專利名稱：丁公藤提取物、含有該提取物的藥物組合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丁公藤提取物，具體地說，是以藥材丁公藤為原料制備的提取物。
背景技術(shù)：
青光眼是一種多元性的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜病變，全世界大約有700萬病人因青光眼而失明。眼壓升高是青光眼發(fā)病過程中的主要危險因素。高眼壓可造成視神經(jīng)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡，視功能損害。降低眼壓是用于青光眼治療的唯一措施，它可減輕青光眼對視野的損害。目前臨床使用抗青光眼降眼壓的藥物有前列腺素類藥、腎上腺素β受體阻斷藥、腎上腺素α2受體興奮藥、碳酸酐酶抑制藥、縮瞳藥、腎上腺素類藥，此外，中草藥提取物中亦有報道治療青光眼的藥物，比如葛根素(puerarin)是葛根Pueraria lobata中提取的異黃酮類化合物，它是一種選擇性的β受體阻斷藥，包公藤堿A，是包公藤Erycibe obtuse folia莖中的提取物，是一種tropane堿，它不僅僅是縮瞳還是強效的降眼壓藥，又是乙酰膽堿受體的興奮劑。細(xì)胞肌纖干擾劑，胞克拉素Cytochalasins、依他尼酸、肌纖分解素、蛋白激酶抑制劑、大麻類藥等，均有治療青光眼的報道，幾乎涵蓋了各種不同的藥理治療機制，每類藥物都有其自身的特點，但也都有其不良反應(yīng)。目前大多數(shù)的藥物無法在各類型青光眼中收到同樣滿意療效，因此，尋找有效和不良反應(yīng)更少的新藥是十分必要的。
丁公藤具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛之功，含有東莨菪內(nèi)酯、東莨菪苷、咖啡酸、氯原酸、包公藤甲素等成分。臨床用于治療急慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、腰肌勞損等癥狀療效較好。目前已有報道包公藤甲素I(丁公藤堿II)是我國首先從旋花科丁公藤屬植物丁公藤Erycibe obtusifolia中分離得到的具有莨菪烷母核的新縮瞳藥，臨床上可治療青光眼。(王麗平，包公藤甲素及其類似物的縮瞳活性，中草藥，1992，23(4)，205～208)但是包公藤甲素是一種生物堿，不良反應(yīng)較大。也有含有原料丁公藤的眼用制劑“抗青膏”治療青光眼的報道(柏超然，自制三種中藥眼膏的組方應(yīng)用介紹，浙江省中醫(yī)院)。由于原料較多，除了丁公藤外，尚有檳榔、蜂蜜、鹽、猴棗散、冰片、麝香、蘆薈等，發(fā)揮藥效的成分復(fù)雜，且由于眼用劑型質(zhì)量要求高，不便于制劑，也不便于制劑的質(zhì)量控制，且該劑型為膏劑，使用、貯存易污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種降眼壓的眼用藥物組合物，本發(fā)明物的另一技術(shù)方案是提供了該藥物組合物的制備方法和用途。
本發(fā)明提供了丁公藤提取物，每克提取物中含有東莨菪內(nèi)酯8.3mg～20.4mg。
本發(fā)明提供了降眼內(nèi)壓的藥物組合物，它是由所述的丁公藤提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的眼用制劑。
所述的眼用制劑液體制劑、半固體制劑。
所述的固體制劑是眼膏劑、眼用膜劑、眼用凝膠劑；所述的液體制劑是滴眼液、緩釋滴眼液。
所述的液體制劑中每1ml含丁公藤提取物0.04～0.06g、東莨菪內(nèi)酯0.3～1.1mg。
所述的緩釋滴眼液是含有下述重量配比的丁公藤提取物原料及輔料制備而成丁公藤提取物0.02～0.08份、卡波姆0.03～0.08份、玻璃酸鈉0.01～0.06份。
進(jìn)一步地，所述的緩釋滴眼液含有下述重量配比的丁公藤提取物原料及輔料制備而成丁公藤提取物0.05份、卡波姆0.05份、玻璃酸鈉0.025份。
本發(fā)明提供了一種制備該藥物組合物的方法，它包括如下步驟a、將藥材丁公藤，加水煎煮，煎煮液過濾、濃縮；b、濃縮液用乙醇沉淀兩次，第一次使乙醇含量60％~80％，靜置，取上清液濾過，濾液回收乙醇，第二次使乙醇含量75％~90％，取上清液濾過，濾液回收乙醇，過濾；c、濾液加活性炭，煮沸脫色，過濾得丁公藤提取物；d、將c步驟制備的丁公藤提取物加上藥學(xué)上可接受的眼用制劑的輔料或輔助性成分制備成常用眼用制劑。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備治療青光眼的眼用藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備抗病毒、眼用止痛、鎮(zhèn)痛的藥物中的用途。
本發(fā)明藥物采用丁公藤為原料提取制備眼用制劑，臨床試驗證明，與丁公藤中的單一成分丁公藤堿II相比，藥效明顯優(yōu)于丁公藤堿II，對青光眼的治療，效果顯著，且毒性小，刺激性小，安全性高，質(zhì)量穩(wěn)定，可控性強，為臨床提供了一種新的選擇。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明藥物原料提取物的制備a、將8kg丁公藤切片洗凈，加水浸漬1h，煎煮2次，第1次3h，第2次2h，合并煎煮液過濾，濾液濃縮至約2000ml；b、濃縮液用乙醇沉淀2次，第1次加95％乙醇使乙醇含量75％，靜置24h，取上清液濾過，濾液回收乙醇，第2次加95％乙醇使乙醇含量85％，靜置24h，取上清液濾過，濾液回收乙醇，濾液加注射用水使成4000ml，靜置48h，過濾；c、濾液加活性炭20g，煮沸脫色10～15min，趁熱過濾，揮干，即得丁公藤提取物。
實施例2本發(fā)明藥物原料提取物的制備a、將8kg丁公藤切片洗凈，加水浸漬1h，煎煮2次，第1次3h，第2次2h，合并煎煮液過濾，濾液濃縮至約2000ml；b、濃縮液用乙醇沉淀2次，第1次加95％乙醇使乙醇含量80％，靜置24h，取上清液濾過，濾液回收乙醇，第2次加95％乙醇使乙醇含量90％，靜置24h，取上清液濾過，濾液回收乙醇，濾液加注射用水使成4000ml，靜置48h，過濾；c、濾液加活性炭20g，煮沸脫色5min，趁熱過濾，揮干。(即得丁公藤提取物)。
實施例3本發(fā)明藥物原料提取物的制備a、將8kg丁公藤切片洗凈，加水浸漬1h，煎煮2次，第1次3h，第2次2h，合并煎煮液過濾，濾液濃縮至約2000ml；b、濃縮液用乙醇沉淀2次，第1次加95％乙醇使乙醇含量60％，靜置24h，取上清液濾過，濾液回收乙醇，第2次加95％乙醇使乙醇含量75％，靜置24h，取上清液濾過，濾液回收乙醇，濾液加注射用水使成4000ml，靜置48h，過濾；c、濾液加活性炭20g，煮沸脫色5min，趁熱過濾，揮干。(即得丁公藤提取物)。
實施例4本發(fā)明藥物緩釋滴眼的制備用硼酸緩沖液調(diào)pH6.0～8.0左右，加蒸餾水，使每1ml中含丁公藤提取物0.05g、吐溫-80 0.1ml、苯氧乙醇0.005g、卡波姆0.05g、玻璃酸鈉0.025g、氯化鈉0.005g100℃流通蒸氣消毒45min，最后灌封濾液。
實施例5本發(fā)明藥物緩釋滴眼的制備制備方法同實施例1、4，只是用量有變化丁公藤提取物0.05g、吐溫-80 0.1ml、苯氧乙醇0.005g、卡波姆0.03g、玻璃酸鈉0.05g、氯化鈉0.006g實施例6本發(fā)明藥物緩釋滴眼的制備制備方法同實施例1、4，只是用量有變化丁公藤提取物0.04g、吐溫-80 0.08ml、苯氧乙醇0.007g、卡波姆0.07g、玻璃酸鈉0.01g、氯化鈉0.008g實施例7本發(fā)明藥物緩釋滴眼的制備制備方法同實施例1、4，只是輔料和用量均有變化丁公藤提取物0.05g、羥丙甲基纖維素0.07ml、聚乙烯吡咯烷酮0.01g、卡波姆0.07g、玻璃酸鈉0.01g、杜滅芬0.001g實施例8本發(fā)明藥物緩釋滴眼的制備制備方法同實施例1、4，只是輔料和用量均有變化丁公藤提取物0.05g、吐溫-800.09ml、聚乙烯吡咯烷酮0.02g、卡波姆0.04g、羥丙甲基纖維素0.03g、苯乙醇0.0008ml實施例9本發(fā)明藥物滴眼液的制備制備方法同實施例1、4，只是輔料和用量均有變化丁公藤提取物0.06g、吐溫-800.08ml、聚乙烯吡咯烷酮0.02g、卡波姆0.04g、苯乙醇0.001ml實施例10發(fā)明藥物滴眼液的制備丁公藤提取物0.05g、羥丙甲基纖維素0.05ml、聚乙烯吡咯烷酮0.01g、卡波姆0.07g、玻璃酸鈉0.01g、杜滅芬0.001g實施例11本發(fā)明藥物眼用凝膠的制備制備方法同實施例1、4，只是輔料和用量均有變化丁公藤提取物0.05g、羥丙甲基纖維素0.1ml、聚乙烯吡咯烷酮0.05g、卡波姆0.27g、玻璃酸鈉0.31g、杜滅芬0.002g實施例12本發(fā)明藥物眼用凝膠的制備制備方法同實施例1、4，只是輔料和用量均有變化丁公藤提取物0.06g、苯氧乙醇0.015g、卡波姆0.32g、玻璃酸鈉0.35g、氯化鈉0.006g、聚乙烯吡咯烷酮0.05g實施例13本發(fā)明藥物眼用制劑最佳配比篩選試驗取丁公藤提取物10g，用200ml注射用水加熱溶解，放冷，在攪拌狀態(tài)下加入不同量的卡波姆和玻璃酸鈉，定容至約250ml，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH值于5.0～9.0，用氯化鈉調(diào)滲透壓至等滲高滲。分別取以上藥液，做影響因素實驗(高溫實驗取藥液于潔凈容器中，密閉，60℃下放置10天；強光實驗將藥液置于潔凈透明的容器中，于光照儀器中用(4500±500)lx的條件下放置10天；分別于第5、10天取樣，觀察性狀、澄明度，檢測含量、pH值)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入10g卡波姆以及5g玻璃酸鈉的樣品，性狀、澄明度最好，并且含量以及pH沒有較大的變化，可以看出，丁公藤提取物0.05份、卡波姆0.05份、玻璃酸鈉0.025份為最佳的配方量。
篩選試驗數(shù)據(jù)如下



實施例本發(fā)明藥物的質(zhì)量控制一、本發(fā)明藥物提取物的質(zhì)量控制本發(fā)明在定性上，以丁公藤對照藥材為對照，對丁公藤提取物進(jìn)行薄層色譜鑒別；在檢查上，增加了對重金屬不得過百萬分之二十的限量檢查；在定量上，采用高效液相色譜法以東莨菪內(nèi)酯為對照品對丁公藤提取進(jìn)行定量，丁公藤提取物每1g含東莨菪內(nèi)酯(C10H804)8.3mg～20.4mg。
定性鑒別取丁公藤提取物0.1g，加乙醇50ml，加熱回流1小時，濾過，濾液濃縮至約2ml，得供試品溶液。另取丁公藤對照藥材2.0g，同法制備對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(17∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。
含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性以C18烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，以甲醇-水-冰醋酸(32∶68∶0.18)為流動相，檢測波長為298nm。理論板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯峰計不低于2000。
對照品溶液的制備 精密稱取東莨菪內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成每1ml中含東莨菪內(nèi)酯50ug的溶液，即得。
供試品溶液的制備 取按實施例1方法制備的本發(fā)明藥物原料提取物0.1g，精密稱定，加3mol/l的鹽酸溶液30ml，置水浴上加熱水解1小時，立即冷卻，移入分液漏斗中，用水20ml分次洗滌容器，并入分液漏斗中，加氯化鈉2g，用氯仿強力振搖提取5次，每次15ml，合并氯仿液，加無水硫酸鈉2g，攪拌，濾過，濾液置70℃水浴上蒸至近干，立即加甲醇使溶解，移至25ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取濾液，即得。
測定法精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定即得。
依法測定6批提取物中東莨菪內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表1。
表16批提取物中東莨菪內(nèi)酯的含量

結(jié)果表明，本品每克丁公藤提取物中含有東莨菪內(nèi)酯8.3mg～20.4mg。
二、本發(fā)明藥物的質(zhì)量控制鑒別本品分別以丁公藤對照藥材、東莨菪堿內(nèi)酯對照品為對照對本品進(jìn)行薄層鑒別。
(1)取實施例4的方法制備的眼用制劑1ml，置具塞試管中，加水10ml、鹽酸3ml，混勻，置水浴中水解4小時，取出，放冷，移入分液漏斗中，試管用水洗滌4次，每次3ml，洗滌液并入分液漏斗中，加氯化鈉3g，振搖使溶解，用氯仿提取4次(20、20、10、10ml)，合并提取液，加無水硫酸鈉2g，搖勻，放置1小時以上，濾過，無水硫酸鈉用氯仿洗滌4次，每次5ml，洗滌液與濾液合并，蒸干，殘渣加適量丙酮使溶解，移至5ml量瓶中，用少量丙酮洗滌容器，并入同一量瓶中，加丙酮至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取東莨菪內(nèi)酯對照品，加丙酮制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VB)試驗，吸取對照品溶液及供試品溶液各4μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙醚-冰醋酸(10∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(2)取實施例4的方法制備的眼用制劑作為供試品溶液。另取丁公藤對照藥材2.0g，加乙醇50ml，加熱回流1小時，濾過，濾液濃縮至約2ml，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(17∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。
含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性以C18烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，以甲醇-水-冰醋酸(32∶68∶0.18)為流動相，檢測波長為298nm。理論板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯峰計不低于2000。
對照品溶液的制備 精密稱取東莨菪內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成每1ml中含東莨菪內(nèi)酯50ug的溶液，即得。
供試品溶液的制備 精密量取實施例4的方法制備的眼用制劑1ml，加3mol/l的鹽酸溶液10ml，置水浴上加熱水解1小時，立即冷卻，移入分液漏斗中，用水20ml分次洗滌容器，并入分液漏斗中，加氯化鈉2g，用氯仿強力振搖提取5次，每次15ml，合并氯仿液，加無水硫酸鈉2g，攪拌，濾過，濾液置70℃水浴上蒸至近干，立即加甲醇使溶解，移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
測定法精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定，即得。
依法測定10批中試樣品樣品中東莨菪內(nèi)酯的含量。結(jié)果見表2。
表210批中試樣品樣品中東莨菪內(nèi)酯的含量

結(jié)果表明，本發(fā)明每1ml含東莨菪內(nèi)酯0.3～1.1mg。
以下通過藥效學(xué)試驗證明本發(fā)明的有益效果。
試驗例1本發(fā)明藥物緩釋滴眼液對家兔眼壓和瞳孔的影響一、實驗材料藥品(1)本發(fā)明藥物緩釋滴眼液(由實施例2制備，用法用量為滴眼，每日3～5次，每次1～2滴)，(2)復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液(由易舒特藥業(yè)出品，批號200408)。
二、實驗動物成年健康大白兔24只，雌雄不限，體重2.40±0.1kg(由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物試驗中心提供)。
三、實驗方法1.高眼壓家兔兔模型的制備和眼內(nèi)壓測定高眼壓家兔模型的建立健康家兔12只，隨機分為2組，每組6只。第1組為本發(fā)明藥物緩釋滴眼液組，第2組為復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液組。在試驗前使動物適應(yīng)實驗室環(huán)境和眼壓的測定，以匹羅卡品縮瞳，靜注2％戊巴比妥鈉(約30mg/kg)全麻后由眼顳側(cè)角膜緣內(nèi)2mm處刺入前房，抽前房水；再經(jīng)縮小的瞳孔和虹膜與品體之間進(jìn)入鼻側(cè)后房，抽后房水，換針管以后向后房水注入1∶200α-糜蛋白酶0.2ml。每天檢測眼壓，于第三天左眼分別滴入測試藥液2滴(約0.1mL)，右眼滴同量的生理鹽水作為對照。用壓陷式眼壓計測量滴藥后15，30，60，120及180min的眼壓。
2.對瞳孔直徑的影響健康家兔12只，兩眼外觀正常，隨機將兔分為2組，每組6只。第1組家兔左眼滴本發(fā)明藥物緩釋滴眼液，右眼滴生理鹽水對照；第2組家兔左眼滴復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液，右眼滴生理鹽水對照。將兔置于兔盒，各組分別滴上述藥物或生理鹽水2滴(約0.1mL)，被動閉眼10s。實驗室內(nèi)采用日光燈照明，光強度恒定，用瞳孔測量儀準(zhǔn)確測量滴藥后15，30，60，120及180min的瞳孔直徑。
統(tǒng)計學(xué)處理用藥前后用配對t檢驗，組間比較用t檢驗。
實驗結(jié)果1.本發(fā)明藥物緩釋滴眼液和復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液滴眼的縮瞳作用用藥組在滴藥后15min瞳孔均縮小，與滴藥前比較差異都有非常顯著意義(P＜0.01)；在滴藥后120min，與滴藥前比較仍有顯著差異(P＜0.05)；至180min時，瞳孔直徑基本恢復(fù)正常(P＞0.05)。本發(fā)明藥物緩釋滴眼液和復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液的組間比較，經(jīng)t檢驗，最大縮瞳作用相接近，差異無顯著意義(P＞0.05)。見表3。
表3本發(fā)明藥物滴眼液對家兔瞳孔直徑的影響(n＝6，x±s)

注兩組用藥前后配對t檢驗aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01。本發(fā)明藥物緩釋滴眼液與復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液給藥組間比較經(jīng)t檢驗dP＞0.05。給藥組與對照組比較，經(jīng)t檢驗gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01。
2.本發(fā)明藥物緩釋滴眼液和復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液對眼壓的作用比較高壓眼前，各組基礎(chǔ)眼壓值之間無明顯差異，為3.0～3.3kPa。高壓眼3天后，對照組眼壓即明顯升高，30min時，眼壓升至4.5kPa(P＜0.01)，之后眼壓逐漸下降，2h后基本恢復(fù)正常水平。在本發(fā)明藥物緩釋滴眼液和復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液后較對照組眼壓明顯下降，用藥后30～120min各時點，眼壓下降與對照組比較，均有非常明顯差異(P＜0.01)。本發(fā)明藥物滴眼液和復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液的眼壓變化比較，經(jīng)t檢驗，無明顯差異(P＞0.05)。見表4。
表4本發(fā)明藥物滴眼液對高壓眼兔眼壓的影響(n＝6，x±s)

注兩組用藥前后配對t檢驗aP＞0.05，bP＜0.05，cP＜0.01。本發(fā)明藥物緩釋滴眼液與復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液給藥組間比較經(jīng)t檢驗dP＞0.05。給藥組與對照組比較，經(jīng)t檢驗gP＞0.05，hP＜0.05，iP＜0.01。
該實施證明本發(fā)明藥物與化合物類藥復(fù)方噻嗎洛爾滴眼液有相同的藥效。
試驗例2本發(fā)明藥物緩釋滴眼液對兔實驗性急性高眼壓模型視網(wǎng)膜谷氨酸的影響一、藥品本發(fā)明藥物緩釋滴眼液(由實施例2制備，用法用量為滴眼，每日3～5次，每次1～2滴)。
二、動物成年健康大白兔(中國家兔)18只，雌雄不限，體重1.4～2.1kg(由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物試驗中心提供)。術(shù)前眼壓7～22mmHg(1mmHg＝0.133kPa)，平均(12.56±3.37)mmHg(日本Kowa公司Perkins眼壓計測量)。
三、方法1.分組大白兔18只，共分3組，每組間術(shù)前眼壓無差異。實驗1組6只兔。采用生理鹽水前房內(nèi)持續(xù)灌注法，將每只兔的1只眼眼壓升高至60mmHg；另1只眼作為對照，維持灌注眼壓20mmHg。實驗2組6只兔。每只兔的1只眼維持灌注眼壓30mmHg，對側(cè)眼維持眼壓20mmHg作為對照，處理方法同實驗1組。正常對照組6只兔(6只眼)。
2.動物模型制備動物稱重，耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉(約1ml/kg)，隨機選1只眼作為高眼壓灌注眼，用5號靜脈輸液針頭行前房穿刺，輸液器接生理鹽水，血壓計加壓維持所需眼壓，持續(xù)4h。正常對照組作為空白對照，不作前房灌注，也不需麻醉。
3.檢測樣品制備擊頭處死動物，迅速取出眼球置培養(yǎng)皿中，于放大鏡下冰上操作，沿角膜緣切開眼球，去晶狀體及玻璃體；無水酒精固定0.5min，輕輕剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜，濾紙吸干酒精，稱重，置勻漿器內(nèi)，加1ml無水酒精，冰上勻漿，至乳糜狀。轉(zhuǎn)入eppendrof管，4℃，15000r/min離心30min。取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.檢測方法采用鄰苯二甲醛柱前衍生法[1]，高效液相色譜儀與熒光光度檢測器測定樣品中的氨基酸。通過標(biāo)準(zhǔn)品的測定，采用外算法根據(jù)氨基酸的色譜峰面積計算樣品中的谷氨酸含量。
四、統(tǒng)計學(xué)處理采用t檢驗。
結(jié)果實驗1組視網(wǎng)膜谷氨酸含量測定(表5)60mmHg灌注眼為(65.51±18.45)10-5mmol/g，20mmHg灌注眼為(42.02±22.45)10-5mmol/g，二者差異有顯著性(P＜0.05)。
表53組兔視網(wǎng)膜谷氨酸含量比較

*組內(nèi)比較，P＜0.05實驗2組視網(wǎng)膜谷氨酸含量測定
30mmHg灌注眼為(68.67±32.65)10-5mmol/g，20mmHg灌注眼為(38.38±13.42)10-5mmol/g，二者差異亦有顯著性(P＜0.05)。
試驗結(jié)果顯示，在灌注眼壓為60mmHg和30mmHg時，視網(wǎng)膜的谷氨酸含量明顯高于對側(cè)自身對照眼(20mmHg壓力灌注)，直接說明兔急性高眼壓模型視網(wǎng)膜谷氨酸水平明顯增高，證實谷氨酸參與了高眼壓對視網(wǎng)膜的損傷。盡管眼壓僅30mmHg左右，EAAs水平仍處于上升狀態(tài)，對視網(wǎng)膜仍有可能造成興奮性毒素作用，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的死亡。在60mmHg和30mmHg組之間未見顯著差異，說明其量效關(guān)系不明顯。但30mmHg顯然是引起視網(wǎng)膜谷氨酸升高的閾上值。
試驗例3本發(fā)明藥物緩釋滴眼液對家兔多次給藥眼刺激性試驗藥物(1)本發(fā)明藥物緩釋滴眼液(由實施例2制備，用法用量為滴眼，每日3～5次，每次1～2滴)，(2)氯化鈉注射液四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司，批號04091131。
動物家兔，一級，體重2.1～2.5kg，雌雄兼用。由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供。
試驗方法(1)分組選擇角膜、虹膜和結(jié)膜均正常無病變的家兔6只。采用同體自身對照方法。于家兔右眼滴入本發(fā)明藥物緩釋滴眼液，0.1mL/眼/次，4次/天；以家兔左眼滴入氯化鈉注射液0.1mL/眼/次，4次/天作對比觀察。將本發(fā)明藥物緩釋滴眼液和氯化鈉注射液分別滴入家兔兩側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，每次滴藥后使家兔眼睛被動閉合10s，以便使藥物充分接觸眼睛各部位(角膜、虹膜、球結(jié)膜、瞼結(jié)膜)，連續(xù)給藥1周(7天)，逐日觀察，并于停藥后再觀察1周(7天)。
(2)觀察檢查指標(biāo)眼刺激反應(yīng)程度每天給藥4次，每2小時給藥1次，分別于每次給藥前按眼刺激評分標(biāo)準(zhǔn)綜合評分，即在每天第1次給藥前、2小時、4小時、6小時用放大鏡檢查雙眼并分別記錄眼刺激反應(yīng)程度。停藥后1周內(nèi)每日觀察雙眼并記錄眼刺激反應(yīng)程度。
眼刺激反應(yīng)程度評分標(biāo)準(zhǔn)及評價標(biāo)準(zhǔn)分別按表6、7進(jìn)行
表6眼刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表7眼刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)

試驗結(jié)果結(jié)果見表8
表8本發(fā)明藥物緩釋滴眼液多次用藥對家兔眼睛的刺激性程度(x±s)

從表8可見，以本發(fā)明藥物緩釋滴眼液對家兔右眼每天多次(4次/天)滴眼，連續(xù)應(yīng)用1周及停藥觀察1周內(nèi)，分別與家兔左眼滴入氯化鈉注射液后比較觀察，在用藥的第2天至第4天內(nèi)，某些時段可見本發(fā)明藥物緩釋滴眼液對部分家兔眼睛有極其輕微的刺激性反應(yīng)，其刺激性強度為0.17～0.83分。按照藥物對眼刺激性評分標(biāo)準(zhǔn)判定，其刺激性強度均在0～3.9分之內(nèi)，屬于“無刺激性”。說明本發(fā)明藥物緩釋滴眼液多次應(yīng)用對眼睛無刺激性。
試驗例4本發(fā)明藥物緩釋滴眼液與丁公藤堿II滴眼液藥效學(xué)試驗比較一、實驗材料藥品(1)本發(fā)明藥物緩釋滴眼液(由成都三明藥物研究所研制，批號040803，用法用量為滴眼，每日3～5次，每次1～2滴)，(2)丁公藤堿II滴眼液(由成都三明藥物研究所配置成以下三種濃度0.25％、0.05％、0.01％[2]用法用量同本發(fā)明藥物緩釋滴眼液)二、實驗動物成年健康大白兔24只，雌雄不限，體重2.40±0.1kg(由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物試驗中心提供)。
三、實驗方法將角膜結(jié)膜均正常的家兔分為4組，平均每組6只，分別為(1)本發(fā)明藥物緩釋滴眼液組、(2)丁公藤堿II滴眼液高劑量組、(3)丁公藤堿II滴眼液中劑量組、(4)丁公藤堿II滴眼液低劑量組。將家兔固定在兔箱中安靜休息1h，分別用0.04％Novesin點眼后局部麻醉，檢測眼壓和瞳孔，每次測量3次，取平均值。分別在左眼點受試藥，右眼點入同劑量的生理鹽水，點藥后1h，再測量雙側(cè)眼壓和瞳孔，進(jìn)行自身對照和組間比較。
四、試驗結(jié)果見表9
表9本發(fā)明藥物滴眼液和丁公藤堿II滴眼對家兔瞳孔直徑和眼內(nèi)壓的影響(n＝6，x±s)

注P1為同組左右眼比較，P2為2、3、4組分別與1組比較；*P＜0.05，有差異，**P＜0.01有顯著差異。
由表9可見，上述試驗是基于與單一活性成分丁公藤堿II的藥效對比，試驗證明本發(fā)明藥物緩釋滴眼液和丁公藤堿II滴眼均有顯著的縮瞳和降低眼內(nèi)壓的作用，并且本發(fā)明藥物緩釋滴眼液降眼壓和縮瞳作用效果大大優(yōu)于丁公藤堿II滴眼液。且本發(fā)明藥物提取工藝簡單，成本低，臨床使用明顯優(yōu)于單一活性成分，為臨床提供了一種新的選擇。
權(quán)利要求
1.丁公藤提取物，其特征在于每克提取物中含有東莨菪內(nèi)酯8.3mg～20.4mg。
2.一種降眼內(nèi)壓的藥物組合物，它是由有效量的權(quán)利要求1所述的丁公藤提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的眼用制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降眼壓的藥物組合物，其特征在于所述的眼用制劑液體制劑、半固體制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的降眼壓的藥物組合物，其特征在于所述的固體制劑是眼膏劑、眼用膜劑、眼用凝膠劑；所述的液體制劑是滴眼液、緩釋滴眼液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的降眼壓的藥物組合物，其特征在于所述的液體制劑中每1ml含丁公藤提取物0.04～0.06g，其中含東莨菪內(nèi)酯0.3～1.1mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降眼壓的藥物組合物，其特征在于所述的緩釋滴眼液是含有下述重量配比的丁公藤提取物原料及輔料制備而成丁公藤提取物0.02～0.08份、卡波姆0.03～0.08份、玻璃酸鈉0.01～0.06份。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的降眼壓的藥物組合物，其特征在于所述的緩釋滴眼液含有下述重量配比的丁公藤提取物原料及輔料制備而成丁公藤提取物0.05份、卡波姆0.05份、玻璃酸鈉0.025份。
8.一種制備權(quán)利要求2-7任一項所述的降眼壓的藥物組合物的方法，它包括如下步驟a、將藥材丁公藤，加水煎煮，煎煮液過濾、濃縮；b、濃縮液用乙醇沉淀兩次，第一次使乙醇含量60％～80％，靜置，取上清液濾過，濾液回收乙醇，第二次使乙醇含量75％～90％，取上清液濾過，濾液回收乙醇，過濾；c、濾液加活性炭，煮沸脫色，過濾，干燥得丁公藤提取物；d、將c步驟制備的丁公藤提取物加上藥學(xué)上可接受的眼用制劑的輔料或輔助性成分制備成常用眼用制劑。
9.權(quán)利要求2-7任一項所述的藥物組合物在制備治療青光眼的眼用藥物中的用途。
10.權(quán)利要求2-7任一項所述的藥物組合物在制備抗病毒、眼用止痛、鎮(zhèn)痛的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種丁公藤提取物，每克提取物中含有東莨菪內(nèi)酯8.3mg～20.4mg。本發(fā)明還提供了含有丁公藤提取物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法和用途。本發(fā)明藥物采用丁公藤為原料提取制備眼用制劑，藥理試驗證明，與丁公藤中的單一成分丁公藤堿Ⅱ相比，藥效明顯優(yōu)于丁公藤堿Ⅱ，對青光眼的治療，效果顯著，且毒性小，刺激性小，安全性高，質(zhì)量穩(wěn)定，可控性強，為臨床提供了一種新的選擇。
文檔編號A61P27/06GK1830462SQ20061000848
公開日2006年9月13日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者陽向波, 謝永平, 李慧琴, 鄭娟 申請人:成都三明藥物研究所