專利名稱：含丹參酮的藥物組合物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以丹參酮為主要活性成分的藥物組合物及其制備方法，具體為乳劑及其制備，及此藥用組合物在制藥中的用途。
背景技術(shù)：
中藥丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)為齒形科植物地干燥根及根莖，丹參作為一種傳統(tǒng)中藥，其應(yīng)用至少有1500年的歷史，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功，能顯著增加冠脈流量。由于它所顯示出來的這些療效，使它成為許多常用于心腦血管疾病中成藥的一個(gè)重要成分。目前一般認(rèn)為，丹參中具有活血化淤活性的有效部位有兩類脂溶性丹參酮類和水溶性丹參酚酸類。脂溶性丹參酮類主要包括丹參酮I(tanshinone-I)、丹參酮II(tanshinone-II)、隱丹參酮(cryptotanshinone)等，其中丹參酮-II包括tanshinone-IIA、tanshinone-IIB、1-hydroxytanshinone-IIA(1-羥基丹參酮-IIA)、ethytanshinoate(丹參酸甲酯)、3a-hydroxytanshin one-IIA(3a-羥基丹參酮-IIA)、tanshinol-A等，丹參酮-I包括tanshinol-A、tanshinone I、dihydrotanshinone I；丹參的主要水溶性丹參酚酸類包括丹酚酸A-C、迷迭香酸及其甲脂、丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸等成分。
丹參酮的生物活性有抑菌、抗炎、清除脂類自由基、影響肺纖維化病理過程、雌激素樣作用、對血小板聚集的影響、保護(hù)心血管、抗腫瘤多方面的生物活性。
丹參酮的制劑在臨床上應(yīng)用的有丹參酮膠囊和丹參酮-IIA磺酸鈉鹽注射液。丹參酮類幾乎不溶于水，制劑的體外溶出差。經(jīng)測定某批復(fù)方丹參片在人工胃液中隱丹參酮最大溶出度為25％，丹參酮IIA溶出未測到；某批丹參酮膠囊在人工胃液中隱丹參酮最大溶出度為1.26％，丹參酮IIA溶出未測到。藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明丹參酮類口服吸收差。因此丹參酮類屬于口服給藥溶出差、生物利用度低的成分。丹參酮-IIA磺酸鈉雖能溶于水，但由于其“強(qiáng)極性”，不易透過有具有脂雙層結(jié)構(gòu)的蛋白生物膜，因此不能通過血腦屏障，使其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量很低。另外羅厚蔚等研究表明丹參酮-IIA在制備成水溶性衍生物丹參酮-IIA磺酸鹽后，其抑菌活性明顯降低羅厚蔚，高紀(jì)偉，鄭家潤，等.丹參酮類及有關(guān)化合物抑菌作用的構(gòu)效關(guān)系.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，19(4)258～262。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是中藥丹參中的脂溶性有效部位丹參酮乳劑藥物組合物的處方及其制備方法與用途，其中乳劑包括口服乳劑與靜脈乳劑。
為解決上述問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案
一種丹參酮的藥物組合物，含治療有效量的隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮I和二氫丹參酮I(以下簡稱精制丹參酮)，所述藥物組合物可以含有藥學(xué)上所說口服或靜脈給藥乳劑制劑的輔料。
丹參酮中含治療有效量的精制丹參酮，是指丹參酮中按重量/重量計(jì)精制丹參酮含量不低于50％，優(yōu)選丹參酮中按重量/重量計(jì)精制丹參酮含量為50％-99％。
本發(fā)明藥物組合物較優(yōu)選的組成是含有按重量/重量計(jì)含量為50％～95％的精制丹參酮、藥學(xué)上可作為載體的油、乳化劑和水；其配比為精制丹參酮0.05～0.2g、中鏈油4g、長鏈油1～16g、乳化劑0.5～5.0g、油酸鈉0.02-0.1g，加水至100ml；
更優(yōu)選的組合物配比是精制丹參酮0.05～0.15g、中鏈油4g、長鏈油1～10g、乳化劑1.0～2.0g，油酸鈉0.02-0.08g，加水至100ml；每100ml乳劑含等滲調(diào)節(jié)劑按重量/重量計(jì)為2.0％～3.0％。
最優(yōu)選的組合物配比是精制丹參酮0.05～0.10g、中鏈油4g、長鏈油1～6g、乳化劑1.0～1.6g，油酸鈉0.04-0.07g，加水至100ml；每100ml乳劑含等滲調(diào)節(jié)劑按重量/重量計(jì)2.0～3.0％。
其中長鏈油為植物油或動(dòng)物油或二者混合物。植物油選自大豆油、玉米油、花生油、橄欖油、蓖麻油、棕櫚油、椰子油、菜籽油、芝麻油、棉子油等。動(dòng)物油選自通常來源于動(dòng)物脂肪，包括魚油、油酸鈉、鯨蠟油等。中鏈油(middle-chain triglycerides(MCT))即中鏈甘油三酸酯，即辛癸酸甘油脂，是半合成的天然功能性油脂，碳鏈長度C8-10，來源于椰子油。乳化劑選自大豆磷脂、蛋黃磷脂、氫化磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、絲氨酸磷脂、肌醇磷脂、磷脂酸、腦磷脂或者它們的混合物，等滲調(diào)節(jié)劑選自甘油。
本發(fā)明對丹參酮在油相的溶解進(jìn)行了篩選丹參酮在大豆油等長鏈油中溶解度很小，達(dá)不到臨床治療有效量；丹參酮在中鏈油中有較好的溶解度，由于中鏈油(MCT)不含人體必需的α-亞麻酸和亞油酸鈉，而必須有長鏈油(LCT)來補(bǔ)充，這就使中鏈油(MCT)單獨(dú)使用不好，同時(shí)我們的研究發(fā)現(xiàn)丹參酮在大豆油等長鏈油和中鏈油的混合油溶解度優(yōu)于其在中鏈油中的溶解度，因此本發(fā)明采用中鏈油和長鏈油的混合油作為油相載體；本發(fā)明對長鏈油和中鏈油的比例進(jìn)行了篩選，確定了長鏈油和中鏈油的最佳比例，既能使丹參酮溶解度達(dá)到臨床治療有效量，又能制成質(zhì)量穩(wěn)定并符合臨床用藥安全的乳劑。本發(fā)明對乳化劑比例進(jìn)行了篩選，確定了最佳比例。
所述藥物組合物的制備方法為將丹參酮或含有治療有效量精制丹參酮與油混合，加熱至60～80℃，攪拌，使溶解為澄明溶液，加入油酸鈉和乳化劑，攪拌，使溶解為澄明溶液，得油相；將等滲劑溶于水中形成水相，加熱至60-80℃；在高速攪拌下將油相加到水相中形成初乳，所得初乳加水定容后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)乳化，得到乳劑。優(yōu)選的制備方法為將含有治療有效量精制丹參酮、大豆磷脂和/或蛋黃磷脂、中鏈油與長鏈油混合，加熱至70～80℃，加入油酸鈉，使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油溶于水中形成水相，加熱至70-80℃；把含有丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌形成初乳，所得初乳加水定容后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化，制得乳劑。
本發(fā)明所述的丹參酮通過丹參藥材乙醇浸提或CO2超臨界流體萃取法提取獲得，并經(jīng)過柱層析純化，其主要成分為隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮I和二氫丹參酮I。
隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮I和二氫丹參酮I統(tǒng)稱為“精制丹參酮”，是丹參的有效部位，是本發(fā)明藥物組合物中的藥效成分。
按照新藥注冊管理辦法，原料藥中有效部位含量不低于50％。對于本發(fā)明藥物組合物，原料藥精制丹參酮按重量/重量比計(jì)含量不得低于50％。
所述的油是指生物可接受的物質(zhì)，一般指植物油、動(dòng)物油、合成油或其混合物。植物油可以是大豆油、玉米油、花生油、橄欖油、蓖麻油、棕櫚油、椰子油、菜籽油、中鏈油、芝麻油或棉子油中的一種或幾中；優(yōu)選為大豆油、芝麻油等富含甘油三酯的油。還可選自五味子油、沙棘油、桃仁油、杏仁油、紅花油、茶油、月見草油、小麥胚芽油、紫蘇油、山蒼子油、鴉膽子油或莪術(shù)油中的一種或幾種；或者選自亞油酸鈉、共軛亞油酸鈉、油酸鈉乙酯、氫化蓖麻油、氫化花生油、氫化棉子油、亞油酸鈉乙酯、共軛亞油酸鈉乙酯、自乳化單硬脂酸酯、辛/癸酸甘油酯或甘油三乙酯中的一種或幾種。動(dòng)物油選自通常來源于動(dòng)物脂肪，包括魚油、油酸鈉、鯨蠟油等。
本發(fā)明所述的乳化劑可以是陰離子表面活性劑、陽離子表面劑、兩性表面活性劑或非離子表面活性劑中的一種或幾種。其中陰離子表面活性劑選自高級脂肪酸的鹽類、硫酸化油和高級脂肪醇硫酸酯類中的一種或幾種，如油酸鈉鈉、油酸鈉鉀、十二(十四、十六、十八)烷基硫酸鈉等。陽離子表面活性劑選自磺酸化物，如辛烷基硫酸(磺酸)鈉、二辛基琥珀酸磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉中一種或幾種；兩性表面活性劑選自豆磷脂、蛋黃磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、絲氨酸磷脂、肌醇磷脂、磷脂酸、腦磷脂或氫化磷脂中的一種或幾種；非離子表面活性劑選自蔗糖脂肪酸酯類(如蔗糖酯)、司盤類、吐溫類、聚氧乙烯脂肪酸酯類(如賣澤Myrij)、聚氧乙烯脂肪醇醚類(如卞澤Brij)、Cetomacrogol類、Cremophore EL類或泊洛沙姆類(如poloxamer)中的一種或幾種。本發(fā)明所述的乳化劑優(yōu)選大豆磷脂、蛋黃磷脂、氫化磷脂等中的一種或幾種，更優(yōu)選為大豆磷脂和/或蛋黃磷脂。
本發(fā)明丹參酮乳劑的等滲調(diào)節(jié)劑為常規(guī)輔料、常規(guī)用量，只要達(dá)到等滲目的即可，如所述等滲調(diào)節(jié)劑為甘油。
由于丹參酮難以溶解于水中，至今尚無注射劑方面的使用。本發(fā)明提供的丹參酮乳劑經(jīng)室溫放置12個(gè)月，30℃放置6個(gè)月穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，激光粒度分析儀測定其平均粒徑變化在規(guī)定范圍，且粒度均勻，符合國家藥品注冊管理辦法要求；高效液相(HPLC)法測定精制丹參酮含量保持穩(wěn)定。其他各項(xiàng)指標(biāo)均符合注射劑要求，表明所得制劑質(zhì)量穩(wěn)定。
本發(fā)明提供的丹參酮乳劑可以改變丹參酮在人體內(nèi)的分布，提高藥物的生物利用度，丹參酮制成乳劑后易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，在體內(nèi)具有顯著的靶向性，在心臟部位和中樞神經(jīng)系統(tǒng)富集從而達(dá)到治療濃度，提高該藥物在治療心血管疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用，比相同劑量下水針劑的心臟靶向性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向性提高300％以上。并且可保持丹參酮原有的活性。該注射劑穩(wěn)定、可耐受高壓滅菌，使用的輔料具有生物相容性，并顯示較少的副作用。
本發(fā)明還提供了所述含丹參酮的組合物在制備治療或預(yù)防感染性疾病、缺血性腦中風(fēng)、腦缺血/再灌注損傷、缺血性心臟病、腫瘤、肝纖維化、糖尿病并發(fā)癥、肺纖維化、慢性腎炎、慢性腎功能不全、阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的丹參酮可以采用市售品(具有相應(yīng)提取設(shè)備或生產(chǎn)型超臨界設(shè)備的廠家均可以生產(chǎn)，如西安天豐生物科技有限公司其產(chǎn)品精制丹參酮10-80％各種含量產(chǎn)品)。實(shí)施例中茶油、中鏈油、精制大豆油、精制芝麻油、魚油、玉米油、花生油均采用鐵嶺北亞藥用油有限公司生產(chǎn)的市售品。豆磷脂、蛋黃磷脂、腦磷脂、氫花磷脂、油酸鈉、甘油均采用上海東尚實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的市售品。
制備例1制備精制丹參酮
取當(dāng)?shù)⑺幉?，粉碎?5％乙醇浸提，回收乙醇得浸膏，硅膠柱層析純化，石油醚-乙醚梯度洗脫，收集富含精制丹參酮部位，得到精制丹參酮。高效液相(HPLC)法測定，含精制丹參酮56％(w/w)。
制備例2制備精制丹參酮
丹參藥材粉碎過篩，置于5L超臨界萃取設(shè)備，CO2超臨界流體萃取物(萃取釜35MPa，60℃，時(shí)間40min，95％乙醇為夾帶劑，循環(huán)量為675ml·h-1，即用量為藥材總量的30％，壓力5MPa，溫度45℃，丹參萃取液過濾，濾液靜置，取沉淀，硅膠柱層析純化，石油醚-乙醚梯度洗脫，收集富含精制丹參酮部位，得到精制丹參酮。高效液相(HPLC)法測定，含精制丹參酮89％(w/w)。
實(shí)施例1精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮50mg、豆磷脂0.5g、加入到茶油1.0g和中鏈油4.0g的混合油中，加入油酸鈉0.02g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于20ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑166nm。
實(shí)施例2精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮200mg、蛋黃磷脂5.0g、加入到精制芝麻油16g和中鏈油4g的混合油中，加入油酸鈉0.1g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.25g溶于60ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑168nm。
實(shí)施例3精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮150mg、蛋黃磷脂2.0g、加入到中鏈油4g中，精制大豆油10g，加入油酸鈉0.08g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于30ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑165nm。
實(shí)施例4精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮50mg、蛋黃磷脂1.0g、加入到魚油1.0g和中鏈油4.0g的混合油中，加入油酸鈉0.02g，加熱至70～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加熱至70-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑174nm。
實(shí)施例5精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮100mg、蛋黃磷脂1.6g、加入到魚油6.0g和中鏈油4.0g的混合油中，加入油酸鈉0.07g，加熱至70～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于30ml水中形成水相，加熱至70-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑174nm。
實(shí)施例6精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮50mg、氫化磷脂1.0g、加入到中鏈油4.0g和玉米油1.0g的混合油中，加入油酸鈉0.04g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于50ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑164nm。
實(shí)施例7精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮80mg、腦磷脂1.4g、加入到中鏈油4.0g和花生油4.0g的混合油中，加入油酸鈉0.06g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑155nm。
實(shí)施例8精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮120mg、蛋黃磷脂1.2g、加入到中鏈油6g和大豆油2g的混合油中，加入油酸鈉0.05g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于30ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑158nm。
實(shí)施例9精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮150mg、蛋黃磷脂1.2g、加入到中鏈油6.0g和玉米油4.0g的混合油中，加入油酸鈉0.07g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑158nm。
實(shí)施例10精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮200mg、蛋黃磷脂1.6g、加入到中鏈油10g和大豆油5g的混合油中，加入油酸鈉0.05g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于40ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡橙黃色乳液，平均粒徑158nm。
比較例1精制丹參酮油相的制備
將精制丹參酮20mg加入到10g玉米油中，加熱至60～80℃，攪拌，精制丹參酮不溶于玉米油，無法制得油相。
比較例2精制丹參酮油相的制備
將精制丹參酮20mg加入到20g大豆油中，加熱至60～80℃，攪拌，精制丹參酮不溶于大豆油，無法制得油相。
比較例3精制丹參酮油相的制備
將精制丹參酮200mg加入到4.0g中鏈油中，加熱至60～80℃，攪拌，精制丹參酮不能全溶于中鏈油，無法制得油相。
比較例4精制丹參酮油相的制備
將精制丹參酮200mg加入到4.0g中鏈油和6.0g大豆油中，加熱至60～80℃，攪拌，精制丹參酮溶解為澄明溶液，可制得油相。
比較例5精制丹參酮乳劑的制備
將精制丹參酮150mg、蛋黃磷脂1.6g、加入到中鏈油10g中，加入油酸鈉0.025g，加熱至60～80℃，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于100ml水中形成水相，加熱至60-80℃；把含有精制丹參酮的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121℃滅菌15分鐘，制得乳劑。所得乳劑為均勻的淡紅色乳液，平均粒徑168nm。
以下試驗(yàn)例1采用的丹參酮乳劑按實(shí)施例1、2、5制備。其余試驗(yàn)例的丹參酮乳劑按實(shí)施例10制備。試驗(yàn)例中所述的丹參酮IIA磺酸鹽注射液購自上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的市售品。各種細(xì)菌購自中國藥品生物制品檢定所；各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皆購自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
試驗(yàn)舉例丹參酮乳劑在體內(nèi)分布特點(diǎn)(藥物在大鼠體內(nèi)的組織分布研究)
Sprague Dawley(簡稱SD)大鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分為8組，每組6只，按20mg/kg體重尾靜脈注射藥物，對照藥為丹參酮IIA磺酸鹽注射液，其余四組為丹參酮乳劑(按照實(shí)施例5制備)，給藥后分別于15min、30min、60min、120min放血處死(每時(shí)間點(diǎn)6只動(dòng)物，雌雄各半)，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、胃腸、腦，用生理鹽水沖洗表面血污，吸干水分，-25℃保存供測試；測試前用組織勻漿器制成400mg/ml的生理鹽水勻漿使用。測試血漿和各組織中丹參酮IIA含量，采用高效液相色譜法定量分析以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表1。
表1丹參酮乳注射給藥后藥物在體內(nèi)各組織分布濃度數(shù)據(jù)表(丹參酮IIAμg/g組織)
結(jié)果表明
1、乳劑能夠顯著提高藥物在心臟的靶向性；
2、結(jié)果表明該藥制成乳劑后可以透過血腦屏障，在腦中的分布量明顯比注射液提高。
試驗(yàn)例1丹參酮乳劑體外抑菌作用試驗(yàn)
1方法
采用平板打孔法分別檢測丹參酮乳劑組(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml)、丹參酮IIA磺酸鹽注射液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、溶血性鏈球菌、人型結(jié)核桿菌抑菌效果。
2結(jié)果
結(jié)果顯示丹參酮乳劑各劑量組對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、溶血性鏈球菌、人型結(jié)核桿菌均具有顯著的抑菌效果。與丹參酮IIA磺酸鹽注射液對比有顯著性差異。
表2丹參酮乳劑抑菌作用
注與丹參酮IIA磺酸鹽注射液比較 *P＜0.05，**P＜0.01。
以下試驗(yàn)例中動(dòng)物給藥方法皆為靜脈注射給藥。采用的丹參酮乳劑皆按實(shí)施例10制備。
試驗(yàn)例2丹參酮乳劑對大鼠局部腦缺血損傷的影響
1.分組與實(shí)驗(yàn)方法
Wistar大鼠隨機(jī)分為(1)假手術(shù)組(等容量溶劑)，(2)模型對照組(等容量溶劑)，(3)丹參酮II-A磺酸鈉注射液組(6mg/kg)，(4)丹參酮乳劑低劑量組(3mg/kg)；(5)丹參酮乳劑中劑量組(6mg/kg)；(6)丹參酮乳劑高劑量組(12mg/kg)。每組10只。禁食12小時(shí)后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動(dòng)脈游離端拉至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24mm尼龍線，長度5.0cm)由頸外動(dòng)脈插入至顱內(nèi)，遇輕微阻力時(shí)停止，插入深度約為2cm。結(jié)扎頸外動(dòng)脈開口，并打開頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾，消毒縫合傷口，造成左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型；假手術(shù)組僅進(jìn)行右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈的分離(以上實(shí)驗(yàn)均在23℃～25℃進(jìn)行)。術(shù)后各組動(dòng)物靜脈注射相應(yīng)藥物。24小時(shí)后按文獻(xiàn)劉小光，徐理納，一種能評價(jià)溶栓和抗溶栓的大鼠腦中動(dòng)脈模型，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30662所述方法及標(biāo)準(zhǔn)觀察并記錄大鼠的行為障礙(A)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，計(jì)為0分，如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲計(jì)為1分，肘屈曲計(jì)為2分，肩內(nèi)旋計(jì)為3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩內(nèi)旋者，計(jì)為4分。(B)將動(dòng)物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查阻力。如雙側(cè)阻力對等且有力，計(jì)為0分，如向手術(shù)對側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降者，根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計(jì)為1，2和3分。(C)將動(dòng)物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計(jì)為0分。同樣根據(jù)手術(shù)對側(cè)肌張力下降程度不同計(jì)為1，2和3分。(D)動(dòng)物有不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，計(jì)為1分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)評分，滿分為11分，分?jǐn)?shù)越高，表示動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。
行為評分后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，染色后照相，用中國航空航天大學(xué)病理圖像分析軟件求梗塞面積比。數(shù)據(jù)用X±s表示，以組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
2.結(jié)果
如表3所示，缺血24小時(shí)后，大鼠表現(xiàn)出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達(dá)到全腦的25％左右；給予不同劑量的丹參酮乳劑，動(dòng)物行為障礙有不同程度的減輕，大鼠腦缺血區(qū)也有明顯好轉(zhuǎn)，且呈劑量依賴性。與丹參酮II-A磺酸鈉注射液組相比有顯著性差異。
表3丹參酮乳劑對大鼠局部腦缺血損傷的影響(n＝10，X±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，與丹參酮II-A磺酸鈉注射液組比較#P＜0.05，##P＜0.01。
試驗(yàn)例3丹參酮乳劑對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響
1.分組及實(shí)驗(yàn)方法
分組同前。禁食12小時(shí)后，按實(shí)驗(yàn)例2所述方法造成左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血；術(shù)后10min各組動(dòng)物靜脈注射相應(yīng)藥物。缺血2小時(shí)后，抽出尼龍線，造成大鼠腦缺血/再灌注損傷；再灌22小時(shí)后，按按試驗(yàn)例2所述方法進(jìn)行行為評分、腦片染色。數(shù)據(jù)用X±s表示，以組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
2.結(jié)果
如表4所示，缺血2小時(shí)再灌22小時(shí)后，大鼠表現(xiàn)出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達(dá)到全腦的25％左右；給予不同劑量的丹參酮乳劑，動(dòng)物行為障礙有不同程度的減輕，大鼠腦缺血區(qū)也有明顯好轉(zhuǎn)，且呈劑量依賴性。與丹參酮II-A磺酸鈉注射液組相比有顯著性差異。
表4丹參酮乳劑對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響(n＝10，X±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，與丹參酮II-A磺酸鈉注射液組比較#P＜0.05，##P＜0.01。
試驗(yàn)例4丹參酮乳劑對大鼠心肌缺血的影響
1.分組及實(shí)驗(yàn)方法
分組同前。禁食12小時(shí)后，ip烏拉坦(1.2g/kg)麻醉，測肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左緣1cm處，剪開胸壁肌肉及二條肋骨，迅速打開胸腔，暴露心臟，在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，立即將心臟放回，排擠出胸腔空氣，用止血鉗閉合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。術(shù)后各組動(dòng)物靜脈滴注(用輸液泵注射)相應(yīng)藥物(給藥體積3ml，30min滴完)。記錄術(shù)后0，2，6h心電圖，隨后取出心臟，以冷生理鹽水洗凈后，-20℃冰箱冷凍過夜。次日，將冷凍的心臟由結(jié)扎處至心尖部等厚切成5片，浸入新鮮配制的0.5％N-BT磷酸緩沖液(pH 7.4)中。37℃水浴振搖10～15min。用濾紙吸干切片表面的染色液，分離染色部分和未染色部分，稱重，記算梗死面積。心肌梗死百分比(％)＝梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量)×100％。
3.結(jié)果如表5所示，不同劑量的丹參酮乳劑均明顯減少結(jié)扎冠狀動(dòng)脈所致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面積，并可降低由心肌缺血造成的肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖J點(diǎn)的升高。丹參酮乳劑對心肌具有保護(hù)作用，能降低缺血引起的心肌損傷。中、高劑量組與丹參酮II-A磺酸鈉注射液組相比有顯著性差異。
表5丹參酮乳劑對大鼠心肌缺血損傷的影響(n＝10，X±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，與丹參酮II-A磺酸鈉注射液組比較#P＜0.05，##P＜0.01。
試驗(yàn)例5.丹參酮乳劑對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用
1.材料及試驗(yàn)方法
藥物臨用前以完全培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度。RPMI1640培養(yǎng)基GIBCO公司生產(chǎn)。新生牛血清(超級)，杭州四季青生物工程材料有限公司，生產(chǎn)批號000528。胰蛋白酶，Sigma公司生產(chǎn)。MTT，Sigma公司。注射用鏈霉素，山東瑞陽制藥有限公司，1g(100萬單位)/支，批號200105123。注射用青霉素鈉，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，80萬單位/支，批號L020312。其它常用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。
細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、Bel-7402、人卵巢癌細(xì)胞株H08910、人前列腺癌胞PC-3M、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、人食管癌細(xì)胞株CaEs-17、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、人胃癌細(xì)胞株BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901、人早幼粒白血病細(xì)胞株HL60，均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理室。
儀器CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Costar，USA)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，USA)。
軟件Microsoft Excel 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件；Microcal Origin 6.0數(shù)據(jù)處理軟件。
實(shí)驗(yàn)方法RPMI1640培養(yǎng)基一袋加水一升，補(bǔ)加2g碳酸氫鈉，10萬單位青霉素和100mg鏈霉素，調(diào)節(jié)pH值至7.4，用0.22um除菌濾膜過濾除菌。90ml培養(yǎng)基加滅活新生牛血清10ml即為完全培養(yǎng)液。胰蛋白酶用D-hanks緩沖液溶解后過濾除菌。
所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含5ml完全培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2、飽合濕度下。貼壁細(xì)胞以0.25％胰蛋白酶消化后傳代，懸浮細(xì)胞1000rpm離心10min后棄原培養(yǎng)液加新鮮培養(yǎng)液傳代。
貼壁培養(yǎng)細(xì)胞胰蛋白酶消化后，懸浮細(xì)胞離心后，加完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至1×105個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞加入到96孔培養(yǎng)板，每孔100μl。加完細(xì)胞的培養(yǎng)板于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后倒掉原培養(yǎng)液，于96孔板中加入各組藥物的完全培養(yǎng)液，藥物濃度最高為20μg/ml，按0.5倍倍比稀釋，共設(shè)3個(gè)濃度梯度，另設(shè)不含藥組為對照組，每個(gè)處理設(shè)四個(gè)平行孔。振蕩混勻后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，倒掉原培養(yǎng)液，加入100μl含0.5mg/ml MTT的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中放置4h，取出培養(yǎng)板，小心吸去培養(yǎng)板孔中上清，加入150μl DMSO，振蕩使藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶充分溶解。于Bio-TEK Synergy HT酶標(biāo)儀上測定每孔光吸收，測定波長570nm，參考波長630nm。根據(jù)各孔光吸收值計(jì)算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率。
根據(jù)藥物濃度對數(shù)和對應(yīng)的抑制率，利用Micro Origin軟件作線性回歸，根據(jù)直線方程求出藥物對細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)。
2.結(jié)果見表6。
表6 丹參酮乳劑對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用(IC50，μg/ml)
結(jié)果表明，丹參酮乳劑各劑量組均可明顯抑制多種人源腫瘤細(xì)胞株的體外增殖，其半抑制濃度IC50均小10μg/ml。且優(yōu)于丹參酮II-A磺酸鈉注射液組。
試驗(yàn)例6.丹參酮乳劑抑制小鼠體內(nèi)移植瘤生長的抑制作用
1.材料與方法
動(dòng)物及瘤株昆明種小白鼠，體重18-22g，雄性。C57BL/6純系小鼠，體重18-22g，雄性。小鼠S180肉瘤、H22肝癌、Lewis肺癌、U14宮頸癌均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理室引進(jìn)。
實(shí)驗(yàn)方法S180、H22和U14腫瘤均于昆明種小鼠腹腔內(nèi)傳代，一般傳代后7天長出腹水。無菌注射器取出腹水后用注射用生理鹽水稀釋3倍后，接種于昆明種小鼠腋下皮下，0.2ml/只。Lewis肺癌于C57BL/6小鼠腋下傳代，接瘤后10天左右，取生長狀態(tài)良好瘤組織，加入5倍量生理鹽水后研磨成勻漿，過100目篩得瘤細(xì)胞懸液，接種于C57BL/6小鼠腋下，0.2ml/只。接瘤后第二天給藥。連續(xù)給藥10天，末次給藥后24小時(shí)，脫頸椎處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織稱重，計(jì)算抑瘤率。
2.結(jié)果丹參酮乳劑各劑量組皆可以明顯抑制小鼠體內(nèi)移植瘤的生長。且優(yōu)于丹參酮A磺酸鈉注射液組。詳見表7。
表7 丹參酮乳劑對小鼠體內(nèi)移植瘤生長的抑制作用
注各組瘤重與模型組比較**P＜0.01。與丹參酮II-A磺酸鈉注射液組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
試驗(yàn)例7丹參酮乳劑對肝纖維化的影響
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組，雄性SD大鼠，體重170-230g，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組正常對照組、模型組、丹參酮乳劑不同劑量組，每組10只。
2.實(shí)驗(yàn)方法
大鼠肝纖維化模型復(fù)制及各組處置方法參考吳孟超等復(fù)制大鼠肝纖維化模型的方法吳孟超，楊廣順.大鼠肝硬變模型復(fù)制的研究.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1984，1(4)145-147，每4d每100g體重皮下注射60％四氯化碳油溶液0.3ml，以5％乙醇水溶液作為溶劑。正常對照組大鼠每4d皮下注射油溶液0.3ml/100g體重，1周后，隔日灌服自來水0.3ml/100g體重，每日腹腔注射滅菌水0.1ml/100g體重(每周6次)，以自來水作為飲料；肝纖維化組大鼠按上述方法造模1周后，隔日灌服自來水0.3ml/100g體重，每日腹腔注射滅菌水0.1ml/100g體重(每周6次)；丹參酮乳劑組大鼠按上述方法造模1周后，隔日灌服自來水0.3ml/100g體重，每日腹腔注射丹參酮乳劑2mg/100g體重(每周6次)。第4、8周末，各組隨機(jī)抽取6只動(dòng)物，用25％烏拉坦溶液按150mg/100g體重腹腔注射麻醉，解剖，門靜脈采血，留取肝組織，部分用10％中性福爾馬林溶液固定，24-48h內(nèi)制石蠟塊。
觀察指標(biāo)及測定方法肝組織病理學(xué)檢查采用HE染色，纖維增生程度分為0-4級栗坤，趙玉珍，朱秋霜等.川芎嗪對老齡小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影響.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，1998；214-5。用放射免疫方法測定血清透明質(zhì)酸含量，透明質(zhì)酸放射免疫分析測定盒購自上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心，所用儀器為SN-695A型智能放免γ測量儀。肝組織中羥脯氨酸測定采用氧化法，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
病理學(xué)檢查正常對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝臟4周末及8周末均出現(xiàn)明顯的纖維化；丹參酮乳劑各劑量組中纖維化程度均較模型組輕。
大鼠血清中透明質(zhì)酸含量4周末與8周末，除大劑量組8周時(shí)間點(diǎn)外，丹參酮乳劑其他時(shí)間點(diǎn)大鼠血清透明質(zhì)酸含量均較模型組低，差異顯著(表8)。
表8 丹參酮乳劑對肝纖維化大鼠血透明質(zhì)酸含量(μg/L)的影響
注△，與正常對照組比較，P＜0.05；▲與模型組比較，P＜0.05；▲▲P＞0.05。
大鼠肝組織中膠原蛋白含量4周末，丹參酮乳劑各劑量組大鼠肝組織中膠原蛋白含量低于肝纖維化組，差異顯著；8周末時(shí)，較模型組亦低，但大劑量組差異不顯著(見表9)。
表9 丹參酮乳劑對肝纖維化大鼠肝組織膠原蛋白含量(mg/g肝粉)的影響
注△，與正常對照組比較，P＜0.05；▲，與模型組比較，P＜0.05；▲▲，與模型組比較，P＞0.05。
試驗(yàn)例8丹參酮乳劑對醛糖還原酶(AR)活性的影響
1.試驗(yàn)方法
分組同前。造模方法采用四氧嘧啶(100mg/kg)誘發(fā)糖尿病。實(shí)驗(yàn)第16周時(shí)將大鼠斷頭處死，取腎臟剔除附著物，搗碎取勻漿，供測定AR活性用。
AR活性測定方法即記錄NADPH在340nm處吸收光值下降10U來表示酶活性。本研究使用的反應(yīng)體系67mmol/L、pH6.2的Na+-K+-磷酸緩沖液、10mmol/L的DL-甘油醛、5mmol/L的2-巰基乙醇、0.1mmol/L的NADPH和酶適量；實(shí)驗(yàn)杯包括全部試劑，對照杯以雙蒸水代替底物DL-甘油醛。
測定組織勻漿酶活性，同時(shí)測定蛋白含量，一單位酶活性規(guī)定為1min產(chǎn)生1μmolNADP+的酶量，各組織酶活性用比活性進(jìn)行比較，比活性＝酶單位/mg蛋白。
2.結(jié)果
糖尿病鼠模型組其AR活性顯著高于正常組(P＜0.01)，使用丹參酮乳劑后AR活性明顯下降，與模型組相比，P值均＜0.01；雖然各治療組AR活性仍高于正常組，但與正常組相比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表10。
表10 實(shí)驗(yàn)各組AR活性變化比較
注與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；##P＜0.01。
試驗(yàn)例9丹參酮乳劑對肺纖維化大鼠模型的影響
1.造模方法
分組同前。用無菌配置的1.5％戊巴比妥納對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉(2.5ml/kg體重)，以無菌操作行頸部正中切口，采用鈍行分離法暴露氣管，經(jīng)氣管穿刺向肺部緩慢注入無菌生理鹽水配置的濃度為4mg/ml的博萊霉素A5(BLMA5)溶液0.2～0.3ml(BLMA5劑量為5mg/kg體重)，立即直立旋轉(zhuǎn)動(dòng)物，使藥液在肺內(nèi)分布均勻。正常對照組注入等量無菌生理鹽水。
2.觀察指標(biāo)采集腹主靜脈血樣，用EDTANa2抗凝，分離血漿，-20℃凍存，待檢。測定血漿TNF-α、NO、MDA的含量及SOD的活性，均嚴(yán)格按相應(yīng)的試劑盒說明書操作。
3.結(jié)果
丹參酮乳劑各劑量皆可降低實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠血漿TNF-α、NO、MDA含量，提高SOD活性，對博萊霉素致大鼠的肺損傷具有一定保護(hù)作用。見表11。
表11 實(shí)驗(yàn)各組TNF-α、NO、MDA的含量及SOD的活性變化比較
注與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；##P＜0.01。
試驗(yàn)例10丹參酮乳劑對大鼠慢性腎炎模型的影響
1.造模方法
分組同上。采用抗Thy-1抗體制備大鼠系膜增生性腎炎模型(兔抗鼠Thy-1抗血清(ATS)的制備參照文獻(xiàn)陳廣平，郭慕依，張?jiān)露?，?大鼠Thy-1抗血清制備及系膜增生性腎炎模型的建立.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1996，3241，參照上述文獻(xiàn)方法，將正常組外各組大鼠由尾靜脈注射ATS1ml/100g，每周1次，連續(xù)4周。
2.給藥方法
在首次注射ATS后的第2天開始給藥。
3.觀察指標(biāo)第4周末行眼球摘除采血后，即刻剖腹取腎臟。
3.1一般情況
大鼠的精神狀態(tài)、體重、體毛、飼料量、飲水量、二便及活動(dòng)情況等。
3.2免疫熒光學(xué)檢查
取小塊腎皮質(zhì)組織作冰凍切片，用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗大鼠IgG(Sigma公司，效價(jià)1:64)作直接熒光染色，AO one-twenty熒光顯微鏡觀察。熒光強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)鄒萬忠.腎臟病理與臨床.長沙湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1993.9-10，26-27。
3.3光學(xué)顯微鏡觀察
取部分腎組織用10％中性甲醛固定，階梯乙醇脫水，石臘包埋，切片，作蘇木素伊紅染色(HE)和過碘酸雪夫氏反應(yīng)染色(PAS)，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。對每例標(biāo)本任選10個(gè)腎小球，計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球的細(xì)胞數(shù)，測量每個(gè)腎小球的長徑，并記錄系膜增生程度，其分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)鄒萬忠.腎臟病理與臨床.長沙湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1993.9-10，26-27。
3.4電子顯微鏡觀察
每組取3只大鼠腎臟1mm2大小3塊作電鏡觀察，常規(guī)用2％戊二醛前固定，1％鋨酸后固定，階梯乙醇脫水，環(huán)氧樹脂EPON812包埋，超薄切片，并行鈾和鉛雙重染色后，置JEM-1200EX透射電鏡下觀察，拍照記錄。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4.1一般情況
在實(shí)驗(yàn)過程中模型組有1例大鼠死亡，造模之各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的精神不振、攝食減少、生長遲緩、身體消瘦、蜷縮、體毛無光澤、大便稀爛等現(xiàn)象，以模型組最為顯著.
4.2光鏡檢查
結(jié)果顯示正常對照組有1例見腎小球毛細(xì)血管輕度充血，余無異常。模型組腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞均有增生，系膜基質(zhì)增寬，并可見少量中性粒細(xì)胞浸潤?；啄の匆娒黠@增厚。大部分腎小球增大，腎球囊閉塞。近曲小管上皮細(xì)胞呈中度或重度細(xì)胞內(nèi)水腫，部分腎小管腔內(nèi)見蛋白。各治療組系膜增生現(xiàn)象有減輕，近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)水腫明顯好轉(zhuǎn)，腎小管內(nèi)蛋白消失。詳見表12-14。
表12 各組大鼠免疫熒光檢查結(jié)果比較(n＝10)
注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表13 各組腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)、腎小球大小的比較(x±s)
注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表14 各組大鼠系膜增生程度比較(n＝10)
注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
4.3電鏡檢查
結(jié)果顯示正常組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。模型組系膜區(qū)顯著增寬，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，有云霧狀電子致密物在系膜區(qū)沉積部分足突融合，毛細(xì)血管基底膜基本正常。各治療組病理改變輕于模型組，以丹參酮乳劑高劑量組病變最輕，中、低劑量組次之。
5.結(jié)論
丹參酮乳劑對大鼠慢性腎炎模型的腎臟病理損害有治療作用。
試驗(yàn)例11丹參酮乳劑對大鼠慢性腎功能不全模型的影響
1.造模方法
除正常對照組外，其余各組大鼠采用Plant法，行5/6腎大部分切除術(shù)制作慢性腎衰大鼠模型用1％戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，將其固定于鼠臺上，腰背部剃毛，酒精消毒后，于脊柱左側(cè)作切口，打開腹腔，暴露左腎，剝離腎包膜，以無菌縫線結(jié)扎左側(cè)腎蒂，切除左腎上下極和外側(cè)緣，局部以明膠海綿止血，以甲硝唑注射液沖洗腹腔以防止感染，然后逐層縫合肌肉和皮膚。1周后結(jié)扎右腎動(dòng)脈后切除右腎。切除之腎組織稱重，間接估算左殘腎重量，要求腎組織平均切除率為80％左右。
2.分組及給藥
雄性SD大鼠，體重170-230g，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組假手術(shù)組(給予手術(shù)，但并未切除腎臟)、模型組、保護(hù)組(兩次術(shù)后第2天即開始給予丹參酮乳劑6mg/kg)、丹參酮乳劑不同劑量組(兩次術(shù)后1周開始給予丹參酮乳劑3、6、12mg/kg)，每組10只。療程8周。每2周稱體重1次，以調(diào)整大鼠給藥量。
3.觀測指標(biāo)
3.1一般情況主要觀察精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度、飲食、體重等。
3.2腎功能檢測用藥8周后稱重，股靜脈取血8ml收集于試管中靜置1h，分離血清，用自動(dòng)生化儀測定血肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)水平。處死動(dòng)物，快速摘取殘余腎臟(正常對照組大鼠取雙腎全重的1/6進(jìn)行比較)，去除筋膜等腎外組織，鹽水沖洗后濾紙吸干水分，電子天平稱重，計(jì)算腎重/體重比。
4.結(jié)果
4.1一般情況正常對照組動(dòng)物表現(xiàn)機(jī)警，反應(yīng)快，皮毛致密，整齊而有光澤，飲食正常；造模后各組動(dòng)物精神萎靡，活動(dòng)遲緩，皮毛蓬松，枯槁無光澤，食欲不振。其中模型對照組最為明顯，丹參酮乳劑各劑量組及保護(hù)組優(yōu)于模型對照組。
4.2腎功能檢測造模后，模型組大鼠血清肌酐、尿素氮明顯高于正常對照組(P＜001)，治療后，丹參酮乳劑各劑量組及保護(hù)組血清Cr、BUN明顯下降。盡管與正常組比較仍有差異(P＜001)，但已經(jīng)顯著低于模型對照組，尤以丹參酮乳劑大劑量組及保護(hù)組對BUN的改善較為明顯(P＜005)，丹參酮乳劑大劑量組Cr的降低亦非常明顯(P＜001)。
造模后各組殘余腎代償性肥大明顯，與正常組比較差異有非常顯著性(P＜001)，而大鼠體重則有所下降，尤以模型組體重下降明顯(與正常組比較P＜005)，丹參酮乳劑各劑量組和保護(hù)組則與正常對照組比較沒有明顯差別；此外，造模后各組大鼠腎重/腎體重比明顯增高，與正常對照組比較差異有非常顯著性(P＜001)，而保護(hù)組則有所降低(與模型組比較，P＜005)，提示丹參酮乳劑能夠改善慢性腎衰大鼠體重下降，并具有預(yù)防性阻止腎代償性肥大的作用。
詳見表15。
表15 丹參酮乳劑對慢性腎衰大鼠腎功能的影響(x±s)
注與模型組比，**P＜001；與正常對照組，#P＜005，##P＜001。
5.結(jié)論
丹參酮乳劑3、6、12mg/kg具有延緩慢性腎功能不全進(jìn)展的作用。
試驗(yàn)例12丹參酮乳劑對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響
1.Aβ1-40誘導(dǎo)大鼠AD樣病變模型的制備及分組
應(yīng)用凝聚態(tài)β淀粉樣肽1～40片段(Aβ1-40)注入大鼠海馬內(nèi)建立AD樣病變的動(dòng)物模型。具體如下
SD雄性大鼠共50只，清潔2級，體重250～300g。SD大鼠經(jīng)麻醉后于立體定位儀下以Aβ1-40行雙側(cè)海馬內(nèi)注射，每側(cè)各1μl(預(yù)先將Aβ1-40溶于無菌生理鹽水10μg/μl，用前37℃下孵育1周)。注射部位為前囟后3.5mm，腦正中線旁開2.0mm，其深度為2.7mm。
大鼠隨機(jī)分為5組(1)Aβ1-40處理模型組；(2)丹參酮乳劑低劑量治療組(3mg/kg)；(3)丹參酮乳劑中劑量治療組(6mg/kg)；(4)丹參酮乳劑高劑量治療組(12mg/kg)；(5)假手術(shù)對照組即海馬內(nèi)注射等量生理鹽水。
給藥方法各組動(dòng)物于造模前一周開始靜脈注射給藥，每天1次，連續(xù)3周。迷宮訓(xùn)練期間，于訓(xùn)練前0.5h給藥。
2.觀察指標(biāo)與方法
空間學(xué)習(xí)記憶力測試采用Morris水迷宮法。平臺設(shè)于迷宮東北象限正中，水平面高出平臺1.5cm，水溫保持在19℃～20℃，大鼠連續(xù)訓(xùn)練5d，每天2次，設(shè)定最長游動(dòng)時(shí)間為70s，以秒表記時(shí)，記錄大鼠找到平臺所需時(shí)間(潛伏期，EL)。
3.結(jié)果
對AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶力的影響隨訓(xùn)練天數(shù)增加，各組大鼠平均EL逐漸縮短。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠EL明顯延長，第4天開始差異顯著(P＜0.05)，說明造模成功。與模型組比，丹參酮乳劑3mg/kg組大鼠于第4天開始EL明顯縮短，6mg/kg組則于第3天開始EL明顯縮短，12mg/kg組則于第2天即開始EL明顯縮短，皆差異顯著；12mg/kg組第5天則有極顯著性差異。表明丹參酮乳劑各劑量組均能顯著改善Aβ1-40相誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，且呈劑量依賴性。詳見表16。
表16 丹參酮乳劑對實(shí)驗(yàn)性AD模型大鼠空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力的影響
注與AD模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01。
權(quán)利要求
1、一種含丹參酮的藥物組合物，其組成為，每100克組合物中含有
丹參酮0.05～0.2g、油5～20g、乳化劑0.5～5.0g、余量的水。
2、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，每100克組合物中還含有0.02-0.1g油酸鈉。
3、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述丹參酮中隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮I和二氫丹參酮I四者總含量按重量/重量計(jì)不低于50％。
4、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述油為藥學(xué)上作為載體的油，由中鏈油與長鏈油以中鏈油比長鏈油為1比0.25～4的比例組成。
5、如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于，所述長鏈油為植物油或動(dòng)物油或兩者混合物，所述植物油為大豆油、玉米油、花生油、橄欖油、蓖麻油、棕櫚油、椰子油、菜籽油、芝麻油、棉子油或它們的混合物，所述動(dòng)物油為魚油、油酸鈉、鯨蠟油或它們的混合物。
6、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述乳化劑為大豆磷脂、蛋黃磷脂、氫化磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、絲氨酸磷脂、肌醇磷脂、磷脂酸、腦磷脂或者它們的混合物。
7、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，每100克組合物中含有丹參酮0.05～0.10g、中鏈油4g、長鏈油1～6g、乳化劑1.0～1.6g、油酸鈉0.04-0.07g、等滲調(diào)節(jié)劑按重量/重量計(jì)為2.0～3.0％和余量的水。
8、如權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于，所述組合物是口服乳劑或靜脈乳劑。
9、權(quán)利要求1-9所述組合物的制備方法，其特征在于，將丹參酮和乳化劑與油混合，加熱，攪拌，使溶解為澄明溶液，得油相；將等滲劑溶于水中形成水相；在高速攪拌下將油相加到水相中形成初乳，所得初乳加水定容后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)乳化，得到乳劑。
10、權(quán)利要求1-8的組合物在制備治療或預(yù)防感染性疾病、缺血性腦中風(fēng)、腦缺血/再灌注損傷、缺血性心臟病、腫瘤、肝纖維化、糖尿病并發(fā)癥、肺纖維化、慢性腎炎、慢性腎功能不全、阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種含丹參酮的藥用組合物及制備方法，該組合物包括丹參酮、油、乳化劑和水。該組合物可制成口服乳劑與靜脈乳劑?？捎糜谥委熁蝾A(yù)防感染、缺血性腦中風(fēng)、腦缺血/再灌注損傷、缺血性心臟病、腫瘤、肝纖維化、糖尿病并發(fā)癥、肺纖維化、慢性腎炎、慢性腎功能不全、阿爾茨海默病。
文檔編號A61P11/00GK1839819SQ200610008478
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者滕厚雷, 吳巍, 邵萌, 韓非, 于翠翠, 翟大偉 申請人:?？诰G科南藥研究開發(fā)有限公司