專(zhuān)利名稱(chēng)：作為g蛋白－偶聯(lián)受體拮抗劑的環(huán)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型環(huán)狀的化合物，其具有調(diào)節(jié)G蛋白-偶聯(lián)受體活性的能力。這些化合物優(yōu)選地作為拮抗劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了環(huán)狀的肽類(lèi)和肽類(lèi)似物C5a受體拮抗劑，其對(duì)多形核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的C5a受體具有活性。本發(fā)明的化合物為強(qiáng)活性的且具有選擇性，并可用于多種炎性疾病的治療。
背景技術(shù)：
所有的參考文獻(xiàn)，包括在本說(shuō)明書(shū)中引用的任何專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)，這里都引入作為參考。但并不表示任何參考構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)的討論表述的是其作者聲稱(chēng)的內(nèi)容，但本申請(qǐng)者保留審查所引用文獻(xiàn)的正確性以及相關(guān)性的權(quán)利。應(yīng)該清楚地理解，盡管這里參考料許多現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)，但是這種參考并不表示這些文獻(xiàn)中的任何一種在澳大利亞或在任何其它的國(guó)家形成了本技術(shù)領(lǐng)域的通用知識(shí)。
G蛋白-偶聯(lián)受體在人體中廣泛分布，包括約60％的已知的細(xì)胞受體類(lèi)型，并調(diào)節(jié)針對(duì)很寬范圍內(nèi)源性配體的細(xì)胞跨膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。它們參與一系列生理和病理生理過(guò)程，包括但不限于與心血管、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)、生殖、代謝、消化、免疫炎性、以及生長(zhǎng)失調(diào)以及其它細(xì)胞調(diào)節(jié)性和增殖性失調(diào)相關(guān)的過(guò)程。選擇性調(diào)節(jié)G蛋白-偶聯(lián)受體的藥物具有重要的治療應(yīng)用。這些受體逐漸被認(rèn)作重要的藥物靶標(biāo)，由于其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的至關(guān)重要的作用(G protein-coupled Receptors，IBC Biomedical Library Series，1996)。
研究最為集中的G蛋白-偶聯(lián)受體之一為C5a受體。C5a為已知的最強(qiáng)活性的趨化劑之一，并將嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞征集至損傷部位，改變其形態(tài)；誘導(dǎo)脫粒作用；增加鈣轉(zhuǎn)移、血管滲透性(水腫)以及嗜中性粒細(xì)胞粘附性；收縮平滑肌；刺激炎性介質(zhì)的釋放，包括組胺、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、全列腺素以及白三烯以及溶酶體酶系的釋放；促進(jìn)氧自由基的形成；并增加抗體的產(chǎn)生(Gerard和Gerard，1994).
C5a的過(guò)表達(dá)或下調(diào)參與免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎性疾病的發(fā)病機(jī)理，例如在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、牛皮癬、齒齦炎、動(dòng)脈粥樣硬化、阿耳茨海默(氏)病、肺損傷和體外透析后綜合征以及多種其他的疾病中(Whaley 1987；Sim 1993)。
限制C5a的促炎性作用的試劑具有抑制慢性炎癥以及其伴隨的疼痛和組織損傷的潛能。由于這些原因，防止C5a與其受體結(jié)合的分子可用于治療補(bǔ)體激活驅(qū)動(dòng)的慢性炎性疾病。這些化合物也為補(bǔ)體介導(dǎo)免疫性機(jī)理的研究提供來(lái)了有價(jià)值的新的信息。
在我們的前述申請(qǐng)No.PCT/AU98/00490中，其所有公開(kāi)這里引入作為參考，我們描述了一些人C5a碳-端類(lèi)似物的三維結(jié)構(gòu)，并利用這種信息設(shè)計(jì)了與人C5a受體(C5aR)結(jié)合的新化合物，作為C5a激動(dòng)劑或拮抗劑。以前認(rèn)為推定的拮抗劑可能同時(shí)需要C端精氨酸和C-端羧酸酯以滿足受體結(jié)合和拮抗劑活性(Konteatis等，1994)。在PCT/AU98/00490中，我們證實(shí)事實(shí)上對(duì)與C5aR的高親和力結(jié)合或?qū)卓箘┗钚远裕┒唆人狨ヒ话悴⒉皇潜仨毜?。但我們發(fā)現(xiàn)目前還沒(méi)有意識(shí)到的結(jié)構(gòu)特征，一種扭轉(zhuǎn)(turn)構(gòu)型，是嗜中性粒細(xì)胞上人C5a受體高親和力結(jié)合的關(guān)鍵性識(shí)別特征。我們利用這種發(fā)現(xiàn)涉及了受限的結(jié)構(gòu)模板，所述模板能使疏水基團(tuán)聚集成疏水排列以與C5a受體相互作用。
通過(guò)考察在我們前述申請(qǐng)中活性最強(qiáng)的化合物中的每一個(gè)氨基酸殘基位置結(jié)構(gòu)變化的效果，我們現(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)出人嗜中性粒細(xì)胞C5a受體環(huán)拮抗劑的其他實(shí)例，并鑒定出具有許多強(qiáng)C5aR拮抗劑活性的化合物。這些化合物各包括環(huán)狀骨架(scaffold)，其滿足在稍早PCT/AU98/00490申請(qǐng)中顯示的一般性三維結(jié)構(gòu)需求，但我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些取代基與環(huán)相連可以導(dǎo)致令人驚奇的最出乎意料的結(jié)果，產(chǎn)生高和低的拮抗劑活性，而這種情形不能由前述申請(qǐng)PCT/AU98/00490準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。這些令人驚奇的新發(fā)現(xiàn)使得我們提煉并更好地定義C5a受體拮抗活性地必須藥效團(tuán)。這里描述的出乎意料的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系有助于定義人多形核白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)上的C5a受體拮抗活性的精細(xì)藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)。該藥效團(tuán)預(yù)期也適于人和哺乳動(dòng)物其他細(xì)胞上的C5a受體。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了式I的環(huán)狀肽或類(lèi)肽，其為G蛋白-偶聯(lián)受體拮抗劑的化合物，基本上沒(méi)有激動(dòng)劑活性 其中A為H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-?；?、NH-苯甲酰基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基或O-芳基；B為烷基、芳基、苯基、芐基、萘基或吲哚基，或D-或L-氨基酸例如L-苯基丙氨酸或L-苯基甘氨酸的側(cè)鏈，但不為甘氨酸、D-苯基丙氨酸、L-高苯基丙氨酸、L-色氨酸、L-高色氨酸、L-酪氨酸或L-高酪氨酸的側(cè)鏈；C為小的取代基，例如D-，L-或高-氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、或硫代脯氨酸的側(cè)鏈，但優(yōu)選地不為體積大的取代基例如異亮氨酸、苯基丙氨酸，或環(huán)己基丙氨酸；D為中性D-氨基酸例如D-亮氨酸、D-高亮氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸、D-高環(huán)己基丙氨酸、D-纈氨酸、D-正亮氨酸、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、或D-酪氨酸的側(cè)鏈，但優(yōu)選地不為小的取代基例如甘氨酸或D-丙氨酸的側(cè)鏈、大體積的平面?zhèn)孺溊鏒-色氨酸，或體積大的帶電側(cè)鏈例如D-精氨酸或D-賴氨酸；
E為體積大的取代基，例如選自L-苯基丙氨酸、L-色氨酸和L-高色氨酸的氨基酸的側(cè)鏈，或?yàn)長(zhǎng)-1-萘基(napthyl)或L-3-苯并噻吩基丙氨酸，但不為D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-高苯基丙氨酸、L-2-萘基L-四氫異喹啉、L-環(huán)己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴丙氨酸，或L-組氨酸的側(cè)鏈；F為L(zhǎng)-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸，或L-刀豆氨酸的側(cè)鏈，或生物電子等排體，即，側(cè)鏈其中末端胍或脲基受限制，但是碳骨架被不同結(jié)構(gòu)的替換，但是側(cè)鏈以整體的形式與靶蛋白的反應(yīng)與母體基團(tuán)的方式一樣；X為-(CH2)nNH-或(CH2)n-S-，其中n為1～4的整數(shù)，優(yōu)選地2或3；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或CH2CHCOCHRNH-，且其中R為任何常用或不常用的氨基酸的側(cè)鏈，條件是化合物不是下述的化合物1。
在C中，順式和反式形式的羥基脯氨酸和硫代脯氨酸都可以使用。
優(yōu)選地A為乙酰胺基、氨基甲基或取代的或未取代的磺酰胺基。
優(yōu)選地其中A為取代的磺酰胺，取代基為1～6，優(yōu)選地1～4碳原子烷基鏈，或苯基或甲苯甲?；?。
優(yōu)選地G蛋白-偶聯(lián)受體為C5a受體。但是，我們發(fā)現(xiàn)我們?cè)缙谏暾?qǐng)的先導(dǎo)化合物對(duì)抗利尿激素和神經(jīng)激肽受體也具有明顯的結(jié)合親和力，因此這些受體也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，化合物具有C5aR拮抗劑活性，并且沒(méi)有C5a激動(dòng)劑活性。
本發(fā)明的環(huán)狀化合物優(yōu)選地為拮抗劑人、哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于，人分葉核白細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞上的C5a受體。本發(fā)明的化合物優(yōu)選地強(qiáng)烈地且選擇性地與C5a受體結(jié)合，并更優(yōu)選地在亞微摩爾濃度(sub-micromolar濃度)具有強(qiáng)拮抗劑活性。更優(yōu)選地化合物地受體親和力IC50＜25μM，并且拮抗劑活性IC50＜1μM。
更優(yōu)選地，化合物選自這里描述的2～6、10～15、17、19、20、22、25、26、28、30、31、33～37、39～45、47～50、52～58和60～70化合物。更優(yōu)選的化合物為化合物33、化合物60或化合物45。
在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“烷基”為直鏈、支鏈、或環(huán)狀、取代的或未取代的1～6，優(yōu)選地1～4個(gè)碳原子的烷基鏈。更優(yōu)選地，烷基為甲基。術(shù)語(yǔ)“?；睘槿〈幕蛭慈〈?～6，優(yōu)選地1～4個(gè)碳原子?；?。更優(yōu)選地?；鶠橐阴；?。術(shù)語(yǔ)“芳基”應(yīng)理解為取代的或未取代的碳環(huán)或雜環(huán)芳基，其中所述環(huán)優(yōu)選地為5或6員。
“常見(jiàn)”氨基酸為L(zhǎng)-氨基酸，選自甘氨酸、亮氨酸、異高氨酸、纈氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和組氨酸。
“非常見(jiàn)”氨基酸包括但不限于，D-氨基酸、高-氨基酸、N-烷基氨基酸、脫氫氨基酸、除苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以外的芳香氨基酸、鄰-，間-或?qū)?氨基苯甲酸、鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、正亮氨酸、δ-谷氨酸、氨基丁酸、L-芴基丙氨酸、L-3-苯并噻吩基丙氨酸以及α，α-二取代的氨基酸。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明化合物以及可藥用載體或賦性劑的組合物。
本發(fā)明的組合物可配制成適于口服、腸胃外、吸入、鼻內(nèi)、透皮或其他局部應(yīng)用，但優(yōu)選口服或局部應(yīng)用。對(duì)于局部應(yīng)用，可使用溶媒例如二甲基亞砜(sulphonate)或丙二醇。取決于處理的組織表面，可優(yōu)選其他溶劑。
可以預(yù)期絕大多數(shù)如果不是所有的本發(fā)明化合物在代謝酶的存在下穩(wěn)定，例如消化刀、血液、肺的那些酶或細(xì)胞內(nèi)酶。所述穩(wěn)定性可用本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的常規(guī)方法很方便地進(jìn)行測(cè)定。
通過(guò)任何期望的途徑給藥的合適制劑可用標(biāo)準(zhǔn)的方法制備得到，例如參考公知的教材例如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，Vol.II，2000(20th edition)，A.R.Gennaro(ed)，Williams & Wilkins，Pennsylvania。
第三方面，本發(fā)明提供了一種治療G蛋白-偶聯(lián)受體介導(dǎo)病理疾病的方法，包括對(duì)需要這種治療的哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的化合物。
優(yōu)選地G蛋白-偶聯(lián)受體介導(dǎo)的疾病為C5a受體介導(dǎo)的疾病，并更優(yōu)選地涉及C5a的過(guò)表達(dá)或表達(dá)下調(diào)。這些疾病包括但不限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、齒齦炎、纖維癥、動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化癥、阿耳茨海默(氏)病、哮喘、癡呆、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肺損傷、體外透析后綜合征、以及皮膚炎性疾病例如牛皮癬、濕疹和接觸性皮炎。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，疾病為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在第二優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疾病為再灌注損傷。在第二實(shí)施方案中，應(yīng)該很清楚地理解，不適用式I的限制性條件。
盡管本發(fā)明沒(méi)有以任何方式限制到治療任何具體的動(dòng)物或種屬，特別地預(yù)期本發(fā)明化合物可用于人的醫(yī)學(xué)治療，并也可用于獸醫(yī)治療，特別是相伴動(dòng)物例如貓和狗，家畜例如牛、馬和羊，以及動(dòng)物園動(dòng)物，包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)、大的?？苿?dòng)物、貓科動(dòng)物、碲類(lèi)動(dòng)物和犬科動(dòng)物。可以治療的其他物種包括爬行類(lèi)、魚(yú)類(lèi)或兩棲類(lèi)動(dòng)物。
本發(fā)明化合物可以任何合適的劑量和任何適合的途徑進(jìn)行給藥?？诜⒕植?、透皮或鼻內(nèi)給藥為優(yōu)選的給藥方式，因?yàn)檫@些途徑具有更強(qiáng)的便利性以及可接受性。局部應(yīng)用也可包括制劑例如子宮托或陰道或直腸栓給藥或水性滴劑用于對(duì)耳或眼睛局部給藥。有效劑量將取決于治療疾病的特性、以及治療個(gè)體的年齡、體重以及潛在的健康狀況。這可由醫(yī)師或獸醫(yī)進(jìn)行判斷。利用本領(lǐng)域公知的方法很容易通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行確定合適的劑量水平。
在本發(fā)明中，應(yīng)該清楚地理解術(shù)語(yǔ)“包括”意思為“包括但不限于”，并且術(shù)語(yǔ)“包括”具有相應(yīng)的含義。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示靜脈內(nèi)(A)、口服(B)和局部(C)AcF-[OPdChaWR]以及適當(dāng)對(duì)照(D)施用對(duì)皮膚阿蒂斯反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的脈管滲漏的抑制。
圖2顯示了靜脈內(nèi)(A)、口服(B)和局部(C)AcF-[OPdChaWR]以及適當(dāng)?shù)木植繉?duì)照(D)施用對(duì)皮膚阿蒂斯反應(yīng)關(guān)聯(lián)的循環(huán)TNFα升高的抑制情況。
圖3顯示靜脈內(nèi)、口服和局部AcF-[OPdChaWR]應(yīng)用后皮膚阿蒂斯反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的病理指數(shù)的下降。
圖4顯示C5a拮抗劑對(duì)消化道缺血-再灌注誘導(dǎo)的腸水腫的效果。
圖5顯示C5a拮抗劑對(duì)消化道缺血-再灌注誘導(dǎo)的嗜中性白血球減少的效果。
圖6顯示C5a拮抗劑對(duì)消化道缺血-再灌注誘導(dǎo)的血清TNFα上升的效果。
圖7顯示C5a拮抗劑對(duì)消化道缺血-再灌注誘導(dǎo)的血清觸珠蛋白升高的效果。
圖8顯示C5a拮抗劑對(duì)消化道缺血-再灌注誘導(dǎo)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的效果。
圖9顯示C5a拮抗劑對(duì)消化道缺血-再灌注的組織病理的效果。
圖10顯示在第2天到+14天經(jīng)口施用AcF-[OPdChaWR]對(duì)關(guān)節(jié)炎性右膝關(guān)節(jié)腫脹的抑制。
圖11顯示對(duì)右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)灌洗液中TNF-α和IL-6水平的抑制。“未處理”表示動(dòng)物未用AcF-[OPdChaWR]處理，但是右膝在致敏后用抗原刺激。
圖12顯示皮膚應(yīng)用3D53的DMSO/蒸餾H2O或PG/H2O溶液在15分鐘之內(nèi)在循環(huán)血漿中出現(xiàn)C5a拮抗劑，并且明顯的水平持續(xù)至少4小時(shí)。點(diǎn)代表每組中(n＝6-8)的平均值±SEM。
圖13顯示局部應(yīng)用C5a拮抗劑對(duì)C5a-誘導(dǎo)的嗜中性白血球減少的抑制。結(jié)果以時(shí)間0點(diǎn)基線的百分變化進(jìn)行表述。
圖14顯示局部應(yīng)用C5a拮抗劑抑制大鼠中靜脈內(nèi)注射LPS的全身作用。數(shù)據(jù)標(biāo)明施用多種C5a拮抗劑，或者通過(guò)i.v.(1mg/kg)，或皮膚局部應(yīng)用(50mg/kg總應(yīng)用劑量溶劑載體50％DMSO/50％H2O)，抑制i.v.LPS(1mg/kg)引起的嗜中性白血球減少。(a)3D53(化合物1)；(b)化合物45；(c)化合物17。
圖15顯示C5a拮抗劑AcF-[OPdChaWR]在大鼠再灌注過(guò)程中對(duì)下列指標(biāo)血清水平增加的影響(A)肌酸激酶(CK)和(B)乳酸脫氫酶(LDH)。數(shù)據(jù)為平均值±SEM(n＝6-10)。*P＜0.05所有的藥物處理組vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05所有的藥物處理組vs.假手術(shù)。
圖16顯示C5a拮抗劑，AcF-[OPdChaWR]在再灌注后2、3和4小時(shí)對(duì)大鼠中下列指標(biāo)血清水平增加的影響(A)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和(B)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。數(shù)據(jù)為平均值±SEM(n＝6-10)。*P＜0.05所有的藥物處理組vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05所有的藥物處理組vs.假手術(shù)。
圖17顯示大鼠中下列指標(biāo)的水平(A)循環(huán)PMNs、(B)肌肉髓過(guò)氧化物酶(MPO)、(C)肺MPO和(D)肝臟MPO。水平為試驗(yàn)完成后在大鼠上測(cè)得。數(shù)據(jù)為平均值±SEM(n＝4-10)。*P＜0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05vs.假手術(shù)。
圖18顯示在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)取得的大鼠肝臟勻漿樣品中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。數(shù)據(jù)為平均值±SEM(n＝4-10)。*P＜0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05vs.假手術(shù)。
圖19顯示試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠后肢肌肉的水腫(濕重-干重比)量。數(shù)據(jù)為平均值±SEM(n＝4-10)。*P＜0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05vs.假手術(shù)。
發(fā)明詳述通常，術(shù)語(yǔ)″治療″等這里用來(lái)指影響研究對(duì)象、組織或細(xì)胞得到需要的藥理和/或生理效果。效果可為預(yù)防性的，全部或部分地預(yù)防疾病或征兆或癥狀，以及和/或?yàn)橹委熜缘?，部分或全部治愈疾病。這里所用的″治療″包含脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物，特別是人中的任何的疾病的治療或預(yù)防，并包括預(yù)防傾向于患病并且診斷還沒(méi)有患病的研究對(duì)象中疾病的發(fā)生；抑制疾病，即，終止其發(fā)展；或疾病的減輕或改善作用，即引起疾病作用的轉(zhuǎn)歸。
本發(fā)明包括用于改善疾病的多種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案的藥物組合物通過(guò)將式I化合物、類(lèi)似物、衍生物或其鹽以及一種或多種藥物活性物質(zhì)式I化合物與一種或多種藥物活性物質(zhì)的組合用載體、賦性劑和添加劑或佐劑一起制備成適合對(duì)研究對(duì)象給藥的形式而進(jìn)行制備。
經(jīng)常施用的載體或佐劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇以及其他糖類(lèi)、滑石粉、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動(dòng)植物油、聚乙二醇以及溶劑，例如無(wú)菌水、乙醇、甘油以及多羥基醇類(lèi)。靜脈內(nèi)溶媒包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。防腐劑包括抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體。其他的可藥用載體包括水性溶劑、無(wú)毒性賦性劑，包括鹽類(lèi)、防腐劑、緩沖劑等，如例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams& Wilkins(2000)和The British National Formulary 43rd ed.(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain，2002；http//bnf.rhn.net)中所描述的，其內(nèi)容這里引入作為參考?？伤幱媒M合物的pH以及各種成分的確切濃度根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)常規(guī)進(jìn)行調(diào)節(jié)。參見(jiàn)Goodmanand Gilman′s The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.，1985)。
可藥用組合物優(yōu)選地以單位劑量進(jìn)行制備和給藥。固體單位劑量包括片劑、膠囊以及栓劑。對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行治療的時(shí)候，依據(jù)化合物的活性、給藥方式、疾病的性質(zhì)以及嚴(yán)重程度、對(duì)象的年齡以及體重，可以使用不同的劑量。在某些情況下，更高或更低的日劑量是合適的。日劑量的給藥可下述方式實(shí)現(xiàn)通過(guò)單個(gè)單位劑量的單次給藥或數(shù)個(gè)更小劑量單位給藥，以及也可以通過(guò)在特定的時(shí)間間隔多次施用細(xì)分劑量。
本發(fā)明的藥物組合物可以治療有效量進(jìn)行局部或全身給藥。用于這種用途的有效量當(dāng)然地取決于疾病的嚴(yán)重程度以及研究對(duì)象的體重以及一般狀況。典型地，體外使用的劑量將為原位施用組合物的量有用的指導(dǎo)，并且動(dòng)物模型可用來(lái)判斷治療細(xì)胞毒性副作用的有效劑量。在Langer，Science，2491527，(1990)中描述了多種需要考慮的因素?？诜?yīng)用的制劑可為硬明膠膠囊的形式，其中所述活性成分與惰性固體稀釋劑，例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土進(jìn)行混合。其也可為軟明膠膠囊的形式，其中所述活性成分與水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水性懸浮劑通常包含活性物質(zhì)以及適于制備水性懸浮劑的賦性劑。這些賦性劑可為助懸劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠以及阿拉伯樹(shù)膠；分散或潤(rùn)濕劑，其可為天然存在的磷脂例如卵磷脂；(b)亞烷基氧化物與脂肪酸的縮合物，例如，硬脂酸聚氧乙烯酯；(c)環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如heptadecaethylenoxy十六烷醇；(d)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或(e)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯。
藥物組合物可為無(wú)菌注射水性或油性懸浮液的形式。所述懸浮劑可依照已知的方法進(jìn)行配制，利用合適的分散或潤(rùn)濕劑以及助懸劑例如上面述及的那些。無(wú)菌注射制劑也可為在無(wú)毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑無(wú)菌注射溶液或懸浮液，例如，1，3-丁二醇溶液。在可用的可接受的溶媒和溶劑中，有水、Ringer氏溶液以及等張氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌、固化油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這種目的，可使用任何溫和的固化油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于注射制劑。
式I化合物可以脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)進(jìn)行給藥，例如小單層脂質(zhì)體、大單層脂質(zhì)體以及多層脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可由多種磷脂例如膽固醇、十八烷酰胺或磷脂酰膽堿形成。
本發(fā)明式I化合物的劑量水平一般為約0.5mg～20mg千克體重的水平，優(yōu)選的劑量水平為約0.5mg～約10mg千克體重每天(為約0.5g～約3g每人每天)?？膳c載體物質(zhì)混合制備單一劑量的活性成分的量將根據(jù)要處理的宿主以及具體的給藥途徑而變化。例如，人口服制劑可包含約約5mg～1g的活性化合物以及適當(dāng)量方便量的載體物質(zhì)，后者可在約5～95％總組合物的范圍內(nèi)變化。單位劑量形式通常包含約5mg～500mg活性成分。
但是，應(yīng)該理解為具體的劑量水平將取決于多種因素包括具體使用化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排除速率、藥物組合以及進(jìn)行治療的具體疾病嚴(yán)重程度。
此外，一些本發(fā)明化合物將與水或常見(jiàn)的有機(jī)溶劑形成溶劑合物。這些溶劑合物包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的化合物還可與其他化合物組合以提供有效的組合。因此包括藥物活性成分與本發(fā)明式I化合物的任何化學(xué)兼容的組合。
應(yīng)該清楚地理解為前述有關(guān)藥物制劑、給藥途徑、劑量水平等論述同等地適用于化合物1。
這里使用的縮寫(xiě)如下
在說(shuō)明書(shū)中，常規(guī)的單字母和三字母代碼用來(lái)表示氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“3D53”和“PMX53”是同義詞，并表示化合物Ac-Phe-[Om-Pro-dCha-Trp-Arg]；術(shù)語(yǔ)“LP-10”和“PMX-201”是同義詞，并表示化合物Ac-Phe-[Om-Pro-dCha-Trp-Cit]；以及術(shù)語(yǔ)“LP-16”和“PMX-205”是同義詞，并表示化合物HC-[Orn-Pro-dCha-Trp-Arg]，其中“HC”表示氫化肉桂酰基(hydrocinnamate)。
本發(fā)明現(xiàn)在只參考下述一般性方法以及實(shí)驗(yàn)例進(jìn)行描述。
我們發(fā)現(xiàn)目前已經(jīng)測(cè)試的所有式I化合物具有廣泛的類(lèi)似的藥理活性，與化合物1(這里也指為3D53或PMX53)的活性類(lèi)似，盡管單個(gè)具體化合物的物理化學(xué)性質(zhì)、活性以及生物利用度隨具體的取代基有一定程度的變化。因此，我們預(yù)期化合物1得到的體外或體內(nèi)結(jié)果可以適當(dāng)?shù)仡A(yù)測(cè)在相應(yīng)分析中式I化合物的活性。
一般方法保護(hù)的氨基酸和樹(shù)脂得自Novabiochem。TFA、DIPEA和DMF(肽合成級(jí))購(gòu)自Auspep。所有其他的物質(zhì)為試劑級(jí)，除非另有說(shuō)明。制備級(jí)別的反相HPLC制備在Vydac C18反相柱(2.2×25cm)上進(jìn)行，并且分析性反相HPLC分離在Waters Delta□Pak PrepPak C18反相柱(0.8×10cm)上進(jìn)行，利用溶劑A＝水/0.1％TFA和溶劑B＝水10％/乙腈90％，0.09％TFA的梯度混合物。肽的分子量用電噴霧質(zhì)譜測(cè)定，在三重四極質(zhì)譜儀(PE SCIEX API III)上記錄，如(Haviland等，1995)中所述。1H-NMR譜在Bruker ARX 500MHz或Varian Unity 400譜儀上記錄。質(zhì)子歸屬利用2D NMR實(shí)驗(yàn)(DFCOSY。TOCSY，NOESY)進(jìn)行判斷。
化合物通過(guò)質(zhì)譜和反相分析性HPLC進(jìn)行分析。
化合物合成線性肽序列通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域人員公知的手工逐步標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成(SPPS)技術(shù)進(jìn)行制備。氨基酸或肽端HBTU用DIEA進(jìn)行原位中和。偶聯(lián)用標(biāo)準(zhǔn)的定量茚三酮測(cè)定進(jìn)行監(jiān)控。利用Boc化學(xué)進(jìn)行氨基酸的臨時(shí)的Nα-保護(hù)，用TFA處理2次1分鐘去除Boc基團(tuán)。肽在NovabiochemBoc-D-Arg(Tos)-PAM或Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹(shù)脂上進(jìn)行合成，取代值為約0.2-0.5mmol/g。用液體HF(10mL)、對(duì)甲酚(1mL)在-5℃處理1-2小時(shí)將肽完全脫保護(hù)丙裂解。肽用反相HPLC(例如梯度0％B～75％B，60分鐘)純化并經(jīng)電噴霧質(zhì)譜經(jīng)分析。
或者，線性肽可用Fmoc化學(xué)進(jìn)行合成，利用HBTU/DIEA活化Fmoc-D-Arg(Mtr)-Wang樹(shù)脂。Fmoc基團(tuán)的去除利用50％哌啶/DMF處理2個(gè)1分鐘。裂解和脫保護(hù)使用95％TFA/2.5％TIPS/2.5％H2O得到Mtr-保護(hù)的肽，可用RP-HPLC純化。
環(huán)化線性肽的一般步驟涉及將肽(1當(dāng)量)和BOP(5當(dāng)量)溶解在DMF(10mM肽濃度)中，并劇烈攪拌，然后加入DIEA(15當(dāng)量)。盡管在絕大多數(shù)情況下反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成，一般將溶液室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。在高真空30℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去DMF，然后經(jīng)RP-HPLC純化。對(duì)于包含游離N端的環(huán)狀肽，將Fmoc基團(tuán)用作環(huán)化步驟中臨時(shí)的N-端保護(hù)基。在高真空30℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去DMF，并且然后將肽用30％哌啶/DMF室溫處理1小時(shí)以除去Fmoc基團(tuán)。然后高真空除去溶劑，并經(jīng)RP-HPLC純化。下面描述了代表性的環(huán)肽的合成。
NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定在Varian Unity 400譜儀在24℃參照溶劑測(cè)定測(cè)試化合物(3mg的750μl d6-DMSO溶液，δ2.50)的1H-NMR譜。二維1H□NMR NOESY(馳豫接力2.0s，混合時(shí)間50-300ms)，DFQ□COSY和TOCSY(混合時(shí)間75ms)實(shí)驗(yàn)以相靈敏的模式獲得并記錄。對(duì)所有實(shí)驗(yàn)，獲得時(shí)間＝0.186s，譜寬＝5500Hz，復(fù)合點(diǎn)數(shù)(t1維)＝1024。數(shù)據(jù)及進(jìn)行零填充并且在二維方向傅立葉轉(zhuǎn)換成1024實(shí)點(diǎn)。
化合物1的NMR數(shù)據(jù)利用TRIAD軟件(Tripos Assoc.)在SiliconGraphics Indy工作站上進(jìn)行處理。將2DNOE交叉峰進(jìn)行積分并表征為強(qiáng)(1.8-2.5)、中(2.3-3.5)以及弱(3.3-5.0)。從上和下距離限制編目利用Diana2.8(69距離限制，包括對(duì)相鄰殘基27以及更遠(yuǎn)6)利用剩余二面角限制(REDAC)策略計(jì)算初步的三維結(jié)構(gòu)。利用MARDIGRAS精確地計(jì)算上和下距離限制。在本階段，檢查肽可能存在的氫鍵，并將其添加為距離限制。將50個(gè)最低能量Diana結(jié)構(gòu)進(jìn)行有限分子動(dòng)力學(xué)(RMD)以及能量最小化(REM)。最初，REM由50步最速下降組成，然后100步成對(duì)梯度最小化。RMD通過(guò)將結(jié)構(gòu)加熱至300K刺激1ps，然后500K刺激1ps進(jìn)行。用2ps將溫度逐漸降至300K最后在200K保持2ps。用50步最速下降，200步成對(duì)梯度然后300步Powell最小化執(zhí)行REM。檢查最后的結(jié)構(gòu)以得到相對(duì)于骨架重原子(N、Cα和C具有平均成對(duì)rms差異。50個(gè)結(jié)構(gòu)的20個(gè)對(duì)所有骨架原子(O，N，C)具有平均rmsd＜0.5。
受體-結(jié)合分析分析按照下述方法進(jìn)行，用新鮮的人PMNs，如以前所述(Sanderson等，1995)的方法分離得到，利用緩沖液50mM HEPES、1mM CaCl2，5mMMgCl2、0.5％牛血清白蛋白、0.1％桿菌肽以及100μM苯基甲基磺酰氯(PMSF)進(jìn)行。在4℃分析中，將緩沖液、未標(biāo)記的重組人C5a(Sigma)或肽、Hunter/Bolton標(biāo)記的125I-C5a(～20pM)(New England Nuclear，MA)以及PMNs(0.2×106)依次加入到Millipore Multiscreen分析板(HV 0.45)中，終體積為200μL/孔。4℃孵育60分鐘后，過(guò)濾樣品并將板用緩沖液洗滌1次。將濾器干燥，沖壓并在LKBγ計(jì)數(shù)器終計(jì)數(shù)。非特異性結(jié)合通過(guò)包含1mM肽或100nM C5a進(jìn)行評(píng)價(jià)，一般為總結(jié)合的10-15％。
利用非線性回歸和用Dunnett post-test統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
利用髓過(guò)氧化物酶釋放分析評(píng)價(jià)拮抗劑活性細(xì)胞的分離如以前所述(Sanderson等，1995)并與細(xì)胞松弛素B孵育(5μg/mL，15分鐘，37℃)。將包含0.15％明膠和肽的Hank′s平衡鹽溶液加到96孔板(總體積100μL/孔)中，然后加入25μL細(xì)胞(4×106/mL)。為了評(píng)價(jià)各肽拮抗C5a的能力，將細(xì)胞與各肽在37℃孵育5分鐘，然后加入C5a(100nM)并繼續(xù)孵育5分鐘。然后將50μL磷酸鈉(0.1M，pH 6.8)加到各孔中，將板冷卻到室溫，并將25μL等體積的二甲氧基對(duì)二氨基聯(lián)苯(5.7mg/mL)和H2O2(0.51％)的新鮮混合物加入到各孔中。在10分鐘的時(shí)候加入2％疊氮鈉終止反應(yīng)。在Bioscan 450板讀取器上測(cè)定450nm處的吸光度，相對(duì)于對(duì)照值(無(wú)肽)進(jìn)行校正，并通過(guò)非線性回歸進(jìn)行分析。
消炎活性的體內(nèi)分析下述公知的體內(nèi)分析體系用來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物的消炎活性。用非線性回歸分析和Student’s t-檢驗(yàn)、變量分析方法分析所有的分析數(shù)據(jù)，p＜0.05作為具有顯著意義的臨界水平。
(a)角叉(菜)膠爪水腫對(duì)麻醉的(腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪)Wistar大鼠(150-200g)或小鼠注射無(wú)菌空氣(第1天20ml，第4天10ml)進(jìn)入背部的皮下組織。6天后可以使用形成的腔，將角叉(菜)膠(2ml，1％w/w的0.9％鹽水溶液)注射到空氣袋中，10小時(shí)后收集流出液。第6天后每天施用測(cè)試化合物，并通過(guò)空氣袋流出液中的細(xì)胞差分計(jì)數(shù)分析它們的消炎效果。注射后的合適的時(shí)間處死動(dòng)物，并用2ml的0.9％鹽水灌洗空腔；灌洗液轉(zhuǎn)移到肝素化的管中并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和Diff-Quik染色細(xì)胞離心制劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
或者，通過(guò)足部注射注射角叉(菜)膠在Wistar大鼠中發(fā)展的常規(guī)的角叉(菜)膠爪水腫可用來(lái)引起水腫，后者在2小時(shí)內(nèi)可見(jiàn)，在4小時(shí)發(fā)展到極限。測(cè)試化合物在炎性原(inflammagen)前40分鐘施用，并通過(guò)2和4小時(shí)后的爪的微彎腳器測(cè)定評(píng)價(jià)其效果。參見(jiàn)Fairlie，D.P.等(1987)。還參見(jiàn)Walker和Whitehouse(1978)。
(b)佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。
在大鼠(3系)中誘導(dǎo)佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎，通過(guò)免疫(注射熱滅活的結(jié)核分支桿菌Mycobacterium tuberculosis)或化學(xué)(用avridine)方法，通過(guò)與油性溶媒一起在尾部接種佐劑，例如Freund氏佐劑(參見(jiàn)Whitehouse，M.W.，Hahdbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases，Eds.Greenwald，R.A.；Diamond，H.S.；Vol.1，pp.3-16，CRC Press)。
在13天內(nèi)，佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎顯示為尾部的局部炎癥以及潰瘍、所有四爪的總體腫脹、爪和耳朵的炎性損傷、體重下降以及發(fā)熱。這些癥狀，與人體中的那些炎性疾病類(lèi)似(Winter和Nuss，1966)，可用藥物例如消炎痛或環(huán)孢霉素減輕，在人中也顯示處有益的效果(例如Ward和Cloud，1966)。在第14天不用藥物處理，關(guān)節(jié)炎大鼠將出現(xiàn)爪肥大、白蛋白減少以及血清中上升的急性階段反應(yīng)蛋白，以及外源性物質(zhì)的肝代謝下降，顯示為延長(zhǎng)的巴比妥-誘導(dǎo)的睡眠時(shí)間。
為了評(píng)價(jià)化合物的活性，在用關(guān)節(jié)炎原接種(第0天)后的第10～13天，將化合物經(jīng)口(≤10mg/kg/天)或腹膜內(nèi)(腹腔注射)給藥4天。如果化合物具有活性，或者炎癥不可見(jiàn)，或尾部或前爪的炎癥顯著減輕，用微卡鉗測(cè)量爪厚度以及尾部體積進(jìn)行評(píng)估，以及炎性損傷的總體檢查。在第18天，將動(dòng)物通過(guò)頸部錯(cuò)位處死，除非沒(méi)有關(guān)節(jié)炎癥狀，在這期間在得到倫理委員會(huì)允許的基礎(chǔ)上繼續(xù)觀察。實(shí)驗(yàn)交錯(cuò)排列以使通量最大化，在進(jìn)行化合物之間的早期比較。這種常規(guī)分析被認(rèn)同為確證用于人體的抗炎劑的方法。
藥代動(dòng)力學(xué)雌性和雄性Wistar大鼠(200-250g)用1mL的zoletil(50mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg；Lyppard，Australia)進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹膜內(nèi)注射。在大鼠的下腹部區(qū)域剃出5×10cm的區(qū)域并作記號(hào)，在該區(qū)域應(yīng)用藥物劑量。包含10mg/ml的C5a拮抗劑儲(chǔ)存液以各種濃度的水溶解在溶劑丙二醇或二甲基亞碸中，并用抹刀均勻地涂抹在大鼠的剃毛的腹部區(qū)域。用加熱墊來(lái)保持大鼠的體溫，并在第1小時(shí)每隔15分鐘采集血液樣品，之后每1小時(shí)采集1次共3小時(shí)。
立即將血樣品加入到包含肝素(500單位/μL)管中并離心(11000xg)。取出各樣品的血漿層并在-20℃儲(chǔ)存。加入氘代的內(nèi)標(biāo)2H3CO-F-[OPdChaWR]50μL，5μg/mL的50％乙腈/水溶液)并渦旋。將樣品進(jìn)一步用高效液相色譜(HPLC)級(jí)的乙腈進(jìn)行1∶3稀釋并快速渦旋(20sec)，然后離心(11000xg)。該方法導(dǎo)致樣品中大血漿蛋白沉淀，并將藥物從血漿中完全萃取出來(lái)。樣品的液體部分放置在1mL Eppendorf管中并儲(chǔ)存待分析。
這些樣品轉(zhuǎn)移至96孔板中并用GeneVac離心蒸發(fā)器蒸發(fā)至干，然后用流動(dòng)相重建于孔(20μL)中。樣品的分析用液相色譜(LCMS)進(jìn)行，利用裝配有多孔板自動(dòng)進(jìn)樣器和PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF質(zhì)譜儀的Agilent 1100series HPLC。從藥物內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)峰面積比的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定濃度。標(biāo)準(zhǔn)的制備通過(guò)將適當(dāng)量的藥物以及內(nèi)標(biāo)加入到未處理的大鼠血漿中，并用與實(shí)驗(yàn)樣品同樣的方法進(jìn)行提取和制備。
實(shí)施例1環(huán)狀化合物的合成環(huán)肽AcF-[OPdChaWR](1)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg以0.20mmole規(guī)模用Boc化學(xué)方法進(jìn)行合成，利用HBTU/DIEA活化并在Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹(shù)脂(338mg，SV＝0.591mmol/g)進(jìn)行原位中和。樹(shù)脂(457mg)的裂解和脫保護(hù)通過(guò)將樹(shù)脂用HF(10ml)和對(duì)甲酚(1ml)在-5～0℃處理1-2小時(shí)而實(shí)現(xiàn)，得到粗肽(160mg，90％)。環(huán)化涉及將粗肽(41mg，45μmol)、BOP(126mg，0.28mmol)和DIEA(158μL，0.9mmol)在DMF(57mL)中攪拌15小時(shí)。真空去除溶劑并將環(huán)狀肽經(jīng)rpHPLC純化(18.8mg，47％)Rt＝10.8分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，30分鐘)。MS[M+H]+(計(jì)算值)＝896.5，[M+H]+(實(shí)驗(yàn)值)＝896.5。
環(huán)狀A(yù)cF-[OPdPheWR](33)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dPhe-Trp-Arg用Boc化學(xué)方法利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹(shù)脂上進(jìn)行合成。樹(shù)脂的裂解和脫保護(hù)通過(guò)將樹(shù)脂用HF(10ml)和對(duì)甲酚(1ml)在-5～0℃處理1-2小時(shí)而實(shí)現(xiàn)，得到粗肽。環(huán)化涉及將粗肽(85mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(10mL)中攪拌15小時(shí)。真空去除溶劑并將環(huán)狀肽經(jīng)rpHPLC純化(31mg)Rt＝16.7分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，30分鐘)。MS[M+H]+(計(jì)算值)＝890.5，[M+H]+(實(shí)驗(yàn)值)＝890.5。
環(huán)狀A(yù)cF-[OPdChaFR](60)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Phe-Arg用Boc化學(xué)方法利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹(shù)脂上進(jìn)行合成。樹(shù)脂的裂解和脫保護(hù)通過(guò)將樹(shù)脂用HF(10ml)和對(duì)甲酚(1ml)在-5～0℃處理1-2小時(shí)而實(shí)現(xiàn)，得到粗肽。環(huán)化涉及將粗肽(104mg)、BOP(57mg)和DIEA(103μL)在DMF(1mL)中攪拌15小時(shí)。真空去除溶劑并將環(huán)狀肽經(jīng)rpHPLC純化(52mg)。Rt＝11.37分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，15分鐘)。MS[M+H]+(計(jì)算值)＝857.5，[M+H]+(實(shí)驗(yàn)值)＝857.4。
環(huán)肽AcF-[OPdCha(N-Me-Phe)R](64)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-(N-Me-Phe)-Arg-OH用Fmoc化學(xué)進(jìn)行合成，利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Novabiochem的Fmoc-L-Arg(pbf)-Wang樹(shù)脂(0.35mmol/g)上進(jìn)行，利用甲基-L-Phe(281mg，2當(dāng)量)、Fmoc-dCha(275mg，2當(dāng)量)、Fmoc-Pro(472mg，4當(dāng)量)、Fmoc-Orn(Boc)(477mg，3當(dāng)量)、Fmoc-Phe(542mg，4當(dāng)量)和Ac2O(4當(dāng)量)。樹(shù)脂的裂解和脫保護(hù)通過(guò)用95％TFA(15mL)處理樹(shù)脂1小時(shí)而實(shí)現(xiàn)，乙醚沉淀后得到粗肽(150mg)。環(huán)化涉及將rpHPLC純化的肽(100mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(2mL)中攪拌4小時(shí)。真空去除溶劑并將環(huán)狀肽經(jīng)rpHPLC純化(50mg)Rt＝33分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，30分鐘)。MS[M+H]+(計(jì)算值)＝871.5，[M+H]+(實(shí)驗(yàn)值)＝871.5。
環(huán)肽AcF-[{Orn-(δN-Me)}PdChaWR](66)的合成。Boc-(δN-Me-Orn)-OH按照?qǐng)?bào)道的方法(Pol.J.Chem.1988，62，257-261)進(jìn)行合成。線性肽Ac-Phe-[Om-(δN-MeCbz)]-Pro-dCha-Trp-Arg-OH利用Boc化學(xué)進(jìn)行合成，用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Novabiochem Boc-L-Arg(tosyl)Pam樹(shù)脂(0.41mmol/g)上進(jìn)行。將樹(shù)脂用HF/對(duì)甲苯酚處理2小時(shí)實(shí)現(xiàn)樹(shù)脂的裂解和脫保護(hù)，用乙醚沉淀后得到粗肽。環(huán)化涉及將RP-HPLC純化的肽(100mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(2mL)中攪拌4小時(shí)。真空去除溶劑，并將環(huán)狀肽經(jīng)rpHPLC純化。Rt＝11.5分鐘(35％B)。MS[M+H]+(計(jì)算值)＝910.5，[M+H]+(實(shí)驗(yàn)值)＝910.5。
純化及表征粗肽用制備性rp-HPLC利用Vydac C18反相柱(2.2×25cm)純化。使用1mL/分鐘的溶劑A～溶劑B梯度并在214nm檢測(cè)。收集級(jí)分并用離子噴霧質(zhì)譜(ISMS)測(cè)定正確的分子量，用分析性rp-HPLC檢測(cè)純度，在WatersDelta-Pak PrepPak C18反相柱(0.8×10cm)(變化 梯度例如0～75％B，60分鐘)上進(jìn)行。乙腈為HPLC級(jí)(BDH Laboratories)且TFA為合成級(jí)(Auspep)。
表1顯示了用來(lái)制備環(huán)狀化合物1-70的反應(yīng)實(shí)例，以及它們用電噴霧質(zhì)譜(Mass Spec Found)以及在指定洗脫條件下反相HPLC(rp-HPLC)保留時(shí)間(Rt分鐘)的表征。
表2描述了各個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，并列出了它們用髓過(guò)氧化物酶分析測(cè)量各自的對(duì)人分葉核白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)上C5a受體的受體結(jié)合親和力以及拮抗劑活性。
表1表2中所列環(huán)狀化合物的合成和表征總結(jié)
*Tyr-O-芐基為使用的氨基酸，但是產(chǎn)物涉及重排成芐基取代基取代的間-C-取代酪氨酸(見(jiàn)化合物70的結(jié)構(gòu))。
實(shí)施例2環(huán)狀化合物的拮抗劑活性表2顯示了實(shí)施例1中合成的化合物的結(jié)構(gòu)，以及它們各自用髓過(guò)氧化物酶分析測(cè)定的對(duì)人分葉核白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)C5a受體的受體結(jié)合親和力和拮抗劑活性。
化合物1-9、16-18、20、21、23、24、27-32、36、38、44、51和59包括在我們較早專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/AU98/00490公開(kāi)的結(jié)構(gòu)通式的寬范圍內(nèi)。但是，表2證實(shí)事實(shí)上，在這些化合物中，只有1-6、17、20、28、30、31、36和44對(duì)人嗜中性粒細(xì)胞C5a受體具有可觀的拮抗劑活性(IC50＜1μM)。其他化合物，7-9、16、18、21、23、24、27、29、32、38、51以及59沒(méi)有顯示可觀的拮抗劑活性和/或受體親和力，在所有的情況下IC50＞1μM。
另一方面，化合物10-15、19、22、25、26、33-35、37、39-43、45、47-50、52-58以及60-70沒(méi)有包括在PCT/AU98/00490范圍內(nèi)，盡管它們的確涉及與所述申請(qǐng)中公開(kāi)的相同或類(lèi)似的環(huán)狀骨架。表2顯示了這些新化合物中，10-12、14、15、25、33、35、40、45、48、52、58、60、66和68-70具有可觀的拮抗劑活性(IC50＜1μM)。然而，其他的化合物(13、19、22、26、34、37、39、41-43、47、49、50、53-57、61-65和67)沒(méi)有顯示可觀的拮抗劑活性和/或受體親和力，在這些情況下，IC50＞1μM。
表2中的這些結(jié)果使我們能夠進(jìn)一步定義并提煉C5a受體拮抗劑活性所需要的活性藥效團(tuán)的限制條件，以得到或預(yù)測(cè)亞微摩爾活性的拮抗劑。
表270個(gè)C5a受體環(huán)狀拮抗劑的實(shí)例的結(jié)構(gòu)以及對(duì)人分葉核白細(xì)胞的活性C5aR拮抗劑實(shí)例





“C5a結(jié)合IC50”指與人PMNs實(shí)現(xiàn)50％最大結(jié)合所需要的化合物濃度?！癈5a拮抗劑IC50”指實(shí)現(xiàn)50％拮抗從C5a-刺激的人PMNs髓過(guò)氧化物酶釋放所需要的化合物濃度。框中的區(qū)域表示結(jié)構(gòu)之間相對(duì)變化的位置?；衔?為從我們前述申請(qǐng)PCT/AU98/00490中得到的先導(dǎo)化合物，這里也包括用于比較。
實(shí)施例3環(huán)狀C5a拮抗劑這些環(huán)狀拮抗劑以及它們明顯的受體-結(jié)合親和力和拮抗劑活性的一些實(shí)例顯示在3中，其中使用了單字母來(lái)表示氨基酸?！癲”表示氨基酸的右旋(D)形式?！癗D”表示沒(méi)有測(cè)定。
表3作為C5a拮抗劑的新化合物
Ms＝甲磺酰基，Ts＝甲苯磺?；琈eSuc＝甲基琥珀酸酯，Suc＝琥珀酸酯，Ahx＝6-氨基己酸酯，HPhe＝高苯基丙氨酸，Phg＝苯基甘氨酸，HC＝氫化肉桂酰胺基(Hydrocinnamate)ND＝未測(cè)定
Hyp＝反式-羥基脯氨酸，Thp＝順式-硫代脯氨酸
Aic-氨基茚滿羧酸Tic-四氫異喹啉dhCha-D-高環(huán)己基丙氨酸
hPhe＝高苯基丙氨酸，2Nal＝2-萘基丙氨酸，1Nal＝1-萘基丙氨酸，Bta＝苯并噻吩基丙氨酸，F(xiàn)lu＝芴基丙氨酸，Tyr-O-烷基＝酪氨酸的O-烷基化類(lèi)似物。Tic＝四氫異喹啉
Can＝L-刀豆氨酸，Cit＝瓜氨酸，hArg＝高精氨酸
1Nal＝1-萘基丙氨酸，Dap＝2，3-二氨基丙酸，dPhe＝D-苯基丙氨酸實(shí)施例4藥效團(tuán)提煉在表2結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們發(fā)展了人分葉核白細(xì)胞上C5a受體拮抗活性需要的提煉的藥效團(tuán)，如下所述位置“A”能容忍大量基團(tuán)，包括H(例如化合物17、18)、烷基、芳基、NH2、NH烷基、N(烷基)2、NH芳基、NH?；?例如化合物1、3、4、5、6)、NH苯甲?；?例如化合物2)、OH、O烷基、O芳基、NHSO2烷基(例如化合物10)、NHSO2芳基(例如化合物11)，對(duì)活性沒(méi)有不利的作用。
位置“A”取代基的寬容忍性表示在環(huán)狀肽骨架的附加基團(tuán)方面受體中有相當(dāng)?shù)目臻g。該位置因此可用來(lái)添加取代基以改變拮抗劑的水和脂質(zhì)溶解性，從而提高拮抗劑的口服或透皮吸收。該位置也可連接標(biāo)記例如熒光標(biāo)記，對(duì)靶細(xì)胞有高度親和力的拮抗劑或多肽序列，例如與C5a氨基酸1-69類(lèi)似的序列。
位置“B”可為烷基、芳基、苯基、芐基、萘基或吲哚、或D-或L-氨基酸的側(cè)鏈，例如L-苯基丙氨酸(化合物1)、或L-苯基甘氨酸(化合物12)。不應(yīng)為D-苯基丙氨酸(化合物8)、L-高苯基丙氨酸(化合物7)、L-酪氨酸(化合物9)、L-高酪氨酸、甘氨酸(化合物13)、L-色氨酸(化合物16)、或L-高色氨酸的側(cè)鏈。
位置“B”不能容忍寬范圍的取代基。似乎L-苯基丙氨酸的芐基不能容忍許多取代，并且不能變得更大。該位置看起來(lái)是受體結(jié)合所需要的，而不是對(duì)拮抗活性本身重要，因?yàn)樾揎椀淖畲笮Ч窃谑荏w親和力方面，如IC50測(cè)定所示。
位置“C”應(yīng)該為小取代基，例如D-或L-氨基酸的側(cè)鏈例如脯氨酸(化合物1)、L-纈氨酸(化合物20)、丙氨酸、反式-羥基脯氨酸(化合物25)，或順式-硫代脯氨酸(化合物26)。不應(yīng)該為大的取代基例如L-異高氨酸(化合物21)、D-或L-苯基丙氨酸(化合物22、23)、L-環(huán)己基丙氨酸(化合物24)的側(cè)鏈。
“D”位置應(yīng)該為大體積的取代基，例如D-氨基酸如D-亮氨酸(化合物31)、D-高亮氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸(化合物1)、D-高環(huán)己基丙氨酸(化合物28)、D-纈氨酸(化合物29)、D-正亮氨酸(化合物36)、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸(化合物33)、D-四氫異喹啉(化合物35)、D-谷氨酰胺(化合物37)、D-谷氨酸(化合物38)、或D-酪氨酸(化合物40)的側(cè)鏈。不應(yīng)該為更小的取代基，例如甘氨酸、D-丙氨酸(化合物30)的側(cè)鏈，體積大的平面?zhèn)孺溔鏒-色氨酸(化合物32)、大的帶電側(cè)鏈如D-精氨酸(化合物39)或D-賴氨酸(化合物43)，或L-氨基酸如L-環(huán)己基丙氨酸(化合物27)。骨架上位置“D”處小的D-氨基酸以及小的或大的L-氨基酸將導(dǎo)致C5a受體親和力的極大下降。
位置“E”選自L-色氨酸(化合物1)和L-高色氨酸，而不是D-色氨酸(化合物59)或L-N-甲基色氨酸(化合物47)的大側(cè)鏈；L-苯基丙氨酸(化合物60)而不是L-高苯基丙氨酸(化合物61)；L-萘基(化合物52)而不是L-2-萘基(化合物53)；L-3-苯并噻吩基丙氨酸(化合物58)。不應(yīng)該是L-環(huán)己基丙氨酸(化合物50)、D-亮氨酸(化合物51)、L-芴基丙氨酸(化合物54)、甘氨酸(化合物55)、L-四氫異喹啉(化合物56)，或L-組氨酸(化合物57)的側(cè)鏈。
環(huán)狀肽骨架位置“E”的取代基對(duì)C5a受體的拮抗活性至關(guān)重要。該位置的取代基可限制構(gòu)象變化，后者通常與拮抗劑反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。這可能是“阻滯”殘基，其將拮抗劑固定在受體中并防止受體的構(gòu)象重組，而構(gòu)象重組這一點(diǎn)是激動(dòng)活性必須的。
位置“F”可為下列基團(tuán)的側(cè)鏈L-精氨酸(化合物1)、L-高精氨酸(化合物44)、L-瓜氨酸(化合物45)；或L-刀豆氨酸(化合物48)。而不應(yīng)該是D-或L-賴氨酸(化合物47)、D-或L-高賴氨酸、或甘氨酸(化合物49)。該位置的取代基大小對(duì)得到高受體親和力很重要。瓜氨酸化合物具有未帶電的側(cè)鏈，但是與該位置的精氨酸相比，仍然具有可觀的拮抗劑活性。
位置“X”可為-(CH2)nNH-或-(CH2)n-S-，其中n為1～4的整數(shù)，優(yōu)選地2或3，-(CH2)2O-、-(CH2)3O-、-(CH2)3-，-(CH2)4-、-CH2COCHRNH-、或-CH2-NHCOCHRNH-其中R為任何常見(jiàn)的或不常見(jiàn)的L-或D-氨基酸的側(cè)鏈。該基團(tuán)提供了環(huán)化連接，例如在化合物1的Arg和Phe殘基之間，從而影響環(huán)狀骨架的結(jié)構(gòu)。此外，該連接基上的取代基例如R能潛在地與受體殘基相互作用以增加拮抗劑地親和力。
環(huán)上氨基酸成分的N-甲基化傾向于降低化合物的受體結(jié)合親和力和拮抗劑活性(例如64，65)，盡管鳥(niǎo)氨酸的δ氮的N-甲基化事實(shí)上對(duì)拮抗劑活性無(wú)影響。
骨架上的多重變化對(duì)得到相對(duì)于1的活性增加的拮抗劑是不利的。因此盡管L-Phe對(duì)1中的L-Trp是一種合適的置換(例如60)，拮抗劑活性改變很小，1的組合改變，例如L-Phe代替Trp以及或者L-高Phe代替Arg(例如67)或?qū)β?苯基丙氨酸代替Arg(例如68)，導(dǎo)致下降的受體親和力以及下降的拮抗劑活性。類(lèi)似地，當(dāng)1中的L-Trp用L-Phe代替且D-Cha用D-Phe代替，化合物失去了根本的活性(例如62)。盡管1中的D-Cha改變?yōu)镈-Phe仍然導(dǎo)致拮抗劑活性的保持(例如33)，當(dāng)與L-Phe代替L-Trp的置換一起時(shí)候(62)，這種變化就是有害的。
明顯地，這些殘基在與受體結(jié)合中存在協(xié)調(diào)性，由于單一變化的一種(例如33，60)產(chǎn)生的活性高于兩種變化一起進(jìn)行(例如62)的情形。當(dāng)Arg被仍然含帶電氨基的芳香基團(tuán)替代的時(shí)候(69)，活性顯著下降，如當(dāng)60中的Phe被取代的酪氨酸所替換(70)得到的結(jié)果那樣。
所有這些變化指出了環(huán)狀骨架上什么能或什么不能用來(lái)得到人PMNC5a受體親和力和拮抗劑活性。已經(jīng)公認(rèn)在其他細(xì)胞類(lèi)型上的C5a受體對(duì)側(cè)鏈具有不同的容忍性，但是環(huán)狀骨架仍然構(gòu)成活性化合物的基礎(chǔ)。
實(shí)施例5大鼠中逆向被動(dòng)阿蒂斯反應(yīng)逆向被動(dòng)腹膜阿蒂斯反應(yīng)按照以前公開(kāi)的方法進(jìn)行誘導(dǎo)(Strachan等，2000)，一組大鼠在腹膜抗體沉積之前用AcF-[OPdChaWR](1)經(jīng)口強(qiáng)飼(10mgkg-1的10％乙醇/90％鹽水溶液至終體積200μl)或抗體沉淀30分鐘之前適當(dāng)?shù)乜诜苊綄?duì)照進(jìn)行處理。雌性Wistar大鼠(150-250g)用氯胺酮(80mg kg-1腹腔注射)和甲苯噻嗪(12mg kg-1腹腔注射)進(jìn)行麻醉。
將大鼠的側(cè)面小心地剃毛并在每側(cè)清楚地描繪5個(gè)不同的位置。注射抗體10分鐘之前，將埃文斯藍(lán)(15mg kg-1i.v.)、雞卵清蛋白(20mg kg-1i.v.)注射到股靜脈誘導(dǎo)在各個(gè)皮膚位置逆向被動(dòng)阿蒂斯反應(yīng)。在大鼠每側(cè)2個(gè)分開(kāi)的皮膚位置以雙份注射兔抗雞卵清蛋白(只有鹽水、100、200、300或400μg抗體，終注射體積30μL)，每只大鼠有10個(gè)注射位置。將大鼠放置在加熱墊上，并在4小時(shí)的處理期間保持麻醉狀態(tài)，定期采集血液樣品。血液在冰上自發(fā)地凝結(jié)，并且收集血清樣品并保存在-20℃。皮膚阿蒂斯反應(yīng)誘導(dǎo)4小時(shí)后，將麻醉的大鼠安樂(lè)死，并從各阿蒂斯反應(yīng)位點(diǎn)采集10mm2面積的皮膚。將皮膚樣品在10％緩沖的福爾馬林中至少保存10天，然后利用蘇木精和曙紅染色進(jìn)行組織學(xué)分析。此外，另一組皮膚樣品放置在1mL甲酰胺中過(guò)夜，在650nm處測(cè)定埃文斯藍(lán)萃取液的吸光度，作為血清滲漏到皮膚中的指標(biāo)。圖1顯示了用AcF-[OPdChaWR]靜脈內(nèi)、口服或局部前處理后皮內(nèi)注射0-400μg位置-1的兔抗雞卵清蛋白后皮膚沖壓提取液的光密度。數(shù)據(jù)顯示為650nm處吸光度與血漿吸光度的百分比的平均值±SEM(n＝3-6)。*表示當(dāng)與阿蒂斯對(duì)照值相比P值≤0.05的情況。
將大鼠用C5aR拮抗劑，AcF-[OPdChaWR](1)的TFA鹽進(jìn)行處理，或者靜脈內(nèi)(0.3-1mgkg-1的包含10％乙醇的200μL鹽水，皮膚阿蒂斯開(kāi)始之前10min)、經(jīng)口(0.3-10mgkg-1的200μL鹽水，包含10％乙醇，經(jīng)口強(qiáng)飼，在處理之前18小時(shí)斷食的大鼠的皮膚阿蒂斯之前30分鐘)或局部(200-400μg位置-1，皮膚阿蒂斯反應(yīng)開(kāi)始之前10分鐘)，或用適當(dāng)?shù)娜苊綄?duì)照。拮抗劑局部應(yīng)用涉及應(yīng)用20μl的10-20mgmL-1溶液，溶解在10％二甲基亞碸(DMSO)中，在阿蒂斯反應(yīng)開(kāi)始之前10分鐘將其直接涂抹在各側(cè)皮膚上，。
從用埃文斯藍(lán)處理的大鼠鹽水-只有注射位置只作為抗原對(duì)照，從用埃文斯藍(lán)加上局部只有DMSO處理大鼠的鹽水-單用注射位置用作溶媒對(duì)照，用埃文斯藍(lán)加上或者靜脈內(nèi)、口服或局部拮抗劑處理大鼠的鹽水-單用注射位置作為拮抗劑對(duì)照，并且埃文斯藍(lán)加上皮膚兔抗雞卵清蛋白作為抗體對(duì)照。局部應(yīng)用肽AcF-[OPGWR]作為無(wú)活性肽對(duì)照，其具有與AcF-[OPdChaWR](1)類(lèi)似的化學(xué)組成以及溶解性，但是在分離的人PMNs中IC50結(jié)合親和力＞1mM。AcF-[OPGWR]也溶解在10％DMSO中，并阿蒂斯反應(yīng)開(kāi)始之前10分鐘以400μg位置-1的劑量進(jìn)行局部應(yīng)用。
TNFα測(cè)定血清TNFα濃度用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)量。所用的抗體對(duì)為兔抗大鼠TNFα抗體偶聯(lián)生物素化的鼠抗-大鼠TNFα抗體。圖2顯示用AcF-[OPdChaWR]靜脈內(nèi)、口服或局部預(yù)處理大鼠組的皮膚阿蒂斯反應(yīng)開(kāi)始后定期的時(shí)間間隔的血清TNFα濃度。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM(n＝3-6)。*表示與阿蒂斯對(duì)照值相比，P值＜0.05。
白介素-6測(cè)定如前所述地ELISA方法用來(lái)測(cè)量血清和腹膜洗液白介素-6(IL-6)濃度(Strachan等，2000)。
病理學(xué)評(píng)價(jià)將大鼠皮膚樣品在10％緩沖的福爾馬林中固定至少10天，并用蘇木精和曙紅利用標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)技術(shù)進(jìn)行染色。皮膚樣品以盲檢的方式分析病例證據(jù)，大鼠PMN浸潤(rùn)程度以0-4級(jí)進(jìn)行評(píng)分。皮膚阿蒂斯反應(yīng)開(kāi)始產(chǎn)生間質(zhì)嗜中性粒細(xì)胞的增加，按照下述方式進(jìn)行定量。切片評(píng)分為0，如果沒(méi)有檢測(cè)到異常。評(píng)分為1表示血管中出現(xiàn)增加的PMNs，但是炎性細(xì)胞沒(méi)有遷移出內(nèi)腔。評(píng)分2和3表示在組織間隙中出現(xiàn)增加數(shù)目的PMNs，并且在血管的周?chē)霈F(xiàn)更明顯的炎性細(xì)胞聚集。表示嚴(yán)重病理異常的最大評(píng)分4存在于下述特征的皮膚切片中，伴隨PMNs過(guò)量浸潤(rùn)到組織中并且這些細(xì)胞遷移出血管。圖3顯示皮內(nèi)注射增加量的抗體導(dǎo)致皮膚樣品病理指數(shù)評(píng)分的劑量響應(yīng)增加(A)。顯示了用AcF-[OPdChaWR]靜脈內(nèi)(B)(n＝3)、經(jīng)口(C)(n＝3)和局部(D)(n＝3)預(yù)處理的大鼠中皮膚樣品進(jìn)行皮內(nèi)注射鹽水或400μg位置-1抗體(n＝5)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM。*當(dāng)與阿蒂斯值相比，用無(wú)參數(shù)的t-檢驗(yàn)P≤0.05。
實(shí)施例6C5a拮抗劑對(duì)大鼠中腸缺血-再灌注損傷模型的影響所有實(shí)驗(yàn)之前12小時(shí)，將雌性Wistar大鼠(250-300g，n＝132)禁食并且只給予水。將動(dòng)物經(jīng)腹膜內(nèi)注射80mgkg-1氯胺酮和10mgkg-1甲苯噻嗪進(jìn)行麻醉，并在整個(gè)過(guò)程中，將大鼠放置在加熱墊上以保持正常的體溫。通過(guò)中線切開(kāi)打開(kāi)腹部以暴露腸系膜上動(dòng)脈(SMA)。從通過(guò)一定長(zhǎng)度的聚乙烯管打環(huán)的縫合絲形成一種非-創(chuàng)傷性閉合動(dòng)脈裝置。通過(guò)牽引至環(huán)的末端閉合SMA。將聚乙烯導(dǎo)管插入股靜脈以輸入1mgkg-1AcF-[OPdChaWR](1)的5％乙醇溶液或無(wú)菌無(wú)熱源鹽水，體積0.2ml。用2分鐘完成輸液。經(jīng)口施用AcF-[OPdChaWR](1)(0.3、1、10mgkg-1)在閉合之前60分鐘通過(guò)強(qiáng)飼(0.2ml鹽水的25％乙醇溶液)而實(shí)現(xiàn)。腸缺血通過(guò)將SMA夾住30分鐘進(jìn)行誘導(dǎo)，之后移去閉合縫合，然后監(jiān)控再灌注120分鐘。假手術(shù)大鼠按照同樣的方式進(jìn)行處理，除了省略脈管閉合，并且輸注0.2ml無(wú)菌、無(wú)熱源鹽水或強(qiáng)飼0.2ml鹽水的25％乙醇溶液。在估計(jì)PMN數(shù)目的時(shí)間期間180分鐘內(nèi)以定期的時(shí)間間隔將血樣品(50μL)收集到肝素化的Eppendorf管中。在不同系列的同樣實(shí)驗(yàn)中，在180分鐘的定期時(shí)間間隔點(diǎn)采集全血并在冰上凝結(jié)，并且收集血清或血漿樣品并在-20°℃保存以進(jìn)行后續(xù)的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、觸珠蛋白(Hp)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)濃度的測(cè)定。在120分鐘再灌注期間結(jié)束的時(shí)候，將動(dòng)物用過(guò)量的戊巴比妥進(jìn)行安樂(lè)死。取出閉合的回腸部分，將內(nèi)腔用鹽水洗滌，并將腸吸干然后稱(chēng)重。將樣本在烤箱中在80℃干燥24小時(shí)得到組織的干重。通過(guò)評(píng)價(jià)濕和干組織重量比判斷腸水腫。此外，富集缺血和正常腸樣本，并用鹽水洗滌并立即在10％緩沖的甲醛-鹽水固定以進(jìn)行組織學(xué)研究。
圖4顯示與假手術(shù)動(dòng)物相比，缺血-再灌注后小腸的濕干重之比顯著地升高。與未處理的缺血-再灌注(I/R)動(dòng)物相比，用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和10mg/kg p.o.處理顯著地減少組織水腫。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM(每組中，n＝4-6)。*，P＜0.05vs.假手術(shù)動(dòng)物。+，P＜0.05vs.I/R動(dòng)物。
嗜中性白血球減少分析將用于PMN計(jì)數(shù)的血(50μL)放置在肝素化的管中并在等體積的Histopaque 1083(Sigma，U.S.A.)上分層，分離PMNs并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。PMN的濃度值表示為SMA閉合之前即刻得到的值的平均百分?jǐn)?shù)±SEM。
圖5顯示與假手術(shù)動(dòng)物(A，B)相比，消化道缺血-再灌注引起顯著的循環(huán)PMN濃度下降。用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.(A)和10mg/kg p.o.(B)進(jìn)行前處理的大鼠顯著地抑制缺血-再灌注誘導(dǎo)的嗜中性白血球減少。1mg/kg p.o.(B)處理的動(dòng)物顯示沒(méi)有抑制嗜中性白血球減少。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*等于P＜0.05vs.對(duì)照動(dòng)物。線顯示30分鐘缺血期。
腫瘤壞死因子-α測(cè)定血清TNF-α濃度用酶聯(lián)免疫吸附分析(OptEIA，Pharmingen，USA)，按照生產(chǎn)者的說(shuō)明。血清樣品中TNF-α的濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)線性回歸分析進(jìn)行測(cè)定。
圖6顯示與假手術(shù)動(dòng)物相比，消化道缺血-再灌注產(chǎn)生顯著的血清TNF-α升高。用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1-10mg/kg p.o.前處理的大鼠完全抑制血清TNF-α水平的變化。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*，P＜0.05vs.假手術(shù)動(dòng)物。線顯示30分鐘缺血期。
觸珠蛋白分析血清Hp利用Hp分析試劑盒(Tridelta Development Ltd.U.K)進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明。血清樣品中的Hp濃度利用線性回歸從標(biāo)準(zhǔn)曲線中測(cè)定。
圖7顯示與假手術(shù)動(dòng)物相比，消化道缺血-再灌注產(chǎn)生顯著增加的血清觸珠蛋白。用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg p.o.進(jìn)行大鼠前處理顯著地抑制血清觸珠蛋白水平的增加。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM(每組n＝4-6)。*，P＜0.05vs.假手術(shù)動(dòng)物。+，P＜0.05vs.I/R動(dòng)物。
天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶分析血漿AST(AST/GOT；Sigma，USA)濃度在收集血漿48小時(shí)內(nèi)根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)量。血漿AST濃度從校準(zhǔn)曲線得到。結(jié)果以Sigma-Franke(SF)單位/ml進(jìn)行表述。
圖8顯示與假手術(shù)動(dòng)物相比，消化道缺血-再灌注導(dǎo)致顯著增加的血漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。與未處理的I/R動(dòng)物相比，用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg處理顯著地降低消化道缺血-再灌注誘導(dǎo)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*，P＜0.05vs.假手術(shù)動(dòng)物。+，P＜0.05vs.I/R動(dòng)物。
組織病理學(xué)將樣本在10％甲醛-鹽水中固定，包埋在石蠟中，連續(xù)切片，并用蘇木精和曙紅染色。以盲檢的方式，讓一位訓(xùn)練的觀察者讀片并評(píng)分。腸組織損傷的程度利用前述0～8級(jí)分級(jí)評(píng)分進(jìn)行判斷(Chiu等，1970)。
圖9顯示與假手術(shù)動(dòng)物相比，消化道缺血-再灌注導(dǎo)致顯著的腸損傷。與未處理的I/R動(dòng)物相比，用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg處理顯著地降低消化道缺血-再灌注誘導(dǎo)的組織損傷。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*，P＜0.05vs.I/R動(dòng)物。
實(shí)施例7大鼠單關(guān)節(jié)抗原-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎雌性Wistar大鼠(150-250g)從Central Animal Breeding House，Universityof Queensland獲得。將甲基化的牛血清白蛋白(mBSA)(0.5mg)溶解在Freund全佐劑(0.5mg)中并超聲以產(chǎn)生均勻的懸浮液。在第1天和第7天每只大鼠接受皮下注射這種懸浮液(0.5mL)。在第12-28天，將大鼠隔離到分離的籠子中，每天監(jiān)測(cè)體重以及進(jìn)食和進(jìn)水情況。大鼠接受包含AcF-[OPdChaWR](1)或者普通自來(lái)水龍頭水或飲用水。每天監(jiān)測(cè)體重和進(jìn)水情況，并且大鼠在試驗(yàn)的12-28天接受日劑量為1mg/kg/天的C5aR拮抗劑AcF-[OPdChaWR](1)。在第14天，將大鼠麻醉并將其后肢剃光。每只大鼠接受通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(100μl)注射在左膝注射mBSA(0.5mg)，右膝接受鹽水。膝蓋只接受鹽水處理的大鼠接受正常的飲水并作為鹽水對(duì)照，大鼠接受AcF-[OPdChaWR](1)飲用水溶液的大鼠的鹽水處理膝蓋作為拮抗劑對(duì)照。
在第28天將大鼠安樂(lè)死，并將全血收集到Eppendorf管中并在冰上凝結(jié)。將血樣品離心(11,000rpm×3分鐘)并收集血清并在-20℃儲(chǔ)存直至用ELISA進(jìn)行血清細(xì)胞因子分析。將各膝蓋莢膜用100μL鹽水灌洗，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外，將部分膝關(guān)節(jié)洗液滴到玻璃載波片上，并使之空氣干燥。一旦干燥，將細(xì)胞用不同的染料(DiffQuick)進(jìn)行染色，并用40x鏡頭顯微鏡進(jìn)行差示細(xì)胞計(jì)數(shù)。將各關(guān)節(jié)的其余洗液在-20℃儲(chǔ)存直至后續(xù)用ELISA進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞因子水平分析。去除各膝關(guān)節(jié)，并用解剖刀將皮膚分離并進(jìn)行固定。將膝關(guān)節(jié)樣品在10％緩沖的福爾馬林儲(chǔ)存≥10天。然后將膝關(guān)節(jié)用蒸餾水洗滌并在飽和的EDTA溶液中放置21天進(jìn)行脫鈣并包埋在石蠟中。
膝組織樣品利用上述實(shí)施例6中描述的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)技術(shù)進(jìn)行制備并用蘇木精和曙紅染色。以盲檢的方式分析組織載波片。組織切片用0-4級(jí)評(píng)分，0分表示無(wú)異常，隨著滑液細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨破壞以及出血的出現(xiàn)，評(píng)分升高。沒(méi)有樣品中出現(xiàn)明顯的骨侵蝕。在進(jìn)行TNFα和IL-6水平ELISA分析時(shí)候?qū)⒀搴突簶悠方鈨?。從?biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定濃度，利用前述實(shí)施例6中描述的ELISA方法。
圖10顯示在第-2～+14天經(jīng)口施用AcF-[OPdChaWR]對(duì)關(guān)節(jié)炎右膝關(guān)節(jié)腫脹的抑制，而圖11顯示在右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)洗液中TNF-α和IL-6水平的抑制。未處理指動(dòng)物未用AcF-[OPdChaWR]處理但是在敏化后右膝用抗原刺激。
實(shí)施例8C5a拮抗劑局部皮膚應(yīng)用本發(fā)明教導(dǎo)了局部應(yīng)用C5a拮抗劑可用來(lái)治療涉及補(bǔ)體系統(tǒng)激活的局部炎性疾病。在該實(shí)施例中，我們證實(shí)局部應(yīng)用C5a拮抗劑也可產(chǎn)生全身藥理作用，并在循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)相應(yīng)濃度的C5a拮抗劑。
在局部皮膚應(yīng)用后，考察了環(huán)狀拮抗劑的體內(nèi)藥理性質(zhì)。使用了內(nèi)血毒癥模型，其中1mg/kg Escherichia coli脂多糖(LPS；血清型55B5，Sigma，USA，以100mg ml-1的水溶液4℃儲(chǔ)存)，經(jīng)i.v注射到大鼠中，產(chǎn)生循環(huán)PMN水平和血壓的急性變化。這些參數(shù)在有和無(wú)C5aR拮抗劑(1mg/kg i.v或50mg/kg/大鼠局部)條件下測(cè)定。該研究顯示局部應(yīng)用C5a受體拮抗劑是一種有效的轉(zhuǎn)運(yùn)化合物的方法，觀察到全身性藥理活性。
將重200-250g的雌性Wistar大鼠用來(lái)進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試所有的C5a受體拮抗劑。將大鼠按照前述方法進(jìn)行麻醉，并轉(zhuǎn)移到加熱墊上以保證在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中保持體溫。將導(dǎo)管插入到股靜脈中，用縫合線進(jìn)行保護(hù)，并充滿100μL肝素化鹽水。對(duì)大鼠施用拮抗劑或溶媒，靜脈內(nèi)(1mg kg-1的200μL鹽水，包含10％乙醇，LPS刺激之前10分鐘)或局部(10mg位置-1的50％二甲基亞砜/H2O，補(bǔ)體刺激之前60分鐘)。在拮抗劑或溶媒對(duì)照的iv用藥10分鐘之后或局部用藥60分鐘之后，對(duì)大鼠經(jīng)股導(dǎo)管i.v輸注LPS(1mg kg-1i.v的100μL鹽水溶液)、重組人C5a(2μgkg-1的100μL溶液)，或溶媒對(duì)照。所有i.v輸注試劑在2分鐘時(shí)間注射完畢，然后注射100μL鹽水以保證藥物的完全輸送。
在藥物和LPS或C5a給藥的時(shí)間點(diǎn)，從尾靜脈采集全血樣品(0.1mL)。并在相對(duì)于注射LPS(時(shí)間0點(diǎn))的-15、0、5、10、15、30、60、90、120和150分鐘采集樣品，并放置在含肝素(500單位/mL)的管中。為了分離PMNs，將100μL血在200μL的Histopaque 1077(Sigma U.S.A.)溶液上分層并在400xg室溫(25℃)離心30分鐘。分出富含血小板的血漿上清液層、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞界面以及Histopaque的分離層并棄去，留下富含PMN和紅細(xì)胞層。將9mL冷蒸餾水(4℃)加入到殘留的沉淀中并振蕩40秒以溶解紅血細(xì)胞。將Dulbecco’s磷酸鹽緩沖的鹽水(10x濃度)加入以恢復(fù)等張性。然后將細(xì)胞在400xg在10℃離心15分鐘。將得到的上清液棄去，剩下PMNs沉淀。將PMNs進(jìn)一步用9mL鹽水洗滌，并再在400xg在10℃離心10分鐘。再將得到的上清液棄去，將得到的沉淀再懸浮于100μL鹽水中并充分混合。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上對(duì)PMNs計(jì)數(shù)。將各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)計(jì)算為補(bǔ)體刺激或LPS之前時(shí)間0點(diǎn)的細(xì)胞總數(shù)的百分比。
將用于本研究的雌性Wistar大鼠分成下述處理組(a)單用LPS，其中輸注100μL 5％乙醇(-15分鐘)+1mg/kg LPS(0分鐘)；(b)乙醇對(duì)照，其中在-15分鐘輸注100μL5％乙醇以考察乙醇對(duì)大鼠中測(cè)定參數(shù)的影響；
(c)拮抗劑對(duì)照，其中在-15分鐘經(jīng)i.v.輸注1mg/kg環(huán)狀拮抗劑；(d)i.v拮抗劑+LPS，其中輸注1mg/kg環(huán)狀拮抗劑(-15分鐘)以及1mg/kgLPS(0分鐘)；以及(e)局部-應(yīng)用拮抗劑+LPS，其中10mg/大鼠的拮抗劑涂抹在大鼠的腹部，然后在0分鐘的時(shí)候iv輸注LPS。
將C5a拮抗劑例如3D53(PMX53)以應(yīng)用劑量50mg/kg對(duì)大鼠皮膚給藥在循環(huán)血漿中產(chǎn)生藥理顯著水平的藥物。藥物在多種溶劑，例如二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PG)以及水以及多種組合中的應(yīng)用導(dǎo)致循環(huán)中出現(xiàn)藥物的藥理相關(guān)濃度，如圖12中所示。這表明皮膚應(yīng)用3D53的DMSO/蒸餾水或丙二醇(PG)/水溶液導(dǎo)致在15分鐘內(nèi)在循環(huán)血漿中出現(xiàn)C5a拮抗劑，并且顯著的水平持續(xù)至少4小時(shí)。
實(shí)施例9皮膚應(yīng)用后C5a拮抗劑的全身性作用如實(shí)施例8中所示，對(duì)動(dòng)物皮膚局部應(yīng)用C5a拮抗劑在循環(huán)中產(chǎn)生藥理相關(guān)的藥物水平。為了顯示這些水平具有全身性活性，測(cè)定了這些循環(huán)水平的C5a拮抗劑抑制中性白細(xì)胞減少癥的效果，后者為i.v.給藥C5a時(shí)的作用。
將C5a受體拮抗劑3D53以(10mg/大鼠)的50％丙二醇和50％蒸餾水進(jìn)行給藥。將組合物均勻地涂抹在腹部皮膚(4×8cm2)上30分鐘，然后將C5a經(jīng)i.v.注射2μg/kg的200μl鹽水溶液。在下列時(shí)間點(diǎn)采集血樣-30(藥物給藥前)、0(C5a注射前)以及5、15、30、60和120分鐘以測(cè)定循環(huán)PMNs。如圖13中所示，局部應(yīng)用化合物3D53的確預(yù)防C5a的中性白細(xì)胞減少癥作用。
實(shí)施例10局部應(yīng)用C5a拮抗劑抑制LPS的全身性效果將C5a拮抗劑，3D53(化合物1)以及化合物17和化合物45以劑量10mg/大鼠在50％DMSO/50％H2O中進(jìn)行局部應(yīng)用，如上所述。皮膚應(yīng)用拮抗劑60分鐘后，將LPS以1mg/kg劑量經(jīng)i.v.進(jìn)行注射。在LPS注射后，監(jiān)測(cè)循環(huán)PMN水平150分鐘，并計(jì)算PMN水平相對(duì)于注射LPS時(shí)間0點(diǎn)的百分變化。得到的結(jié)果，如圖14中所示，表明局部應(yīng)用的每種C5a拮抗劑抑制響應(yīng)i.v.LPS的嗜中性白血球減少，并且這種抑制可與i.v.注射藥物后觀察到的抑制相比。
實(shí)施例11在腹主動(dòng)脈瘤手術(shù)后以及外傷性壓傷后，下肢缺血-再灌注(I/R)損傷是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題(Kerrigan和Stotland，1993)。骨骼肌肉組織的缺血和隨后的再灌注刺激受影響肌肉的炎性反應(yīng)，以及在其他組織中誘導(dǎo)損傷(Gute等，1998)。在嚴(yán)重的肢體缺血情況下，發(fā)生的再灌注與多全身性組織衰竭導(dǎo)致的高死亡率相關(guān)聯(lián)(Defraigne和Pincemail，1997)。為了考察C5a受體拮抗劑對(duì)大鼠中下肢缺血-再灌注(I/R)后多種局部和遠(yuǎn)端損傷參數(shù)的抑制能力，將大鼠后肢進(jìn)行缺血2小時(shí)和再灌注4小時(shí)。這種止血帶刺激模型已經(jīng)被慣犯地用作下肢I(xiàn)/R損傷的模型。
將大鼠進(jìn)行雙后肢缺血2小時(shí)和再灌注4小時(shí)。藥物處理大鼠或在缺血前10分鐘或再灌注之前10分鐘接受AcF-[OPdChaWR](1mg/kg)i.v.，或缺血之前30分鐘口服(10mg/kg)。測(cè)定循環(huán)中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙氨酸和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT/AST)、肌酸酐、血尿氮(BUN)、分葉核白細(xì)胞(PMNs)和鈣(Ca++)和鉀(K+)的水平。這些生化指標(biāo)公知可以反映I/R事件后的組織或器官損傷。其他測(cè)量的參數(shù)包括肺、肝臟和肌肉中的尿蛋白水平、肌肉水腫和髓過(guò)氧化物酶(MPO)濃度以及肝臟勻漿中的TNF-α濃度。與假手術(shù)動(dòng)物相比，這些參數(shù)中沒(méi)有觀察到明顯的變化，表明單用藥物沒(méi)有這些標(biāo)志物變化所定義的副作用。肢體I/R損傷特征為CK、LDH、ALT、AST、肌酸酐、BUN、蛋白尿、PMNs、血清K+、肌肉水腫、器官M(fèi)PO以及肝臟勻漿TNF-α濃度的顯著升高，但是血清Ca++濃度的顯著下降。當(dāng)大鼠接受AcF-[OPdChaWR]處理的時(shí)候，這些參數(shù)均有顯著改善。
本研究按照National Health & Medical Research Council of Australia的指導(dǎo)規(guī)則進(jìn)行，并且實(shí)驗(yàn)方案得到University of Queensland Animal EthicsCommittee的批準(zhǔn)。重250-300g的雌性Wistar大鼠禁食過(guò)夜，然后通過(guò)腹腔注射注射6mg/kg甲苯噻嗪和120mg/kg氯胺酮進(jìn)行麻醉。通過(guò)另外注射氯胺酮維持實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的麻醉。將大鼠放置在加熱墊上以保持正常的體溫，并將聚乙烯導(dǎo)管插入到右頸靜脈以輸入C5a拮抗劑或7％乙醇/鹽水。雙后肢缺血按照下述方式誘導(dǎo)通過(guò)在每只后肢較大轉(zhuǎn)節(jié)上應(yīng)用乳膠o-環(huán)(市售環(huán)形物；Hayes Veterinary Supplies，Brisbane，Australia)。缺血2小時(shí)后，切開(kāi)乳膠環(huán)并去除并將肢體再灌注4小時(shí)。使用了6個(gè)實(shí)驗(yàn)組
(a)假手術(shù)，(b)只有缺血，(c)只有I/R-，(d)I/R+C5a拮抗劑(1mg/kg，i.v.)，缺血前10分鐘給藥，(e)I/R+C5a拮抗劑(10mg/kg，p.o.)，缺血前30分鐘給藥，以及(f)I/R+C5a拮抗劑(1mg/kg，i.v.)，再灌注前10分鐘給藥。
假手術(shù)動(dòng)物不進(jìn)行任何缺血或再灌注，并且只有缺血的動(dòng)物用止血帶2小時(shí)沒(méi)有后續(xù)的再灌注。其他所有實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行2小時(shí)缺血以及4小時(shí)的再灌注。假手術(shù)、只有缺血以及I/R組在缺血前10分鐘輸注7％乙醇/鹽水之，而不是藥物。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，從尾靜脈采血，并且血清或血漿在4℃或-20℃保存以進(jìn)行后續(xù)的生化分析。在研究的最后階段收集尿液以測(cè)定尿蛋白水平。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的時(shí)候，將大鼠實(shí)行安樂(lè)死，并取出肺、肝臟以及腓腸肌肌肉部分并評(píng)估水腫、嗜中性粒細(xì)胞集聚以及進(jìn)行肝臟TNF-α研究。
所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。數(shù)據(jù)分析利用GraphPad Prism 3.0軟件(GraphPad Software，Inc.USA)進(jìn)行。假手術(shù)和只有I/R-組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較利用單變量(one-way)分析然后進(jìn)行Dunnett比較后檢驗(yàn)(post-test)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。
(a)肌酸激酶和乳酸脫氫酶的抑制利用CK試劑盒(Sigma，St.Louis，USA)根據(jù)生產(chǎn)廠家說(shuō)明，測(cè)量缺血后即刻、以及再灌注1、2和3小時(shí)后以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采得的血清樣品中的肌酸激酶(CK)的循環(huán)水平。在只接受I/R動(dòng)物中，止血帶放松后10分鐘采集血清以進(jìn)行CK測(cè)定。再灌注2小時(shí)后采集的樣品進(jìn)行1∶5稀釋。
測(cè)量缺血即刻，再灌注1、2和3小時(shí)后以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血清樣品中的乳酸脫氫酶(LDH)循環(huán)水平。在只接受I/R動(dòng)物中，止血帶放松后10分鐘采集血清以進(jìn)行LDH測(cè)定。根據(jù)廠家說(shuō)明利用LDH試劑盒(Sigma)LDH測(cè)定濃度，再灌注2小時(shí)后取得的樣品進(jìn)行1∶4稀釋。對(duì)于這兩種酶，將所有的樣品在4℃保存并在收集后24小時(shí)內(nèi)分析。結(jié)果用Sigma-Franke(SF)單位/mL表示。
如圖15中所示，在再灌注1、2、3和4小時(shí)后，雙后肢I(xiàn)/R產(chǎn)生CK和LDH循環(huán)水平升高，兩種酶水平都在4小時(shí)后達(dá)到峰值。與假手術(shù)大鼠相比，只有缺血的大鼠沒(méi)有顯示出明顯的CK或LDH水平升高(CK，58.3±23.5單位/mL；LDH，269.5±72.8單位/mL；P＞0.05；n＝4)。與假手術(shù)大鼠相比，在只有I/R的大鼠中，止血帶釋放10分鐘后，這些酶的水平?jīng)]有顯著的增加(CK，73.9±28.1單位/mL；LDH，395.3±123.2單位/mL；P＞0.05；n＝4)，表明在4小時(shí)期間再灌注-依賴的升高。再灌注顯著地升高CK和LDH的血漿水平(P＜0.05)。缺血之前用C5a拮抗劑處理的大鼠，或者i.v.(1mg/kg)或口服(10mg/kg)，具有類(lèi)似的顯著地下降的CK和LDH水平，與只接受I/R大鼠相比(P＜0.05)。此外，再灌注之前用C5a拮抗劑(1mg/kg)i.v.處理的大鼠也顯示出顯著的CK和LDH水平的抑制，具有與缺血前處理大鼠類(lèi)似的幅度(P＜0.05)。所有藥物處理大鼠在再灌注期間的這些酶的水平顯著地高于假手術(shù)大鼠組的水平，顯示C5a拮抗劑的部分抑制作用(P＜0.05)。
(b)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的抑制測(cè)量實(shí)驗(yàn)結(jié)束以及再灌注后2和3小時(shí)取得的血漿樣品中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的循環(huán)水平。只接受I/R的動(dòng)物在止血帶釋放后10分鐘采集血清以測(cè)定ALT和AST。用ALT/AST試劑盒(GPT/GOT；Sigma)，根據(jù)廠家說(shuō)明測(cè)定ALT和AST的濃度，測(cè)定在收集血漿24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行，血漿分析前儲(chǔ)存在4℃。結(jié)果以SF單位/mL表示。
如圖16中所示，再灌注2、3或4小時(shí)后，肢體I/R導(dǎo)致血漿中ALT和AST的升高，兩種酶4小時(shí)后達(dá)到濃度峰值。與假手術(shù)大鼠相比，只接受2小時(shí)缺血的大鼠的ALT或AST水平?jīng)]有顯著升高(ALT，12.9±4.6單位/mL；AST，91.4±10.4單位/mL；P＞0.05；n＝4)。在只接受I/R大鼠中，止血帶松開(kāi)10分鐘后，與假手術(shù)大鼠相比，兩種酶的水平?jīng)]有顯著增加(ALT，18.1±4.4單位/mL；AST，105.9±21.3單位/mL；P＞0.05；n＝4)，再次表明再灌注-依賴的升高。在所有3組用C5a拮抗劑處理的大鼠中發(fā)現(xiàn)具有類(lèi)似的ALT和AST水平的顯著下降，與只接受I/R大鼠相比(P＜0.05)。再灌注4小時(shí)后，而不是在2或3小時(shí)，與假手術(shù)大鼠相比，藥物處理大鼠具有顯著地上升的ALT水平(P＜0.05；圖16A)。與此形成對(duì)比的是，與假手術(shù)大鼠相比，這些藥物處理大鼠在所有測(cè)量時(shí)間點(diǎn)具有升高的AST水平，表明C5a拮抗劑對(duì)ALT和AST的不同抑制作用(P＜0.05；圖16B)。
(c)鉀和鈣離子血清水平變化的抑制在各實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以及對(duì)只接受I/R動(dòng)物止血帶釋放10分鐘后，用火焰光度計(jì)(Corning 435；Corning，U.S.A.)測(cè)量鉀離子(K+)的血清水平。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以及對(duì)只接受I/R的動(dòng)物在止血帶釋放10分鐘后，利用鈣試劑盒(Sigma)測(cè)量血清鈣離子(Ca++)濃度。將樣品儲(chǔ)存在-20℃并在收集后2周內(nèi)測(cè)量K+和Ca++水平。結(jié)果以mmol/L表示，并總結(jié)在表1中。
表1缺血以及再灌注4小時(shí)后大鼠血清陽(yáng)離子水平的改變
數(shù)據(jù)為平均值±SEM.
a大鼠數(shù)b缺血/再灌注*P＜0.05vs I/R-只有P＜0.05vs假手術(shù)血尿氮、肌酸酐以及尿蛋白的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集的血清樣品中血尿氮(BUN)循環(huán)水平的測(cè)量利用尿氮試劑盒(Sigma)根據(jù)廠家說(shuō)明進(jìn)行。將樣品儲(chǔ)存在-20℃并在收集后2周內(nèi)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集的血清樣品中肌酸酐的循環(huán)水平利用肌酸酐試劑盒(Sigma)根據(jù)廠家說(shuō)明進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束之前1小時(shí)收集的尿樣品中的蛋白濃度利用蛋白試劑盒(Sigma)根據(jù)廠家說(shuō)明進(jìn)行。將樣品儲(chǔ)存在4℃并在收集后24小時(shí)內(nèi)分析。所有這三種參數(shù)以mg/dL表示，如表2中所示。
表2缺血以及再灌注4小時(shí)后大鼠腎臟損傷標(biāo)志物的改變
數(shù)據(jù)為平均值±SEM.
a大鼠數(shù)b血尿氮c缺血/再灌注d沒(méi)有檢測(cè)到*P＜0.05vs I/R-只有P＜0.05vs假手術(shù)與假手術(shù)大鼠相比，再灌注4小時(shí)后在只接受I/R-大鼠中觀察到高鉀血癥(P＜0.05)。與只接受I/R的大鼠相比，在所有3組藥物處理組中的大鼠具有顯著地下降的K+水平，再灌注之前處理的大鼠顯示出接近正常的水平(P＜0.05)。缺血以及再灌注4小時(shí)后，與假手術(shù)動(dòng)物相比，只接受I/R的大鼠具有顯著地下降的血清Ca++濃度(P＜0.05)。在所有3組藥物處理組中的大鼠顯示出類(lèi)似的I/R-誘導(dǎo)的Ca++水平下降的抑制作用(P＜0.05)。藥物處理I/R大鼠中以及只有缺血大鼠中K+和Ca++二者的水平與假手術(shù)大鼠中的二者水平?jīng)]有顯著的差別(P＞0.05)。在只接受I/R-大鼠中止血帶釋放10分鐘后這些離子的水平(K+，5.27±0.49mmol/L；Ca++，2.50±0.17mmol/L；P＞0.05；n＝4)與假手術(shù)大鼠中的水平也沒(méi)有顯著的差別。
與假手術(shù)大鼠相比，缺血以及再灌注4小時(shí)后，只接受I/R大鼠具有顯著升高的血清BUN和肌酸酐水平以及增加的尿蛋白濃度(P＜0.05)。與假手術(shù)大鼠相比，單獨(dú)缺血2小時(shí)沒(méi)有引起這些參數(shù)中的任何一種上升(P＞0.05)。與只接受I/R大鼠相比，在所有3組用C5a拮抗劑處理的大鼠具有顯著地降低的這些參數(shù)水平(P＜0.05)，并且與假手術(shù)大鼠相比，這些水平?jīng)]有顯著的不同(P＞0.05)。
分葉核白細(xì)胞數(shù)目以嗜中性粒細(xì)胞聚集的抑制測(cè)量缺血之前即刻采集以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集的血樣品中的循環(huán)PMNs，按照Strachan等，(2000)描述的方法。最終樣品中的PMNs數(shù)表述被缺血前數(shù)目的平均百分比±SEM。
如圖17A中所示，與假手術(shù)大鼠相比，再灌注4小時(shí)后只接受I/R大鼠中的循環(huán)PMNs顯著地升高(P＜0.05)。與假手術(shù)大鼠相比，只有缺血處理的大鼠沒(méi)有顯著的PMNs升高(P＞0.05)。在所有的3組藥物處理組中大鼠的PMN數(shù)與假手術(shù)大鼠中的數(shù)值沒(méi)有顯著的不同(P＞0.05)，并且與只接受I/R大鼠相比，顯著地下降(P＜0.05)，缺血前用i.v.(1mg/kg)處理的大鼠顯示出最大的抑制作用。
嗜中性粒細(xì)胞向大鼠中肝臟、肺和肌肉的浸潤(rùn)通過(guò)測(cè)量髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性水平來(lái)判斷。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，得到肺(～0.5g)、肝臟(～1g)以及左下肢肌肉(～1g)并稱(chēng)重然后用1mL磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)進(jìn)行勻漿。然后將樣品進(jìn)行超聲處理，肝臟和肺樣品20秒，或肌肉樣品60秒。離心后(14,000xg，10分鐘，22℃)，將得到的上清夜立即用來(lái)測(cè)量MPO水平。分析混合物由o-dianasidine(2.85mg/mL；Sigma)、過(guò)氧化氫酶(0.85％)以及1∶40稀釋的樣品的PBS溶液組成。底物加入5分鐘后，讀取450nM處的吸光度，并將結(jié)果以吸光度單位/克組織表示。
將在大鼠后肢肌肉、肺以及肝臟MPO的活性水平作為進(jìn)入組織組織的嗜中性粒細(xì)胞的測(cè)定(Kyriakides等，2000)。如圖17B、C和D中所示，與假手術(shù)大鼠大鼠相比，只接受I/R大鼠的后肢肌肉、肺以及肝臟中的MPO活性有顯著的升高(P＜0.05)，而假手術(shù)大鼠、只有缺血大鼠在這些組織的任何一種中MPO的活性沒(méi)有顯著的增加(P＞0.05)。與只接受I/R大鼠相比，所有3組藥物處理大鼠在所有的組織中有顯著下降的MPO活性(P＜0.05)，與假手術(shù)大鼠相比，其水平?jīng)]有顯著的不同(P＞0.05)。
對(duì)肝臟勻漿TNF-α的抑制肝臟勻漿上清樣品中TNF-α水平的測(cè)量，利用酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒(OptEIA，Pharmingen，USA)，如以前所述(Strachan等，2000)方法進(jìn)行。將來(lái)自肝臟勻漿樣品上清液進(jìn)行1∶10稀釋然后用于分析。將上清儲(chǔ)存在-20℃，并在收集后2周內(nèi)分析樣品。結(jié)果以ng/g組織表示。如圖18中所示，與假手術(shù)大鼠的樣品相比，來(lái)自只接受I/R大鼠的肝臟勻漿樣品顯著增加的TNF-α濃度(P＜0.05)。只有缺血大鼠中的TNF-α水平與假手術(shù)大鼠沒(méi)有顯著的不同(P＞0.05)。與只接受I/R的大鼠相比，在藥物處理大鼠中，所有3組具有類(lèi)似的下降的TNF-α濃度(P＜0.05)，與假手術(shù)動(dòng)物相比，沒(méi)有顯著的不同(P＞0.05)。
肌肉水腫的抑制將在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)得到的右后肢肌肉(～1g)稱(chēng)重并在80℃烤箱放置24小時(shí)，然后再稱(chēng)重。測(cè)定濕干重比，并作為肌肉水腫的測(cè)定指標(biāo)。如圖19中所示，與假手術(shù)動(dòng)物相比，只接受I/R大鼠后肢肌肉的濕干重比顯著地增加(P＜0.05)。只有缺血?jiǎng)游镏械谋壤c假手術(shù)動(dòng)物沒(méi)有顯著的不同(P＞0.05)。與只接受I/R大鼠相比，在所有3組藥物處理大鼠中，存在類(lèi)似的下降的濕重-干重比(P＜0.05)，并且這些值與假手術(shù)動(dòng)物中的值沒(méi)有顯著的不同(P＞0.05)。
結(jié)果表明接受2小時(shí)的止血帶-誘導(dǎo)的雙后肢缺血以及再灌注4小時(shí)的大鼠遭受局部損傷以及肺、肝臟以及腎臟損傷，如用多種組織壓力指標(biāo)測(cè)定。與假手術(shù)動(dòng)物相比，只接受缺血的大鼠在疾病標(biāo)志物方面沒(méi)有顯著的改變。與假手術(shù)動(dòng)物相比，再灌注10分鐘后從接受只有I/R處理的動(dòng)物采集的血也沒(méi)有顯著的CK、LDH、AST、ALT、K+或Ca++血漿或血清水平改變。局部骨骼肌肉損傷的嚴(yán)重性通過(guò)再灌注后4小時(shí)肌肉水腫以及嗜中性粒細(xì)胞聚集以及再灌注期間血清CK和LDH的增加來(lái)評(píng)估。胞質(zhì)CK發(fā)現(xiàn)主要在肌肉中，并且時(shí)可靠的肌肉組織損傷標(biāo)志物(Tay等，2000)。乳酸脫氫酶也是一種見(jiàn)于肌肉的胞質(zhì)酶，但是也存在于許多其他組織中(Carter等，1998)。因此，LDH是一種特異性稍差的肌肉損傷測(cè)量，但是仍然可作為一般組織損傷的測(cè)量。
在接受缺血以及再灌注處理的動(dòng)物的肺、肝臟以及腎臟中檢測(cè)遠(yuǎn)端器官損傷指標(biāo)。通過(guò)測(cè)量肺軟組織中嗜中性粒細(xì)胞聚集的增加來(lái)評(píng)價(jià)肺損傷。通過(guò)測(cè)量肝TNF-α以及嗜中性粒細(xì)胞聚集的增加，以及通過(guò)測(cè)量ALT和AST血漿水平來(lái)定量肝損傷。盡管ALT和AST血漿水平的增加典型地可用作肝臟病理學(xué)地標(biāo)志物，但是這兩種酶也見(jiàn)于肌肉中，因此部分增加任何地源于肌肉，而不是肝臟損傷(Tay等，2000)。骨骼肌肉I/R后腎機(jī)能障礙較為常見(jiàn)(Tanaka等，1995)。我們發(fā)現(xiàn)I/R大鼠中血清BUN和血漿肌酸酐增加。但是，肌酸酐，并且特別是BUN，也源自肌肉，并且觀察到的增加也可源于肌肉損傷(Carter等，1998)。我們發(fā)現(xiàn)I/R大鼠中蛋白尿右相當(dāng)大的增加，表明一定程度的腎損傷。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在該模型中，C5a拮抗劑AcF-[OPdCha WR]抑制許多局部組織以及遠(yuǎn)端器官損傷的疾病標(biāo)志物。這些結(jié)果表明C5a在骨骼肌肉I/R損傷病理生理中的關(guān)鍵作用。由于人中下肢缺血和再灌注較高的并發(fā)癥發(fā)病率，本發(fā)明的C5a受體拮抗劑代表了的一種將來(lái)可能的這些并發(fā)癥的治療，特別是當(dāng)I/R損傷可以預(yù)計(jì)的情況，例如在手術(shù)操作中。C5a拮抗劑阻滯促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生以及嗜中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的能力可能是其疾病調(diào)節(jié)特性中的關(guān)鍵因素。這里的口服活性證實(shí)這種藥物性質(zhì)可廣泛用于臨床情況。
討論本發(fā)明描述了一系列包含構(gòu)象限制的扭轉(zhuǎn)環(huán)狀分子，其具有結(jié)合細(xì)胞的預(yù)先構(gòu)成，也可于人C5a結(jié)合。本發(fā)明化合物的主要特征在于環(huán)狀骨架表現(xiàn)處的預(yù)先構(gòu)成的扭轉(zhuǎn)構(gòu)型，其至少3各疏水基團(tuán)聚集到相鄰的空間，創(chuàng)造了疏水表面‘結(jié)構(gòu)部分(patch)’。
拮抗劑的這種扭轉(zhuǎn)構(gòu)象將使環(huán)狀肽與跨膜區(qū)域中在或鄰近于人C5a的C-端也結(jié)合的C5a受體位置結(jié)合。
這里描述的結(jié)果能夠設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)甚至更強(qiáng)活性的構(gòu)象限制的小分子C5a拮抗劑。理論上這些環(huán)狀拮抗劑的特征也可用來(lái)設(shè)計(jì)不相關(guān)的非-肽模板，其類(lèi)似地取代基投射成與當(dāng)這些C5a受體拮抗劑受體結(jié)合時(shí)候占據(jù)的類(lèi)似的三維空間，取代基相應(yīng)于或類(lèi)似于這里描述的環(huán)狀肽骨架相連的那些基團(tuán)。
與非環(huán)狀肽相比，環(huán)狀肽作為候選藥物具有數(shù)種重要的優(yōu)點(diǎn)(Fairlie等1995，F(xiàn)airlie等，1998，Tyndall和Fairlie，2001)。本說(shuō)明書(shū)描述的環(huán)狀化合物對(duì)蛋白水解降解穩(wěn)定，在人血或血漿、在人或大鼠胃液，或在消化酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶存在下在37℃至少穩(wěn)定7小時(shí)。與之相反，由L-氨基酸組成的短的線性肽在這些條件下數(shù)分鐘內(nèi)快速降解成其組成氨基酸。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于環(huán)狀和非肽分子采用的受限的單一構(gòu)象，與非環(huán)狀或線性肽相比，后者具有足夠的靈活性在溶液中采取多種結(jié)構(gòu)而不是受體-結(jié)合需要的一種結(jié)構(gòu)。第三，環(huán)狀化合物例如本發(fā)明描述的那些通常具有更大的脂溶性，作為藥物與非環(huán)肽相比，具有更高的藥物生物利用度，非環(huán)肽幾乎不能經(jīng)口給藥。第四，環(huán)狀分子的血漿半衰期通常比肽類(lèi)長(zhǎng)。
對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很明顯的是，盡管本發(fā)明為了清楚和理解進(jìn)行進(jìn)行了一定程度的詳細(xì)描述，在不偏離本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的發(fā)明概念的基礎(chǔ)上，可以對(duì)這里描述的實(shí)施方案和方法進(jìn)行多種修飾和改變。
這里引用的參考文獻(xiàn)列在后頁(yè)中，這里引入作為作為參考。
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權(quán)利要求
1.下列通式表示的環(huán)狀肽或類(lèi)肽化合物，其為G蛋白-偶聯(lián)受體拮抗劑，且基本上無(wú)激動(dòng)劑活性， 其中A為H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-?；?、NH-苯甲?；?、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基、或O-芳基；B為烷基、芳基、芐基、萘基或吲哚基、或?yàn)長(zhǎng)-苯基丙氨酸或L-苯基甘氨酸的側(cè)鏈；C為甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、或硫代脯氨酸的側(cè)鏈；D為D-亮氨酸、D-高亮氨酸、D-環(huán)己基丙氨酸、D-高環(huán)己基丙氨酸、D-纈氨酸、D-正亮氨酸、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、或D-酪氨酸的側(cè)鏈；E為L(zhǎng)-1-萘基或L-3-苯并噻吩基丙氨酸、或?yàn)檫x自L-苯基丙氨酸、L-色氨酸和L-高色氨酸的氨基酸側(cè)鏈；F為L(zhǎng)-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸、或L-刀豆氨酸的側(cè)鏈、或其生物電子等排體；X為-(CH2)nNH-或(CH2)n-S-，其中n為1～4的整數(shù)；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或CH2CHCOCHRNH-，且其中R為任何常見(jiàn)或不常見(jiàn)氨基酸的側(cè)鏈，條件是化合物不是AcF-[OPdChaWR](化合物1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中n為2或3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其中A為乙酰胺基、氨基甲基，或取代的或未取代的磺酰胺基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中取代酰胺上的所述取代基為1～6碳原子的烷基鏈，或苯基或甲苯甲?；?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求的4化合物，其中烷基鏈為1～4碳原子鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物具有C5a受體、抗利尿激素受體或神經(jīng)激肽受體拮抗劑活性。
7.權(quán)利要求的6的化合物，其中所述化合物具有C5aR拮抗劑活性，并且沒(méi)有C5a激動(dòng)劑活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物具有亞微摩爾濃度的拮抗劑活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求的8化合物，其中所述化合物的受體親和力IC50＜25μM，且拮抗劑活性IC50＜1μM。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，選自化合物2～6、10～15、17、19、20、22、25、26、28、30、31、33～37、39～45、47～50、52～58和60～70。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中所述化合物為化合物33、化合物60或化合物45。
12.一種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)的化合物以及可藥用載體或賦性劑。
13.一種治療G蛋白-偶聯(lián)受體介導(dǎo)的病理疾病的方法，包括向需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)的化合物的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的G蛋白-偶聯(lián)受體介導(dǎo)的疾病為C5a受體介導(dǎo)的疾病。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病涉及C5a的過(guò)表達(dá)或表達(dá)下調(diào)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述疾病選自類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、齒齦炎、纖維癥、動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化癥、阿耳茨海默氏病、哮喘、癡呆、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肺損傷、體外透析后綜合征以及皮膚炎性疾病例如牛皮癬、濕疹和接觸性皮炎。
17.一種治療再灌注損傷的方法，包括對(duì)需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)的化合物或化合物1的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中化合物為這里描述的化合物33、化合物60和化合物45。
19.一種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1～18中任一項(xiàng)的化合物以及可藥用載體或賦形劑。
20.一種治療治療G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)病理疾病的方法，包括向需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求1～18中任一項(xiàng)的化合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的疾病為C5a受體介導(dǎo)的疾病。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病涉及C5a的過(guò)表達(dá)或表達(dá)下調(diào)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述疾病選自類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、齒齦炎、纖維癥、動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化癥、阿耳茨海默氏病、哮喘、癡呆、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肺損傷、體外透析后綜合征以及皮膚炎性疾病例如牛皮癬、濕疹和接觸性皮炎。
24.一種治療再灌注損傷的方法，包括對(duì)需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)的化合物或化合物1的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有調(diào)節(jié)G蛋白－偶聯(lián)受體活性能力的新型環(huán)狀化合物。所述化合物優(yōu)選地作為拮抗劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了環(huán)狀的肽和類(lèi)肽C5a受體拮抗劑，其具有拮抗分葉核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞C5a受體上的活性。本發(fā)明的化合物有效且具有選擇性，可用于治療多種炎性疾病。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1847261SQ20061000679
公開(kāi)日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月17日
發(fā)明者史蒂夫·泰勒, 伊恩·A·希爾斯, 戴維·費(fèi)爾利 申請(qǐng)人:昆士蘭大學(xué)