,
f謂sc豐z'o"a/ 戸feowz'c //"g ("遞過存錄/〃歪^#,式,#^* ^游藥激敎減絲浙^"笏拔&). Drag C/^^.(藥物抗性更新)
M似;7:M5-55)。然而，最重要的方面，是只有能夠?qū)τ泻Υ碳ぞ哂谐渥愕?轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的那些細(xì)胞是將在所述刺激下存活下來的唯一的細(xì)胞。明顯地， 為了使該反應(yīng)"適應(yīng)于"存活發(fā)生，不可缺少的是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的外遺傳機制 是完整的。因此，如果惡性細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組-修飾劑的影響下，存活所必需的 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將不會發(fā)生，并且所述細(xì)胞可能具有功能不可逆的改變或遭受細(xì) 胞程序性死亡。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄可以被定義為所述細(xì)胞表達(dá)生物活性蛋白 的能力。因此，轉(zhuǎn)錄是高度受調(diào)節(jié)的現(xiàn)象。所述過程在基因水平上起始并 且在蛋白水平上終止并且包括多個事件；因此轉(zhuǎn)錄具有數(shù)個調(diào)節(jié)水平，其 中它們是下列各項1)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，其是DNA的物理結(jié)構(gòu)，其包括染色 質(zhì)包裝的水平，所述染色質(zhì)包裝的水平確定調(diào)節(jié)蛋白與基因調(diào)節(jié)或啟動子 區(qū)結(jié)合的能力，2)轉(zhuǎn)錄起始的控制，3)轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)運，4)轉(zhuǎn)錄物加工和修 飾，5)轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性，6)翻譯起始，7)翻譯后改變，和8)蛋白的轉(zhuǎn)運和 禾急定'l"生。(/4rc/wm6aw/f /' jpn.ese" JD. (7e"e0.cs o/ewAarjof/c 7 jV/4 pofymerasej /, //,朋c//// r真提生激/ A^ ^合艨/，//浙///游遺傳;> .Mcra^o/i evf微生
^C^"^^). /^^57:703-^0。毋庸置疑，作用在越高的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平上，轉(zhuǎn) 錄效果將越重要。因此，轉(zhuǎn)錄組修飾劑，通過作用在最高的調(diào)節(jié)水平上， 對大量的總的基因表達(dá)具有作用。
組蛋白的共價修飾，如乙酰化作用，和DNA甲基化作用，在確定染 色質(zhì)包裝的級別和最終確定總的基因表達(dá)上具有關(guān)鍵的作用；因為該原 因，抑制DNA甲基化和組蛋白脫乙酰作用的藥劑已經(jīng)證實具有明顯改變 表達(dá)的性質(zhì)。甲基化作用的損失可能減少在某個基因座結(jié)合甲基化結(jié)構(gòu)域 的蛋白復(fù)合物的量，導(dǎo)致將必須被組蛋白脫乙酰酶-抑制劑抑制的組蛋白脫 乙酰酶活性的減少。此外，轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物的損失可以有利于基因啟動子 和具有組蛋白乙酰酶活性的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物的再次締合。已知DNA甲基 轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)的最豐富的形式可以直接結(jié)合于組蛋白脫乙酰酶，并且氨 基端還具有結(jié)合協(xié)阻抑物的能力(M^卯M五p/ge"efz'": /"&rac"o" o/i)A^ me^y/加'o"aw/c/zraw如'"(^遺傳,Z)A^伊基眾浙染經(jīng)^^游裙互/^^).
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盡管已經(jīng)測試了數(shù)百個潛在的抗腫瘤劑，治療人類癌癥仍然是具有挑 戰(zhàn)性的，其中許多抗腫瘤治療僅是部分有效的，并且具有對實際上所有的 系統(tǒng)導(dǎo)致附屬作用的可能性。因此，存在這樣的需要，即不僅具有更有效 的治療選擇，還以在基因轉(zhuǎn)錄上更具有選擇性的方式攻擊惡性細(xì)胞的更具 特異性的一些治療方法。為此原因，本發(fā)明的一個目的是提供基于改變轉(zhuǎn) 錄組而輔助癌癥治療的組合物，其通過使用轉(zhuǎn)錄修飾劑如肼屈嗪和丙戊酸 鎂的方式進行，使用其細(xì)胞將不能在由化學(xué)療法或放射療法誘導(dǎo)的有害刺 激下存活。
抗高血壓藥肼屈嗪是DNA甲基化抑制劑，其用于在實驗系統(tǒng)中使T 細(xì)胞DNA甲基化不足，這使這些細(xì)胞具有自反應(yīng)性(r""g凡C/7""g S
誘導(dǎo)的狼疫的機制).Com/ "nSo" o/praco^am^e /^<ira/az/"e 朋a/op & W的/" Wvo^體/A浙沐/^比莰普謄卡汲俊浙,腐驥與其類敘 激/y^/zn'to朋e謂.(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)/卯7,'W:/W6-W)。最近，己經(jīng)證實，
在體外和體內(nèi)模型中，肼屈嗪使來自抑制性抑制基因的啟動子區(qū)去甲基化
并且誘導(dǎo)其再激活；并且此外，再激活的基因產(chǎn)物是功能性的(&gwraJB， 7>e)o-Becem7 C' /￥/'e2C7zavez ^， Sa/azar爿M' Zizawo M' Dwe/to-Gowzd/ez
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C7/" Omce/^&s.(臨床癌癥研究)2卯H "96-603)。 肼屈嗪對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有直接抑制作用，并且在體外模式中， 已經(jīng)證實在該分子上的兩個氮原子與酶活性位點的氨基酸Lysl62和 Arg240相互作用，所述酶活性位點的氨基酸Lysl62和Arg240構(gòu)成抑制 基因的功能的去甲基化作用和再活化性質(zhì)G4"ge/a Fa^i^-]^tofez, 附'^s《Mez-歸^fez Q J^/oz《wez-(S""c/ze2爿M i^z附/rez A Mar""ez丄，
tw"weo/ /as/c age"f. Z)och'"g WW& cw weMy/f,'""映mye (l-肼基氮雜萘(胼 屈嗪)作為抗腫瘤藥劑的計算機研究.關(guān)于甲基轉(zhuǎn)移酶的評價研究^ .丄e/few />"《￡>鄉(xiāng)"￡>/謂^ (",欽沒絲發(fā)遞#7廁5,'《'U(5)。
丙戊酸或其鹽，如在已知作為VPA的丙戊酸鎂情形中，2-丙基戊酸是 已經(jīng)在許多年以來用作抗驚厥藥并具有充分證實的安全模式的藥物。
a/ er 35 years o/c/z'm.ca/ ex/ en'e"ce f^"/^"^^^^^"^^ 7^^;^7^廣.' 35年游游尿經(jīng)驗游,總錄).CA^Dn^fOVS,熟2002, /6:卯5-7/4)。最近 己經(jīng)證實這種藥物是組蛋白脫乙酰酶的抑制劑。被抑制的酶是I族和II族 種類的那些，不包括組蛋白脫乙酰酶6和10。在體外和體內(nèi)觀察到的組蛋 白H3和H4的高度乙酰化伴隨其對該酶家族的酶促抑制作用。這種對組 蛋白的作用對誘導(dǎo)分化、誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和抑制細(xì)胞增殖產(chǎn)生重要作
/j " torge/ o/va// ra/c aczW-膨血fed ce歸ar (i晚re""'a"o"像蛋占應(yīng)乙激藤 ;f/^/f麼分導(dǎo)效-智應(yīng)分眾必教標(biāo)義Ca"cw i e^蘑,砑究J
出于這種原因，本發(fā)明的另一個目的是提供由肼屈嗪和丙戊酸或其任 一種鹽如丙戊酸鎂組成的治療試劑盒，其有助于針對癌癥使用的通常療 法。
附圖簡述


圖1A, 1B， 1C, 1D， 1E， 1F，和1G，顯示用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄組修飾組合物處
理的不同的惡性細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性作用。
圖2 A, 2B和2C顯示本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄組修飾組合物在惡性細(xì)胞系中產(chǎn)生
代表性化療劑(順鉑，多柔比星和吉西他濱)的細(xì)胞毒性作用的增強。 圖3A顯示根據(jù)本發(fā)明的每種基因的甲基化頻率。 圖3B,顯示根據(jù)本發(fā)明的甲基化頻率的代表性情形。 圖3C，顯示根據(jù)本發(fā)明，在甲基化百分比和肼屈嗪劑量之間的相關(guān)性。
圖4A, 4B和4C顯示在治療前和治療后活組織檢查中的信使的基因表
達(dá)的示范性情形。
圖5, 6和7顯示根據(jù)本發(fā)明的組蛋白脫乙酰酶活性數(shù)據(jù)。
圖8顯示本發(fā)明的組合物的組蛋白脫乙酰酶抑制作用的數(shù)據(jù)。
圖9顯示用根據(jù)本發(fā)明的組合物處理和不用其處理的動物中的腫瘤生
長阻滯作用。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供應(yīng)用組合物和治療試劑盒以輔助治療惡性腫瘤，其通過使 用補充用化學(xué)療法或放射療法進行的治療的轉(zhuǎn)錄組修飾化合物進行。
轉(zhuǎn)錄組修飾劑的組合物是肼屈嗪和丙戊酸或其任一種鹽如丙戊酸鎂 的組合，其輔助化學(xué)療法，其可以是但不限于這些化合物苯丁酸氮芥，
環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺(iphosphamide)，氮芥，美法侖塞替派，卡莫司 汀，洛莫司汀，六甲蜜胺，達(dá)卡巴嗪，和丙卡巴肼，順鉑，卡鉑和奧沙利 鉑，多柔比星，柔紅霉素，表柔比星，伊達(dá)比星，絲裂霉素C，博來霉素， 放線菌素D，類視黃醇，激素藥劑，長春新堿，長春堿，長春地辛，長春 瑞濱，伊立替康，托泊替康，依托泊苷，替尼泊苷，紫杉醇，多西他賽，
5-氟尿嘧啶，吉西他濱，甲氨蝶呤，白介素，干擾素，單克隆抗體如曲妥
單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗(rituxan)、抗CD-33單抗(myelotarg)， 和抑制性小分子如吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、和伊馬替尼。
本發(fā)明的組合物和治療試劑盒可以用于對抗一些類型的腫瘤，其包 括，但不限于，乳腺癌，卵巢癌，子宮癌，皮膚癌，骨癌，前列腺癌，肝 癌，腎癌，肺癌，腦癌，頭頸癌，膽囊癌，胰腺癌，結(jié)腸和直腸癌，甲狀 旁腺癌，甲狀腺癌，腎上腺癌，胃癌，腎癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，韋爾姆斯瘤， 睪丸癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，肉瘤，急性和慢性白血病，淋巴瘤和脊髓發(fā)育不 良綜合征。
本發(fā)明的組合物可以通過口服途徑施用或通過任何其它施用途徑施 用，如果所述個體表現(xiàn)出緩慢的乙酰化作用，其以包含83mg的肼屈嗪加 丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂的制劑，以30 mg/Kg體重的劑量進行施用，或 如果所述個體表現(xiàn)出快速的乙酰化作用，其以182 mg的肼屈嗪加丙戊酸 或其鹽如丙戊酸鎂的劑量，以30mg/Kg體重的劑量進行施用，。在其實施 方案的任一種中的兩種藥劑應(yīng)該以控釋制劑的形式進行施用，其在化學(xué)治 療的第一次給藥前7天或在第一次放射治療階段前7天開始施用，以容許 在這些治療的細(xì)胞毒性刺激前對轉(zhuǎn)錄組進行修飾。
實施例 應(yīng)用實施例1
為了證實所述轉(zhuǎn)錄組修飾組合物，肼屈嗪和丙戊酸或丙戊酸鎂具有抗 腫瘤作用，使用來自子宮頸癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、上呼吸道和消化道癌和 肉瘤的多種惡性腫瘤細(xì)胞系。將細(xì)胞以1.5-2.5 x103細(xì)胞/孔的密度，接種 在96孔平板(Falcon Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)中的0.1 ml的完 全培養(yǎng)基中。次日，將細(xì)胞用10pM的肼屈嗪和lmM的丙戊酸鎂處理4 天。次日，使用MTT測定測量細(xì)胞存活力。簡而言之，將在磷酸鹽緩沖 溶液中的50 ^ MTT試劑加入每個孔中。具有活性線粒體的存活細(xì)胞將 MTT還原為可沉淀的紫色化合物-甲賸-其用加入每個孔中的150 pi DMSO 溶解。其后，在ELISA讀數(shù)器上以分光光度法進行讀數(shù)。所有的測定一式
三份地進行。將每次處理的細(xì)胞毒性作用表示為相對于未處理的對照的細(xì) 胞存活力的百分?jǐn)?shù)(％對照)，將其定義為[(As7()nm處理的細(xì)胞)/A57C)細(xì)未處
理的細(xì)胞)]x100。
圖1A， 1B， 1C, 1D, 1E, 1F，和1G，顯示在所有的處理細(xì)胞系HeLa，子 宮頸癌細(xì)胞系；來自肉瘤的HT1080;來自乳腺癌的MCF-7中，分別來自 喉嚨和口腔的KB和HEP2表皮樣瘤；來自結(jié)腸癌的SW480， KB 口腔表 皮樣瘤，HEP2喉(larinx)表皮樣瘤；D54中，所述轉(zhuǎn)錄組修飾組合物產(chǎn) 生明顯的細(xì)胞毒性，存活力在12.7%到43.4%的減少范圍內(nèi)變化。
應(yīng)用實施例2
一旦證實所述轉(zhuǎn)錄組修飾組合物對惡性腫瘤細(xì)胞系的生長具有抑制 作用，便研究所述組合物是否增加化學(xué)治療劑的細(xì)胞毒性作用。為此目的， 選擇三種藥物，其是該種類的代表垸化劑如順鉑，抗生素如多柔比星
(doxorubicin)，抗代謝藥如吉西他濱。將所述細(xì)胞以1.5-2.5 x 103細(xì)胞/ 孑L的密度，接種在96-孔平板(Falcon Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 中的0.1ml的完全培養(yǎng)基中，。次日，將細(xì)胞用所述化學(xué)治療劑以在圖2A, 2B和2C中顯示的濃度，加10 的肼屈嗪和1 mM的丙戊酸或丙戊酸鎂 進行處理。在次日，將包含所述藥物的培養(yǎng)基去除，并且加入相同的濃度 的新鮮的肼屈嗪和丙戊酸鎂，再處理48小時。在次日(在第4天)，使用 MTT測定測量細(xì)胞存活力。簡而言之，將50^的在磷酸鹽緩沖溶液中的 MTT試劑加入每個孔中。具有活性線粒體的存活細(xì)胞將MTT還原為可沉 淀的紫色化合物-甲臘-其用加入每個孔中的150WDMSO溶解。隨后，在 ELISA讀數(shù)器上以分光光度法讀數(shù)。所有的測定一式三份地進行。將每次 處理的細(xì)胞毒性作用表示為相對于未處理的對照的細(xì)胞存活力的百分?jǐn)?shù) (%對照)，將其定義為[(A，m處理的細(xì)胞)/A5，m未處理的細(xì)胞)]x100。 圖2A， 2B，和2C顯示在所有的情形中，轉(zhuǎn)錄組修飾組合物加化療劑的細(xì) 胞毒性更大。在該條件下，作為抑制濃度50(IC50)的12pM順鉑的濃度， 在用轉(zhuǎn)錄組修飾組合物處理時，在HeLa細(xì)胞中導(dǎo)致37%的存活力減少。 關(guān)于阿霉素和吉西他濱也證實了類似的效果，分別減少27%和37%。
應(yīng)用實施例3
為了證實可以在臨床獲得由抑制基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致的去甲基化和再活 化作用，進行了I期臨床研究以證實在癌癥患者中，肼屈嗪以哪種劑量可 具有對轉(zhuǎn)錄的去甲基化和再活化作用。為此目的，將肼屈嗪施用于每組4 名患者的組，每組的劑量為1) 50 mg/天，2) 75 mg/天，3) 100 mg/天，禾口 4) 150 mg/天，施用10天。在開始治療前和在第11天進行活組織檢查并 采集外周血樣品。關(guān)于下列基因的啟動子:」尸C, MGM7;五/ , OSTP7， A4尸《 /Mi A FF/r//7pM分析處理前和處理后的甲基化作用的狀態(tài)，以及通過 RT-PCR分析它們信使的表達(dá)狀態(tài)。此外，評估進行過母體失活(parental unactivation) H19的基因的甲基化狀態(tài)以及在通常情況下發(fā)現(xiàn)其被甲基化 的基因組克隆，以及在所述基因組中的甲基化細(xì)胞因子(citokine)的總含 量。使用來自美國國家癌癥研究所(U.S. National Cancer Institute (CTC NCI)) 的標(biāo)準(zhǔn)評估肼屈嗪的毒性。肼屈嗪被良好耐受，僅記錄了下列不理想的作
用惡性，嘔吐，疲勞，頭痛和心悸。與所述基因相關(guān)，發(fā)現(xiàn)在治療前的
活組織檢查中有70%的分析樣品(128個中的89個)具有至少一個甲基化基 因，16個活組織檢查-患者的每個中有8個基因，并且所有的患者在他們 的腫瘤中具有至少一個甲基化基因。每個基因的個體分析證實了下列甲基 化頻率APC 94%, 25%, FF/r 88%, GS7P7 88%, MGMT 81%, pM 19%， 和iX4尸尺100。/。.。在處理前活組織檢查中，發(fā)現(xiàn)在每個基因中 的可變的去甲基化存活頻率，從對于MGMT的13個樣品中的2個即15% 變化到對于基因p7(5的3個樣品中的2個即67%。圖3A。代表性實例顯 示在圖3B中。去甲基化的百分?jǐn)?shù)和肼屈嗪的劑量之間的相關(guān)性如下50 mg 40%, 75 mg 52%， 100 mg 43%, 150 mg 32% ，如可在圖3C中看出。 基因表達(dá)分析顯示90%(128中的116)的腫瘤樣品在處理前和處理后的
活組織檢查中不依賴于基因的甲基化狀態(tài)而表達(dá)信使，因此它們不是提供 信息的(infomiative)。在12個提供信息的情形中，發(fā)現(xiàn)它們中有9個沒有 表達(dá)處理前被甲基化的基因，但是在處理后，他們被去甲基化并且他們重 新表達(dá)了所述基因。代表性實例顯示在圖4A，4B,和4C中，并且基因重 新表達(dá)的全部頻率總結(jié)在圖4D中。
上述結(jié)果證實在50和150 mg之間的劑量范圍內(nèi)的肼屈嗪有效改變癌
癥患者中的基因表達(dá)(ZamZvYwo f Segz/ra匿尸ac/zeco萬，尸e/^z-Cflrafe"os五, 丄，i eW〃a-)^z《Mez ^， r^/a-C7za;;e6丄'CTzavez- 5/awco」，j"ge/ej ￡， Cabrera G <SW"<iora/ & r^/o-^cem7 C, Cte"ora-版to Z)Me"as-
A爿—aye /她辦o//7j^/ra/"z/"e to cfe附e鄉(xiāng)/flte朋(i reacf/v她 expmwz'o" o/fwmor swp/ m 5w gewasf肼屈嗪對月中瘤抑制基因的去甲基化禾口 表達(dá)的再活化的I期臨床研究J.^WCOwcer (BMC癌癥)2M》5.'")。
應(yīng)用實施例4
為了證實丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂在癌癥患者的腫瘤中誘導(dǎo)組蛋白 的高度乙酰化并且抑制組蛋白脫乙酰酶的活性，進行了另一項臨床研究， 其中將不同劑量的丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂施用于患有子宮頸癌的患者。 12名最近被診斷患有該種癌癥并且以前沒有接受治療的患者以每組4名 患者接受了下列劑量的丙戊酸鎂。組l,20mg/Kg，組2，30mg/kg,組3，40 mg/Kg。由于將丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂以分劑量每8小時施用5天，在 處理前和在接下來的日子(第6天)進行腫瘤的活組織檢查并且采集血樣。 通過蛋白質(zhì)印跡法分析樣品中的組蛋白H3的高度乙?；湍[瘤中的組蛋 白H4的高度乙?；⑶沂褂帽壬珳y定法分析腫瘤的核提取物中組蛋白 脫乙酰酶的活性，以及在血清中的丙戊酸水平。還在處理后活組織檢査中 分析基因p"和C4i 的表達(dá)水平。在周期結(jié)束時，記錄處理的毒性。所 有的患者都完成了治療；平均劑量是1890mg/天，其中平均值分別對應(yīng)于 20， 30和40 mg/kg劑量的1245, 2000和2425 mg。在12名患者的9名中 觀察到了2度睡意。治療后，分別在9名和7名患者中發(fā)現(xiàn)H3和H4的
高度乙?；?他們中的六名在兩種組蛋白中具有高度乙?；?陽性和陰性對 照，分別用或不用tricostatine處理的HeLa細(xì)胞)。在8名患者中組蛋白脫
乙酰酶的活性減少，而在兩名患者中沒有變化，其具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性 (雙尾t檢驗p <0.0264)。(陽性和陰性對照，用tricostatine處理或不用其處 理的HeLa細(xì)胞的核提取物)，圖5, 6和7。該數(shù)據(jù)證實在所用劑量的丙戊 酸鎂是有效的，并且作為組蛋白脫乙酰酶的抑制劑被良好耐受，其反應(yīng)了 增加其表達(dá)的這些基因如p27 (圖8)的表達(dá)的改變。
應(yīng)用實施例s
一旦評估了肼屈嗪和丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂改變患者腫瘤中的基
因(g6nica)表達(dá)水平的能力，我們便在免疫缺陷小鼠的肉瘤模型中研究這些 轉(zhuǎn)錄組修飾劑的組合物是否增加化學(xué)治療的抗腫瘤作用。為此目的，研究 了一組6只雌性無胸腺小鼠的數(shù)個組，將其用六百萬個肉瘤HT1080細(xì)胞 系注射。 一旦形成了腫瘤，便將動物用肼屈嗪和丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂 以等價于在患者中所用那些的劑量進行系統(tǒng)(sistemically)治療。治療的 組如下1)用鹽水溶液處理的對照，2)用阿霉素每周治療一次，3)用肼 屈嗪和丙戊酸鹽(valproato)的組合物治療7天，隨后用阿霉素進行相同的 每周一次的治療。該結(jié)果證實在第5周，沒有經(jīng)過治療的動物的腫瘤達(dá)到 2和3 cr^之間的體積，并且用阿霉素進行的治療在治療后3周產(chǎn)生了幾 乎完全的抗腫瘤效果，但是，從此時，腫瘤再次生長，而在用所述組合物 治療的動物中，腫瘤的再次生長被阻止，如可從圖9中看出。上述結(jié)果表 明，轉(zhuǎn)錄組修飾組合阻止腫瘤細(xì)胞實施恢復(fù)生長能力所必需的轉(zhuǎn)錄改變。 這種現(xiàn)象通常發(fā)生在患者的癌癥的治療中，其中通常發(fā)現(xiàn)完全或幾乎完全 的抗腫瘤反應(yīng)在其后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明的組合物可能誘導(dǎo)腫瘤的延長的 或完全的消退。
本發(fā)明的組合物可以結(jié)合在治療試劑盒中以通過口服施用或通過任 何其它施用途徑施用，如果所述個體表現(xiàn)出緩慢的乙?；饔?，其以包含 83 mg的肼屈嗪加丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂的制劑，以30 mg/Kg體重的 劑量施用，并且如果所述個體表現(xiàn)出快速乙?；饔?，其以1S2 mg的肼 屈嗪加丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂的劑量，以30mg/Kg體重的劑量進行施 用。兩種藥劑都應(yīng)該以控釋制劑的形式施用，以避免由肼屈嗪和丙戊酸或 其鹽如丙戊酸鎂產(chǎn)生的血清水平的峰值，并且減少由其快速吸收導(dǎo)致的副 作用。
由于肼屈嗪對甲基化的抑制作用在其施用后的至少48小時起始， 并且在去甲基化的背景上，丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂對轉(zhuǎn)錄的作用可能更 高，用所述組合物進行的治療優(yōu)選地必須在化學(xué)治療的第一次給藥前7天 或放射治療前7天開始，以容許在化學(xué)治療或放射治療的細(xì)胞毒性刺激前 對轉(zhuǎn)錄組進行修飾。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其包含轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)修飾劑的組合，以與化學(xué)治療或放射治療一起輔助治療癌癥。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述轉(zhuǎn)錄組修飾組合是肼 屈嗪加丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的藥物組合物，其在藥用賦形劑中包含 50-100 mg肼屈嗪和20-50 mg/kg的丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂，以施用于 被認(rèn)為具有緩慢乙酰化作用的個體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的藥物組合物，其在藥用賦形劑中包含 150-200 mg肼屈嗪和20-50 mg/kg丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂，以施用于被 認(rèn)為具有快速乙?；饔玫膫€體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4所述的藥物組合物，其中所述丙戊酸的鹽是丙戊酸鎂。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述化療劑包括，但不限 于苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺(iphosphamide)，氮芥，美法 侖塞替派，卡莫司汀，洛莫司汀，六甲蜜胺，達(dá)卡巴嗪，和丙卡巴肼，順 鉑，卡鉑和奧沙利鉑，多柔比星，柔紅霉素，表柔比星，伊達(dá)比星，絲裂 霉素C，博來霉素，放線菌素D，類視黃醇，激素藥劑，長春新堿，長春 堿，長春地辛，長春瑞濱，伊立替康，托泊替康，依托泊苷，替尼泊苷， 紫杉醇，多西他賽，5-氟尿嘧啶，吉西他濱，甲氨蝶呤，白介素，干擾素， 單克隆抗體如曲妥單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗(rituxan)、抗CD-33 單抗(mydotarg)，和抑制性小分子如吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、和伊馬替尼。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述癌癥是包括但不限于 下列各項的任一種實體瘤乳腺癌，卵巢癌，子宮癌，皮膚癌，骨癌，前 列腺癌，肝癌，腎癌，肺癌，腦癌，頭頸癌，膽囊癌，胰腺癌，結(jié)腸和直 腸癌，甲狀旁腺癌，甲狀腺癌，腎上腺癌，胃癌，腎癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，韋 爾姆斯瘤，睪丸癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，肉瘤，急性和慢性白血病，淋巴瘤和脊髓發(fā)育不良綜合征。
8. —種治療試劑盒，其包括轉(zhuǎn)錄組修飾劑的藥物組合物，以與化學(xué)治 療或放射治療一起輔助治療癌癥。
9. 權(quán)利要求8的治療試劑盒，其中所述藥物組合物是肼屈嗪加丙戊酸 或其鹽如丙戊酸鎂的組合。
10. 權(quán)利要求8和9的治療試劑盒，其中如果所述個體表現(xiàn)出緩慢乙 ?；饔?，所述藥物組合物以50-100 mg的肼屈嗪和超過20-50mg/kg的 丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂的每日劑量口服施用。
11. 權(quán)利要求8和9的治療試劑盒，其中如果所述個體表現(xiàn)出快速乙 ?；饔?，所述藥物組合物以150-200 mg的肼屈嗪和超過20 -50 mg/kg的丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂的每日劑量口服施用。
12. 權(quán)利要求8-11的治療試劑盒，其中所述丙戊酸鹽是丙戊酸鎂。
13. 權(quán)利要求8的治療試劑盒，其中所述藥物組合物在用化學(xué)治療或 放射治療開始進行治療前7天幵始施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用轉(zhuǎn)錄組修飾劑以阻止惡性腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷必要的遺傳改變從而對抗細(xì)胞刺激并且從化學(xué)治療或放射治療后存活下來。所述轉(zhuǎn)錄組修飾劑的組合包括抑制DNA甲基化機制的藥劑和抑制組蛋白脫乙?；奈镔|(zhì)。本發(fā)明涉及治療試劑盒，其包括施用有效劑量的肼屈嗪和丙戊酸或其鹽如丙戊酸鎂，其傾向于與放射治療或化學(xué)治療一起用于治療患者的癌癥。
文檔編號A61P35/00GK101355934SQ200580052494
公開日2009年1月28日 申請日期2005年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
發(fā)明者路易斯·埃斯特拉德·弗洛雷斯, 阿爾索·杜埃尼亞斯·岡薩雷斯 申請人:墨西哥國立自治大學(xué)