專(zhuān)利名稱(chēng)：基于復(fù)制型痘苗病毒載體的艾滋病疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及基于復(fù)制型痘苗病毒載體的抗人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的疫苗及其制備方法和用途。本發(fā)明的艾滋病疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的抗HIV的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)簡(jiǎn)稱(chēng)艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV)感染引起的一種傳染性疾病。自從1981年發(fā)現(xiàn)第一例病例以來(lái)，艾滋病一直以驚人的速度在全球蔓延，成為世界上危害人類(lèi)生命和健康最嚴(yán)重的病毒性疾病之一。艾滋病的流行給世界的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了巨大影響。在一些發(fā)展中國(guó)家，HIV感染已造成了人均壽命縮短、勞動(dòng)力減少、食品短缺，使經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展倒退了20年。HIV在中國(guó)的流行經(jīng)歷了傳入期(1 985-1988)、播散期(1989-1994)和增長(zhǎng)期(1995年至今)三個(gè)階段。近年來(lái)，中國(guó)HIV流行形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。截止2003年底，估計(jì)中國(guó)HIV感染者已達(dá)84萬(wàn)，全人群感染率為0.07％，累計(jì)死于艾滋病的人數(shù)已達(dá)到16萬(wàn)。目前中國(guó)艾滋病的流行趨勢(shì)處于世界第14位，在亞洲排名第2位，而且，HIV感染者數(shù)目以每年40％的速度在遞增。
近年來(lái)抗HIV病毒藥物的研制和應(yīng)用取得了很大進(jìn)展，部分感染者得到了較好的治療。然而，耐藥株的出現(xiàn)使這些藥物不是對(duì)每個(gè)病人都有效，復(fù)雜的服藥過(guò)程使部分病人不能堅(jiān)持按時(shí)服藥而導(dǎo)致治療失敗，昂貴的費(fèi)用也使治療難以大規(guī)模推廣。歷史經(jīng)驗(yàn)證明，控制疾病流行最經(jīng)濟(jì)有效的方法就是應(yīng)用疫苗，成功的實(shí)例如天花、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、肝炎等，因此，研制安全有效的艾滋病疫苗一直是科學(xué)工作者們奮斗的目標(biāo)。
各國(guó)科學(xué)家一致認(rèn)為有效的艾滋病疫苗必須能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HIV特異性的CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(CTL)和中和抗體反應(yīng)。目前各單一疫苗難以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，需要采用不同類(lèi)型疫苗聯(lián)合免疫的策略才能提高艾滋病疫苗的免疫效果?？晒┻x擇的候選疫苗包括下列幾種傳統(tǒng)疫苗(滅活疫苗和減毒活疫苗)、合成肽和蛋白亞單位疫苗、DNA疫苗以及活載體疫苗。
與其它類(lèi)型疫苗相比，活載體疫苗的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在(1)能主動(dòng)感染靶組織或細(xì)胞，提高了外源基因進(jìn)入細(xì)胞的效率；(2)載體自身有佐劑效應(yīng)，能誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生；(3)多數(shù)能誘導(dǎo)長(zhǎng)期的免疫應(yīng)答。
其中以痘苗病毒為載體的活載體疫苗研究進(jìn)行得最為深入和廣泛，但目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的多為非復(fù)制型載體，如MVA、NYVAC和ALVAC。但臨床試驗(yàn)顯示非復(fù)制型載體免疫原性相對(duì)較弱，而且同一種疫苗在人體中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)明顯弱于猴體內(nèi)的免疫應(yīng)答。這可能與其非復(fù)制的特性有關(guān)。非復(fù)制型載體疫苗感染宿主細(xì)胞后，只能進(jìn)行一個(gè)周期的抗原表達(dá)、加工和呈遞過(guò)程，無(wú)法產(chǎn)生有感染性的病毒并開(kāi)始新一輪的感染，因而它對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激是有限的和短暫的。有鑒于此，國(guó)際上活載體疫苗的研究重點(diǎn)已從非復(fù)制型轉(zhuǎn)向復(fù)制型，以充分發(fā)揮活載體能夠復(fù)制的特點(diǎn)，更好地刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了針對(duì)HIV感染的新的疫苗和免疫接種方法，其中采用復(fù)制型痘苗病毒為載體構(gòu)建了表達(dá)HIV抗原的活載體艾滋病疫苗。
本發(fā)明提供了一種表達(dá)HIV抗原的活載體艾滋病疫苗，其包含復(fù)制型痘苗病毒作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的胸苷激酶(TK)區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸。
在本發(fā)明的艾滋病疫苗中，所述復(fù)制型痘苗病毒例如是痘苗病毒天壇株。優(yōu)選地，所述重組的復(fù)制型痘苗病毒，不含有選擇標(biāo)記基因。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的艾滋病疫苗中，所述至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸來(lái)源于中國(guó)HIV主要流行毒株97CN54。
可用于構(gòu)建本發(fā)明的疫苗的HIV抗原例如為gag-pol和/或gp140TM。因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種復(fù)制型的艾滋病活載體疫苗，所述疫苗通過(guò)將中國(guó)HIV主要流行毒株97CN54的gag-pol和gp140TM基因整合入痘苗病毒天壇株的TK區(qū)構(gòu)建而成。
優(yōu)選地，可以對(duì)疫苗中的編碼HIV抗原的多核苷酸進(jìn)行修飾，例如同義突變和/或部分刪除的修飾。本發(fā)明的艾滋病疫苗還可包含藥用可接受的佐劑和/或載體。
本發(fā)明還提供了一種艾滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個(gè)成份和指示免疫程序的說(shuō)明書(shū)，其中一個(gè)成份為本發(fā)明的上述艾滋病疫苗。


圖1顯示轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVTT1.0的構(gòu)建路線。
圖2顯示載體pVTT1.0經(jīng)KpnI、NdeI和EcoRV酶切分析結(jié)果。泳道M顯示為DNA分子量MarkerDL15000的；泳道1、pVTT1.0/KpnI 2、pVTT1.0/NdeI 3、pVTT1.0/EcoRV。
圖3顯示質(zhì)粒pVTT-gagpol的酶切電泳圖。質(zhì)粒pVTT-gagpol分別用PstI、XbaI、NcoI酶切進(jìn)行鑒定，泳道1.λDNA/HindIII+EcoRI marker；2.pVTT-gagpol/PstI；3.pVTT-gagpol/XbaI；4.pVTT-gagpol/NcoI；5.λDNA/HindIII marker；6.DL15000marker。
圖4顯示質(zhì)粒pVTT-mgp140TM的酶切電泳圖。質(zhì)粒pVTT-mgp140TM分別進(jìn)行NdeI，SalI酶切分析，冰道1.marker DL2000；2.pVTT-mgp140TM質(zhì)粒；3.pVTT-mgp140TM/NdeI；4.pVTT-mgp140TM/SalI。
圖5顯示質(zhì)粒pVTT-gagpolenv的構(gòu)建流程。pVTT-gagpol經(jīng)PmeI和PacI雙酶切之后，補(bǔ)平并回收3.0kb的pE/L-gagpol片段；質(zhì)粒pVTT-mgp140TM用PmeI單酶切后，與片段pE/L-gagpolΔ連接。
圖6顯示質(zhì)粒pVTT-gagpolenv的酶切電泳圖。質(zhì)粒pVTT-gagpolenv經(jīng)HindIII、PstI酶切鑒定分析，泳道1.pVTT-gagpolenv/HindIII；2.pVTT-gagpolenv/pstI；3.Marker DL2000；4.Marker DL15000。
圖7顯示重組病毒篩選原理。
圖8顯示抗體染色法篩選重組病毒，A痘苗病毒天壇株形成的噬斑(陰性對(duì)照)；BHIV抗原表達(dá)陽(yáng)性的噬斑。
圖9顯示VTKgagpolenv的PCR鑒定結(jié)果，泳道1.VTKgagpolenv/gagpol；2.天壇株/gagpol；3.VTKgagpolenv/gp140TM；4.天壇株/gp140TM；5.Marker DL2000。
圖10顯示VTKgagpolenv的WB鑒定結(jié)果，泳道1.BENCHMARKTMPrestained protein Ladder；2-3.VTKgagpolenv感染的細(xì)胞。
圖11顯示Dot Blotting檢測(cè)篩選標(biāo)記丟失的結(jié)果。1.VTKgagpolenv；2.陰性對(duì)照痘苗病毒天壇株；3.陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pVI-gagpol。
圖12顯示重組病毒VTKgagpolenv免疫家兔后誘導(dǎo)的HIV特異性免疫應(yīng)答。
圖13顯示DNA疫苗初始免疫-VTKgagpolenv加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生針對(duì)Env蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
圖14顯示DNA疫苗初始免疫-VTKgagpolenv加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生針對(duì)Gag蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
圖15顯示DNA疫苗初始免疫-VTKgagpolenv加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生針對(duì)HIV的特異性體液免疫應(yīng)答。
保蔵轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT 1.0，于2005年9月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCC No.1458。
質(zhì)粒pSC65，于2004年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)是CGMCC No.1097。
大腸埃希氏菌PT-gp140TM/DH5α，于2005年8月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCCNo.1439。
大腸埃希氏菌PT-gagpol/DH5α，于2005年8月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCCNo.1438。
具體實(shí)施方案本發(fā)明的針對(duì)艾滋病疫苗是基于復(fù)制型痘苗病毒載體而構(gòu)建的，其不同于目前常規(guī)使用的非復(fù)制型痘苗病毒載體，如MVA、NYVAC和ALVAC。在本發(fā)明的疫苗中，所述復(fù)制型痘苗病毒的TK區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸，經(jīng)施用后能夠引發(fā)個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)HIV的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
術(shù)語(yǔ)“復(fù)制型”是指可以在人體內(nèi)復(fù)制的痘苗病毒載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述復(fù)制型痘苗病毒載體是痘苗病毒天壇株(vaccine virus TianTan strain，VTT)。痘苗病毒天壇株由中國(guó)科學(xué)家自上世紀(jì)二十年代分離后，曾作為天花疫苗在中國(guó)廣泛接種，并最終在中國(guó)消滅了天花。天壇株的接種人數(shù)達(dá)十多億，其安全性在實(shí)踐中得到了長(zhǎng)期和充分驗(yàn)證。天壇株疫苗的副反應(yīng)發(fā)生率明顯低于國(guó)際上使用的其它天花疫苗毒株，包括美國(guó)近年在生物反恐中使用的紐約株。天壇株載體具有安全性高，免疫原性好，可在體內(nèi)誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，而且免疫反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間也遠(yuǎn)長(zhǎng)于非復(fù)制型載體。
可以選擇合適的HIV抗原基因用于構(gòu)建本發(fā)明的疫苗，例如，可以根據(jù)具體的流行病學(xué)研究結(jié)果，選擇作為當(dāng)?shù)氐闹饕餍兄甑腍IV的抗原基因。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)中國(guó)分子流行病學(xué)研究結(jié)果，選擇中國(guó)自行分離和克隆的，占中國(guó)流行毒株38.4％的B’/C重組株97CN54(CRF07)作為設(shè)計(jì)艾滋病疫苗的病原模型。在本發(fā)明的疫苗中，在復(fù)制型痘苗病毒的TK區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸，優(yōu)選地，所插入的多核苷酸是編碼HIV-1抗原env、gag和pol的多核苷酸。Gag蛋白是十分保守的衣殼蛋白，在自然感染者中有針對(duì)Gag的CTL應(yīng)答和T輔助細(xì)胞增殖反應(yīng)(Van Baalen CA，et al.Fine-specificityof cytotoxic T lymphocytes which recognize conserved epitopes of the Gagpritein of human immunodeficiency virus type-1.J Gen Virol 1996；771659-1665、Betts MR，et al.Cross-clade human immunodeficiency virus(HIV)-specific cytotoxic T-lymphcyte responses in HIV-infected Zambians.JVirol 1997；718908-8911和Duradi D，et al.Cross-reactions between thecytotoxic T lymphocyte responses of human immunodeficiency virus-infectedAfrican and European patients.J Virol 1998；723547-3553)。Env蛋白是HIV的外膜蛋白，也是中和抗體識(shí)別的主要靶點(diǎn)，是HIV疫苗中不可缺少的組分。Pol蛋白雖然表達(dá)量比較低，但它富含CTL表位和T輔助細(xì)胞表位，因此其作為免疫原的潛力正日益被人們所認(rèn)識(shí)(Walker BD et al.HIV-1 reverse transcriptase is a target for cytotoxic T lymphocytes in infectedindividuals.Science 1988 Apr 1；240(4848)64-6)。為了提高疫苗的安全性和免疫原性，可以對(duì)所述編碼HIV-1抗原的多核苷酸的序列進(jìn)行了修飾及優(yōu)化。例如，可缺失pol基因中編碼整合酶和RNaseH的序列，以排除外源基因被錯(cuò)誤整合入細(xì)胞基因組的可能。env基因則可選擇gp140TM區(qū)域，包括gp120和蛋白的穿膜區(qū)，能將膜蛋白錨定在細(xì)胞膜上，提高其免疫原性。實(shí)現(xiàn)這些修飾及優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域已知的。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述編碼HIVgagpol的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述編碼gp140TM的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明中，編碼HIV抗原的多核苷酸通過(guò)合適的方法例如同源重組而被插入至痘苗病毒基因組中的胸苷激酶(TK)基因中，以形成攜帶目的基因的重組的復(fù)制型痘苗病毒。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗，即所述重組的復(fù)制型痘苗病毒，不含有選擇標(biāo)記基因。
為此，本發(fā)明提供了一種痘苗病毒的通用轉(zhuǎn)移載體，以便將目的基因重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)中。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體是含有neo基因和lacZ基因雙重篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)。該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體含有以下元件①三個(gè)篩選標(biāo)記Amp抗性基因、lacZ基因和neo基因。由p7.5啟動(dòng)子啟動(dòng)的lacZ基因用于重組痘苗病毒的藍(lán)白斑篩選，由PE6啟動(dòng)子啟動(dòng)的neo基因用于既帶有篩選標(biāo)記又帶有目的基因的重組痘苗病毒的純化(在G418的作用下痘苗病毒野毒株的增殖將被抑制)，為了使neo基因能夠更好的發(fā)揮作用，neo基因的尾部帶有200bp的poly(A)序列。②同源臂tkL和tkR序列tkL和tkR是痘苗病毒胸腺苷激酶(TK)的部分片段，是痘苗病毒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒發(fā)生分子間同源重組的同源序列。③lacZ’序列200bp的lacZ’序列與lacZ基因尾部的200bp的序列完全同源，使帶有篩選標(biāo)記和目的基因的重組痘苗病毒發(fā)生分子內(nèi)同源重組，從而丟掉篩選標(biāo)記。④痘苗病毒的早晚期啟動(dòng)子pE/L。⑤多克隆位點(diǎn)，位于啟動(dòng)子pE/L的下游。
采用本發(fā)明的通用轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0，可將目的基因重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)中，并使得痘苗病毒基因組中不含有選擇標(biāo)記基因。因此，本發(fā)明還提供了用于構(gòu)建基于復(fù)制型痘苗病毒的針對(duì)SARS-CoV的疫苗的方法，所述方法包括使用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)將編碼HIV抗原gagpol和gp140TM的多核苷酸置于pVTT 1.0的啟動(dòng)子pE/L下，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVTT-gagpolenv；pVTT-gagpolenv在雞胚細(xì)胞內(nèi)與痘苗病毒天壇株發(fā)生同源重組，使HIV主要抗原基因與含neo基因和lacZ基因的雙重篩選標(biāo)記一同重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)中。在抗生素G418選擇壓力下，用加有X-gal和中性紅的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪斑，挑取既含有目的基因又含篩選標(biāo)記的藍(lán)色重組痘苗病毒，共經(jīng)過(guò)三輪單斑純化；然后在無(wú)G418壓力選擇下，藍(lán)色重組痘苗病毒自身會(huì)因?yàn)檗D(zhuǎn)移質(zhì)粒中一小段約200bp的lacZ’片段與完整的lacZ基因發(fā)生分子內(nèi)的同源重組，從而丟失neo基因和lacZ基因而得到只含有HIV gagpol和gp140TM的編碼序列的重組痘苗病毒天壇株(圖7)。
本發(fā)明的疫苗可進(jìn)一步包含藥用可接受的合適的佐劑、載體和/或賦形劑，合適的佐劑、載體和賦形劑是本領(lǐng)域已知的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在構(gòu)建天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗基礎(chǔ)上，先用HIV DNA疫苗(劉穎等，表達(dá)HIV多價(jià)抗原的重組痘苗病毒的構(gòu)建及免疫效果的研究.病毒學(xué)報(bào)2003，Vol19(3)205-209)初始免疫，再用本發(fā)明的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫的免疫方案(即Prime-boost策略)，能夠成功誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)及高滴度中和抗體。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例實(shí)施例1痘苗病毒通用轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0的構(gòu)建1.重組質(zhì)粒pSC-neo的構(gòu)建質(zhì)粒pIRESneo(購(gòu)自Clontech公司)先用XhoI酶切，再用SmaI酶切(反應(yīng)溫度為25℃)，Klenow酶補(bǔ)平，回收1.2kb的目的片段neo-polyA；過(guò)渡載體質(zhì)粒pSC65(保藏號(hào)CGMCC No.1097)用BglII酶切，Klenow酶補(bǔ)平，去磷酸化酶(CIAP)處理，回收載體；二者16℃連接4h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。挑取多個(gè)單菌落，小量提取質(zhì)粒，用XbaI和PstI鑒定，正確重組克隆命名為pSC-neo。
2.人工合成痘苗病毒載體早期啟動(dòng)子PE6和lacZ融合片段。
采用重疊PCR(Overlaping PCR)的方法合成基因。首先把序列PE6和lacZ融合多核苷酸片段的正鏈和負(fù)鏈分別列出，然后根據(jù)基因長(zhǎng)度把正鏈和負(fù)鏈序列分割成長(zhǎng)度為50bp的寡核苷酸(兩條鏈最5’端的一條長(zhǎng)度為25bp左右)，除兩端的序列外，每條正鏈和負(fù)鏈序列都與兩條互補(bǔ)鏈的寡核苷酸有25bp左右的互補(bǔ)。每10條左右的寡核苷酸都與同樣數(shù)目的互補(bǔ)寡核苷酸混合成一個(gè)退火體系，在PCR管中先升溫再慢慢退火。以退火產(chǎn)物為模板，以配對(duì)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到500bp左右的基因片段。多個(gè)重疊的片段先混合，然后升溫、退火，以退火體系為模板，以?xún)啥艘镞M(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到更長(zhǎng)的基因片段。合成的痘苗載體早期啟動(dòng)子PE6和lacZ融合片段連接到T-easy通用測(cè)序載體，得到質(zhì)粒pT-lacZ’-PE6，測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計(jì)(SEQ ID NO7)。
3.獲得痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0。
質(zhì)粒pT-lacZ’-PE6經(jīng)SmaI+HindIII消化，回收0.4kb的lacZ’-PE6片段；連接到質(zhì)粒pSC-neo，得到痘病毒轉(zhuǎn)移載體pVTT 1.0(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1)。
經(jīng)KpnI、NdeI和EcoRV鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT-gagpolenv的構(gòu)建質(zhì)粒pVTT-gagpolenv的構(gòu)建分三步進(jìn)行(1)質(zhì)粒pVTT-gagpol的構(gòu)建質(zhì)粒pT-gagpol(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏號(hào)CGMCC No.1438)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心構(gòu)建，含有g(shù)agpolΔ基因，該質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XmnI消化，Klenow酶補(bǔ)平，回收2.9kb目的片段；載體pVTT 1.0經(jīng)SmaI酶切，CIAP去磷酸化，回收線性化載體。載體和片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，正確克隆命名為pVTT-gagpol。分別用PstI、XbaI、NcoI酶切質(zhì)粒pVTT-gagpol進(jìn)行鑒定，酶切電泳圖如圖3所示。
(2)質(zhì)粒pVTT-gp140TM構(gòu)建質(zhì)粒pT-gp140TM(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏號(hào)CGMCC No.1439)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心構(gòu)建，含有g(shù)p140TM基因。該質(zhì)粒經(jīng)SacI和SacII雙酶切后，Klenow酶削平，回收約2.2kb的gp140TM片段。載體pVTT 1.0用SmaI酶切后，用CIAP去磷酸化，回收線性化載體pVTT 1.0。線性化載體pVTT1.0與片段gp140TM連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行NdeI，SalI酶切分析，如圖3所示。鑒定陽(yáng)性克隆命名為pVTT-gp140TM。
(3)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT-gagpolenv的構(gòu)建質(zhì)粒pVTT-gagpolenv的構(gòu)建流程如圖5所示。pVTT-gagpol經(jīng)PmeI和PacI雙酶切之后，補(bǔ)平并回收3.0kb的pE/L-gagpol片段；質(zhì)粒pVI75-mgp140TM用PmeI單酶切后，與片段pE/L-gagpolΔ連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒命名為pVTT-gagpolenv。質(zhì)粒經(jīng)HindIII、PstI酶切鑒定，如圖6所示。
實(shí)施例3重組病毒的篩選轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTT-gagpolenv的tkL和tkR區(qū)與痘苗病毒天壇株發(fā)生同源重組，使目的基因gagpolΔ和gp140TM與標(biāo)記基因neo和lacZ一同重組到痘苗病毒基因組的TK序列中。在G418存在的條件下，由于選擇壓力分子內(nèi)未發(fā)生同源重組，標(biāo)記基因neo和lacZ暫時(shí)保留在基因組中，用加有X-gal和中性紅的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪斑，可以挑取既含目的基因又含篩選標(biāo)記的藍(lán)色重組痘苗病毒(未發(fā)生重組的病毒因G418的存在而被抑制生長(zhǎng))。接著在無(wú)G418的條件下篩選，藍(lán)色重組痘苗病毒自身會(huì)因?yàn)檗D(zhuǎn)移質(zhì)粒帶入的一小段約200bp的lacZ’片段與完整的lacZ基因發(fā)生分子內(nèi)的二次同源重組，從而丟失neo基因和lacZ基因而得到了只含目的基因的重組痘苗病毒，用加有X-gal和中性紅的低熔點(diǎn)瓊脂糖鋪斑，就能挑取只含目的基因的白色重組病毒。原理如圖7所示。
(1)轉(zhuǎn)染痘苗病毒天壇株感染80-90％成片的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)MOI＝0.01～0.1，37℃吸附1小時(shí)后，棄去培養(yǎng)上清，并用無(wú)血清Eagle’s培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次。用重組質(zhì)粒pVTT-gagpolenv轉(zhuǎn)染病毒感染的CEF細(xì)胞，方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)(Invitrogen，Lipofectin Reagent Cat.18292-011)。37℃ CO2孵箱培養(yǎng)48h，凍融三次后收獲轉(zhuǎn)染的病毒液。
(2)病毒篩選成片的CEF細(xì)胞先用含0.4mg/ml G418的Eagle’s培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24h，收獲的轉(zhuǎn)染病毒液300μl接種到預(yù)處理的CEF細(xì)胞(Eagle’s培養(yǎng)基仍含有0.4mg/mL G418)，37℃培養(yǎng)48h后鋪斑(Eagle’s含10mg/mL X-gal和1％中性紅，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖)。出現(xiàn)2個(gè)藍(lán)色噬斑，分別挑取藍(lán)色噬斑至1mlEagle’s維持液中。反復(fù)凍融3次，再取100μl接種到G418預(yù)處理的CEF細(xì)胞上。重復(fù)上述過(guò)程，單斑連續(xù)純化2代，得到第三代藍(lán)斑共12株。此時(shí)挑取的病毒含有HIV目的基因、標(biāo)記基因lacZ和neo。
將12株第三代藍(lán)斑病毒凍融三次后，分別取100μl感染未經(jīng)G418處理的CEF細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48h，鋪斑。其中有2株病毒未出現(xiàn)白色噬斑，其余10株病毒同時(shí)出現(xiàn)藍(lán)色噬斑和白色噬斑。共挑取白色噬斑27個(gè)。27株白斑凍融3次后，分別取100μl接種CEF細(xì)胞(24孔板)，48h后免疫組化檢測(cè)抗原表達(dá)，方法如下
a)培養(yǎng)48小時(shí)后傾去培養(yǎng)上清；b)甲醇∶丙酮(1∶1)溶液固定細(xì)胞2min；c)PBS漂洗兩次；d)用含3％胎牛血清的PBS稀釋P24抗血清(兔源)；e)稀釋度是1∶1000。每孔加入0.5ml；f)搖擺平臺(tái)上室溫孵育1h；g)PBS漂洗兩次；h)每次2min。加入含3％胎牛血清PBS稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5000)；i)搖擺平臺(tái)上室溫孵育30-45min；j)PBS漂洗兩次；k)每次2min。加入顯色底物DAB；1)室溫孵育5-10min。噬斑顯色后終止反應(yīng)。
經(jīng)過(guò)篩選共有4株白色噬斑病毒抗原表達(dá)呈陽(yáng)性(如圖8所示)，這4株病毒再次分別接種CEF細(xì)胞，經(jīng)過(guò)三輪單斑純化，每輪挑取的白斑都經(jīng)過(guò)抗體染色篩選，最終獲得重組病毒VTKgagpolenv。
實(shí)施例4重組病毒VTKgagpolenv的鑒定提取重組病毒VTKgagpolenv和天壇株的基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的基因gagpolΔ和mgp140TM。引物序列如下Gagpol-for5’-GCG GAG GCT AGA AGG AGA GAG ATG G-3’(SEQ ID NO3)；Gagpol-rev5’-CTA CTA GCC TTC CAT GGC TAT TTT CTG CAC-3’(SEQ ID NO4)；Gp140-for5’-AGC GGA TCC ACC ATG AGA GTG ACG GGG ATC-3’(SEQ ID NO5)；Gp140-rev5’-GTC GGA TCC GAC TAA GGT CAG TAT CCT G-3’(SEQ ID NO6)。
結(jié)果顯示VTKgagpolenv特異性擴(kuò)增出2.9kb和2.1kb的片段，證實(shí)重組病毒VTKgagpolenv含有目的基因gagpolΔ和mgp140TM，如圖9所示。
Western Blotting檢測(cè)VTKgagpolenv HIV基因的表達(dá)，VTKgagpolenv以0.1～0.01pfu/細(xì)胞的劑量感染CEF細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞，加入1ml的蛋白提取緩沖液(1％SDS，1mmol/L PMSF，20mmol/L Tris-ClpH7.0，1％β-巰基乙醇)，立即混勻，反復(fù)凍融三次。PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，5％的脫脂奶室溫封閉2h。5％的脫脂奶稀釋一抗(來(lái)自NIH AIDS Research&Reference Reagent Programm，HIV-1 SF2 GP160抗血清(羊源)，1∶1000稀釋?zhuān)籋IV-1 Gag P24抗血清(兔源)，1∶2000稀釋)。室溫孵育2h。PBS洗膜3次，每次10min。加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，5％的脫脂奶按1∶5000稀釋?zhuān)覝胤跤?h。PBS洗膜3次，每次1 0min。DAB顯色后，結(jié)果如圖10所示，VTKgagpolenv表達(dá)的Gag蛋白分子量為55KDa，此外還有一條約41KDa的條帶，此為Gag蛋白加工不完全的產(chǎn)物。VTKgagpolenv表達(dá)的gp140TM蛋白的大小則在140～80 KDa范圍之間，這顯示了gp140TM蛋白從未糖基化到完全糖基化不同階段的不同分子量。
提取重組病毒VTKgagpolenv和天壇株的DNA，紫外交聯(lián)將DNA固定到硝酸纖維素膜上，以地高辛探針標(biāo)記試劑盒(DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit Cat.1745832，Roche)標(biāo)記neo和LacZ基因探針，進(jìn)行Dot blot檢測(cè)，詳細(xì)方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。結(jié)果顯示，除陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)外，VTKgagpolenv和752-1反應(yīng)均為陰性，說(shuō)明重組痘苗病毒已經(jīng)丟失了標(biāo)記基因neo和LacZ，結(jié)果如圖11。
各項(xiàng)鑒定結(jié)果表明VTKgagpolenv能夠正確表達(dá)HIV目的蛋白，并且標(biāo)記基因已被完全刪除。因此VTKgagpolenv被確定為重組天壇痘苗病毒艾滋病疫苗。
實(shí)施例5重組天壇痘苗病毒艾滋病疫苗在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)HIV特異性免疫的效力(1)家兔實(shí)驗(yàn)
3只家兔分別在0，10周背部皮膚劃痕接種VTKgagpolenv，免疫劑量分別1.6×104pfu，1.6×105pfu，1.6×106pfu；1只家兔在0，10周肌肉注射VTKgagpolenv(1.6×106pfu)。接種后每2周經(jīng)耳緣靜脈采血檢測(cè)HIV抗體。結(jié)果如圖12所示，劃痕接種1.6×106pfu的家兔在4周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)HIV特異性抗體，加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著升高；接種1.6×104pfu，1.6×105pfu的家兔誘導(dǎo)抗體水平低，持續(xù)時(shí)間短。肌肉免疫的家兔6周后開(kāi)始產(chǎn)生抗體，加強(qiáng)免疫后抗體水平也顯著提高。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)VTKgagpolenv在家兔能誘導(dǎo)HIV特異性抗體，且加強(qiáng)免疫能提高免疫效果。
(2)小鼠實(shí)驗(yàn)本例中使用6-8周齡BALB/c(H-2d)雌性小鼠(體重19-25克，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)檢測(cè)本發(fā)明疫苗的效力。小鼠皮內(nèi)多點(diǎn)注射50μl的VTKgagpolenv(1.6x107pfu/ml)，對(duì)照組注射相同劑量痘苗病毒天壇株。6周后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的分泌。取小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106，96孔板每孔加入細(xì)胞100μl。刺激肽(p24肽，env2肽庫(kù)和Pol肽)終濃度5μg/ml，刺激1h后，加入BFA(終濃度10μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)18h。以CD8/PE，CD3/PE-cy5，IFN-γ/FITC染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)分泌IFN-γ的CD8細(xì)胞占總CD8細(xì)胞的比率。VTKgagpolenv皮內(nèi)免疫小鼠后，誘導(dǎo)的HIV特異性的IFN-r分泌細(xì)胞占CD8細(xì)胞總數(shù)的0.659％，與對(duì)照組有顯著性差異，表明VTKgagpolenv能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HIV特異性細(xì)胞免疫。
將VTKgagpolenv(1.6x107pfu/ml)倍比連續(xù)稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度。小鼠雙側(cè)脛骨前肌注射，每組20只，第6周時(shí)檢測(cè)HIV特異性抗體。使用本室純化的Gag蛋白包被ELISA板，包被濃度為0.1μg/ml，一抗是免疫小鼠血清，1∶50稀釋?zhuān)欢故抢备^(guò)氧酶標(biāo)記的羊抗小鼠。采用Bliss方法計(jì)算ED50值。疫苗的ED50是8.5×105pfu。表明VTKgagpolenv能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HIV特異性細(xì)胞免疫。
(3)猴體實(shí)驗(yàn)本例中使用的恒河猴(體重約3Kg，猴齡約3歲)來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長(zhǎng)類(lèi)中心。試驗(yàn)組4只猴子(5#--8#)，對(duì)照組2只(11#，12#)。免疫程序采用初始-加強(qiáng)免疫的方式，即在0周，4周，10周進(jìn)行3次DNA疫苗免疫，每次三角肌注射pGP140和pGPNEF等比例(各1mg/0.5ml)混合的DNA疫苗2mg。第18周皮膚劃痕接種重組痘苗病毒VTKgagpolenv 5×105pfu。對(duì)照組接種時(shí)間和途徑與試驗(yàn)組相同，區(qū)別在于用同樣劑量的痘苗病毒天壇株和DNA疫苗空載體。
用ELISPOT法檢測(cè)HIV抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，試驗(yàn)所用的肽由NIH艾滋病研究和參比試劑項(xiàng)目(NIH AIDS Research&ReferenceReagent Program)免費(fèi)提供。Env區(qū)87條肽(Cat#4830 to 4913)被分成兩個(gè)肽庫(kù)(env-14830-4871；env-24872-4913)，Gag區(qū)121條肽(Cat#EVA7080.1-7080.121)被分成3個(gè)庫(kù)(gag-17080.1-7080.40；gag-2；7080.41-7080.80；gag-37080.8 1-7080.121)。用商品化的HIV抗體檢測(cè)試劑盒(biomerieux公司)測(cè)定HIV特異的抗體反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組痘苗病毒能在恒河猴體內(nèi)誘導(dǎo)HIV特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫，特別是在DNA疫苗初始免疫之后，重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫能顯著提高免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖13，14，15。
以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其無(wú)意于對(duì)本發(fā)明的范圍做出任何限制。顯然，在不脫離本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)的情況下，本領(lǐng)域人員可以對(duì)本發(fā)明作出多種改動(dòng)和變化，因此，這些改動(dòng)和變化同樣在本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心<120>基于復(fù)制型痘苗病毒載體的艾滋病疫苗<130>I200501572CB<160>7<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2145<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus<400>1atgagagtga cggggatcag gaagaattat cggcatttat ggagatgggg caccatgctc 60cttgggatgt tgatgatcag tagtgctgta ggaaacttgt gggtcacagt ctattatggg 120gtacctgtat ggaaagaggc aaccaccact ttattttgtg catcagatgc taaagcatat 180gatacagagg tacataatgt ttgggctaca catgcctgtg tacccgcaga ccccaaccca 240caagaaatgg ttttggaaaa tgtaacagaa aattttaaca tgtggaaaag tgaaatggta 300aatcagatgc aggaagatgt aatcagttta tgggatcaaa gcctaaaacc atgtgcaaag 360ttgaccccac tctgtgtcac tttagaatgt agaaatgtta gcagtaatag taatgatacc 420taccatgaga cctaccatga gagcatgagg gaaatgaaaa attgcccttt caatgcaacc 480acagtagtaa gagataggaa gcagacagtg tatgcacttt tctatagact tgatatagta 540ccacttacta agaagaacta tagtgagaat tctagtgagt attatagatt aataaattgt 600aatacctcag ccataacaca agcctgtcca aaggtcactt ttgatccaat tcctatacac 660tattgcactc cagctggtta tgcaattcta aagtgtaatg ataagatatt caatgggaca 720ggaccatgcc ataatgttag cacagtacaa tgtacacatg ggattaagcc agtggtatca 780
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<223>Gagpol-for<400>3gcggaggcta gaaggagaga gatgg25<210>4<211>30<212>DNA<213>Artlficial<220>
<223>Gagpol-rev<400>4ctactagcct tccatggcta ttttctgcac 30
<210>5<211>30<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Gp140-for<400>5agcggatcca ccatgagagt gacggggatc 30<210>6<211>28<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Gp140-rev<400>6gtcggatccg actaaggtca gtatcctg 28<210>7<211>429<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>LacZ′-PE6<400>7gccccgggct cgagttatga tctacttcct taccgtgcaa taaattagaa tatattttct 60acttttacga gaaattaatt attgtattta ttatttatgg gtgaaaaact tactataaaa 120agcgggtggg tttggaatga tgtaaagctt aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg 180aatataaata agctcgaagt cgacgcccaa ctggtaatgg tagcgaccgg cgctcagctg 240gaattccgcc gatactgacg ggctccagga gtcgtcgcca ccaatcccca tatggaaacc 300gtcgatattc agccatgtgc cttcttccgc gtgcagcaga tggcgatggc tggtttccat 360cagttgctgt tgactgtagc ggctgatgtt gaactggaag tcgccgcgcc actggtgtgg 420gccatgttt 429
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)HIV抗原的活載體艾滋病疫苗，其包含復(fù)制型痘苗病毒作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的胸苷激酶(TK)區(qū)插入了至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的艾滋病疫苗，其中所述復(fù)制型痘苗病毒是痘苗病毒天壇株。
3.權(quán)利要求1或2的疫苗，其中所述疫苗不含有選擇標(biāo)記基因。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的艾滋病疫苗，其中所述至少一種編碼HIV抗原的多核苷酸來(lái)源于中國(guó)HIV主要流行毒株97CN54。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV抗原選自gag-pol和gp140TM。
6.權(quán)利要求5所述的艾滋病疫苗，其中編碼gp140TM的多核苷酸進(jìn)行了同義突變和部分刪除的修飾，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求5所述的艾滋病疫苗，其中編碼gag-pol的多核苷酸進(jìn)行了部分刪除的修飾，具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求6所述的艾滋病疫苗，其中編碼gag-pol的多核苷酸進(jìn)行了部分刪除的修飾，具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的艾滋病疫苗，其還包含藥用可接受的佐劑和/或載體。
10.一種艾滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個(gè)成份和指示免疫程序的說(shuō)明書(shū)，其中一個(gè)成份為權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的艾滋病疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)抗原的復(fù)制型艾滋病活載體疫苗及其用途，所述疫苗基于復(fù)制型痘苗病毒如痘苗病毒天壇株而構(gòu)建。本發(fā)明的復(fù)制型活載體疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的抗HIV的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了用于構(gòu)建所述艾滋病疫苗的載體。本發(fā)明還涉及使用所述艾滋病疫苗的免疫接種方案。
文檔編號(hào)A61P31/18GK101020052SQ20061000756
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者邵一鳴, 劉穎, 劉建元 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心