專利名稱：小干擾rna與單壁碳納米管復合物及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及單壁碳納米管(SWNTs)作為生物材料的應用，特別是一種小干擾RNA與單壁碳納米管復合物及制備方法和應用。小干擾RNA(siRNA)與單壁碳納米管復合物(siRNA:SWNTs+)可導入腫瘤細胞和免疫調節(jié)細胞如樹突細胞，用于檢測其對腫瘤細胞生長的影響以及免疫調節(jié)的功能，此發(fā)明具有潛在的臨床治療應用價值。
背景技術：
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)特異性地抑制其互補基因表達的一種現(xiàn)象。小干擾RNA(small interfering dsRNA，siRNA)可以介導基因沉默，可以用于哺乳動物細胞干涉RNA的表達，從而影響靶基因的功能。RNA干涉治療是最近幾年發(fā)展的能使靶基因滅活的最具潛力的遺傳治療方法。端粒酶反轉錄酶是保持染色體結構穩(wěn)定的關鍵酶，在細胞增殖過程中起關鍵作用。端粒酶反轉錄酶能在有增殖能力的細胞內檢測到，尤其是各種腫瘤細胞。在正常的體細胞很難發(fā)現(xiàn)。因此端粒酶反轉錄酶的小分子抑制劑或端粒酶反轉錄酶表達的降低為靶向性腫瘤細胞治療提供了可能。早在1995年，F(xiàn)eng et al.(1995，Science，269(5228)，1236-1241)用抗端粒酶反轉錄酶mRNA導致了Hela細胞的死亡。
盡管有一些脂質體類轉染試劑和電穿孔方法可以轉染siRNA，但這些試劑一般轉染效率低而且不穩(wěn)定。為了取得安全有效的siRNA干擾治療，急切需要一個能使siRNA保持穩(wěn)定，進入細胞，并且能夠體內應用的siRNA載體轉染方法。有效的siRNA載體導入細胞方法能夠潛在的發(fā)揮治療效果。但到目前為止還沒有一種有效的能夠體內應用的siRNA載體，這就嚴格限制了siRNA作為藥物治療的應用。
單壁碳納米管(SWNTs)的各項優(yōu)異的性能不僅使其在電子、航空、航天、機械、能源等領域擁有廣泛的應用潛力，最近其在生物領域的一些應用也顯示了它們潛在的功能，氧化的SWNTs可以在它們的羥基或羧基部分連接蛋白質，多肽，DNA，寡核苷酸，糖基等生物大分子。由于功能化的SWNTs可以進入哺乳動物細胞并且沒有明顯毒性，所以SWNTs可以用作一些分子進入細胞的載體，如可作為各種藥物傳遞的載體，尤其可以用作具有疫苗傳遞等有臨床治療作用的載體。最近研究發(fā)現(xiàn)功能化的SWNTs可以連接siRNA因分子。Dai Hongjie等人(J.Am.Chem.Soc.2005，127，6021-6026.PNAS，2005，102，11600-11605.J.Am.Chem.Soc.2005，127，12492-12493.)利用一種帶有氨基的聚乙烯醇2000磷脂分子先對SWNTs進行包裹，得到分散性能很好的SWNTs，再用一種雙官能團偶合劑連接siRNA，這種復合物能夠進入細胞降低腫瘤細胞中特定基因的表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種小干擾RNA與單壁碳納米管復合物及制備方法和應用，可以克服現(xiàn)有siRNA的載體毒性高，轉染效率低且不穩(wěn)定，不具備臨床應用價值等方面的不足。本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管的復合物采用正電荷功能化的單壁碳納米管作為siRNA的載體，提供一種低毒高效的siRNA轉染劑，將siRNA傳遞入細胞，包括腫瘤細胞和免疫調節(jié)細胞，從而達到抑制腫瘤細胞生長和免疫調節(jié)的目的。其特點是利用碳納米管的納米級尺寸、可進行多種功能化使其可被吞噬細胞吞噬或穿透細胞膜進入細胞內部的特點。通過兩方面的功能加以證明其一端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物降低端粒酶反轉錄酶的mRNA(信使RNA)水平，降低它們的活性與表達，最終導致腫瘤細胞死亡。其二利用免疫分子基因siRNA與SWNTs結合導入免疫調節(jié)細胞如樹突細胞，以沉默樹突細胞中的靶基因，調節(jié)其免疫功能。本發(fā)明能有效的將siRNA導入細胞沉默基因。因此，SWNTs可作為一種高效的siRNA轉染劑和載體，顯示了其在基因治療或基因干涉等方面的應用前景。
本發(fā)明提供的一種小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的結構表示為siRNA:SWNTs+，它是用Boc-保護的二元胺通過共價鍵連接到SWNTs，使其成鹽帶有正電荷，再與帶有負電性的siRNA通過靜電相互作用構成的復合物。
所述的單壁碳納米管是直徑為1.0～2.0nm，長度為10nm～100μm的單壁碳納米管。
所述的二元胺是C2～C20的二元胺中的至少一種。優(yōu)選丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和十二二胺。
所述的siRNA是端粒酶反轉錄酶siRNA或免疫刺激分子CD80siRNA。
端粒酶反轉錄酶的siRNA的(根據(jù)Ambion提供的設計程序進行)特殊靶序列是AACAGATCAAGAGCAGTAGTC和AATATGTCAGACTCCTCAGGT；CD80siRNA特殊的靶序列是AACTGTCCAAGTCAGTGAAAG和AAGTGTGGCCCGAGTATAAGA。
本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的制備方法包括如下步驟1)SWNTs的純化、切割和氧化采用在硝酸或鹽酸中超聲并回流的方法純化，然后用表面活性劑Triton-X洗滌，SWNTs進一步用混酸切割氧化，在(硝酸∶硫酸＝1∶3)中超聲一定時間。
2)將二元胺用Boc-保護(或不進行保護)，然后與酰氯化的SWNTs進行反應，再脫掉Boc-保護并成鹽(或不用脫保護，加酸成鹽)，得到胺鹽功能化的SWNTs，再將siRNA與功能化的單壁碳納米管相互作用。
本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的制備方法包括如下具體步驟1)將SWNTs(采用電弧法制備)在2.6M硝酸或濃鹽酸中超聲分散1h，并回流24h，離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化后的SWNTs在混酸(濃硝酸∶濃硫酸＝1∶3)中超聲5h，水洗去酸液。
2)在氬氣保護下將(Boc)2O加入至二胺溶液中反應8h，室溫攪拌3天，得Boc-CnH2nNH2。(Boc)2O與二胺的摩爾比是1∶7.5。
3)步驟2)得到的SWNTs加入到混合溶劑二氯亞砜和DMF(體積比20∶1)中，SWNTs濃度約為5mg/mL，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥，得到酰氯化的SWNTs-COCl。
4)Boc-CnH2nNH2與SWNTs-COCl(重量比是100∶1)，在DMF溶劑中，氬氣保護下90℃反應96h，反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥，得到SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc。
5)冰水浴和Ar保護條件下，二噁烷為溶劑，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc反應，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc的重量比約為16∶1，撤去冰水浴，室溫反應1h，離心除去反應液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次，室溫下干燥產(chǎn)品，得到SWNTs+。
6)SWNTs+在水溶液中超聲分散，室溫下與siRNA孵育1小時，然后水洗兩次，得到siRNA:SWNTs+復合物，通過電子能譜、分光光度計或電鏡分析表征。
本發(fā)明提供的小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的應用是1)以siRNA為靶向端粒酶反轉錄酶的基因序列，siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤細胞生長抑制功能的檢測。
2)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物進入腫瘤細胞導致端粒酶反轉錄酶RNA水平的降低，降低端粒酶反轉錄酶的活性和抑制蛋白質的表達。
3)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物進入腫瘤細胞抑制腫瘤細胞的生長與繁殖。
4)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物直接注入腫瘤組織導致腫瘤細胞的死亡。
5)以siRNA靶向免疫刺激分子CD80，進行免疫調節(jié)細胞功能的檢測。
6)將CD80siRNA:SWNTs+復合物與成熟和未成熟的樹突細胞孵育，抑制細胞內CD80的表達，降低CD80mRNA的水平。
7)將CD80siRNA:SWNTs+注入小鼠體內，抑制免疫調節(jié)Gr-1+CD11b+細胞CD80的表達。
本發(fā)明小干擾RNA與單壁碳納米管的復合物采用正電荷功能化的單壁碳納米管作為siRNA的載體，提供一種低毒高效的siRNA轉染劑，將siRNA傳遞入細胞，包括腫瘤細胞和免疫調節(jié)細胞，從而達到抑制腫瘤細胞生長和免疫調節(jié)的目的。其特點是利用單壁碳納米管的納米級尺寸、可進行多種功能化使其可被吞噬細胞吞噬或穿透細胞膜進入細胞內部的特點。通過兩方面的功能加以證明其一端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物降低端粒酶反轉錄酶的mRNA(信使RNA)水平，降低它們的活性與表達，最終導致腫瘤細胞死亡。其二利用免疫分子基因siRNA與SWNTs結合導入免疫調節(jié)細胞如樹突細胞，以沉默樹突細胞中的靶基因，調節(jié)其免疫功能。本發(fā)明能有效的將siRNA導入細胞沉默基因。因此，SWNTs可作為一種高效的siRNA轉染劑和載體，顯示了其在基因治療或基因干涉等方面的應用前景。
總之，所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的應用，它用作檢測和治療腫瘤細胞生長或其它細胞系的試劑，以及用作調節(jié)免疫功能或治療免疫相關疾病試劑。
本發(fā)明的具體特點是1)單壁碳納米管是一種優(yōu)良的納米級材料，可以進行多種功能化，通過Boc-保護的二元胺功能化再成鹽后能得到分散性能較好的SWNTs。
2)siRNA等不易進入細胞內的物質可通過與碳納米管結合的方法有效進入細胞。
3)siRNA等不穩(wěn)定易降解的物質與單壁碳納米管結合后有較好的穩(wěn)定性不易被降解，可提高導入細胞的效率和導入細胞后的功效。
4)本發(fā)明的方法可將端粒酶反轉錄酶siRNA導入腫瘤細胞以抑制腫瘤細胞的生長和增殖，有潛在的臨床應用價值。
5)本發(fā)明的方法可將免疫調節(jié)分子siRNA導入樹突細胞，以沉默樹突細胞中的靶基因，調節(jié)免疫功能，這對與免疫功能有關的疾病如腫瘤，移植排斥反應，自身免疫性疾病等有廣泛的臨床應用價值。


圖1端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。
圖2端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。
圖3端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物在體外抑制腫瘤細胞的生長與增殖。
圖4端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制腫瘤組織內腫瘤細胞的生長和增殖。
圖5 CD80siRNA:SWNTs+復合物導致成熟樹突細胞和未成熟樹突細胞CD80基因的沉默。
圖6 CD80siRNA:SWNTs+復合物進入腫瘤相關性Gr-1+CD11b+細胞引導CD80基因沉默。
圖7體內注射CD80siRNA:SWNTs+復合物導致小鼠細胞內CD11b+細胞的CD80表達降低。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域的技術熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內容做出一些非本質的改進和調整。
本發(fā)明使用的透射電鏡配備電子能譜(FEI，TECNAI-20)，分光光度計(Eppendorf，AG biophotometer)，原子力顯微鏡(Veeco，Nanoscope IV)，流式細胞儀(BD FACScalibur)。
各種試劑的純度均為分析純。SWNTs的氧化使用的混酸是濃酸。
實施例11.siRNA:SWNTs+復合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負載的SWNTs(SWNTs+)的制備a.己二胺的單氨基保護7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，28.3g(244mmol)1，6-己二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內滴完，然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.30g，產(chǎn)率61.0％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護過的己二胺與酰氯化的SWNTs反應4.3g Boc-C6H12NH2，30ml DMF，0.0430g SWNT-COCl加入反應瓶，氬氣保護下90℃反應96h。反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護下加入30mg SWNT-CO-NHC6H12-Boc并撤去冰水浴，室溫反應1h。反應結束離心除去反應液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復合物通過電子能譜，分光光度計，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤細胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計檢測(圖1)。圖1端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。
A端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的電子能譜A1SWNTs；A2未帶正電荷負載的SWNTs與端粒酶反轉錄酶siRNA結合的復合物；A3帶有正電荷的SWNTs與端粒酶反轉錄酶siRNA的復合物。
B通過分光光度計對端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物連接的分析。IRF相對熒光強度。(相對熒光強度＝樣本熒光強度/對照熒光強度)。
C端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的電鏡表征C1透射電鏡。
C2原子力顯微鏡(箭頭指示siRNA與帶有正電荷的SWNTs聯(lián)結)。
(3)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致端粒酶反轉錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉錄酶的表達，抑制端粒酶反轉錄酶的活性(圖2)。圖2端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。
A端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致端粒酶反轉錄酶的mRNA水平降低。GAPDH陽性對照；siRNA:SWNTs+實驗組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
A1鼠肺癌細胞LLC。
A2鼠宮頸癌細胞TC-1。
A3鼠卵巢癌細胞IH8。
B端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物降低端粒酶反轉錄酶的表達。Actin陽性對照。
B1鼠肺癌細胞LLC。
B2鼠宮頸癌細胞TC-1。
B3鼠卵巢癌細胞IH8。
C端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制端粒酶反轉錄酶的活性。siRNA:SWNTs+實驗組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNT+復合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進行評估。引物包括鼠端粒酶反轉錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞的端粒酶反轉錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復合物用辣根過氧化酶標記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞的端粒酶反轉錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制腫瘤細胞生長。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞中。在24小時內對照組細胞，siRNA單獨處理的細胞，其它對照siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞都生長良好。而加入端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物的腫瘤細胞的生長明顯受到抑制(圖3)。圖3端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物在體外抑制腫瘤細胞的生長與增殖。
A肺癌細胞B鼠宮頸癌細胞C鼠卵巢癌細胞A1，B1，C1細胞對照。
A2，B2，C2端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞。
A3，B3，C3siRNA單獨處理的細胞。
A4，B4，C4其它對照siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞。
A5，B5，C5不同實驗組腫瘤細胞的數(shù)量。siRNA:SWNTs+實驗組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
D端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物處理的鼠肺癌細胞的變化。D1轉染前的鼠肺癌細胞，D2轉染后24小時后的細胞，D3轉染4天的細胞，D4轉染6天后的細胞。
(5)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤部位的直接注射導致腫瘤生長的抑制。
a.單一點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點注射100uL端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制(圖4，A)。
b.多點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點注射100uL注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(siRNA 10nM)；B3多點注射端粒酶反轉錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(圖4，B)。說明注射了端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制。
圖4腫瘤組織內注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制鼠肺癌細胞的生長和增殖。
A端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物在一點注射導致的對腫瘤生長和增殖的抑制。
A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組；A3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物。
B多點注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致的對腫瘤生長和增殖的抑制。
B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組；B3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA；B4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物。
C腫瘤的平均重量。M.T.W.(g)鼠肺癌在不同處理與對照組的平均重量。
3.siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt 2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞的檢測。
A、將復合物分別加入到未成熟的樹突細胞、成熟的樹突細胞和Raw264.7細胞系的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進行細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測。
同時轉染siRNA:SWNTs復合物的不成熟樹突細胞，成熟樹突細胞，單核細胞以及Raw264.7細胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(圖5)。圖5 CD80siRNA:SWNTs+復合物導致CD80基因的沉默。
ACD80siRNA:SWNTs+在未成熟的樹突細胞中導致CD80基因沉默。
BCD80siRNA:SWNTs+復合物在成熟的樹突細胞中引導CD80基因沉默。
CCD80siRNA:SWNTs+復合物在單核細胞細胞系RAW264.7中引導的基因沉默A1，B1，C1加入CD80siRNAA2，B2，C2加入其它對照siRNA與SWNTs+結合的復合物A3，B3，C3加入實驗CD80siRNA:SWNTs+復合物a抗體亞型對照；b實驗組CD80siRNA:SWNTs+復合物(A3，B3，C3)與對照單獨CD80siRNA(A1，B1，C1)或未帶正電荷SWNTs與CD80siRNA復合物(A2，B2，C2)。
cCD80在未處理細胞的表達組中的表達。
DCD80siRNA:SWNTs+復合物在未成熟樹突細胞，成熟的樹突細胞和Raw264.7細胞系RNA水平。GAPDH陽性對照；siRNA:SWNTs+實驗組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
B、將復合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細胞的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測(圖6)。圖6CD80siRNA:SWNTs+復合物在腫瘤相關性Gr-1+CD11b+細胞引導CD80基因沉默。
A光鏡下來自于腹腔植入卵巢癌細胞的小鼠脾細胞形態(tài)。(40x)Ba抗體亞型對照；bCD80在CD80siRNA:SWNTs+復合物處理的Gr-1+CD11b+細胞中的表達；cCD80在未經(jīng)處理的Gr-1+CD11b+細胞中的表達。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內，此復合物可被脾臟內免疫調節(jié)細胞Gr-1+CD11+細胞吸收，抑制這些細胞的CD80的表達(圖7)。圖7體內注射CD80siRNA:SWNTs+復合物導致小鼠脾細胞內CD11b+細胞的CD80表達降低。
A1卵巢癌鼠脾細胞；A2卵巢癌鼠脾細胞大細胞表達Gr1和CD11b分子；A3CD80siRNA:SWNTs+復合物對CD80表達的影響。
A3.1注射CD80siRNA；A3.2注射CD80siRNA:SWNTs+復合物；A3.3注射對照siRNA:SWNTs+結合的復合物；A3.4不同處理組CD80的表達。a抗體亞型對照；b注射CD80siRNA:SWNTs+復合物組CD80的表達；c和d對照組CD80的表達。
A4不同處理組mRNA的水平。GAPDH陽性對照siRNA:SWNTs+實驗組；MocksiRNA:SWNTs對照組。
實施例2
1.siRNA:SWNTs+復合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.辛二胺的單氨基保護7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，35.1g(244mmol)1，8-辛二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.68g，產(chǎn)率59.0％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護過的辛二胺與酰氯化的SWNTs反應4.68g Boc-C8H16NH2，30ml DMF，0.0468g SWNT-COCl加入反應瓶，氬氣保護下90℃反應96h。反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護下加入30mg SWNT-CO-NHC8H16-Boc并撤去冰水浴，室溫反應1h。反應結束離心除去反應液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復合物通過電子能譜，分光光度計，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤細胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計檢測(與實例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致端粒酶反轉錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉錄酶的表達，抑制端粒酶反轉錄酶的活性(與實例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNT+復合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進行評估。引物包括鼠端粒酶反轉錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGAGTTGCTGT端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞的端粒酶反轉錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復合物用辣根過氧化酶標記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞的端粒酶反轉錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制腫瘤細胞生長(與實例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞中。在24小時內對照組細胞，siRNA單獨處理的細胞，其它對照siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞都生長良好。而加入端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物的腫瘤細胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤部位的直接注射導致腫瘤生長的抑制。
a.單一點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點注射100uL端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制(與實例一的圖4，A類似)。
b.多點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點注射100uL注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(siRNA 10nM)；B3多點注射端粒酶反轉錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞的檢測。
A、將復合物分別加入到未成熟的樹突細胞、成熟的樹突細胞和Raw264.7細胞系的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進行細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測。
同時轉染siRNA:SWNTs復合物的不成熟樹突細胞，成熟樹突細胞，單核細胞以及Raw264.7細胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實例一的圖5類似)。
B、將復合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細胞的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測(與實例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內，此復合物可被脾臟內免疫調節(jié)細胞Gr-1+CD11+細胞吸收，抑制這些細胞的CD80的表達(與實例一的圖7類似)。
實施例31.siRNA:SWNTs+復合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.癸二胺的單氨基保護7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，42.0g(244mmol)1，10-癸二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.95g，產(chǎn)率56.0％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護過的癸二胺與酰氯化的SWNTs反應4.95g Boc-C10H20NH2，30ml DMF，0.0495g SWNT-COCl加入反應瓶，氬氣保護下90℃反應96h。反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護下加入30mg SWNT-CO-NHC10H20-Boc并撤去冰水浴，室溫反應1h。反應結束離心除去反應液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復合物通過電子能譜，分光光度計，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤細胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計檢測(與實例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致端粒酶反轉錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉錄酶的表達，抑制端粒酶反轉錄酶的活性(與實例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNT+復合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進行評估。引物包括鼠端粒酶反轉錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞的端粒酶反轉錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復合物用辣根過氧化酶標記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞的端粒酶反轉錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制腫瘤細胞生長(與實例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞中。在24小時內對照組細胞，siRNA單獨處理的細胞，其它對照siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞都生長良好。而加入端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物的腫瘤細胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤部位的直接注射導致腫瘤生長的抑制。
a.單一點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點注射100uL端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制(與實例一的圖4，A類似)。
b.多點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點注射100uL注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(siRNA 10nM)；B3多點注射端粒酶反轉錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞的檢測。
A、將復合物分別加入到未成熟的樹突細胞、成熟的樹突細胞和Raw264.7細胞系的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進行細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測。
同時轉染siRNA:SWNTs復合物的不成熟樹突細胞，成熟樹突細胞，單核細胞以及Raw264.7細胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(圖5)。
B、將復合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細胞的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測(與實例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內，此復合物可被脾臟內免疫調節(jié)細胞Gr-1+CD11+細胞吸收，抑制這些細胞的CD80的表達(與實例一的圖7類似)。
實施例41.siRNA:SWNTs+復合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.十二二胺的單氨基保護7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，48.8g(244mmol)1，12-十二二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品4.53g，產(chǎn)率46.5％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護過的十二二胺與酰氯化的SWNTs反應4.53g Boc-C12H24NH2，30ml DMF，0.0453g SWNT-COCl加入反應瓶，氬氣保護下90℃反應96h。反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護下加入30mg SWNT-CO-NHC12H24-Boc并撤去冰水浴，室溫反應1h。反應結束離心除去反應液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復合物通過電子能譜，分光光度計，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤細胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計檢測(與實例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致端粒酶反轉錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉錄酶的表達，抑制端粒酶反轉錄酶的活性(與實例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNT+復合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進行評估。引物包括鼠端粒酶反轉錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞的端粒酶反轉錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復合物用辣根過氧化酶標記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞的端粒酶反轉錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制腫瘤細胞生長(與實例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞中。在24小時內對照組細胞，siRNA單獨處理的細胞，其它對照siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞都生長良好。而加入端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物的腫瘤細胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤部位的直接注射導致腫瘤生長的抑制。
a.單一點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點注射100uL端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制(與實例一的圖4，A類似)。
b.多點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點注射100uL注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(siRNA 10nM)；B3多點注射端粒酶反轉錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞的檢測。
A、將復合物分別加入到未成熟的樹突細胞、成熟的樹突細胞和Raw264.7細胞系的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進行細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測。
同時轉染siRNA:SWNTs復合物的不成熟樹突細胞，成熟樹突細胞，單核細胞以及Raw264.7細胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實例一的圖5類似)。
B、將復合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細胞的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測(與實例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內，此復合物可被脾臟內免疫調節(jié)細胞Gr-1+CD11+細胞吸收，抑制這些細胞的CD80的表達(與實例一的圖7類似)。
實施例51.siRNA:SWNTs+復合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.丁二胺的單氨基保護7.09g(32.5mmol)(Boc)2O溶于80ml新蒸二噁烷，21.5g(244mmol)1，4-丁二胺溶于250ml二噁烷。在氬氣保護下將(Boc)2O滴加至二胺溶液中在8h內滴完。然后室溫攪拌3天。處理后得到產(chǎn)品3.4g，產(chǎn)率55.7％。
b.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
c.Boc保護過的丁二胺與酰氯化的SWNTs反應3.4g Boc-C4H8NH2，30ml DMF，0.0340g SWNT-COCl加入反應瓶，氬氣保護下90℃反應96h。反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥。
d.去Boc保護，生成鹽酸鹽9.6ml二噁烷，0.4ml濃HCl置于冰水浴攪拌，Ar保護下加入30mg SWNT-CO-NHC4H8-Boc并撤去冰水浴，室溫反應1h。反應結束離心除去反應液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次然后室溫干燥產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復合物通過電子能譜，分光光度計，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤細胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計檢測(與實例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致端粒酶反轉錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉錄酶的表達，抑制端粒酶反轉錄酶的活性(與實例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNT+復合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進行評估。引物包括鼠端粒酶反轉錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞的端粒酶反轉錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復合物用辣根過氧化酶標記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞的端粒酶反轉錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制腫瘤細胞生長(與實例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞中。在24小時內對照組細胞，siRNA單獨處理的細胞，其它對照siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞都生長良好。而加入端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物的腫瘤細胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤部位的直接注射導致腫瘤生長的抑制。
a.單一點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點注射100uL端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制(與實例一的圖4，A類似)。
b.多點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點注射100uL注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(siRNA 10nM)；B3多點注射端粒酶反轉錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞的檢測。
A、將復合物分別加入到未成熟的樹突細胞、成熟的樹突細胞和Raw264.7細胞系的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進行細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測。
同時轉染siRNA:SWNTs復合物的不成熟樹突細胞，成熟樹突細胞，單核細胞以及Raw264.7細胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTGAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實例一的圖5類似)。
B、將復合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細胞的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測(與實例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內，此復合物可被脾臟內免疫調節(jié)細胞Gr-1+CD11+細胞吸收，抑制這些細胞的CD80的表達(與實例一的圖7類似)。
實施例61.siRNA:SWNTs+復合物的制備(1)SWNTs的純化、切割和氧化。
0.5g SWNTs在70mL 2.6M HNO3中超聲分散1h，再回流24h，然后離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去Triton X-100。純化的SWNTs進一步用混酸切割氧化(硝酸∶硫酸＝1∶3)，100mg純化的SWNTs在400mL混酸中超聲5h，然后用蒸餾水洗去酸液。
(2)正電荷負載的SWNTs(SWNTs+)的制備。
a.SWNTs的酰氯化100mg SWNTs加入到20mL二氯亞砜中，再加1mL DMF，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，產(chǎn)品冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥。
b.己二胺與酰氯化的SWNTs反應6.1g NH2-C6H12-NH2，0.0605g SWNT-COCl加入反應瓶，超聲分散，90℃反應96h。反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，用乙醇洗滌數(shù)次，然后室溫下真空干燥。
c.成鹽SWNT-CO-C6H12NH2水溶液加入少許6M鹽酸，攪拌1h，再離心水洗兩次，收集固體產(chǎn)品。
(3)siRNA:SWNT+復合物的制備和表征將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。siRNA:SWNTs+復合物通過電子能譜，分光光度計，透射電鏡和原子力顯微鏡分析表征。
2.siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤細胞生長抑制功能的檢測。
(1)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的制備。將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM端粒酶反轉錄酶siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。端粒酶反轉錄酶siRNA序列1#正義鏈CAGAUCAAGAGCAGUAGUCtt和反義鏈GACUACUGCUCUUGAUCUGtt；2#正義鏈UAUGUCAGACUCCUCAGGUtt和反義鏈ACCUGAGGAGUCUGACAUAtt。
(2)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的表征。端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物通過透射電鏡、電子能譜、原子力顯微鏡、分光光度計檢測(與實例一的圖1類似)。
(3)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物引導基因沉默。端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物導致端粒酶反轉錄酶的mRNA水平降低，降低端粒酶反轉錄酶的表達，抑制端粒酶反轉錄酶的活性(與實例一的圖2類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNT+復合物分別加入到培養(yǎng)的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞，siRNA終濃度為2nM。14小時后，消化收集這些siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞，用Trizol提取RNA。端粒酶反轉錄酶的mRNA通過半定量RT-PCR進行評估。引物包括鼠端粒酶反轉錄酶5’ATGACCCGCGCTCCTCGTTGC和3’GACAGCAGAGATGTGGAGCTG；陽性對照GAPDH引物5’ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC和3’CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞的端粒酶反轉錄酶蛋白水平也通過Western Blotting方法檢測。100ug的核提取液由7.5％SDS-PAGE膠分離，然后轉移到nitrocellulose膜上，蛋白抗體復合物用辣根過氧化酶標記的第二抗體檢測。
端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物轉染的腫瘤細胞的端粒酶反轉錄酶活性通過德國Boehringrt Mannheim公司生產(chǎn)的PCR ELISA Kit測定。
(4)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物抑制腫瘤細胞生長(與實例一的圖3類似)。
將端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物分別加入到在24孔板中培養(yǎng)好的鼠肺癌細胞，鼠宮頸癌細胞，鼠卵巢癌細胞中。在24小時內對照組細胞，siRNA單獨處理的細胞，其它對照siRNA:SWNTs+復合物處理過的細胞都生長良好。而加入端粒酶反轉錄酶siRNA納米碳管復合物的腫瘤細胞的生長明顯受到抑制。
(5)端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物對腫瘤部位的直接注射導致腫瘤生長的抑制。
a.單一點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，A1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；A2一點注射100uL端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(10nM siRNA)；A3只注射端粒酶反轉錄酶siRNA(10nM siRNA)；A4注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(10nM siRNA)。
注射后，每隔2天測量腫瘤大小。7天后A1，A3和A4三組腫瘤大小無顯著差異。A2組腫瘤在注射位點，有明顯的凹陷，說明此區(qū)域的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制(與實例一的圖4，A類似)。
b.多點注射。
將2×106的肺癌細胞注射到小鼠右腿下方。當腫瘤生長至5×5×5mm時分4組，B1未經(jīng)處理的腫瘤對照組；B2向腫瘤中多點注射100uL注射端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物組(siRNA 10nM)；B3多點注射端粒酶反轉錄酶siRNA(siRNA 10nM)；B4多點注射其它對照siRNA:SWNTs+結合的復合物(siRNA 10nM)。
注射后每隔2天測量腫瘤大小。8天后B1，B3和B4三組腫瘤大小無顯著差異。B2組腫瘤與其它組腫瘤大小有明顯差異，比其它組腫瘤都明顯減小(與實例一的圖4，B類似)。說明注射了端粒酶反轉錄酶siRNA:SWNTs+復合物的腫瘤細胞生長和增殖都受到了抑制。
3.siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞，降低靶基因的水平，抑制靶基因的表達。
(1)制備CD80siRNA:SWNTs+復合物。
將SWNTs+在水溶液中超聲分散，得到溶液濃度為1.5-2.0mg/L，與100nM CD80siRNA室溫孵育1小時，然后水洗兩次。
兩組CD80siRNA序列被用于我們的研究中1#正義鏈CUGUCCAAGUCAGUGAAAGtt和反義鏈CUUUCACUGACUUGGACAGtt；2#正義鏈GUGUGGCCCGAGUAUAAGAtt和反義鏈UCUUAUACUCGGGCCACACtt(2)siRNA:SWNTs+復合物進入免疫調節(jié)細胞的檢測。
A、將復合物分別加入到未成熟的樹突細胞、成熟的樹突細胞和Raw264.7細胞系的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后進行細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測。
同時轉染siRNA:SWNTs復合物的不成熟樹突細胞，成熟樹突細胞，單核細胞以及Raw264.7細胞系總RNA用Trizol提取。CD80mRNA的水平通過半定量RT-PCR進行評估。
鼠CD80的引物5’ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGG和3’CTAAAGGAAGACGGTCTG陽性對照基因GAPDH引物與上述相同(與實例一的圖5類似)。
B、將復合物分別加入到培養(yǎng)Gr-1+CD11b+細胞的培養(yǎng)瓶中，復合物siRNA終濃度為2nM。48小時后將細胞表面分子染色，進行流失細胞儀檢測(與實例一的圖6類似)。
C、將CD80siRNA:SWNTs+經(jīng)鼠尾靜脈注入植入卵巢癌小鼠體內，此復合物可被脾臟內免疫調節(jié)細胞Gr-1+CD11+細胞吸收，抑制這些細胞的CD80的表達(與實例一的圖7類似)。
權利要求
1.一種小干擾RNA與單壁碳納米管復合物，其特征在于它的結構表示為siRNA:SWNTs+，它是用Boc-保護的二元胺通過共價鍵連接到SWNTs，使其成鹽帶有正電荷，再與帶有負電性的siRNA通過靜電相互作用構成的復合物。
2.按照權利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復合物，其特征在于所述的單壁碳納米管是直徑為1.0～2.0nm，長度為10nm～100μm的單壁碳納米管。
3.按照權利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復合物，其特征在于所述的二元胺是C2～C20的二元胺中的至少一種，優(yōu)選丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺或十二二胺。
4.按照權利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復合物，其特征在于所述的siRNA是端粒酶反轉錄酶siRNA或免疫刺激分子CD80siRNA；端粒酶反轉錄酶的siRNA的特殊靶序列是AACAGATCAAGAGCAGTAGTC和AATATGTCAGACTCCTCAGGT；CD80siRNA特殊的靶序列是AACTGTCCAAGTCAGTGAAAG和AAGTGTGGCCCGAGTATAAGA。
5.一種小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)SWNTs的純化、切割和氧化采用在硝酸或鹽酸中超聲并回流的方法純化，然后用表面活性劑Triton-X洗滌，SWNTs進一步用混酸切割氧化，在體積比混酸為硝酸∶硫酸＝1∶3中超聲反應；2)將二元胺用Boc-保護或不進行保護，然后與酰氯化的SWNTs進行反應，再脫掉Boc-保護并成鹽，或不用脫保護，加酸成鹽，得到胺鹽功能化的SWNTs，再將siRNA與功能化的單壁碳納米管相互作用。
6.一種小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的制備方法，其特征在于包括如下具體步驟1)將SWNTs(采用電弧法制備)在2.6M硝酸或濃鹽酸中超聲分散1h，并回流24h，離心洗去酸液，再分別用1.1％和0.2％的Triton X-100洗滌，過膜收集固體，最后用蒸餾水洗去TritonX-100；純化后的SWNTs在混酸(濃硝酸∶濃硫酸＝1∶3)中超聲5h，水洗去酸液。2)在氬氣保護下將(Boc)2O加入至二胺溶液中反應8h，室溫攪拌3天，得Boc-CnH2nNH2；(Boc)2O與二胺的摩爾比是1∶7.5；3)步驟2)得到的SWNTs加入到混合溶劑二氯亞砜和DMF(體積比20∶1)中，SWNTs濃度約為5mg/mL，超聲分散1h，然后70℃加熱回流攪拌24h，冷卻，旋蒸除去二氯亞砜，再加四氫呋喃超聲洗滌四～五次，抽濾干燥，得到酰氯化的SWNTs-COCl；4)Boc-CnH2nNH2與SWNTs-COCl(重量比是100∶1)，在DMF溶劑中，氬氣保護下90℃反應96h，反應完成后用0.1μm尼龍膜過濾收集產(chǎn)品，并用二噁烷洗兩次，然后室溫下真空干燥，得到SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc；5)冰水浴和Ar保護條件下，二噁烷為溶劑，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc反應，濃HCl與SWNTs-CO-NHCnH2n-Boc的為量比約為16∶1，撤去冰水浴，室溫反應1h，離心除去反應液，將SWNTs用二噁烷洗滌2次，室溫下干燥產(chǎn)品，得到SWNTs+；6)SWNTs+在水溶液中超聲分散，室溫下與siRNA孵育1小時，然后水洗兩次，得到siRNA:SWNTs+復合物。
7.權利要求1所述的小干擾RNA與單壁碳納米管復合物的應用，其特征在于它用作檢測和治療腫瘤細胞生長或其它細胞系的試劑，以及用作調節(jié)免疫功能或治療免疫相關疾病試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及小干擾RNA與單壁碳納米管復合物及制備方法和應用。它的結構表示為siRNA:SWNTs
文檔編號A61P37/00GK1840706SQ20061001305
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月16日 優(yōu)先權日2006年1月16日
發(fā)明者楊榮存, 陳永勝, 楊曉英, 張灼寒, 張園, 王淑靜, 馬延風 申請人:南開大學