專利名稱：棕點湍蛙抗微生物多肽及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棕點湍蛙抗微生物多肽及其在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從抗生素發(fā)明以來，人類在控制和治療微生物感染疾病中取得了較大的成就。但隨著“傳統(tǒng)抗生素”的持續(xù)使用，不斷產(chǎn)生出諸多新問題。目前，微生物抗藥性已成為臨床微生物感染疾病治療的重大問題，以至于某些病原細(xì)菌已沒有臨床治療的一線藥物。萬古霉素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性感染疾病目前均是世界范圍內(nèi)的臨床難題，三類主要引起腦膜炎的細(xì)菌在臨床上也出現(xiàn)了強(qiáng)的抗藥性，抗青霉素、氯霉素腦膜炎雙球菌、肺炎球菌，對抗新頭孢菌素抗生素的肺炎球菌也廣泛出現(xiàn)。因此新一類抗生素的研制已成為當(dāng)務(wù)之急和國際上的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性如在最小作用濃度時，快速而廣譜地殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)；對真菌也有抑制作用；不會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生；對于拒不感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗菌劑，其研制已受到廣泛重視。
很多兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點。據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進(jìn)入臨床治療。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入三期臨床；Intrabiotics公司生產(chǎn)的活性多肽IB-367已獲準(zhǔn)用于治療癌癥病人因多種細(xì)菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗；Applied Microbiology公司與Astra公司合作用活性多肽nisin治療胃潰瘍的臨床試驗也取得良好的療效。我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對其皮膚活性肽類物質(zhì)研究不多。在我國，棕點湍蛙(Amolops loloensis)主要分布于四川、云南省，是我國特色資源動物之一，如何更合理地開發(fā)利用這一特色資源造福于人類，是業(yè)內(nèi)人士面臨的共同課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的棕點湍蛙抗微生物多肽。
本發(fā)明的目的還在于提供一種棕點湍蛙抗微生物多肽的應(yīng)用，特別是其在制備病原微生物感染疾病的治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的。利用乙醚刺激棕點湍蛙，收集其皮膚分泌液，經(jīng)離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)一系列的生物化學(xué)手段分離純化得到一種多肽，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)，根據(jù)所得到的氨基酸序列合成該多肽。采用飛行時間質(zhì)譜法測定分子量，等電聚焦測定等電點，自動氨基酸測序儀確認(rèn)氨基酸序列結(jié)構(gòu)，本發(fā)明提供的是一種單鏈多肽，并將其命名為棕點湍蛙抗微生物多肽，分子量2667.34道爾頓，等電點8.86，多肽全序列為苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—甲硫氨酸—亮氨酸—丙氨酸—甘氨酸—亮氨酸—丙氨酸—丙氨酸—天冬酰胺—苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—谷氨酸—亮氨酸—苯丙氨酸—半胱氨酸—賴氨酸—異亮氨酸—蘇氨酸—賴氨酸—賴氨酸—半胱氨酸；或表示為Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Glu Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys20發(fā)明人將本發(fā)明的棕點湍蛙抗微生物多肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。
本發(fā)明的棕點湍蛙抗微生物多肽是從天然生物資源得到的產(chǎn)物，實驗證明其具有顯著的抑制細(xì)菌生長的作用，可以作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物被應(yīng)用。
本發(fā)明利用我國自然資源，為制備病原微生物感染疾病的治療藥物提供了新的選擇。
具體實施例方式
下面的實施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實施例一、棕點湍蛙抗微生物多肽的制備將捕于我國四川省的兩棲類動物活體棕點湍蛙用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從棕點湍蛙皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥后保存。詳細(xì)制備過程為第一步，Sephadex G-50凝膠過濾柱層析，按上述方法獲得的原材料棕點湍蛙皮膚分泌液凍干粉300mg溶解于5ml純凈水，10000rpm 4℃離心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝膠過濾柱(長1000mm，直徑26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0緩沖液平衡，充分后將樣品上于該柱。用同樣緩沖液洗脫，收集活性峰。
第二步，反相高壓液相色譜為Sephadex G-50凝膠過濾得到的活性成分的峰上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(長300mm，直徑5mm)用含1‰三氟乙酸的乙腈緩沖液從0％至100％的梯度洗脫。收集具有抗菌作用的活性峰。
第三步，純化的棕點湍蛙抗微生物多肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用飛行時間質(zhì)譜法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過上述方法制備的棕點湍蛙抗微生物多肽是一種單鏈多肽，分子量2667.34道爾頓，等電點8.86，多肽全序列為苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—甲硫氨酸—亮氨酸—丙氨酸—甘氨酸—亮氨酸—丙氨酸—丙氨酸—天冬酰胺—苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—谷氨酸—亮氨酸—苯丙氨酸—半胱氨酸—賴氨酸—異亮氨酸—蘇氨酸—賴氨酸—賴氨酸—半胱氨酸；或表示為Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Glu Leu1 5 10 15Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys20將上述棕點湍蛙抗微生物多肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比較，末發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。
二、棕點湍蛙抗微生物多肽抑制細(xì)菌生長的作用實驗抗菌活性檢測，采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個。第一個鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1。
表1棕點湍蛙抗微生物多肽抑制細(xì)菌生長的作用


由表1可見，棕點湍蛙抗微生物多肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長的作用，表明其可以用于制備病原微生物感染疾病的治療藥物被應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種棕點湍蛙抗微生物多肽，其特征在于該多肽是從棕點湍蛙中分離得到的一種單鏈多肽，分子量2667.34道爾頓，等電點8.86，多肽全序列為苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-賴氨酸-半胱氨酸。
2.如權(quán)利要求1所述的棕點湍蛙抗微生物多肽的應(yīng)用，其特征在于用于制備病原微生物感染疾病的治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棕點湍蛙抗微生物多肽及其在制藥中的應(yīng)用。通過生物化學(xué)手段，從棕點湍蛙皮膚分泌液中分離純化得到抗微生物多肽，并測定其序列，按照所得的序列合成該多肽。本發(fā)明的棕點湍蛙抗微生物多肽是一種單鏈多肽，分子量2667.34道爾頓，等電點8.86，多肽全序列為苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—甲硫氨酸—亮氨酸—丙氨酸—甘氨酸—亮氨酸—丙氨酸—丙氨酸—天冬酰胺—苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸—谷氨酸—亮氨酸－苯丙氨酸—半胱氨酸—賴氨酸—異亮氨酸—蘇氨酸—賴氨酸—賴氨酸—半胱氨酸。本發(fā)明的多肽具有顯著的抑制細(xì)菌生長的作用，可用于制備病原微生物感染疾病的治療藥物。
文檔編號A61K38/17GK1827641SQ200610012608
公開日2006年9月6日 申請日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者劉敬澤, 梁建國 申請人:河北師范大學(xué)