專利名稱：人參皂苷f的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是人參皂苷F1(ginsenoside F1)的醫(yī)藥用途。
人參皂苷F1分子式C36H62O9分子量638.87背景技術(shù)人參(Panax ginseng C.A.Mey.)為五加科植物人參的根，分布于黑龍江、吉林、遼寧和河北北部的深山中。作為常用中草藥首載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品。人參性溫、味甘微苦，具有大補(bǔ)元?dú)?、固脫生津、益智安神等功效。用治勞傷虛脫，食少，倦怠，反胃吐食，大便滑泄，虛咳喘促，自汗暴脫，驚悸，健忘，眩暈頭痛，陽萎，尿頻，消渴，婦女崩漏，小兒慢驚，及久虛不復(fù)，一切氣血津液不足之證。
目前公認(rèn)人參皂苷是人參的有效部位，其中的Rg1作為有效成分之一，含量較高，活性強(qiáng)，作用廣。但是，天然人參皂苷被腸道吸收的能力極差，難以入血發(fā)揮藥效作用，從而影響了人參皂苷的新藥開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。
近年研究表明，人和大鼠口服人參皂苷后，在人腸道內(nèi)代謝途徑為Rg1→Rh1→原人參三醇(Ppt)，在大鼠腸道內(nèi)的代謝途徑為Rg1→Rh1/F1(ginsenoside F1)→原人參三醇(Ppt)。其中F1為Rh1的同分異構(gòu)體Kanaoks M，Akao T，Kobashi K.Metabolism of ginseng saponins，ginsenoside，by human intestinal flora.Wakan Iyakugaku Zasshi，1994，11241；HideoH，Jong HS，Satoshi M，et al.Main ginsengsaponin metabol ites formed by intestinalbacteria.Planta Med，1996，62453。說明Rg1經(jīng)腸內(nèi)菌代謝后，兩個中間產(chǎn)物(Rh1及F1)被吸收入血產(chǎn)生藥理作用。
對于人參單體皂苷的藥理作用的研究發(fā)現(xiàn)，盡管人參中主要有效成分是人參皂苷，然而各單體的藥理作用并不完全一致，有些甚至截然相反，因此單體皂苷的生物活性研究非常重要。
近年國內(nèi)外多側(cè)重于天然人參皂苷的研究，而對于人參皂苷F1的藥理活性研究則較少，已有文獻(xiàn)報道的人參皂苷F1藥理活性有以下幾方面抗癌張有為，竇德強(qiáng)，陳英杰，等.人參皂苷對人體骨肉瘤細(xì)胞U2OS增殖的影響.中草藥，2001，32(3)232-236；HasegawaHideo，Sung Jong-Hwan，Matsumiya Satoshi，et al.Reversal of daunomycin andvinblastine resistance in multidrug-resistant P388 Leukemia in vitro throughenhanced cytotoxicity by triterpenoids.Planta Med，61(5)，409-1、抗紫外線引起的細(xì)胞凋亡Lee Enn Hee，Cho Si Young，Kim Su Jong，et al.Ginsenoside F1protects humanHaCaT keratinocytes from ultraviolet-B-induced apoptosis by maintaining constantlevels of Bcl-2.Journal of Investigative Dermatology，121(3)607-613、抗HIVHasegawa Hideo，Matsumiya Satoshi，Satoshi Uchiyama Masamori，et al.Inhibitoryeffect of some triterpenoid saponins on glucose transport in tumor cells and itsapplication to in vitro cytotoxic and antiviral activities.Planta Med，60(3)，240-3、調(diào)節(jié)綿羊紅細(xì)胞葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)Hasegawa Hideo，Matsumiya Satoshi，Murakami Chikgar，et al.Interactions of ginseng extract，ginseng separated fractions，and sometriterpenoid saponins with glucose transporters in sheep erythrocytes.PlantaMed，60(2)，153-7、誘導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間通訊的降低Zhang YW，Dou DQ，Zhang L，etal.Effects of ginsenosides from Panax ginseng on cell-to-cell communication functionmediated by gap junctions.Planta Med.2001 Jul；67(5)417。關(guān)于人參皂苷F1在治療白內(nèi)障方面的活性則未見報道。
白內(nèi)障是最常見的致盲眼病之一。我國目前至少有670萬盲人，其中因白內(nèi)障致盲的占40～70％，且白內(nèi)障致盲人數(shù)每年增加約40萬。據(jù)WHO統(tǒng)計，當(dāng)今世界有1500萬白內(nèi)障致盲患者。白內(nèi)障有先天性、外傷性、并發(fā)性、年齡相關(guān)性等多種類型，其中主要是年齡相關(guān)性白內(nèi)障。45歲以上的人沒有上述的原因而發(fā)生的白內(nèi)障，叫做年齡相關(guān)性白內(nèi)障。在我國，50歲以上的人有不少有不同程度的晶體混濁，60歲以上已為常見，70歲以上多達(dá)90～95％。年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生如同人體衰老一樣，雖經(jīng)幾十年大量的研究，原因仍不十分明確。目前多數(shù)學(xué)者公認(rèn)白內(nèi)障是多種因素綜合作用的結(jié)果，最初和最主要的因素是氧化損傷致使晶體蛋白結(jié)構(gòu)的改變。因此，目前白內(nèi)障的治療尚未發(fā)現(xiàn)在臨床有確切療效的藥物。對白內(nèi)障的治療以手術(shù)為主，但手術(shù)費(fèi)用較高且不易被患者接受。故尋找并開發(fā)可延緩白內(nèi)障形成的藥物則具有重要的臨床意義與價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了人參皂苷F1在制備治療白內(nèi)障的藥物中的應(yīng)用。
《本經(jīng)》“主補(bǔ)五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智?！鼻遗R床報道人參有提高視力及增強(qiáng)視覺暗適應(yīng)的作用，并由人參中有效成分之一20(S)-人參皂苷Rg3開發(fā)的20(S)-人參皂苷Rg3眼膏已批準(zhǔn)臨床研究。從而提示我們對來源于人參的成分人參皂苷F1是否具有治療白內(nèi)障的作用進(jìn)行探索，結(jié)果表明人參皂苷F1能明顯延緩白內(nèi)障的形成，減輕晶狀體混濁程度，降低MDA含量，提高SOD活性，且都不同程度優(yōu)于維生素E。從而為人參皂苷F1治療白內(nèi)障提供藥效學(xué)支持。
人參皂苷F1是一種已知的具有藥物活性的物質(zhì)，因此，可以按常規(guī)制劑方法，將其制備成臨床適用的任何一種藥劑，例如片劑、膠囊劑、顆粒劑等口服固體制劑、口服液體制劑、注射劑、滴眼液、眼膏等眼部用藥制劑等。
在制備上述制劑的過程當(dāng)中，可以將人參皂苷F1與任何一種適用于制備成臨床藥劑的賦型劑混合使用，制備成藥物制劑。
通過本發(fā)明，人參皂苷F1可有效用于治療白內(nèi)障，并且副作用小。
由于人參皂苷F1在制備治療白內(nèi)障的藥物中的應(yīng)用是發(fā)明人的首次發(fā)現(xiàn)，因此，無論是人參皂苷F1單獨(dú)使用為活性成分制成的藥劑，還是利用人參皂苷F1的抗白內(nèi)障活性與其他活性成分配合使用制成的藥劑，均在本專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明通過下列實施方式證明了人參皂苷F1在治療白內(nèi)障方面的用途，但不僅限于這些
具體實施例方式試驗例人參皂苷F1對大鼠D-半乳糖性白內(nèi)障的影響1試驗材料1.1動物Wistar大鼠48只，雌雄各半，鼠齡22天(提前三天斷乳)，體重40～50g。全部動物由海南省人民醫(yī)院動物實驗中心提供。自由飲水進(jìn)食，實驗前在實驗環(huán)境中適應(yīng)2-3d，實驗室溫度控制在(24±1)℃，相對濕度為40％-80％。
1.2藥品、試劑及設(shè)備人參皂苷F1按制備例5方法制備。
維生素E注射液規(guī)格1ml:50mg，石家莊制藥一廠生產(chǎn)。
1％硫酸阿托品眼膏上海通用藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
半乳糖溶液購自上海邁坤化工有限公司。
SOD、MDA測定試劑盒皆為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。
SLM-1裂隙燈顯微鏡購自重慶康華科技有限公司。
TG-328B電光分析天平購自上海天平儀器廠。
2分組與給藥選用1％阿托品散瞳檢查晶狀體透明的健康Wistar大鼠48只。動物隨機(jī)分為6組，每組8只。具體如下(1)正常組。給予生理鹽水；(2)模型組給予無菌生理鹽水；(3)人參皂苷F1低劑量組(2.5mg/kg)；(4)人參皂苷F1中劑量組(5mg/kg)；(5)人參皂苷F1高劑量組(10mg/kg)；(6)維生素E(1.3ml/100g)。
給藥方法于制模當(dāng)天即給予灌胃，每天1次，連續(xù)14天。
3試驗方法3.1造模方法每日給予除正常組大鼠外各組大鼠腹腔緩慢注入80％半乳糖溶液(20mg/kg)，共14天。
3.2觀察指標(biāo)與方法3.2.1裂隙燈顯微鏡檢查1％阿托品散瞳，每日用裂隙燈檢查雙眼晶狀體混濁情況，記錄下其出現(xiàn)I級混濁的時間，末次給藥12小時后記錄各組大鼠晶狀體混濁情況。
裂隙燈下晶狀體檢查分級晶狀體混濁程度按下列標(biāo)準(zhǔn)分級。0期(無混濁)晶狀體透明清亮；I期(輕度混濁)僅赤道部有空泡；II期(明顯混濁)空泡擴(kuò)展到中央；III期(皮質(zhì)混濁)皮質(zhì)呈現(xiàn)不規(guī)則條紋或劍竹狀向前極放射的混濁灶，逐漸形成彌漫性灰色→灰白色混濁，晶狀體核心尚透明；IV期(核混濁)晶狀體除皮質(zhì)混濁外晶狀體核密度增高，色灰或灰白或白色；V期(完全混濁)整個晶狀體呈完全性白內(nèi)障。
3.2.2晶狀體及血清SOD、MDA測定實驗第14天給藥后12小時，裂隙燈顯微鏡檢查后，各組大鼠乙醚麻醉，摘眼球，眼眶取血。摘除之眼球，以冰生理鹽水漂洗后，仔細(xì)從后路剖開眼球，除去眼球壁及玻璃體，剝離懸韌帶，冰盤上小心分離晶狀體。以每只大鼠的晶狀體為一個標(biāo)本，用4℃蒸餾水沖洗后，濾紙吸干，分析天平稱重，按W/V＝1∶9加入生理鹽水中，于冰浴下研磨10min，高速冷凍離心(3000r/min)10～15min后，取其上清液即為10％晶狀體勻漿，同時低溫離心血液取血清，立即送檢測定。
4.結(jié)果4.1人參皂苷F1對大鼠晶狀體混濁發(fā)生時間的影響人參皂苷F1與維生素E皆可延長晶狀體發(fā)生混濁的時間，與模型組比較有顯著性差異，且人參皂苷F1大劑量優(yōu)于維生素E療效，兩者比較有顯著性差異(表1)。
表1各組大鼠晶狀體混濁發(fā)生時間情況(X±s)

注與模型對照組比較 *P＜0.05；與維生素E組比較 #P＜0.05。
表2各組大鼠晶狀體混濁情況

4.2各組大鼠晶狀體及血清SOD活性及MDA的含量變化情況(見表3)表3各組大鼠晶狀體及血清SOD活性及MDA的含量變化情況(X±s)

注與模型對照組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與維生素E組比較 #P＜0.05，##P＜0.01。
5.結(jié)論人參皂苷F1能明顯延緩白內(nèi)障的形成，減輕晶狀體混濁程度，降低MDA含量，提高SOD活性，且都不同程度優(yōu)于維生素E。
制備例中所述的人參皂苷Re、人參皂苷Rg1采用云南植物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的市售品；柚皮苷酶采用上海寶豐生化有限公司生產(chǎn)的市售品；二甲亞砜采用盤錦興海制藥有限公司生產(chǎn)的市售品；甲酰胺采用淄博市博山華耀試劑廠生產(chǎn)的市售品；羧甲基纖維素鈉采用上海邦成化工有限公司生產(chǎn)的市售品。
制備例1人參皂苷F1的制備500mg人參皂苷Re、150mg柚皮苷酶溶于50ml磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 4.5，離子強(qiáng)度為0.01M，含10％的乙醇)中，于40℃水浴中水解7天；反應(yīng)液經(jīng)離心收集沉淀；用10ml水洗滌沉淀，洗滌3次(10ml×3)，洗液與母液合并，濃縮至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗滌沉淀，洗滌5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集殘余物得人參皂苷F1301mg。HPLC法測定人參皂苷F1含量為63％。
制備例2人參皂苷F1的制備500mg人參皂苷Rg1，150mg柚皮苷酶溶于50ml甘氨酸-HCl緩沖液(pH 4.5，離子強(qiáng)度為0.01M，含10％的二甲亞砜)中，于40℃水浴中水解7天；反應(yīng)液經(jīng)離心收集沉淀；用10ml水洗滌沉淀，洗滌3次(10ml×3)，洗液與母液合并，濃縮至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗滌沉淀，洗滌5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集殘余物得人參皂苷F1325mg。HPLC法測定人參皂苷F1含量為84％。
制備例3人參皂苷F1的制備500mg人參皂苷Re和Rg1混合物，150mg柚皮苷酶溶于50ml為醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.5，離子強(qiáng)度為0.01M，含10％的甲酰胺)中，于40℃水浴中水解7天；反應(yīng)液經(jīng)離心收集沉淀；用10ml水洗滌沉淀，洗滌3次(10ml×3)，洗液與母液合并，濃縮至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗滌沉淀，洗滌5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集殘余物得人參皂苷F1310mg。HPLC法測定人參皂苷F1含量為69％。
制備例4人參皂苷F1注射藥物的制備取制備例2的人參皂苷F10.1g，加水10ml，加入0.1g吐溫80，充分溶解，0.22μm微孔濾膜濾過，分裝，121℃滅菌15min，即得。
制備例5動物試驗灌胃藥物的制備取制備例1的人參皂苷F10.1g，加水10ml，加入1g助懸劑羧甲基纖維素鈉，充分混懸，即得。
權(quán)利要求
1.人參皂苷F1在制備治療白內(nèi)障的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
人參皂苷F
文檔編號A61P27/00GK1839858SQ20061000847
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者吳巍, 滕厚雷 申請人:?？诰G科南藥研究開發(fā)有限公司